JPH09505567A - 多環式駆虫薬、その製造のための方法及び菌株、並びにその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種株の発酵により誘導される式（Ｉ−III）の新規化合物を開示する。これらの化合物は非常に強力な外部寄生虫駆除剤、駆虫剤及び殺虫剤である。

Description

【発明の詳細な説明】 多環式駆虫薬、その製造のための方法及び菌株、並びにその用途発明の背景 米国特許第４３１０５１９号及び第４１９９５６９号に開示されているアベル メクチンのような新規駆虫薬はよく知られている。しかしながら、このようなア ベルメクチン化合物は内部及び外部寄生虫に対して強力な薬剤ではあるが、本発 明の化合物とは構造的に非常に異なる。放線菌から単離された大環状物質である アベルメクチン類は本発明の多環式真菌代謝物とは関係がない。ｄｅ Ｊｅｓｕ ｓ等，Ｊ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ Ｉ，６９７−７０１ ページ（１９８４）には、多環式構造を有するｊａｎｔｈｉｔｒｅｍｓとして同 定された真菌代謝物が記載されているが、上記構造は本発明の化合物の幾つかの 構造要素を欠いている。発明の要約 本発明は新規な駆虫薬及び外部寄生虫駆除薬の製造に関する。従って、このよ うな新規化合物を開示することが本発明の目的である。他の目的は該化合物の新 規製造方法を提供することである。他の目的は該化合物の製造に使用さ れる微生物及び該製造に適用可能な発酵条件を記載することである。更に別の目 的は本発明の化合物を駆虫薬として使用する組成物及び方法を記載することであ る。以下の記述を読めば、それ以外の目的は明白となろう。図面の簡単な説明 図１、図２及び図３はそれぞれ化合物１、２及び３のプロトン核磁気共鳴スペ クトルである。図面では、共鳴ピークの幾つかを「×」で示す。これらのピーク は共存する溶媒由来のものであり、化合物の構造とは関係ない。 図１はＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ５００ ＮＭＲ分光計にて、ＣＤ₂Ｃｌ₂中 、５００ＭＨｚ、２５℃で記録した化合物１の核磁気共鳴スペクトルである。化 学シフトは、δ５．３２の溶媒ピークを内部標準として用いて０ｐｐｍのＴＭＳ に対するｐｐｍで示す。診断ピークのみを記す。 図２はＶａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００ ＮＭＲ分光計にて、ＣＤ₂Ｃｌ₂中 、４００ＭＨｚ、２５℃で記録した化合物２の核磁気共鳴スペクトルである。化 学シフトは、δ５．３２の溶媒ピークを内部標準として用いて０ｐｐｍのＴＭＳ に対するｐｐｍで示す。診断ピークのみを記す。 図３はＶａｒｉａｎ ＸＬ３００ ＮＭＲ分光計にて、 ＣＤＣｌ₃中、３００ＭＨｚ、室温で記録した化合物３の核磁気共鳴スペクトル である。化学シフトは、δ７．２４の溶媒ピークを内部標準として用いて０ｐｐ ｍのＴＭＳに対するｐｐｍで示す。診断ピークのみを評価する。発明の詳細な説明 本発明は独特の構造を有する新規化合物に関する。本発明は更に、Ｎｏｄｕｌ ｉｓｐｏｒｉｕｍ種又はその突然変異体の発酵培地における本発明の化合物の新 規製造方法に関する。 本発明の化合物は以下の構造式： で表される。 前記構造式は、ある位置では立体配置を限定せず、別の位置では立体配置を限 定して図示しており、本発明はこのような全ての立体異性体を包含するものとす べきである。 特に、種々の不斉中心の立体異性体はα配置であってもβ配置であってもよい。 α及びβはそれぞれ、このような基が分子の全体面よりも下にあるのか上にある のかを示す。 本発明の化合物は主に、寄生虫、例えばマダニ、シラミ、ノミ、並びに家畜動 物や家禽にかみつく他の昆虫（例えばＴｅｎｏｐｈａｌｉｄｅｓ，Ｉｘｏｄｅｓ ，Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ，Ｌｕｃｉｌｉａ及びＨｅｍｏｔｏｂｉａ）のような節足 動物寄生虫によって生ずる疾病の治療及び／又は予防で駆虫薬として使用される 。該化合物は、ヒトを含む他の動物で発生する寄生虫病の治療にも有効である。 最良の結果のために使用すべき最適量は勿論、治療すべき動物の種、寄生虫感染 又は侵入の型及び深刻度に依存する。一般に、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋ ｇ動物体重の新規化合物を経口投与すると、良好な結果が得られる。このような 全用量は１回で投与するか又は１〜５日のような比較的短期間で分割投与する。 本発明の新規化合物を用いれば、約０．０２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重を１回用 量で投与することによって動物で上記寄生虫の優れた駆除が達成される。必要と あれば治療を繰り返して再感染を防止する。これは寄生虫の種や使用する農業技 術に依存する。これらの 物質を動物に投与する技術は当業者には公知である。 本発明の化合物はゴキブリＢｌａｔｅｌｌａ種、アリＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ、 イガＴｉｎｅｏｌａ種、ヒメマルカツオブシムシＡｔｔａｇｅｎｕｓ種及びイエ バエＭｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａのような家庭内病害虫に対しても活性であ る。 本発明の化合物は、貯蔵穀物の病害虫（例えばＴｒｉｂｏｌｉｕｍ種、Ｔｅｎ ｅｂｒｉｏ種）や、農業植物の病害虫（例えばハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ 種）、アブラムシＡｃｙｒｔｈｉｏｓｉｐｈｏｎ、移動性直翅類（例えばバッタ ）、及び植物組織上に生存する未成熟期の昆虫）に対しても有用である。この化 合物は、農業では重要となり得る土壌線虫や植物寄生虫（例えばＭｅｌｏｉｄｏ ｇｙｎｅ種）の駆除のための殺線虫剤として有用である。 本発明の化合物は、カプセル剤、濃縮塊もしくは錠剤のような単位剤形で、又 は液体飲薬（通常はベントナイトのような懸濁剤や湿潤剤又は同様の賦形剤を添 加した活性成分の水溶液、水中懸濁液又は水中分散液）として経口投与すること ができる。一般に、飲薬は更に消泡剤を含んでいる。飲薬処方物は一般に約０． ００１〜約１．０重量％の 活性化合物を含んでいる。好ましい飲薬処方物は約０．０１〜約０．１重量％の 活性化合物を含み得る。カプセル剤及び濃縮塊は活性成分をデンプン、タルク、 ステアリン酸マグネシウム又はリン酸二カルシウムのようなキャリヤーベヒクル と混合してなる。 本発明の化合物の乾燥固体単位剤形での投与が所望される場合は通常、所望量 の本発明の化合物を含むカプセル剤、濃縮塊又は錠剤が使用される。これらの剤 形は、活性成分を適切な微粉希釈剤、充填剤、崩壊剤及び／又は結合剤（例えば デンプン、ラクトース、タルク、ステアリン酸マグネシウム、植物性ゴム等）と 均質かつ均一に混合することによって製造される。このような単位処方物は、治 療すべき宿主動物の型、感染の深刻度や型、及び宿主の体重のような要因によっ て駆虫薬の総重量や含量が大幅に変動し得る。 本発明の化合物を動物飼料原料を介して投与すべき場合、化合物は飼料に均質 に分散させるか、ふりかけ剤として使用するか、又は固形飼料の形態で使用して 飼料完成品に添加するか、場合によっては別個に与えることもできる。あるいは 、本発明の駆虫用化合物は例えば管腔内、筋肉内、気管内又は皮下注射で動物に 非経口投与してもよい。この 場合、活性成分は液体キャリヤーベヒクルに溶解又は分散させる。非経口投与の 場合、活性材料を、好ましくは植物油種（例えばピーナツ油、綿実油等）の許容 可能なベヒクルと適切に混合する。ソルケタール（ｓｏｌｋｅｔａｌ）、グリセ ロール、ホルマール及び水性非経口処方物を用いる有機調製物のような他の非経 ロベヒクルも使用される。本発明の化合物は投与用非経口処方物に溶解又は懸濁 させる。このような処方物は一般に約０．５５重量％〜約５重量％の本発明の化 合物を含んでいる。 本明細書に記載する化合物を動物の飼料成分として投与するか又は飲料水に溶 解もしくは懸濁させる場合、活性化合物を不活性キャリヤー又は希釈剤に均質に 分散させた組成物を使用する。不活性キャリヤーとは、駆虫薬とは反応せず、且 つ動物に安全に投与できるものを指す。飼料投与用キャリヤーが動物配給物の成 分であるか又は成分になり得るものであることが好ましい。 適切な組成物には飼料プレミックス又は補助物質が含まれ、この中には本発明 の化合物が比較的多量に存在する。これらは動物に直接与えるか又は直接もしく は中間の希釈又は配合ステップの後に飼料に添加するのに適している。 このような組成物に適した典型的なキャリヤー又は希釈剤には例えば、蒸留酒残 渣の乾燥穀物、粗びきトウモロコシ粉、柑橘類粗びき粉、発酵残留物、カキ貝殻 粉末、コムギふすま、糖蜜可溶性物質、粗びきトウモロコシ穂粉、食用マメ粉砕 飼料、ダイズ粒、圧潰石灰石等が含まれる。粉砕、攪拌、微粉砕又は混転のよう な方法により、本発明の化合物をキャリヤー全体に均質に分散させる。本発明の 化合物を約０．００５重量％〜約２．０重量％含んでいる組成物が飼料プレミッ クスに特に適している。動物に直接与えられる飼料補助物質は、本発明の化合物 を約０．０００２重量％〜約０．３重量％含んでいる。 このような補助物質を、飼料完成品の活性化合物濃度が寄生虫病の治療及び防 除に望ましいものとなるような量だけ動物飼料に加える。本発明の化合物の所望 される濃度は前述した要因や使用する特定化合物によって異なるが、通常は所望 の駆虫結果を達成するために本発明の化合物を約０．００１重量％〜約０．２重 量％の濃度で飼料に与える。 更には、化合物を動物飼料に添加すべき場合、発酵ブロスの乾燥菌糸体滓を使 用することが可能である。菌糸体は活性の大部分を含み、菌糸体の活性レベルは 調べることが できるので、直接動物飼料に添加することができる。 本発明の化合物は、生長中又は貯蔵中の作物に損害を及ぼす農業病害虫を駆除 するのにも有用である。この化合物はこのような農業病害虫を防除するために、 散布液、粉剤、エマルジョン等のような公知の技術を用いて生長中又は貯蔵中の 作物に適用される。 本発明の化合物の駆虫活性は、個々の化合物の試料、該化合物の混合物、濃厚 抽出物等を、３日前に適当な寄生虫に感染させたマウスに飼料を介して経口投与 することにより調べることができる。投薬開始から１１日目、１２日目及び１３ 日目にマウスの排泄物中の卵を調べ、翌日マウスを殺して、小腸の近位部分に存 在する虫の数を調べる。卵及び虫の数が薬物を適用していない感染対照と比較し て大幅に減少するときには、活性化合物であるとする。 本発明の新規化合物は、真菌属Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍの株を発酵させる ことにより製造される。このような一培養物は、本出願人の培養物コレクション ではＭＦ−５９５４と称する。ＭＦ−５９５４生成株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ，ＭＤ．２０８５２）の永久コレクションに寄託されており、受託番 号は７４２４５であった。この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に 関するブダペスト条約に基づき１９９３年９月２１日に行われた。 Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種 ＭＦ−５９５４の形態及び培養上の特徴は以 下の通りである： （Ｌ−９５４，９６７を産生する）ＭＦ−５９５４は、Ｂｉｌｌｓ及びＰｏｌ ｉｓｈｏｏｋの表面滅菌法（１９９１）によって、ＪＰ３３７（木本組織由来の 内長性真菌）として単離された。以下の説明では、頭文字が大文字の色の名前は Ｒｉｄｇｗａｙ（１９１２）による。 粗びきトウモロコシ寒天（Ｄｉｆｃｏ）では、コロニーは２５℃、相対湿度５ ０％、１２時間の蛍光灯明暗周期で６日後に直径４２ｍｍに達する。コロニーマ ット増殖は見られない。表面は付着してフェルト状、全体に無色；浸出物及び可 溶性顔料はなし；裏側無色；甘く芳しい匂いがする。 粗びきカラスムギ寒天（Ｄｉｆｃｏ）では、コロニーは同一条件下で６日後に 直径４２ｍｍに達する。コロニーマットは付着してまばらに綿状で、コロニー中 心は黄色−褐 色（マルス黄色、ローシェンナ色）、中間から縁は淡黄色−褐色（淡橙色黄色、 アンチモン黄色）、縁は全体に白色；浸出物、匂い及び可溶性顔料はなし；裏側 は淡褐色。 ジャガイモ−スクロース寒天（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等、１９９２）では、コロ ニーは同一条件下で６日後に直径４３ｍｍに達する。コロニーマットは付着して まばらに綿状で、赤味がかった褐色（淡い赤褐色、赤ワイン色）で、コロニー中 心は色あせて、縁で透明になる、縁は不明瞭；浸出物、匂い及び可溶性顔料はな し；裏側は赤褐色（濃い赤ワイン色）。 ３７℃で、粗びきトウモロコシ寒天上、暗所では、コロニーは６日後に直径８ ２ｍｍに達する；コロニーマットは、マットが付着している接種点（白色）を除 いて全体に綿状である、縁全体は白色；浸出物及び可溶性顔料はなし；裏側は無 色；甘く芳しい匂いがする。 菌糸は透明から淡褐色、隔膜あり、壁は平滑から僅かにざらつき、厚い壁、幅 ２．５〜３．５μｍ。単線虫（ｍｏｎｏｎｅｍａｔｏｕｓ）分生子柄、直立、１ ５０−４００×３．０−４．０μｍ、房毛で分岐、透明から淡褐色、隔膜あり、 厚い壁、平滑から細かなざらつきからいぼ状、時 折オリーブに似た丸い突起部（直径２．５μｍ）あり。分生子発生細胞は全割性 、末端１６−２４×１．５−２．０μｍ、末端は細かなざらつきからいぼ状、円 筒形、不規則。分生子は倒卵形から長円−楕円形、先端を切り取った付着点、４ ．１−５．７×１．６−２．５μｍ、透明、隔膜なし、薄い壁、分生子発生細胞 の先端から仮軸で生成、ｄｅｎｔｉｃａｌｓに先端クラスターとして蓄積。 ＭＦ−５９５４を真菌属Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔ ｅｓ，Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）内に置く。この属の重要な生物分類特 徴には、通常分岐している単線虫分生子柄及び分生子のシンポジュラス（ｓｙｍ ｐｏｄｕｌｏｕｓ）生成が含まれる。更には、分生子が多量に生成されるために 、分生子を保有する区域は末端又は節間及び小節である（Ｊｏｎｇ及びＲｏｇｅ ｒｓ、１９７２）。これらの特徴によって、Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ属は、 Ｇｅｎｉｃｕｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｘｙｌｏｃｌａｄｉｕｍ及びＵｓｔｉｌｉｎ ａのような他の同様の真菌と区別される。これらの属は多数のクロサイワイタケ 科（ｘｙｌａｒｉａｃｅｏｕｓ）（子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ））真 菌（例えばＨｙｐｏｘｙｌｏ ｎ、Ｘｙｌａｒｉａ、Ｒｏｓｅｌｌｉｎｉａ等）の無性（アナモルフ）状態であ る。 大半のＮｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ単離物とは異なり、ＭＦ−５９５４は３７ ℃でよく増殖するが、培養物中では既知の種と結び付ける他の特徴的な性質は示 さない。従って、Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種と名付ける。 本発明の化合物は、Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種の生成株を用いて、後述す る条件下で適切な固体又は水性普通培地において好気性発酵中に生成される。多 数の抗生物質の製造に使用されるような水性及び固体培地は、これらの多環式化 合物の製造方法への使用に適している。 このような普通培地は、微生物によって同化され得る炭素及び窒素源、並びに 一般に少量の無機塩を含んでいる。更には、この発酵培地は、微生物の増殖及び 所望化合物の生成に必要な微量金属を含み得る。これらは通常、栄養源として使 用され得る炭素及び窒素の複合源中に十分な濃度で存在するが、勿論所望とあれ ば培地に別個に添加してもよい。 一般に、糖質、例えばグルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、デ キストリン、セレロース、粗びきトウモロコシ粉、オートムギ粉等やデンプンの ような炭水化物は普通培地で適切な同化性炭素源である。培地で使用される炭素 源の正確な量は培地中の他の成分にも多少依存するが、通常は培地中に１〜１５ ０ｇ／ｌの炭水化物量で十分であることが知見されている。これらの炭素源は個 々に使用することができるし、このような幾つかの炭素源を同一培地で組み合わ せてもよい。 本発明の化合物の生成では、種々の窒素源（例えば酵母水解物、酵母自己融解 物、酵母細胞、トマトペースト、粗びきトウモロコシ粉、オートムギ粉、粗びき ダイズ粉、カゼイン水解物、酵母抽出物、トウモロコシ浸漬液、蒸留酒残渣の可 溶性物質、粉状綿実しめかす、食肉抽出物等）がＮｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種 によって容易に同化され得る。種々の窒素源は培地中１〜５ｇ／ｌの量で単独又 は組み合わせて使用することができる。 培地中に取り込むことができる養分無機塩としては、ナトリウム、カリウム、 マグネシウム、アンモニウム、カルシウム、ホスフェート、スルフェート、クロ ライド、カー ボネート及び同等のイオンを得ることのできる慣用的な塩が含まれる。鉄、亜鉛 、マンガン、銅、ホウ素、モリブデン等のような微量金属も含まれる。 以下及び実施例に記載する培地は、使用され得る多様な培地を単に例示するも のであって、限定するものではない。 以下は、Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種 ＭＦ−５９５４株，ＡＴＣＣ７４２ ４５の増殖に適した培地例である。 寒天斜面培地の組成 酵母抽出物 ４ｇ 麦芽抽出物 １０ｇ グルコース ４ｇ バクト寒天 ２０ｇ 蒸留水 １０００ｍｌ ｐＨ７．０ シード培地及び生成培地の組成 シード培地 成分 ｇ／Ｌ 酵母抽出物 ４．０ 麦芽抽出物 ８．０ グルコース ４．０ ジュンロン １．５ 蒸留水を用いて培地を調製し、ｐＨを７．０に調整した後に滅菌し、じゃま板 のない２５０ｍｌ三角フラスコに５０ｍｌずつ小分けした。綿栓を使用した。１ ２１℃で２０分間滅菌した。 生成培地Ａ １．固体部分： ４Ｌのローラーボトルに１２５０ｃｃのバーミキュライトを添加する。ラテッ クスで栓をする。６０分間オートクレーブ処理、次いで３０分間乾燥。 ２．液体部分： 成分 ｇ／Ｌ グルコース １５０．０ 尿素 ４．０ ＮＺアミン型Ａ ４．０ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．５ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．２５ ＫＣｌ ０．２５ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．９ ＣａＣＯ₃ １６．５ 蒸留水を用いて培地を調製した（ｐＨは調整せず）。これを１Ｌ三角フラスコ に４２５ｍｌずつ小分けした。綿栓を使用し、培地を１２１℃で１５分間減菌し た。 生成培地Ｂ 成分 ｇ／Ｌ グリセロール ７５．０ グルコース １０．０ アルダミンＰＨ ５．０ （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２．０ 粗びきダイズ粉 ５．０ トマトペースト ５．０ クエン酸ナトリウム ２．０ 蒸留水を用いて培地を調製し、ｐＨを７．０に調整した後に滅菌した。培地を じゃま板のない２５０ｍｌ三角フラスコに５０ｍｌずつ小分けした。フラスコを 綿栓し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。 Ｎｕｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種を使用する発酵を約２０℃〜約４０℃の範囲の 温度で実施することができる。最適の結果のためには、これらの発酵を約２２℃ 〜約３６℃の範囲の温度で実施することが最も好都合である。約２２℃〜約２７ ℃の温度が最も好ましい。本発明の化合物を生成するのに適した普通培地のｐＨ は約６．５〜約８．０の範囲であり、好ましい範囲は約６．８〜約７．３である 。 小規模発酵は、既知の滅菌技術を使用して適量の普通培地をフラスコ内に導入 し、フラスコにＮｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種の胞子又は栄養細胞増殖物を接種 し、フラスコを綿で軽く栓をし、９５〜３００ｒｐｍの回転振盪器にて約２５℃ の一定室温で約７〜３５日間発酵させることによ り好都合に実施される。より大規模な作業の場合、攪拌器及び発酵培地通気手段 を備えた適切なタンクで発酵を実施することが好ましい。タンク内に普通培地を 形成し、滅菌後にＮｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種の栄養細胞増殖源を接種する。 約２２〜２７℃の範囲の温度で普通培地を攪拌及び／又は通気しながら、発酵を ７〜２５日間継続する。通気度は発酵器寸法、攪拌速度等のような幾つかの要因 に依存する。一般にはより大規模の発酵物では、約９５〜３００ｒｐｍにて、約 ５０〜５００Ｌ／分（ＬＰＭ）の空気で撹拌する。 本発明の化合物の全発酵ブロスからの分離及び化合物の回収は、溶媒抽出によ り、また種々のクロマトグラフィー技術や溶媒系を用いるクロマトグラフィー分 別を適用して実施する。 本発明の化合物は水への溶解度が低いが、有機溶媒には溶ける。この特性を使 用して、発酵ブロスから化合物を回収することが好都合であり得る。従って、一 つの回収方法では、発酵ブロス全体をほぼ同量の有機溶媒と合わせる。どんな溶 媒も使用できるが、水不混和性溶媒（例えば酢酸エチル、塩化メチレン、クロロ ホルム等）を使用すること が好ましい。最大の回収を達成するには一般に数回の抽出が望ましい。溶媒は、 本発明の化合物及び本発明の化合物の駆虫活性が欠如している他の物質を分離す る。溶媒が水不混和性溶媒の場合、層を分離して有機溶媒を減圧下で濃縮する。 残留物を、好ましくはシリカゲルを含んでいるクロマトグラフィーカラム上に置 く。カラムは所望の生成物及び若干の不純物を保持するが、多くの不純物、特に 非極性不純物は通過させる。カラムを穏やかな極性の有機溶媒（例えば塩化メチ レン又はクロロホルム）で洗浄して、更に不純物を除去する。次いでこれを塩化 メチレン又はクロロホルムと有機溶媒との混合物で洗浄する。有機溶媒としては アセトン、メタノール及びエタノール等が好ましい。溶媒を蒸発させ、クロマト グラフィー媒質としてはシリカゲル、酸化アルミニウム、イオン交換樹脂、デキ ストランゲル等を用い、溶離剤としては種々の溶媒や溶媒の組み合わせを用いて カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフ ィー、高圧液体クロマトグラフィー等により残留物を更に精製する。薄層、高圧 、液体及び分取層クロマトグラフィーを使用して、本発明の化合物の存在を検出 して該化合物を単離することができる。 前述の技術や当業者に公知の他の技術を使用すれば、本発明の化合物を含む精 製組成物が得られる。生物活性又は物理化学的特徴について種々のクロマトグラ フィー画分を分析することによって所望化合物の存在を調べる。化合物の種々の スペクトル特徴、特に核磁気共鳴、質量、紫外及び赤外スペクトルを詳細に分析 して両方の化合物を調べた。 実施例１ １．培養：寒天斜面にＭＦ−５９５４を導入し、これを使用してＦＶＭ（凍結栄 養菌糸体）を調製した。寒天斜面の一部をシード培地Ａ（５０ｍｌ，じゃま板な し２５０ｍｌフラスコ）に無菌移動させた。これを２インチ行程の回転振盪器に て、２２０ｒｐｍ、２５℃、相対湿度８５％で３日間インキュベートしてバイオ マスを得た。バイオマスの一部をグリセロールを含む滅菌バイアルに移し、（Ｆ ＶＭとして）凍結した。これらを−７５℃で１０〜１５％のグリセロール最終濃 度に維持した。１．０ｍｌの解凍した一次ＦＶＭを前述のようにシード培地内に 移して２５℃で２〜３日間、２２０ｒｐｍでインキュベートし、凍結させること により一次ＦＶＭから二次ＦＶＭを調製した。 ２．シード：凍結バイアル（ＦＶＭ）を室温に解凍し、これを使用して５０ｍｌ のシード培地Ａに対して０．５〜１．０ｍｌのＭＦ−５９５４シード培養物を接 種した。これらを回転振盪器（２２０ｒｐｍ）上、２５℃、相対湿度８５％で２ 〜３日間増殖させた。時には第２期のシードを使用した。これを生長させるため には、前述の第１期のシード１ｍｌを５０ｍｌの新しいシード培地Ａに希釈し、 ２５℃、２２０ｒｐｍ、相対湿度８５％で２４〜３０時間インキュべートした。 ３．生成：生成培地Ａの組成は固体基質発酵培地である。シードの一部（１８〜 ２４ｍｌ）を４２５ｍｌの生成培地Ａ内に置いた。このフラスコを強く攪拌させ てバイオマスを分散させた。粒子の大きいバーミキュライトを１２５０ｃｃ含む ４Ｌローラー培養容器内に内容物を注入して小分けした。ローラーボトルの内容 物を振盪／混合して均質に接種してならした。ローラーボトルをＷｈｅａｔｏｎ ローラー装置上で約４ｒｐｍにて、２２〜２５℃、相対湿度５０〜７５％で１９ 〜２８日間水平方向に回転させてインキュベートし、発酵培地中に二次代謝物を 得た。 本発明の化合物の生成について幾つかの液体培地を調べ、 その結果発酵規模をより簡単に大きな容器に拡大することができた。ごく少数の 被試験液体培地で生成が検出された。液体生成培地Ｂを使用した。シード培養物 を前述のように接種し、回転振盪器上、２２０ｒｐｍ、２５℃、相対湿度８５％ で３日間増殖させた。シードの一部（１ｍｌ）を使用して、５０ｍｌ（２％接種 物）を含む各生成フラスコに接種した。回転振盪器（２２０ｒｐｍ）上、２５℃ 、相対湿度５０％で２１〜２８日間フラスコをインキュベートした。 ２つの生成方法は製造する生成物の量が殆ど同様であった。しかしながら、第 ２の方法（液体生成培地Ｂ）は、攪拌容器まで規模を拡大できるため、多量に製 造できるという利点を有する。固体生成法（培地Ａのローラーボトル）では規模 拡大は困難になる。 更に、より大きな容器（２２Ｌタンク）を使用してこの培養物から本発明の化 合物を生成した。 実施例２ 精製及び予備特性分析 培地上で２１日間増殖させた培養物を含んでいる１２個の２Ｌローラーボトル を、１００ｒｐｍの回転機にてそれ ぞれ４時間、６５０ｍｌのメチルエチルケトン（ＭＥＫ）で抽出した。抽出物を 濾過し、合わせ、真空下で蒸発乾固して重量を８ｇにした。この材料を２０ｍｌ の塩化メチレンに溶解し、９５：５の塩化メチレン：メタノールで、８００ｍｌ のシリカゲル（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）カラムに装入した。溶離に使用する以下の溶媒 の各々のカラム容量比：９５：５、９：１、３：１、１：１塩化メチレン：メタ ノール及びメタノール。４０ｍｌずつに画分を収集した。画分５１−５５に活性 の大部分があることを、バイオアッセイ（Ｌｕｃｉｌｉａ）によって測定した。 当該画分を合わせ、真空下で蒸発乾固して、２００ｍｇの重量を得た。この試料 を８．５ｍｌのメタノールに溶解し、メタノール中のＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２ ０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に装入し、６．５ｍｌ／分の流量で１３ｍｌず つの画分を収集した。画分４１−５０に活性があったので、これらをプールし、 乾燥して、９０ｍｇの重量を得た。この材料を０．５ｍｌのメタノールに溶解し 、Ｅｋａ Ｎｏｂｅｌ Ｃ−１８ ＨＰＬＣカラム（９．６ｍｍ×２５０ｍｍ） に室温で２回注入し、２７０ｎｍ、４ｍｌ／分の流量で監視した。使用した溶媒 系は７０：３０のアセトニトリル：水で、 ０．１％ＴＦＡを含み、１回目の単離では画分２６−２７で、２回目の単離では 画分２７−２８に活性材料が単離された。分析ＨＰＬＣ：Ｅｋａ−Ｎｏｂｅｌカ ラム（４．６×２５０ｍｍ Ｃ−１８）、流量１ｍｌ／分、４０℃、及びＴＬＣ により数種の溶媒系で化合物純度を調べた。プールした画分を真空濃縮し、塩化 メチレン中に抽出し、乾燥すると、４．８ｍｇの純粋化合物（化合物１）が得ら れた。 前述のシリカカラムからのその後の画分も生物活性を有していた。画分を合わ せ、真空乾燥させて、１．４ｇの重量を得た。固体をメタノールで数回洗浄した 。この固体は化合物１と同様の紫外スペクトルを示す成分を含んでいた。この分 光特性を使用して、更なる精製ステップを監視し、純粋化合物で最後に生物活性 を調べた。即ち、５００重量ｍｇ含んでいるメタノール溶液をメタノール中、２ ５０ｍｌ Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０カラムで分別した。これらの合わせた 画分には大半の重量が含まれていた。この材料を乾燥し、３ｍｌメタノールに再 度溶解し、８ｍｌ／分の流量の８０−２０のアセトニトリル−水（０．１％ＴＦ Ａ）溶媒系を用いて分取Ｚｏｒｂａｘ Ｃ−１８カラム（２２．５ｍｍ×２５０ ｍｍ）に１ｍｌの材料を室温で注 入し、２７０ｎｍで紫外線検出し、８ｍｌずつの画分を収集した。３つの分別の 各々から得た画分２９を合わせて化合物２を得た。画分２１−２２は化合物３を 含んでいた。両方の溶液を濃縮し、酢酸エチルで抽出し、水洗し、乾燥した。化 合物２の重量は１．８ｍｇで、化合物３の重量は１．０ｍｇであった。両方の化 合物を化合物１と同様にＮＭＲ及びＭＳ解析により特性分析した。 ＪＥＯＬ ＨＸ１１０質量分析計で高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量スペクトルを 記録した。ジチオトレイトール：ジチオエリトリトール（２０／８０）のマトリ ックスを用いてＦＡＢスペクトルを得た。ｕｌｔｒａｍａｒｋ １９６０（Ｆｏ ｍｂｌｉｎ）を基準化合物として用いて高分解能で正確な質量測定を実施した。 重要な高分解能データを以下に示す。 ¹³Ｃ ＮＭＲデータ Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００及び５００ＮＭＲ分光計のそれぞれで、Ｃ Ｄ₂Ｃｌ₂中、１００及び１２５ＭＨｚで２５℃にて¹³Ｃ ＮＭＲスペクトルを記 録した。化学シフトは、５３．８ｐｐｍの溶媒ピークを内部標準として用いて０ ｐｐｍのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するｐｐｍで示す。 化合物１（１２５ＭＨｚ）：１９８．０，１７２．６，１６２．０，１５４．７ ，１５４．６，１４０．８，１４０．０，１３８．４，１３５．９，１３４．０ ，１２５．９，１２５．１，１２２．７，１２２．０，１２１．８，１１７．５ ＊，１１６．７，１１３．１，７６．８，７６．４＊，７５．３，７３．９，７ ２．６，５８．２，５６．１，４８．０，４７．８，４５．２，３９．１，３２ ．３，３２．０，３０．１，２９．９，２７．８，２６．０，２５．７，２４． ７，２３．５，１９．６，１８．１＊，１５． １，１２．６，１１．２ｐｐｍ。 炭素数４３はＨＲ ＦＡＢ−ＭＳによって誘導される分子式Ｃ₄₃Ｈ₅₃ＮＯ₆と 一致する。 化合物２（１００ＭＨｚ）：１９８．１，１７２．０，１６２．０，１５４．８ ，１４７．１，１４０．１，１３８．３，１３５．９，１３４．０，１２６．８ ，１２２．６，１２２．０，１２１．８，１１７．８＊，１１６．７，１１３． ２，１０６．９，７６．６＊，７５．３，７３．９，７３．３，７２．７，５８ ．２，５５．５，４９．６，４８．１，４４．５，４１．３，３９．５，３２． ０，３０．４，３０．１，３０．０，２９．９，２７．８，２６．０，２４．８ ，２３．４，１８．０＊，１７．７，１６．７，１５．３，１２．５ｐｐｍ。 炭素数４３はＨＲ ＦＡＢ−ＭＳによって誘導される分子式Ｃ₄₃Ｈ₅₃ＮＯ₇と 一致する。 ＊を付けた炭素は幅広い共鳴として観察された。 ¹Ｈ ＮＭＲデータ ３００、４００又は５００ＭＨｚ分光計で¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを記録した 。化学シフトは溶媒ピークを内部標準として用いて０ｐｐｍのＴＭＳに対するｐ ｐｍで示す。 化合物１（図１参照）（５００ＭＨｚ）：δ０．９６（３Ｈ，ｓ），１．０７（ ３Ｈ，ｓ），１．１２（３Ｈ，ｓ），１．１４（３Ｈ，ｓ），１．３１（３Ｈ， ｓ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．４２（３Ｈ，ｓ），〜１．４６（３Ｈ，ｂｒ ．ｓ），１．９６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ），２．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１ ，１４Ｈｚ），２．７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１４Ｈｚ），２．８１（１ Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３，６．０Ｈｚ），２．８５（１Ｈ，ｍ），３．４３（１Ｈ，ｍ ），４．９６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．０９（１Ｈ，ｓ），５．２０（１Ｈ，ｂ ｒ．ｓ），５．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），５．９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝ １５Ｈｚ），６．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝ １１，１５Ｈｚ），７．３３（１Ｈ，ｂｒ．ｄ，Ｊ〜１１Ｈｚ），７．７１（１ Ｈ，ｓ）。 化合物２（図２参照）（４００ＭＨｚ）：δ０．９５（３Ｈ，ｓ），１．０７（ ３Ｈ，ｓ），１．１２２（３Ｈ，ｓ），１．１２６（３Ｈ，ｓ），１．３１（３ Ｈ，ｓ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．４２（６Ｈ，ｓ），１．７３（１Ｈ，ｄ ｄ，Ｊ＝９．５，１２．５Ｈｚ），１．８６（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），２ ．３４（１Ｈ，ｂｒ．ｄｄ，Ｊ＝７． ５，１２．５Ｈｚ），２．３６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１，１４Ｈｚ），２．７８ （１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１４Ｈｚ），２．８１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３，６． ５Ｈｚ），２．９３（１Ｈ，ｍ），４．８８（Ｈ，ｂｒ．ｑ．Ｊ〜８Ｈｚ），５ ．００（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．１０（１Ｈ，ｓ），５．２０（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ 〜１Ｈｚ），５．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），６．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ ＝３Ｈｚ），６．９３（１Ｈ，ｄｑ，Ｊ＝８，１．５Ｈｚ），７．７２（１Ｈ， ｓ）。 化合物３（図３参照）（３００ＭＨｚ）：δ０．９１（３Ｈ，ｓ），１．０５（ ３Ｈ，ｓ），１．０９（３Ｈ，ｓ），１．１１（３Ｈ，ｄ，Ｊ〜７．５Ｈｚ）， １．１３（３Ｈ，ｓ），１．３３（３Ｈ，ｓ），１．３４（３Ｈ，ｓ），１．４ ７（３Ｈ，ｓ），２．３０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．５，１３．５Ｈｚ），２． ７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．５，１３．５Ｈｚ），２．８７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝ ３，６．０Ｈｚ），４．００（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５，１０．５Ｈｚ），４． ５８（１Ｈ，ｍ），５．０２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．０７（１Ｈ，ｓ），５． １７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ），５．２３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），６．０２（ １Ｈ，ｄ， Ｊ＝３Ｈｚ），７．６７（１Ｈ，ｓ）。 略字：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｑ＝クアルテット、ｂｒ＝幅広い 、ｍ＝マルチプレット、Ｊ＝¹Ｈ−¹Ｈカップリング定数（Ｈｚ）（±０．５Ｈｚ ）〜＝約）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ， ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，Ｅ Ｅ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｓ，ＵＺ (72)発明者 エンドリス，リチヤード・ジー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08836、マーテインズビル、チムニー・ロ ツク・ロード・792 (72)発明者 ヘルムズ，グレゴリー・エル アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07023、フアンウツド、シヤデイー・レイ ン・68 (72)発明者 ヘンセンズ，オツトー・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07701、レツド・バンク、リバー・プラザ、 アレグザンダー・ドライブ・65 (72)発明者 オンデイーカ，ジヨン・ジー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07023、フアンウツド、ニコルズ・コー ト・12 (72)発明者 オストリンド，ダン・エイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07060、ウオツチヤング、バリー・ロー ド・585 (72)発明者 ポリシユーク，ジヨン・デイー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07076、スコツチ・プレインズ、サンセツ ト・プレイス・1933 (72)発明者 ジンク，デボラ・エル アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07726、マナラパン、ブレニム・ロード・ 37

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式： で表される化合物。 ２．炭素源、窒素源及び微量元素源の培地中でＮｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種Ｍ Ｆ−５９５４の生成株を発酵させ、化合物を単離することからなる請求項１に記 載の化合物の 製造方法。 ３．株がＮｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種ＭＦ−５９５４，ＡＴＣＣ ７４２４５ である請求項２に記載の方法。 ４．寄生虫に感染した動物を有効量の請求項１に記載の化合物で治療することか らなる非ヒト動物の寄生虫感染の治療方法。 ５．不活性キャリヤー及び請求項１に記載の化合物を含んでなる動物の寄生虫感 染の治療に有用な組成物。 ６．植物又は植物の生長する土壌に有効量の請求項１に記載の化合物を適用する ことからなる植物又は植物作物の寄生虫感染の治療方法。 ７．不活性キャリヤー及び請求項１に記載の化合物を含んでなる植物の寄生虫感 染の治療に有用な組成物。 ８．請求項１に記載の化合物を製造できる生物学的に純粋なＮｏｄｕｌｉｓｐｏ ｒｉｕｍ種ＭＦ−５９５４培養物。 ９．Ｎｏｄｕｌｉｓｐｏｒｉｕｍ種ＭＦ−５９５４，ＡＴＣＣ ７４２４５であ る請求項８に記載の生物学的に純粋な培養物。