BE905582A - Procede de production et de purification d'antigenes proteiques de mycobacterium bovis-bcg, produits obtenues et leurs applications. - Google Patents
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Abstract
Procédé de production et de purification d'antigènes protéiques de Mycobacterium Bovi-BCG dans un milieu Sauton carencé en zinc caractérisé par l'additon, lors de la préparation de ce milieu, d'une quantité de zinc égale à environ 10% de la quantité usuellement additionnée (soit environ 0,1425 mg de ZnSO4 7H2O) par litre de milieu, récolte du filtrat et purification des antigènes protéiques.
Description
PROCEDE DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION D'ANTIGENES PROTEIQUES DE MYCOBACTERIUM BOVIS-BCG, PRODUITS OBTENUS ET LEURS APPLICATIONS. PROCÉDÉ DE PRODUCTION ET DE PURIFICATION D'ANTIGENES PROTÉIQUES DE MYCOBACTERIUM BOVIS-BCG, PRODUITS OBTENUS ET LEURS APPLICATIONS. Objet de l'invention La présente invention concerne un procédé de production et de purification d'antigènes protéiques de Mycobacterium Bovis-BCG. Elle s'étend à différents antigènes de Mycobaçterium Bovis-BCG pouvant être obtenus par ce procédé ainsi qu'aux applications, en particulier dans des tests de diagnostic de la tuberculose. Brève description de l'état de la technique Les techniques de culture carencée en zinc du BCG ont été décrites dans le "Journal of General Microbiology (1981) 124, 353-357". Alors que le BCG croît sur le milieu Sauton normal en formant un voile qui atteint son développement maximum après 14 jours, si lors de la préparation du milieu Sauton - milieu synthétique simple - l'addition des ions zinc est omise selon la technique décrite, le BCG pousse mal, le voile sombre après 8 à 9 jours et le rendement poids sec de la culture après 14 jours est 4 à 5 fois inférieur à celui d'une culture normale; les bactéries toutefois sont toujours alcoolo-acido résistantes. Ce milieu est 2 à 3 fois plus riche en protéines et en aldéhydes qu'un milieu de culture normal. De plus, il y apparaît une classe de protéines précipitables à pH 4,5, de telles protéines sont à peine détectables dans les conditions de culture normale. Pour obtenir cet effet de carence en zinc sur les cultures de BCG, il est indispensable d'utiliser pour la préparation de milieu Sauton une eau distillée de résistivité égale ou supérieure à 106 ohms.cm; il faut également que la verrerie en pyrex utilisée soit soigneusement rincée avec une eau de même résistivité. 2 Élément caractéristique de l'invention On s'est aperçu qu'il est possible d'améliorer la quantité d'antigènes qui est libérée dans de tels filtrats de culture carencé par l'addition lors de la préparation du milieu, d'une quantité de zinc égale à 10% de la quantité usuellement additionnée au milieu Sauton, soit 0,1425 mg de ZnS04 7H20 par litre de milieu (au lieu de 1,425 mg). Ceci conduit au développement plus important d'un "voile anormal" avec libération accrue de protéines dans le milieu; dans ces conditions la récolte peut prendre place après 21 jours au lieu de 14 jours. Ces filtrats de culture constituent un excellent matériel de départ pour l'isolement d'antigènes de surface et extracytoplasmiques, non seulement du BCG, mais aussi de différentes espèces de mycobactéries (souches humaines, bovines, aviaires et atypiques) et l'effet de carence en zinc peut être étendu à d'autres espèces de bactéries à croissance lente. Techniques de purification d'antigènes spécifiques A partir de tels filtrats de culture carencée, il est possible de préparer des antigènes caractéristiques de l'invention. La purification des antigènes de Mycobacterium Bovis-BCG (Souche 1173 P2) est obtenue par chromatographies successives sur Phenylsepharose, DEAE Sephacel et filtration moléculaire sur Sephadex (les termes SEPHAROSE, SEPHACEL et SEPHADEX sont des marques). Première étape Récolte des filtrats de culture carencée en zinc <EMI ID=1.1> Les milieux de culture sont rassemblés et la plupart des bactéries sont éliminées par décantation. Le milieu est alors filtré sur une unité Millipak <EMI ID=2.1> <EMI ID=3.1> téines, on ajoute du phosphate KH2PO4 / Na2HP04 pour atteindre une concentration 0,02 M, et du chlorure de sodium, pour atteindre une concentration 0,45M; le Tween 80 et EDTA sont ajoutés pour obtenir respectivement une concentration 0,005% P/V et 10-<3> M finales. (Tween est une marque). Le pH est ajusté à pH 7,3 avec de l'acide chiorhydrique 5N. Tous les tampons utilisés dans la purification sont ajustés à pH 7,3 et contiennent du Tween 80 0,005% P/V; ils ont été stérilisés par autoclavage à 120[deg.] pendant 20 minutes. Toutes les opérations qui <EMI ID=4.1> Le milieu est appliqué sur une colonne de phénylsépharose de la société suédoise Pharmacia 5 x 16 cm équilibré par 600 ml de tampon phosphate 0,02 M contenant du chlorure de sodium 0,45 M et de l'EDTA 10-<3> M. Deuxième étape <EMI ID=5.1> se. Le débit est de 800 ml par heure. Le gel est lavé par environ 600 ml du même tampon pour éliminer les protéines non fixées, et puis successivement par 800 ml des tampons phosphates 0,02 M et 0,004 M et finalement avec le même volume d'éthanol 10% V/V. La fraction éluée avec <EMI ID=6.1> de poids moléculaire 64.000 en conditions dénaturantes et la fraction éluée par l'éthanol 10% V/V la protéine <EMI ID=7.1> sont des marques). Troisième étape <EMI ID=8.1> Aux deux fractions .contenant la P32 et la P64 du tampon phosphate est ajouté pour atteindre respectivement les concentrations 0,004 M et 0,02 M et de l'EDTA pour atteindre une concentration 10-4 M finale. Les solutions protéiques sont alors appliquées sur des colonnes de DEAE sephacel (5 x 5 cm) équilibrées <EMI ID=9.1> (P32) et l'autre par 500 ml de tampon phosphate 0.02 M EDTA 10-4 M (P64). La P32 est éluée par 600 ml de tampon phosphate 0,025 M, toutes les fraction du seul pic obtenu sont rassemblées et concentrées dans un appareil Amicon (AMICON est une marque) sous 1 kg/cm <2> de pression d'azote sur une membrane Amicon PM10. La P64 est éluée par 2 1 d'un gradient phosphate s'étalant de 0,02 M à 0,12 M; les fractions du pic obtenu sont analysées en électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS) et les fractions purifiées sont rassemblées et concentrées dans les mêmes conditions que pour la P32. Quatrième étape Filtration moleculaire. Les échantillons ainsi concentrés de P32 et de P64 sont soumis à une filtration moléculaire sur Sephadex G100 (P32) et G200 (P64) (2,5 x 40 cm) - à un débit de 12 ml/par heure. Les deux protéines ainsi purifiées sont homogènes sur la base de 3 critères - une bande en électrophorèse en conditions dénaturantes (dodécylsulfate de sodium - SDS), - un pic en filtration moléculaire, - une ligne de précipitation en contre-immunoélectropho= rèse (CIE). Ces protéines sont des constituants des cellules de BCG ayant cru en conditions normales; elles sont présentées dans les extraits cellulaires solubles. Caractéristiques physico-chimiques et chimiques des protéines isolées A. Poids moléculaire <EMI ID=10.1> B. La composition en acides aminés de ces protéines est reprise dans le tableau ci-dessous <EMI ID=11.1> <EMI ID=12.1> <EMI ID=13.1> dans ces deux protéines, le rapport des acides glutamique et aspartique sur les acides aminés basiques ly- <EMI ID=14.1> A noter aussi l'absence de cystéine et dé tryptophane.dans la P64. <EMI ID=15.1> Le spectre U.V. de la P32 correspond au spectre classique des protéines. Son absorption à 280 mm est <EMI ID=16.1> La P64 présente un spectre anormal, avec une absorbance unusuelle à 340 mm et un rapport d'absorbance A 280/A 260 de 1,05 (ce rapport est de 1,7 pour la P32)- Une solution de P64 à 1 mg/ml dans le même tampon que celui décrit pour la P32 donne une absorbance à 280 mm de 0,39 (voir graphique annexé). Le dosage des protéines est effectué par la méthode au Bleu de Coamassie (Réf. Spector, TH. Analytical Biochemistry 1978, 86, 142 - 146), la sérum albumine bovine est utilisée comme standard. Ces spectres sont repris dans la figure unique annexée. D. Présence du sucre Le contenu en sucre déterminé par le test phénol acide sulfurique est de 1,4% pour la P32 et égal ou inférieur à 0,3% pour la P64.. Propriétés biologiques des protéines A. Ces deux protéines sont des antigènes de Mycobacterium Bovis-BCG. Elles ont été identifiées par <EMI ID=17.1> P32 est l'antigène 85.A., la P64 est l'antigène 82. Des antigènes proches ou identiques aux 2 protéines isolées sont présents chez d'autres souches bovines, et chez des souches humaines telle la bacille de KOCH agent de la tuberculose. B. Ces deux protéines sont immunogènes - en effet, injectées à l'animal soit à l'état pur soit dans des mélanges complexes elles provoquent la formation d'anticorps dirigés contre elles. Plusieurs anticorps monoclonaux dirigés contre la P64 ont été préparés et peuvent être utilisés. L'anticorps monoclonal IV C7 a une affinité élevée pour la P64- Cet anticorps monoclonal a donné une réaction immunohistochimique positive sur des biopsies de poumon de patients tuberculeux (dans environ 10 cas testés). Les coupes pulmonaires de patients non tuberculeux n'ont pas donné de réaction (également environ 10 cas testés). Activité tuberculinique Les deux protéines rélèvent l'hypersensibilité différée chez des cobayes préalablement sensibilisés soit avec du BCG vivant (1 mg poids humide contenant entre 4 et 8.106 cellules par cobaye pesant entre 300 et 500 g), soit avec du BCG tué (2 mg poids humide dans 0,5 ml d'ajuvant incomplet de Freund). La P64 relève 50 à 100 x plus efficacement l'hypersensibilité différée que la ?32' Son activité par mg de protéine est de l'ordre de 40% de celle de 1 mg de PPD lyophilisée. La mesure de l'activité tuberculinique, in vivo, consiste en la mesure du diamètre de l'induration produite 24 heures après l'injection en intradermique du produit à tester par rapport à la PPD lyophilisée (exprimée en poids) utilisée comme référence (PPD = Purified Protein Derivative). Les résultats d'une expérience type sur cobaye sont repris dans le tableau ci-dessous. Activité des protéines purifiées mesurées par rapport à la PPD et exprimées en pour cent. <EMI ID=18.1> Les valeurs entre parenthèses représentent les limites de confiance à p = 0,05. <EMI ID=19.1> La protéine P32 induit la production d'interferon 7 in vitro dans des cultures de cellules de rate prove- <EMI ID=20.1> Les souris sont sensibilisées par injection intraveineuse de BCG ayant cru en voile sur du milieu Sauton. La dose injectée par souris est de 0,2 ml d'une suspension contenant 2,5.106 bactéries vivantes (C.F.U. - colony forming unit). Après une à quatre semaines les souris sont sacrifiées, les cellules de la rate, en suspension dans du milieu R.P.M.I. 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal inactivé, sont distribuées dans des plaques pour microcultures en présence soit des antigènes à tester, soit de la PPD utilisée comme référence. L'unité d'interferon est définie ici comme la réciproque de la dernière dilution du surnageant de culture qui donne 50% de protection de la lyse de la lignée cellulaire L 929 infectée par le virus V.S.V. Les résultats d'une expérience type sont repris dans le tableau ci-dessous. <EMI ID=21.1> ron par ml de surnageant de culture. Ils peuvent être transformés en unités internationales. <EMI ID=22.1> Applications des antigènes purifiés Les antigènes protéiques purifiés, les anticorps polyclonaux dressés contre elles, les anticorps monoclonaux dressés contre la P64, et ultérieurement les anticorps monoclonaux dressés contre la P32 et les peptides issus par hydrolyse des protéines peuvent être utilisés dans différents tests de diagnostic rapide de la tuberculose : ELISA, RIA, Immunoliposomes, Immunohistochimie, pour la détection d'anticorps et d'antigènes dans les échantillons cliniques, sérums, expectorations, lavages, bronchoalvéolaires et biopsies. Les antigènes protéiques et anticorps polyclonaux ou monoclonaux réactifs peuvent être présentés sous formes de trousses (kits) de détection. Des peptides issus par hydrolyse des protéines P64 et P32, et des anticorps monoclonaux dirigés contre ces peptides testés (sur modèle animal) comme spécifiques des souches de mycobactéries bovines et humaines permettraient d'améliorer le diagnostic de la tuberculose et d'exclure les infections par mycobactéries d'origine aviaire ou par des mycobactéries atypiques. Des peptides issus par hydrolyse de la protéine P64 et présentant des activités tuberculiniques pourraient éventuellement servir de standard de référence en lieu et place des PPD bovines et humaines. Un exemple de production d'anticorps est donné ci-dessous. Des souris BALB/c sont immunisées au moyen d'un <EMI ID=23.1> par la chaleur et adsorbées sur phosphate d'aluminium. Elles reçoivent 2 injections intrapéritonéales de ce mélange espacées par un intervalle d'au moins 1 moins. L'immunisation est contrôlée par la recherche des anticorps par ELISA une semaine après la deuxième injection. Sept jours plus tard, les souris reçoivent par voire in- <EMI ID=24.1> elles sont sacrifiées et leur rate est prélevée. Les splénocytes sont alors fusionés avec des cellules de myélome Sp2/0 selon la technique classique décrite par Fazekas de St. Groth et Scheidegger (Production of Monoclonal antibodies : strategy and tactics. J. of immunological methods, 35 (1980) 1-21). Les cellules fusionnées provenant d'une rate sont réparties en 10 microplaques à 96 puits et mises en culture en milieu Iscove-HAT enrichi par 10% de sérum foetal de veau inactive loc. cit. Quatorze jours plus tard, la présence d'anticorps dans les cultures est controlée par ELISA. Après développement suffisant, les colonies positives sont transférées en plaques à 24 puits et clonées en agar mou. Les résultats indiquent qu'une des anticorps monoclonaux anti P64 (IV C7) permet de distinguer entre les souches de mycobactéries bovines et humaines d'une part, et les souches aviaires et atypiques d'autre part. REVENDICATIONS 1. Procédé de production et de purification d'antigènes protéiques de Mycobacterium Bovis-BCG dans un milieu Sauton carencé en zinc caractérisé par l'addition, lors de la préparation de ce milieu, d'une quantité de zinc égale à environ 10% de. la quantité usuellement additionnée (soit environ 0,1425 mg de ZnS04 7H20) par litre de milieu, récolte du filtrat et purification des antigènes protéiques.
Claims (1)
- 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'on utilise la souche 1173 P2 de Mycobacterium tuberculosis var. Bovis-BCG.3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la purification est réalisée par des chromatographies successives sur Phenylsepharose, DEAE Sephacel et filtration moléculaire sur Sephadex.4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que dans une première étape, le milieu de culture est soumis successivement aux opération suivantes : décantation et filtration, addition de KH2P04/Na2HP04 pour atteindre une concentration 0,02 M, et du chlorure de sodium, pour atteindre une concentra- <EMI ID=25.1><EMI ID=26.1>M finales, le pH est ajusté à 7,3, ensuite on stérilise et ajoute du phosphate et applique sur une colonne de Phenylsepharose 5 x 16 cm équilibrée par 600 ml de tampon phosphate 0,02 M contenant du chlorure de sodium 0,45 M<EMI ID=27.1>5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que dans une deuxième étape, on réalise le lavage et l'élution de la colonne de Phenylsepharose en lavant d'abord le gel par le même tampon que dans la première étape et ensuite successivement par 800 ml des tampons phosphates 0,02 M et 0,004 M et finalement avec le même volume d'éthanol 10% V/V.6. Procédé selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'on recueille lors de l'élution avec le tampon<EMI ID=28.1><EMI ID=29.1>10% V/V, une protéine (P32) de poids moléculaire 32.000 Daltons après quoi chaque éluat subit une filtration.7. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que dans une troisième étape à la fraction P32, on ajoute un tampon phosphate jusqu'à une concentration de 0,004 M et à l'EDTA jusqu'à une concentration de 10-4 M, on applique sur des colonnes DEAE Sephacel équilibrée par 500 ml du même tampon phosphate 0,004 M - EDTA 10-4 M et ou due par 600 ml de tampon phosphate 0,025 M, recueille toutes les fractions du seul pic obtenu et concentr e.8. Procédé selon la revendication 6 caractérisé en ce que dans une troisième étape à la fraction P32, on ajoute un tampon phosphate jusqu'à une concentration de 0,02 M et à l'EDTA jusqu'à une concentration de"10-4 M, on applique sur des colonnes DEAE Sephacel équilibrée par 500 ml du même tampon phosphate 0,02 M - EDTA 10-4 M et on élue par 2 litres un gradient phosphate s'étalant de 0,02 M à 0,12 M, les fractions du pic obtenu sont analysées en électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS) et les fractions purifiées sont rassemblées et concentrées.9. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que dans une quatrième étape les échantillons sont soumis à une filtration moléculaire sur Sephadex G100.10. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que dans une quatrième étape les échantillons sont<EMI ID=30.1>11. Antigènes protéiques caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 9.12. Antigènes protéiques caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et 8 et 10. 13. Application des antigènes protéiques selon la revendication 11 ou 12 dans des tests de diagnostic rapide de la tuberculose.14. Application des antigènes protéiques selon la revendication 13 avec des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, sous forme de trousses de détection de la tuberculose.15. Application des peptides issus par hydrolyse des protéines P64 et P32 et des anticorps monoclonaux dirigés contre ces peptides au diagnostic de la tuberculose.16. Application des peptides issus par hydrolyse de la protéine P64 comme standard de référence.17. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les antigènes protéique des revendications 11 ou 12.
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| EP0419355A1 (fr) * | 1989-09-19 | 1991-03-27 | N.V. Innogenetics S.A. | Polypeptides et peptides recombinantes, acides nucléiques lesencodantes, et l'utilisation de celles-ci pour le diagnostique de la tuberculose |
| WO1991004272A1 (fr) * | 1989-09-19 | 1991-04-04 | N.V. Innogenetics S.A. | Polypeptides et peptides recombines, acides nucleiques codant pour ces derniers et emploi de ces polypeptides et peptides dans le diagnostic de la tuberculose |
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-
1986
- 1986-10-09 BE BE0/217279A patent/BE905582A/fr not_active IP Right Cessation
Cited By (7)
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|---|---|---|---|---|
| EP0419355A1 (fr) * | 1989-09-19 | 1991-03-27 | N.V. Innogenetics S.A. | Polypeptides et peptides recombinantes, acides nucléiques lesencodantes, et l'utilisation de celles-ci pour le diagnostique de la tuberculose |
| WO1991004272A1 (fr) * | 1989-09-19 | 1991-04-04 | N.V. Innogenetics S.A. | Polypeptides et peptides recombines, acides nucleiques codant pour ces derniers et emploi de ces polypeptides et peptides dans le diagnostic de la tuberculose |
| AU631460B2 (en) * | 1989-09-19 | 1992-11-26 | N.V. Innogenetics S.A. | Recombinant polypeptides and peptides, nucleic acids coding for the same and use of these polypeptides and peptides in the diagnostic of tuberculosis |
| US5916558A (en) * | 1989-09-19 | 1999-06-29 | N.V. Innogenetics S.A. | Recombinant polypeptides and peptides, nucleic acids coding for the same and use of these polypeptides and peptides in the diagnostic of tuberculosis |
| US6531138B1 (en) | 1989-09-19 | 2003-03-11 | N.V. Innogenetics S.A. | Recombinant polypeptides and peptides, nucleic acids coding for the same and use of these polypetides and peptides in the diagnostic of tuberculosis |
| US7279170B2 (en) | 1989-09-19 | 2007-10-09 | N.V. Innogenetics S.A. | 32-kDa protein derived from Mycobacterium tuberculosis and related peptides |
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