"Nouvel agent antitumeur obtenu par réduction microbienne stéréosélective de la 4-déméthoxydaunorubicine" Nouvel agent antitumeur obtenu par réduction micro-
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La présente invention concerne un procédé selon lequel des micro-organismes appartenant aux genres Streptomyces, Corynebacterium et Mycobacterium sont utilisés pour une réduction stéréosélective du groupe fonctionnel 13-cétone de la 4�déméthoxydauno�
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4-déméthoxy-13-dihydrodaunorubicines stéréoisomères en C-13 possibles. Le nouveau composé (il) désigné ci-après par l'expression "FCE 22723", est utile comme agent antitumeur et il exerce, sur des tumeurs expérimentales, une activité comparable à celle de la 4déméthoxydaunorubicine (I). Le substrat pour la réduction microbienne stéréos élective est un analogue synthétique de la daunorubicine qui a été décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n[deg.] 4.046.878 de la Demanderesse (6 septembre 1977),
Une réduction non-stéréos élective du groupe
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(I) en vue d'obtenir un mélange des deux alcools stéréoisomères en C-13 est décrite dans la demande de brevet britannique n[deg.] 82/11692 de la Demanderesse
(déposée le 22 avril 1982).
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de biosynthèse selon lequel Corynebacterium mediolanum, souche ATCC 14004., Myco� bacterium fortuitum, souche NRRL B-8119 et un nouveau mutant de l'espèce Streptomyces peucetius, souche
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organismen" où elle est enregistrée sous le numéro matricule DSM 2444, sont caractérisés par leur aptitude à réduire de manière stéréosélective le groupe fonctionnel 13-cétone de la 4-déméthoxydaunorubicine
(I) et à accumuler le nouveau composé FCE 22723 (II) dans des bouillons de fermentation.
La présente invention concerne des procédés ayant pour but de récupérer le composé FCE 22723 (II) de bouillons de fermentation, de le concentrer en solution brute et de le purifier.
Le cadre de la présente invention englobe la nouvelle anthracycline antitumeur FCE 22723 (il) obtenue à l'état pur et sous forme de son chlorhydrate par les procédés de biosynthèse.
L'invention fournit également une composition pharmaceutique comprenant le composé II ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables en mélange avec un support ou un diluant pharmaceutiquement ac-
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Un exemple spécifique est un nouveau microorganisme mutant Streptomyces peucetius. souche
M 87 F.I.
Des mutants qui sont caractérisés par leur aptitude à réduire de manière stéréosélective la fonction 13-cétone d'un composé 1 et à accumuler le nouveau composé FCE 22723 (il) dans la bière de fermentation, peuvent être obtenus par mutation de genres différents de bactéries, notamment Streptomyces
Streptomyces peucetius subsp. aureus ATCC
31428 a subi une mutation comme décrit dans la présente spécification pour donner un nouveau microorganisme de laboratoire.
La mutation de S. peucetius subs. aureus. ATCC 31428 en utilisant de la nitrosoguanidine a donné lieu à la formation d'un nouveau mutant qui transforme
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organisme mutant M 87 Polo de S. peucetius subs. aureus a reçu le numéro matricule DSM 2444 à la "Deutsche
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d'Allemagne, où il a été déposé dans la collection permanente,
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être distinguée de celle du micro-organisme apparenté S. peucetius ATCC 31428., tandis que l'on peut établir clairement une distinction dans les caractères appar-
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paille à jaune citron qui caractérise son microorganisme apparenté S. peucetius ATCC 31428.
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tandis que le micro-organisme apparenté S. peucetius ATCC 31428 n'est pas sélectif à cet égard. Cette pro- <EMI ID=12.1>
cours de la période d'incubation.
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son chlorhydrate après solubilisation dans de l'eau distillée stérile. L'intervalle préféré (mais non limitatif) de la concentration du composé 1 dans la culture se situe entre environ 100 et 400 mierogrammes/ litre. On développe la culture dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, par exemple, un carbohydrate assimilable, ainsi qu'une source d'azote, par exemple, une matière protéique ou un composé azoté assimilable. Parmi les sources préférées de carbone, il y a le glucose, le sucrose, le glycérol, l'amidon, l'amidon de mais, la dextrine, les mélasses et analogues. Parmi les sources préférées d'azotée il y a la liqueur de macération du mats, l'extrait de levure,
la levure sèche de brasserie, la farine de soya, la farine de coton, la farine de mars, la caséine, la farine de poisson, les produits solides de distillerie, la peptone animale, l'extrait de viande, les sels d'ammonium et analogues. On peut avantageusement utiliser des combinaisons de ces sources de carbone
et d'azote. Des métaux à l'état de traces, par exemple, le zinc, le magnésium, le manganèse, le cobalt,
le fer et analogues ne doivent pas nécessairement être ajoutés aux milieux de fermentation, car l'eau du robinet et des ingrédients non purifiés sont utilisés comme composants du milieu avant la stérilisation de
ce dernier, La durée du procédé de transformation peut se situer entre environ 72 heures et 8 jours. La température d'incubation au cours du procédé de trans-
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contenus des récipients de transformation sont aérés par agitation à environ 250 tours/minute ou par agitation avec de l'air stérilisé afin de faciliter la
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ficacité du procédé de transformation.
On contrôle le déroulement de la réaction de transformation microbienne en prélevant des échantillons des fermentations à différents intervalles et en procédant à une extraction à un pH de 8,2 avec un mélange 9:1 de dichloromé�hane et de méthanol. Lorsqu'on soumet un échantillon de l'extrait organique à une chromatographie sur couche mince en utilisant, comme éluant, un mélange 80:20:7:3 (en volume) de chloroforme, de méthanol, d'acide acétique et d'eau, on constate que le composé FCE 22723 (II) apparaît à
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l'apparition de la 4-déméthoxydaunorubicine (I) à une valeur Rf de 0,35. On peut effectuer une estimation quantitative des deux anthracyclines après la chromatographie sur couche mince en utilisant les systèmes d'élution mentionnés ci-dessus en raclant et en éluant, avec du méthanol, les zones correspondantes de couleur rouge pour procéder finalement à une détermination spectrophotométrique à 482 nm.
Les bouillons de fermentation entiers dans lesquels le composé I a été transformé en un composé
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fusoires. On extrait le gâteau mycélien de couleur orange avec un solvant organique miscible à l'eau tel que le méthanol et d'autres alcools inférieurs, le
<EMI ID=18.1> dioxanne, l'acétonitrile et l'acétone ; de préférence, on utilise le méthanol. On recueille les extraits mycéliens, on les concentre sous pression réduite et on les combine avec les liqueurs de fermentation filtrées, on les règle à un pH de 8,2, puis on les extrait avec un solvant organique non miscible à l'eau
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thane ou, de préférence, un mélange 9:1 de dichlorométhane et de méthanol. Les extraits organiques contiennent le composé FCE 22723 (il) conjointement avec
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tion mineurs.
On concentre l'extrait organique sous pression réduite jusqu'à siccité et l'on soumet le résidu dissous dans du dichlorométhane à une chromatographie dans une colonne de gel de silice tamponnée à un pH de 7 avec un gradient d'un mélange de dichlorométhane, de méthanol et d'eau. On élue tout d'abord le composé
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FCE 22723 (II) avec un mélange 30:5,5:0,6. A partir des fractions mises en commun, après lavage avec de l'eau, concentration à un faible volume en présence de n-propanol et après addition d'un équivalent d'acide chlorhydrique et d'un excès d'éther diéthylique, on obtient un précipité du composé pur FCE 22723 (II) sous forme de son chlorhydrate,
Sous forme d'une base libre, le composé
FCE 22723 (II) est soluble dans les solvants organiques polaires et les alcools aqueux, tandis que son chlorhydrate est soluble dans l'eau et les alcools inférieurs, mais insoluble dans les solvants organiques. Le chlorhydrate du composé FCE 22723 possède les propriétés physicochimiques suivantes :
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Spectre d'absorption des rayons infrarouges (KBr) :
pics aux fréquences suivantes :
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Spectre de résonance magnétique nucléaire <1><3>C :
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Formule moléculaire :
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m/e en équivalent DF vis-à-vis de la base libre : 499 (M+) .
Un procédé de chromatographie liquide sélective sous haute pression permet de séparer les deux alcools stéréoisomères en C-13 présents dans un échantillon de 4-déméthoxy-13-dihydrodaunorubicine synthétique préparée comme décrit dans la demande de brevet britannique n[deg.] 82/11692 de la Demanderesse (déposée le
22 avril 1982), laquelle présente deux pics avec des
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En adoptant le même procédé de chromatographie liquide sélective sous haute pression, le composé FCE 22723 (II) apparaît sous forme d'un seul pic avec un temps de rétention de 34 minutes correspondant à celui du constituant plus lent de la 4-déméthoxy-13dihydrodaunorubicine synthétique.
<EMI ID=30.1> Procédé de chromatographie liquide sélective sous haute pression
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me).
Phase mobile B : CH3CN
Elution : isocratique pendant 40 minutes (80% A
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60% B.
Débit : 0,6 ml/minute.
Détection : 254 nm.
Activité biologique
L'activité antiprolifère du composé FCE 22723
(II) a fait l'objet d'essais "in vitro" sur une formation de colonie de cellules de HeLa. Comme indiqué dans le tableau 1., le composé II a été trois fois plus
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la 4-déméthoxydaunorubicine (I). En ce qui concerne l'activité antitumeur "in vivo", le composé FCE 22723
(II) a fait l'objet d'essais contre la leucémie ascitique P388. Des souris CDF-1 ont fait l'objet d'une transplantation intrapéritonéale au moyen de 106 cellules/souris ; le traitement avec les composés étudiés a été effectué 24 heures plus tard.
Le tableau 2 donne les résultats de deux expériences. A la dose optimale adoptée au cours des essais, le composé FCE 22723 (il) a été plus puissant
(environ 10 fois) que la daunorubicine et aussi puis-
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à leurs doses optimales.
1 Tableau 1 : Aptitude des cellules de HeLa cultivées à
former des colonies après traitement avec le composé FCE 22723 (il)<1>.
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Les cellules de HeLa ont été exposées aux médicaments pendant 24 heures .
Tableau 2 : Activité antitumeur du composé FCE 22723
(II) contre la leucémie ascitique P388
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<1> Traitement par voi e intrapéritonéale au jour 1 Temps de survie moyen exprimé par le pourcentage de
témoins non traités ; données de deux expériences.
Les exemples non limitatifs ci-après sont donnés pour décrire plus en détail les procédés et le produit de la présente invention.
Exemple 1
On développe une culture de Streptomyces peucetius , souche M 87 F.I. (DSM 2444) pendant 14 jours à 28[deg.]C sur des cultures inclinées d'agar-agar comportant le milieu d'entretien suivant (milieu SA) :
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on effectue la stérilisation par chauffage à 115[deg.]C dans un autoclave pendant 20 minutes.
On recueille les spores de la culture ainsi développée et on les met en suspension dans 3 ml d'eau distillée stérile ; on inocule cette suspension dans
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milieu de croissance liquide suivant : 0,3% de levure sèche de brasserie ; 0,5% de peptone 0,05% de
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100 ml. On effectue la stérilisation par chauffage à
120[deg.]C dans un autoclave pendant 20 minutes. Après stérilisation, le pH de ce milieu se situe entre 6,8 et 7. On agite les ballons inoculés pendant deux jours
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fonctionnant à 250 tours/minute et décrivant un cercle d'un diamètre de 7 cm. On inocule 1,5 ml de la culture développée décrite ci-dessus dans des ballons Erlenmeyer de 300 ml contenant 50 ml du milieu de transfor-
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tion par chauffage à 115[deg.]C dans un autoclave pendant
20 minutes. On stérilise séparément la solution de glucose et on l'ajoute à la concentration appropriée dans chaque ballon stérilisé.
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24 heures dans les conditions décrites pour la phase d'ensemencement. A ce moment, dans chaque ballon, on
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l'eau distillée stérile à une concentration de 10 mg/ ml. On incube les ballons agités pendant 2 jours supplémentaires pour obtenir une transformation de 85%
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Exemple 2
On développe une culture de S. peucetius�
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à l'exemple 1. On met en commun les spores de trois cultures inclinées et on les recueille dans 10 ml d'eau distillée stérile ; on inocule la suspension ainsi obtenue dans un ballon de 2 litres à fond rond muni de chicanes et contenant 500 ml du milieu d'ensemencement décrit à l'exemple 1. On incube le ballon pendant 48 heures sur un agitateur rotatif fonctionnant à 120 tours/minute et décrivant un cercle d'un
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litres du milieu de biotransformation décrit à l'exemple 1 et on stérilise à la vapeur à 120"C pendant 30 minutes, la solution de glucose étant stérilisée séparément et ajoutée à la concentration voulue dans la cuve de fermentation stérilisée. On laisse se déve-
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litre du milieu/minute. Après 48 heures., on ajoute le composé constituant le substrat à la concentration indiquée à l'exemple 1 et l'on incube la culture pendant 3 jours supplémentaires pour obtenir une trans-
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2% d'agar-agar ;eau distillée : pour compléter à 100 ml. On effectue la stérilisation à 110[deg.]C dans un autoclave pendant 20 minutes. On inocule la suspension de cellules ainsi obtenue dans le milieu de biotrans-
<EMI ID=50.1> formation décrit à l'exemple 1 et on la laisse se
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Erlenmeyer de 300 ml contenant 50 ml du milieu, en agitant à 220 tours/minute.
A ce moment, on ajoute le composé I formant le substrat à la concentration indiquée à l'exemple 1 et l'on incube la culture dans les mêmes con ditions pendant 3 jours supplémentaires pour obtenir une transformation de 60% du composé I en un composé II.
Exemple 4
On développe une culture de Corynebacterium mediolanum, ATCC 14004 pendant 5 jours à 30[deg.] C sur le
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lée : pour compléter à 100 ml. On effectue la stérilisation en autoclave à 110[deg.]C pendant 20 minutes. On inocule la suspension de cellules ainsi obtenue dans le milieu de biotransformation décrit à l'exemple 1 et on la laisse se développer pendant 3 jours à 30[deg.]C dans des ballons Erlenmeyer de 300 ml contenant 50 ml du milieu, en agitant à 220 tours/minute. A ce moment�
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concentration indiquée à l'exemple 1 et l'on incube la culture dans les mêmes conditions pendant 3 jours supplémentaires pour obtenir une transformation de
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Exemple 5
On filtre la bière complète (5 litres) provenant d'une fermentation suivant l'exemple 2 en utilisant 2% de terre d'infusoires comme adjuvant de filtration. On extrait le gâteau de filtre humide avec 3 litres de méthanol. Après filtration, on effectue deux extractions supplémentaires avec du méthanol pour assurer une récupération complète des pigments de couleur rouge-orange. On concentre les
i extraits méthanoliques combinés sous pression réduite et on combine 1 litre du concentrat avec le bouillon filtré, puis on l'extrait complètement à un pH de 8,2 avec un mélange 9:1 de dichlorométhane et de méthanol.
On concentre l'extrait organique (contenant les compo-
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à une chromatographie dans une colonne de gel de silice tamponnée à un pH de 7 avec un gradient d'un mélange de dichlorométhane, de méthanol et d'eau. On élue tout
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on élue le composé FCE 22723 (II) avec un mélange
30:5,5:0,6.
A partir des fractions mises en commun, après lavage avec de l'eau, concentration à un faible volume en présence de n-propanol, addition d'un équivalent d'acide chlorhydrique et d'un excès d'éther diéthylique, on obtient le composé pur FCE 22723 (il, 0,72 g,
60%) sous forme de son chlorhydrate (point de fusion :
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on récupère également le composé I non transformé
(Os48 g, 40%) sous forme de son chlorhydrate.
Exemple 6
On extrait la bière complète (500 ml) provenant d'une fermentation suivant l'exemple 3 et on soumet l'extrait obtenu à une chromatographie en colonne en adoptant le procédé décrit à l'exemple 5 on ob-
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re complète (500 ml) provenant d'une fermentation suivant l'exemple 4 et l'on obtient le composé pur
<EMI ID=59.1> sous forme de leurs chlorhydrates.
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REVENDICATIONS
1. Procédé de réduction microbienne stéréosélective du groupe fonctionnel 13-cétone de la 4déméthoxydaunorubicine pour obtenir spécifiquement une des deux 4-déméthoxy-13-dihydrodaunorubicines stéréoisomères possibles, ce procédé consistant à cultiver
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subs. aureus (souche M 87 F.I.)� Mycobacterium fortuitum ou Corynebacterium mediolanum en présence de
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conditions aérobies et dans un milieu de culture aqueux contenant une source assimilable de carbone et une source assimilable d'azote, puis récupérer� du
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rubicine formée.