Nouveaux antibiotiques obtenus à partir d'une souche de genre Cryptosporiopsis, leur préparation et leur application en thérapeutique La présente invention a pour objet de nouveaux antibiotiques qui seront désignés par la suite par
S 41062/F-1, S 41062/F-6 et S 41062/F-7, leur préparation et leur application en thérapeutique, à titre
de principes actifs de-médicaments.
<EMI ID=1.1>
et S 41062/F-7 présentent les caractéristiques suivantes :
S 41062/F-1
- Il se présente sous la forme d'une poudre micro-cristalline blanche fondant à 235-240[deg.]C (décomposition gra- <EMI ID=2.1>
- Spectre ultra-violet dans le méthanol
<EMI ID=3.1>
- Spectre infra-rouge dans le bromure de potassium :
voir figure 1;
- Spectre de RMN sur protons (90 MHz dans le diméthylsulfoxyde; substance de référence : tétraméthylsilane):
voir figure 4;
- Spectre de RMN sur le carbone 13 dans le méthanol tétradeutéré (36 mg dans 0,3 ml); substance de référence : tétraméthylsilane), voir tableau II, colonne A;
- en spectrométrie de masse, on obs.erve des pics par désorption de champ : M (+li) + 1055 et M (+Na) + 1071 <EMI ID=4.1>
d'un poids moléculaire de 1048;
- Analyse élémentaire après séchage à la température ambiante sous vide poussé:
<EMI ID=5.1>
C = 57,3% : H=7,7% : N=10,7% : 0=24,4%
Trouvé:
<EMI ID=6.1>
Solubilité : S 41062/F-1 se dissout bien dans le méthanol,
<EMI ID=7.1>
est difficilement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther, le benzène et l'hexane;
- le composé est stable dans le méthanol aqueux à pH 4 à 7. Sous des conditions alcalines ou fortement acides
- il se décompose en perdant son activité anti--fongique.
- L'hydrolyse acide, effectuée dans de l'acide chlorhydrique 6N à 110[deg.]C pendant 24 heures donne, comme produit de dégradation, un acide,gras_saturé qui, sous forme de son ester méthylique, présente en spectro- <EMI ID=8.1>
-.Analyse des amino-acides (selon la méthode de Stein et Moore)
On obtient des produits de dégradation ayant des temps de rétention analogues ou similaires à ceux, par exemple, de l'acide aspartique, de l'hydroxypyroline, de la sérine et de l'ammoniac ainsi qu'un amino-acide inconnu ayant un temps de rétention compris entre celui de la leucine et de la tyrosine.
Le composé S 41062/F-1 est un hexapeptide cyclique neutre portant un reste d'acide gras saturé, ramifié, contenant 16 atomes de carbone et fixé par l'intermédiaire d'un groupe amide. D'après les études de détermination de structure (analyse d'amino-acides,éthérification) et les données spectrométriques (spectre
<EMI ID=9.1>
les amino-acides suivants sont présents: la sérine,
la 4-hydroxyproline, la 4-méthyl-3-hydroxy-proline,
la 3-hydroxy-homo-tyrosine et probablement la 4,5dihydroxy-ornithine. Le sixième amino-acide inconnu contient un groupe carbamoyle et, probablement, une fonction hydroxy secondaire. L'antibiotique S 41062/F-1 possède la structure suivante :
<EMI ID=10.1>
Chromatographie en couche mince : voir tableau I
Activité anti-fongique : voir tableau V
S 41062/F-6
Selon les.produits obtenus par dégradation acide, le composé S 41062/F-6 est un mélange d'au moins
3 composants..Il se présente sous la forme d'une poudre blanche micro-cristalline, fondant à 240-244[deg.]C (décomposition graduelle) ; <EMI ID=11.1>
- Spectre ultra-violet dans le méthanol
<EMI ID=12.1>
- Spectre infra-rouge dans le bromure de potassium :
voir figure 2;
- Spectre de RMN sur protons (90 MHz dans le DMSO; substance de référence : tétrarnéthylsilane) . voir figure 5;
- Spectre de RMN sur carbone 13 dans le méthanol tétradeutéré (44 mg dans 0,3 ml; substance de référence :
tétraméthylsilane) : voir tableau II, colonne B;
- Analyse élémentaire après séchage à la température ambiante, sous vide poussé :
<EMI ID=13.1>
- Solubilité : S 41062/F-6 est facilement soluble dans <EMI ID=14.1>
(DMSO); il est difficilement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther, le benzène
et l'hexane ;
- le composé est stable dans le méthanol aqueux à pH 4 à 7. Sous des conditions alcalines ou fortement acides, il se décompose en perdant son activité anti-fongique.
- l'hydrolyse acide effectuée dans de l'acide chlorhydrique 6N à 110[deg.]C pendant 24 heures donne, comme produit de dégradation, un acide gras saturé qui, sous forme
de son ester méthylique, présente en spectrométrie
<EMI ID=15.1>
- Analyse des amino-acides (selon la méthode de Stein et Moore)
On obtient des produits de dégradation dont les temps de rétention sont analogues ou similaires, par exemple, à ceux de l'acide aspartique, de l'hydroxy-
<EMI ID=16.1>
ainsi qu'un amino-acide inconnu ayant un temps de rétention compris entre celui de la leucine et de la tyrosine;
- Chromatographie en couche mince: voir tableau I;
- Activité anti-fongique : voir tableau V :
S 41062/F-7
Il se présente sous la forme d'une poudre blanche fondant à partir de 205[deg.]C (suintement avec décomposition graduelle); <EMI ID=17.1>
- Spectre ultra-violet dans le méthanol
<EMI ID=18.1>
<EMI ID=19.1>
- Spectre infra-rouge dans le bromure de potassium :
voir figure 3;
- Spectre de RMN sur protons (90 MHz dans le DMSO; substance de référence : tétraméthylsilane) : voir figure 6; <EMI ID=20.1> deutéré (38 mg dans 0,25 ml; substance de référence:
tétraméthylsilane): voir tableau II,colonne C;
- Analyse élémentaire après séchage à la température ambiante sous vide poussé :
<EMI ID=21.1>
Après avoir dissous un échantillon-dans un mélange d'acétate d'éthyle et d'isopropanol, on agite
la solution avec de l'acide chlorhydrique très dilué,
on l'évapore puis on fait précipiter à partir de méthanol avec de l'acétone. L'analyse élémentaire subséquente donne les résultats suivants :
<EMI ID=22.1>
- Solubilité : S 41062/F-7 se dissout bien dans le méthanol, l'éthanol, la pyridine et le diméthylsulfoxyde
(DMSO); il est difficilement soluble dans l'eau, le chloroforme, l'acétate d'éthyle, l'éther, le benzène et l'hexane,
- l'hydrolyse acide, effectuée avec de l'acide chlorhydrique 6N à 110[deg.]C pendant 24 heures donne, comme produit de dégradation, un acide gras saturé qui, d'après les temps de rétention observés en chromatographie en phase gazeuse et les pics moléculaire et de fragmentation déterminés par spectrométrie de masse, pourrait être l'acide diméthylmyristique.
- Analyse des amino-acides On obtient des produits de dégradation ayant des temps de rétention analogues
ou similaires à ceux par exemple de l'acide aspartique, de l'hydroxypyroline/allo-hydroxyproline, de la sérine et de l'ammoniac ainsi qu'un autre amino-acide ayant un temps de_rétention compris entre celui de la leucine et de la tyrosine.
Chromatographie en couche mince . voir tableau I Activité anti-fongique : voir tableau V
<EMI ID=23.1>
La chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice (épaisseur des__plaques 0,25 mm, Merck) donne les valeurs Rf suivantes :
<EMI ID=24.1>
Pour révéler les composés de l'invention sur les chromatogrammes_en couche mince, on peut utiliser de la vapeur d'iode ou vaporiser d'autres réactifs appropriés. On peut par exemple préparer un réactif vaporisable approprié en dissolvant 100 mg de chlorure ferrique dans 1 ml d'acétate d'éthyle et en y ajoutant
100 ml d'acide sulfurique concentré exempt de nitrate.
<EMI ID=25.1>
mince complètement secs de solvant puis on chauffe en..utilisant un appareil de chauffage à incandescence jusqu'à apparition de fortes taches brunes.
TABLEAU II
:._-Spectres de RMN sur carbone 13 (spectromètre Bruker HX-90-E
à 22, 63 MHz ; fréquence de balayage : 6000 Hz)
<EMI ID=26.1>
Conformément au procédé de l'invention,pour préparer les antibiotiques S 41062/F-1, S 41062/F-6 et/ou S 41062/F-7, on cultive sur ou dans un milieu de culture une souche susceptible de produire S 41062/F-1, et/ou S 41062/F-6 et/ou S 41062/F-7, par exemple une souche de champignons du genre Cryptosporiopsis.
Le procédé de l'invention peut être effectué selon des méthodes connues. Une culture de
transfert de la souche produisant S 41062/F-1,
S 41062/F-6 et/ou S 41062/F-7 a été déposée le 2.1.1980 auprès du "American Type Culture Collection (ATCC) Rochville, Maryland, USA,et est accessible au public sous le n[deg.] ATCC 20594. La culture est également dispo-
<EMI ID=27.1>
Une autre culture de transfert a été déposée le 16.6.1980 auprès du "Unitéd States Department of Agriculture
(Northern Utilization Research and Development Division),
<EMI ID=28.1>
duisant S 41062/F-1, S 41062/F-6 et/ou S 41062/F-7,
qui-ont été obtenues à partir de la souche mère de
ATCC 20594 ou NRRL 12192, par mutation, par exemple par irradiation, traitement avec des substances mutagènes connues, ou par sélection.
Caractéristiques de la souche ATCC 20594 (ou NRRL 12192)
Cette souche a été isolée à partir d'une
racine de plante recueillie près de Soyhières (Suisse)
et forme en culture pure des conidiomes ouverts
compacts (acervules). Cette caractéristique permet d'affirmer que la souche, déposée sous le n[deg.] ATCC 20595 et NRRL 12192,
<EMI ID=29.1>
copiques et selon la clé de détermination de B.C. Sutton
(Ainsworth, Sparrow & Sussman: The Fungi, v.IVa., Academic Press 1973, chapitre 11, p. 555),le champignon peut être rattaché au genre Cryptosporiopsis Bub & Kab. A l'exception de quelques rares caractéristiques indéter-minables, cette classification est en bonne conformité avec celle de J.A. von Arx (A Revision of the Fungi classified as Gloeosporium, Bibliotheca Mycologica,
v. 24, J.Cramer, 1970, pp. 5,6, 27-29). Etant donné
que l'on n'a pas observé de fructifications sur le substrat d'origine, que jusqu'à présent l'on n'a pas
pu observer d'état parfait et que
les descriptions de culture acceptables sur le plan
de la taxonomie sont très rares dans la littérature
(J.W. Groves 1939 : Some Pezicula species and their conidial stages, Can. J. Research 17, 125-143; J.W. Groves
1939 : Some Pezicula species occuring on alnus,
Mycologia 32, 112-123; J.W. Groves 1941 : Pezicula carnea and Pezicula subcarnea, Mycologia 33, 510-522;
J.W. Groves 1947: Pezicula Morthieri on Rhamnus,
Mycologia 39, 328-333), une classification plus précise semble ne pas pouvoir être établie actuellement.
Les données physiologiques et morphologiques suivantes sont caractéristiques de la souche Cryptosporiopsis ATCC 20534 produisant les antibiotiques S 41062/F-1,
S 41062/F-6 et/ou S 41062/F-7 : la croissance est bonne
en milieu gélose de préférence à température inférieure. Les températures minimales et maximales de croissance sont respectivement de 0[deg.] et 31-33[deg.], la croissance optimale s'effectuant entre 15 et 24[deg.]C.
Le tableau III ci-après indique les caractéristiques de croissance en fonction de la température et
du milieu d'incubation.
Le milieu gélosé en boites de Pétri est ensemencé et incubé de manière à obtenir une colonie
par boîte ; après une période d'incubation de 14 jours, on mesure le diamètre des colonies (moyenne de 6 colonies
en mm), ce qui sert de mesure du rythme de croissance.
<EMI ID=30.1>
<EMI ID=31.1>
<EMI ID=32.1>
<EMI ID=33.1>
crémeuse, trouvé dans la jeune culture sur milieu MA
et qui se développe vigoureusement avec un aspect pelucheux à laineux-pelucheux,devient graduellement
gris clair à brun gris ou brun clair au cours de l'incubation. Sur la face réverse, les colonies sont
de couleur brun ocre à brun châtain et les cultures incubées à environ 27[deg.]C excrètent, dans le milieu gélosé, un pigment brun foncé.
Dans un milieu MA liquide (milieu MA sans agar-agar), dont on peut ajuster le pH avec de l'acide chlorhydrique ou de l'hydroxyde de sodium,on observe
à pH 2,0 sous agitation à 180 tours/minute et à une température de 21-22[deg.]C, une bonne croissance de la
souche ATCC 20594 alors qu'à un pH supérieur à 9,3
cette souche ne croît pas. D'une manière générale,
on obtient une bonne croissance à un pH compris entre
2,3 et 8,0.
Les températures inférieures sont également préférables pour la sporulation de la souche de Cryptosporiopsis ATCC 20594.
Après une incubation de 7 à 10 jours sur un milieu MA à 18[deg.]C, il se forme de nombreuses microconodies et macroconidies . Celles-ci se présentent sous la forme de conidiomes (acervules) ayant l'aspect d'un disque;
de couleur crème à brun clair et d'un diamètre de 50 à
200/u, ou sous forme d'agrégats de conidiomes d'une dimension jusqu'à 3 mm; une muqueuse apparaît à la surface
des conidiomes.
D'après l'examen microscopique,
les cellules_conidiogènes présentes dans la couche supérieure des conidiomes peuvent être considérées
comme des phialides. Il est fréquent que deux phialides formant des microconidies soient-situées directement l'une derrière l'autre; les bases terminales lenticulaires des phialides sont gonflées, et mesurent <EMI ID=34.1>
un pore latéral. Les macroconidies formant des phialides
<EMI ID=35.1>
et ne sont généralement pas disposées les unes derrière les autres.
Les microconidies,uni-cellulaires,hyalines,
sont très petites et de forme cylindrique à légèrement claviforme, l'extrémité la plus large étant arrondie,
la plus étroite étant tronquée. D'autre part, les macroconidies,uni-cellulaires, incolores à faiblement ambrées, sont grandes et normalement de forme allantofde. L'une des extrémités est arrondie, l'autre est tronquée.
Les conditions de culture peuvent avoir une nette influence sur la formation et la dimension des microconidies et des macroconidies, comme indiqué dans le tableau IV.
TABLEAU IV
<EMI ID=36.1>
<EMI ID=37.1>
(Tableau IV suite).
<EMI ID=38.1>
<EMI ID=39.1>
Les macroconidies mûres présentent de nombreuses
-petites vacuoles qui se colorent en rouge intense avec le colorant Sudan III et en noir intense avec le
colorant Sudan-black B. Les microconidies ne se colorent pas.
La germination des macroconidies est optimale
<EMI ID=40.1>
(70 à 80% de germination). A un pH supérieur à 5,5,
le taux de germination est inférieur à 5%. Le taux de germination des microconidies est inférieur à 1% sous toutes les conditions essayées.
La nouvelle souche ATCC 20594 peut être
cultivée à une température appropriée sur différents milieux nutritifs conventionnels, en culture de surface aérobie ou en culture immergée.
Dès qu'une quantité suffisante des nouveaux composés S 41062/F-1, S 41062/F-6 et/ou S 41062/F-7
a été préparée dans la culture, ce que l'on peut déterminer en vérifiant l'activité envers Candida sp.,. le mycélium peut être séparé de la bouillie de culture et extrait
en procédant selon les méthodes habituelles.
Selon un procédé d'isolement préféré, on homogénéise le mycélium avec du méthanol, on sépare la phase liquide puis on la concentre. On extrait ensuite avec un solvant organique non miscible à l'eau, par exemple de l'acétate d'éthyle, on élimine le solvant sous pression réduite, on dissout le résidu d'évaporation dans du méthanol et, après lavage, par exemple avec de l'hexane, on évapore à siccité sous pression réduite.
Les souches S 41062/F-1, S 41062/F-6 et/ou
S 41062/F-7 peuvent être isolées et purifiées selon des méthodes connues, par exemple par chromatographie ou séparation à contre-courant.
L'invention concerne également les bouillons
de fermentation obtenus pendant la culture des souches Cryptosporiopsis produisant S 41062/F-1, S 41062/F-6
et/ou S 41062/F-7.
Les nouveaux composés S 41062/F-1, S 41062/F-6 et S 41062/F-7 se signalent par d'intéressantes pro-. priétés pharmacodynamiques, en particulier par des propriétés antibiotiques. Ils exercent notamment une action inhibitrice sur la croissance des micro-organismes tels que les levures et les champignons, mais sont inactifs envers les bactéries gram-positives et gramnégatives.
Le large spectre d'activité des nouveaux composés envers les levures et champignons est particulièrement remarquable envers différentes souches
de Candida pathogènes pour l'homme.
Dans le tableau V suivant, on a rassemblé
les concentrations inhibitrices minimales (CIM) de
S 41062/F-1, S 41062/F-6, S 41062/F-7 contre différents micro-organismes. Ces concentrations ont été déterminées par des essais de dilution en série, selon des méthodes connues; l'incubation est effectuée à une température
de 27[deg.]C pendant 48 à 72 heures dans un milieu contenant de l'extrait de malt.
T A B L E A U V
<EMI ID=41.1>
L'activité inhibitrice envers les levures et les champignons exercée par les nouveaux composés a également été mise en évidence par des essais in vivo sur le
modèle d'infection génitale. On infeste par voie intravaginale des souris et des rats préalablement traités
avec du benzoate d'estradiol, puis on les traite pendant
5 jours successifs, par voie orale ou parentérale
(souris) ou par voie intra-vaginale (rat) avec la substance à essayer. Le résultat du traitement est déterminé
par la présence ou 1'. absence de champignon dans le vagin
ou sur l'utérus de ces animaux.
On observe une activité anti-mycotique
en application topique à une concentration de 2% et au delà.
L'activité systémique est observée in vivo
lors de l'application sous-cutanée à une dose comprise environ:entre 5 et 50 mg/kg.
Grâce à ces propriétés, les composés S 41062/F-1, S 41062/F-6 et S 41062/F-7 peuvent être utilisés en thérapeutique comme médicaments, en particulier comme antibiotiques. Ils seront prescrits à une dose quotidienne comprise entre environ 300 et 3000 mg, qu'on administrera en plusieurs doses unitaires contenant chacune environ
de 75 à 1500 mg de substance active, à raison de 2 à 4 fois par jour, ou sous forme retard.
Les nouveaux antibiotiques de l'invention peuvent être utilisés soit seuls soit mis sous forme de compositions pharmaceutiques appropriées, notamment pour l'administration par voie orale ou parentérale. Pour préparer des compositions pharmaceutiques appropriées, on travaille la substance active avec des véhicules, diluants et/ou excipients acceptables du point de vue pharmacologique. De telles
<EMI ID=42.1>
invention sans aucunement en limiter la portée. Les températures sont toutes indiquées en degrés Celsius.
Exemple 1
Culture de la souche ATCC 20594 dans un fermenteur en verre <EMI ID=43.1>
La suspension de spores et de mycélium utilisée pour ensemencer est préparée à partir d'une culture inclinée de souches ATCC 20594 obtenue après 21 jours d'incubation à 21[deg.] sur un milieu gélosé ayant la composition suivante :
<EMI ID=44.1>
b) Préculture
On met en suspension dans une solution physiologique de chlorure de sodium, les spores et les mycéliums de la culture obtenue sous a) et on utilise cette suspension pour ensemencer dans un Erlenmeyer de 2 litres, 1 litre du milieu de préculture suivant :
<EMI ID=45.1>
<EMI ID=46.1>
agitateur à mouvement rotatif, tournant à 180 tours/ minute.
<EMI ID=47.1>
On utilise la préculture obtenue sous b) pour ensemencer, dans un fermenteur en verre de 14 litres,
10 litres du milieu de culture suivant :
<EMI ID=48.1>
Avant de procéder à la stérilisation, on.ajuste
<EMI ID=49.1>
<EMI ID=50.1>
On laisse incuber pendant 5 jours à 21[deg.] tout en agitant à 150 tours/minute et sous aération (1 litre/ minute/litre de milieu).
Exemple 2
Culture de la souche ATCC 20594 dans un fermenteur en acier a) Culture de culture pendant jours
On effectue la culture pendant 21 jours à 21[deg.] dans des ballons de Roux de 400 ml, en utilisant 150 ml du même milieu gélosé que celui décrit à l'exemple la).
b) Préculture
Pour préparer la suspension nécessaire pour l'ensemencement, on ajoute 50 ml d'une solution saline physiologique et on obtient la suspension de spores et de mycélium en utilisant un racloir stérile.
On utilise les 250 ml d' inoculum ainsi préparé pour ensemencer 50 litres d'un milieu de préculture de la même composition que celle décrite à l'exemple lb).
On opère dans un fermenteur en acier.-de 75 litres.
On laisse incuber pendant 5 jours à 21[deg.] sous une pression de 0,5 bar tout en aérant (0,5 litre d'air par minute), et en agitant à une vitesse de rotation de 150 tours/minute.
c) Culture intermédiaire
On utilise 100 litres de la préculture décrite ci-dessus pour ensemencer 500 litres du milieu de culture intermédiaire ayant la composition suivante :
<EMI ID=51.1>
On opère dans un fermenteur en acier de 750 litres.
On laisse incuber pendant 4 jours à 21[deg.] sous une pression de 0,5 bar tout en aérant (0,5 litre par minute, par litre de milieu nutritif), et en agitant
(100 rotations par minute), <EMI ID=52.1>
On utilise la culture intermédiaire pour ensemencer dans un fermenteur en acier de 4500 litres,
3000 litres d'un milieu nutritif d'une composition identique à celle décrite sous le). On laisse incuber pendant 5 jours à 21[deg.], sous une pression de 0,5 bar tout en aérant à raison de 1,0 litre par minute et par litre de milieu nutritif.
Exemple 3
<EMI ID=53.1>
S 41062/F-7
On ajuste à pH 6-7,300litres du bouillon
de fermentation (obtenu à l'exemple 2) par addition d'acide sulfurique dilué ou d'hydroxyde de sodium
et on sépare le précipité de mycélium du filtrat de culture à l'aide d'un séparateur Westfalia.
On homogénéise le mycélium humide dans un réacteur Dispax avec 10 fois sa quantité de méthanol
et on sépare la phase liquide. On répète cette opération
<EMI ID=54.1>
avenir réuni les filtrats, on élimine-le méthanol sous pression réduite et on extrait à 3 reprises avec de l'acétate d'éthyle et une fois avec un mélange d'acétate d'éthyle et d'isopropanol dans le rapport 4:1. On élimine ensuite les solvants sous pression réduite et on dissout le résidu dans 10 fois sa quantité de méthanol aqueux
à 90%. Après lavage avec de l'hexane, la phase polaire
est évaporée à siccité sous pression réduite.
On dissout ce résidu dans 1,5 litre d'un
mélange de chlorure de méthylène, de méthanol et d'eau dans le rapport 78:20:2 et on le sépare par chromatographie sur 20 kg de gel de silice Merck (0,05 - 0,2-mm) en utilisant le même mélange de solvants comme éluant.
On obtient des fractions de 13 litres.
On réunit les fractions n[deg.] 8 et 9 qui sont actives contre Candida albicans; elles contiennent principalement les composés S 41062/F-1 et S 41062/F-7.
On chromatographie ces fractions sur
1,5 kg de Séphadex LH 20 en éluant avec du méthanol
<EMI ID=55.1>
dérablement enrichies en S 41062/F-1 et S 41062/F-7.
On divise les résidus concentrés de ces fractions en 4 portions qui sont chacune chromatographiées
<EMI ID=56.1>
de 10 cm de diamètre). On utilise,comme éluant, un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol dans le rapport 4:1 et on recueille des fractions de 100 ml.
On vérifie la pureté des résidus des fractions par chromatographie en couche mince et on réunit les fractions pures. Les fractions 40 à 65 contiennent
S 41062/F-7 à l'état pur et les fractions 75 à 85 comprennent S 41062/F-1 à l'état pur.
On dissout dans l'éthanol les résidus concentrés contenant S 41062/F-1 , on réunit les solutions, on traite la solution globale avec du charbon actif et on filtre sur une couche de talc de manière à obtenir
une solution limpide. Après avoir évaporé le filtrat presque incolore sous pression réduite ménagée, on mélange lentement le résidu avec de l'acétone, ce qui fait précipiter le S 41062/F-1 sous la forme d'un produit
<EMI ID=57.1>
graduelle.
On réunit ensuite les fractions contenant
<EMI ID=58.1>
tographie -en couches minces, on filtre dans du méthanol sur une couche de talc et, après avoir concentré sous pression réduite , on ajoute lentement de l'acétone. On obtient ainsi S 41062/F-7 sous la forme d'un précipité amorphe fondant à partir de 205[deg.]C (suintement avec décomposition graduelle).
On réunit les fractions 10 et 11 qui ont été obtenues lors de la première chromatographie et qui
<EMI ID=59.1>
solution globale résultante sur 500 g de gel de silice Merck (0,04-0,06 mm) en _.utilisant, comme'éluant, un mélange de chlorure de méthylène et de méthanol dans le rapport 4:1 et on recueille des fractions de 80 ml.
On évapore à siccité sous pression réduite
les fractions présentant une activité contre Candida albicans puis on vérifie la pureté des résidus d'évaporation par chromatographie en couche mince.
On réunit les fractions contenant en majeure partie S 41062/F-6, on les dissout dans du méthanol, on . filtre sur une couche de talc et,après évaporation sous pression réduite, on mélange lentement avec de l'acétone.
Le composé S 41062/F-6 ainsi obtenu précipite sous la forme d'un composé blanc micro-cristallin fondant à 240-244[deg.] avec décomposition graduelle.