DK175194B1 - Rekombinante DNA-molekyler, interferon-omega-type gener, transformerede værter indeholdende DNA-informationen, ekspressionsplasmider for interferon-omega-typer, E. coli transformeret hermed, humane interferoner af type I, fremgangsmåde....... - Google Patents

Description

i DK 175194 B1

Opfindelsen angår rekombinante DNA-molekyler, indeholdende en kodende sekvens for hidtil ukendte humane interferon-proteiner af type I, der indeholder 168-174 aminosyrer, for interferon-pseudo-o)2 (se figur 12) , in-v 5 terferon-pseudo-o3 (se figur 13) eller interferon- pseudo-u)4 (se figur 14) . Endvidere angår opfindelse in-terferon-o>-type gener, transformerede værter indeholdende DNA-informationen, ekspressionsplas-mider for sådanne interferon-ω-typer, E. coli transformeret hermed, fremit) gangsmåder til fremstilling af disse proteiner, medicinsk anvendelige interferonholdige blandinger, anvendelse af ω-interferon til fremstilling af medicinsk anvendelige blandinger og fremgangsmåde til fremstilling af nævnte ekspressionsplasmider.

15 Begrebet interferon blev dannet for at beskrive et udvalg af proteiner, der er endogene i menneskeceller og kendetegnes ved, at de udviser biologisk aktivitet, der dels overlapper og dels divergerer. Disse proteiner ændrer kroppens immunforsvar, og man antager, at de del-20 tager i virksom beskyttelse mod virussygdomme. Man inddelte eksempelvis interferonerne i tre klasser, nemlig i o-, 3- og γ-interferon.

Af 3- og γ-interferon kendes på nuværende tidspunkt i den menneskelige organisme kun én undertype (se f.eks. S. Ohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 5305 -25 5309 (1981); Gray et al., Nature 295, 503-508 (1982);

Taya et al., EMBO Journal 1/8, 953-958 (1982)). Derimod er der beskrevet forskellige undertyper af a-interferon, (se f.eks. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 299, 7-28 (1982))

De fuldt udviklede a-interferoner adskiller sig fra hin-30 anden ved højst 23% divergens og er ca. 166 aminosyrer i længden. Især interessant er en rapport om et (»-interferon, der har en overraskende høj molekylvægt (26.000. bestemt ved SDS polyacrylamid/gelelektroforese) (Goren,

I DK 175194 B1 I

I 2 I

I P. et al. Virology 130, 273-280 (1983)). Dette inter- I

I feron kaldes IFN-α 26K. Det er blevet fastslået, at det I

I udviser den indtil nu højeste specifikke antivirale og I

I anticellulære aktivitet. 'I

I 5 De hidtil kendte interferoner er tilsyneladende I

I virksomme overfor en hel del sygdomme, men har kun ringe I

I eller overhovedet ingen virkning ved mange andre sygdom- I

I me (f.eks. Powledge, Bio/Technology, March 1984, 215 - I

I 228 "Interferon on Trial"). Derudover forekommer der bi- I

I virkninger ved interferoner. Eksempelvis fastslog man I

I ved prøver af rekombinant α-interferons bivirkning mod I

I cancer, at doser på omkring 50 millioner enheder, der I

I ifølge erfaringer fra fase I prøver skulle være sikre, I

I medførte akutte tilfælde af forvirring, ledsmerter, der I

I medførte arbejdsudygtighed, meget kraftig træthed, man- I

I ^ gel på appetit, tab af orienteringsevne, epileptiske an- I

I fald og forgiftning af leveren. Efter tilfælde af døde- I

I lige hjerteanfald ved behandling af kræftpatienter med I

I IF-α, forbød den franske regering i 1982 forsøg med det- I

I te. Der berettedes også om mindst to hjertedødsfald i I

I 20 Amerika ved forsøg for nylig udført dér. Det er blevet I

I mere og mere tydeligt, at i det mindste en del af bi- I

virkningerne, såsom feber og upasselighed, er direkte I

I forårsaget af selve interferonmolekylet og ikke kan hen- I

I føres til forureninger. I

I ^ På grund af de store forhåbninger, som interferon I

I havde vakt, og ansporet af Ønsket om at finde hidtil I

I ukendte interferonlignende molekyler med mindre bivirk- I

I ninger, var det målet for denne opfindelse at finde og I

I fremstille sådanne hidtil ukendte substanser. I

I Opfindelsen angår således bestemte hidtil ukendte I

I 30 interferoner af type I, som kan indeholde et Leader-pep- I

I tid, og deres N-glykosylerede derivater (her betegnet I

I som ω-interferon eller IFN-ω), der indeholder fra 168 I

3 DK 175194 B1 til 174, hensigtsmæssigt 172 aminosyrer, og udviser en divergens på 30 - 50%, hensigtsmæssigt 40-48% overfor de i hidtil kendte undertyper af α-interferon og en divergens i på 70% overfor β-interferon, og på den ene side virker 5 som α-interferoner, men på den anden side ikke besidder disse kendte substansers mange terapeutiske ulemper.

Genstanden for opfindelsen er altså hidtil ukendte interferoner i fuldstændig ren form, deres ikke-gly-kosylerede og glykosylerede former, gensekvenserne, der 1Q koder herfor, såvel som rekombinante molekyler, der indeholder disse sekvenser· Genstanden for opfindelsen er endvidere ekspres s i ons-vehik ler som plasmider, der indeholder omtalte gensekvenser, endvidere forskellige værtsorganismer, såsom mikroorganismer eller vævskultu-^ rer, der gør fremstilling af disse hidtil ukendte interferoner ved gæring eller ved vævskulturmetoder mulig.

Disse ovenfor nævnte genstande for opfindelsen er ejendommelige ved det i hovedkravenes kendetegnende dele anførte.

20 Særlig fremhæves ifølge opfindelsen ω-interfero ner såvel som de tilsvarende gensekvenser med følgende formel: 25

I DK 175194 B1 I

I I

I 5 10 15 I

I Cys Asp Leu Pro Gin Asn Bis Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu I

I TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG I

I 20 25 30 I

I 5 Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu I

I GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC I

I 35 40 45 I

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly I

I AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG I

I 1Λ 50 55 60 I

AU Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met

I AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG I

I 65 70 75 . I

I Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala I

I CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT I

I 15 80 85 90 I

I Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His I

I GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT I

I 95 100 105 I

I Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys-Leu Leu Gin Val Val Gly I

I CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA I

I 20 110 115 120 I

I Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu I

I GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG I

I 125 130 135 I

Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys I

I AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA I

I 140 145 150 I

Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys I

I TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA I

I 155 160 165 I

Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys I

I 30 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA I

I 170 I

I Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser I

I GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT I

I 35 I

5 DK 175194 B1 I position 111 kan sekvensen GGG (der koder for Gly) erstattes med GAG (der koder for Glu). De foretrukne molekyler omfatter også derivater, der er N-gly-• kosylerede i aminosyreposition 78.

5 Som eksenqpel kan begge de forannævnte ω-interfe- roner indeholde et Leader-peptid med formlen:

Met Ala Leu.Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly 10

Forklaring til tegningerne:

Fig. 1 : Restriktionskort for klonen E76E9 Fig. 2 : Restriktionskort for klonen P9A2 Fig. 3 : DNA-sekvens for klonen P9A2 15 Fig. 4 : DNA-sekvens for klonen E76E9

Fig. 5 : Genomisk Southern Blot analyse med DNA fra klonen P9A2 anvendt som sonde Fig. 6 : Konstruktion af ekspressionsklonen pRHWl2 Fig. 7 : Aminosyre- og nukleotidforskelle mellem inter-20 feroner af type I

Fig. 8a; Liste over singulære nukleotidpositioner i IFN-aA-genet

Fig. 8b: Liste over singulære nukleotidpositioner i IFN-ωΐ-genet.

25 Fig. 8c: Liste over singulære nukleotidpositioner i IFN-aD-genet

Fig. 9: Skematisk afbildning af syntesen af interferonundertype til specifik sonde

Fig. 10: Påvisning af interferon-undertype fra specifik 30 rnRNA

Fig. 11: DNA-sekvens i IFN-wl-genet Fig. 12: DNA-sekvens i IFN-pseudo-o>2-genet Fig. 13: DNA-sekvens i IFN-pseudo-td3-genet Fig. 14: DNA-sekvens i IFN-pseudo-o>4-genet 35 Fig. 15: Korrigeret opstilling af sekvenserne i IFN-ω-

I DK 175194 B1 I

I I

I generne I

I Fig. 16: Homologier for signalsekvenserne I

I Fig. 17: Homologier for de "færdige" proteinsekvenser I

I Fig. 18: Homologier for de 4-DNA-sekvenser overfor hin- I

I 5 anden. I

I Ifølge opfindelsen tilvejebringer man de hidtil I

I ukendte ω-interferoner og DNA-sekvenserne, der koder I

I herfor, på følgende måde: I

I En linie af humane B-lymphom-celler, f.eks. I

I 10 Namalwa-celler (se G. Klein et al., Int. J. Cancer 10, I

I 44 (1972)), kan ved behandling med et virus, f. eks. I

I Sendai-virus, bringes til samtidig at producere a- og β- I

I interferon. Man kan isolere mRNA, dannet i de stimule- I

I rede Namalwa-celler, og dette kan bruges som skabelon I

I 15 ved cDNA-syntese. For at forhøje udbyttet af de inter- I

I feronspecifikke sekvenser ved kloneringsfremgangsmåden, I

I lader man præparationen af mRNA gradiensseparere i en I

I sukkeropløsning i henhold til de individuelle mRNA-mole- I

I kylers forskellige længde. Man indsamler hensigtsmæs- I

I 20 sigt mRNA-moleky lerne i 12S-området (omkring 800 til I

I 1000 basers længde for mRNA). Her udsedimenterer mRNA- I

I molekylerne, der er specifikke overfor a- og β-interfe- I

I roner. mRNA fra dette gradientområde opkoncentreres ved I

I udfældning og genopløsning i vand. I

I 25 Fremstilling af et bibliotek for cDNA følger i I

I det væsentlige metoder, kendt fra litteraturen (se f. I

I eks. E. Dworkin-Rastl, M.B. Dworkin og P. Swetly, Jour- I

I nal of Interferon Research 2/4, 575-585 (1982)). Man I

I primer mRNA ved tilsætning af oligo-dT. Derefter til- I

I 30 sætter man de fire desoxynukleosidtriphosphater (dATP, I

I dGTP, dCTP, dTTP), og enzymet revers transkriptase, og I

I syntesen af cDNA foretages i en passende pufferopløsning I

I ved 45°C og varer en time. Man renser cDNA/mRNA-hybrid I

ved chloroformekstraktion og kromatografi på en gelsøj- I

I 35 le, f.eks. Sephadex G50. RNA hydrolyseres ved alkalibe- I

7 DK 175194 B1 handling (0,3 mol NaOH ved 50°C, en time), og efter neutralisation med sur natriumacetatopløsning udfælder man cDNA med ethanol.

Man udfører dobbeltstrengssyntesen i en passende 5 opløsning (seks timer ved 15°C) efter tilsætning af de fire desoxynukleosidtriphosphater og E.coli DNA-polyme-rase I, hvorved under dannelse af hårnålsstrukturen ved 3'-enden cDNA samtidig fungerer som skabelon og primer (se A. Eftratiadis et al., Cell 7, 279, (1976)). Efter 10 ekstraktion med phenol, kromatografi på Sephadex G50 og udfældelse med ethanol, behandles DNA i passende opløsning med den enkeltstreng-specifikke endonuklease Si.

Derved nedbrydes den hårnålestruktur i cDNA, der ikke er indbygget i dobbeltstrengen. Man ekstraherér med chloro-15 form og udfælder med ethanol, og gradientseparerer dobbeltstrengs DNA (dsDNA) i en sukkeropløsning efter størrelse. Ved den videre klonfremstilling anvender man hensigtsmæssigt kun dsDNA af størrelse 600 bp eller højere for at øge sandsynligheden for kun at tilvejebringe 20 kloner, som indeholder den fuldstændige kodende sekvens for de hidtil ukendte interferoner. dsDNA med mere end 600 bp længde opkoncentreres fra sukkergradienten til udfældning med alkohol og opløsning i vand.

De dannede dsDNA-molekyler skal med henblik på 25 opformering anbringes i en passende vektor, og derefter i bakterien E. coli. Som vektor anvendes hensigtsmæssigt plasmidet pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). Dette plasmid består i det væsentlige af et replicon og to selektionsmarkører. Disse bibringer vær-30 ten resistens mod visse antibiotika, Ampicillin og te-tracyclin (Apr, Tcr). Genet for 6-lactamase (Apr) indeholder sekvensen, der genkender restriktionsendonuklea-sen PstI. pBR322 kan gennemskæres med Pstl. De udhængende 3'-ender forlænges i en passende pufferopløsning 35 ved hjælp af enzymet terminal desoxynukleotid-transfera-

I DK 175194 B1 I

i 8 I

I se (TdT) under anvendelse af dGTP. Samtidig forlænges I

I dsDNA også i 3'-enderne med enzymet TdT, idet der anven- I

I des dCTP. Homopolymerenderne af plasmid og dsDNA er kom- I

I plementære og vil hybridisere, når plasmid DNA og dsDNA I

I 5 blandes under iagttagelse af passende koncentrationsfor-

I hold og under egnede salt-, puffer- og temperaturbetin- I

I gelser (T. Nelson et al., Methods in Enzymology 68, 41 - I

I 50 (1980)). I

I E. coli af stammen HB 101 (Genotyp P-, hsdS20 I

I 10 (r-B, m-B) recAl3, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 I

I (Smr), xyl-5, mtl-1, supE44, λ-) præpareret ved vask med H

I en CaCl2-opløsning, så den er rede til at optage det re- I

I kombinante vektor-dsDNA-molekyle. Præparerede E.coli HB I

I 101 blandes med DNA, og efter inkubation ved 0°C udsæt- I

I 15 tes det derved dannede plasmid-DNA for en transformation I

I ved et varmechock ved 42°C i to minutter (M. Dagert et I

I al., Gene 6, 23-28 (1979)). De transformerede bakterier I

I anbringes dernæst på agarplader, der indeholder tetra-

I cyclin (10 yg pr. liter). På dette agar kan E. coli HB I

I 20 101 kun vokse, hvis det har optaget et vektor- eller re- I

I kombinant-vektormolekyle (Tcr). Rekombinante vektor- I

I dsDNA-molekyler bibringer værten genotypen ApsTcr, da β- I

I laktamaseinformationen ved anbringelse af dsDNA i $-lak- I

I tamasegenet er blevet ødelagt. Klonerne overføres til I

I 25 agarplader, der indeholder 50 yg/ml ampicillin. Kun ca.

I 3% af klonerne vokser her, hvad der betyder, at 97% af I

I klonerne har fået indsat et dsDNA-molekyle. Ud fra 0,5 I

I yg dsDNA tilvejebringer man mere end 30.000 kloner. Her- I

I af overføres 28.600 kloner individuelt til hulningerne i I

I 30 mikrotiterplader, der indeholder næringsmedium, 10 yg/ml I

I tetracyclin og glycerin. Efter klonvækst opbevares pla- I

I derne ved -70°C (cDNA-bibliotek). I

I Når cDNA-biblioteket skal gennemsøges for kloner, I

I der indeholder gener for hidtil ukendt interferon, lader I

I 35 man efter optøning klonerne overføre til et nitrocellu- I

9 DK 175194 B1 losefilter. Dette filter ligger på vækstagar, der indeholder tetracyclin. Man lader bakteriekolonierne vokse og fikserer derefter bakteriernes DNA på filteret.

Som sonde anvender man med fordel indføjnings-5 stykket i klonen pER33 (E. Rastl et al., Gene 21, 237 -248 (1983)) - se også EP-A-0.115.613), der indeholder genet for IFNa2-Arg. Dette stykke DNA markeres radioaktivt ved hjælp af haktranslation, hvorved der anvendes DNA-polymerase I, dATP, dGTP, dTTP og a-^P-dCTP. Nitro-10 cellulosefilteret forbehandles under passende, men ikke stringente, hybridiseringsbetingelser uden den radioaktive sonde og derefter hybridiserer man ca. 16 timer under nærværelse af den radioaktive sonde. Derefter vaskes filteret under passende, men ikke stringente, betingel-15 ser· På grund af den manglende stringens under hybridi-seringen og vasken fanger man ikke blot interferon a2-Arg-holdige kloner, men også andre interferonholdige kloner, hvis gensekvens kan afvige betragteligt fra det hidtil kendte interferon-α. Efter tørring eksponeres 20 filteret på en røntgenfilm. En mørk farvning, der afviger tydeligt fra baggrundsniveauet, viser, at der findes en klon med interferon-specifikke sekvenser.

Da radioaktivitetssignalerne er af forskellig kvalitet, lader man både de positive og de mistænkelig 25 positivt reagerende kloner opformeres i lille målestok.

Man isolerer plasmid DNA-molekylerne, lader dem fordøje af restriktionsendonukleasen PstI, og lader dem skille efter størrelse ved elektroforese på en agarosegel (Birnboim et al·, Nucl. Acid. Res. 7, 1513 (1979)). DNA 30 i agarosegel overføres efter Southern's metode (E.M. Southern, J. Mol Biol· 98, 503-517 (1975)) til et nitrocellulosefilter. DNA på dette filter hybridiseres med den radioaktive IFN-genholdige denaturerede sonde. Som positiv kontrol tjener plasmidet 1F7 (deponeret hos DSM 35 under DSM-nummer 2362), der indeholder genet for inter-

I DK 175194 B1 I

i 10 I

I feron-o2-Arg. Ifølge autoradiogrammet er det tydeligt, I

I at klonen E76E9 og klonen P9A2 indeholder en sekvens, I

I som under ikke stringente betingelser hybridiserer med I

I genet for interferon-a2-Arg. Til brug for nærmere ka- I

I 5 rakteristik af den dsDNA, der er indsat i klonerne E76E9 I

I og P9A2. lader man plasmiderne for disse kloner frem- I

I stille i større målestok. DNA’en fordøjes med forskel- I

I lige restriktionsendonukleaser, f.eks. med Alul, Sau3A, I

I Bglll, Hinfl, PstI og Haelll. De dannede fragmenter ad- I

I 10 skilles på en agarosegel. Ved sammenligning med passen- I

I de størrelsesmarkør, f.eks. de fragmenter, der opstår I

I ved fordøjelse af pBR322 med restirktionsendonukleasen I

I Hinfl henholdsvis Haelll, kan man bestemme størrelsen af I

fragmenterne. Der optegnes kort, som anvist af Smith og I

I 15 Birnstiel (H.O. Smith et al. Nucl. Acid. Res. 3, 2387 - I

I 2398 (1967)), og rækkefølgen af disse fragmenter bliver I

I bestemt. Ved hjælp af de på denne måde tilvejebragte I

I restriktionsenzymkort (fig. 1 og 2) kan man overraskende I

I slutte, at det ved de indsatte stykker i klonerne E76 I

I 20 drejer sig om hidtil ukendte gener for interferon, nem- I

I lig generne for ω-interferonerne. I

I Denne information om ω-interferonerne er en I

I hjælp, når det indsatte cDNA skal fordøjes af egnede re- I

I striktionsendonukleaser. De dannede fragmenter ligeres I

I 25 med dsDBA-formen (den replikative form) af bakterieopha- I

I gen M13 mp9 (J. Messing et al., Gene 19, 269-276 (1982)) I

I og opdeles i sekvenser ved hjælp af Sanger’s dideoxyme- I

I tode (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463- I

I 5467 (1977)). Man isolerer enkeltstrengs-DNA fra de re- I

30 kombinante phager. Disse bindes til en syntetisk oligo- I

I mer, og man udfører derefter i fire parallelforsøg dob- I

I beltstrengssyntese under anvendelse af det store frag- I

I ment af DNA-polymerase I fra E. coli (Klenow-fragment). I

Til hver af de fire delreaktioner sættes en af de fire I

I 35 didesoxynukleosidtriphosphater (ddATP, ddGTP, ddCTP, I

11 DK 175194 B1 DDTTP). Dette fører til statistisk fordelte kædebrud på de steder, hvor der i skabelon-DNA findes komplementære baser til det pågældende didesoxynukleosidtriphosphat. Derudover benyttes også radioaktivt mærket dATP. Når 5 syntesereaktionen er tilendebragt, lader man produkterne denaturere og lader fragmenterne af enkeltstrengs-DNA opdele efter størrelse på en denaturerende polyacryl-amidgel (F. Sanger et al., FEBS Letters 87, 107 - 111 (1978)). Derefter eksponeres gelen på en røntgenfilm.

10 DNA-sekvensen for den rekombinante M13 phag kan så aflæses fra autoradiogrammet. Sekvenserne for de indsatte stykker i forskellige rekombinante phager bearbejdes yderligere i passende computerprogrammer (R. Staden,

Nuel. Acid. Res. 10, 4731-4751 (1982)).

15 Fig. 1 og 2 viser sekvenseringsstrategien. Fig.

3. viser DNA-sekvensen af det indsatte stykke i klonen P9A2, fig. 4 for klonen E76E9. Den ikke-kodende DNA-streng vises i retningen 5'+ 3' sammen med den tilsvarende aminosyresekvens.

20 cDNA, isoleret fra klonen E76E9 for u>-(Glu)-in- terferon har en længde på 858 basepar og indeholder en 3' ikke-translateret region. Regionen, der koder for færdig t»)-(Glu)-interferon, forløber fra nukleotid 9 til nukleotid 524. cDNA, isoleret fra klonen P9A2 for u>(Gly) 25 -interferon har en længde på 877 basepar, og kodesekvensen for færdig ω-interferon løber fra nukleotid 8 til nukleotid 523. Den 3‘ ikke-translaterede region forløber ved P9A2 ud til poly-A-afsnittet.

DNA-sekvenserne, der koder for færdig ω-interfe-30 ron, findes fuldstændigt i klonerne E76E9 og P9A2. De begynder i den N-terminale ende med aminosyrerne cyste-in-asparaginsyre-leucin. Det har overraskende vist sig, at begge de færdige ω-interferoner har en længde på 172 aminosyrer, hvilket afviger tydeligt fra længden af hid-35 til kendte interferoner, som f. eks. 166 (henholdsvis

I DK 175194 B1 I

I 12 I

I 165) aminosyrer ved α-interferoner. Det har overrasken- I

I de vist sig, at begge ω-interferonerne besidder et po- I

I tentielt N-glykosyleringssted på aminosyrepositionen 78 I

I (asparagin-methionin-threonin). I

I 5 En sammenligning af DNA fra klonerne E76E9 og

I P9A2 viser en forskel. Tripletten, der koder for amino- I

I syre 111 i klon E76E9 er GAG og koder for glutaminsyre, I

I hvorimod denne triplett er GGG i klon P9A2 og koder for H

I glycin. De to ω-interferoner adskiller sig altså fra H

I 10 hinanden på et aminosyrested og betegnes u>-(Glu)-inter- I

I feron (E76E9) og ui(Gly)-interferon (P9A2). I

I Sammenligning af de ω-interferoner med de hidtil I

I kendte humane α-interferon undertyper giver følgende I

I billede: I

I 15 I

I ω ^ι·-

I Proteinlængde I

I aminosyrer_172_166 _ I

I 20 I

I Potentiel N-glykosyle- I

I ringssted, position_78_- (++) I

I +) Interferon o-A har kun 165 aminosyrer I

I 25 ++) Interferon o-H har et potentielt N-glykosy- I

I leringssted på position 75 (D. Goeddel et I

I al.. Nature 290, 20-26 (1981)). I

I E. coli HB 101 med plasmidet E76E9 og E. coli 101 I

I 30 med plasmidet P9A2 er blevet deponeret hos Deutschen I

I Sammlung fur Mikroorganismen (DMS Gottingen) med numrene I

I DSM 3003 henholdsvis DSM 3004 den 3. juli 1984. I

I Som bekræftelse på, at de hidtil ukendte kloner H

I producerer en interferon-lignende aktivitet, kan man f. I

I 35 eks. kultivere klonen E76E9 og prøve bakteriens nedbryd- I

I ningsprodukt efter væksten ved en Plaque-reduktionsprø- I

13 DK 175194 B1 ve. Som det var ventet, producerede bakterien interferon-lignende aktivitet (se Eksempel 3).

Endvidere lod man, som bekræftelse på, at det ved begge de hidtil ukendte interferoner drejede sig om med-5 lemmer af en ny interferon-gruppe, al DNA fra Namalwa-celler isolere og fordøje med forskellige restriktions-nucleaser. Herved kan man få et overslag over, hvor mange gener der kodes af cDNA fra klonerne P9A2 og E76E9.

Man lod de tilvejebragte DNA-fragmenter skille på aga-10 rosegel efter Southern's metode (E.M. Southern et al-, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)), anbringe på nitrocellulosefilter og under relativ strenge betingelser hybri-disere med radioaktiv mærket specifik DNA fra klonen P9A2.

15 Resultaterne af hybridiseringen med DNA fra plas- midet P9A2 og pER33 vises i fig. 5a.

På denne betegnes de enkelte spor med bogstaver, der henfører til de forskellige DNA-prØver (E = EcoRl, H = HindiII, B = BamHI, S = Sphl, P = PstI, C = Clal).

20 Den venstre halvdel af filteret blev hybridiseret med interferon-a-gen-sonden ("A"), og den højre halvdel med det indføjede cDNA fra klonen P9A2 ("O"). Båndgruppen, der enten hybridiserer med α-interferongensonden eller med den hidtil ukendte interferon-gensonde, er forskel-25 lig. Ved de to forskellige sonder kan man ikke påvise nogen krydshybridisering, bedømt efter de tilsvarende spor.

I fig. 5b afbildes cDNA fra klonen P9A2, og det fragment der benyttes til hybridisering. Angrebssteder-30 ne for nogle restriktionsenzymer er vist (P - sti, S =

Sau3A, A * Alul) . Sonden omfatter kun to af de tre mu lige Pstl-fragmenter. Hybridiseringsprøven viser kun ét hybridiserende fragment med omtrent 1300 basepar (bp), som hører til det homologe gen. Det mindre, 120 bp lan-35 ge fragment, var løbet igennem og ud af gelen. Bandet,

I DK 175194 B1 I

I 14 I

I der hører til 5'-delen af genet, kan ikke påvises, da I

sonden ikke indeholder denne region. Der kan ses mindst I

I seks forskellige bånd i dette Pstl-spor. Dette betyder, I

I at der må være nogle andre gener til stede i det humane I

I 5 genom, som er beslægtet med de hidtil ukendte sekvenser. I

I Hvis der i disse gener skulle være et eller flere PstI- I

angrebssteder, så kan det ventes, at man vil kunne iso- I

I lere i det mindste tre yderligere gener. I

I Disse gener vil med fordel kunne isoleres fra et I

10 humant gen-bibliotek, der er indbygget i en plasmidvek- I

I tor, en phagvektor eller kosmidvektor (se Eksempel 4e). I

I På dette sted må det nævnes, at ω-interferonerne I

ifølge opfindelsen ikke blot omfatter de to færdige in- I

I terferoner, der beskrives detailleret, men også om for- I

I 15 skellige modifikationer af disse polypeptider, der ikke I

I berører IFN-io-aktiviteten. Disse modifikationer kan f. I

I eks. være afkortning af molekylet ved den N- eller C- I

I terminale ende, ombytning af aminosyrer med andre re- I

I ster, hvorved aktiviteten ikke ændres væsentligt, kemi- I

20 ske eller biokemiske bindinger af molekylet til andre I

I molekyler, der kan være inerte eller aktive. Ved de I

sidstnævnte modifikationer kan det f.eks. dreje sig om I

I hybridmolekyler af et eller flere ω-interferoner og/- I

I eller kendte a- eller β-interferoner. I

I 25 Med det formål at finde forskellene i aminosyrer I

I og nukleotidsekvenserne i de hidtil ukendte interfero- I

ner, især io(Gly)- og u)(Glu)-interferon, sammenlignet med I

I de allerede kendte a-interferoner og β-interferonet, der I

I er publiceret (C. Weissmann et al., Phil. Trans. R. Soc. I

I 30 London 299, 7-28 (1982); A. Ullrich et al-, J. Molec. I

I Biol. 156, 467-486 (1982); T. Taniguchi et al., Proc. I

Nat. Acad. Sci. 77, 4003-4006 (1980); K. Tokodoro et I

I al-, EMBO J. 3, 669-670 (1984)), ordner man tilsvarende I

I sekvenser parvist og tæller forskellene ved de enkelte I

I 35 positioner. I

15 DK 175194 B1

Fra resultaterne afbildet i fig. 7 finder man, at DNA-sekvenserne i klonerne P9A2 og E76E9 er beslægtede med sekvenserne i interferoner af type I, (f.eks. a-og β-interferoner). Andetsteds vises, at forskellen mellem 5 aminosyresekvenserne mellem de enkelte α-interferoner og de hidtil ukendte sekvenser er større end 41,6% og mindre end 47,0%. Forskellene mellem de hidtil ukendte sekvenser eller sekvenserne i de enkelte a-interferoner og sekvenserne i β-interferonerne er af størrelsesordenen 10 70%. Med henblik på resultaterne af Eksempel 4, hvor man påviser eksistensen af en hel gruppe beslægtede gener, og med henblik på den nomenklatur, der er foreslået for interferonerne {J. Vilceck et al., J. Gen. Virol.

65, 669-670 (1984)) antager man, at de indføjede stykker 15 cDNA i klonerne P9A2 og E76E9 koder for en hidtil ukendt klasse type I-interferon, som kan betegnes som interfe-ron-ω.

Endvidere påvises det, at gen-ekspressionen for ω-interferon er analog til ekspressionen af et interfe-20 ron-typel-gen. Med dette formål undersøges transkrip-tionen af de enkelte medlemmer af multigenfamilien o- og ω-interferoner ved hjælp af Sl-mapping-metoden (A. J.

Berk et al., Cell 12, 721 (1977)) (se Eksempel 7), og det vises, at ekspressionen ω-1-mRNA er virusinducerbar.

25 Da transkripterne af en sådan genfamilie kun er forskellige i nogle enkelte baser ud af ca. 1000, er hybridise-ring alene intet tilstrækkeligt følsomt middel til at bestemme forskelle mellem de forskellige IFN mRNA.

Til dette formål fremstiller man mRNA-sekvenserne 30 af 9 α-interferoner, af interferon-ω-Ι og af p-interfe-ron. Baserne, der er specifikke for den øverste sekvens, betegnes her med store bogstaver. Sådanne specifikke steder kan let findes ved hjælp af et trivielt computer-program. En hybridiseringssonde, som beror på 35 et specifikt sted, kan kun hybridisere perfekt med mRNA

I DK 175194 B1 I

I 16 I

I fra en bestemt undertype. Alle øvrige mRNA kan ikke hy- I

I bridisere på det specifikke sted af undertypen. Når hy- I

I bridiseringssonden er markeret radioaktivt i den speci- I

I fikke 5'-ende, beskyttes kun de radioaktive mærkninger I

I 5 mod fordøjelse af en enkeltstreng-specifik nuclease I

I (fortrinsvis Sl-nuclease), som har hybridiseret med den I

I interferon-undertype-mRNA, som sonden var konstrueret I

I til. I

I Dette princip gælder ikke kun for interferon, men I

I 10 kan anvendes til enhver gruppe af kendte sekvenser, der I

I udviser de specifikke steder, der beskrives i fig. 8. I

I De ovennævnte specifikke positioner i undertyper- I

I ne er i de fleste tilfælde ikke restriktionssteder, I

I hvorfor gennemskæring af cDNA med restriktions-endonuc- I

15 leaser ikke er egnet til at fremstille undertype-speci- I

I fikke hybridiseringssonder. Derfor er de i dette eksem- I

pel benyttede sonder konstrueret ved udvidelse af et i I

H 5'-enden radioaktivt markeret oligonucleotid, som er I

I komplementær til mRNA i interferon-ω-Ι ovenfor det spe- I

I 20 cifikke sted. I

I Pra fig. 10 fremgår, som ventet, at ω-1-mRNA kan I

induceres i Namalwa- og NC37-celler. I

I Opfindelsen angår derfor ikke blot gensekvenser, I

der koder specifikt for de angivne ω-interferoner, men I

25 også modifikationer, der let og rutinemæssigt kan tilve- I

I jebringes ved mutation, nedbrydning, transposition eller I

I tilføjelse. Alle sekvenser, der koder for de beskrevne, I

I humane ω-interferoner (dvs. som udviser det biologiske I

I aktivitetsspektrum, der her beskrives), og som er dege- I

30 nereret sammenlignet med de viste sekvenser, skal også I

I indbefattes, idet fagfolk på området er i stand til at I

I fremstille de degenererede DNA-sekvenser af de kodende I

I regioner. Endvidere er enhver sekvens, der koder for et I

I polypeptid med IFN-» aktivitetsspektrum, og som hybridi- I

35 serer med de viste sekvenser (eller dele deraf), under I

17 DK 175194 B1 stringente betingelser (eksempelvis betingelser, der selektivt giver mere end 85%, hensigtsmæssigt mere end 90% homologi) indbefatet.

Man gennemfører hybridiseringerne i 6 x SSC/5 x 5 Denhardt's opløsning/0,1% SDS ved 65°C. Stringensgraden fastlægges ved hjælp af udvaskningsgraden. For en udvælgelse af DNA-sekvenser med ca. 85% eller større homologi er betingelserne 0,2 x SSC/0,01%, SDS/65°C, og for en selektionering en udvælgelsen af DNA-sekvenser med ca.

10 90% eller større homologi er betingelserne 0,1 x SSC/- 0,01% SDS/65°C egnet.

Ved gennemsøgning af et kosmid-bibliotek under disse betingelser (0,2 x SSC) opnår man nogle kosmider, der hybridiserer med en IFN-u>-sonde. Sekvensanalysen af 15 restriktionsenzymfragmenter, isoleret herfra, giver det autentiske IFN-iu-gen (se fig. 11), såvel som tre yderligere dermed beslægtede gener, der betegnes som IFN-pseu-do-<j>2, IFN-pseudo-u)3 og IFN-pseudo-u>4 (se fig. 12-14).

Disse såvel som de peptider, der koder for, omfattes og-20 så af opfindelsen. De kendetegnes i kravene 11 til 13 samt 36 til 38.

Fra DNA-sammenligningerne ses, at der er en omtrentlig 85% homologi mellem pseudogenerne og IFN-ωΙ-genet. (interferon-w-et-gen).

25 Derudover viser IFN-ωΙ-genet, at mRNA ved tran- skription indeholder information for et funktionelt interferonprotein, dvs. der kodes for et 23 aminosyrer langt signalpeptid med formlen: 30 Met Ala Leu leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val

Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly der følges af det 172 aminosyrer lange, færdige IFN-ωΙ.

Interferon-w-gener kan anbringes i alle organis-35 mer, der vil give høje udbytter. Egnede værter og vek-

I DK 175194 B1 I

i 18 I

I torer er bedst kendt af fagmanden, man kan som eksempel I

I henvise til EP-A-0.093.619. I

I For ekspressionen er prokaryoter især hensigts- I

I mæssige. Især er E. coli K 12, stamme 294 (ATCC nr. I

I 5 31.446) egnet. Blandt andre stammer, der er egnet, I

I nævnes E. coli X1776 (ATCC nr. 31.537). Lige så vel som I

I de ovenfor nævnte stammer kan E. coli W 3110 (F“, λ“, I

I prototroph, ATCC, nr. 27.325), baciller som Bacillus I

I subtilis, og andre Enterobacteriaceae, som Salmonella I

I 10 typhimurium eller Serratia marcensens, såvel som I

I forskellige Pseudomonader anvendes. I

I I almindelighed kan man anvende plasmid-vektorer, I

I der indeholder replikon og kontrolsekvenser, der stammer I

I fra arter, der er kompatible med værtscellerne, sammen I

I 15 med disse værter. I vektoren findes normalt foruden et I

I replikationssted, genkendelsessekvenser, der gør det mu- I

I ligt at udvælge de transformerede celler efter phenoty- I

I pi. Som eksempel transformerer man normalt E. coli med

I pBR322, et plasmid, der stammer fra E. coli-celler I

I 20 (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)). pBR322 indeholder I

I gener for ampicillin- og tetracyclin-resistens, og gør I

I det derved nemt at identificere transformerede celler. I

I Plasmidet pBR322 eller andre plasmider må derudover in- I

I deholde promotorer eller må modificeres sådan, at de I

I 25 kommer til at indeholde promotorer, som mikrobeor- I

I ganismen kan udnytte til ekspression af sine egne prote- I

I iner. De promotorer, der oftest anvendes under fremstil- I

I ling af rekombinant DNA, indeholder β-rlaktamase I

I (phenicillinase) og laktose-promotorsystemer, (Chang et I

I 30 al., Nature 275, 615 (1989); Itrakura et al., Science I

I 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 I

I (1979)) og Tryptophan(trp) promotor-systerner (Goeddel et I

I al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0.036.776). I

I Selv om de ovennævnte er de almindeligst anvendte promo- I

I 35 torer, er der også udviklet og benyttet andre mikrobiel- I

19 DK 175194 B1 le promotorer. Gen-sekvensen for IFN-ω kan f.eks· indsættes under kontrol af Leftward-promotoren, der hører til bakteriophagen λ (Pl). Denne promotor er en af de kraftigste, styrbare promotorer, man kender. Man kan 5 styre den ved hjælp af λ-repressoren, for hvilken man kender restriktionssnitstederne.

En temperaturfølsom allel af dette repressor-gen kan indføjes i en vektor, der indeholder en fuldstændig IFN-u)-sekvens. Hvis man forhøjer temperaturen til 42°C, 10 bliver repressoren inaktiveret, og promotoren eksprime-res op til sin maksimale koncentration. Summen af mRNAf der produceres under disse betingelser, skulle være tilstrækkelig til, at man kan tilvejebringe en celle, der blandt sine nye syntetiske ribonukleinsyrer indeholder 15 omkring 10%, der stammer fra P^-promotoren. Det er på denne måde muligt at etablere en klon-bank, i hvilken en funktionel IFN-to-sekvens bliver placeret i nabolaget til 5 et ribosom-bindingssted i varierende afstand fra X-Pl~ promotoren. Disse kloner kan derefter prøves, og man 20 kan udvælge de, der giver det højeste udbytte.

Ekspressionen og translationen af en IFN-to-se-kvens kan også forløbe under kontrol af andre reguleringssystemer, der kan gælde som "homolog" til organis-men i dens ikke-transformerede form. Således indeholder 25 f.eks. kromosomal DNA fra en laktoseafhængig E. coli en laktose eller lac-operon, der ved udrystning af enzymet β-galactosidase gør nedbrydning af lactose mulig.

Lac-kontrolelementerne kan fås fra bakteriophagen X-plac5, der kan inficere E. coli. I phagen findes lac-30 operon, der kan stamme fra transduktion af samme bakteriearter. Reguleringssystemer, der kan anvendes ifølge opfindelsen, kan stamme fra plasmid DNA, der hører til organismen. Systemet lac-promotor-operator kan induceres ved hjælp af IPTG.

35 Andre promotor-operatorsystemer eller dele deraf kan i lige så høj grad anvendes: F.eks. arabinose-ope-

I DK 175194 B1 I

I 20 I

I rator, colicin Εχ-operator, galactose-operator, alkalisk I

I phosphatase-operator, trp-operator, xylose-A-operator,, I

I tac-promotor og andre. I

I Foruden prokaryoter kan også eukaryotiske mikro- I

I 5 organismer anvendes, såsom gærkulturer. Den mest an- I

vendte er Saccharomyces cerevisiae blandt de eukaryoti- I

I ske mikroorganismer, skønt et antal andre arter også kan I

I bruges. Til ekspression i Saccharomyces kan man f.eks. I

I benytte plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al. Nature 282, 39 I

I 10 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper I

I et al·. Gene 10, 157 (1980)) og plasmidet Yep 13 (Bwach I

I et al.. Gene 8, 121-133 (1979)) på normal vis anvendes. I

I Plasmidet YRp7 indeholder genet TRP1, der stiller en se- I

I lektioneringsmarkering til rådighed for en gærmutant, I

I 15 der ikke kan gro i trypthophanholdigt medium; f.eks. I

I ATCC nr. 44.076. I

I Defekten i TRPl, der karakteriserer genomet for I

I værtsorganismen, er således et brugbart hjælpemiddel, I

I hvormed transformationen kan påvises, idet man foretager I

I 20 væksten uden tryptophan. På ganske tilsvarende måde I

I forholder det sig ved plasmidet YEpl3, der indeholder I

gærarts-genet LEU 2, der kan benyttes til at supplere en I

I LEU-2-minus mutant. Egnede promotor-sekvenser for gær- I

I artsvektorer findes i regionen i umiddelbar 51-nærhed i I

I 25 genet for ADH I (Animerer G., Methods of Enzymology 101, I

I 192-201 (1983)), 3-phosphoglycerate-kinase (Hitzeman et I

I al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) eller andre glyko- I

I lytiske enzymer (Kawaski og Fraenkel, BBRC 108, 1107 - I

I 1112 (1982)) som enolase, glyceraldehyd-3-phosphat, de- I

30 hydrogenase, hexokinase, pyruvat, decarboxylase, phos- I

I phofructokinase, glucose-6-phosphat-isomerase, phospho- I

I glucose-isomerase og -glucokinase. Ved indsats af egne- I

I de ekspressionsplasmider kan terminationssekvenser asso- I

I cieret med disse gener, derudover indsættes i ekspres- I

I 35 sionsvektoren i 3'-enden af den sekvens, der skal eks- I

21 DK 175194 B1 primeres, så polyadenylering og terminering af mRNA kan forudbestemmes.

Andre promotorer, der besidder den fordel, at transkriptionen kan kontrolleres ved hjælp af vækstbe-5 tingeiserne, er promotorregionerne i gener for alkohol-dehydrogenase-2, isocytochrom C, syre-phosphatase nedbrydende enzymer, der er koblet med nitrogen-metabolismen, det ovenfor nævnte glyceraldehyd-3-phosphat-dehy-drogenase og enzymer, der kan nedbryde maltose og galak-10 tose. Promotorer, der reguleres ved en gærarts "Mating type Locus", f.eks. promotorer for generne BARI, MFol, STE2, STE3 og STE5, kan indsættes i temperaturregulerede systemer under anvendendelse af temperaturafhængige sivmutationer. (Rhine PH. D. i Thesis, University of Ore-15 gon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Disse mutationer har indflydelse på ekspressionen af hvilende "Mating type kassetter" af gærarter og derigennem indi-20 rekte på promotorer, der afhænger af "Mating type". I almindelighed er dog enhver plasmidvektor egnet, der indeholder en gærkompatibel promotor og passende replika-tions- og terminationssekvenser.

Egnede værtsorganismer er foruden mikroorganismer 25 også kulturer af multicellulære organismer. I princippet kan enhver sådan kultur anvendes, lige meget om den stammer fra hvirveldyr eller hvirvelløse dyr. Den største interesse har celler fra hvirveldyr, så at vækst af vævscellekulturer er blevet en rutinemetode i de senere 30 år (Tissue, Culture, Academic Press# Kruse and Patterson, Editors (1973)). Eksempler på sådanne anvendelige værtscellelinier er VERO- og HeLa-celler, celler fra guldhamster-æg (CHO) og W138, BHJ, COS-7 og MDCK-celle-linier. Ekspressionsvektorer fra disse celler indehol-35 der iøvrigt (om nødvendig) et replikationssted, en pro-

I DK 175194 B1 I

I 22 i I motor, der er anbragt før genet, der skal eksprimeres,

I sammen med ethvert nødvendigt ribosombindingssted, RNA- I

I Splicing-sted, polyadenyleringssted og transkriptionelle I

I terminations-sekvenser. I

I 5 Til anvendelse i celler fra pattedyr baserer man

I ofte kontrolfunktionerne i ekspressionsvektorerne på vi- I

I rusmateriale. Som eksempel stammer ofte anvendte promo- I

I torer fra Polyoma Adenovirus 2, og især ofte fra Simian I

I virus 40 (SV 40). De først og sidst anbragte slutpromo- I

I 10 torer fra SV 40 er især nyttige, da begge let kan tilve- I

I jebringes fra virusset som et fragment, der også inde- I

I holder de virale replikationssteder i SV 40. (Fiers et I

I al., Nature 273, 113 (1978)). Mindre eller større frag- I

I menter fra SV 40 kan også anvendes under forudsætning I

I 15 af, at de indeholder den omtrent 250 bp lange sekvens, I

I der løber fra Hindlll snitstedet til Bgl I snitstedet i I

I det virale replikationsområde. Derudover er det også I

I muligt, og ofte anbefalelsesværdige at anvende promotor I

I eller kontrolsekvenser, der på almindelig vis har for- I

I 20 bindelse med de ønskede gensekvenser, under forudsætning I

I af, at disse kontrolsekvenser er kompatible med værts- I

I cellesystemerne. I

I Et replikationsområde kan enten præpareres ved en I

I passende vektorkonstruktion, så den kan indbygge et exo- I

I 25 gent område, f.eks. fra SV 40 eller en anden viruskilde I

I (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, PBV osv.) eller kan præpa- I

I reres ved hjælp af værtscellens kromosomale replika- I

I tionsmekanisme. Hvis vektoren skal integreres i værts- I

I cellens kromosom, er den sidstnævnte metode normalt til- I

I 30 strækkelig. I

I Det er dog hensigtsmæssigt at integrere generne i I

I et ekspressionsplasmid pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., I

I Gene 21, 237-248 (1983) og EP-A-0.115.613, deponeret hos I

I DSM under nummeret DSM 2773 den 20. december 1983), da I

I 35 denne vektor indeholder alle reguleringselementer, der I

23 DK 175194 B1 fører til høj ekspression af det klonede gen. Ifølge opfindelsen erstatter man følgelig i plasmidet pBR322 det indeholdte EcoRl/BamHI-fragment med en DNA-sekvens med formlen 5

EcoRI Sau3A

10 qaattcacqctGATCGCTAAAACATTGTGCAÅAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA 59 ^mRNA-Start Met CAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116 RBS Hindlll

Zys Asp ^ rGT GAT C---IFN-omeca-Gen->

Sau3A

20 25 1 35

I DK 175194 B1 I

I 24 I

I Por at nå opfindelsens mål kan man med reference I

I til fig. 6 eksempelvis benytte følgende fremgangsmåde: I

I I. Fremstilling af de nødvendige enkelt DNA-fragmenter: I

I 5 Fragment a I

I Til fremstilling af fragment a) lader man et I

I plasmid, der indeholder et gen for IFN-ω, f.eks. plasmid I

I P9A2 fordøje med restriktionsendonucleasen Avail. Efter I

I kromatografi og rensning af det tilvejebragte cDNA-ind- I

I 10 føjningsstykke lader man dette to gange fordøje med re- I

I striktionsendonucleaserne Ncol og Alul og derefter iso- I

I lere ved hjælp af kromatografi og elektroelution. Dette I

I fragment indeholder den største del af det tilsvarende I

I ω-interferon-gen. Eksempelvis udviser u>(Gly)-interfe- I

I 15 rongenet fra klonen P9A2 følgende struktur: I

I 10 15 I

I His Giv Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu I

I CI CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 2£ I

I Ncol I

I 20 20 25 30 I

I Val Leu Leu His Gin Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu I

I GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 I

I 35 40 45 I

I Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly I

I AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 I

I 25 I

50 55 60

Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met I

I AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 I

I 65 70 75 I

I Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala I

I 30 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG Ci3<· 208 I

I 80 85 90 I

Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His I

I GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 I

I 95 100 105 I

I Gin Gir. Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Giv I

I 35 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 I

25 DK 175194 B1 110 115 120

Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu 'Thr Leu 5 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA C TG ACC TTG 343 125 130 135

Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 140 145 150

Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys 10 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 155 160 165

Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 170

Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAÅTTTGCCATA 530 TAAC ACTTGC AC ATGTGAC TCTGGTCAATTC AAAAGAC TC TTATTTCGGC TTTAATC AC 589 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 20 TT ATTC TT AC ATTTT ATC ATATTTATAC TATTTATATTC TTATATAAC AAATGTTTGCC 766 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGfct 802

Alul 25 1 35

I DK 175194 B1 I

I 26 I

I Fragment b I

I Til fremstilling af fragment b) lader man plasmid I

I P9A2 fordøje med restriktionsendonucleasen Avail. Efter I

I kromatografi og rensning af det tilvejebragte cDNA-ind- I

I 5 sættelsesstykke lader man dette viderefordøje med re- I

I striktionsendonucleasen Sau3A og isolerer det ønskede I

I 189 bp lange fragment ved "hjælp af kromatografi og elek- I

I troelution. Dette fragment har følgende struktur: I

I 5 10 15 I

I Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr Leu I

I IgAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA C TT AGC AGG AAC ACC TTG 42 I

I s7u3a| NcoI I

I 20 25' 30 I

I 15 ^eu ^eu Gin ^et Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu I

I GTG C TT CTG CAC C AA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 87 I

I 35 40 45 I

I Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Met Val Lys Gly I

I AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 132 I

I 20 I

I 50 55 60 I

I Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu Eis Glu Met I

I ACG CAG TTG CAG AAG GGC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 177 I

I 25 Leu Gin Gin Ile I

I CTG CAG CAjg atc 189 I

I Sau3A| I

I 30 Fragment c I

I Til fremstilling af fragment c) lader man plasmi- I

I det pER33 (se E. Rastl-Dworkin et al./ Gene 21, 237-248 I

I (1983) og EP-A-0.115.613) fordøje to gange med restrik- I

I tionsenzymerne EcoRI og PvuII. Det efter agarosegel- I

I 35 fraktionering og rensning tilvejebragte 390 bp lange 27 DK 175194 B1 fragment, som indeholder Trp-promotor, det ribosomale bindingssted og startkodon, lader man derefter fordøje med Sau3A. Man tilvejebringer det ønskede 108 bp lange fragment ved agarosegel-elektroforese, elektroelution og 5 elutip-søjlerensning. Det udviser følgende struktur:

EcoRI |Sau3A

qaattcacgctjGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA 5 9 ,JmRNA-Start Met 10 ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAG ATG 116 RBS Hindlll

Cys Asp TGT gat c 123

Sau3A

15

Sammenbinding af fragmenterne b og c: 20 Fragmenterne b og c sammenbindes med T4-ligase og gennemskæres efter destruktion af enzymet med Hindlll.

Dette ligerede fragment har følgende struktur:

Hindlll Sau3A Ncol 25 alftGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 -] - ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 30 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAkqct t Sau3A Hindlll! 35

I DK 175194 B1 I

I 28 I

I 5 I

I 10 I

I Som alternativ kan dette DNA-fragment, der er I

I nødvendig til fremstilling af plasmid pRHWlO, også I

I 15 tilvejebringes ved anvendelse af to syntetisk fremstil- I

I lede oligonukleotider: I

I Oligonukleotidet med formlen I

I 5' -AGCTTAAAGATGTGT-3 ' I

I 20 I

I skal i sin 5'-ende være dephosphoryleret. I

I Oligonucleotidet med formlen I

I 5’-GATCACACATCTTTA-3' I

I 25 I

I behandles med T4-polynucleotidkinase og ATP ved 5'-en- I

I den. I

I Ved hybridisering af de to oligonucleotider får I

I man følgende korte DNA-fragment: I

I 30 I

I 5'-AGCTTAAAGATGTGT 3' I

I 3'- ATTTCTACACACTAGp 5' I

I Ved den ene ende opstår der et 5' -overhængende I

I 35 stykke, der er typisk for Hindlll, og ved den anden ende I

I et 5'-overhængende stykke, der er typisk for Sau3A. I

29 DK 175194 B1

Fragment b) dephosphoryliseres ved hjælp af kal-vetarmphosphatase. Fragment b) og det ovenfor beskrevne fragment bringes sammen og forbindes med hinanden ved hjælp af T4~ligase.

5 Da ligasen kræver en 5'-phosphatholdig ende, kan det syntetiske DNA-stykke i Sau3A-enden knyttes sammen med fragment b) eller med et andet syntetisk DNA-stykke.

Da de to resulterende fragmenter har forskellig længde, kan de skilles ved selektiv isopropanolfældning. Det 10 derved rensede fragment phosphoryleres ved hjælp af T4-polynucleotidkinase og ATP.

II. Fremstilling af ekspressionsplasmider 15 a) Fremstilling af plasmidet pRHWlO:

Man liniariserer ekspressionsplasmidet pER103 (E. Rastl-Dworkin et al.. Gene 21, 237-284 (1983) og EP-A-0.115.613, deponeret ved DSM med DSM-nummer 22773) med HindiII og behandler derefter med kalvetarmphosphatase.

20 Efter isolering og rensning af det tilvejebragte DNA, lader man dette dephosphorylere og sammenbinder det derefter med de ligerede fragmenter b og c (efter disses behandling med Hindlll). Derefter transformeres E. coli HB 101 med den tilvejebragte blanding og kultiveres på 25 LB-agar plus 50 iig/ml ampicillin. Plasmidet, der udviser den ønskede struktur, kalder man pRHW 10 (se fig. 6), det tjener efter sin replikation som mellemprodukt ved fremstilling af yderligere plasmider. b) Fremstilling af plasmid pRHWl2i 30 Man opskærer plasmid pRHWlO med BamHI, tilsætter

Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I og de fire deoxy-nucleosidtriphosphater. Det efter inkubation tilvejebragte liniariserede plasmid, der har stumpe ender, renses og gennemskæres derefter med Ncol. Det store frag-35 ment, som kan fås efter agarosegel-elektroforese, elek-

I DK 175194 B1 I

I 30 I

I troelution og elutip-rensning, saramenbindes med fragment

I a. Derefter transformeres blandingen med E. coli HB 101 I

I og kultiveres på LB-agar plus 50 yg/ml ampicillin. Pias- I

I midet, der udviser den ønskede struktur, får betegnelsen I

I 5 pRHWl2 (se fig. 6), der eksprimerer det ønskede I

I w(Gly)-interferon. I

I Til eksempel indeholder 1 liter af den således I

I tilvejebragte bakteriekultur (optisk tæthed: 0,6 ved 600 I

I nm) 1 x 10^ IE interferon. I

I 10 I

I c) Fremstilling af plasmid pRHWll: I Man lader plasmid pRHWIO opskære med BamHI og

I tilsætter Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I og de 4 I

I desoxynucleotsidphosphater. Det efter inkubation tilve- I

I 15 jebragte liniariserede plasmid, der har lige ender, ren- I

I ses og gennemskæres derefter med Ncol. Det store frag- I

I ment, som fås efter agarosegel-elektroforese, elektro- I

I elution og elutip-rensning, sammenbindes med fragment a I

I på analog måde, udvundet af plasmid E79E9, hvori dog det I

I 20 for den 111. aminosyre(Gly) kodende GGG-kodon er erstat- I

I tet med GAG-kodon (Glu). Derefter transformeres den I

I tilvejebragte blanding med E. coli HB 101 og opkultive- I

I res på LB-agar. Plasmidet, der udviser den ønskede

I struktur, får betegnelsen pRHWll (se analogt fig. 6) og I

I 25 det eksprimerer det ønskede u>(Glu)-interferon. I

I Transformation af cellerne med vehiklerne kan I

I foregå ved mange fremgangsmåder. Man kan f.eks. benytte I

I calcium, hvorved man enten vasker cellerne i magnesium, I

I suspenderer dem i calcium og tilsætter DNA, eller sætter I

I 30 cellerne til et fælles præcipitat af DNA og calciumphos- I

I phat· Ved følgende genekspression overføres cellerne I

I til et medium, der er selektiv overfor transformerede I

I celler. I

I Efter transformation af værten, ekspression af I

I 35 genet og fermentering eller celledyrkning under betin- I

31 DK 175194 B1 gelser, hvorunder IFN-ω bliver eksprimeret, kan man normalt. ekstrahere produktet ved hjælp af kendte kromatografiske skillemetoder og herved tilvejebringe et materiale, der indeholder IFN-ω med eller uden Leader- og 5 Tailing-sekvenser· IFN-ω kan eksprimeres med en Leader— sekvens ved N-enden (pre-IFN-ω), der kan fjernes af visse værtsceller. I modsat fald er det nødvendigt at fraspalte det eventuelle Leader-polypeptid for at tilvejebringe færdigt IFN-ω. Man kan også modificere IFN-ω-10 klonen således, at det færdige protein bliver produceret direkte i mikroorganismen i stedet for Pre-IFN-ω. I dette tilfælde kan man anvende precursorsekvensen fra gær-mating-pheromonet MF-e-1 for at opnå en korrekt færdiggørelse af det fusionerede protein og for at få udskilt 15 produktet i vækstmediet eller i periplasmaet. DNA-se-kvensen for funktionelt eller færdigt IFN-ω kan forbindes med MF-α-Ι på det formodede kathepsin-lignende snit-sted (efter Lys-Arg) ved position 256, regnet fra initieringskodon ATG (Kurjan, Herskowitz Cell 30, 933-943 20 (1982)).

På basis af deres biologiske virkningsområde er de hidtil ukendte interferoner ifølge opfindelsen anvendelige for enhver type behandling, som kendte interferoner benyttes til. Her kan f.eks. nævnes Herpes, Rhino-25 virus, eventuelle AIDS-infektioner, forskellige arter af cancer og lignende. De hidtil ukendte interferoner kan benyttes alene eller i kombination med andre kendte interferoner eller biologisk aktive produkter, f.eks. med IFN-α, IL-2, andre immun-modulatorer og lignende.

30 IFN-ω kan indgives parenteralt i tilfælde, hvor der ønskes antitumor eller antiviral behandling, og i tilfælde, hvor de immunsuppressive egenskaber skal udnyttes. Der kan benyttes lignende doseringer og doseringsrater, som man for tiden benytter ved kliniske un-35 dersøgelser med IFNa-materialer, f.eks. ca. (1-10) x 10®

I DK 175194 B1 I

I 32 I

I enheder daglig, og præparater, der er mere end 1% rene I

I op til f.eks. 5 x 10^ enheder daglig. I

I Eksempelvis kan man som passende dosis ved et i I

I det væsentlige bakterielt produceret IFN-ω, der skal an- I

I 5 vendes parenteralt, opløse 3 mg IFN-ω i 25 ml 5% humant I

I serumalbumin. Denne opløsning passeres gennem et bakte- I

I riologisk filter, og den filtrerede opløsning fordeles I

I aseptisk på 100 små flasker, af hvilke hver indeholder 6 I

I x 10^ enheder ren IFN-ω til parenteral brug. Før anven- I

I 10 delsen opbevares småflaskerne hensigtsmæssigt koldt I

I (-20°C). Forbindelserne ifølge opfindelsen kan formule- I

I res på kendt måde til farmaceutisk anvendelige midler, I

I hvorved polypeptidet ifølge opfindelsen blandes med en I

I farmaceutisk acceptabel bærer. Anvendelige bærere og I

I 15 deres formulering beskrives af E.W. Martin i Remington's I

I Pharmaceutical Sciences, hvortil der udtrykkelig henvi- I

I ses. IFN-ω blandes med en afmålt mængde bærestof for at I

I tilvejebringe et egnet farmaceutisk middel, der på ef- I

I fektiv måde skal anvendes på patienten. Midlet anvendes I

I 20 med fordel parenteralt. I

I De følgende eksempler, der ikke skal begrænse op- I

I findelsen, beskriver opfindelsen i detailler. I

25 Eksempel 1 I

I Udsøgning af kloner, der er specifikke for IFN-sékvensen I

I a) Fremstilling af cDNA-bibliotek I

I mRNA fra celler, stimuleret med Sendai-virus, be- I

I 30 nyttes som udgangsmateriale til fremstilling af et cDNA- I

I bibliotek efter metoder, kendt fra litteraturen (E. I

I Dworkin-Rastl et al., Journal of Interferon Research Vol I

I 2/4, 575-585 (1982)). De dannede 30.000 kloner overfø- I

I res individuelt til fordybningerne i mikrotiterplader. I

I 35 Følgende medium anvendes ved vækst og indfrysning af ko- I

33 DK 175194 B1 lonierne: 10 g Trypton 5 g gærekstrakt 5 5 g NaCl

0,51 g Na-citrat, 2 H2O

7,5 g K2HPO4 H2O 1,8 g KH2PO4 0,09 g MgS04, 7 H2O

10 0,9 g (NH4)2SO4

44 g glycerin 0,01 g tetracyclin, HC1 ad 1 1 H2O

15 Mikrotiterpladerne med de individuelle kloner in kuberes natten over ved 37°C og opbevares derefter ved -70°C.

b) Hybridiseringssonde 20 Som udgangsmateriale for hybridiseringssonder tjener det rekombinante plasmid pER33 (E. Dworkin-Rastl et al.. Gene 21, 237-248 (1983)). Dette plasmid indeholder koderegionen for det færdige interferon IFN-a2-arg plus 190 baser, der tilhører den 3' ikke-translate-25 rende region. 20 ug pER33 inkuberes en time ved 37°C med 30 enheder Hindlll restriktionsendonuclease i 200 yl reaktionsopløsning (10 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiotreitol (DTT), 50 mM NaCl). Reaktionen standses ved tilsætning af 1/25 vol 0,5 M ethylendini-30 trilotetraeddikesyre (EDTA) og ophedning til 70°C i ti minutter. Efter tilsætning af 1/4 vol 5 x puffer (80% glycerin, 40 mM tris-eddikesyre pH 7,8, 50 mM EDTA, 0,05% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% bromphenolblåt), lader man de dannede fragmenter adskille efter størrelse 35 elektroforetisk på en 1% agarosegel [gel- og gennemløbs-

I DK 175194 B1 I

I 34 I

I puffer (TBE)? 10,8 g/l trishydroxymethylaminomethan I

I (Trisbase), 5,5 g/l borsyre 0,93 g/l EDTA]. Man inku- I

I berer gelen med en 0,5 yg/ml ethidiumbromidopløsning, I

I hvorved DNA-båndene bliver synlige i UV-lys, og udskærer I

I 5 den del af gelen, der indeholder det IFN-gelholdige DNA- I

I stykke (ca. 800 bp længde). Man påsætter en spænding og I

I elektroeluerer DNA i 1/10 x TBE-puffer. DNA-opløsningen I

I ekstraheres en gang med phenol og fire gange med ether, I

I og DNA udfældes ved tilsætning af 1/10 vol 3 M natrium- I

I 10 acetat (NéiAc) pH 5,8, og 2,5 vol EtOH fra den vandige I

I opløsning ved -20°C. Man fracentrifugerer DNA, vasker I

I en gang med 70% ethanol og tørrer fem minutter i vakuum. I

I Hertil tilsættes 50 μΐ vand (ca. 50 yg/yl). Denne DNA I

I mærkes radioaktivt ved hjælp af haktranslation (modifi- I

I 15 ceret efter T. Maniatis et al., Molecular Cloning, ed. I

I CSH). 50 μΐ inkubationsopløsning indeholder: 50 mM I

I Tris pH 7,8, 5 mM MgCl2# 10 mM mercaptoethanol, 100 ng I

I indføjning-DNA fra pER33, 16 pg DNasel, 25 yMol dATP, I

I 25 μΜοΙ dGTP, 25 μΜοΙ dTTP, 20 μΟί a32P-dCTP (> 3000 I

I 20 Ci/mMol) såvel som 3 enheder DNA-polymerase I (E. coli). I

I Inkubationen foregår ved 14°C i 45 minutter. Man stand- I

I ser reaktionen ved at tilsætte 1 vol 50 mM EDTA, 2% SDS, I

I 10 mM Tris pH 7,6 opløsning og opvarmer til 70°C i ti I

I minutter. DNA skilles ved kromatografi over Sephadex I

I 25 G-100 i TE-puffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) fra ik- .1

I ke indbygget radioaktivitet. Den radioaktivt mærkede I

I sonde udviser en specifik aktivitet på ca. 4 x 10^ I

I cpm/yg. I

I c) Udvælgelse af kloner med IFN-genholdig indføjning I

I 30 Man optøer bakteriekulturerne, der er nedfrosset I

I på mikrotiterpladerne (a). Et stykke nitrocellulosefil- I

I ter af passende størrelse (Schleicher og Schiill, BA 85, I

I 0,45 μπ porestørrelse) lægges på LB-agar (LB-agar: 10 I

I g/l trypton, 5 g/l gærekstrakt, 5 g/l NaCl, 15 g/l bacto I

I 35 agar, 20 mg/l tetracyclin-HCl). Med et stempel, der I

35 DK 175194 B1 passer til mikrotiterpladen, overføres de individuelle kloner til nitrocellulosefilteret. Natten over vokser bakterierne ved 37°C til kolonier på ca. 5 ram diameter.

For at destruere bakterierne og denaturere DNA, lægger 5 man nitrocellulosefilteret i rækkefølge på stabler af Whatman 3MM filter stænket med følgende opløsninger: 1) 8 minutter på 0,5 M NaOH, 2) 2 minutter 1 M Tris pH 7,4, 3) 2 minutter 1 M Tris pH 7,4 og 4) 4 minutter 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris pH 7,4. Filtrene lufttørres og 10 holdes derefter to timer ved 80°C. Forbehandlingen af filtrene varede fire timer ved 65°C i hybridiseringsop-løsningen, der består af 6 x SSC (1 x SSC svarer til 0,15 M NaCl; 0,015 M trinatriumcitrat; pH 7,0), 5 x

Denhardt's opløsning (1 x Denhardt's opløsning svarer 15 til 0,02% PVP (polyvinylpyrrolidon)? 0,02% Ficoll (MG:

40.000 D); 0,02% BSM (Bovine-serum albumin) og 0,1% SDS

(natriumdodecylsulfat). Ca. 1 x 10^ cpm pr. filter af sonden, fremstillet i b) denatureres ved kogning og tilsættes hybridiseringsopløsningen. Hybridiseringen varer 20 16 timer ved 65°C. Filtrene vaskes fire gange en time ved 65°C med 3 x SSC/0,1% SDS. Filtrene lufttørres, beskyttes med Saran Wrap og eksponeres på Kodak X-OmatS film. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2

Eksempel 2 3

Kontrol af IFN-gehholdige rekombinante plasmider ved 4 hjælp af Southern Transfer_ 5

Af de positive eller mistænkelig positivt reage- 6 rende kolonier dyrkes 5 ml kulturer i L-urt (10 g/l 7 trypton, 5 g/l gærekstrakt, 5 g/l NaCl, 20 mg/l tetra- 8 cyclin x HC1) natten over ved 37°C. Plasmid-DNA isole 9 res modificeret efter Birnboim og Doly (Nucl. Acid Res.

10 7, 1513, (1979)). Cellerne centrifugeres fra 1,5 ml su- 11 spension (Eppendorf-centrifuge) og udsuspenderes igen ved

I DK 175194 B1 I

I 36 I

I 0°C i 100 yl lysozymopløsning, der består af 50 mM glu- I

I kose, 10 mM EDTA, 25 mM tris-HCl pH 8,0 og 4 mg/ml lyso- I

I zym. Efter fem minutters inkubation ved stuetemperatur I

I tilsætter man 2 rumfangsdele iskold 0,2 M NaOH, 1% SDS- I

I 5 opløsning og inkuberer yderligere fem minutter. Derefter I

I tilsætter man 150 yl iskold kaliumacetatopløsning pH I

I 4,8 og inkuberer fem minutter. De udfældede celledele I

I bortcentrifugeres. DNA-opløsningen ekstraheres med 1 I

I rumfangsdel phenol/CHC3 (1:1), og DNA udfældes ved til- I

I 10 sætning af 2 rumfangsdele ethanol. Efter centrifugering I

I vasker man bundfaldet en gang med 70% ethanol og tørrer I

I fem minutter i vakuum. DNA opløses i 50 yl (TE)-puffer. I

I 10 yl heraf sættes til 50 yl reaktionsopløsning (10 mM I

I Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2> 50 mM NaCl, 1 mM DTT) I

I 15 og fordøjes en time ved 37°C med 10 enheder Pstl-re- I

I striktionsendonuclease. Man tilsætter 1/25 del rumfang I

I 0,5 M EDTA og 1/4 rumfang 5 x puffer (se Eksempel lb)), I

I opheder ti minutter til 70°C og fraskiller derefter DNA I

I elektroforetisk på en 1% agarosegel (TBE-puffer). DNA i I

I 20 agarosegel overføres efter Southern's metode (E. Μ. I

I Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) til et ni- I

I trocellulosefilter. Gelen inkuberes en time med en 1,5 I

I M NaCl/0,5 M NaOH-oplØsning, hvorved DNA denatureres. I

I Derefter neutraliserer man en time med en 1 M Tris x HC1 I

I 25 pH 8/1,5 M NaCl-opløsning. DNA overføres til nitrocel- I

I lulosefilteret med 10 x SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M natrium- I

I citrat, pH 7,0). Når overførslen er tilendebragt (ca. I

I 16 timer) skyller man filteret kortvarigt i 6 x SSC-puf- I

I fer, lufttørrer det og bager det to timer ved 80°C. Fil- I

I 30 teret forbehandles fire timer med en 6 x SSC/5 x I

I Denhardt's opløsning/0,1% SDS (se Eksempel lc) ved 65°C. I

I Ca. 2 x 10^ cpm af hybridiseringssonden (se Eksempel lb) I

I denatureres ved ophedning til 100°C og anbringes i hy- I

I bridiseringsopløsningen. Man hybridiserer 16 timer ved I

I 35 65°C. Derefter vasker man filteret 4x1 time ved 65°C I

37 DK 175194 B1 med en 3 x SSC/0,1% SDS-opløsning. Efter lufttørring dækkes filteret med Saran Wrap og eksponeres på Kodak X-Omats film.

5

Eksempel 3 Påvisning af interferonaktivitet i klon E76E9

En 100 ml kultur af klon E76E9 dyrkes i L-urt (10 g/1 trypton, 5 g/l gærekstrakt, 5 g/1 NaCl, 5 g/l glu-10 kose, 20 mg tetracyclin x HC1 pr. 1) til en optisk tæthed Agoo = 0*8* Bakterierne fracentrifugeres i 10 minutter ved 7000 rpm, vaskes en gang med en 50 mM Tris x HC1 pH 8,0, 30 mM NaCl-opløsning og suspenderes i 1,5 ml vaskeopløsning. Man inkuberer \ time ved 0°C med 1 15 mg/ml lysozym og nedfryser og genoptøer derefter bakteriesuspensionen fem gange. Celleresterne bortcentrifugeres ved 40.000 rpm en time. Man sterilfiltrerer centrifugatet og prøver det for interferonaktivitet.

Herved anvender man Plaque-reduktionstesten med 20 V3-celler og "Vesicular Stomatitis Virus" (G. R. Adolf et al., Arch. Virol. 72, 169-178 (1982)). På uventet vis producerer klonen op til 9000 IU interferon pr. liter udgangskultur.

25 Eksempel 4

Genomisk Southern Blot til bestemmelse af antal gener med hidtil ukendte sekvenser_ a) Isolering af DNA fra Namalwa-celler 30 Man centrifugerer 400 ml af en Namalwa-cellekul tur i en JA21-centrifuge ved 1000 rpm for at udfælde cellerne. Bundfaldet vasket forsigtigt, idet det udsuspenderes i NP40-puffer (NP40-puffer: 140 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris/Cl pH 7,4) og udfældes igen ved 35 1000 rpm. Det nye bundfald udsuspenderes i 20 ml NP40-

I DK 175194 B1 I

I 38 I

I puffer og tilsættes 1 ml 10% NP40-opløsning, så celle- I

I væggene kan ødelægges. Efter fem minutter i isbad lader I

I man de intakte cellekærner udcentrifugere ved 1000 rpm I

I og kasserer centrifugatet. Man suspenderer cellekærner- I

I 5 ne i 10 ml af en opløsning, der består af 50 mM Tris/Cl I

I pH 8,0, 10 mM EDTA og 200 mM NaCl, og tilsætter 1 ml I

I 20% SDS for at fjerne proteiner. Den tilvejebragte vi- I

I skose opløsning ekstraheres to gange med samme mængde I

I phenol (mættet med 10 mM Tris/Cl pH 8,0) og to gange med I

I 10 chloroform. DNA udfældes ved ethanoltilsætning, fra- I

I skilles ved centrifugering, hvorefter DNA-bundfaldet I

I vaskes en gang med 70% ethanol, tørres fem minutter i I

I vakuum og opløses i 6 ml TE-puffer (TE-puffer: 10 mM I

I Tris/Cl pH 8,0, 1 mM EDTA). Koncentrationen af DNA er I

I 15 0,8 mg/ml. I

I b) Restriktions-endonuclease-fordØjelse af DNA fra Na- I

I malwaceller__ I

I Restriktions-endonuclease-fordøjelsen udføres ved I

I 20 betingelser angivet af producenten (New England I

I Biolabs). 1 yg DNA fordøjes med 2 enheder egnet restrik- I

I tions-endonuclease i et rumfang på 10 yl ved 37°C i to I

I timer eller længere· EcoRI, Hindlll, BamHl, SphI, I

I PstI og Clal anvendes som restriktionsendonucleaser. I

I 25 Hver gang anvendes 20 yg DNA. Til kontrol af fordøjel- I

I sesreaktionens forløb skiller man hver gang ved reaktio- I

I nens begyndelse 10 yl fra (alikvote mængder) og omsast ter I

I med 0,4 yg Xphag-DNA. Man kontrollerer disse alikvote I

I mængder efter to timers inkubation ved hjælp af agarose- I

I 30 gel-elektroforese og bedømmer fuldstændigheden for for- I

I døjelsesprocessen ved hjælp af en farveprøve for λ-phag- I

I DNA-fragmenter. I

I Efter kontrollen standser man reaktionen ved at I

I tilsætte EDTA til en slutkoncentration på 20 mM og ophe- I

I 35 der ti minutter til 70°C. DNA udfældes ved tilsætning I

39 DK 175194 B1 af 0,3 M NaAc pH 5,6, og 2,5 rumfangsdele ethanol. Efter 30 minutters inkubation ved -70°C udfældes DNA i en Eppendorf-centrifuge, vaskes en gang med 70% ethanol og tørres. Den tilvejebragte DNA opbevares i 30 ul TE-puf-5 fer.

c) Gelelektroforese og Southern Transfer

De fordøjede DNA-sonder skilles efter størrelse på 0,8% agarosegel i TBE-puffer (10,8 g/l Tris-base, 5,5 10 g/l borsyre, 0,93 g/l EDTA). Til dette formål blander man 15 yl af DNA-sonden med 4 yl puffer (0,02% SDS, 5 x TBE-puffer, 50 mM EDTA, 50% glycerin, 0,1% Bromphenol-blåt), opheder i kort tid til 70°C og anbringer opløsningen i en fordybning i gelen. λ-DNA, som er opskåret 15 med EcoRI og Hindlll, anbringes i en tilsvarende fordybning og benyttes som markør for DNA-størreisen. Man udfører gel-elektroforesen i løbet af 24 timer ved omkring 1 V/cm. Derefter anbringes DNA efter Southern’s metode på et nitrocellulosefilter (Schleicher og Schuell, BA 20 85), herved benyttes som overføringspuffer 10 x SSC (1 x SSC: 150 mM trinatriumcitrat, 15 mM NaCl, pH 7,0). Man tørrer filteret ved stuetemperatur og opheder det derefter to timer til 80°C for at binde DNA hertil.. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 d) Hybridiseringssonde 2 20 yg plasmid P9A2 opskæres med Avail, hvorved 3 der dannes et fragment på omtrent 1100 pb længde, som 4 indeholder hele cDNA-indføjningen. Dette DNA-stykke op 5 skæres igen med Sau3A og Alul, og det største DNA-stykke 6 isoleres efter agarose-gel-elektroforese (se fig. 5b) 7 ved hjælp af elektroelution og elutip-søjlekromatografi.

8

Det på denne måde tilvejebragte DNA (1,5 yg) opløses i 9 15 μΐ vand.

10 20 yg plasmid pER33 opskæres med Hindlll, som op- 11 skærer dette ekspressionsplasmid for IFN-α 2-Arg to gan-

I DK 175194 B1 I

I 40 I

I ge (E. Rastl-Dworkin et al. Gene 21, 237-248 (1983)). I

I Det lille DNA-fragment indeholder genet for interferon- I

I ct2Arg og isoleres på samme måde som ved plasmid P9A2. I

I Begge DNA-stykker haktranslateres efter en meto- I

I 5 de, foreslået af P.W.J. Ribgy et al. (J. Mol. Biol. 113, I

I 237-251 (1977)). Haktranslationen gennemføres begge I

I gange med 0,2 pg DNA i en opløsning på 50 yl, der består I

I af 1 x hakpuffer (1 x hakpuffer: 50 mM Tris/Cl pH 7,2, I

I 10 mM MgS04, 0,1 mM DTT, 50 pg/ml BSA), hver gang med I

I 10 100 μΜοΙ dATP, dGTP og dTTP, 150 pCi a-1P-dCTP I

I (Amersham, 3.000 Ci/mMol) og 5 enheder DNA-polymerase I I

I (Boehringer-Mannheim, haktranslationskvalitet). Efter I

I to timer ved 14°C standser man reaktionen ved tilsætning I

I af den samme mængde af en EDTA-oplØsning (40 mmol) og I

I 15 fjerner det ikke omsatte radioaktive materiale ved hjælp I

I af G50-søjlekromatografi med TE-puffer. Den blivende I

I specifikke radioaktivitet er omtrent 100 x 10^ cpm/pg I

I DNA. I

I e) Hybridisering og autoradiografi I

I 20 Man skærer nitrocellulosefilteret i to halvdele.

I De to halvdele indeholder identiske påsætninger af Na- I

I walwa-DNA, som er behandlet med de restriktionsenzymer, I

I der er nævnt i Eksempel 4a. Filtrene præhybridiseres to ' I

I timer ved 65°C i en opløsning, der indeholder 6 x SSC, 5 I

I 25 x Denhardt’s (1 x Denhardt'ss 0,02% bovin serum-albumin I

I (BSA), 0,02% polyvinylpyrrolidon (PVP), 0,02% Ficoll I

I 400), 0,5% SDS, 0,1 mg/ml denatureret kalvebrissel-DNA I

I og 10 mM EDTA. Hybridiseringen gennemføres i 16 timer I

I ved 65°C i en opløsning, der indeholder 6 x SSC, 5 x I

I 30 Denhardt's, 10 mM EDTA, 0,5% SDS og omtrent 10 x 106 cpm I

I haktranslateret DNA. Den ene halvdel af filteret hybri- I

I diseres med interferon-a2-Arg-DNA, og den anden halvdel I

I med interferon-DNA, der er isoleret fra plasmid P9A2. I

I Efter hybridiseringen vaskes begge filtre ved stuetempe- I

I 35 rator fire gange med en opløsning, der består af 2 x SSC I

41 DK 175194 B1 og 0,1% SDS, og derefter to gange ved 65°C med en opløsning, der består af 0,2 x SSC og 0,01% SDS. Derefter tørrer man filtrene og eksponerer på en Kodak X—Omat S— film.

5 Eksempel 5

Fremstilling af ekspressionsplasmiderne _pRHW 12 og pRHW 11_

Indledning: 10 Fremstilling af ekspressionsplasmiderne belyses i fig. 6 (ikke skalatro), endvidere udføres alle restriktionsenzymf ordø jelserne efter producentens anvisning.

a) Fremstilling af plasmid pRHW 10 15 Man lader 100 ug plasmid P9A2 fordøje ved hjælp af 100 enheder restriktion-endonuclease Avail (New Englands Biolabs). Herefter inaktiverer man enzymet ved ophedning til 70°C og fraktionerer de tilvejebragte fragmenter efter størrelse på en 1,4% agarosegel med 20 TBE-puffer (TBE-puffer: 10,8 g/l Tris-base, 5,5 g/l borsyre, 0,93 g/l EDTA). Båndene, som indeholder hele cDNA-indfØjningsstykket, elektroelueres og renses på en elutipsøjle (Schleicher & Schuell). Man tilvejebringer 20 ug, og heraf viderefordøjes 6 ug med restriktionsen-25 donucleasen Sau3a (20 enheder ialt 100 ul opløsning).

Man adskiller fragmenterne ved hjælp af 2% agarosegel TBE-puffer. Efter farvning med ethidiumbromid (EtBr) elektroeluerer man det 189 bp lange DNA-stykke og renser det som beskrevet ovenfor (= fragment b i fig. 6).

30 Man isolerer det tilsvarende DNA-stykke fra eks- pressionsplasmidet pER33 (E. Rastl-Dworkin et al.. Gene 21, 237-248 (1983)) for at kunne føje interferongenet sammen med en promotor, et ribosomalt bindingssted og en startkodon. Til dette formål lader man 50 ug pER 33 to 35

I DK 175194 B1 I

I 42 I

I gange fordøje med restriktionsenzymerne EcoRI og PvuII I

I og fraktionerer de tilvejebragte fragmenter efter stør- I

I relse på en 1,4% agarosegel i TBE-puffer. Det 389 bp I

I lange DNA-stykke, som indeholder Trp-promotoren, det ri- I

I 5 bosomale bindingssted, og startkodonen, elektroelueres I

I og renses over en elutipsøjle. Det således tilve- I

I jebragte fragment lader man derefter fordøje med Sau3A, I

I og det ønskede 108 bp lange fragment får man ved hjælp I

I af agarosegelelektroforese, elektroelution og elutip- I

I 10 søjlerensning med et udbytte på omkring 100 ng (= frag- I

I ment c i f ig. 6). I

I 20 ng af fragment b sammenføjes i løbet af 18 I

I timer ved 14°C med 20 ng af fragment c i et volumen på I

I 40 μΐ under anvendelse af 10 enheder T4-ligase i en op-

I 15 løsning, som indeholder 50 mM Tris/Cl pH=7,5, 10 mM I

I MgCl2# 1 mM DTT og 1 mM ATP. Derefter lader man enzymet I

I destruere ved ophedning til 70°C og lader det tilveje- I

I bragte DNA opskære med HindiII i et totalrumfang på 50 I

lul. I

I 20 Man lader 10 yg af ekspressionsplasmidet pER 103 I

I (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983)) lini- I

I arisere med Hindlll i et totalrumfang på 100 μΐ. Efter I

I to timer ved 37°C tilsætter man 1 volumen 2 x phosphata- I

I sepuffer (20 mM Tris/Cl ph 9,2, 0,2 mM EDTA) sammen med I

I 25 en enhed kalvetarmsphosphatase (CIP). Efter 30 minutter I

I ved 45°C tilsætter man en yderligere enhed CIP og inku- I

I berer yderligere i 30 minutter. Det på denne måde til- I

I vejebragte DNA renses ved hjælp af dobbelt phenoleks- I

I traktion, enkelt chloroformekstraktion og fældning ved I

I 30 tilsætning af 0,3 M natriumacetat (pH = 5,5) og 2,5 rum- I

I fang ethanol. Dernæst dephosphorylerer man for at for- I

I hindre, at vektoren ved næste procestrin skal gendannes. I

I Man sammenbinder i løbet af 18 timer ved 14°C 100 I

I ng af det liniariserede pER 103, og de ligerede fragmen- I

I 35 ter b og c (efter fordøjelse med Hindlll) i en opløsning I

43 DK 175194 B1 på 100 yl, der indeholder ligasepuffer, med T4-DNA-liga-se.

200 yl forberedt E. coli HB 101 (E. Dworkin et al., Dev. Biol. 76, 435-448 (1980)) blandes med 20 yl af 5 den ovennævnte blanding og inkuberes i 45 minutter på is. Derefter standses DNA-optagelsen ved hjælp af et varmechock på 42°C i to minutter. Cellesuspensionen inkuberes yderligere ti minutter på is, og overføres derefter til LB-agar (lOg/l trypton, 5 g/l gærekstrakt, 5 10 g/l NaCl, 1,5 % agar), som indeholder 50 mg/l ampicil-lin. Plasmiderne, der findes i de tilvejebragte 24 kolonier, isoleres efter en metode angivet af Birnboim og Doly (se Nucl. Acid. Res. 7, 1513-1523 (1979)). Efter fordøjelse med forskellige restriktionsenzymer udviser 15 et plasmid den ønskede struktur. Dette får betegnelsen pRHW 10 (se fig. 6).

b) Fremstilling af plasmid pRHW 12

Ca. 10 yg af plasmid pRHW 10 opskæres med BamHI.

20 Derefter tilsætter man Klenow-fragmentet fra DNA-polyme-rase I, og de fire deoxynucleosid-triphosphater og inkuberer 20 minutter ved stuetemperatur. Det tilvejebragte liniariserede plasmid, der har lige ender, renses ved phenolekstraktion og fældning og opskæres derefter med 25 restriktionsendonuclease Ncol i et volumen på 100 yl.

Det største fragment udvindes ved hjælp af agarosegel-elektroforese, elektroelution og elutip-rensning. Fragment a) (se fig. 6) tilvejebringer man fra 4 yg Avall-fragment, som indeholder P9A2-cDNA-indføjningsstykket 30 (se ovenfor) ved fordøjelse med Ncol og Alul, hvorved man opnår omtrent 2 yg fragment a).

Til slut sammenføjes fragment a), og det dertil tilsatte to gange med BamHl/NcoI fordøjede pRHW 10 i et volumen på 10 yl, idet der anvendes 10 ng af hver DNA.

35 Ved sammenføjning af et opfyldt BamHI-opskæringssted til

I DK 175194 B1 I

I 44 I

I en DNA, der er opskåret med Alul, opstår igen et BamHI- I

I opskæringssted. I

I Den ovenfor nævnte blanding transformeres med I

I forbehandlet E. coli HB 101 som beskrevet ovenfor. Af I

I 5 de tilvejebragte 40 kolonier udvælger man en, som får I

I betegnelsen pRHW 12. I

I Plasmidet isoleres, og EcoRI/BamHI-indføjnings- I

I stykket sekvensanalyseres efter Sangers metode (F. I

I Sanger et al., Proc. Nat- Acad. Sci 74, 5463 - 5467 I

I 10 (1979)). Det indeholder den ventede sekvens.

I c) Fremstilling af plasmid pRHW 11 I

I Fremgangsmåden følger Eksempel 5b. 1 yg af plas- I

I mid pRHW 10 fordøjes med BamHI. De klæbrige ender af I

I 15 det tilvejebragte DNA afstumpes ved hjælp af Klenow- I

I fragmentet fra DNA-polymerase I og de 4 deoxynucleosid- I

I triphosphater, derefter opskæres det liniariserede DNA I

I med Ncol. Det store fragment udvindes ved hjælp af aga- I

I rosegel-elektroforese, elektroelution og Elutip-søjle- I

I 20 kromatografi. I

I NcoI-AluI-fragmentet fra klon E76E9 isolerer man I

I som i Eksempel 5b. 10 ng af dette vektorfragment og 10 I

I ng af cDNA-fragmentet sammenbinder man i et rumfang på I

I 10 μΐ under egnede betingelser ved hjælp af en enhed T4- I

I 25 ligase· Efter transformation af DNA-blandingen i E. coli I

I HB 101 og gennemsøgning af de tilvejebragte 45 kolonier I

I på LB-plader, der indeholder ampicillin, udvælger man en I

I klon, som får betegnelsen pRHWll. Klonen opdyrkes, og I

I man isolerer plasmid DNA. Dettes struktur bekræftes I

I 30 ved, at det indeholder restriktions-endonuclease-snit- I

I steder for Alul, EcoRI, HindlH, Ncol, Pstl. I

I 35 I

45 DK 175194 B1 d) Ekspression af interferon-aktivitet af E. coli HB 101, der indeholder plasmid pRHW 12_ 100 ml af bakteriekulturen inkuberes i M9 minimal medium, som indeholder alle aminosyrer undtagen tryptho-5 phan (20 vg/ml pr. aminosyre), 1 ug/ml thiamin, 0,2% glukose og 20 pg/ml indol(3)-acrylsyre (IAA), induktor for tryphtophan-operon, indtil en optisk tæthed på 0,6 ved 600 nm. Derpå udcentrifugerer man bakterierne (ti minutter, 7000 rpm), vaskes en gang med 50 mM Tris/Cl pH 10 =8,, 30mM NaCl og udsuspenderer i 1,5 ml af denne puffer. Der inkuberes 30 minutter med 1 mg/ml lysosym på is, hvorefter man fem gange udfryser og optøer bakterierne. Man fjerner celleresterne ved centrifugering en time ved 40.000 rpm. Centrifugatet sterilfiltreres og 15 prøves for interferonaktivitet ved en plaque-reduktions-prøve under anvendelse af humane A549 celler og Encopha-lo-myocarditisvirus.

Resultat: 1 1 af den fremstillede bakteriekultur inde holder 1 x 10^ IE interferon (A. Billian, 20 Antiviral Res. 4, 75-98 (1984)).

Eksempel 6

Forskelle i aminosyre- og nucleotis-sekvenser for type I-interferoner_ 25 a) Sammenligning af aminosyresekvenserne

Den parvise sammenligning af aminosyresekvenserne foretages således, at man begynder sammenligningen med den første cysteinrest i det færdige α-interferon og ved den første cysteinrest i de aminosyresekvenser, som 30 cDNA-indføjningerne i plasmiderne P9A2 og E76E9 koder for. Begge sekvenser kaldes i fig. 7 IFN-ω, da man ved de opnåede værdier ikke kunne fastslå nogen forskelle mellem de specifikke sekvenser, der hører til P9A2 og til E76A9-kIonerne. Den eneste rettelse var indførelsen 35 af en tom plads ved position 45 hos interferon aA, som

I DK 175194 B1 I

I 46 I

I blev talt som en fejl. Når ω-interferon sekvens er part I

I i sammenligningen, udføres denne under hensyntagen til I

I de sædvanlige 166 aminosyrer. Denne værdi gives i fig. I

I 7 sammen med værdier for de øvrige 6 aminosyrer, som I

I 5 klonerne P9A2 og E76E9 koder for. Man får procentfor- I

I skellene ved division af de udregnede forskelle med tal- I

I let 1,66. En ekstra aminosyre svarer således til et I

I procenttal på 0,6. For de seks ekstra aminosyrer i IFN- I

I ω giver dette 3,6%, som allerede er indregnet i procent- I

I 10 tallet. I

I Ved sammenligning med β-interferon begynder man I

I ved den 3. aminosyre i det færdige β-interferon, og med I

I den første aminosyre i det færdige α-interferon eller I

I den første aminosyre, for hvilken plasmiderne P9A2 og I

I 15 E76E9 koder. Den længste sammenligningsstruktur for o- I

I interferon versus β-interferon løber således over 162 I

I aminosyrer, og der er to ekstra aminosyrer både for α- I

interferon og for β-interferon. Disse tælles som fejl I

I og vises separat i fig. 7, men er indregnet i procent- I

I 20 tallene. Sammenligning af β-interferon med aminosyrese- I

I kvenserne, der tilhører klonerne P9A2 eller E76E9, gen- I

I nemføres på samme måde. Herved optræder der dog ialt 10 I

I ekstra aminosyrer. I

I 25 b) Sammenligning af nucleotid-sekvenser I

I Opstilling af sekvenser til sammenligning foregår I

analogt med Eksempel 6a). Det første nucleotid i det I

I færdige α-interferon DNA er det første nucleotid, der I

I hører til tripletten, der koder for cystein i det færdi- I

I 30 ge α-interferon. Det første nucleotid i DNA fra plas- I

I miderne P9A2 eller E76E9 er også det første nucleotid i I

I kodonen for cystein-1. Det første nucleotid i DNA fra I

I β-interferon er det første nucleotid i den tredie tri- I

I plet. Sammenligningen løber over ialt 498 nucleotider, I

35 når de enkelte DNA fra α-interferonerne sammenlignes med I

47 DK 175194 B1 DNA fra β-interferon, og over 516 nucleotider, når DNA-sekvenserne fra de enkelte a-interferoner eller &-inter-feron bliver sammenlignet med sekvenserne fra plasmider-ne P9A2 og E76E9. Det absolutte fejltal angives i den 5 venstre del af tabellen på fig. 7, og derefter følger i parentes det tilsvarende procenttal.

Eksempel 7 10 Virusinducerbar ekspression for ω-1-mRNA og NC37-celler a) Syntese af en specifik hybridiseringssonde for interferon___ 10 ymol af oligonucleotidet d(TGCAGGGCTGCTAA) 15 blandes med 12 ymol γ-^Ρ-ΑΤΡ (specifik aktivitet: >

5000 Ci/mMol) og 10 enheder polynucleotid-kinase i et totalrumfang på 10 yl (70 mM Tris/Cl pH = 7,6, 10 mM

MgCl2/ 50 mM DTT), og man lader blandingen stå en time ved 37°C. Derefter standses omsætningen ved en 10 mi-20 nutter lang ophedning til 70°C. Det tilvejebragte radioaktivt markerede oligonucleotid hybridiseres med 5 yMol M13pRHW 12 ssDNA (se fig. 9) i et totalvolumen på 35 yl (100 mM NaCl) i en time ved 50°C.

Der køles til stuetemperatur og tilsættes hak-25 translationspuffer, de 4-desoxynucleosid-triphosphater og 10 enheder Klenow-polymerase til et totalvolumen på 50 yl (50 mM Tris/Cl pH = 7,2, 10 mM MgCl2, 50 yg/ml BSA, 1 mM pr. nucleotid). Polymeriseringen gennemføres en time ved stuetemperatur og standses derefter ved op-30 hedning i fem minutter til 70°C.

Ved omsætningen opnår man et delvist dobbeltstrenget cirkulært DNA. Dette opskæres derefter i et totalvolumen på 500 yl med 25 enheder Avail, hvorved den af producenten foreskrevne puffer anvendes. Herved op-35 skæres den dobbeltstrengede region i ensartede størrel-

I DK 175194 B1 I

I 48 I

H ser. Derefter standses omsætningen ved en 5-minutters I

I ophedning til 70°C. I

b) Fremstilling af RNA fra virus-inficerede celler I

I 5 100 x lO^celler (0,5 x 10^/ml) behandles 48-72 I

I timer med 100 μΜοΙ dexamethason - kontrolprøven indehol- I

I der ingen dexamethason. Til brug for interferon-induk- I

I tion suspenderes ekspressionscellerne i et serumfrit me- I

dium i en koncentration på 5 x 106/ml og inficeres med I

10 2^® enheder/ml Sendai-virus. Aliquote dele af væske I

I over cellekulturbundfaldet prøves i Plaque-reduktions- I

prøven (Eksempel 5b) for IFN-aktivitet. Cellerne ind- I

høstes seks timer efter virusinficeringen ved hjælp af I

centrifugering (1000 g, 10 minutter), vaskes med 50 ml I

15 NP40-puffer (Eksempel 4a), udsuspenderes i 9,5 ml iskold I

NP40-puffer og lyseres ved at holdes på is i fem minut- I

ter med 0,5 ml 10% NP40. Man fjerner cellekærnerne ved I

centrifugering (1000 x g, 10 minutter), og centrifugatet I

indstilles med 50 mM Tris/Cl, 0,5% sarkosin og 5 mM EDTA I

H 20 på pH = 8 og opbevares ved -20°C. RNA isoleres fra een- I

I trifugatet ved ekstraktion en gang med phenol, en gang I

I med phenol/chloroform/isoamylalkohol og en gang med I

I chloroform/isoamylalkohol. Vandfasen overføres til 4 I

I ml 5,7 molær CsCl-chlorid og centrifugeres i en SW-ro- I

I 25 rotor (35 rpm, 20 timer) for at befri ekstrakten for DNA I

I og restproteiner. RNA-bundfaldet udsuspenderes i 2 ml I

I TE pH = 8,0 og udfældes med ethanol. Det udfældede RNA I

opløses derefter i vand til en koncentration på 5 mg/ml. I

I 30 c) Påvisning af interferon-ω mRNA I

0,2 pi af den ifølge Eksempel 7b fremstillede hy- I

I bridiseringssonde udfældes sammen med 20-50 yg af den I

I ifølge Eksempel 7c fremstillede RNA ved tilsætning af I

I ethanol. I et kontroleksperiment bruges i stedet for I

I 35 cellulær RNA transfer RNA (tRNA) eller RNA, som stammer I

49 DK 175194 B1 fra E. coli, transformeret med plasmidet pRHW 12 (Eksempel 5).

Det tilvejebragte bundfald vaskes saltfrit med 70% ethanol, tørres og opløses i 25 μΐ 80% formamid (100 5 mM PIPES pH = 6,8, 400 mM NaCl, 10 raM EDTA). Derefter

opheder man sonderne i fem minutter til 100°C for at denaturere hybridiseringssonden, indstiller umiddelbart derefter temperaturen til 52°C og inkuberer ved denne temperatur i 24 timer. Efter hybridiseringen stiller 10 man på is og tilsætter 475 yl Sl-reaktionsblanding (4 mM

Zn(Ac)2» 30 mM NaAc, 250 mM NaCl, 5% glycerin, 20 yg ss kalve-thymus-DNA, 100 enheder Sl-nuclease). Der fordøjes en time ved 37°C, hvorefter reaktionen stoppes ved ethanolfældning.

15 Bundfaldet opløses i 6 vi formamid-puffer og ud separeres på en 6% acrylamidgel, som indeholder 8 M urinstof, i det væsentlige som ved sonder til DNA-se-kvenseringsreaktioner (F. Sanger et al., Proc. Nat.

Acad. Sci. 74, 5463-5467 (1979)).

20 Ved autoradiografi benyttes den tørrede gel og en

DuPont Cronex X-film under anvendelse af en Kodak Lanex Regular Intensivator, og der arbejdes ved -70°C.

Forklaring_til_fig._10 25 Rækkerne A til C er til kontrol.

Række A: 20 yg tRNA

Række B: 10 yg RNA fra pER 33 (E. coli-ekspressions- stamme til interferon-o2-Arg) Række C: 1 ng RNA fra pRHW 12 (E. coli-ekspressions- 30 stamme til interferon-ω-Ι) Række D: 50 yg RNA fra ubehandlede Namalwa-celler Række E: 50 yg RNA fra virus-inficerede Namalwa-celler Række F: 50 yg RNA fra Namalwa-celler, forbehandlet med dexamethason og inficeret med virus 35 Række G: 20 yg RNA fra ubehandlede NC 37-celler

I DK 175194 B1 I

I 50 I

I Række H: 20 yg RNA fra virus-inficerede NC 37-celler I

I Række I: 20 yg RNA fra NC 37-celler, forbehandlet med I

dexamethason og inficeret med virus I

I Række M: Skalamarkering (pBR 322 opskåret med Hinfl). I

I 5 Rækkerne B og C viser, at det ventede signal kun I

I kan påvises, når der findes et ωΐ-specifikt RNA blandt I

I RNA-molekylerne. Yderligere vises, at selv et stort I

I overskud af falsk RNA ikke giver baggrundssignal (se I

I række B). Endvidere giver heller ikke tRNA, anvendt som I

I 10 hybridiseringspartner, noget signal (se række A). I

I Rækkerne G til I viser induktion af ωΐ-specifik I

I RNA i virus-inficeret NC 37-celler. Forbehandlingen med I

I dexamethason forstærker denne effekt. I

I Rækkerne D til F viser, at man i det store og he- I

15 le får samme resultat med Namalwa-celler. Induktionen I

med ωΐ-specifik RNA er dog ikke så stærk som ved NC 37- I

I cellerne. Resultatet er parallelt med resultatet af må- I

I linger for interferon på centrifugat over det pågældende I

I cellebundfald. I

I 20 Forholdene ved interferon-cal-genekspression er I

I altså, som man kunne vente ved et interferon typel-gen. I

I Eksempel 8 I

I 25 Isolering af genet, der koder for IFN-ωΙ henholdsvis be- I

I slægtede gener:_ I

I a) Cosmid-undersØqelse I

I En human cosmidbank (human DNA, mandligt) klonet I

I 30 i cosmidvektor pcos2 EMBL (A. Ponstka, H.-R. Rockwitz, I

I A.-M. Frischauf, B. Hohn, H. Lehrach Proc. Natl. Acad. I

I Scl. 81, 4129-4133 (1984)) med en komplekscitet på 2 x I

I 106) gennemsøges for IFN-ω- henholdsvis beslægtede ge- I

I ner. E. coli DH1 (rK“* rec.A; gyrA96, sup- E) I

I 35 benyttes som værtsorganisme. Man fremstillede derefter I

51 DK 175194 B1

Mg++-celler (= "plating bacteria"). E. coli DH1 vokser natten over i K-urt (10 g/l trypton, 5 g/l gærekstrakt, 5 g/l NaCl), supplementeret med 0,2% maltose· Bakterierne afcentrifugeres og overføres til en 10 mM MgS04~op-5 løsning, indtil ODggo = 2· 5 ml af denne cellesuspension inkuberes 20 minutter ved 37°C med 12,5 x 10® "colony forming units" af sammenpakkede cosmide 20.

Derpå tilsættes 10 rumfang LB, og opslæmningen holdes en time ved 37°C for at opnå ekspression af kanamycinresi-10 stensen, leveret af cosmidet. Derefter fracentrifugeres bakterierne, udsuspenderes i 5 ml LB og udstryges i 200 μΐ portioner på nitrocellulosefilter (BA85, Schleicher og Schvill, 132 mm gennemsnit), der ligger på LB-agar (1,5% i L-urt) plus 30 ug/ml kanamycin. Der udvokser 15 10.000 - 20.000 kolonier pr. filter. Kolonierne replika- platteres på yderligere nitrocellulosefiltre, der opbevares ved 4°C.

En gruppe af kolonifiltrene behandles som i Eksempel lc), dvs. man denaturerer bakterierne, hvorved 20 man kan fiksere enkeltstrengs-DNA til nitrocellulose. Filteret forvaskes fire timer ved 65°C i en 50 mM Tris/-HC1, pH = 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS-opløsning. Derefter inkuberes filteret to timer ved 65°C i en 5 x Denhardt's (se Eksempel lc), 6 x SSC, 0,1% SDS-opløs-25 ning og hybridiseres derefter 24 timer ved 65°C med ca.

50 x 10® cpm hak-translateret, denatureret IFN-ωΙ DNA (Hindlll-BamHI indføjningsstykke i klon pRHWl2, se fig.

6) i samme opløsning. Efter hybridiseringen vaskes filteret 3 x 10 minutter ved stuetemperatur i en 2 x SSC,

30 0,01% SDS-opløsning og derefter 3 x 45 minutter ved 65°C

i en 0,2 x SSC, 0,01% SDS-opløsning. Filteret tørres og eksponeres på Kodak X-Omat S film under anvendelse af et forstærkerfolie ved -70°C. Positivt reagerende kolonier lokaliseres på replika-filteret, kradses af og resuspen-35 deres i L-urt + kanamycin (30 yg/ml). Fra denne suspen-

I DK 175194 B1 I

I 52 I

I sion udplattes nogle yl på LB-agar + 30 yg/ml kanamycin. I

De deraf resulterende kolonier replika-platteres på et I

I nitrocellulose-filter. Disse filtre hybridiseres som I

I beskrevet ovenfor med -mærket IFN—ωΙ-DNA. Fra hver I

I 5 hybridiserende koloni isoleres cosmidet ved en metode I

I beskrevet af Birnboim & Doly (Nucl. Acids Res. 7, 1513 I

(1979)). Med denne cosmid DNA-præparation transformeres I

E. coli DHl, og trans formanterne selektioneres på LB- I

I agar + 30 yg/ml kanamycin. Transformanterne prøves igen I

I 10 med 32p„ra(jioafc.t-iv markeret IFN-wl-DNA for positivt rea- I

I gerende kloner. Der udvælges hvert sted en klon fra det I

oprindelige isolerede, hvis cosmid fremstilles i større I

H målestok (Clewell, D.B. og Helinski, D.R., Biochemistry I

9, 4428 (1970))- Tre af de isolerede cosmider bærer I

15 navnene cos9, coslO og cosB. I

I b) Afledet kloning af hybridiserende fragmenter i PPC8 I

1 yg af hver af cosmiderne cos9, coslO og cosB I

opskæres med HindiII under de af producenten (New I

20 England Biolabs) anbefalede betingelser. Fragmenterne I

skilles elektroforetisk på 1% agarosegel i TBE-puffer og I

overføres på nitrocellulosefilter efter Southern's meto- de (Eksempel 4c). Begge filtre hybridiseres som beskre- I vet i Eksempel 4d) med haktranslateret ωΙ-DNA, vaskes og 25 eksponeres. Der anvendes omtrent 20 yg af hvert cosmid til opskæring med Hindlll, og de dannede fragmenter I skilles gel-elektroforetisk. Fragmenterne, der i præ- I forsøget hybridiserede med ωΙ-DNA, elektroelueres og I renses over elutip-søjler (Schleicher + Schiill). Disse 30 fragmenter sammenbindes med Hindlll-liniariseret, de- I phosphoryleret pUC8 (Messing, J., Vieira, J., Gene 19, I 269-276 (1982)). E. coli JM101 (supE, thi, (lac-proAB), I [f\ traD36, pro AB, lac q Z M15] (f.eks. fa. P. L. Bio- I chemicals) transformeres med denne reaktionsblanding.

I 35 Bakterierne udstryges på LB-agar, der indeholder 50 yg/ DK 175194 B1 • 53 ml ampicillin, 250 yg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-&-D-galaktopyranosid (BCIG, Sigma) og 250 yg/ml isopropyl-$-D-thiogalakto-pyranosid (IPTG, Sigma). En blåfarvning af de dannede kolonier viser, at indføjningen af et 5 stykke pUC8 er mislykkedes. Fra nogle hvide kloner isolerer man plasmid DNA i lille målestok, opskærer med Hindlll og skiller på 1% agarosegel. DNA-fragmenterne overføres på nitrocellulosefilter og hybridiseres med 32ρ_ω_£»«ν som ovenfor. Med basis i cos9 og coslO udvæl-10 ges fra hvert sted en afledet klon, som betegnes pRHW22 henholdsvis pRH57. Udgående fra cosB kloner man to fragmenter, der hybridiserer med med ωΐ-sonden og betegner dem pRH51 henholdsvis pRH52.

15 c) Sekvensanalyse

Det i pUC8 indføjede DNA udskilles fra vektordelen ved hjælp af opskæring med Hindlll og følgende gel-elektroforese. Dette DNA, ca. 10 yg, sammenbindes under anvendelse af T4 DNA-ligase i 50 yl reaktionsopløsning, 20 rumfanget forøges til 250 yl med hak-translationspuffer (Eksempel 4d) og endelig brydes DNA under isafkøling ved hjælp af ultralyd (MSE 100 Watt Ultrasonic Disintegrator, største ydelse ved 20 kHz, fem gange 30 sekunder). Herefter repareres enderne af brudstykkerne ved hjælp af 25 tilsætning af 1/100 rumfang af henholdsvis 0,5 mM dATP, dGTP , dCTP og dTTP sammen med 10 enheder Klenow-frag-ment af DNA-polymerase I i to timer ved 14°C. De tilvejebragte DNA-fragmenter, der har lige ender, adskilles efter størrelse på en 1% agarosegel. Fragmenter med 30 størrelser mellem 500 og 1000 bp isoleres og klones ved hjælp af phagvektoren M13 mp8, der er opskåret med Smal og dephosphoryleret. Enkeltstreng DNA rekombinante pha-ger isoleres og opdeles efter Sanger's metode (Sanger F. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci 74, 5463-5467 (1976)).

35 Enkeltsekvenserne kombineres til en totalsekvens ved

I DK 175194 B1 I

I 54 I

I I

I hjælp af EDB (Staden, R., Nucl. Acids Res. 10, 4731 - I

I 4751 (1982)). I

I d) Sekvens for den af ledede klon pRH57 (IFN-ωΙ) I

I 5 Sekvensen vises i fig. 11. Dette 1933 bp lange I

I fragment indeholder genet for interferon-ωΐ. Regionen, I

der koder for protein, omfatter nucleotiderne 576 til I

I 1163. Sekvensen er fuldstændig identisk med sekvensen I

I fra cDNA-klonen P9A2. Nucleotidafsnittet 576 til 674 I

I 10 koder for et 23 aminosyrer langt signalpeptid. Den så- I

I kaldte TATA-box ligger i en for interferon type I-gen I

I karakteristisk afstand fra startkodonen ATG (positioner I

I 476-482). I genet findes nogle signalsekvenser for po- I

lyadenylering ved transkriptionen (ATTAAA i posi- I

I 15 tionerne 1497 - 1502 henholdsvis 1764 - 1794; AATAAA i I

I positionerne 1729 - 1734 henholdsvis 1798 - 1803), hvor- I

I af den første anvendes i klon P9A2. I

I e) Sekvens for den afledede klon pRHW22 (IFN-pseudo-(n2) I

I 20 I fig. 12 gengives den 2132 bp lange sekvens, der I

hører til Hindi 11-fragmentet fra cosmidet cos 9 og som I

I hybridiserer med ωΙ-DNA-sonden. Der ses en åben læse- I

I ramme fra nucleotid 905 til nucleotid 1366. Den tilsva- I

I rende aminosyresekvens er gengivet. De første 23 amino- I

I 25 syrer minder om, hvad der findes i signalpeptidet i ty- I

I pisk type I interferon. De næste 131 aminosyrer viser I

I indtil aminosyre 65 lighed med ω-1-interferon, og det er I

I bemærkelsesværdigt, at tyrosin er første aminosyre i det I

fuldt udviklede'protein. I

I 30 Efter aminosyreposition 66 følger sekvensen for I

I et potentielt N-glykosyleringssted (Asn-Phe-Ser). Fra I

dette sted adskiller aminosyresekvensen sig fra sekven- I

I sen sig fra sekvensen, der hører til et type 1-interfer- I

I on. Det kan dog bevises, at man ved egnede indføjninger I

I 35 og deraf resulterende forskydninger af proteinlæserammen I

55 DK 175194 B1

Kan opnå lighed med IFN-ωΙ (se Eksempel 9). Set ud fra type I interferon drejer det sig ved det isolerede gen om et pseudogen: IFN-pseudo-ui2.

5 f) Sekvens for den afledede klon pRH51 (IFN-pseudo-M3)

Et omtrent 3.500 bp langt Hindlll-fragment, der stammer fra cosmid B og hybridiserer med ωΐ-sonden, sekvensopdeles delvist (fig. 13). Der findes en åben læseramme fra nucleotidpositionen 92 til 394. De første 10 23 aminosyrer udviser et signalpeptids kendetegn. Den påfølgende sekvens begynder med tryptophan og ligner IFN-ωΙ indtil aminosyre 42. Derefter bliver sekvensen forskellig fra IFN-ωΙ og ender efter aminosyre 78. Man kan ved indføjninger ændre sekvensen således, at den vi-15 ser en stor homologi til IFN-ωΙ (Eksempel 9). Genet betegnes IFN-pseudo-u>3.

g) Sekvens for indføjningsstykket i pRB52 (XFN-pseudo —d>4 )___ 20 Et 3.659 bp langt Hind-fragment isoleret fra cosmid B og hybridiserende med ωΙ-DNA vises i fig. 14.

En åben læseramme, hvis translationsprodukt viser delvis homologi med IFN-ωΙ, findes mellem nucleotidpositionerne 2.951 og 3.250. Efter et 23 aminosyre langt signalpep-25 tid begynder den følgende aminosyresekvens med phenyl-alanin. Homologien med IFN-1 brydes.allerede efter den 16. aminosyre, genoptages ved den 22. aminosyre og ender med den 41. aminosyre. En eventuel translation var mulig til aminosyre 77. Analogt med Eksempel 8f) og 8g) 30 kan man også her tilvejebringe en god homologi med IFN-ωΐ ved hjælp af indføjningerne (Eksempel 9). Det her isolerede pseudogen betegnes som IFN-pseudo-o»4.

35

I DK 175194 B1 I

I 56 I

I Eksempel 9 I

I Udnyttelse af generne for 4 medlemmer af I FN-ot-fami lien I

I I fig. .15 vises generne for IFN-ωΙ til IFN- I

I 5 pseudo-u>4 samlet sammen med aminosyreoversætteisen. For I

I at opnå bedre overensstemmelse indfører man tomme plad- I

I ser i de enkelte gener. Disse betegnes ved punkter. Der I

I fjernes ingen baser. Basenummereringen indbefatter også I

I de tomme pladser. Aminosyreoversaettelsen af IFN-ωΙ bi- I

I 10 beholdes {f.eks. på position 352 - 355: "C.AC" koder for I

I His). Ved pseudogenerne oversættes kun til en aminosy- I

re, hvor oversættelsen er entydig. Det kan af denne I

I sammenligning straks ses, at de fire isolerede gener er I

I beslægtet med hinanden. Således findes f.eks. det po- I

I 15 tentielle N-glykosyleringssted (nucleotidpositionerne I

I 301 til 309) i alle fire gener. I

I Derudover findes, undtagen i IFN-pseudo-u>4 ved I

I nucleotidpositionerne 611 til 614, en triplet, der udgør I

I et stopkodon, der ved IFN-ωΙ sørger for, at et fuldt ud- I

I 20 viklet protein med en længde på 172 aminosyrer bliver I

afsluttet. Ved denne opstilling eksisterer ved IFN- I

I pseudo-ta2 (nucleotidpositionerne 497 til 499), og ved I

IFN-pseudo-o>4 (nucleotidpositionerne 512 til 514) tidli- I

I ge stopkodoner. I

I 25 Slægtsskabsgraden mellem generne henholdsvis ami- I

I nosyreoversættelserne lader sig beregne af opstillingen I

I i fig. 15. Fig. 16 giver DNA-homologien mellem medlem- I

I merne af IFN-<i>-familien. Ved parvis sammenligning af I

I positioner tæller man ikke disse med, hvor der i den ene I

I 30 eller begge partnere er en tom plads på positionen. I

I Sammenligningen giver en homologi på omtrent 85% mellem I

IFN-u>l-DNA og sekvenserne for pseudogenerne. IFN-pseudo- I

I o)2-DNA er omtrent 82% homolog med DNA fra IFN-pseudo-u3 I

I henholdsvis IFN-pseudo-ω4. Fig. 17 viser resultatet af I

I 35 sammenligning af signalsekvenserne og fig. 18 resultatet I

57 DK 175194 B1 af sammenligninger af de "fuldt udviklede" proteiner.

De sidste ligger mellem 72 og 88%. Denne homologi er dog væsentlig større end den, der findes mellem IFN-ωΙ og IFN-a'erne og IFN-β (Eksempel 6). Det faktum, at de 5 enkelte medlemmer af IFN-w-familien er fjernere fra hinanden end de i IFN-a-familien lader sig forklare ved, at tre af de fire isolerede IFN-u-gener er pseudogener og åbenbart ikke mere er underkastet det selektionstryk, som funktionelle gener er.

10

Eksempel 10 Gæring

Stambeholdning: 15 En enkeltkoloni af bakteriestammen HB10l/pRHW14 på LB-agar (med 25 mg/ml ampicillin) overføres ved podning til trypton-soja-urt (OXDID CM129) med 25 mg/ml ampicillin og rystet ved 37°C og 250 o/min til en optisk tæthed (546 nm) på ca. 5 er nået (logaritmisk vækstfa-20 se). Man tilsætter 10 vægt% steril glycerol, fylder kulturen i sterile ampuller, der hver indeholder 1,5 ml og nedfryser til -70°C.

Prækultur 25 Kulturmediet indeholder 15 g/l Na2HP04 χ 12H2O, 0,5 g/l NaCl; 1,0 g/l NH4CI; 3,0 g/l KH2P047 0,25 g/l

MgS04 x 7H2? 0,011 g/l CaCl2; 5 g/l caseinhydrolysat (Merck 2238); 6,6 g/l glukose-monohydrat; 0,1 g/l am picillin; 20 mg/l cystein og 1 mg/1 thiamin-hydrochlor-30 id. 4 portioner på 200 ml af dette medium overføres til 1000 ml Erlenmeyerkolber, der hver podes med 1 ml af en stamkultur af HBl01/pRHWl4 og rystes i 16-18 timer ved 37°c og 250 o/min.

35 Hovekdultur:

I DK 175194 B1 I

I 58 I

I Gæringsmediet indeholder 10 g/1 (NH4)2HP04, 4,6 I

I g/1 K2HP04 x 3H20? 0,5 g/l NaCl; 0,25 g/l MgS04 x I

I 7H20; 0,011 g/1 CaCl2; 11 g/l glukosemonohydrat; 21 I

I g/1 caseinhydrolysat (Merck 2238); 20 mg/l cystein; 1 I

5 mg/l thiamin-hydrochlorid og 20 mg/l 3-B-indolacrylsyre. I

I 8 liter sterilt medium i en gæringsbeholder med 14 liter I

totalrumfang (højde: radius = 3:1) inokkuleres med 800 I

ml af prækulturen. I

I Gæringen forløber ved 28°C, 100 o/min. (Effigas- I

I 10 Turbine), en lufttilførsel på lvvm (volumen/volumen/mi- I

I nut) og en begynde Ises-pH på 6,9. I løbet af gæringen I

I aftager pH og holdes derefter konstant på 6,0 med 3 N I

I NaOH. Når man har nået en optisk tæthed (546 nm) på 18 I

I til 20 (sædvanligvis efter 8,5 - 9,5 timers gæring) I

I 15 afkøler man med andre betingelser uændret til 20°C, ind- I

I stiller uden lufttilførsel pH med 6N H2S04 til 2,2 og I

I omrører i en time ved 20°C og 800 o/min. (uden lufttil- I

I førsel). Den nu inaktiverede biomasse afcentrifugeres i I

I en CEPA-laboratoriecentrifuge type GLE ved 30.000 o/min, I

I 20 nedfryses til -20°C. og opbevares. I

Eksempel 11 I

Rensning af interferon-w-Gly I

I 25 I

I a) Delvis rensning I

I Alle processer udføres ved 4°C. I

I 140 g biomasse (E. coli HB101 transformeret med I

I ekspressionsklonen pRHW12) udsuspenderes i 1150 ml 1% I

I 30 eddikesyre (forudkølet til 4°C) og omrøres i 30 minut- I

I ter. Man indstiller pH af suspensionen med 5 M NaOH til I

I 10,0 og rører yderligere to timer. Derefter indstilles I

I med 5 M HC1 til pH 7,5, røres yderligere 15 minutter og I

I centrifugeres (4°C,' 1 time, 10.000 o/minut, J21 centri- I

I 35 fuge (Beckman), JA10-rotor). I

59 DK 175194 B1

Det klare centrifugat overføres til en 150 ml CPG (controlled pore glass)-søjle (CPG 10-350, porestørrelse 120/200) med 50 ml/time, vaskes med 1000 ml 25 mM Tris/-1M NaCl, pH 7,5 og elueres med 25 mM Tris/lM KCNS/50% 5 ethylenglycol, pH 7,5 (50 ml/time).

Den proteintop, der indeholder interferonaktiviteten indsamles, dialyseres natten over mod 0,1 M Na-phosphat, pH = 6,0, og 10% polyethylenglycol 40.000, og det opståede bundfald afcentrifugeres (4°C, 1 time, 10 10.000 o/min, J21-centrifuge, JA20-rotor) (se Tabel 1).

b) Yderligere Rensning

Det dialyserede og koncentrerede CPG-eluat fortyndes med puffer A (0,1 M Na-phosphat pH 6,25/25% 1,2— 15 propylenglycol) 1:5 og overføres til en "Superloop"“injektionsanordning (Pharmacia) og derfra med 0,5 ml/min til en med puffer A ækvilibreret monoS 5/5 (Pharmacia, kationbytter)-søjle. Elutionen udføres med 0,5 ml/min over 20 ml liniær gradient fra 0 til 1 M NaCl i puffer 20 A. Gennemløbet og fraktioner på 1 ml samles og prøves ved hjælp af en CPE-reduktionstest for interferonaktivitet. De aktive fraktioner samles.

TABEL 1 25

Volumen Biologisk test Protein total U/mg Udbytte _(ml) U/ml+ U total (mg/ml) (mg)_%

Vol. 1150 15.000 17,3xl06 3,6 4140 4180 100 DL 2200 < 600 >l,3x!06 0,74 1628 <600_<5 30 Eluat 124,3 170000 21,0xl06 16,8 2088 10000 121 efter dialyse 41 300000 12,3xl06 12,6 516,6 23800 71 + CPE-reduktionstest: A549 celler, EMC-virus 35 U: Enheder baseret på interferon-a2 (se Eksempel 2 i

I DK 175194 B1 I

I 60 I

I EP-A-0.115.613; E. coli HB101 transformeret med I

I ekspressionsklon pER 33) som standard I

I DL: Gennemløb. I

I 5 I

I Eksempel 12 I

I Karakterisering af HuIFN-ωΙ I

I A. Antiviral aktivitet på humane celler

I B. Antiviral aktivitet på abeceller I

I 10 C. Væksthæmmende aktivitet på human Burkitt's lym- I

I phomceller (Zellinie Daudi) I

I D. Antivækstaktivitet på humane cervixcarcinomceller I

I (Cellelinie HeLa) I

I E. Syrestabilitet I

I 15 F. Serologisk karakterisering. I

I A* Antiviral aktivitet på humane celler I

I Cellelinie: Human lungecarcinomcellelinie A549 (ATCC I

I CCL 185 I

I 20 Virus: Muse-encephalomyocarditis-virus (EMCV)

I Prøvesystem: Hæmning af den cytophatiske effekt (alle I

I titreringer udføres fire gange) I

I Et partielt renset præparat af HuIFN-ωΙ med et I

I 25 proteinindhold på 9,4 mg/ml titreres i en passende for- I

I tynding i nævnte prøvesystem. Præparatet udviste anti- I

I viral virkning med en specifik aktivitet på 8300 IE/ mg I

I baseret på referencen Go-23-901-527. I

I 30 I

I 35 I

61 DK 175194 B1 B. Antiviral aktivitet på abeceller

Cellelinie: GL-V3 abenyreceller (Christofinis G.J., J. Med. Microbiol. 3, 251-258, 1970)

Virus: Vesicular Stomatitis Virus (VSV) 5 Prøvesystem Plaque-reduktions-test (alle titreringer fire gange)

Præparatet beskrevet i Eksempel 12A udviste en specifik antiviral aktivitet på 580 E/mg i nævnte prøvesystem.

10 C. Antivækstaktivitet på humane Burkitt'ø lymphomcel- ler (cellelinie Daudi)__

Humane Burkitt's lymphom-cellelinie Daudi dyrkedes under tilstedeværelse af forskellige koncentrationer 15 af HuIFN-ωΙ. Celletætheden bestemmes efter to, fire og seks dages inkubation ved 37°C; ubehandlede kulturer var kontrol. Alle forsøg blev gennemført tredobbelt.

Af følgende figur fremgår, at IFN-ω udviser en udpræget hæmning for cellevækst ved en koncentration på 100 anti-20 virale enheder (IE, se Eksempel 12A) pr. ml; ved en koncentration på 10 IE/ml kunne man iagttage en delvis midlertidig hæmning (følgende symboler anvendes i figuren: o Kontrol, ° 1 IE/ml, Q 10 IE/ml, ^ 100 IE/ML): 25 30 35

I DK 175194 B1 I

I 62 I

I !χο4ΤΠ i ; i ~ : · I

I ' 7 j

I 5 0.5- | ' | ' : ff / I

I oi- | :· ; | f / ' I

I J- o.i- ‘fiTi .. · ; ; I

I 5 ? r i. · i I

I o ' I

Η

I 15 S I

I » ' i : I

I o i I

I : ·» ’ ! . i ,· I

I jl'*: ϊ I

· •‘—r—:—:-r i ; “ T"^ I

I 20 ·:·! 0. i 2 · : 4 · ! e : I

I DAGE I

I D. Væksthæmmende aktivitet på humane cervixcarcinomcel- I

I ler (cellelinie HeLa)_ I

I 25 Den humane cervixcarcinom-cellelinie HeLa dyrkes I

sammen med følgende proteiner eller proteinblandinger; I

I HuIFN-ωΙ (se Eksempel 12A) 100 IE/ml I

I HuIFN-γ (se Eksempel 12A) 100 IE/ml I

Human tumor-nekrosefaktor (HuXFN), >98% ren# I

I 30 fremstillet af Genentech Inc., San Francisco, I

I USA (se Pennica D. et al.. Nature 312, 724-729; I

I 1984) 100 ng/ml I

I Alle binære kombinationer af de nævnte proteiner I

I med koncentrationer som ovenfor. I

I 35 I hver 3 cm kunststof-vævskulturskål blev anbragt I

I to kulturer (50.000 celler/skål) og der inkuberes seks I

63 DK 175194 B1 dage ved 37°C og i tilslutning hertil blev celletætheden bestemt· Behandling af cellerne med HuIFN-ωΙ eller HuIFN-f havde kun ringe indflydelse på cellevæksten, hvorimod HuIFN-γ viste en tydelig cytostatisk effekt.

5 Kombinationer af IFN-γ med IFN-ωΙ viste synergistisk cy-tostatisk/cytotoksisk virkning.

Følgende figur viser resultaterne af forsøget: ! i i ππττπ—·—I—I—γτττγπ-, 10 ·.'·!.! i;: ? ti' ·: i C = ! :ϊ i S j /-Ή. »·).!· r ·.; i ·4·Κ I f: j ;'iI^if:iCT‘nnrij »r,l: -til i ::.!:= 1»·:ιΐΐ,ΐ;-j{ J|:,.ilM. 1:Mi ri (L· 'tf: ’ *.* * . i ’ * .i* *:! ' ' ’ J *' 1 · · .* * *.·. ·* ί :* *··'*ϊ |' ·*: I * ··*! · *j · j * i j ί·· ΐ “ Γ·· *** ·: *; 15 M.!·"" )r:r~- 15 -;:»r;~!SG isaasi-:!;·*H r-bS:l afe _ i i l·'i.;'.1: i ·"·—;Γ1 >T^_yj5rF^7r^· Γ”~—·Γ~^·^ΓΤ~Γ~'ί'·'ιΓ73Γ7· i· J 1 fil ντ·': •:-7 i r :i ί i mm

: p·- ί i-·-I i j . ri }V |-:Γ;1 Γ:ν;^ :j!:‘:i Γ Lrl.p -T

2o t -vhhner?· 3 5 10 30 60 100 25 10 4 x celler/målestok Følgende symboler anvendes i ovenstående figur: C ubehandlet kontrol, T HuTNF, O HuIFN-ωΙ, G HuIFN-γ.

E. Syrestabilitet 30 Med henblik på undersøgelse af syrestabiliteten af HuIFN-ωΙ blev en fortynding af det i Eksempel 12A nævnte præparat anbragt i cellekulturmedium (o/min. I 1640 med 10% føtal kalveserum) og pH blev med HC1 indstillet på en værdi af 2, der inkuberedes 24 timer ved 36 4°G og neutraliseredes med NaOH. Denne prøve titreredes

I DK 175194 B1 I

I 64 I

I ved hjælp af en antiviral test (se Eksempel 12A), den H

I udviste 75% biologisk aktivitet i forhold til en kon- I

I trol, der var inkuberet ved neutral pH. IFNojI kan altså H

I betegnes som syrestabil. I

I 5 I

I F. Serologisk karakterisering I

I Med henblik på bestemmelse af HuIFN-ωΙ's serolo- I

I giske egenskaber sammenlignet med HuIFN-a2 forinkuberer

I man prøver (fortyndet til 100 IE/ml med lige store rum- I

I 10 fang af opløsninger af monoklonale antistoffer eller po- I

I lyklonale antisera 90 minutter ved 37°C, derefter be- I

I stemmes prøvernes antivirale aktivitet. Den følgende ta- I

I bel viser, at HuIFN-ωΙ kun kan neutraliseres af et anti- I

I serum mod leukocytinterferon i relativ høj koncentra- I

I 15 tion, men ikke af antistoffer, der virker mod HuIFN-a2 I

I eller HuIFN-ø. HuIFN-^l er derfor hverken serologisk I

I beslægtet med HuIFNct2 eller med HuIFN-β: I

I 20 I

I 25 I 1

I 35 I

30 I

65 DK 175194 B1

TABEL

Antiserum mono- Fortynding Neutralisering af

Tel« antistoffer yg/ml_HuIFN-a2_HuIFN-ωΙ 5 EBI-11) 1 + 10 +++ 100 +++ 1000 - 0 EBI-33·) 1 +++ 10 10 +++ 100 +++ 1000 +++ 0 L3B72) 100 +++ 0 1000 +++ 0 15 Fare-anti- leukocyter-IFN^) 1:50.000 +++ - 1: 5.000 +++ 0 1: 500 +++ + 1: 50 - +++ 20 Kanin-anti-

HuIFN-a2 1: 1.000 +++ 1: 100 +++ 0 1: 10 - 0 Fåre-anti- 25 HuIFN-84^_1: 50_=_0_ 1) = se EP-A-0.119.476 2) = A. Berthold et al. i Arzneimittelforschung 35, 364-369 (1985) 3) = Research Reference Reagent Catalog nr- 30 G-026-502-568 4) = Research Reference Reagent Catalog nr.

G-028-501-568

Research Resources Branch, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, 35 Maryland, USA.

Symboler: - ikke prøvet, 0 ingen neutralisation, + del vis neutralisation, +++ fuldstændig neutralisation.

Claims (37)

1. Rekombinante DNA-molekyler, indeholdende en I I kodende sekvens for hidtil ukendte humane interferon- I I proteiner af type I, der indeholder 168-174 aminosy- I I 5 rer, for interferon-pseudo-ti>2 (se figur 12) , interfe- I I ron-pseudo-u>3 (se figur 13) eller interferon-pseudo- I I ω4 (se figur 14), kendetegnet ved, at ko- I I desekvensen under så stringente betingelser, at kun I I en homologi på mere end 85% kan påvises, hybridiserer I I 10 med a) indsættelsen i Pst-1 gennemskæringsstedet i I I plasmidet E76E9 i E.coli HB101 deponeret ved DSM med I I deponeringsnummer DSM 3003, b) i plasmidet P9A2 i E. I I coli HB 101 deponeret ved DSM med deponeringsnummer I I DSM 3004. I I 15 2. DNA-molekyle ifølge krav 1,kende- I I tegnet ved, at de stringente betingelser kun I I tillader påvisning af en homologi på mere end 90%. I

3. DNA-molekyle ifølge krav 1 og 2, kende- I I tegnet ved, at kodesekvensen foreligger som I I 20 indsættelse ved Pst-1 gennemskæringsstedet a) i I I plasmidet E76E9 i E.coli HB101 deponeret ved DSM med . I I deponeringsnummer DSM 3003, b) i plasmidet P9A2 i E. I I coli HB 101 deponeret ved DSM med deponeringsnummer I I DSM 3004, eller er en degenereret variant af disse I I 25 indsættelser. I

4. DNA-molekyle ifølge krav 1 til 3, k e η - I I detegnet ved, at vehiklen er et plasmid, der I I kan undergå replikation i prokaryoter eller i euka- I I ryoter. I I 30 5. DNA-molekyle ifølge krav 4,kende- I I tegnet ved, at det er en ekspressionsvehikel, I I der kan undergå replikation i mikroorganismer eller i I I pattedyrsceller. I DK 175194 B1

6. DNA-molekyle ifølge krav 5, kende tegnet ved, at det indeholder sekvensen TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 45

5 GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 90 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 135 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 180 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 225 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 270 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 315

10 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 360 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 405 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 450 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 495 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT 516 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

7. DNA-molekyle ifølge krav 5, kende 2 tegnet ved, at DNA-molekylet ifølge krav 6 i 3 position 332 indeholder nucleotidet A i stedet for 4 nucleotidet G. 5

8. DNA-molekyle ifølge krav 5, kende- 6 tegnet ved, at det er plasmidet E76E9 i E.coli 7 HB101 deponeret ved DSM med deponeringsnummer DSM 8 3003 eller er plasmidet P9A2 i E. coli HB 101 depone 9 ret ved DSM med deponeringsnummer DSM 3004. 10

9. DNA-molekyle ifølge krav 6 og 7, kende- 11 tegnet ved, at dette yderligere indeholder en for et leader-peptid kodende DNA-sekvens med formlen ATG GCC CTC CTG TTC CCT CTA CTG GCA GCC CTA GTG ATG ACC AGC TAT AGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC I DK 175194 B1 I I 68 I

10. Interferon-iol-gen, kendetegnet I I ved, at det har formlen GATCTGGTAAACCTGAA 17 I I GCAAATATAGAAACCTATAGGGCCTGACTTCCTACATAAAGTAAGGAGGGTAAAAATGG 76 I I AGGCTAGAATAAGGGTTAAAATTTTGCTTCTAGAACAGAGAAAATGATTTTTTTCATAT 135 I I ATATATGAATATATATTATATATACACATATATACATATATTCACTATAGTGTGTATAC 194 I I ATAAATATATAATATATATATTGTTAGTGTAGTGTGTGTCTGATTATTTACATGCATAT 253 I I AGTATATACACTTATGACTTTAGTACCCAGACGTTTTTCATTTGATTAAGCATTCATTT 312 I I GTATTGACACAGCTGAAGTTTACTGGAGTTTAGCTGAAGTCTAATGCAAAATTAATAGA 371 I I TTGTTGTCATCCTCTTAAGGTCATAGGGAGAACACACAAATGAAAACAGTAAAAGAAAC 430 I I TGAAAGTACAGAGAAATGTTCAGAAAATGAAAACCATGTGTTTCCTATTAAAAGCCATG 469 I I CATACAAGCAATGTCTTCAGAAAACCTAGGGTCCAAGGTTAAGCCATATCCCAGCTCAG 548 I I TAAAGCCAGGAGCATCCTCATTTCCCA ATG GC£ CTC C TG TTC CCT CTA CTG 599 I I GCA GCC CTA GTG ATG ACC AGO TAT AGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC 644 I I TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 689 I I GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 734 I I AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 779 I I AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 824 I I CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 869 I I GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 914 I I CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 959 I I G AA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 1004 I I AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 1045 I I TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 1094 I I TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 1139 I I GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGA AATGATTCTCATTGATTAATTTGCCAT 1190 I I ATAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCA 1249 I I CAGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTT 1308 I I AAAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTA 1367 I TTTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGC 1426 I I CTTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGCTTTCCATTTGGTTAAATATTGTA 1485 I TTTTGTTATTTATTAAATTATTTTCAAACAAAACTTCTTGAAGTTATTTATTCGAAAAC 1544 I I CAAAATCCAAACACTAGTTTTCTGAACCAAATCAAGGAATGGACGGTAATATACACTTA 1603 I I CCTATTC ATTC ATTCCATTT AC AT AATATGTATAAAGTG AG TAT CA AAGTGGCA TATTT 1662 I I TGGAATTGATGTCAAGCAATGCAGGTGTACTCATTGCATGACTGTATCAAAATATCTCA 1721 I I TGTAACCAATAAATATATACACTTACTATGTATCCCACAAAAATTAAAAAGTTATTTTA 1780 I I AAAAAGAAATACAGGTGAATAAACACAGTTTCTTTCCGTGTTGAAGAGCTTTCATTCTT 1839 I I ACAGGAAAAGAAACAGTAAAGATGTACCAATTTCGCTTATATGAAACACTACAAAGATA 1898 I I AGTAAAAGAAAATGATGTTCTCATACTAGAAGCTT 1933 I DK 175194 B1

11. Interferon-col-gen, kendetegnet ved, at det har formlen AAGCTTGAGCCCCCAGGGAAGCATAACCACATGAACCTGAATGAATATATT 51 CTAGAAGGAGGGAAGC^æAGAGAAGTTCTTTCACTAATAACCATCAAGGTCTTCTGTG 110 AATCAAATATCAAACAAAGATAGTCCTAAAAAGTTTAATTTCCAGAGATAGGTAATTTC 169 CTAACTGAATACAGAAACCCATAGGGCCCAGGGATCCTGATTTCCTATGCAAAATGGAG 228 GGTAAAACTGGAGGCTAGGATCTGGGCTAAAAGTATATACTTCTAACAGTAGCACAAAG 287 ATGTTTCTCATCTGATTGATCAATATTCATTTGGATTGATATATCTTAAGTTTACTGGG 346 AATATTGAACATCCATTGCAAAAATCAAGAGTGTAGAGTGATGACCTCCTTTTAGGTCA 405 TATAGAACAAGGTTTTTCAACCCCCATCCATGGACCGGGGTACTGGTCCTGGCCTGGTA 464 GGAACAGGGCCGCACAGCAGGAGGCAAGCAGGCCAACCAACAAGCATTAACGCCTGAGC 523 TCTGCCTCCTGTCAGATCAGCAGTGGCATTGGATTCTCAAAAGAGCAGGAACCCTATTG 582 TGAAGTGCAGATGCGAAGGATCTAGGTTGTGGTCTCCTAATGAGAATCTAATGCCTCTG 641 AAAGCATTCCCTCCCTGACCCCATTTTTCGTGGAAAAATTATCTTCCACCAAACTGGTG 700 GCCAAAAGGTTGTGGATGCTGATATAGAAGACATGTAAATGAAAACAATAAATGGAATT 759 AAAAATTTAGAGAAATGCTCAGAAAAATGAAAACTATTTGTGCTCCATTAAAGCCATGC 818 ATAGATAGAATGTCTTCATAGAACCTAGGATCCAAGGTTCTATGAAGACCTCAGCTCAA 877 CGAGGCCAAAAGCATCCTGATTTCTGA ATG GCC CTC CTC TTC CCT CTA CTG 928 GCA GCC CTA GAG GTG TGC AGC TGT GGC TCT TCT GGA TCT CTA GGA 973 TAT AAC CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTG CTA GGC AGG AAC ACC TTG 1018 GTG CTT TTG GGC CAA ATG AGG AGA ATC TCT CCC TTC TTG TGT CTA 1063 AAG GAC AGA AGT GAC TTC AGA TTC CCC CAG GAG AAG GTG GAA GTC 1108 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAG GCT ATG TCT TTC CTC TAT GAT GTG 1153 TTA CAG CAG GTC TTC AAC TTC TCA CAC AAA GCG CTC CTC TGC TGC 1198 ATG GAA CAT GAC CTT CCT GGA CCA ACT CCA CAC TTT ACG TCA TCA 1243 GCA GCT GGA ACA CCT GGA GAC CTG CTT GGT GCA GGA GAT GGG AGA 1288 AGG AGA AGC TGG GGG CAG TGG GTG ATT GAG GGC TCT ACA CTG GCC 1333 TTG AGG AGG TAT TTC CAG GAA TCC ATC TCT ACC TGA AAGAGAAGAAA 1380 TAAAGATTGTGCCTGGGAAGTTGTCAGAGTGGAAATCATGAGATCCTTTTCATCCACAA 1439 GTTTGGAAGAAAGATTGAGAAGTAAGGATGAAGACCTGGGCTCATCATGAAATGATTCT 1498 CATTGACTAATCTGCCATATCACACTTGTACATGTGACTTTGGATATTCAAAAAGCTCA 1557 TTTCTGTTTCATCAGAAATTATTGAATTAGTTTTAGCAAATACTTTATTAATAGCATAA 1619 AGCAAGTTTATGTCAAAAACATTCAGCTCCTGGGGCATCCGTAACTCAGAGATAACTGC 1675 CCTGATGCTGTTTATTTATCTTCCTTCTTTTTTTTCATGCCTTGTATTTATGATATTTA 1734 TATATTTTATATTTTCATCTTCACATCGTATTAAAATTTATAAAACATTCACTTTTTCA 1793 TATTAAGTTTGCATTTTGTTTTATTAAATTCATATCAAAGAAAACTCTGTAAATGTTTC 1852 I DK 175194 B1 I I 70 I I TATTCTAAAAACAATGTCTACTTTCTCTTTTTGTAAACCAAATTGAAAATATGGTAAAA 1911 I I TGTATTAACTCATTCATTTCATTCCTATTATATGTATAAATTGAGTAAATGGCAAACTG 1970 I I TGGGGTTTTCTTAAAGAAATACAGGTGAATAAAGCAAACACAGTTTCTCTCAGTCTAAG 2029 I I AGGGAAAGAGACGTAAAAACAGGACAAATATTTATATTATTTCAATTATGTTAAATGCT 2088 I I ACAAAGAGAAGTAAAGAAAAGTGATGTTCTCACATCAGAAGCTT 2132 I

12. Interferon-pseudo-a)3-gen, kendeteg- I I net ved, at det har formlen CCATG 5 I I CATAGCAGGAATGCCTTGAGAGAAGCTGAAGTCCAAGGTTCATCCAGACCCCAGCTCAG 64 I I CTAGGCCAGCAGCACCCTCGTTTCCCA ATG GTC CTC CTG CTT CCT CTA CTC 115 I I GTG GCC CTG CCG CTT TGC CAC TGT GGC CCT GTT GGA TCT CTG AGC 160 I I TGG GAC CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 205 I I GCA CTT CTG . GGC CAA ATG TGC AGA ATC TCC ACT TTC TTG TGT CTC 250 I I AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CTG GAG ATG TGG ATG GCA 295 I I GTC AGT TGC AGA AGG CCC CGG CCC TGT CTG TCC TCC ATG AGA TGC 340 I I TTC AGC AGA TCT TCA GCC TCT TCC CCA CAG AGT GCT CCT CTG CTG 385 I I CCT GGA ACA TGA CCCTCCTGGACCAACTCCACACTGGACTTCATCTGCAGCTGGA 440 I I ATGCCTGGATGCTTGCTTAGGGCAGACAAAAAGAGAGGAAGAATCTGTGGGGGTGATTG 499 I I GGGCCCTACACTGGCCTTGAGGACGTACTTTCAGGGAATGCATGGGAATCCAGGGAATC 558 I I TACCTGGAGGAGAAGAAATACAGTGACTGTGCTTGGGAGGTTGTCAGAGTGGAATCGTG 617 I I AAATCCTTCTCTTCATCATCAACAAACTTGCAAGAAGGACTGAGAAGTAAGGATGAAGA 676 I I CCTGGGTTCATCCTGAAATTATTCTCATTGATTAATCTGCCATATCACACTTGCACATG 735 I I TGTCTTTG GTCATTTCAATAGGTTCTTATTTCTGCAG 772 I I 13, Interferon-pseudo-ω4-gen, kendeteg- I I net ved, at det har formlen I I AAGCTTTGGGCATGACCTAGTAGGTGACTCTT 32 I I AGTTGGAGTGGTCAGTTGTAAGGCTCTTGCTCAGTCACGTGGCTCCCCTGTATTTCCCC 91 I I ACGTTTGCAGCCGTGCTCCTTCTCAATGCTATGAAAGTGTGGGCTCCTCTCCCACTGGA 150 I I GTGCTGACTGTAGCTTGTATCTTGGCACTCCCAGGCTGTACATAACAGCTCTGAGGTGA 209 I I TCTCAGGGTTAATGTTTTCTCCCCGACTTGGAGGCCATTGAAGGAAGGGACCTTAGTAG 268 I I TAGTTGTAACTGAGGGTCTTTTGCTTGTCTCCTGGGGGCTCCACCCCAGAGATGCAGGT 327 I I GAGCAATCACTCAGTGCATTCAGCTTGGGATGGGGGTGTCTGTGCTGTGGGCCCAAGAC 386 I I AGGGGTTCCCTGCCTGGTGATGTGAGGGGTGGGTGGTTGACCAATGGCAGACAGACTGG 445 I I CCTCCTCTCTTGGGTTGACAGCAGCTTGTTGGAGGTATGCATAAGGCACTTGGGGTCTT 504 I I GCTCCTTCATTAGTTCCAAGGTAGCTGGGGTAGTACCACTGCAGAGGCAGTGTTAGACA 563 I I GGCTTTCTGTTACCCCTGGGGTCTCCACCTCCTAGAAATGTGAAGTCATGTTAATGGGA 622* I DK 175194 B1 GTGTTTAGCCAGAGGAGTGGGGTGGCTGCATGCTGGTGTAAGTATGGGACTTCACTTCT 681 TGGGAAACAGGGAGGTGGAATCTTACCA6CAGGAGACT6TTCTCCTCACGATGTGTAAC 740 CTGCAGTGTGCTGGAAGTTTAGGTGACTGTGGCATGATGTTAGCTTGTAAACAAAGAGC 799 TTCAGACTCTTTGTCTCTTCCCCAGACCCAAGGCAGCAAGGATAAAAGCTGCTGCTGTG 858 GCAGTGGCAGAGGTAGQATGGTTGTGGGAGCCTCTCCCCAGGGAAACTCTAGTCAACTA 917 CCAGTGGATATGCTCAGCCATGGGTAGGGTGACTGTTCTGCAGTCATGGGCAGGGGGCC 976 TGCTCCTGAAGAATAGGGACAGGGATTCTCAGGGAAGAGGGGCTGGACTCCTCTTCATA 1035 TAGTGGCGATGATGTGCTGGAGGTGCCAGTGTAGTGAATAGGCCTTTGTTCCTTCCCCA 1094 GCCAGAGGGCTGCTGGGGCTGTCCCACTGCAACGGTCATGGTGGATGGGTTATGGGTTG 1153 ACTGTGGGATTTCTTTCTTGGAGAAATGCTGGACTGCCTGATTGAGGAGACGAGGGAAG 1212 GGAAGAATGCCTGTGCTGGAGTCTCTGGTCAGGTGGCTCTGCCACAGAGGAGAGGTGAC 1271 CACGAGGAACTGCGTGGAGAACAGTGTAGCCACTCTTCTGTGAGGCAGTTGCTCTGTTT 1330 TGGGGATCTGGAGGAGCCGCTATTCCTTACAGATTCCCAGAGCCTGGAGACAGCAAGGG 1389 CAAGAGCTGTGAGAAAGCAAAGATAGCAACCCACCCTTCTCACTGGGAGCTCTGTTCCA 1448 GGGAGATGCAGAGCTGCCATTGCTCAATAGCCCCAGCTGGTAGCTGGAGACCCAGGCCT 1507 GGCAGACCCACCCAGTGAGCAGATAGGGGATTAGGGACCCACATAACACACAGTCTGGC 1566 CACTTTTCCATAGGGCTGCTGAATATGCTGGGGGTCCAATCCAGACCATAGTCACCTCA 1625 CATTTTTCAGTACCTGAAGATATCAACAGTGAAGGCTATGAAACAGTGAAGATGGGGAC 1684 CTGCCCCTGCCTCTGGACCTCTGTrCCAGAGAGGTACAACCTGTTGCCTCCGACATACA 1743 TGCAGGAGGTGGCTGGAGACCCGGTGGATATCCCTCCCACTGAGGAGAAGCAGCATCAG 1802 GGAATCAGGTGAAGAAACAGTCTGGCCACTTTTTGGTAGAGCAGCTGTGCTTGCTGGGG 1861 GTCTGCTACCACCCCCAGCAAAAAGAATGGCATTTGCAAGAATGGCTAAGGCTGCTAAA 1920 CAGCAACAATGGCAACCTACCATTCCCrrTGGAGCGCCATCCCAGGGAXATTCGAAACT 1979 GCTGTCCACTAGAAAACAGTGGTGGAGGTGAGTGGAGACCCCAGTGGAGAGTTTCACCT 2038 GGTGAAAAGAAACAGGATTTGGGATCGACATGAATAACCAATCTGACTGCTTCCCCGTA 2097 GAGCTGCTGGACTGTGCTGGGTGGCTGCTCCAGTCCCTAGCTGCCTTGGACTGCCGAGA 2156 ACCCAAAGGCTCCAATAGCTAAGATTGTGAAAGAGCAAAGATGGCAGCCCACCCCCTGC 2215 CACAGGGAGCTCCATGTCAGGGAGGTATGAGGCTGCTACCAGTGTCTGGCTGGATTCCC 2274 AAGTCGAGTGGGTCTXACCCTGAGACAGGCCATGGAAGGTGGGCCTGTCATTGTCACTG 2333 CCCAGCGCCCTGGATGAAACCCCTTTGCTAGGGGTATGTATAGGGGTCTAGCGTCCTGC 2392 TTGGCTGGAGTTAIAGCTTCTTTTGTGGGGAGGCCTGGGTATCTAAGGCTCCAGGGTAC 2451 CCATGCATGCGAGAGCGGCTGCTCTGCTGAACCCTACGTAGCCCTGCATGTCAGACTAA 2510 ATGCCCTGGTAGAGTGGGTTCACTAGGAGATCTCCTGACCTGAGGATTGCAAAGATCTG 2569 TGGGAGAAGCGTGGGTCCCCAGGGCTGCTCACTTACTCACCACTTCCCTGGGCAGGAGA 2628 GGCTCCCCTGGCTCTGTGTCATCCTGGGGGGGCAGTTGTCCTGCCTXACTTTGCTTTAT 2687 TCTCCATGGGTCAAGTTGTTlTCTTGAGTCTCAATGTGTGCACCTGGTTTiTrCAGTTG 2746 AAGGTGCTGTATTTACTTGCCCCTTCCATTTCTCTCCATGAGAGTGGCACACACTAGCA 2805 GGTTCCAGTCGGCCATCrTGCAACCCCTGAAAACTATTTGTTTCCAGCTATAAGCCATT 2864 I DK 175194 B1 I I 72 I I GAGAGAACCTGGAGTGGCATAAAAAGAATGCCTCGGGGTTCATCCCGACCCCAGCTCAG 2923 I I CTAGGCCAGCAGCACCCTCGTTTCCCA ATG GTC CTA CTG CTT GTT CTA CTG 2974 I I GTG GCC CTG CTG CTT TGC CAA TGT GGC CCT GTT GGA TCT CTG GGC 3019 I I TTT GAC CTG CCT CAG AAC CGT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 3064 I I GCA TTC TGG GCC AAA TGC AGA ATC TCC ACT TTC TTG TGT CTC AAG 3109 I I GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CTG GAG ATG TGG ATG GCA GTC 3154 I I ATT TGC AGA AGG CCC AGG CTG TGT CTG TCC TCC ATG AGA TGC TTC 3199 I I AGC AGA TCT TCA GCC TCT TCC CCA CAG AGC GCT CCT CTG CTG CCT 3244 I I GGA ACA TGA CCCTCCTGGACCAGCTCCACACTGGATTTCATCAGCAGCTCGAATAG 3300 I I CCTGGAGTCTTGCTTAGGGCAGGCAACAGGAGAGGAAGAATCTGTGGGGGTGATTGGGA 3359 I I CCCTACACTGGCCTTGAGGAGGTACTTCCAGGGAATCCATGGGAATCCAGAGAATCTAC 3418 I I CTGAAAGAGAAGAAATACAGTGACTGTGCTTAGGAGGTTGTCAGAATGGAATCATGAAA 3477 I I TCCTTCTCTTCATCAACAGACTTGCAAGGACTGAGAAGTAAGGATGAAGACCTGGGGTC 3536 I I TGCTTTACTCTTTCTTATTTTCTTCCTCTTCCTTACTATGTGTTTATTTCTTCTTTTTC 3595 I I TAGTTCCTTAACTTGTAAGTAGTTCACTTGGTTTGAGGTCTTTCTTCTTTTTTAATATA 3654 I I AGCTT 3659

14. Transformeret værtsorganisme, kende- I tegnet ved, at den indeholder den genetiske in- I I formation ifølge krav 1 til 10. I I 15. Værtsorganisme ifølge krav 14, k e n d e - I I 20tegnet ved, at den genetiske sekvens er inde- I I holdt i en vehikel, der kan undergå replikation i I I værtsorganismen. I I 16. Værtsorganisme ifølge krav 14,kende- H I tegnet ved, at den er en pattedyrscellelinie I 25 eller E.coli. I 17. Værtsorganisme ifølge krav 14,kende- I I tegnet ved, at den er E.coli med DSM nr. 3003 I eller E.coli med DSM nr. 3004. I I 18. Værtsorganisme ifølge krav 17,kende- H I 30tegnet ved, at vehiklen derudover indeholder I I for ekspressionen nødvendige replikon- og kontrolse- I I kvenser. I DK 175194 B1

19. Værtsorganisme ifølge krav 18, kendetegnet ved, at vehiklen indeholder de for ekspression nødvendige replikon- og kontrolsekvenser fra plasmidet pER103 med DSM nr. 2773 (se figur 6). 5 20. Værtsorganisme ifølge krav 19, kende tegnet ved, at den er transformeret med et eks-pressionsplasmid ifølge krav 21, 22 eller 23.

21. Ekspressionsplasmid for interferon-ω, der er et derivat af plasmidet pBR322, kendeteg-10 n e t ved, at plasmidet pBR322 i stedet for sit eget kortere EcoRI/BamHI-fragment indeholder en DNA-sekvens med formlen EcoRI Sau3A g a a trt c acoctGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTCGCGA 59 ^mRHA-Start Met ACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTAAGCTTAAAfl ATG 116 RBS Hindlll Cys Asp TGT fiÅX. C-jIH^-omega-Gen-» Sau3A

22. Ekspressionsplasmid pRHW12 ifølge krav 21, kendetegnet ved, at interferon-o>-genet op- viser en DNA-sekvens med formlen TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 Ncol GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 208 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 GAA GGA GAA TCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 I DK 175194 B1 I I 74 I I TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 I I GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAAT6ATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 I I TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589 I I AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 I I AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 I I TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 I I TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCASCi 802 I I Alul I I 10 I

23. Ekspressionsplasmid pRHWll ifølge krav 21, .1 I kendetegnet ved, at interferon-6>-genet op- I I viser en DNA-sekvens med formlen I I TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 I I Ncol I I GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 I I AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 I I AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 I I CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 208 I I GCC TGG AAC ATG ACC CTC CIA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 I I CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 I I GAA GGA GAA TCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCT GGA CTG ACC TTG 343 I I AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 I I TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 I I TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 I I GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 I I TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589 I I AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 I I AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 I I . TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 I I TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCASst 802 I I Alul I DK 175194 B1

24. Plasmid pRHWIO, der er et derivat af pBR.322, kendetegnet ved, at der i plasmi-det pER103 med DSM nr. 2773 (se figur 6) i Hindlll-stedet er indføjet et DNA-fragment med formlen Hindi II Sau3A Ncol a^SCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAaoet·. t Sau3A Hindlll

25. E. coli HB 101, kendetegnet ved, at den er transformeret med et plasmid ifølge krav 12, 22, 23 eller 24.

26. Humane interferon-proteiner af type I, kendetegnet ved, at de kodes for af et DNA-molekyle ifølge et af kravene 1 til 10.

27. Humane interferoner ifølge krav 26, kendetegnet ved, at de modne interferoner opvi- 25 ser en divergens på 30 til 50% over for humane ot-interferoner.

28. Humane interferoner af type I ifølge krav 28, kendetegnet ved, at a) de modne interferoner opviser en divergens på 30 30 til 50% over for humane a-interferoner og en divergens på omtrent 70% over for β-interferon, og b) de har en længde på 168-174 aminosyrer; samt N-glycosylerede derivater deraf. __ _ ____ I DK 175194 B1 I I 76 I

29. Interferoner ifølge krav 28,kende- I I tegnet ved, at de opviser en divergens på 40 I I til 48% over for humane ot-interferoner, samt N- I I glycosylerede derivater deraf. I I 5 30. Interferoner ifølge krav 26 til 29, k e n - I I detegnet ved, at de indeholder et leader- I I peptid. I

31. Interferoner ifølge krav 26 til 29, k e η - I I detegnet ved, at de har 172 aminosyrer. H I 10 32. Interferon ifølge krav 31, kende- I I tegnet ved, at det har aminosyresekvensen I I 5 10 15 I I Cys Asp Leu Pro Gin Asn His Gly Leu Len Ser Arg Asn Thr Leu I I 20 25 30 I I Val Leu Leu His Gin net Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu I I 35 40. 45 I I Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin Glu Net Val Lys Gly I I 50 55 60 I I Ser Gin Leu Gin Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met I 65 70 75 I I Leu Gin Gin Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala I I 80 85 90 I I Ala Trp Asn Met Thr Len Leu Asp Gin Leu His Thr Gly Leu His I 95 100 105 I I Gin Gin Leu Gin His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gin Val Val Gly I I 110 115 120 I I Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu I 125 130 135 I Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys I I 140 145 150 I I Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys I I 155 160 165 I I Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg Leu Arg Ser Lys I I 170 I I Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser I I og i aminosyreposition 78 N-glycosylerede derivater I I deraf. I DK 175194 B1

33. Interferon ifølge krav 31, kendetegnet ved, at interferonet ifølge krav 32 i position 111 indeholder aminosyren Glu i stedet for Gly, og i aminosyreposition 78 N-glycosylerede derivater deraf.

34. Interferoner ifølge krav 30 til 33, ken detegnet ved, at de indeholder et leader-peptid med formlen Met Ala Leu Leu Phe Pro Leu Leu Ala Ala Leu Val Met Thr Ser Tyr Ser Pro Val Gly Ser Leu Gly. 10- 35. Fremgangsmåde til fremstilling af interfe ron-proteiner ifølge krav 26 til 34, kendetegnet ved, at en egnet værtsorganisme transformeres med genetisk information, der koder for interferon-proteiner iføl-15 ge krav 26 til 34; denne information eksprimeres til produktion af det pågældende interferon i værtsorganismen; og det herved tilvejebragte interferon-protein isoleres fra denne værtsorganisme.

36. Fremgangsmåde ifølge krav 35, kende - tegnet ved, at informationen er indeholdt i et hvilket som helst DNA-molekyle ifølge krav 1 til 10.

37. Fremgangsmåde ifølge krav 36, kende tegnet ved, at værtsorganismen efter transfor- 25 mationen er defineret ifølge et af kravene 15 til 20.

38. Fremgangsmåde ifølge krav 35, kende - tegnet ved, at interferonet er defineret ifølge krav 32 til 34.

39. Fremgangsmåde ifølge krav 35, kende - 30 tegnet ved, at der som vært anvendes E.coli HB 101 og som plasmid et plasmid ifølge krav 21, 22 eller 23. I DK 175194 B1 I I 78 I I 40. ω-Interferon, der kan fremstilles ved frem- I I gangsmåden ifølge krav 35 eller 39. I

41. Blanding, der er egnet til antitumor- eller I I antiviral behandling, kendetegnet ved, at I I 5 den ud over et eller flere inerte bærestoffer og/ el- I I ler fortyndingsmidler indeholder en aktiv mængde af I I interferon-peptid ifølge et af kravene 26 til 34. I

42. Anvendelse af ω-interferon ifølge krav 30 I I til 34 til fremstilling af en til antitumor- eller I I 10 antiviral behandling egnet blanding. I

43. Fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet I pRHWlO, kendetegnet ved, at der i plasmi- I I det pER103 med DSM nr. 2773 (figur 6) i Hindlll- I I stedet ved hjælp af ligasereaktion indføjes et DNA- I I 15 fragment med formlen I I Hindlll Sau3A Ncol I I aAGCTTAÅAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 I I ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 I I CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 I I CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 I I AGATCACACA TCTTTAaact t I I Sau3A Hindlll I I og at det således tilvejebragte plasmid transformeres I I til replikation i E. coli og dyrkes. I DK 175194 B1

44. Fremgangsmåde til fremstilling af ekspres-sionsplasmidet pRHW12, kendetegnet ved, at der i det ved restriktionsendonucleasefordøjelse med BamHI, udfyldning af skæringssteder ved hjælp af Kle-5 now-fragmentet fra DNA-polymerase I og de 4 desoxy-nucleosidtriphosphater og en følgende skæring med Ncol opnåede større fragment af plasmidet pRHWlO, som i Hindu I-stedet fra plasmid pER103 med DSM nr. 2773 (se figur 6) indeholder DNA-fragmentet med formlen :Hindlll Sau3A Ncol a&SCXTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CGATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG TAAAAGGGAG 150 CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 AGATCACACA TCTTTAaact t 6au3A Hindlll ved ligasereaktion indføjes det ved fordøjelse af Avail-fragmentet af klonen P9A2 (DSM nr. 3004) ved hjælp af Ncol og Alul opnåede fragment med formlen c CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 Ncol GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT 208 GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 I DK 175194 B1 I I 80 I I TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 I I TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 I I GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 I I TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589 I I AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 64 B I I AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 I I TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 I I TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGct 802 I I Alul I I og at det således tilvejebragte plasmid transformeres I I til replikation i E. coli og dyrkes. I

45. Fremgangsmåde til fremstilling af ekspres- I I sionsplasmidet pRHWll, kendetegnet ved, at I I 15 der i det ved restriktionsendonucleasef ordøj else med I I BamHI, udfyldning af skæringssteder ved hjælp af Kle- I I now-fragmentet fra DNA-polymerase I og de 4 desoxy- I I nucleosidtriphosphater og en følgende skæring med I I Ncol opnåede større fragment af plasmidet pRHWlO, som I I 20 i Hindu I-stedet fra plasmid pER103 med DSM nr. 2773 I I (se figur 6) indeholder DNA-fragmentet med formlen I I HindiII Sau3A Ncol I I aAGCTTAAAG ATGTGTGATC TGCCTCAGAA CCATGGCCTA CTTAGCAGGA 50 I I ACACCTTGGT GCTTCTGCAC CAAATGAGGA GAATCTCCCC TTTCTTGTGT 100 I I CTCAAGGACA GAAGAGACTT CAGGTTCCCC CAGGAGATGG XAAAAGGGAG 150 I I CCAGTTGCAG AAGGCCCATG TCATGTCTGT CCTCCATGAG ATGCTGCAGC 200 I I AGATCACACA TCTTTAaact t I I Sau3A HindiII I DK 175194 B1 ved ligasereaktion indføjes det ved fordøjelse af Avail-fragmentet af klonen E76E9 (DSM nr. 3003) ved hjælp af Ncol og Alul opnåede fragment med formlen C CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG 28 NCOl GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC 73 AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG 118 AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG 163 CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC AGA GAG CGC TCC TCT GCT 208 3GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT 253 CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA 298 GAA GGA GAA TCT GCT GAG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG 343 AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA 388 TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA 433 TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA 478 GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT TGAAATGATTCTCATTGATTAATTTGCCATA 530 TAACACTTGCACATGTGACTCTGGTCAATTCAAAAGACTCTTATTTCGGCTTTAATCAC 589 AGAATTGACTGAATTAGTTCTGCAAATACTTTGTCGGTATATTAAGCCAGTATATGTTA 648 AAAAGACTTAGGTTCAGGGGCATCAGTCCCTAAGATGTTATTTATTTTTACTCATTTAT 707 TTATTCTTACATTTTATCATATTTATACTATTTATATTCTTATATAACAAATGTTTGCC 766 TTTACATTGTATTAAGATAACAAAACATGTTCAGCt 802 Alul og at det således tilvejebragte plasmid transformeres til replikation i E. coli og dyrkes.

46. Synergistisk blanding ifølge krav 41, kendetegnet ved, at den yderligere inde holder y-interferon.

46. Synergistisk blanding ifølge krav 41, kendetegnet ved, at den yderligere inde- 30 holder human tumornekrosefaktor.