Technique à ADN de recombinant pour la
préparation d'une protéine ressemblant
à l'interféron humain La présente invention concerne une technique à ADN de recombinant en vue de la préparation d'une protéine ressemblant à l'interféron humain.
L'interféron est une molécule naturelle qui est produite par des cellules en réponse à une infection virale et à certains autres stimulis, (voir, par exemple, Isaacs A. et Lindenmann J., Proc. Roy. Soc. B., (1957), 147, 258-267).
Cette molécule, lorsqu'elle est exposée à des cellules, rend ces cellules résistantes à l'infection virale.
Par conséquent, l'interféron constitue un agent antiviral bien connu (voir, par exemple, Isaacs A. et coll., (1957),
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Depuis l'observation originale de Inactivité antivirale, on a attribué un certain nombre d'autres propriétés à l'interféron (voir, par exemple, Stewart W.E., II, Interferon I, (1979), Académie Press, I. dresser (Ed.)),
y compris un rôle potentiel d'inhibition de la croissance de cellules cancéreuses in vivo (voir, par exemple, Paucker
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coll., (1970), Ann. N.Y. Acad. Sci., 173, 694-699; Mellstedt H. et coll., (1979), Lancet, 1, 245-247; Blomgren H. et coll.,
(1976), Acta. Med. Scand. , 199, 527-532; Merigan T.C. et coll., (1978), New Engl. J. Med., 298, 981-987 et Merigan T.C. et coll., (1978), New Engl. J. Med., 299, 1449-1453).
L'interféron manifeste également un degré marqué de spécificité vjs-à-vis de l'espèce (cf. entre autres Tyrell D.A.J. ,
(1959), Nature, 184, 452-453 et Gresser I. et coll., (1974), Nature, 251, 543-545), ce qui signifie que, pour le traitement d'une maladie humaine, on préfère l'interféron qui provient de cellules humaines.
Pour un rapport détaillé relatif à l'interféron, on peut se référer à l'ouvrage Texas Reports on Biology and
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Branch, Galveston, Texas, U.S.A., (S. Baron et F. Diazani, Editeurs).
Quant aux sources classiques, les cellules de culture de tissu constituent la seule source pratique de matière. Un procédé qui se base sur des cellules de culture de tissu est considéré comme exigeant une quantité importante de travail, pas fiable, coûteux et donnant généralement de faibles rendements.
La présente invention a pour objet des moyens de préparation d'une protéine possédant des propriétés qui ressemblent à celles de l'interféron humain par la mise en oeuvre de techniques à ADN de recombinant dans des bactéries, qui sont meilleur marché et beaucoup plus fiables et qui offrent également la possibilité de produire des formes modifiées de l'interféron. Au surplus, on peut obtenir des rendements élevés en produit.
L'interféron est une glycoprotéine qui possède un poids moléculaire d'environ 20.000. Les séquences polypeptidiques aminoterminales des interférons humains et de souris sont connues (voir, par exemple, Knight E. Jr. et coll., (1980), Science, 207, 525-526; Zoon K.C. et coll.,
(1980), Science, 207, 527; et Taira H. et coll., (1980), Science, 207, 528-529).
Le schéma A qui termine le présent mémoire montre des régions choisies de ces séquences, en même temps que des possibilités de codons correspondants. Parmi les treize aminoacides connus chez l'interféron de fibroblaste FS-4. trois sont communs (soulignés) aux interférons de souris
A et B que l'on obtient à partir d� cellules de tumeur ascitique d'Ehrlich, cependant que seul un aminoacide est commun entre les interférons de lymphoblastolde et de fibroblaste humain. En fait, au niveau de l'ADN, il semble qu'il y ait plus de probabilité de similitude entre l'interféron de fibroblaste humain et les interférons de souris
A et B (pointillé) qu'entre les deux protéines humaines.
La région correspondant aux cinq restes aminoterminaux de l'interféron de fibroblaste humain présente manifestement un nombre minimal de permutations d'oligonucléotides de codage sur une séquence de longueur suffisante pour être raisonnablement spécifique pour un mARN individuel dans une cellule eucaryote, (voir, par exemple, Montgomery D.L. et coll., (1978), Cell, 14, 673-680). Les codons pour les restes de sérine et de leucine ont été déduits en choisissant d'abord.les triplets les plus susceptibles de montrer une homologie maximale avec les codons de souris analogues. Les ambiguités subsistait alors dans ces triplets et les autres triplets ont ensuite été davantage réduites en agissant sur les fréquences connues d'usage de codons dans des gènes humains, (voir, par exemple, Grantham R. et coll., (1980), Nucl. Acids Res., 8, r47-r62).
Il a par conséquent été possible de réduire le nombre de séquences de codage potentielles à deux, ne différant seulement que par le troisième résidu ou reste du codon de sérine qui ne manifeste pas de discrimination claire dans cette position. Sur cette base, on a déduit les séquences de deux oligodésoxyribonucléotides (IFIA et IB) dont on attendait qu'ils amorcent spécifiquement la synthèse de l'interféron
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le polyA-mARN (3'-mARN à polyadénylation terminale) provenant de cellules "induites".
Un facteur supplémentaire qui intervient dans
*la prévision de la structure d'amorceurs spécifiques vis-à-vis du mARN d'interféron était la supposition qu'un reste ou
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ment stable avec un reste ou résidu U dans l'ARN (ou un reste ou résidu T dans l'ADN). Par conséquent, si, dans certaines positions, les amorceurs contenaient un résidu G au lieu du résidu A correct, on pouvait encore s'attendre à un degré d'amorçage spécifique. (Voir, par exemple, Powers G.J. et
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Les oligonucléotides (IFIA et IB) ont été synthé-
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induits pour produire de l'interféron par amorçage avec de l'interféron et une superinduction subséquente en utilisant
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enzyme qu'est la transcriptase réverse avec les substrats de désoxynucléoside triphosphate classiques. Seul l'IFIA
a donné un transcrit d'environ 150 nucléotides, spécifique vis-à-vis du mARN de fibroblastes induits. La séquence nucléotidique de ce transcrit à brin négatif a été déterminée par mise en oeuvre de procédés connus et est montrée sur le schéma B qui figure à la fin du présent mémoire.
Le brin supérieur dans le schéma B est la séquen-
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blaste humain, représenté comme le brin inférieur dans le schéma A. La séquence de mARN définit à son tour la séquence protéinique, commençant à partir du premier AUG de la région amino-terminale de la molécule de précurseur d'interféron présumé.
On a synthétisé un second oligodésoxynucléotide
(IFII) qui était complémentaire à une partie de la séquence déterminée comme indiqué sur le schéma C qui se trouve à la
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décrit plus haut à du cADN préparé par mise en oeuvre de procédés connus à partir du mARN total provenant de cellules de fibroblastes induites et faussement induites et d'un transcrit produit de la manière précédemment indiquée. Lorsque l'on a fractionné les produits de cette réaction sur une base dimensionnelle en faisant appel à une électrophorèse à gel de dénaturation, on a obtenu un transcrit radioactif particulier d'environ 700 nucléotides à partir de cADN provenant de cellules induites mais non faussement induites.
Lorsqu'on l'a soumis à une électrophorèse à travers des gels natifs, le produit spécifique vis-à-vis de l'interféron avait une longueur d'environ 850 paires de
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de la molécule de mARN d'interféron complète. Cette contradiction dimensionnelle peut être expliquée en présumant que
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agissant comme un gabarit pour l'IFII, s'autoamorce en vertu de l'extrémité 3' se recerclant sur elle-même. Ce transcrit est ensuite allongé jusqu'à la position du transcrit amorcé à l'IFII où il est arrêté, engendrant ainsi un gène d'interféron bicaténaire (à double brin) de pleine longueur (c.à.d. un gène codant pour l'interféron), où l'extrémité 3' du transcrit autoamorcé et l'extrémité 5' du transcrit amorcé
à l'IFII ne sont pas attachés par une liaison covalente. Par conséquent, le calibre ou la dimension du produit spécifique vis-à-vis de l'interféron variera en fonction du type du système de gel.
Le gène d'interféron a été élue de gels natifs
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de l'élucidation de la séquence de gène codant pour l'extrémité amino de l'interféron de fibroblaste mûr. On a également réalisé une version allongée de IFII, IFIII (représentée sur le schéma D qui figure en fin du présent mémoire) et on a répété le procédé décrit plus haut. On a obtenu les mêmes résultats.
Cette séquence confirme largement les prévisions utilisées dans la synthèse de l'IFIA. On peut constater,
à partir d'une comparaison des schémas A et E qui accompagnent le présent mémoire, que la séquence de mARN réelle spécifiant l'extrémité amino du polypeptide d'interféron
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l'IFIA était basée, à l'exception de seulement une différence nucléotidique dans le codon pour le cinquième aminoacide
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quent, hors d'un total de sept positions nucléotidiques ambiguës, six étaient prévues correctement dans le cas de l'IFIA. (Voir, par exemple, Houghton M. et coll., (1980),
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On a ensuite réalisé un amorceur oligodésoxynucléotidique supplémentaire IFIV (représenté sur le schéma D qui accompagne le présent mémoire) qui correspondait à une région proche de l'extrémité de la séquence nouvellement déterminée. En répétant le mode opératoire susmentionné,
on a obtenu une information de séquence supplémentaire
à partir de laquelle un autre amorceur IFV (représenté sur le schéma D qui accompagne le présent mémoire) a été déduit et synthétisé. On a ensuite de nouveau répété le procédé. De cette manière, on a déterminé par étapes successives la séquence de gène entière codant pour le polypeptide d'inter-
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accompagne le présent mémoire). (Voir, par exemple, Houghton
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Le schéma F que l'on retrouvera à la fin du présent mémoire représente la séquence de gène bicaténaire qui code pour la séquence de mARN non traduite en 5' et la séquence de mARN de codage pour protéine.
Un schéma illustratif des procédés de base mis
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bactériens figure à la fin du présent mémoire et constitue le schéma G.
Les produits finals de ces procédés étaient des recombinants contenant des gènes d'interféron codant
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mARN d'interféron non traduite en 3'. Au surplus, ces
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une molécule de liant d'Hind III synthétique aux deux extrémités du gène.
Une séquence nucléotidique d'ADN partielle d'un de ces recombinants de gène d'interféron est représentée sur le schéma H qui accompagne le présent mémoire, qui montre qu'au cours des procédés de clonage (vraisemblablement en résultat du traitement par la SI nucléase), le nucléotide terminal 5' de IFIII était perdu. De même, on a observé que le triplet de mARN codant pour le résidu de tyrosine à la
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plutôt que le triplet UAC qui avait été antérieurement déterminé par séquentialisation directe de transcrits réverses
(voir le schéma E qui accompagne le présent mémoire). Ce changement de nucléotide "silencieux" est vraisemblablement une réflexicn du polymorphisme du gène et signifie que les deux types de gène engendrent l'expression d'interférons identiques.
Afin d'exprimer le gène d'interféron dans des bactéries, on l'a transféré à partir de pBR 322 (voir, par
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Cette dernière série de plasmides contient la séquence du promoteur responsable de la transcription de l'opéron tryptophane et pourvoit aux besoins des trois phases de traduction possibles (voir, par exemple, la demande de brevet britannique publiée n[deg.] 2.052.516). Cependant, si le gène d'interféron est inséré dans ces plasmides dans l'orientation correcte, eu égard à la transcription, seul l'un d'entre eux donnera l'expression fidèle du gène.
A partir de la séquence montrée sur le schéma H qui accompagne le présent mémoire, on a prévu que le pWT 221 assure-
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dernier fût fusionné à un peptide amino terminal des soixante restes résultant de l'expression de la séquence de gène trp E courte et des molécules de liant d'Hind III
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expression du liant d' Hind III et de l'amorceur IFIII utilisé dans le clonage original du gène d'interféron. En fait, lorsque l'on a transféré le gène d'interféron aux plasmides
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l'absence de tryptophane et en présence d'acide 3 0-indole acrylique, on n'a seulement pu démontrer une activité anti-
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La figure 1 des dessins ci-annexés (dans laquelle Veros = cellules témoin non infectées du virus EMC (virus de l'encéphalomyocardite), Std. A = standard A d'interféron, Std. B = standard B d'interféron, 221 = extrait de recombinant contenant le gène d'interféron inséré dans pWT 221,
231 = extrait de recombinant contenant le gène d'interféron <EMI ID=32.1>
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on avait ajouté le Standard B d'interféron préalablement à l'extraction et EMC = cellules témoin infectées du virus EMC), montre un résultat typique obtenu lorsque des extraits bactériens sont titrés en ce qui concerne l'activité antivirale dans un système in vitro. Dans ce système, on a dilué
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qués à des monocouches de cellules de callitriche d'Afrique
(Veros). Après une nuit d'incubation, on a attaqué les cellules par le virus EMC avant la coloration des cellules, si bien que l'on a constaté que les échantillons contenant l'activité d'interféron protégeaient les cellules vero contre l'effet cytopathogène (cpe) du virus. En comparant les résultats obtenus avec ceux obtenus avec des standards d'interféron, on peut établir le niveau d'activité.
On n'a pas décelé d'activité dans des extraits <EMI ID=35.1>
résultat obtenu avec le recombinant pWT 231 est montré sur la figure 1), tandis que l'activité observée à partir des extraits de recombinants pWT 221 est équivalente à un rende- <EMI ID=36.1>
unités de référence internationale d'interféron par litre de bactéries (c.à.d. équivalente à 106 unités d'une préparation d'interféron standard internationale, 1 unité étant
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de la réplication du virus en culture de tissu). Il est vraisemblable qu'une activité d'interféron considérable est perdue au cours du procédé d'extraction, étant donné que lorsque l'on ajoute un standard d'interféron de fibro-
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(Il faut noter que l'effet toxique observé des
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à la présence de Triton X-100 qui fut utilisé pour la mise en oeuvre de ce procédé d'extraction particulier).
Il était à présent nécessaire d'enlever l'ADN codant pour les aminoacides de non interféron à l'extrémité amino du polypeptide d'interféron fusionné. Ceci peut être commodément effectué en recourant à l'emploi du plasmide pWT 501 (voir, par exemple, la demande de brevet britannique publiée n[deg.] 80 36080).
Le plasmide pWT 501 possède une longueur moléculaire de 3805 bp (paires de bases) et sa carte de restriction est illustrée par la figure 2 des dessins ci-annexés.
Ce plasmide peut être produit par un procédé qui
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isolant le fragment contenant le promoteur de trp, en incubant ce fragment avec de l'ADN polymérase I, en soudant le fragment à extrémité émoussée à des liants d'Hind III, en restreignant la matière soudée en utilisant Hind III, en isolant le fragment contenant le promoteur de trp, en soudant ce fragment au pAT 153 traité à la phosphatase alcaline bactérienne, coupé à l'Hind III (voir, par exemple, Twigg A.J. et Sherratt D., (1980), Nature, 283, 216-218), en transformant le K-12 HB101 d'E. coli (génotype gal-, lac-, <EMI ID=42.1>
une sélection pour la résistance à 1 ' ampicilline et la résistance à la tétracycline.
Un petit fragment de restriction à l'Hind III/ Taq I qui contient le promoteur de trp peut être isolé à par-
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en question est situé dans la séquence d'ADN qui correspond au site de liaison de ribosome dans la région de la mARN qui code pour le polypeptide conducteur de trp, qui se manifeste juste avant le triplet méthioninique initiateur. Ce fragment
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du gène d'interféron cloné qui contient la totalité de la séquence de codage de protéine mûre, précédée par seulement six paires de bases comme le représente le schéma I qui accompagne le présent mémoire. Etant donné que le résidu
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méthionine, le procédé d'union ou de soudure peut être réalisé de telle manière que l'on produise un ADN chimérique qui, lorsqu'il est transcrit, contient un site de liaison de ribosome artificiel qui utilise ce codon de méthionine comme codon initiateur pour la traduction. La molécule conjointe
a ensuite été clonée en K-12 HB101 d'E. coli en utilisant
le pAT 153 comme vecteur de plasmide. Ce procédé est illustré
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Une autre conséquence importante du procédé ci-dessus réside dans le fait que le plasmide d'expression ainsi obtenu est dépourvu de la région atténuatrice de trp qui joue un rôle important dans la régulation de la transcription de l'opéron de trp (voir, par exemple, Miozzari G.F.
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Des recombinants contenant la molécule conjointe nécessaire pour chaque orientation ont ensuite été analysés en ce qui concernait leur aptitude à produire de l'interféron. On a constaté qu'ils produisaient des proportions notablement supérieures, grosso modo sextuples (dans les deux orientations), d'activité antivirale extractible, lorsqu'on les comparait aux recombinants contenant le gène <EMI ID=48.1>
de l'interféron produit (environ 19.000 daltons) est plus
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mide d'expression (environ 24.COO daltons). Ceci est illustré par la figure 3 des dessins ci-annexés et est raisonnablement compatible avec la nature espérée des polypeptides d'interféron produits dans les deux cas (sur la figure 3 : a = recombinant contenant molécule conjointe en orientation dextrorsum (c.à.d. que la transcription
se déroule depuis le promoteur de trp vers le gène de résistance à la tétracycline dans le plasmide), b = recombinant contenant molécule conjointe en orientation senestrorsum
(c.à.d. que la transcription se déroule depuis le promoteur de trp en s'écartant du gène de résistance à la tétracycline), c = transformant ne contenant seulement que le pAT 153,
d = recombinant contenant le gène d'interféron mais dépourvu du promoteur de trp, f = recombinant d'expression constitué du gène d'interféron inséré dans pWT 221 et g � recombinant d'expression constitué du gène d'interféron inséré dans
pWT 211). La figure 3 annexée au présent mémoire illustre également l'abondance du polypeptide d'interféron de 19.000 daltons par rapport au produit de 24.000 daltons synthétisé dans le recombinant à pWT 221. Cet accroissement de l'expression du gène d'interféron peut être attribué à l'enlèvement de la région de l'atténuateur de trp.
La séquence de liaison au ribosome artificiel contient six nucléotides entre les restes du site de clivage ou scission Taq I et le codon initiateur ATG. Le plasmide original (pWT 501) ne contient seulement que cinq nucléotides
(de séquence différente) dans cette région analogue (voir schéma I). Par conséquent, d'autres changements du calibre
et de la séquence de cette région particulière dans le recombinant d'interféron peuvent augmenter l'efficience de
la liaison au ribosome et concomitamment améliorer le rendement en polypeptide d'interféron.
Il faut s'attendre à ce que le rendement en polypeptide analogue à l'interféron puisse encore être davantage amélioré en augmentant le nombre de gènes d'interféron et/ou de promoteurs de trp dans chaque plasmide. Ceci peut se faire par mise en oeuvre de procédés connus.
De même, l'utilisation de fermenteurs bactériens dans lesquels de fortes densités cellulaires peuvent être obtenues, accroissent manifestement le rendement en activité d'interféron par litre de bactéries.
Outre son aptitude à protéger les cellules Vero contre le cpe du virus EMC, le polypeptide d'interféron produit dans des bactéries protège également des cellules de callitriche africain V3 contre une infection par le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) in vitro. En outre, comme l'interféron de fibroblaste natif, le polypeptide d'interféron bactérien s'est également avéré être capable d'augmenter l'activité léthale naturelle de lymphocytes humains in vitro.
La protéine analogue à l'interféron génétiquement engendrée est principalement destinée à l'usage pour le traitement de maladies et elle sera utilisée en quantités efficaces, éventuellement en combinaison avec un excipient
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d'études utilisant des interférons humains natifs ont consi-
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rence internationales par jour pendant diverses périodes
(voir, par exemple, Scott G.M. et Tyrell D.A.J., (1980), Brit. Med. J., 280, 1558-1562). On prévoit que le régime de traitement préféré sera amené à varier en fonction du type et de la gravité de la maladie. Le polypeptide d'interféron produit à partir de bactéries peut manifester des activités différentes et des propriétés pharmacocinétiques différentes par -rapport à l'interféron de fibroblaste natif dans certaines circonstances.
On a également utilisé l'ADN de recombinant d' interféron pour trier des bancs de gènes humains quant à la présence de clones contenant le gène d'interféron chromosomial. On a obtenu ce dernier en extrayant d'abord le fragment de restriction à l'Hind III contenant le gène d'interféron d'un plasmide de recombinant pWT 221, en radiomarquant et en hybridant ensuite à des plaques produites par la transfection de bactéries avec une collection d'hybrides
<EMI ID=52.1> spécifiquement le gène d'interféron de sondage ont été puri-
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a ensuite été séquence et la séquence est présentée dans le schéma J qui accompagne le présent mémoire.
On a observé une séquence de gène ininterrompue identique à celle illustrée dans le schéma F qui accompagne le présent mémoire, immédiatement suivie d'une séquence correspondant à la séquence de mARN d'interféron non traduite en 3' qui a été antérieurement déterminée (voir, par
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Derynck R. et coll., (1980), Nature, 285, 542-547). Cette observation indique qu'il n'existe pas de séquences interposées (introns) dans le gène d'interféron de fibroblaste particulier dans le génome.
Au surplus, les courtes séquences de gène en amont et en aval du gène d'interféron ont également été déterminées. La région de flanquement en amont peut constituer une partie de la séquence d'initiation à l'ARN polymérase/promoteur qui règle la transcription du gène d'interféron dans les fibroblastes humains (voir, par exemple,
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Il apparaît que les bactéries ne peuvent pas fidèlement exprimer des gènes eucaryotes contenant des introns et, de la sorte, une implication de ce qui précède réside dans le fait qu'il serait possible d'induire des bactéries pour produire des interférons humains en les
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de bancs de gènes humains aisément disponibles et une telle solution offre des avantages par rapport à l'isole-
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eucaryotes induites, la synthèse du'gène à cADN in vitro, la transformation de bactéries, etc. Etant donné qu'il apparaît que les gènes d'interféron ne contiennent en
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de leucocyte en est également dépourvu (voir, par exemple,
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telle solution pourrait être appliquée à divers gènes d' interféron.
En utilisant le gène d'interféron clone, c.à.d. le gène à cADN, comme sonde pour des séquences homologues dans l'ADN génomial total restreint avec toute une variété d'enzymes de restriction, la présence d'un type prédominant de gène d'interféron de fibroblaste pourrait être observée
(voir, par exemple, Houghton M. et coll., loc cit).
Cependant, il n'y avait pas de manifestation de la présence d'autres gènes qui étaient partiellement homologues à la sonde (ibid). La possibilité subsiste par conséquent que d'autres gènes d'interférons pourraient être isolés (à partir de produits de digestion soumis à restriction de l'ADN génomial total ou directement à partir de bancs de gènes chromosomiaux humains) en utilisant le présent gène d'interféron clone particulier. Au surplus, ayant utilisé avec succès des oligonucléotides spécifiques pour déceler des recombinants bactériens contenant des gènes d'interféron
(voir (11) ci-dessous), il est à présent réalisable d'utiliser des oligonucléotides choisis pour déceler et isoler
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gènes chromosomiaux humains ou présents dans un produit de digestion sous restriction de l'ADN génomial total. Par exemple, la présente séquence de gène d'interféron manifeste certaines similitudes avec des gènes de leucocytes humains
(voir, par exemple, Taniguchi T. et coll., (1980), Nature,
285, 547, et Streuli M. et coll., (1980), Science, 209,
1343-1347). Par l'emploi d'une sonde oligonucléotidique
qui est commune entre les séquences de gène d'interféron
de fibroblastes et de leucocytes, il est possible d'isoler
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humains par exemple. De manière similaire, on pourrait obtenir d'autres gènes d'interféron partiellement homologues par l'emploi d'autres oligonucléotides homologues à différentes régions du présent gène d'interféron clone. Une telle approche peut être plus efficace que la simple utilisation du gène d'interféron de fibroblaste cloné entier comme sonde pour les gènes partiellement homologues, en raison d'une
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par l'utilisation d'oligonucléotides spécifiques.
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d'interféron indiquent qu'elles peuvent coder pour une fonction commune manifestée par les divers polypeptides d'interféron. Par conséquent, la séquence de gène codant pour les 50-60 aminoacides approximativement à l'extrémité carboxyle de la molécule, peut être d'une importance particulière et il faut comprendre que le produit d'un recombinant contenant un tel sous-gène ou une partie de celui-ci peut être d'une valeur particulière. De manière similaire, d'autres sous-gènes (qu'ils présentent une certaine homologie avec d'autres séquences de gène d'interféron ou non) peuvent également être d'une valeur particulière.
Il faut également comprendre que la séquence de gène d'interféron de fibroblaste peut être limitée quant à l'expression dans des bactéries en raison de l'emploi de codons qui peuvent être peu fréquemment utilisés dans des molécules de mARN bactérien. Par conséquent, il est clair qu'en changeant certains codons de gène d'interféron, en manière telle qu'ils continueront encore d'encoder le même aminoacide, mais qu'ils seront plus efficacement traduits par l'appareil de traduction bactérien, on peut améliorer
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pour décider quels sont les codons, s'il y en a, qui tireraient bénéfice de l'ajustement, peut être basée sur l'usage de codon observé dans des molécules de mARN procaryotes
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De même, il faut bien comprendre que le clonage
du gène d'interféron contenant additionnellement l'ADN pour la séquence de.signal prépeptidique peut entratner un certain avantage. Par exemple, l'interféron produit peut être séquestré dans l'espace périplasmique, éventuellement après clivage ou scission de la séquence de signal. Au surplus, la conformation de l'interféron polypeptidique peut être plus similaire à l'état naturel, en comparaison de celui obtenu par l'expression directe de la séquence de gène ne codant seulement
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l'interféron produit peut être supérieure.
D'autres techniques de production de l'interféron par fabrication génétique comprennent l'introduction du gène d'interféron nécessaire dans des cellules eucaryotes, par exemple des cellules L de souris ou des cellules de levure.
On peut transformer des cellules L de souris avec de l'ADN exogène et ceci peut s'effectuer avec des gènes d'interféron humain selon un certain nombre de manières différentes. Par exemple, un gène d'interféron chromosomial contenant la totalité de la séquence à ADN nécessaire à l'initiation correcte par l'ARN polymérase pourrait être cloné dans les cellules de souris, de manière à permettre ainsi la transcription et l'expression subséquente.
En alternative, un gène d'interféron dépourvu de cette séquence de promoteur pourrait être soudé à un autre morceau d'ADN eucaryote contenant un promoteur, par exemple le gène de thymidin� kinase que l'on utilise comme base pour la sélection du transformant (voir, par exemple, bigler M.
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la transcription du gène d'interféron se déroulerait par l'intermédiaire de la séquence de gène soudée ou liée.
Il est également possible que la transformation de cellules L avec un gène d'interféron dépourvu d'une séquence de promoteur puisse encore entraîner l'expression de l'ADN, en raison de l'insertion fortuite dans des régions particulières du génome.
Certains plasmides habitent aussi des cellules de levure et des gènes d'interféron pourraient être introduits dans de tels plasmides ou des versions convenablement modifiées de ces plasmides, de façon à obtenir l'expression de l'ADN hétérologue et le rendement en polypeptide d'interféron.
Il est possible que l'interféron produit par mise en oeuvre de tels procédés puisse être d'une efficacité et d'une activité biologique supérieures à celles de l'interféron produit dans des procaryotes où certaines modifications importantes ne peuvent pas être apportées à la protéine eucaryote. Le rendement en interféron peut également être supérieur dans ces systèmes eucaryotes.
Par conséquent, selon une première de ses formes de réalisation, la présente invention a pour objet un gène pour l'expression d'une protéine possédant des propriétés ressemblant à celles de l'interféron humain, caractérisé en ce qu'il comprend un brin codeur et un brin complémentaire, le brin codeur comprenant la séquence :
<EMI ID=69.1>
ou une sous-unité ou un équivalent de ce gène.
(Il faut comprendre que ce que l'on appelle
<EMI ID=70.1>
Ce qui figure ci-dessus correspond à la séquence codant l'mARN entière plus les séquences de gène en amont et en aval, obtenues en isolant le gène d'un banc de gènes chromosomiaux et en procédant à une séquentialisation.
Selon une autre de ses formes de réalisation,
<EMI ID=71.1>
codeur comprend la séquence qui suit :
<EMI ID=72.1>
ou une sous-unité ou un équivalent de ce gène.
Ceci correspond à la séquence qui a été décrite plus haut avec une certaine séquence aval supplémentaire.
La présente invention a également pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit :
<EMI ID=73.1>
ou une sous-unité de ce gène.
Ceci constitue une forme polymorphe de la séquence décrite plus haut.
Certaines parties particulières de tels gènes constituent également des formes de réalisation de la présente invention.
Par conséquent, selon l'une de ses formes de réalisation particulières, la présente invention a pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit :
<EMI ID=74.1>
ou un équivalent de ce gène.
Avec l'addition éventuelle d'un ou deux restes ou résidus A à l'extrémité 3', ceci constitue la séquence
<EMI ID=75.1>
Selon une autre de ses formes de réalisation particulières; la présente invention a pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit :
<EMI ID=76.1>
ou un équivalent de ce gène.
Ceci correspond à la séquence de gène codant pour le prépeptide et la protéine mûre.
La présente invention a également pour objet un gène dont le brin codeur comprend la séquence qui suit :
<EMI ID=77.1>
<EMI ID=78.1>
ou un équivalent de ce gène.
Ceci correspond à la séquence de gène codant pour la protéine mûre.
Les sous-unités de ces gènes constituent également des formes de réalisation de la présente invention.
L'invention concerne également un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de ce gène, conforme à l'une quelconque des trois premières formes de réalisation susmentionnées de l'invention, caractérisé en ce que l'on utilise, comme sonde, une molécule possédant une séquence d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de ce gène conforme à l'une quelconque des autres formes de réalisation susmentionnées de l'invention, afin d'isoler de l'ADN chromosomial humain un gène d'interféron chromosomial humain.
Il faut comprendre que bien que l'on puisse initialement utiliser de l'ADN monocaténaire ou bicaténaire comme sonde, un brin monocaténaire sera présent à l'étape d'hybridation.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de celui-ci, conforme à l'une quelconque des formes de réalisation susmentionnées de l'invention, autres que les trois premières, caractérisé
en ce que l'on isole le polyA-mARN de cellules de fibroblastes induites, on synthétise du cADN monocaténaire en utilisant un oligo dT amorceur et on en synthétise de
l'ADN bicaténaire en utilisant de la transcriptase réverse ou de l'ADN polymérase I de E. coli et éventuellement un amorceur.
Il est préférable d'utiliser un amorceur au cours de la troisième étape de ce procédé. De manière générale, on fractionne le mélange réactionnel après la seconde étape et/ou après la troisième étape. On inhibe de préférence l'autoamorçage après la seconde étape. On peut identifier le produit, après clonage, en utilisant un amorceur pour trier les colonies.
La présente invention concerne aussi un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de celui-ci, conforme à l'une quelconque des formes de réalisation susmentionnées de l'invention, autre que les trois premières, caractérisé en ce que l'on isole le mARN de cellules de fibroblastes induites, on synthétise du cADN monocaténaire en utilisant un amorceur spécifique et de la transcriptase réverse et on en synthétise de l'ADN bicaténaire en utilisant de la transcriptase réverse ou de l'ADN polymérase I de E. coli et éventuellement un amorceur.
On peut considérer que ceci constitue une variante du procédé susmentionné.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'un gène ou d'un équivalent de gène ou d'une sous-unité de celui-ci qui possède une partie commune à ou apparentée à une partie d'un gène ou d'un équivalent de ce gène ou d'une sous-unité de celui-ci, conforme à l'une quelconque des trois premières formes de réalisation susmentionnées de l'invention, caractérisé en ce que l'on utilise, comme sonde, une molécule possédant une séquence correspondant à au moins une partie d'une
<EMI ID=79.1>
chromosomial humain à partir de l'ADN chromosomial humain.
La présente invention concerne également un recombinant de plasmide, caractérisé en ce qu'il comprend . un vecteur de plasmide dans lequel est inséré, à un site d'insertion, un gène ou une sous-unité de ce gène ou un équivalent de celui-ci, le recombinant de plasmide permettant la traduction dans la phase correcte pour le mARN correspondant au gène ou à la sous-unité de ce gène ou à l'équivalent de ce gène inséré et possédant un promoteur bactérien en amont de et adjacent au site d'insertion, de
<EMI ID=80.1>
équivalent de ce gène inséré se trouve sous contrôle d'un promoteur bactérien. Il peut être considéré comme avantageux d'insérer une multiplicité de fragments d'ADN. De manière similaire, on peut trouver souhaitable d'utiliser une multiplicité de promoteurs bactériens. Il est particulièrement avantageux d'utiliser un recombinant de plasmide qui est dépourvu d'au moins une partie de la séquence d'ADN responsable de l'atténuation de la transcription. Un exemple particulier d'un recombinant de plasmide préféré comprend un dérivé modifié de pWT 501. Dans certaines circonstances, on peut tirer bénéfice du fait que l'ADN inséré code également pour un codon d'initiation et/ou au moins une partie d'un site de liaison ou soudure de ribosome.
La production d'un tel recombinant de plasmide par mise en oeuvre d'un procédé caractérisé en ce que l'on insère l'ADN au site d'insertion d'un vecteur de plasmide approprié constitue également une forme de réalisation de la présente invention.
Dans un cas particulier, un tel procédé peut comprendre l'isolement d'un fragment d'Hind III d'environ
150 bp contenant un promoteur de trp à partir du pWT 501, l'autosoudure, la digestion partielle avec du Taq I, le traitement par de la SI nuclease, le traitement par de l'ADN polymérase I de E. coli, la restriction avec Hind III, l'isolement d'un fragment d'environ 100 bp contenant le promoteur de trp, la soudure à un fragment d'environ 700 bp
<EMI ID=81.1>
nant le gène ou une sous-unité de ce gène ou un équivalent de ce gène par du Sac I, de la SI nucléase, de l'ADN polymérase I de E. coli et de l'Hind III, la restriction avec l'Hind III et la soudure au pAT 153 traité par une phosphatase alcaline bactérienne, ayant subi une restriction
à l'Hind III.
La présente invention a également pour objet une cellule caractérisée en ce qu'elle comporte à l'état inséré, un gène tel que décrit plus haut ou une sous-unité de ce gène ou un équivalent de celui-ci, ou un recombinant de plasmide tel que décrit plus haut.
Dans le cas préféré, la cellule est une cellule K-12 HB 101 d'E. coli.
La production d'une telle cellule par mise en oeuvre d'un procédé caractérisé en ce que l'on insère l'ADN ou le recombinant de plasmide dans une cellule constitue également une forme de réalisation de la présente invention.
Selon une autre de ses formes de réalisation, la
<EMI ID=82.1>
une protéine possédant des propriétés qui ressemblent à celles de l'interféron humain, caractérisé en ce que l'on cultive une cellule du genre susmentionné et on récupère la protéine exprimée.
On donne ci-dessous des formes de réalisation illustratives et non limitatives de la présente invention.
(1) Synthèse des oligodésoxynucléotides
<EMI ID=83.1>
(IFIII), GpApGpGpApGpApTpTpApApG (IFIV) et CpCpTpGpGpApAp GpApApA (IFV) ont été synthétisés par une méthodologie
au triester classique (voir, par exemple, Hsiung H.M. et coll., (1979), Nucl. Acids Res., 6, 1371-1385) et conformément au schéma réactionnel représenté sur la figure 4 des
<EMI ID=84.1>
On a débloqué les oligonucléotides totalement protégés
avec de l'acide benzènesulfonique à 2 % (p/v), du fluorure de tétraéthylammonium 0,1 M dans un mélange de tétrahydrofuranne (THF)/pyridine/H20 (8/1/1 en volume), cette opération étant suivie du traitement par de l'ammoniac. On a purifié les oligonucléotides débloqués par une chromatographie en phase liquide sous pression élevée (HPLC) sur de la silice microparticulaire "Partisil 10 SAX" que l'on a soumise à une dérivation avec des groupes ammonium quaternaire
(Whatman).
(2) Phosphorylation des oligonucléotides
On a incubé chaque oligonucléotide synthétique
<EMI ID=85.1>
cal Centre, Amersham, Buckinghamshire, Angleterre; activité spécifique >5000 Ci/mmole) et 3 unités de polynucléotide kinase (EC 2.7.1.78), (1 unité est la quantité qui catalyse
<EMI ID=86.1>
incubation pendant 30 minutes à 37[deg.]C selon Richardson C.C.,
(1972), Progress in Nucleic Acids Research, 2, 815), dans
<EMI ID=87.1>
(chlorhydrate de tris (hydroxyméthyl) aminométhane) pH 9,0 ,
<EMI ID=88.1>
éthylène-diaminetétra-acétique), 0,1 mM de spermidine et
<EMI ID=89.1>
lorsque la plupart des molécules de l'amorceur furent marquées, on a soit dilué le mélange jusqu'à 200 ul et
<EMI ID=90.1>
(SDS) et à 10 mM d'EDTA et, étant donné que peu d'oligo-
<EMI ID=91.1>
secoué avec un égal volume de phénol saturé d'eau et secoué de nouveau après l'addition du même volume de chloroforme, centrifugé (10.000 x g; 2 minutes) et extrait la phase aqueuse résultante comme décrit ci-dessus, que l'on a ensuite extraite à deux reprises avec un égal volume de chloroforme et ensuite concentrée par précipitation à l'éthanol (ce qui a impliqué l'ajustement de la concentration en NaCl à 200 mM, l'addition de 2,5 volumes d'éthanol
<EMI ID=92.1>
IB), soit simplement chauffé à 100[deg.]C pendant 5 minutes
(IFII, III, IV et V).
(3) Isolement de poly A - mARN
Des bouteilles montées sur des rouleaux 20 1 de fibroblastes humains (FS-4)(provenant de cellules de prépuce humain) ou 17/1 (provenant de cellules de poumons d'embryons humains) ont été amorcées jusqu'au lendemain à l'aide d'interféron homologue (60 unités de référence internationales/ml) avant d'être superinduites pendant
5 heures avec du poly(I):poly(C), (30 ug/ml) et du
<EMI ID=93.1>
n'ont pas reçu de poly(I):poly(C). On a enlevé les cellules de la surface de verre par un bref traitement à l'aide d' une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1,25 mg/ml de trypsine (EC 3.4.4.4), 0,5 mg/ml d'EDTA, <EMI ID=94.1>
milieu R.P.M.I. 1640 (modification de Searle, Flow Labora-
<EMI ID=95.1>
(v/v) de sérum de veau. Après avoir rapidement lavé les culots (1.000 x g, 5 minutes) avec du R.P.M.I. 1640 contenant 2 ug/ml de cycloheximide, on a lysé les cellules par homogénéisation dans du Tris-HCl 0,2 M, pH 9, du NaCl 50 mM, de l'EDTA 10 mM, du SDS 0,5 % (p/v), 1 mg/ml d'héparine et on les a ensuite déprotéinisées à l'aide d'un égal volume de phénol équilibré dans le tampon susmentionné (sans héparine), cette opération étant suivie de trois extractions
<EMI ID=96.1>
tamponné (1:1 v/v). Après la précipitation à l'éthanol et la dissolution, on a sélectivement précipité l'ARN avec du NaCl 3M et on a isolé le mARN polyadénylé par chromatographie à l'oligo (dT) - cellulose (voir, par exemple,
<EMI ID=97.1>
1408-1412).
(4) Transcription réverse du mARN de fibroblaste en utilisant
IFIA et IB
On a incubé 75 pmoles de 5'-oligonucléotide
<EMI ID=98.1>
fibroblaste contenant du poly(A) à 25[deg.]C pendant 1 heure dans 36 pl de KC1 0,4 M, de manière à permettre à l'amorceur
<EMI ID=99.1>
On a ensuite dilué le produit ainsi obtenu avec un mélange de transcription de façon à obtenir une solution finale contenant 0,5 mM de chacun de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 4 mM de MgCl2, 60 mM de KCl, 5 mM de DTT, 0,01 % (v/v) de Triton X-100 (détergent non
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
mARN, 20 unités/ml d'inhibiteur de ribonucléase de foie
de rat (1 unité est la quantité qui donne une inhibition de
<EMI ID=102.1>
(1961), Biochim. Biophys. Acta, 51, 37), (voir, par exemple, Gribnau A.A.M. et coll., (1969), Arch. Biochem. Biophys.,
130, 48-52) et 100 unités/ml d'AMY (virus de la myéloblastose aviaire) de transcriptase réverse (1 unité est la quantité qui incorpore 1 n mole de dTMP dans le produit précipitable à l'acide après incubation pendant 10 minutes à 37[deg.]C selon Houts G.E. et coll., (1979), J. Virol., 29, 517). On a poursuivi l'incubation pendant 60 minutes à 37[deg.]C et on a ensuite
<EMI ID=103.1>
concentré par précipitation à l'éthanol (voir (2) ci-dessus).
(5) Analyse des produits de la transcription réverse obtenus
avec IFIA et IB
On a dissous les produits précipités à l'éthanol dans de l'eau et on les a incubés en présence de NaOH 0,1 M et d'EDTA 1 mM à 37[deg.]C pendant 30 minutes. On a ensuite ajouté un égal volume d'urée 10 M, de saccharose 25 % (p/v), de
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
90 secondes avant de l'appliquer à de l'urée 7M contenant
du gel de polyacrylamide (12,5 % p/v) (voir, par exemple, Maxam A. et Gilbert W., (1977), Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
74, 560-564). Après l'électrophorèse, on a autographié le
gel afin de localiser la position des molécules marquées.
Le produit marqué d'environ 150 nucléotides et produit uniquement par du mARN à partir de cellules induites, a ensuite été élué de la tranche de gel et on a déterminé sa séquence
(voir, par exemple, Maxam et Gilbert, loc cit). La séquence est illustrée par le schéma B qui accompagne le présent mémoire.
<EMI ID=106.1>
blastes
On a préparé le cADN en incubant le mélange
<EMI ID=107.1>
50 mM de Tris-HCl, pH 8, 10 mM de MgCl2, 0,01 % (v/v) de
<EMI ID=108.1>
100 unités/ml d'AMV de transcriptase réverse. Après l'incubation, on a extrait le mélange à l'aide de phénol et de chloroforme et on l'a précipité à l'éthanol (voir (2) ci-dessus). On a récupéré l'ADN par centrifugation, on l'a séché et dissous dans 200 ni de NaOH 0,3 N. Après incubation pendant 1 heure à 50[deg.]C, on l'a neutralisé et élué sous forme du pic exclu d'une colonne de G50 (M) Sephadex, polymère de dextrane modifié, réticulé, particulaire (Pharmacia)
<EMI ID=109.1>
(p/v). On a rassemblé les fractions du pic et on les a concentrées par précipitation à l'éthanol.
(7) Transcription de cADN avec des oligonucléotides IFII,
III, IV et V
On a préincubé le 5'-oligonucléotide marqué au
<EMI ID=110.1>
<EMI ID=111.1>
obtenu à 37[deg.]C pendant 3 heures dans une solution finale contenant alors 0,01 % (v/v) de Triton X-100, 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 20 mM de DTT, 10 mM d'acétate de magnésium, 0,5 mM de chacun de dATP, dCTP, dGTP et dTTP, 80 mM de KC1,
1.000 unités/ml de transcriptase réverse d'AMV du 5'-oligo-
<EMI ID=112.1>
naire (17,6 �g/ml). Après l'extraction par du phénol et du chloroforme, on a fait passer la phase aqueuse à travers
une colonne de G50 (M) Sephadex dans du NaCl 50 mM, du SDS 0,1 % (p/v) et on a précipité la fraction exclue à l'aide d'éthanol, on l'a dissoute et on l'a soumise à une électrophorèse.
(8) Analyse de transcrits produits par IFII, III, IV et V
On a traité les transcrits de la manière décrite plus haut, c.à.d. pour des transcrits produits par IFIA et IB
<EMI ID=113.1>
(p/v) dans de l'urée 7M, ou bien on les a préparés et soumis à une électrophorèse à travers des gels d'agarose (1,4 % p/v) natifs (voir, par exemple, Sharp P.A. et coll., (1973), Biochemistry, 12, 3055-3063), que l'on a ensuite autoradiographiés. On a ensuite élue les gènes d'interféron à partir de tranches de gel d'agarose choisies d'abord par passage à travers une aiguille de seringue 19G, puis une aiguille de seringue 21G (Gillette) et agitation des fragments de gel
<EMI ID=114.1>
<EMI ID=115.1>
pH 7, de l'EDTA 0,1 mM et du Triton X-100 (0,02 % - v/v).
Après centrifugation (700 x g, 5 minutes) à travers un tampon de laine de verre posé sur un papier filtre GF/C et GF/B
(Whatman), on a extrait le filtrat au phénol et au chloroforme et on l'a ensuite précipité à l'éthanol.
On a ensuite séquence l'ADN comme mentionné plus haut.
(9) Préparation de gènes d'interféron pour le clonage
(a) Production de cADN monocaténaire à partir de polyA-mARN total isolé de fibroblastes induits :
On a synthétisé le cADN dans un milieu d'incubation de 20 ml contenant les constituants décrits plus haut
- (6). Après l'extraction à l'aide de phénol et de chloroforme, on a chromatographié la phase aqueuse sur une colonne de Sephadex G50 (M) (28 x 4 cm) à partir de laquelle on a élue le cADN dans la fraction exclue dans du NaCl 50 mM, SDS 0,1 Il/. (p/v). On a précipité le cADN avec de l'éthanol et on l'a ensuite récupéré, dissous dans 0,4 ml de NaOH <EMI ID=116.1>
être centrifugé à travers un gradient de saccharose alcalin comme décrit ci-dessous.
(b) Purification du cADN monocaténaire d'interféron :
On a divisé le cADN ci-dessus en deux parties
<EMI ID=117.1>
pendant 24 heures dans un rotor SW 41 de Beckmann, à travers
<EMI ID=118.1>
contenant du NaOH 0,2 N, du NaCl 100 mM et de l'EDTA 10 mM.
On a recueilli des fractions de 0,5 ml par déplacement
<EMI ID=119.1>
rassemblé les fractions correspondantes des deux gradients, on les a neutralisées et précipitées à l'aide d'éthanol absolu. On a recueilli les précipités par centrifugation, on les a lavés dans de l'éthanol absolu et on les a ensuite
<EMI ID=120.1>
tenant des transcrits de cADN d'interféron par analyse des produits obtenus après l'amorçage de petites parties aliquotes de chaque fraction à l'aide de (32p) IFIII et de transcriptase réverse, de la manière décrite plus haut (7) et (8).
On a rassemblé les fractions principales qui avaient donné lieu à la synthèse d'une molécule d'ADN d'interféron d'une longueur d'environ 700 nucléotides dans une préparation pour une synthèse à grande échelle de gènes d'interféron à double brin.
(c) Inhibition de l'activité autoamorçante du cADN monocaténaire d'interféron purifié :
Avant de procéder à une préparation à grande échelle de gènes d'interféron à double brin, on a réduit l'activité autoamorçante du cADN monocaténaire d'interféron purifié (lorsqu'il était subséquemment incubé avec de la transcriptase réverse) en incubant le cADN à 37[deg.]C pendant
3 heures dans 1,5 ml d'un milieu contenant du cacodylate de
<EMI ID=121.1>
<EMI ID=122.1>
mM et 600 unités/ml de transférase terminale (EC 2.7.7.31)
(1 unité est la quantité qui incorpore 1 n mole de dATP dans le produit précipitable à l'acide en l'espace d'une heure à 37[deg.]C en utilisant du d(pA)50 comme amorceur, selon
<EMI ID=123.1>
70).
Après l'extraction à l'aide de phénol et de chloroforme, réalisée de la manière décrite plus haut, on a rendu la phase aqueuse 0,3 normale en NaOH et on l'a incubée pendant 1 heure à 50[deg.]C. On a ensuite neutralisé
le mélange et on l'a chromatographié sur une colonne Sephadex G50 (moyen) (20 x 2 cm) et on a élue le cADN dans
<EMI ID=124.1>
<EMI ID=125.1>
<EMI ID=126.1>
Le résultat de la mise en oeuvre de ce procédé réside dans l'addition d'un reste d'AMP simple à l'extrémité 3'-hydroxyle du cADN. Le traitement à l'alcali engendre également un mélange de restes 2' et 3' phosphate à cette extrémité qui ne peut plus prendre part à une réaction d' autoamorçage avec de la transcriptase réverse. Par conséquent, lorsque des gènes bicaténaires sont subséquemment préparés en utilisant un oligonucléotide pour amorcer la transcription spécifique sur le cADN monocaténaire, la proportion de produits autoamorcés contaminants est réduite et le cADN monocaténaire résiduel peut subséquemment être dégradé par la SI nucléase (EC 3.1.4.21).
On peut également très fortement inhiber l'activité autoamorçante par la préincubation du cADN dans des mélanges tampons appropriés avec de la transcriptase reverse ou de la transcriptase terminale, en présence des quatre didésoxynucléosides triphosphates. On peut aussi incuber
<EMI ID=127.1>
triphosphate, de manière à produire une queue de poly(dA) à l'extrémité 3*-hydroxyle, ce qui inhibe également efficacement l'activité autoamorçante.
(d) Synthèse de gènes d'interféron bicaténaires en <EMI ID=128.1>
On a purifié le cADN monocaténaire d'interféron par centrifugation à travers un gradient de saccharose alcalin et on a réduit son activité autoamorçante de la manière décrite plus haut. On a ensuite préincubé 20 �g de cette matière à 25[deg.]C pendant 2 heures dans 0,36 ml contenant du KCl 0,4 M et 575 pmoles de IFIII que l'on avait préalablement incubé avec de la polynucléotide kinase
(EC 2.7.1.78) et du (y_32p) ATP, également de la manière
<EMI ID=129.1>
naires par incubation plus poussée à 37[deg.]C pendant 3 heures dans 1,8 ml de milieu contenant alors du Triton X-100
<EMI ID=130.1>
de l'acétate de magnésium (10 mM), du dATP, du dCTP, du dGTP et du dTTP (0,5 mM), de la transcriptasé réverse
<EMI ID=131.1>
phénol et de chloroforme, on a élue les gènes à partir d'une colonne de Sephadex G50 (moyen) (20 x 2 cm) dans du NaCl
<EMI ID=132.1>
<EMI ID=133.1>
du NaCl à 0,2 M avant de procéder à la précipitation avec 2,5 volumes d'éthanol absolu. Après repos à -70[deg.]C pendant
30 minutes, on a recueilli le précipité par filtration et
<EMI ID=134.1>
(e) Purification de gènes d'interféron à double brin :
On a sédimenté l'ADN à travers un gradient de
<EMI ID=135.1> <EMI ID=136.1>
<EMI ID=137.1>
de Beckmann à 42.000 tpm pendant 18 heures à 2[deg.]C, puis on a recueilli des fractions de 0,2 ml du produit et on les a
<EMI ID=138.1>
gation, on l'a redissous et on en a ensuite soumis de peti-
<EMI ID=139.1>
<EMI ID=140.1>
on a ensuite passé à l'autoradiographie du produit.
On a rassemblé les fractions présentant la molécule d'ADN d'interféron de 700 nucléotides.
(f) Préparation de gènes d'interféron contenant des liants d'Hind III à leurs extrémités :
On a d'abord traité les fractions de gradients rassemblées susmentionnées par de la SI nucléase par incubation à 37[deg.]C pendant 30 minutes dans 50 fil d'un milieu
<EMI ID=141.1>
<EMI ID=142.1>
té est la quantité qui solubilise 10 �g d'acide nucléique en 10 minutes à 45[deg.]C selon Vogt V.M., (1973), Eur. J.
<EMI ID=143.1>
Après l'addition de 0,5 fil de SDS à 10 % (p/v), de 1 fil d'EDTA 0,5 M et de 1 ni de Tris-HCl 0,5 M, pH 8,3 , on a extrait le mélange avec du phénol et du chloroforme et on a précipité la phase aqueuse à l'aide d'éthanol. A ce
<EMI ID=144.1>
Afin de garantir la présence d'extrémités "émoussées" pour la soudure subséquente avec des molécules de liant d'Hind III, on a récupéré l'ADN à partir d'éthanol et on l'a incubé pendant 20 minutes à 14[deg.]C dans 50 fil d'un
<EMI ID=145.1>
du 2-mercaptoéthanol 1 mM, du dATP 0,2 mM, du dCTP 0,2 mM,
<EMI ID=146.1>
<EMI ID=147.1>
qui incorpore 10 n moles de nucléotides totaux dans une fraction précipitable à l'acide, en l'espace de 30 minutes, à 37[deg.]C, en utilisant du poly-d(A-T) comme amorceur, selon Richardson C.C. et coll., (1964), J. Biol. Chem., 239, 222). On a ensuite extrait l'ADN de la manière habituelle, on l'a précipité à l'éthanol et on a ensuite séché le culot obtenu par centrifugation.
<EMI ID=148.1>
(Collaborative Research) d'abord par incubation à 37[deg.]C pendant 30 minutes dans 50 fil d'un milieu contenant 50 mM de
<EMI ID=149.1>
éthanol, 0,25 mM de (y_32p) ATP (20 mCi/nmole) , 50 �g/ml de BSA (albumine de sérum bovin) et 100 unités/ml de polynucléotide kinase. Pour garantir une phosphorylation complète, on a incubé le mélange pendant 30 minutes supplémentaires à 37[deg.]C après l'addition de 10 fil d'un milieu conte-
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rATP et 500 unités/ml de polynucléotide kinase. On a ensuite extrait le mélange avec du phénol et du chloroforme et on l'a précipité avec de l'éthanol après l'addition de tARN
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La soudure des liants d'Hind III phosphorylés aux gènes d'interféron a été réalisée en dissolvant le culot de gène d'interféron dans 40 [il d'un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgCl2 10 mM, du rATP 1 mM,
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(1968), J. Biol. Chem., 243, 4543). On a ensuite incubé ce produit à 25[deg.]C pendant 16 heures.
Ces conditions ont engendré un excès environ centuple de liant par rapport à l'ADN.
Après le chauffage du mélange à 65[deg.]C pendant
5 minutes, on a restreint l'ADN à l'aide d'Hind III par l'addition de 60 fil d'un mélange contenant 400 unités/si
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éthanol. Après l'incubation à 37[deg.]C pendant 2 heures, on a amené le mélange à une concentration de SDS de 0,2 % (p/v)
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ADN avec du phénol et du chloroforme et on a ajouté du tARN de levure à la phase aqueuse finale de façon à obtenir une
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produit sur une colonne de Sephadex G150 superfin (50 x 0,7 cm) d'où on a élué les gènes bicaténaires dans la fraction
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produit avec de l'éthanol après avoir amené les concentrations en tARN à 10 �g/ml. On a estimé que l'ADN récupéré
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(g) Fractionnement final des gènes d'interféron :
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d'agarose à 1,4 % (p/v) (20 x 14 x 0,5 cm) pendant 2 heures à 120 volts. On a ensuite élué l'ADN correspondant à une longueur de 600 à 1000 bp du gel, de la manière suivante :
on a excisé la tranche appropriée et on l'a fait passer à travers une aiguille 21G (Gillette). On a lavé cette der-
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de levure et on a congelé la tranche à -70[deg.]C. On l'a ensuite
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la filtrer à travers un papier Whatman n[deg.] 52. On a ajusté le filtrat à une concentration en acétate d'ammonium de 0,1 M, d'acétate de magnésium de 2 mM, de SDS de 0,02 %
(p/v) et on l'a lié à une colonne de 1 ml de diéthylaminoéthyl (DEAE) 52 cellulose. On a ensuite procédé à un triple lavage avec des parties aliquotes de 1,5 ml du tampon susmentionné avant de procéder à l'élution de l'ADN avec des fractions aliquotes de 0,5 ml de NaCl 1,1 M, d'acétate d'
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(p/v) et d'EDTA 0,02 mM. On a ensuite complété l'ADN élue avec les seconde et troisième fractions aliquotes qui furent
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le produit à l'éthanol. On a récupéré le précipité par centrifugation, on l'a lavé à l'éthanol absolu, on l'a séché et on l'a dissous dans 20 fil d'eau. On a prélevé 4 fil pour un comptage à scintillation liquide et on a séché le résidu (environ 8 ng) par dessiccation sous vide.
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On a préparé les vecteurs de la manière suivante:
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on l'a extrait à l'aide de phénol et de chloroforme et on l'a précipité à l' éthanol. On a ensuite incubé le plasmide linéaire récupéré à 65[deg.]C pendant 30 minutes dans 25 fil d'un
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de SDS et 0,7 mg/ml de phosphatase alcaline bactérienne
(EC 3.1.3.1), avant de procéder à une triple extraction avec du chloroforme et du phénol, à une double extraction avec de l'éther et à une nouvelle précipitation à l'éthanol. On a
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On a ensuite dissous le culot de gène séché
(voir (9 - g) ci-dessus) dans 10 ul d'un milieu contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgCl2 10 mM, du rATP 1 mM, du DTT 20 mM, 10 �g/ml d'ADN de vecteur traité et environ
16 unités/ml d'ADN ligase de T4. On a ensuite incubé ce
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100 fil avec du Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 , de l'EDTA 1 mM, du NaCl 0,1 M et on l'a ainsi utilisé pour transformer E. coli
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Curtiss R., III, et coll., (1976), Recombinant Molecules :
Impact on Science and Society (R.F. Beers, Jr. et E.G. Bassett (Eds.), 45-56). De cette manière, on a obtenu un total de 370 transformants résistant à l'ampicilline
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étaient sensibles à la tétracycline et on les a par conséquent identifiés comme étant des recombinants. On a ensuite fait croître 160 de ces derniers sur des filtres millipores posés par dessus des plaques de culture afin d'identifier les recombinants de gène d'interféron par hybridation de
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(11) Triage des récombinants
On a fait croître des recombinants sur des filtres de nitrocellulose (diamètre : 9 cm) jusqu'à ce que les colonies eussent atteint un diamètre de 2 ou 3 mm. Après avoir soulevé les filtres des plaques, on les a placés pendant 7 minutes sur un tampon de papiers filtres Whatman n[deg.] 1 trempés dans du" NaOH 0,5 N. puis pendant 2 minutes sur
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pendant 7 minutes sur un tampon trempé dans du Tris-HCl
0,5 M, pH 7,5 et du NaCl 1,5 M. On a ensuite séché les filtres en les plaçant sur une tubulure d'aspiration de vide pendant environ 5 minutes et on les a finalement lavés avec 100 ml d'éthanol absolu avant de les chauffer pendant
2 heures à une température de 80 à 85[deg.]C. 0
On a préincubé les filtres à 25[deg.]C pendant 2 heures dans 3 x SSC (1 x SSC est constitué de NaCl 0,15 M, de citrate de sodium 0,015 M, pH 7,6) contenant du BSA (0,02 %
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d'épichlorhydrine) et de la polyvinylpyrrolidone (0,02 % p/v) avant d'être égouttés et placés sur un filtre de papier pour sécher à l'air pendant quelques minutes. On a marqué
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manière décrite plus haut et on les a ensuite mis en sus-
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(contenant 0,85 pmole de chaque (Y- P) oligonucléotide
(environ 1 �Ci/pmole)) sur chaque filtre (reposant alors sur une surface non absorbante) et on a laissé la substance pénétrer dans les filtres pendant environ 5 minutes. On a submergé les filtres de paraffine légère et on les a incu-
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l'huile, on a rincé les filtres dans du chloroforme, on les a séchés à l'air et on les a lavés à quatre reprises dans
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les laver, à deux reprises dans 2 x SSC à la même température. Après les avoir modérément séchés au buvard, on a hermétiquement enfermé les filtres dans un sac en polythène et on les a autoradiographiés à -70[deg.]C dans une cassette d'intensification Kodak regular.
L'autoradiographie a indiqué la présence de cinq colonies qui étaient manifestement plus sombres que le reste. On a préparé l'ADN de plasmide à partir de ces colonies selon des procédés connus (voir, par exemple,
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1513-1523) et la restriction subséquente et l'analyse de la séquence nucléotidique ont confirmé que chacun de ces recombinants contenait un gène d'interféron de fibroblaste codant
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non traduite en 3'.
(12) Transfert du gène d'interféron dans des plasmides
d'expression pWT 2x1
On a préparé l'ADN de plasmide à partir de l'un des recombinants d'interféron susmentionnés en centrifugeant un lysat clarifié à travers des gradients de densité contenant du bromure d'éthidium (voir, par exemple, Katz L. et coll., (1973), J. Bacteriol., 114, 577-591 et Wensink P.C.
et coll., (1974), Cell, 3, 315-325). On en a ensuite restreint 3 �g avec de l'Hind III et on a soumis l'ADN extrait à une
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On a vi sualisé le gène d'interféron (environ 730 bp) par
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dant sous de la lumière UV (254 nm), de façon à permettre l'excision d'une petite tranche de gel contenant le gène.
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ayant été lavée avec quatre volumes, par rapport à la tranche de gel. d'AGEB (acétate d'ammonium 0,5 M, acétate de magnésium 10 mM, SDS 0,1 % (p/v) et EDTA 0,1 mM) que l'on avait mélangé à la suspension de gel en secouant modérément pendant 16 heures à 37[deg.]C. On a ajouté du tARN de levure
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avant de concentrer le mélange à travers un papier Whatman n[deg.] 52 dans une seringue de 2 ml et de laver le papier à l'AGEB. On a ensuite dilué le filtrat total cinq fois avec de l'eau avant de procéder à une chromatographie sur une colonne de 1 ml de DEAE 52-cellulose), comme décrit plus
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reprises avec 1 ml d'alcool isoamylique saturé de 1/5 x AGEB contenant du NaCl 1,1 M (afin d'éliminer le bromure d'éthidium) avant de procéder à une précipitation avec de
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On a ensuite soude 4 ni du produit (dans un
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Hind III et ensuite traité par de la phosphatase alcaline afin de minimiser la soudure du plasmide apparenté (voir '
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transformer E. coli K 12 HB-101 en utilisant des procédés connus (voir, par exemple, Emtage J.S. et coll., (1980), Nature, 283. 171-174).
On a fait croître des transformants sur des
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(en fait on a utilisé de la carbénicilline sodique (Beecham) qui est un dérivé qui peut être considéré comme lui étant
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line) et on a préparé l'ADN de plasmide à partir de six à douze colonies dans chaque cas. En procédant à des restrictions avec Pst I (EC 3.1.23.31) et en analysant les produits par électrophorèse, en gel, on a pu identifier les recombinants tout comme l'orientation du gène d'interféron par
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chacun des trois plasmides pWT 2x1, on a sélectionné un recombinant possédant le gène d'interféron dans l'orientation requise pour l'expression et on l'a examiné quant à
son aptitude à produire un interféron biologiquement actif.
(13) Induction de plasmides d'expression contenant le gène
d'interféron
On a fait croître des cultures de 150 ml de chacun des trois clones de pWT 2xl/gène d'interféron dans
du bouillon L (bouillon de luria : bacto tryptone 1 % (p/v),
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de l'ampicilline jusqu'à un O.D.600 am d'environ 0,3.
On a pastillé les bactéries par centrifugation, on les a lavées et on les a remises ensuite en suspension dans un
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d'acide 3 0-indole acrylique et 100 �g/ml d'ampicilline).
Après l'incubation à 37[deg.]C pendant 4 heures (moment au bout duquel le O.D.600 était d'environ 1,0), on a centrifugé les cellules et on les a extraites de la manière décrite ci-dessous.
(14) Extraction d'interféron à partir de bactéries
On a effectué les opérations suivantes à 2[deg.]C :
on a remis les culots bactériens en suspension dans 1,2 ml
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(p/v) contenant du Tris-HCl 0,1 M, pH 8 et 1 % (p/v) de HSA, cette addition étant suivie de l'addition de 0,8 ml
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Après 15 minutes, on a ajouté 0,8 ml d'EDTA 0,5 M de pH 8,5 et on a laissé reposer les cellules pendant 10 minutes supplémentaires. On a ensuite ajouté 4 ml de Triton X-100
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soumis l'extrait à une sonication de façon à réduire la viscosité et à garantir une lyse complète, puis on a procédé à l'ultra-centrifugation du produit à 50.000 tpm dans un rotor Tl 50 de Beckmann, pendant 2 heures. On a dialysé la couche surnageante vis-à-vis de PBS, on l'a clarifiée par centrifugation (10.000 tpm, 10 minutes), avant de la titrer quant à son activité d'interféron en surveillant la protection conférée à des cellules Vero contre le cpe du virus EMC dans un système de titrage à microplaque in vitro
(voir, par exemple, Dahl H. et Degré M., (1972), Acta. Path. Microbiol. Scan., 1380, 863).
Un autre procédé d'extraction implique la simple sonication des bactéries induites dans du Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 , suivie d'une centrifugation pendant 30 minutes à
15.000 x g et le prélèvement de la couche surnageante.
(15) Construction de recombinants d'expression modifiés
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III de 150 bp qui contient le promoteur de trp et la partie de la séquence de gène codant pour le polypeptide conducteur de trp. On a récupéré ce fragment à partir d'un gel de poly-
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sant de la T4 ADN ligase (10). Les enchaînements ont ensuite été partiellement digérés avec du Taq I avant de subir un traitement préalable par la SI nucléase, puis par l'ADN
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dans la séquence correspondant au site de liaison de ribosome dans la région du mARN codant pour le polypeptide conducteur de trp, a engendré un fragment d'environ 100 bp suivant la restriction à l'Hind III. On a isolé ce fragment
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en préparation pour une soudure au fragment Sac I/Hind III du gène d'interféron. On a obtenu ce dernier fragment en procédant d'abord à la digestion du gène d'interféron clone
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l'ADN à une restriction par l'Hind III et on a récupéré le fragment résultant d'environ 700 bp à partir d'un gel de polyacrylamide natif (5 % - p/v) .
On a ensuite mutuellement soudé les deux fragments par incubation à 25[deg.]C pendant 16 heures dans un volume final de 20 \il contenant du Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , du MgCl2 10 mM, de l'ATP 1 mM, du DTT 20 mM, environ 480 unités/ ml de T4 ADN ligase, 0,5 �g/ml du fragment d'Hind III/Taq I
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féron. Après la restriction à l'Hind III, on a transformé
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du pAT 153 comme vecteur. Ce dernier avait été préalablement restreint, avec l'Hind III avant de subir un traitement par la phosphatase alcaline bactérienne (EC 3.1.3.1) en vue de réduire la proportion de transformants non recombinants
(10). On a préparé l'ADN de plasmide à partir de transformants selon des procédés connus (voir, par exemple, Katz et
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par établissement de la carte à l'enzyme de restriction et également par séquencialisation nucléotidique. De cette manière, on a identifié plusieurs recombinants contenant
la molécule conjointe requise. Ces recombinants ont ensuite été induits de façon à produire de l'interféron de la manière décrite plus haut (13), à l'exception que la concentration
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Afin de préparer l'interféron radioactif, on a induit des bactéries de la manière précédemment décrite,
à l'exception que l'on a travaillé en l'absence de casamino acides et en présence de 5 �g/ml d'acide 3 3-indole acrylique. Au bout de la période d'induction, on a incubé des parties aliquotes de 1 ml pendant 15 minutes supplémen-
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ensuite soumis les échantillons à une électrophorèse à tra-
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oeuvre de procédés connus (voir, par exemple, Laemmli, U.K.,
(1970), Nature, 227, 680-685). On a ensuite séché le gel et on l'a autoradiographié afin de visualiser le polypeptide d'interféron (voir figure 4 des dessins annexés).
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SCHEMA C
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SCHEMA E
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SCHEMA F
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SCHEMA G
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SCHEMA H
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SCHEMA J
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