BG106140A - Методи и средства за профилактика и лечение на амилоидогенно заболяване - Google Patents

Методи и средства за профилактика и лечение на амилоидогенно заболяване Download PDF

Info

Publication number
BG106140A
BG106140A BG106140A BG10614001A BG106140A BG 106140 A BG106140 A BG 106140A BG 106140 A BG106140 A BG 106140A BG 10614001 A BG10614001 A BG 10614001A BG 106140 A BG106140 A BG 106140A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
amyloid
antibody
component
protein
fibril
Prior art date
Application number
BG106140A
Other languages
English (en)
Other versions
BG65756B1 (bg
Inventor
Dale Schenk
Original Assignee
Neuralab Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22475417&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG106140(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Neuralab Limited filed Critical Neuralab Limited
Publication of BG106140A publication Critical patent/BG106140A/bg
Publication of BG65756B1 publication Critical patent/BG65756B1/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до фармацевтични препарати и методи за профилактика или лечение на амилоидни заболявания, като болестта на Алцхаймер, фамилниамилоидни невропатии и подобни. Фармацевтичните препарати включват имунологично реактивни количества от амилоидни фибрилни компоненти, по-специално фибрилоформиращи пептиди или белтъци. Изобретениетосе отнася също до лекарствени препарати и методи,използващи имунни реагенти, които реагират с такива фибрилни компоненти.

Description

Изобретението се отнася за фармацевтични препарати и методи за лечение на амилоид-свързани състояния у хора и други гръбначни бозайници.
Предшествуващо състояние на техниката
Амилоидоза е общ термин, който описва известен брой заболявания, характеризиращи се с извънклетъчно отлагане на белтъчни фибрили образуващи “амилоидни отлагания” (амилоидни възли), които могат да се появяват на локализирани места или системно. Фибриларният състав на тези отлагания е идентифицираща характеристика за различните форми на амилоидно заболяване. Например, интрацеребралните и цереброваскуларните отлагания, съставени първично от фибрили на бета амилоиден пептид (β-ΑΡ) са © характерни за болестта на Alzheimer (фамилни и спорадични форми), островният амилоид протеинов пептид (islet amyloid protein peptide IAPP, amylin) е характерен за фибрилите на амилоидните отлагания в клетките на островчетата на панкреаса, свързани с тип II диабет и β2микроглобулин е главният компонент на амилоидни отлагания, които се образуват като последствие от продължително лечение с хемодиализа. Наскоро, прион-свързани заболявания, като болестта на Creutzfeld-Jacob, също са признати като амилоидни заболявания.
Различните форми на заболяване са разделени в два класа, главно на базата на това дали амилоидозата е свързана или не е свързана с подлежащо системно заболяване. Така, някои известни нарушения са разглеждани като първични амилоидози, при които няма данни за предварително съществуващо или придружаващо заболяване. Общо, първични амилоидози на заболяването се характеризират с наличието на “амилоид лека верига-тип” (AL-тип) белтъчни фибрили, наречени така поради хомология на N-крайния участък на AL фибрилите с променливия фрагмент на имуноглобулинова лека верига (kappa или lambda).
Вторична или “реактивна “амилоидоза се характеризира с отлагания от АА тип фибрили, произхождащи от серумен амилоид А протеин (ApoSSA). Тези форми на амилоидоза се характеризират с подлежащо хронично възпалително или инфекциозно болестно състояние (например, ревматоиден артрит, остеомиелит, туберкулоза, проказа).
Наследствени фамилни амилоидози могат да имат свързани невропатични, бъбречни или сърдечно съдови отлагания от ATTR транстиретинов тип. Други наследствени фамилни амилоидози включват други симптоми и могат да имат различни амилоидни компоненти (например, фамилната Средиземноморска треска, която се характеризира с АА фибрили). Други форми на амилоидози включват локални форми, които се характеризират с огнищни, често тумороподобни отлагания, които се появяват в отделни органи. Други амилоидози са свързани с остаряването, и обикновено се характеризират с образуване на плаки в сърцето или мозъка. Също обичайни са амилоидни отлагания свързани с продължителна хемодиализа. Тези и други форми на амилоидно заболяване са обобщени в Таблица 1. (Tan, S.Y. and Pepys, Histopathology 25:403414,1994; Harrison’s Handbook of Internal Medicine, 13th Ed.lsselbacher,
K.J., etal., eds, McGraw-Hill, San Francisco, 1995).
Таблица 1 ____________Класификация на амилоидни заболявания____________ Амилоид Белтъчен Белтъчни Клиника
Белтък/ предшественик варианти
Пептид__________________.________________________________________
АА Серумен амилоид А Реактивна(вторична)
Белтък (ApoSSA) Амилоидоза:
Фамилна Средиземноморска треска Фамилна амилоидна нефропатия с уртикакария и глухота Muckle-Wells syndrome)
АА Серумен амилоид А протеин (ApoSSA) Реактивна системна амилоидоза свързана със системни възпалителни заболявания
AL Моноклонални Имуноглобулинови леки вериги (kappa, lambda) Ak,A (напр. Aklll) Идиопатични( първични) амилоидози:миелома или макрогпобулинемия-свързани .системни
амилоидози свързани с имуноцитна дискразия, моноклонална гамопатия; окултна дискразия, локална нодуларна амилоидоза свързана с хронично възпалително заболяване
АН igG(i(Ti)) ΑγΙ Тежка верига амилоидоза свързана с някои имуноцитни дискразии
ATTR Transthyretin(TTR) най-малко 30 известни точкови мутации Фамилна амилоидна полиневропатия (напр. Met 30, португалска)
ATTR Transthyretin (TTR) напр. Met 111 Фамилна амилоидна Кардиомиопатия (датска)
ATTR Transthyretin (TTR) див тип TTR или Не 22 Системна сенилна амилоидоза
АароА! ApoAl Arg 26 Фамилна амилоидна полиневропатия
Agel Gelsolin Asn 187 Фамилна амилоидоза (финландска)
Acys Cystatin С Gin 68 Наследствена церебрална хеморагия с амилоидоза(ислацдска)
Αβ Амилоид β белтъчен прекурсор (напр. β-ΑΡΡ695) различни: Gin 618, болест на Alzheimer синдром на Down Наследствена церебрална хеморагична амилоидоза (холандска) Спорадична церебрална амилоидна ангиопатия Inclusion bodies myositis
AB2M Beta2 микроглобулин Свързана с хронична хемодиализа
Acai (Про)калцитонин (Про)калцитонин Медуларен карцином на щитовидната жлеза
AANF Атриален натриуретичен фактор Фокални сенилни амилоидози: Изолиран атриален амилоид
Αβ SVEP* ABjM β-амилоид прекурсорен белтък Beta2 микроглобулин Мозък Семенни мехурчета Простата
Кератин Първично локализиран кожен амилоид (макулозен, папулозен)
PrP Прион прекурсорен протеин (33-35kDa клетъчна форма) Scrapie белтък 27-30 kDa Спорадична болест на Creutzfeld-Jacob Kuru (трансмисивна спонгиоформена енцефалопатия, прион заболявания
AIAPP Островен амилоиден полипептид (IAPP) Островчета на Langerhans, Диабет тип II, Инсулинома)
Пептидни напр. прехормони, калцитонин фрагменти Екзокринна амилоидоза, свързана с APUDomas
Често, фибрили образуващи голямата част от амилоидното отлагане, произхождат от един или повече първични прекурсорни белтъци или пептиди, и обикновено са свързани със сулфатирани глюкозамингликани. В допълнение, амилоидните отлагания могат да включват минорни белтъци и пептиди от различни типове, заедно с други компоненти, като протеогликани, ганглиозиди и други захари, както е описано по-подробно в разделите, които следват.
Понастоящем няма специфични, насочени срещу амилоид третирания за никое от амилоидните заболявания. Там където има едно основно или свързано със заболяване състояние, терапията е Ф насочена срещу намаляване произвеждането на амилоидогенен белтък, чрез третиране на основното заболяване. Такъв е примерът при лечението на туберкулоза с антибиотици, при което намаление в натрупването на микобактерии, води до намаление на възпалението и до свързано с това намаление на SSA белтъка. В случая с AL амилоид, дължащ се на мултиплена миелома, на пациенти се прилага химиотерапия, която предизвиква намаление на плазмените клетки и понижение нивата на миеломния имуноглобулин. Тъй като тези нива намаляват, AL амилоида може да се изчисти. Съпритежание на U.S. patent applications USSN 09/201,430, представена на 30 ноември 1998 С и USSN 09/322,289, представена на 28 май 1999, разкриват, че натрупването на амилоидни плаки, свързано с болестта на Alzheimer, може значително да бъде намалено (и предотвратено) чрез въвеждане на агенти, които произвеждат или правят един имунен отговор насочен срещу β-амилоиден пептид (Αβ) и негови фрагменти. Откритието на настоящето изобретение е, че индуцирането на имунен отговор срещу различни компоненти на амилоидната плака, е ефективно за лечение на широк кръг амилоидни заболявания.
б
Техническа същност на изобретението
Настоящето изобретение е насочено към фармацевтични препарати и методи за лечение на известен брой амилоидни заболявания. Съгласно един аспект, изобретението включва фармацевтични препарати, които съдържат като активна съставка агент, който е ефективен да индуцира у пациент имунен отговор срещу амилоиден компонент. Такива препарати общо включват ексципиенти и в предпочитани изпълнения могат да включват адюванти. В следващи предпочитани изпълнения, адювантите включват например, алуминиев хидроксид, алуминиев фосфат, MPL™, QS-21 (Stimulon™) или непълен адювант на Freund. Съгласно сродно изпълнение, такива препарати могат да включват множество от агенти, ефективни да индуцират у пациент имунен отговор срещу повече от един амилоиден компонент.
В сродно изпълнение, агентът е ефективен да произвежда имунен отговор, насочен срещу фибрилен пептиден или белтъчен амилоиден компонент. Предпочитано, такъв фибрилен пептид или белтък произхожда от фибрилен прекурсорен белтък, за който е известно, че е свързан с някои форми на амилоидни заболявания, както са описани тук. Такива прекурсорни белтъци включват, но не се ® ограничават до, Серумен ами лой д А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ApoAl, transthyretin, лизозим, фиброген а верига, gelsolin, цистатин С, Амилоид β белтъчен прекурсор (β-ΑΡΡ), Beta2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоиден пептид, един пептиден хормон и синуклеин. Такива прекурсори включват също мутантни белтъци, белтъчни фрагменти и протеолитични пептиди от такива прекурсори. В едно предпочитано изпълнение, агентът е ефективен да индуцира имунен отговор насочен срещу неоепитоп, образуван от фибрилен белтък или пептид, с оглед на фибрилен прекурсорен белтък. Така както е описано поподробно тук, много фибрили-образуващи пептиди или белтъци са фрагменти на такива прекурсорни белтъци, като изброените по-горе. Когато се образуват такива фрагменти, както при протеолитично разцепване, може да се открие, че няма епитопи в предшественика и следователно не са имунологично на разположение на имунната система, когато фрагментът е част от прекурсорен белтък. Агенти насочени срещу такива епитопи могат да бъдат предпочитани терапевтични агенти, тъй като те по-малко вероятно биха индуцирали автоимунен отговор у пациента.
Съгласно сродно изпълнение, фармацевтичните препарати на изобретението включват агенти насочени срещу амилоидни компоненти, като такива подбрани от група включваща, но без да се ограничава, до следните фибрилни пептиди или белтъци: АА, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, AB2M, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент. Пълните имена и състав на тези пептиди са описани тук. Такива пептиди могат да бъдат получени с методи известни на специалиста в тази област, както тук е описано.
Съгласно следващо сродно изпълнение, агенти включени в такива фармацевтични препарати, съдържат също известни сулфатирани протеогликани. В сродно изпълнение, протеогликанът е хепарин сулфат глюкозаминогликан, предпочитано перлекан (perlecan), дерматан сулфат, хондроитин-4-сулфат или пентозан полисулфат.
Съгласно друг сроден аспект, изобретението включва метод за профилактика и лечение на нарушение, характеризиращо се с амилоидно отлагане у индивид-бозайник. В съответствие с този аспект на изобретението, на индивида е давана дозировка от агент, ефективен да произведе имунен отговор срещу амилоиден компонент, характерен за амилоидното нарушение, от което страда индивида. По същество, методите включват въвеждане на фармацевтични препарати, съдържащи имуногенни амилоидни компоненти, специфични за нарушението, като тези описани по-горе. Такива методи по-нататък са характеризирани за тяхната ефективност да индуцират имуногенни отговори у индивида. Съгласно едно предпочитано изпълнение, методът е ефективен да произвежда имунен отговор, който се характеризира със серумен тигър най-малко 1:1000, по отношение на амилоидния компонент, срещу който е насочен имуногенния агент. В следващо предпочитано изпълнение, серумният тигър е най-малко 1:5000 по отношение на фибрилния ® компонент. Съгласно едно сродно изпълнение, имунният отговор е характеризиран със серумно количество имунореактивност, което е четири пъти по-голямо от нивото на серумната имунореактивност, измерена в контролна серумна проба преди третирането. Последното характеризиране е особено подходящо, когато серумната имунореактивност се определя с ELISA техники, но може да бъде приложено за всяко относително или абсолютно измерване на серумната имунореактивност. Съгласно едно предпочитано изпълнение, имунореактивността е измервана при серумно разреждане от около 1:100.
© Съгласно следващ сроден аспект, изобретението включва метод за определяне прогнозата за пациент, подложен на третиране за амилоидно нарушение. Тук е измервано количеството серумна имунореактивност на пациент, срещу амилоиден компонент, характерен за подбраното нарушение и серумно количество имунореактивност на пациент, което е най-малко четири пъти повисоко от изходното контролно ниво на серумната имунореактивност, е показателно за прогнозата на подобрен статус по отношение на определено амилоидно нарушение. Съгласно предпочитани изпълнения, количеството имунореактивност срещу подбран амилоиден компонент, намиращ се в серума на пациент, се характеризира чрез серумен титър от най-малко 1:1000, или най-малко 1:5000, по отношение на амилоидния компонент.
Съгласно сроден аспект, изобретението включва също, така наречените “пасивни имунизационни” методи и фармацевтични препарати за профилактика и лечение на амилоидни заболявания. Съгласно този аспект на изобретението, на пациенти е давана ефективна дозировка от антитяло, което специфично се свързва с подбран амилоиден компонент, предпочитано фибрилен компонент, който се намира в амилоидните отлагания, характерни за болестта, ® която се лекува. Общо, такива антитела са подбрани поради тяхната способност да се свързват специфично с различни белтъци, пептиди и компоненти, описани във връзка с фармацевтичните препарати и методи, описани в предишните параграфи на този раздел. Съгласно едно сродно изпълнение, такива методи и препарати могат да включват комбинации от антитела, които свързват най-малко два амилоидни фибрилни компоненти. Общо, фармацевтични препарати са въвеждани за да се осигури серумно количество имунореактивност срещу прицелен амилоиден компонент, което е най-малко четири пъти по-високо от серумното ниво на имунореактивност срещу измерваното Ф в контролна серумна проба. Антителата могат също да бъдат въвеждани с носител, както тук е описано. Общо, в съответствие с този аспект на изобретението, такива антитела могат да бъдат въвеждани (или комбинирани за въвеждане) перитонеално, орално, интраназално, подкожно, интрамускулно, топично или интравенозно, но могат да бъдат въвеждани или комбинирани за въвеждане по всякакъв фармацевтично ефективен път (т.е. ефективен да произведе указаните терапевтични нива, както е представено по-горе и тук).
Съгласно едно сродно изпълнение, терапевтични антитела могат да бъдат прилагани чрез въвеждане на полинуклеотид, кодиращ най-малко една антитяло верига у пациента. Съгласно този аспект на изобретението, полинуклеотидът е експресиран у пациента да произвежда антитяло верига във фармацевтично ефективно количество у пациента. Такъв полинуклеотид може да кодира тежки и леки вериги на антитялото, при което се произвеждат тежки и леки вериги у пациента.
Съгласно предпочитани изпълнения, имунизационните схеми, описани по-горе, могат да включват въвеждане на агенти, включително антитела в множествени дозировки, като такива за 6месечен период, такива с начална имунизация, последвана от ® бустерни инжекции на определени интервали от време, като 6седмични интервали, съответно на методите известни в тази област, или съответно на нуждите на пациента, както са определени по имунния отговор. По избор, или в допълнение, такива схеми могат да включват употребата на комбинации ”със забавено освобождаване”, като известните в тази област.
Тези и други цели и особености на изобретението, ице бъдат по-пълно очевидни, когато се прочете следното подробно описание на изобретението във връзка с придружаващите го фигури.
© Кратко описание на фигурите
Фиг.1: Антитяло титър у трансгенни мишки след инжектиране οΑβ1-42.
Фиг.2: Амилоидно натрупване в хипокампа. Процентът от площта на хипокампалната област, заета от амилоидни плаки, определен чрез реактивността с Αβ-специфично моноклонално антитяло 3D6, е определен с компютерен количествен анализ на образи в имунореагирали мозъчни срези. Стойностите за отделните мишки, са представени подредени по третирана група.
, -- > 'j
Хоризонталната линия за всяко групиране показва медианната стойност на разпределението.
Фиг.З: Невритна дистрофия в хипокампа. Процентът от площта на хипокампалната област, заета от дистрофични неврити, определена по тяхната реактивност с човешко АРР-специфично моноклонално 8Е5, е определена с количествен компютерен анализ на образи на имунореагирали мозъчни срези. Стойностите за отделните мишки са показани за AN1792-третираната група и PBSтретираната контролна група. Хоризонталната линия за всяко групиране показва медианната стойност на разпределението.
© Фиг.4: Астроцитоза в ретросплениалната кора (retrosplenial cortex). Процентът от площта на коровата област, зает от глиялен фибриларен кисел белтък (ОЕАР)-положителни астроцити, е определен чрез компютерен количествен анализ на образи на имунореагирали мозъчни срези. Стойностите за отделните мишки са представени подредени според третирана група и медианните стойности на групата са показани чрез хоризонтални линии.
Фиг.5: Геометрични средни антитяло титри срещу Αβ42 след имунизация с един диапазон от 8 дози от Αβ42 (“AN1792”), съдържащи 0.14,0.4, 1.2,3.7,11,33,100 или 300 μρ.
© Фиг.6: Кинетика на антитяло отговора срещу AN 1792 имунизация. Титрите са изразени като геометрични средни на стойностите за 6 животни във всяка група.
Фиг.7: Количествен анализ на образи на корови амилоидни натрупания в PBS- и А№792-третирани мишки.
Фиг.8: Количествен анализ на образи на натрупвания от невритни плаки у PBS- и AN1792-третирани мишки.
Фиг.9: Количествен анализ на образи на процента от ретросплениалната кора, зает от астроцитоза у PBS- и AN1792третирани мишки.
Фиг.1О: Тест за лимфоцитна пролиферация на клетки от слезка от АШ792-третирани (горен блок) и PBS-третирани (долен блок) мишки.
Фиг.11: Тотални Αβ нива в мозъчната кора. Графика на разсейване на отделните Αβ профили при мишки, имунизирани с Αβ или АРР производни, комбинирани с адювант на Freund.
Фиг. 12: Амилоидни натрупвания в кората, определени с количествен анализ на образи на имунореагирали мозъчни срези, за мишки имунизирани с Αβ пептидните конюгати Αβ1-5, Αβ1-12 и Αβ1328; пълноверижните Αβ агрегати Αβ42 (“ΑΝ1792”) и Αβ1-40 (“ΑΝ1528”) и PBS-третирана контролна група.
Фиг. 13: Геометрични средни титри на Αβ-специфично антитяло за групи от мишки, имунизирани с Αβ или АРР производни, комбинирани с адювант на Freund.
Фиг. 14: Геометрични средни титри на Αβ-специфично антитяло за групи от морски свинчета, имунизирани с AN1792, или негово палмитоирано производно, комбинирани с различни адюванти.
Фиг.15 (А-Е): Αβ нива в кората на 12-месечни PDAPP мишки, третирани с AN1972 или AN1528, с различни адюванти.
Фиг.16: Среден титър на мишки третирани с поликлонално антитяло срещу Αβ.
Фиг. 17: Среден титър на мишки, третирани с моноклонално антитяло 10D5 срещу Αβ.
Фиг. 18: Среден титър на мишки третирани с моноклонално антитяло 2D12 срещу Αβ.
Подробно описание на изобретението
А. Дефиниции
Ако не е специално отбелязано, всички термини тук използувани, имат същото значение, както те биха имали за специалиста в тази област на настоящето изобретение. Практикуващите, специално са насочени към Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. and Ausubel, F.M., et al., (1998) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, за определения, специални термини и стандартни методи, известни в тази област на биохимията и молекулярната биология. Разбираемо е, че това изобретение, не е ограничено до специално описана методология, протоколи и реактиви, тъй като те могат да варират, за получаване на същия резултат.
Терминът “адювант се отнася за съединение, което когато се въвежда заедно с един антиген, повишава имунния отговор срещу антигена, но въведено самостоятелно, не генерира имунен отговор срещу антигена. Адюванти могат да повишават имунния отговор по няколко механизма, включително лимфоцитно възстановяване, стимулация на В и/йли Т клетки и стимулация на макрофаги.
© “Амилоидно заболяване” или “амилоидоза” се отнася за всяко от известен брой нарушения, които имат като симптом или част от патологията, натрупване или формиране на амилоидни плаки.
“Амилоидна плака” е извънклетъчно отлагане, състоящо се главно от протеинни фибрили. Общо, фибрилите са изградени от един доминантен белтък или пептид; обаче, плаката може да включва допълнителни компоненти, които са пептиди или не-пептидни молекули, както е описано тук.
“Амилоиден компонент” е всяка молекулна единица, която се намира в амилоидна плака, включително антигенни части от такива
молекули. Амилоидни комоненти включват, но не се ограничават до белтъци, пептиди, протеогликани и въглехидрати. “Специфичен амилоиден компонент” се отнася за молекулна единица, която се намира първично или изключително в амилоидната плака, която е от интерес.
“Агент” е химична молекула от биологичен или синтетичен произход. В контекста на настоящето изобретение, агент е общо молекула, която може да бъде използувана във фармацевтичен състав.
“Анги-амилоиден агент” е агент, който е способен да произведе имунен отговор срещу компонент на амилоидна плака у гръбначен индивид, когато е въведен чрез техники на активна или пасивна имунизация.
Термините “полинуклеотид и “нуклеинова киселина”, както тук са използувани взаимозаменяемо, се отнасят за полимерна молекула, притежаваща основна верига, която съдържа бази, способни да образуват водородни връзки с типични полинуклеотиди, където полимерната основна верига, представя базите по начин да разрешава образуване на водородни връзки в дадена последователност, по специфичен начин между полимерна молекула и типичен полинуклеотид (например, едноверижна ДНК). Такива бази обикновено са инозин, аденозин, гуанозин, цитозин, урацил и тимидин. Полимерни молекули включват двуверижни и едноверижни РНК и ДНК и техни модификации на основната верига, например метилфосфонатни връзки.
Терминът “полипептид” както тук е използуван, се отнася за съединение състоящо се от единична верига от аминокиселинни остатъци, свързани с пептидни връзки. Терминът “белтък” може да бъде синоним на термина “полипептид” или може да се отнася за комплекс от два или повече полипептиди.
Терминът “пептид” също се отнася за съединение изградено от аминокиселинни остатъци свързани с пептидни връзки. Общо пептидите са изградени от 100 или по-малко аминокиселини, докато полипептиди или белтъци имат повече от 100 аминокиселини. Както тук е използуван, терминът “белтъчен фрагмент” може също да бъде разглеждан като пептид.
Фибрилен пептид” или “фибрилен белтък се отнася за мономерна или агрегирана форма на белтък или пептид, които образуват фибрили, намиращи се в амилоидни плаки. Примери за е такива пептиди и белтъци са представени тук.
“Фармацевтичен състав” се отнася за химичен или биологичен състав, подходящ за въвеждане у бозайник. Такива препарати могат специфично да бъдат комбинирани за въвеждане по един или повече начини, включително, но без да се ограничават до, орален, парентерален, интравенозан, интраартериален, подкожен, интраназален, сублингвален, интраспинален, интрацеребровентрикуларен и подобни начини.
“Фармацевтичен ексципиент” или “фармацевтично приемлив ексципиенг” е носител, обикновено течност, в който е комбиниран активния терапевтичен агент. Общо ексципиентът не придава никаква © фармацевтична активност на комбинацията, въпреки че той придава химична и/йли биологична стабилност, характеристики за освобождаване и подобни. Примерни комбинации могат да бъдат намерени, например в Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th Ed., Grennaro, A., Ed., 1995.
“Гликопротеин” е белтък, за който коваленгно е закачена наймалко една въглехидратна верига (олигополизахарид).
“Протеогликан” е гликопротеин, където най-малко една от въглехидратните вериги е гликозамингликан, който е дълъг линеен полимер от повтарящи се дизахариди, в които един член на чифта обикновено е захарна киселина (уронова киселина) и другият е аминозахар.
Терминът “имунологичен” или “имунен”, или “имуногенен” отговор, се отнася за развитието на хуморален (антитяло медииран) и/или клетъчен (медииран от антиген-специфични Т клетки или техни секреционни продукти) отговор, насочен срещу антиген у гръбначен индивид. Такъв отговор може да бъде активен отговор, индуциран чрез въвеждане на имуноген или пасивен отговор индуциран чрез въвеждане на антитяло или индуцирани Т-клетки. Клетъчен имунен отговор е предизвикан от представянето на полипептидни епитопи ® свързани с Клас I или Клас II МНС молекули, за активиране на антиген-специфични CD4+ Т помощни (helper) клетки и/или CD8+ цитотоксични Т клетки. Отговорът може да включва активиране на моноцити, макрофаги, NK клетки, базофили, дендритни клетки, астроцити, микроглиялни клетки, еозинофили или други компоненти на вродения имунитет. Наличието на клетъчно-медииран имунен отговор може да бъде определено чрез стандартни пролиферативни тестове (CD4+ Т клетки) или CTL (цитотоксични Т лимфоцити) тестове, известни в тази област. Относителните приноси на хуморалните и клетъчни отговори за профилактичния или терапевтичен ефект на © даден имуноген, могат да бъдат разграничени чрез отделно изолиране на имуноглобулин (IgG) и Т-клетъчни фракции от имунизирани сингенни животни и измерване профилактичния или терапевтичен ефект у друг индивид.
“Имуногенен агент” или “имуноген” или “антиген” е молекула, която е способна да индуцира имунологичен отговор срещу самата себе си при въвеждане у пациент, заедно със или в отсъствие на адювант. Такива молекули включват, например, амилоидни фибрилни пептиди или техни фрагменти, свързани с белтъчен носител, като keyhole limpet hemocyanin, Cd3 или тетанус токсоид.
“Епитоп” или “антигенна детерминанта” е част от антиген, която се свързва с антиген-свързващ участък от антитяло.
Терминът “Αβ”, “Αβ пептид” и “Амилоид β” пептид са синоними и се отнася за един или повече пептидни комбинации от около 38-43 аминокиселини, произхождащи от Beta амилоид прекурсорен протеин (β-ΑΡΡ), както е описано по-горе. “Αβχχ” се отнася за амилоид β пептид 1-хх, където хх е номер показващ броя аминокиселини в пептида, например Αβ42 е същият както Αβ1-42, който тук също е означен като “AN1792” и Αβ4Ο е същия както Αβ1-4Ο, който тук също е означен като “AN1578”.
Дизагрегиран или мономерен Αβ означава разтворими, мономерни пептидни единици на Αβ. Един метод за изготвяне на мономерен Αβ е да се разтвори лиофилизиран пептид в чист DMSO при третиране с ултразвук. Полученият разтвор се центрофугира за отстраняване на неразтворимия материал. Агрегиран Αβ е смес от олигомери, в която мономерните единици са свързани с нековалентни връзки.
Терминът “гол полинуклеотид” се отнася за полинуклеотид, който не е свързан комплексно с колоиден материал. Голи полинуклеотиди понякога са клонирани в плазмидни вектори.
Терминът “пациент” включва човешки индивиди или бозайници, които получават профилактично или лечебно третиране.
Термините “значително различни в сравнение със“, “статистически значими”, “значително по-високи (или по-ниски) в сравнение със “ и подобни фрази се отнасят за сравнения между данни или други измервания, където разликите между два сравнявани индивида или групи, са видимо или основателно различни за тренирания наблюдател, или статистически значими ( ако фразата включва термина “статистически”, или има известна индикация от статистически тест, като р-стойност, или ако данните, когато се анализират, дават статистическа разлика чрез стандартни статистически тестове известни в тази област).
Препарати или методи “съдържащи” един или повече от изброените елементи, могат да включват други елементи, които не са специфично изброени. Например, състав съдържащ фибрилен компонент пептид, обхваща изолирания пептид и пептида, като компонент на по-голяма полипептидна последователност. Като следващ пример, състав, който съдържа елементи А и В също обхваща състав състоящ се от А,В и С.
® В. Амилоидни заболявания
1. Общ преглед и патогенеза
Амилоидни заболявания или амилоидози включват известен брой болестни състояния с голямо разнообразие на външни симптоми. Тези нарушения имат общо наличие на абнормни извънклетъчни отлагания на белтъчни фибрили, известни като “амилоидни отлагания” или “амилоидни плаки”, които обикновено са с диаметър 10-100 цт и са локализирани в специфични органи и тъканни области. Такива плаки са съставени първично от природно срещащ се разтворим белтък или пептид. Тези неразтворими отлагания са съставени от © общо паралелни агрегати от фибрили, които са с приблизително ΙΟΙ 5nm диаметър. Амилоидните фибрили дават характерно ябълково зелено двойно пречупване в поляризирана светлина, когато са оцветени с багрилото Congo Red . Тези нарушения са класифицирани въз основа на главните фибрилни компоненти, образуващи отлаганията на плаки, както е описано по-долу.
Пептидите или белтъците образуващи отлагания на плаки, често са получени от по-голям прекурсорен белтък. По-специално, патогенезата на амилоидните фибрилни отлагания общо включва протеолитично разцепване на “абнормен” прекурсорен белтък на фрагменти. Тези фрагменти общо агрегират в анти-паралелни β нагънати листа; обаче, някои недеградирани форми на прекурсорния белтък е съобщено, че агрегират и образуват фибрили при фамилна амилоидна полиневропатия (вариант на транстиретин (transthyretin) фибрили) и свързана с диализа амилоидоза (β2 микроглобулин фибрили) (Tan et al., 1994, по-горе).
2. Клинични синдроми
Този раздел предоставя описания на основните типове амилоидози, включително техния характерен фибрилен състав на плаките. Общо откритие на настоящето изобретение е, че амилоидните заболявания могат да бъдат третирани чрез въвеждане на агенти, които служат да стимулират имунен отговор срещу един компонент или компоненти на различни специфични за заболяването амилоидни отлагания. Както е обсъдено в по-големи подробности в Раздел С по-долу, такива компоненти предпочитано са съставки на фибрилите, които образуват плаките. Разделите по-долу слукат да представят като примери, основните форми на амилоидоза и не са предвидени да ограничават изобретението.
© а. АА (реактивна) амилоидоза
Общо, АА амилоидозата е демонстрация на известен брой заболявания, които провокират продължителен остра фаза отговор. Такива заболявания включват хронични възпалителни заболявания, хронични локални или системни микробни инфекции и злокачествени неоплазми.
АА фибрили общо са съставени от 8000 далтона фрагменти (АА пептид или белтък), образувани чрез протеолитично разцепване на серумен амилоиден А протеин (apoSSA), един циркулиращ аполипопротеин, който се намира в HDL частици и който се синтезира в хепатоцити в отговор на такива цитокини като IL-1, IL-6 и TNF. Може да има широко пръснато отлагане в тялото, предпочитано в паренхимни органи. Слезката обикновено е место за отлагане, бъбреците също могат да бъдат засегнати. Отлагането също е обичайно за сърцето и стомашно-чревния тракт.
АА амилоидните заболявания включват, но не се ограничават до възпалителни заболявания, като ревматоиден артрит, ювенилен хроничен артрит, анкилозиращ спондилит, псориазис, псориатична артропатия, синдром на Reiter, болест на Still при възрастни, синдром на Behcet и болест на Crohn. АА отлагания също се получават в резултат на хронични микробни инфекции, като проказа, туберкулоза, бронхиектазии, декубитални язви, хроничен пиелонефрит, остеомиелит и болест на Whipple. Някои злокачествени новообразования могат също да доведат до АА фибрилни амилоидни отлагания. Такива са състояния като лимфома на Hodgkin, бъбречен карцином, карцином на червата, белите дробове и уро-гениталните пътища, базално-клетъчен карцином и космато клетъчна левкемия .
b. AL амилоидози
AL амилоидно отлагане общо е свързано с почти всякаква • дискразия от В лимфоцитен произход, в границите от злокачественост на плазмени клетки (мултиплен миел ом) до доброкачествена моноклонална гамопатия. В определен момент, наличието на амилоидни отлагания може да бъде първичен показател за подлежаща дискразия.
Фибрилите на AL амилоидни отлагания са съставени от моноклонални имуноглобулинови леки вериги или техни фрагменти. По-специално, фрагментите произхождат от N-крайната област на леката верига (kappa или lambda) и съдържат целия или част от техния променлив (VL) домен. Отлагания общо се появяват в мезенхимните тъкани, предизвиквайки периферна или автономна невропатия, carpal tunnel syndrome (синдром на миньорска болест на китките), макроглосия, рестриктивна кардиомиопатия, артропатия на големите стави, имунна дискразия, миеломи, както и окултни дискразии. Обаче, трябва да се отбележи, че почти всяка тъкан, поспециално висцерални органи като сърце, могат да бъдат ангажирани.
с. Наследствени системни амилоидози
Има много форми на наследствени системни амилоидози. Въпреки че те са относително редки състояния, появата в зряла възраст на симптоми и техните наследствени характеристики (обикновено автозомна доминанта) водят до съществуване на такива нарушения в цялата популация. Общо, синдромите се приписват на точкови мутации в прекурсорния белтък, които водят до произвеждане на варианти от амилоидогенни пептиди или белтъци. Таблица 2 обобщава фибрилния състав на примерни форми на тези заболявания. Таблица 2
Наследствени амилоидози
Фибрилен пептид/белтък Генетичен вариант Клиничен синдром
Transthyretin и фрагменти (ATTR) Met30, много други Фамилна амилоидна полиневропатия (FAP), (главно периферни нерви)
Transthyretin и фрагменти (ATTR) Thr45, Ala60,Ser84 Met111,lle122 Сърдечно засягагане преимуществено без невропатия
N-краен фрагмент на Аполипопротеин А1 (apoAl) Arg26 Фамилна амилоидна полиневропатия (FAP), (главно периферни нерви)
N-краен фрагмент на Аполипопротеин А1 (AapoAl) Агд26, Агд50,Агд 60, други Ostertag-тип, неневропатен(преимуществено висцерално засягане)
Лизозим (Alys) Thr56, His67 Ostertag-тип, неневропатен(преимуществено висцерално засягане)
Фиброген а верига фрагмент Leu554, Val526 Ostertag-тип, неневропатен(преимуществено висцерално засягане)
• Gelsolin фрагмент (Agel) Asn187, Tyr187 Краниална невропатия с решетъчна корнеална дистрофия
Цистатин С фрагмент Glu68 Наследствена церебрална хеморагия(церебрална амилоидна ангиопатия)-исландски тип
β-амилоиден белтък (Αβ) произхождащ от Амилоид прекурсорен протеин (АРР) Gln693 Наследствена церебрална хеморагия (церебрална амилоидна ангиопатия)- холандски тип
β-амилоиден белтък (Αβ) произхождащ от Амилоиден прекурсорен протеин (АРР) Ile717, Phe717, Gly717 Фамилна болест на Alzheimer
β-амилоиден белтък (Αβ) произхождащ от Амилоиден прекурсорен протеин (АРР) Asn670, Leu671 Фамилна деменция - вероятна болест на Alzheimer
Прион протеин (РгР) произхождащ от РгР прекурсорен протеин 51-59 инсерт Leu102, Val167, . Asn178, Lys200 Фамилна болест на CreutzfeldtJakob; GerstmannStraussler-Scheinker синдром (нас-
ледствена спонгиоформена енцефалопатия, прион заболявания)
АА произхождащ от серумен амилоиден А протеин (ApoSSA) Фамилна Средиземноморска треска, преимуществено бъбречно засягане (автозомен рецесив)
АА произхождащ от Серумен амилоиден А протеин (ApoSSA) Muckle-Well’s синдром, нефропатия глухота, уртикария болка в крайниците
Неизвестен Кардиомиопатия с перзистиращ атриален застой
Неизвестен Кожни отлагания (булозни, папуларни, пустулодермални)
• Данни взети от Tan & Pepys, 1994, по-горе
Данните представени в Таблица 2 са примерни и не са предвидени да ограничават обсега на изобретението. Например, описани са повече от 40 отделни точкови мутации в transthyretin’oBHfl ген всички, от които водят до клинично подобни форми на фамилна амилоидна полиневропатия.
Transthyretin (TTR) е един 14 килодалтона белтък, който понякога е означаван като преалбумин. Той се произвежда в черния дроб и хороидния плексус и функционира при транспортиране на тиреоидни хормони и витамин А. Най-малко 50 вариантни форми на белтъка, всяка характеризираща се с единична промяна на аминокиселина, са отговорни за различни форми на фамилна амилоидна полиневропатия. Например, замяна на пролин с левцин в позиция 55, води до специално прогресираща форма на невропатия;
замяна на метионин с левцин в позиция 111, води до тежка кардиопатия у датски пациенти. Амилоидни отлагания изолирани от сърдечна тъкан на пациенти със системна амилоидоза разкриват, че отлаганията са изградени от хетерогенна смес на TTR и техни фрагменти, колективно обозначени като ATTR, пълноразмерните последователности, на които са характеризирани. ATTR фибрилните компоненти могат да бъдат екстрахирани от такива плаки и да бъде определена тяхната структура и последователност, с методи известни в тази област (напр. Gustavsson, A., et al., Laboratory Invest. 73:703-708, 1995; Kametani F., et al., Biochem. Biophys. Res.Commun. 125:622-628, ® 1984; Pras, M., et al., PNAS 80:539-42,1983).
Лица, които имат точкови мутации в молекулата на аполипопротеин AI (например Gly -> Arg26; Тгр -> Агд50; Leu -^АгдбО) проявяват една форма на амилоидоза (“Ostertag тип”), характеризираща се с отлагания на белтъка аполипопротеин AI или негови фрагменти (AapoAl). Тези пациенти имат ниски нива липопротеин с висока плътност (HDL) и имат периферна невропатия или бъбречна недостатъчност.
Една мутация на алфа веригата на ензима лизозим (например, lle->Thr56 или Asp-»His57) е основата за друга форма на © Ostertag-тип, не-невропатен наследствен амилоид, съобщен за английски фамилии. Тук, са отложени фибрили на мутантния лизозимен белтък (Alys) и общо пациентите проявяват нарушена бъбречна функция. Този белтък, за разлика от повечето фибрилиобразуващи белтъци описани тук, обикновено е налице в цяла (нефрагментирана) форма (Benson, M.D., et al. CIBA Fdn.Symp. 199: 104-131,1996).
β-амилоиден пептид (Αβ) е 39-43 аминокиселиннен пептид, произхождащ чрез протеолиза от голям белтък, известен като бета амилоиден прекурсорен протеин (βΑΡΡ). Мутации в βΑΡΡ водят до фамилни форми на болестта на Alzheimer, синдром на Down, и/йли сенилна деменция, характеризираща се с мозъчно отлагане на плаки, изградени от Αβ фибрили и други компоненти, които са описани в подробности по-долу. Известни мутации в АРР, свързани с болестта на Alzheimer, се появяват в съседство с местата на разцепване от β или γ секретаза, или в рамките на Αβ. Например, позиция 717 е в съседство с мястото на γ-секретазно разцепване на АРР, при неговото процесиране до Αβ, и позиции 670/671 са в съседство с мястото на β-секретазно разцепване. Мутации при който и да е от тези остатъци, могат да водят до болест на Alzheimer, вероятно като предизвикват нарастване на количеството на 42/43 аминокиселинната форма на Αβ, генериран от АРР. Структурата и последователността на Αβ пептиди с различни дължини, са добре известни в тази област. Такива пептиди могат да бъдат получени съгласно методите известни в тази област (например, Glenner and Wong, Biochem.Biophys.Res.Commun. 129:885890,1984; Glenner and Wong, Biochem.Biophys.Res.Commun. 122: 11311135, 1984). В допълнение, различни форми на пептидите са търговски достъпни.
Синуклеин е свързан със синапсите белтък, който наподобява един аполипопротеин и е в изобилие в невроналния цитозол и пресинаптичните окончания. Пептиден фрагмент произхождащ от асинуклеин, наречен NAC, също е компонент на амилоидни плаки при болестта на Alzheimer. (Clayton et al., 1998). Този компонент служи също като прицелно място за третирания на базата на имуноглобулин, в настоящето изобретение, както е дадено в подробности по-долу.
Gelsolin е калций свързващ белтък, който се свързва със и фрагментира актинови филаменти. Мутации в позиция 187 (например, Asp-» Asn; Asp-> Tyr) на белтъка води до една форма на наследствена системна амилоидоза, обикновено открита у пациенти от Финландия, както и лица от холандски или японски произход. У страдащи индивиди, фибрили образувани от gelsofin’oen фрагменти (Agel), обикновено се състоят от аминокиселини 173-243 (68 kDa карбокситерминален фрагмент) и са отложени в кръвоносни съдове и базални мембрани, което води до корнеална дистрофия и краниална невропатия, която прогресира до периферна невропатия, дистрофични кожни промени и отлагания в други органи. (Kangas, Н., et al. Human Mol.Genet. 5(9): 1237-1243,1996).
Други мутирани белтъци, като мугантна алфа верига на фибриноген (AfibA) и мутантен цистатин С (Acys) също образуват фибрили и предизвикват характерни наследствени нарушения. AfibA w фибрили образуват отлагания, характерни за не-невропатичен наследствен амилоид с бъбречно заболяване; Acys отлагания са характерни за наследствена мозъчна амилоидна ангиопатия, съобщена в Исландия. (Isselbacher, et al., Harrison’s Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, San-Francisco, 1995; Benson, et al., norope). Показано е, че поне в няколко случая, пациенти с мозъчна амилоидна ангиопатия (САА) имат амилоидни фибрили, съдържащи една не-мутантна форма на цистатин С, свързан с бета белтък. (Nagai,
A., et al. Molec.Chem. Neuropathol. 33:63-78,1998).
Някои форми на прион заболяване са разглеждани като © наследствени, възлизащи на около 15% от случаите, които преди са считани, че са преимуществено инфекциозни по природа. (Baldwin, et al., in Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, John Wiley and Sons, New York, 1995). При тези заболявания, пациентите развиват плаки, изградени от абнормни изоформи на нормалния прион протеин (РгРс). Една предоминантна мугантна изоформа, PrPSc, също означена като AScr, се различава от нормалния клетъчен белтък по нейната резистентност към протеазно разграждане, неразтворимост след детергентна екстракция, отлагане във вторични лизозоми, пост-транслационна синтеза и високо съдържание на β-нагънати листа. Генетична връзка е установена за най-малко пет мутации, които водят до болест на Creutzfeldt-Jacob (CJD), Gerstmann-Straussler-Scheinker синдром (GSS) и фатална фамилна инсомния (FFI) (Baldwin). В тази област са известни методи за екстрахиране на фибрилни пептиди от scrapie фибрили, определяне на последователности и изготвяне на такива пептиди (например, Beeks, М., et al. J.Gen.Virol. 76:2567-76,1995).
Например, една форма на GSS е свързана с РгР мутация при кодон 102, докато теленцефален GSS сегрегира с мутации при кодон 117. Мутации при кодони 198 и 217 имат за резултат една форма на GSS, при която невритните плаки характерни за болестта на Alzheimer, съдържат РгР вместо Αβ пептид. Някои форми на фамилна CJD са свързани с мутации при кодони 200 и 210; мутации при кодони 129 и 178 са открити при фамилни CJD и FFI. (Baldwin, по-горе).
d. Сенилна системна амилоидоза
Амилоидното отлагане, системно или фокално, нараства с възрастта. Например, фибрили от див тип transthyretin (TTR) обичайно се намират в сърдечна тъкан на по-възрастни индивиди. Те могат да бъдат асимптомни, клинично неизявени или могат да имат за резултат сърдечна недостатъчност. Асимптомни фибриларни фокални отлагания могат също да се появят в мозъка (Αβ), corpora amylacea на простатата (Αβ2 микроглобулин), стави и семенни мехурчета.
e. Мозъчна амилоидоза
Локално отлагане на амилоид е обичайно в мозъка, особено у по-възрастни индивиди. Най-честият тип амилоид в мозъка е изграден първично от Αβ пептидни фибрили, водещи до деменция или спорадична (не-наследствена) болест на Alzheimer. В действителност, появата на спорадична болест на Alzheimer силно превишава формите, представени като наследствени. Фибрилни пептиди формиращи тези плаки са много сходни с тези описани по-горе, с оглед наследствените форми на болестта на Alzheimer (AD).
f. Амилоидоза свързана с диализа
Плаки изградени от β2 микроглобулин (Αβ2Μ) фибрили обикновено се развиват у пациенти, получаващи продължителна хемодиализа или перитонеална диализа. β2 микроглобулин е един
11.8 kDa полипептид и е леката верига на Клас I МНО антигени, които присъствуват във всички ядрени клетки. При нормални условия, той непрекъснато се отделя от клетъчните мембрани и нормално се филтрува от бъбреците. Нарушение в отделянето, както е в случая с нарушена бъбречна функция, води до отлагане в бъбреците и на други места (първично в богатите на колаген тъкани на ставите). За разлика от други фибрилни белтъци, Αβ2Μ молекули общо присъствуват в нефрагментирана форма във фибрилите. (Benson, погоре).
д. Амилоидози производни на хормони
Ендокринните органи могат да задържат амилоидни отлагания, по-специално у възрастни индивиди. Секретиращи хормон тумори могат също да съдържат производни на хормон амилоидни плаки, фибрилите, на които са изградени от полипептидни хормони като калцитонин (медуларен карцином на щитовидната жлеза), островен амилоиден полипептид (амилин; появяващ се у повечето пациенти с Тип II диабет), и атриален натриуретичен пептид (изолиран от атриална амилоидоза). Последователностите и структурите на тези белтъци са добре известни в тази област.
h. Смесени амилоидози
Има различни други форми на амилоидно заболяване, които обикновено се проявяват като локализирани отлагания на амилоид. Общо, тези заболявания вероятно са резултат на локализирано производство и/йли липса на катаболизъм на специфични фибрилни
прекурсори или предразположение на дадена тъкан (като ставите) за фибрилно отлагане. Примери за такова идиопатично предразположение включват нодуларен (възлест) AL амилоид, кожен амилоид, ендокринен амилоид и свързан с тумор амилоид.
С. Фармацевтични препарати
Откритие на настоящето изобретение е, че препарати способни да предизвикат или предоставят имунен отговор, насочен срещу някои компоненти на амилоидни плаки, са ефективни да лекуват или предотвратяват развитието на амилоидни заболявания. В Ф частност, съгласно изобретението, което тук е представено, е възможно да се предотврати прогресирането или да се подобрят симптомите на, и/или да се намалят натрупванията от амилоидни плаки у засегнати индивиди, когато имуностимулаторна доза от един анти-амилоиден агент, или съответен анти-амилоиден имунен реагент, е въведен у пациент. Този раздел описва примерни ангиамилоидни агенти, които произвеждат активни, както и пасивни, имунни отговори срещу амилоидни плаки и предоставя примерни данни, показващи ефекта от третиране, използуващо такива препарати срещу натрупвания на амилоидни плаки.
© Общо, анти-амилоидни агенти на изобретението са изградени от един специфичен за плаката компонент, предпочитано фибрили образуващ компонент, който обикновено е характерен белтък, пептид или техен фрагмент, както е описано в предишния раздел и даден за пример по-долу. По-общо, терапевтични агенти за употреба в настоящето изобретение, произвеждат или индуцират имунен отговор срещу плака или по-специално, неин фибрилен компонент. Такива агенти следователно включват, но не се ограничават до, самия компонент и негови варианти, аналози и миметици на компонента, които индуцират и/йли реагират кръстосано с антитела срещу компонента, както и антитела или Т-клетки, които специфично са реактивни с амилоидния компонент. Съгласно една важна особеност, фармацевтичните препарати не са подбрани от не-специфични компоненти - т.е. от тези компоненти, които са общо циркулиращи или които са повсеместни в тялото. Като пример, Серумен амилоиден протеин (SAP) е цилкулиращ плазмен гликопротеин, който е произведен в черния дроб и се свързва с повечето известни форми на амилоидни отлагания. Лекарствени препарати са предпочитано насочени срещу този компонент.
Индукцията на имунен отговор може да бъде активна, когато е въведен имуноген да индуцира антитела или Т-клетки, реактивни с компонента у пациент, или пасивна, когато е въведено антитяло, което то самото се свързва с амилоидния компонент у пациента. Примерни агенти за индуциране или произвеждане на имунен отговор срещу амилоидни плаки са описано по-долу.
Фармацевтични препарати на настоящето изобретение могат да включват, в допълнение на имуногенен агент(и), ефективно количество от адювант и/йли ексципиент. Фармацевтично ефективни и полезни адюванти и ексципиенти са добре известни в тази област и са описани в по-големи подробности в следващите раздели.
1. Имуностимулаторни агенти (Активен имунен отговор)
А Анти-фибрилни препарати
Един общ клас от предпочитани анти-амилоидни агенти включва агенти, които произхождат от амилоидни фибрилни белтъци. Както бе споменато по-горе, отличителният белег на амилоидни заболявания е отлагането на амилоидни плаки в един орган, състоящи се главно от фибрили, които на свой ред се състоят от характерни фибрилни белтъци или пептиди. Съгласно настоящето изобретение, такъв фибрилен белтък или пептиден компонент, е полезен агент за индуциране на анти-амилоиден имунен отговор.
Таблици 1 и 2 обобщават примерни образуващи фибрили белтъци, които са характерни за различни амилоидни заболявания. В съответствие с този аспект на настоящето изобретение, въвеждането у засегнат или предразположен индивид, на имуностимулаторен състав, който включва съответен фибрилен белтък или пептид, включително хомолози или техни фрагменти, предоставя терапия или профилактика по отношение на амилоидното заболяване.
Като пример Αβ, известен също като β-амилоиден пептид, или А4 пептид (виж US Patent 4,666,829; Glenner & Wong Biochem.Biophys.Res.Commun. 120, 1131 (1984), е пептид от 39-43 аминокиселини, който е главният компонент на характерните плаки за болест на Alzheimer. Αβ е генериран чрез процесиране на по-голям белтък АРР от два ензима, наречени β и γ секретази (виж Hardy, TINS 20,154 (1997)).
Пример I описва резултатите от експерименти, проведени в подкрепа на настоящето изобретение, при които Αβ42 пептид е въведен у хетерозиготни трансгенни мишки, които свръхекспресират човешки АРР, с една мутация в позиция 717. Тези мишки, известни като “PDAPP мишки” проявяват подобна на Alzheimer патология и са разглеждани като животински модел на болестта на Alzheimer (Games, et al., Nature 373: 523-7, 1995). Както е детайлизирано в примера, тези мишки проявяват откриваема неврпатология с Αβ плаки в техните мозъци, с начало на 6-месечна възраст, и отлагането на плаки е прогресиращо с времето. В описаните тук експерименти, агрегиран Αβ42 (AN1792) е въвеждан у мишки. Повечето от третираните мишки(7/9) нямат откриваем амилоид в техните мозъци на 13-месечна възраст, за разлика от контролни мишки (инжектирани с физиологичен разтвор или нетретирани), всички от които показват значителни
мозъчни натрупвания на амилоид на тази възраст (Фиг.2). Тези различия са дори по-силно проявени в хипокампа (Фиг.З). Третирани мишки проявяват също значими серумни антитяло титри срещу Αβ (всичките по-високи от 1:1000, 8/9 по-високи от 1/10,000; Фиг.1, Таблица ЗА). Общо, третираните с физиологичен разтвор мишки проявяват 4-5 пъти по-малки от изходните нива на антитела срещу Αβ при разреждане 1:100, на всички тестирани интервали, и следователно са считани, че нямат значим отговор в сравнение с контролните (Таблица ЗВ). Тези проучвания демонстрират, че • инжектирането със специфичен образуващ фибрили пептид Αβ, осигурява защита срещу отлагане на Αβ амилоидни плаки.
Серумен амилоиден протеин (SAP) е циркулиращ плазмен гликопротеин, които се произвежда в черния дроб и се свързва по калций-зависим начин с всички форми на амилоидни фибрили, включително фибрили на церебралните амилоидни плаки при болестта на Alzheimer. Като част от горните експерименти, една група мишки е инжектирана със SAP; тези мишки развиват значителни серумни титри срещу SAP (1:1000 - 1:30000), но не развиват откриваеми серумни титри срещу Αβ пептид и развиват мозъчна невропатология с плаки (Фиг.2).
© Следващи експерименти, подробно представени в Пример II, демонстрират доза зависимост на имуногенния ефект от Αβ инжектиране на мишки, третирани между 5-седмична и около 8месечна възраст. При тези мишки, средните серумни титри на анти-Αβ пептид антитела нарастват с броя на имунизациите и повишаване на дозировките; обаче след четири имунизации, серумни титри измерени пет дни след имунизация, се изравняват над по-високите дози (1ЗООрд) на нива около 1.10000 (Фиг.б).
Допълнителни експерименти в подкрепа на настоящето изобретение са описани в Пример III, при които PDAPP модел на мишки, са третирани с Αβ42, започвайки в определен период от време (около 11-месечна възраст), след като амилоидните плаки вече съществуват в техните мозъци. При тези проучвания, животните са имунизирани с Αβ42 или физиологичен разтвор и са убити за тестиране на амилоидни натрупвания на 15 или 18-месечна възраст. Както е илюстрирано на фиг.7, на 18-месечна възраст, Αβ42третираните мишки проявяват значимо по-ниско средно натрупване на амилоидни плаки (натрупване на плаки, 0.01%) в сравнение с PBSтретираните 18-месечни контролни (натрупване на плаки 4.7%) или 12месечни нетретирани животни (0.28%), като натрупването на плаки е измерено чрез анализ на образи, както е детайлизирано в Пример XIII, част 8. Тези експерименти демонстрират ефикасността на методите за третиране на настоящето изобретение, за редуциране на съществуващите натрупвания от плаки и предотвратяване прогресирането на натрупване на плаки у заболелите индивиди.
Съгласно този аспект на изобретението, терапевтичните агенти произхождат от фибрилни пептиди или белтъци, които се съдържат в плаките и са характерни за заболяването, което е от интерес. Друга възможност е такива агенти да са антигенно достатъчно сходни с такива компоненти, за индуциране на имунен отговор, който също реагира кръстосано с фибрилния компонент. Таблици 1 и 2 предоставят примери за такива фибрилни пептиди и белтъци, съставът и последователностите, на които са известни в тази област и могат лесно да бъдат определени, съгласно методите в тази област. (Виж цитираните литературни данни по-долу и Раздел В2 за литературни данни, които специфично посочват методи за екстракция и/йли състав на различни фибрилни пептидни компоненти; следващи примерни фибрилни компоненти са описани по-долу).
Така, в съответствие с настоящето изобретение, когато се прави диагноза на амилоидно заболяване, въз основа на клинични и/йли биопсични определения, опитният специалист ще бъде в състояние да установи фибрилния състав на амилоидните отлагания и да предостави агент, който индуцира имунен отговор, насочен срещу фибриларните пептиди или белтъци.
Като пример, както е описано по-горе, терапевтичният агент използуван за лечение на болест на Alzheimer или други амилоидни заболявания, характеризиращи се с Αβ фибрилно отлагане, може да бъде всеки от естествено срещащите се форми на Αβ пептид, и поспециално човешките форми (т.е. Αβ39, Αβ4Ο, Αβ41, Αβ42 или Αβ43). Последователностите на тези пептиди и тяхната взаимозависимост с АРР прекурсора са добре известни в тази област (например, Hardy et al., TINS 20, 155-168 (1997)). Например Αβ42 има последователността:
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-Hls-HisGln-Lys-Leu-VakPhe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-lle-lleGly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-lle-Ala-OH. (SEQ ID N0:1)
Αβ41, Αβ40 и Αβ39 се различават от Αβ42 по липсата на Ala, Ala-lle и Ala-lle-Val съответно от С-терминалния край на пептида. Αβ43 се различава от Αβ42 по наличието на треонинов остатък при Скрая. Съгласно едно предпочитано изпълнение на изобретението, терапевтични агенти ще индуцират имунен отговор срещу целия или част от фибрилния компонент на заболяването, което е от интерес. Например, предпочитан Αβ имуногенен състав е агент, който индуцира антитяло специфично срещу свободния N-край на Αβ. Такъв състав има предимството, че няма да разпознава прекурсорния белтък, β-ΑΡΡ, при което ще бъде по-малко възможно да предизвика автоимунитет.
Като следващ пример, правилно се преценява, че пациенти засегнати от заболявания, характеризиращи се с отлагане на АА фибрили, например някои хронични възпалителни заболявания, хронични локални или системни микробни инфекции и злокачествени неоплазми, както е описано по-горе, могат да бъдат третирани с АА пептид, един известен 8 килодалтона фрагмент на Серумен амилоид А протеин (ApoSSA). Примерни АА амилоидни нарушения включват, но не се ограничават до възпалителни заболявания, като ревматоиден артрит, ювенилен хроничен артрит, анкилозиращ спондилит, псориазис, псориатична артропатия, синдром на Reiter, болест на Still при възрастни, синдром на Behcet, болест на Crohn, хронични микробни инфекции като проказа, туберкулоза, бронхиектазии, декубитални язви, хроничен пиелонефрит, остеомиелит и болест на Whipple, както и злокачествени неоплазми като Hodgkin лимфома, бъбречен карцином, карцином на червата, белия дроб и урогениталния тракт, базално клетъчен карцином и космато клетъчна левкемия.
АА пептид се отнася до един или повече от хетерогенна група пептиди, произхождащи от N-края на прекурсорен протеин на серумен амилоид A (ApoSSA), започващ при остатък 1,2 или 3 на прекурсорния белтък и завършващ при която и да е точка между остатъци 58 и 84; обикновено АА фибрили са изградени от остатъци 1-76 на ApoSSA. Могат да бъдат определени прецизните структури и състав, и да бъдат синтезирани съответни пептиди, съгласно методи известни в тази област (Liepnieks, J.J. et al., Biochim.Biophys.Acta 1270:81-86 (1995).
Като следващ пример, фрагменти произхождащи от Nкрайния участък, който съдържа целия или част от променливия (VL) домен на имуноглобуллиновите леки вериги (kappa или lambda верига), общо включват амилоидни отлагания в мезенхимни тъкани, предизвикващи периферна или автономна невропатия, carpal tunnel синдром (синдром на миньорска болест на китките), макроглосия, рестриктивна кардиомйопатия, артропатия на големите стави, имунна дискразия, миеломи, както и скрита дискразия. Препарати на изобретението предпочитано индуцират имунен отговор срещу част от леката верига , предпочитано срещу “неоепитоп” - един епитоп, който е образуван в резултат на фрагментиране на молекула предшественик - за редуциране на възможни автоимунни ефекти.
Различни наследствени амилоидни заболявания също са податливи за методите на третиране в настоящето изобретение. Такива заболявания са описани в Раздел В.2, по-горе. Например, различни форми на фамилна амилоидна полиневропатия са резултат на най-малко 50 мутантни форми на transthyretin (TTR), един 14 килодалтона белтък, произведен в черния дроб, всяка характеризираща се с единична аминокиселинна промяна. Докато много от формите на това заболяване са различими на базата на тяхната специална патология иЛгли демографски произход, преценява се, че лекарствените препарати могат също да бъдат съставени от агенти, които индуцират имунен отговор срещу повече от една форма на TTR, като смес от две или повече форми на ATTR, включително див тип TTR, за осигуряване на общо приложим лекарствен състав.
AapoAI-съдържащи амилоидни отлагания са намерени у лица, притежаващи точкови мутации в молекулата на аполипопротеин AI. Пациенти с тази форма на заболяване, общо проявяват периферна невропатия или бъбречна недостатъчност. Съгласно настоящето изобретение, лекарствените препарати са изготвени от една или повече от различните форми на AapoAl, описани тук или известни в тази област.
Известни фамилни форми на болестта на Alzheimer, както и синдром на Down, са резултат от мутации в бета амилоид прекурсорен протеин, предизвикващи отлагане на плаки с фибрили, изградени главно от β-амилоиден пептид (Αβ). Употребата на Αβ пептид в лекарствени препарати на настоящето изобретение е описана по-горе и е илюстрирана тук.
3Ί
Други комбинации за третиране на наследствени форми на амилоидози, обсъдени по-горе, включват препарати, които произвеждат имунен отговор срещу фрагменти на gelsolin, за лечение на наследствена системна амилоидоза, мутантен лизозимен белтък (Alys), за лечение на наследствена невропатия, мугантна алфа верига от фибриноген (AfibA) за една не-невропатна форма на амилоидоза, манифестирана като бъбречно заболяване, мутантен цистатинС (Acys) за лечение на една форма на наследствена мозъчна ангиопатия, съобщена в Исландия. В допълнение, известни наследствени форми на прион заболяване (например, болест на Creutzfeldt-Jacob (CJD), синдром на Gerstmann-Staussler-Scheinker (GSS) и фатална фамилна инсомниа (FFI) се характеризират с една мугантна изоформа на прион протеин, PrPSc. Този белтък може да бъде използуван в лекарствени препарати за лечение и профилактика на отлагане на РгР плаки, в съответствие с настоящето изобретение.
Както е обсъдено по-горе, амилоидно отлагане, системно или фокално, също е свързано с остаряването. В един следващ аспект на настоящето изобретение, отлагането може да бъде предотвратено или лекувано чрез въвеждане у податливи индивиди на препарати, състоящи се от един или повече белтъци, свързани с това остаряване. ® Така, плаки изградени от ATTR произхождащ от див тип TTR, често се откриват в сърдечна тъкан на индивиди с напреднала възраст. Подобно на това, някои възрастни индивиди развиват асимптомни фибриларни фокални отлагания на Αβ в техните мозъци; третиране с Αβ пептид, както е детайлизирано тук, може да бъде потвърдено у такива индивиди. β2 микроглобулин е чест компонент на corpora amylacea на простатата, и следователно е един следващ кандидат агент, съответно на настоящето изобретение.
Като следващ пример, но не като ограничение, има известен брой допълнителни, не-наследствени форми амилоидно заболяване, които са кандидати за методите за третиране на настоящето изобретение. β2 микроглобулинови фибриларни плаки обикновено се развиват у пациенти подложени продължително време на хемодиализа или перитонеална диализа. Такива пациенти могат да бъдат лекувани, чрез третиране с лекарствени препарати насочени срещу β2 микроглобулин или по-предпочитано, техни имуногенни епитопи, в съответствие с настоящето изобретение.
Хормон-секретиращи тумори могат също да съдържат хормон-производни амилоидни плаки съставът, на които общо е характерен за дадения засегнат ендокринен орган. Така, такива фибрили могат да бъдат изградени от полипептидни хормони, като калцитонин (медуларен карцином на щитовидната жлеза), островен амилоиден полипептид) появяващ се у повечето пациенти с Тип II диабет) и атриален натриуретичен пептид (изолиран от атриална амилоидоза). Препарати насочени срещу амилоидни отглагания, които се образуват в интимата на аортата при атеросклероза, също са планирани от настоящето изобретение. Например, Westermark et al., описват 69 аминокиселинен N-терминален фрагмент на аполипопротеин А, който образува такива плаки (Westermark, et al., Am.J.Path. 147: 1186-92, 1995); терапевтични препарати на настоящето изобретение включват имунологични реагенти, насочени срещу такъв фрагмент, както и самия фрагмент.
Горното обсъждане е фокусирано върху амилоидни фибрилни компоненти, които могат да бъдат използувани като терапевтични агенти за лечение и профилактика на различни форми на амилоидно заболяване. Терапевтичният агент може също да бъде активен фрагмент или аналог на естествено срещащ се или мугантен фибрилен пептид или белтък, който съдържа епитоп, индуциращ сходен предпазен или терапевтичен имунен отговор при въвеждане у човек. Имуногенните фрагменти обикновено имат една
последователност от най-малко 3, 5, 6, 10 или 20 съседни аминокиселини от природен пептид. Примерни Αβ пептидни имуногенни фрагменти включват Αβ1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3, 1-4, 112, 13-28, 17-28, 25-35, 35-40 и 35-42. При някои методи са използувани фрагменти, у които липсва поне една, понякога най-малко 5 или 10 С-крайни аминокиселини, които са налице у природно срещащите се форми на фибрилния компонент. Например, един фрагмент, у който липсват 5 аминокиселини от С-терминалния край на Αβ43, включва първите 38 аминокиселини от N-терминалния край на Αβ. Фрагменти от N-терминалната половина на Αβ са предпочитани в някои методи. Аналози включват алелни, видови и индуцирани варианти. Аналозите обикновено се различават от природно срещащите се пептиди при една или няколко позиции, често благодарение на консервативни замени. Аналозите обикновено проявяват най-малко 80 или 90% идентичност на последователността с природни пептиди. Някои аналози включват не-природни аминокиселини или модификации на N или С терминални аминокиселини. Примери за не-природни аминокиселини са α,αдизаместени аминокиселини, N-алкил аминокиселини, млечна киселина, 4-хидроксипролин, γ-карбокси-глутамат, γ-Ν,Ν,Νтриметиллизин, γ-Ν-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, Νформилметионин, 3-метилхистидин, 5-хидрокси-лизин, ω-Νметиларгинин.
Общо, специалистите в тази област ще оценят, че фрагменти и аналози, планирани в съответствие с този аспект на изобретението, могат да бъдат подбрани за кръстосана реактивност с природно срещащи се фибрилни компоненти и/йли терапевтична или профилактична ефикасност при трансгенни животински модели, както е описано по-долу. Такива фрагменти или аналози могат да бъдат използувани в терапевтични препарати на настоящето изобретение, ммвм ако тяхната имунореактивност и ефикасност върху животински модел е грубо еквивалентна на, или по-гол яма от съответни параметри, измерени за амилоидните фибрилни компоненти.
Такива пептиди, белтъци или фрагменти, аналози и други амилоидогенни пептиди, могат да бъдат синтезирани чрез твърдофазна пептидна синтеза или рекомбинантна експресия, съгласно стандартни методи известни в тази област, или могат да бъдат получени от природни източници. Примерни фибрилни препарати, методи за екстрахиране на фибрили, последователности на фибрилни пептидни или белтъчни компоненти са предоставени в много от цитираните литературни данни, във връзка с описанията на специфични фибрилни компоненти предоставени тук. В допълнение, други препарати, методи за екстрахиране и определяне на последователности са известни в тази област и са на разположение на лицата, желаещи да ползуват такива препарати. Автоматични пептидни синтезатори могат да бъдат използувани за изготвяне на такива препарати и са търговски достъпни от много производители, като Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, California) и процедури за изготвяне на синтетични пептиди са известни в тази област. Рекомбинантна експресия може да има в бактерии, като E.coli, дрожди, клетки от насекоми или клетки от бозайници; по избор, белтъци могат да бъдат произведени като се използува безклетъчна in vivo система за транслация, известна в тази област. Процедури за рекомбинантна експресия са описани от Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P.Press, NY 2d ed., 1989). Някои пептиди и белтъци също са търговски достъпни; например, някои форми на Αβ пептид се доставят от фирми като American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, California, и California Peptide Research Inc. Napa, California.
Терапевтични агенти могат също да бъдат съставени от подълги пептиди, които включват например, активен пептиден фибрилен фрагмент или аналог, заедно с други аминокиселини. Например, Αβ може да присъствува като интактен АРР белтък или негов сегмент, като С-100 фрагмента, който започва при N-края на Αβ и продължава до края на АРР. Такива полипептиди могат да бъдат скринирани за профилактична и терапевтична ефикасност върху животински модели, както е описано по-долу. Αβ пептидът, аналог, активен фрагмент или друг полипептид могат да бъдат въведени в асоциирана форма (т.е. ©като амилоиден пептид) или в дисоциирана форма. Терапевтични агенти могат също да включват мултимери на мономерни имуногенни агенти или конюгати, или белтъци носители, и/йли, както е отбелязано по-горе, могат да бъдат добавени към други фибрилни компоненти, за да осигурят по-широк диапазон от анти-амилоидна плака активност.
В следващ вариант, имуногенен пептид, като фрагмент от Αβ, може да бъде представен с вирус или бактерии, като част от имуногенен състав. Нуклеинова киселина, кодираща имуногенния пептид, е включена в генома или епизома на вируса или бактерията. По избор, нуклеиновата киселина е включена по такъв начин, че имуногенният пептид е експресиран като секретиран белтък или като © слет (фузионен) белтък с един белтък от външната повърхност на вирус или трансмембранен белтък на бактерия, така че пептидът да е проявен. Вируси и бактерии използувани в такива методи, трябва да бъдат непатогенни или атенюирани. Подходящи вируси включват аденовирус, HSV, Venezuelan equine encephalitis virus (вирус на венецуелски конски енцефалит) и други алфа вируси, вирус на везикуларния стоматит и други rhabdo вируси, vaccinia и fowl pox (пипка). Подходящи бактерии включват Salmonella и Shigella. Особено подходящо е сливане (фузия) на имуногенен пептид с HBsAg на HBV. Терапевтични агенти включват също пептиди и други съединения, които не притежават обезателно значително сходство на аминокиселинна последователност с Αβ, но независимо от това служат като миметици на Αβ и индуцират сходен имунен отговор. Например, всякакви пептиди и белтъци образуващи β-нагънати листа, могат да бъдат скринирани за пригодност. Могат да бъдат използувани анти-идиотипни антитела срещу моноклонални антитела срещу Αβ или други амилоидогенни пептиди. Такива анти-Id антитела могат да имитират антигена и да предизвикат имунен отговор спрямо него (виж Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, ф Palo Alto, 6th ed.), p.181). Агенти различни от Αβ пептидите ще индуцират имуногенен отговор срещу един или повече от предпочитаните сегменти на Αβ изброени по-горе (например, 1-10, 17, 1-3 и 3-7). Предпочитано, такива агенти индуцират имуногенен отговор, който специфично е насочен срещу един от тези сегменти, без да е насочен срещу други сегменти на Αβ.
Произволни библиотеки от пептиди или други съединения могат също да бъдат скринирани за пригодност. Комбинаторни библиотеки могат да бъдат произведени за много типове съединения, които могат да бъдат синтезирани по начин етап след етап. Такива • съединения включват полипептиди, бета-въртящи миметици, полизахариди, фосфолипиди, хормони, простагландини, стероиди, ароматни съединения, хетероциклични съединения, бензодиазепини, олигомерни-Ь1-заместени глицини и олигокарбамати. Големи комбинаторни библиотеки на съединенията могат да бъдат конструирани чрез метода на кодирани синтетични библиотеки (ESL), описан в Affymax, WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051. Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (всяка от които тук е включена чрез цитат за всякакви цели). Пептидни библиотеки могат също да бъдат създадени чрез методи на фагов дисплей. Виж например, Devlin, WO 91/18980.
Комбинаторни библиотеки и други съединения в началото са скринирани за пригодност, чрез определяне техния капацитет да се свързват с антитела или лимфоцити (В или Т), които са известни, че са специфични за Αβ или други амилоидогенни пептиди, като ATTR. Например, начален подбор може да бъде направен с всякакви поликлонални серуми или моноклонално антитяло срещу Αβ или друг амилоидогенен пептид от интерес. Съединения идентифицирани с такъв подбор, след това са анализирани за капацитет да индуцират антитела или реактивни лимфоцити срещу Αβ, или друг амилоидогенен пептид. Например, множествени разреждания на серуми могат да бъдат тестирани на микротитрационни платки, които са покрити предварително с фибрилен пептид и може да бъде направена стандартна ELISA , за тестиране на реактивни антитела срещу Αβ. След това съединенията могат да бъдат тестирани за профилактична и терапевтична ефикасност у трансгенни животни, предразположени към амилоидогенно заболяване, както е описано в Примерите. Такива животни включват например, мишки носещи 717 мутация на АРР, описани от Games et al. по-горе и мишки носещи 670/671 Шведска мутация на АРР, както е описана от McConlogue et al., US 5,612,486 и Hsiao et al., Science 274, 99 (1996)] Staufenbiel et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 13287-13292 (1997); Sturchler-Pierrat et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94, 13287-13292 (1997); Borchelt et al., Neuron 19, 939-945 (1997)). Същият подход за скриниране може да бъде използуван за други потенциални агенти, като фрагменти на Αβ, аналози на Αβ и по-дълги пептиди, включително Αβ, както е описано по-горе.
Ь. Други компоненти на плаката
Преценено е, че имунологични отговори насочени към други амилоидни компоненти на плаката, могат да бъдат ефективни при профилактика, забавяне или намаляване отлагането на плаки при амилоидни заболявания. Такива компоненти могат да бъдат минорни компоненти на фибрили или свързани с фибрили, или фибрилно образуване в плаките, с условието, че компоненти, които са повсеместни в тялото, или относително не-специфични за амилоидното отлагане, общо са по-малко подходящи за употреба като терапевтични прицелни места.
Следователно, следващо откритие на настоящето изобретение е, че агентите, които индуцират имунен отговор спрямо специфични компоненти на плаката, са полезни за третиране или предотвратяване прогресирането на амилоидни заболявания. Този раздел обосновава няколко примерни молекули, свързани с амилоидна плака. Индукция на имунен отговор срещу която и да е от тези молекули, самостоятелно или в комбинация с имуногенни терапевтични препарати срещу фибрилните компоненти, описани погоре, или срещу който и да е от другите не-образуващи фибрили компоненти, описани по-долу, предоставя допълнителен режим на анти-амилоидно третиране, в съответствие с настоящето изобретение. Също формираща част от настоящето изобретение, са схемите за пасивна имунизация, базирани на такива компоненти на плаката, както са тук описаните.
Като пример, синуклеин е белтък, който структурно е сходен с аполипопротеини, но е открит в невронален цитозол, по-специално в съседство със синаптичните окончания. Има най-малко три форми на белтъка, наречени α, β и γ синуклеин. Наскоро беше показано, че а и β синуклеин са ангажирани в нуклеацията на амилоидните отлагания при някои амилоидни заболявания, по-специално болестта на Alzheimer. (Clayton, D.F., et al., TINS 21 (6): 249-255, 1998). Поспециално, един фрагмент от NAC домена на а и β синуклеин (остатъци 61-95) е изолиран от амилоидни плаки при Alzheimer пациенти; този фрагмент съставлява около 10% от плаката, която остава неразтворима след разтваряне с натриев додецил сулфат (SDS). (George, J.M., et al. Neurosci. News 1:12-17,1995). По-нататък е съобщено, че пълноверижният а синуклеин и неговият NAC фрагмент ускоряват агрегацията на β-амилоиден пептид в неразтворим амилоид in vitro. (Clayton, по-горе).
Допълнителни компоненти свързани с амилоидни плаки включват не-пептидни компоненти. Например, перлекан и перлеканпроизводни гликозамингликани са големи хепарин сулфат протеогликани, които присъствуват в Αβ-съдържащи амилоидни плаки е при болестта на Alzheimer и други системни амилоидози на централната нервна система, включително амилинови плаки свързани с диабет. Показано е, че тези съединения повишават образуването на Αβ фибрили. Намерено е, че сърцевинният белтък и гликозаминогликанови вериги на перлекан участвуват в свързването с Αβ. Допълнителни гликозаминогликани, по-специално дерматан сулфат, хондроитин-4-сулфат и пентозан полисулфат, обикновено се намират в амилоидни плаки от различен тип и също е показано, че повишават образуването на фибрили. Декстран сулфат също има това свойство. Това повишение е значително редуцирано, когато молекулите са десулфатирани. Имуногенни терапевтични средства, насочени срещу © сулфатираните форми на гликозаминогликани, включително самите гликозаминогликани, формират допълнително изпълнение на настоящето изобретение, за първично или вторично третиране. Произвеждането на такива молекули, както и съответни лекарствени препарати съдържащи такива молекули, е във възможностите на специалиста в тази област.
2. Агенти индуциращи пасивен имунен отговор
Терапевтични агенти на изобретението включват също имунни реагенти, като антитела, които специфично се свързват с фибрилни пептиди или други компоненти на амилоидните плаки. Такива антитела могат да бъдат моноклонални или поликлонални и имат свързващи специфичности, които съответствуват на типа амилоидно заболяване, което е прицелно. Терапевтични препарати и схеми за третиране могат да включват антитела, насочени срещу един свързващ домен или епитоп на даден фибрил, или не-фибрилен компонент на плаката, или да включват антитела насочени срещу два или повече епитопи на същия компонент, или аантитела насочени срещу епитопи на множество компоненти на плаката.
• Например, в експерименти направени в подкрепа на настоящето изобретение, на 81/2 до 101/гмесечни PDAPP мишки са правени интраперитонеални (i.p.) инжекции с поликлонално анти-Ар42 или моноклонално анти-Αβ антитяло, изготвени срещу специфични епитопи на Αβ пептид, или с физиологичен разтвор, както е детайлизирано тук в Пример XI. В тези експерименти са контролирани концентрациите на циркулиращи антитела и са правени бустерни инжектирания, необходими да подържат концентрацията на циркулиращото антитяло по-висока от 1:1000, по отношение на специфичния антиген, срещу който е направено антитялото. Наблюдавани са понижения на тоталните Αβ нива в сравнение с © контролните, в корови, хипокампални и малкомозъчни области на третирани с антитяло мишки; най-голямо намаление при тези експерименти са показали мишки третирани с поликлонални антитела.
В следващи експерименти направени в подкрепа на изобретението, е използуван предсказващ in v/уотест (Пример XIV) за проверка изчистването с едно антитяло срещу фрагмент от синуклеин, означен като NAC. Показано е, че синуклеин е свързан с белтък от амилоидна плака. Антитяло срещу NAC е поставяно в контакт с проба от мозъчна тъкан, съдържаща амилоидни плаки и микроглиялни клетки. Като контрола е използуван заешки серум. Последващо мониториране показва подчертано намаление броя и големината на плаките, което е показателно за изчистваща активност на антитялото.
От тези данни става ясно, че натрупването на амилоидни плаки, свързано с болестта на Alzheimer или други амилоидни заболявания, може значително да бъде намалено чрез въвеждане на имунни реагенти насочени срещу епитопи на Αβ пептид или срещу NAC фрагмент на синуклеин, които са ефективни за редуциране натрупването на амилоидни плаки. По-нататък е изяснено, че може да бъде използувано голямо разнообразие от антитела за такива препарати. Антитела, които специфично се свързват с агрегираната форма на Αβ без да се свързват с дисоциираната форма, са подходящи за употреба в изобретението, каквито са и антитела, които специфично се свързват с дисоциираната форма, без да се свързват с агрегираната форма. Други подходящи антитела са свързват и с двете- агрегираната и дисоциираната форми. Някои такива антитела се свързват с природно срещащата се къса форма на Αβ (т.е., Αβ39, 40 или 41), без да се свързват с природно срещащата се дълга форма на Αβ (т.е., Αβ42 и Αβ43). Някои антитела се свързват с дълга форма, без да се свързват с къса форма. Някои антитела се свързват с Αβ без да се свързват с пълноверижния амилоиден прекурсорен белтък. Някои антитела се свързват с Αβ, със свързващ афинитет по-голям от или равен на около 10s, 107,10s, 109 или Ю10 М'1.
Поликлонални серуми обикновено съдържат смесени популации от антитела, свързващи се с някои епитопи по дължината на Αβ. Моноклонални антитела се свързват със специфичен епитоп в Αβ, който може да бъде конформационен или неконформационен епитоп. Някои моноклонални антитела се свързват с епитоп в обсега на остатъци 1-28 на Αβ (с първият N терминален остатък на природен Αβ означен 1). Други моноклонални антитела се свързват с епитоп с остатъци 1-10 на Αβ. Има също моноклонални антитела, които се свързват с епитоп с остатъци 1-16 на Αβ. Други моноклонални антитела се свързват с епитоп с остатъци 1-25 на Αβ. Някои моноклонални антитела се свързват с епитоп в обсега на аминокиселини 1-5, 5-10,10-15, 15-20,25-30,10-20, 20, 30 или 10-25 от Αβ. Профилактична и терапевтична ефикасност на антитела може да бъде тестиране като се използуват процедури на трансгенен животински модел, описани в Примери.
По-общо, от данните представени тук, практикуващият специалист може да планира, произведе и тестира антитела насочени срещу фибрилни белтъци или пептиди, характерни за други амилоидни заболявания, като заболяванията описани тук в Раздел 2, като се използуват препарати описани тук, както и антитела срещу други амилоидни компоненти.
а. Общи характеристики на имуноглобулини
Основната антитяло структурна единица е известно, че съдържа един тетрамер от субединици. Всеки тетрамер е съставен от два идентични чифта от полипептидни вериги, всеки чифт притежава една “лека” (около 25 kDa) и една “тежка” верига (около 50-70 kDa). Амино-терминалната част на всяка верига съдържа една променлива област от около 100 до 110 или повече аминокиселини, първично отговорни за антигенното разпознаване. Карбокси-терминалната част на всяка верига определя една константна област, първично отговорна за ефекторната функция.
Леки вериги са класифицирани като kappa или lambda. Тежки вериги са класифицирани като gamma, mu, alpha, delta или epsilon и определят антитяло изотипа като IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, съответно. В леките и тежки вериги, променливите и константни области са свързани с една “J” област от около 12 или повече аминокиселини, с тежката верига включваща също една “D” област от около 10 повече аминокиселини. (Виж общо, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989). Ch.7 (включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви цели).
Променливите области на всеки лека/гежка верига чифт, формират антитяло свързващото място. Така, едно антитяло има две свързващи места. С изключение при бифункционални или биспецифични антитела, двете свързващи места са еднакви. Целите вериги проявяват същата обща структура на относително консервативни области на рамката (FR), свързани чрез три хиперпроменливи области, наречени също определящи комплементарността области или CDRs. CDRs от двете вериги на всеки чифт са подредени от рамковите области, правещи възможно свързването със специфичен епитоп. От N-края до С-края, и двете лека и тежка вериги, съдържат домените FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Определянето на аминокиселините към всеки домен е в съответствие с дефинициите на Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987 and 1991), или Chothla & Lesk, J.Mol.Bioi. 196: 901-917 (1997); Chothia et al., Nature 342. 878-883 (1989).
b. Получаване на не-човешки антитела
Получаването на не-човешки моноклонални антитела, например, миши, от морски свинчета, заешки или плъши, може да бъда изпълнено например, като се имунизира животно с компонент от плака, като Αβ или други фибрилни компоненти. Може да бъде използуван по-дълъг пептид съдържащ Αβ, или един имуногенен фрагмент на Αβ, или анги- идиотипни антитела срещу едно антитяло срещу Αβ. Виж например, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (включена чрез цитат за всякакви цели). Такъв имуноген може да бъде получен от природен източник, чрез
пептидна синтеза или чрез рекомбинантна експресия. По избор, имуногенът може да бъде въведен слет или комплексиран по друг начин с белтък носител, както е описано по-долу. По избор, имуногенът може да бъде въведен с адювант. Могат да бъдат използувани няколко типа адюванти, както е описано по-долу. Пълен адювант на Freund последван от непълен адювант е предпочитан за имунизации на лабораторни животни. Зайци и морски свинчета обикновено са използувани за получаване на поликпонални антитела. Мишки обикновено са използувани за получаване на моноклонални антитела. Антителата са скринирани за специфично свързване с имуногена. По избор, антителата по-нататък са скринирани за свързване със специфичен участък на имуногена. Например, в случая на Αβ пептид като имуноген, скринирането може да бъде направено чрез определяне свързването на една антитяло с набор от делетирани мутанти на Αβ пептид и определяне кои делетирани мутанти се свързват с антитялото. Свързването може да бъде определено например, чрез Western blot или ELISA. Най-малкият фрагмент, който показва специфично свързване с антитялото, определя епитопа на антитялото. Алтернативно, специфичността на епитопа може да бъде определена чрез конкурентен тест, при който тестирането и референтно антитяло конкурират за свързване с компонента. Ако тестираното и референтното антитела конкурират, тогава те се свързват със същия епитоп или епитопи достатъчно близко, така че свързването на едно антитяло повлиява свързването на другото.
с.Химерни и хуманизирани антитела
Химерни и хуманизирани антитела имат същата или сходна свързваща специфичност и афинитет, както мишо или друго нечовешко антитяло, което предоставя началния материш1 за конструиране на химерно или хуманизирано антитяло. Химерни антитела са антитела, чиито гени за лека и тежка верига са конструирани, обикновено с генно инженерство, от сегменти на имуноглобулинови гени, принадлежащи на различни видове. Например, променливите (V) сегменти на гените от едно мишо моноклонално антитяло, могат да бъдат свързани с човешки константни (С) сегменти, такива като lgG1 и lgG4. Така, типичното химерно антитяло е хибриден белтък, състоящ се от V или антигенсвързващ домен от едно мишо антитяло и С или ефекторен домен от човешко антитяло.
Хуманизирани антитела имат остатъци на променливата регионална рамка главно от човешко антитяло (наречено акцепторно антитяло) и области определящи комплементарността предимно от мишо антитяло (означено като донорен имуноглобулин). Виж, Queen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 : 10029-10033 (1989) и WO 90/07861, US 5,693,762, US 5,693,761, US 5,585,089, US 5,530,101 и Winter, US 5,225,539 (включени чрез цитат в тяхната цялост за всякакви цели). Константната област(и), ако са налице, също са предимно или изцяло от човешки имуноглобулин. Човешките променливи домени обикновено са избрани от човешки антитела, чиито последовател-
ности на рамката проявяват висока степен идентичност на последователността с миши променливи регионални домени, от които произхождат CDRs. Остатъците на тежката и лека верига на променливата регионална рамка, могат да произхождат от същите или различни човешки антитяло последователности. Човешките антитяло последователности могат да бъдат последователностите на природно срещащи се човешки антитела или могат да бъдат консензус последователности на няколко човешки антитела. Виж Carter et al., WO 92/22653. Някои аминокиселини от остатъци на човешка променлива регионална рамка, са подбрани за замени въз основа на тяхното възможно влияние върху CDR конформацията и/йли свързването с антиген. Проучване на такива възможни повлиявания е чрез моделиране, изпитване характеристиките на аминокиселините в специални локализации или емпирично наблюдение на ефектите от замяна или мутагенеза на дадени аминокиселини.
Например, когато една аминокиселина различава между остатък от миша променлива регионална рамка и избран остатък на човешка променлива регионална рамка, аминокиселината на човешка рамка, обикновено ще бъде заменена с еквивалентна аминокиселина от рамката от мишото антитяло, когато основателно се очаква, че аминокиселината:
(1) свързва директно антиген не-ковалентно, (2) е в съседство с CDR област, (3) в друго отношение взаимодействува с CDR област (например е в обсега на около 6 А на CDR област), или (4) участвува в VL-VH граничната повърхност.
Други кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които са необичайни за човешки имуноглобулин в тази позиция. Тези аминокиселини могат да бъдат заменени с аминокиселини от еквивалентна позиция на мишо донорно антитяло или от еквивалентните позиции на по-типични човешки имуноглобулини. Други кандидати за замяна са аминокиселини на акцепторна човешка рамка, които са необичайни за човешки имуноглобули в тази позиция. Променливите регионални рамки на хуманизирани иммуноглобулини, обикновено показват най-малко 85% идентичност на последователността с последователност на променлива регионална рамка или консензус на такива последователности.
d. Човешки антитела
Човешки антитела срещу Αβ са предоставени с различни техники, описани по-долу. Някои човешки антитела са подбрани чрез експерименти за конкурентно свързване, или другояче, да имат същата специфичност на епитопа както дадено мишо антитяло, такова като мишите моноклонални антитела, описани в Пример XI. Човешки антитела могат също да бъдат подбрани за специфичност на определен епитоп, като се използува само един фрагмент на Αβ като имуноген, и/или чрез подбор на антитела срещу един набор от делетирани мутанти на Αβ.
(1)Триома методология
Основният подход и един примерен участник в клетъчната фузия, SPAZ-4, за приложение при този подход, са описани от Oestberg et a., Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, U.S. Patent No. 4,634,664; и Engleman et al., US Patent 4,634,666 (всяка, от които е включена чрез цитат в нейната цялост и за всякакви случаи). Антитяло-произвеждащите клетъчни линии, получени по този метод са наречени триоми, тъй като те са произхождащи от три клетки - две човешки и една миша. Начално, една миша миеломна линия е слята с човешки В-лимфоцит за получаване на не-антитяло-произвеждаща ксеногенна хибридна клетка, като SPAZ-4 клетъчната линия, описана от Oestberg, по-горе. След това ксеногенната клетка е слята с един имунизиран човешки В-лимфоцит, за получаване на ангитялопроизвеждаща триомна клетъчна линия. Намерено е, че триомите произвеждат антитяло по-стабилно, отколкото обичайните хибридоми получени от човешки клетки.
Имунизираните В-лимфоцити са получени от кръв, слезка, лимфни възли или костен мозък на донор човек. Ако са желани антитела срещу специфичен антиген или епитоп, предпочита се да се използува този антиген или негов епитоп за имунизация. Имунизацията може да бъде in vivo или in vitro. За in vivo имунизация, В клетки обикновено се изолират от човек имунизиран с Αβ, негов фрагмент, по-голям пептид съдържащ Αβ или фрагмент, или антиидиотипно антитяло срещу антитяло срещу Αβ. В някои методи, В клетки са изолирани от същия пациент, на когото накрая ще бъде приложена антитяло терапия. За in vivo имунизация, В-лимфоцити обикновено са изложени на антиген за един период от 7-14 часа в среда като RPMI-1640 (виж Engieman, по-горе) допълнена с 10% човешка плазма.
Имунизираните В-лимфоцити са слети с една ксеногенна хибридна клетка като SPAZ-4 , с помощта на добре известни методи. Например, клетките са третирани с 40-50% полиетилен гликол с мол.тегло 1000-4000, при около 37°С за около 5-10 минути. Клетките са отделяни от сместа за фузия и са развивани в селективна среда за желаните хибриди (например, НАТ или АН). Клоновете секретиращи антитела с изискваната свързваща специфичност, са идентифицирани чрез тестиране на триомната култура за способност да се свързва с Αβ или негов фрагмент. Триоми, произвеждащи човешки антитела с желаната специфичност са субклонирани чрез техниката на ограничаващо разреждане и са развивани in vitro в среда за култивиране. Получените триома клетъчни линии след това са тестирани за способност да се свързват с Αβ или негов фрагмент.
Въпреки че триомите са стабилни, те не произвеждат антитела в много високи нива. Експресионните нива могат да бъдат повишени чрез клониране антитяло гените от триома в един или повече експресионните вектори и трансформиране на вектора в стандартни клетъчни линии от бозайници, бактерии или дрожди, съгласно методи добре известни в тази област.
(2) Трансгенни не-човешки бозайници
Човешки антитела срещу Αβ могат също да бъдат получени от не-човешки трансгенни бозайници, притежаващи трансгени, кодиращи най-малко един сегмент от човешкия имуноглобулинов локус. Обикновено, ендогенният имуноглобулинов локус на такива трансгенни бозайници е функционално неактивен. Предпочитано, сегментът от човешкия имуноглобулинов локус включва не-прередени последователности на компоненти от лека и тежка верига. Инактивация на ендогенни имуноглобулинови гени и въвеждане на 0 ендогенни имуноглобулинови гени могат да бъдат постигнати чрез прицелна хомоложна рекомбинация, или чрез въвеждане на YAC хромозоми. Трансгенните животни получени от този процес са способни на функционално пренареждане последователностите на имуноглобулиновия компонент и експресиране на набор антитела от различни изотипове, кодирани от човешки имуноглобулинови гени, без да се експресират ендогенни имуноглобулинови гени. Получаването и свойствата на бозайници, притежаващи тези свойства са описани подробно от например, Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016 US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US ® 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991) (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви случаи). Трансгенни мишки са особено подходящи в това отношение. Анти-Αβ антитела са получени чрез инжектиране на трансгенен не-човешки бозайник, какъвто е описан от Lonberg или Kucherlapati, по-горе, с Αβ или негов фрагмент. Моноклонални антитела са получени чрез, например сливане на Вклетки от такива бозайници с подходящи миеломни клетъчни линии, като се използува конвенционална Kohler-Milstein технология. Човешки поликлонални антитела могат също да бъдат предоставени във формата на серум от хора имунизирани с имуногенен агент. По избор, такива поликлонални антитела могат да бъдат концентрирани чрез афинитетно пречистване като се използува Αβ или друг имуноген амилоиден пептид като афинитетен реагент.
(3) Фагов дисплей методи
Следващ подход за получаване на анти-Αβ антитела е да се скринира една ДНК библиотека от човешки В клетки, съгласно общия протокол очертан от Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989). Например, както е описано за триома методологията, такива В клетки могат да бъдат получени от човек имунизиран с Αβ, фрагменти, поголеми полипептиди съдържащи Αβ или фрагменти, или антиидиотипни антитела. По избор, такива В клетки са получени от пациент, който в крайна сметки ще получи третиране с антитела. Подбрани са антитела свързващи се с епитоп на амилоидния компонент, който представлява интерес, като Αβ или негов фрагмент. След това последователности кодиращи такива антитела (или свързващи фрагменти) са клонирани и амплифицирани. Протоколът описан от Huse е направен по-ефективен в комбинация с фаговдисплей технология. Виж, например Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 7,733,743 и US 5,565,332 (всяка от които е включена чрез цитат в нейната цялост за всякакви случаи). При тези методи, са получени библиотеки на фаги, при които членовете проявяват различни антитела по тяхната външна повърхност.
Антитела обикновено са проявени като Fv или Fab фрагменти. Фаги проявяващи антитела със желана специфичност, са подбрани чрез афинитетно обогатяване срещу един Αβ пептид или негов фрагмент.
В един вариант на фагов-дисплей метод, могат да бъдат получени човешки антитела, притежаващи свързваща специфичност на подбрано мишо антитяло. Виж Winter, WO 92/20791. При този метод е използувана променливата област на тежката или леката верига на подбрано мишо антитяло като изходен материал. Ако например, като изходен материал е избрана променливата област на лека верига, конструирана е фагова библиотека, в която членове проявяват същата променлива област на леката верига (т.е. мишият изходен материал) и една различна променлива област на тежката верига. Променливите области на леката верига, са получени от библиотека на пренаредени променливи области на човешка тежка верига. Подбран е фаг, показващ силна свързваща специфичност за компонента от интерес (например, най-малко 108 и предпочитано най-малко 1О10 М’1). Променливата област на човешка тежка верига от този фаг след това служи като изходен материал за конструиране на следваща фагова библиотека. В тази библиотека, всеки фаг проявява същата променлива област на тежката верига (т.е. областта идентифицирана от първата дисплей библиотека) и различна променлива област на леката верига. Променливите области на леката верига са получени от библиотека на пренаредени човешки променливи области на леката верига. Отново, подбран е фаг проявяващ силна свързваща специфичност за амилоиден пептиден компонент. Тези фаги проявяват променливите области на напълно човешки антиамилоидни пептидни антитела. Тези антитела обикновено имат същата или сходна специфичност на епитопа както мишия изходен материал.
е. Подбор на константна област
Променливите области на тежки и леки вериги на химерни, хуманизирани или човешки антитела, могат да бъдат свързани с наймалко една част от човешка постоянна област. Изборът на константна област зависи отчасти, от това дали е желан антитяло-зависим комплемент и/или клетъчно медиирана токсичност. Например, изотипи lgG1 и lgG3 имат същата активност на комплемента и изотипи lgG2 и lgG4 нямат. Избор на изотип може също да повлияе преминаването на антитяло в мозъка. Константни области на лека верига могат да бъдат lambda или kappa. Антитела могат да бъдат експресирани като тетрамери, съдържащи две леки и две тежки вериги, като отделни тежки вериги, леки вериги, като Fab, Fab’ F(ab’)2 и Fv, или като едноверижни антитела, в които променливи домени на тежка и лека верига са свързани чрез спейсър.
f. Експресия на рекомбинантни антитела
Химерни, хуманизирани и човешки антитела обикновено са произвежани чрез рекомбинантна експресия. Рекомбинантни полинуклеотидни конструкти обикновено включват една контролираща експресията последователност, оперативно свързана с кодиращите последователности на антитяло вериги, включително естественосвързани или хетероложни промоторни области. Предпочитано, контролиращите експресията последователности са еукариотни промоторни системи във вектори, способни да трансформират или трансфектират еукариотни клетки гостоприемници. Веднъж въведен вектора в подходящ гостоприемник, гостоприемникът се подържа в подходящи условия за високо ниво на експресия на нуклеотидните последователности, и събирането и пречистването на кръстосано реагиращи антитела.
Тези експресионни вектори обикновено са реплицируеми в организмите гостоприемници, като епизоми или като интегрална част от хромозомната ДНК на гостоприемника. Обикновено, експресионните вектори съдържат селекционни маркери, например, ампицилин-резистентност или хигромицин-резистентност, което да позволи откриването на клетки, които са трансформирани с желани последователности на ДНК.
E.coli е прокариотен гостоприемник, особено полезен за клониране на ДНК последователности на настоящето изобретение. Микроорганизми, като дрожди също са полезни за експресия. Saccharomyces са предпочитан гостоприемник от дрожди, с подходящи вектори, притежаващи контролиращи експресията последователности, начало на репликация, завършващи последователности и подобни, според желанието. Типични промотори включват 3-фосфоглицерат киназа и други гликолитични ензими. Индуцируеми промотори на дрожди включват, между другото, промотори на алкохол дехидрогеназа, изоцитохром С и ензими, отговорни за оползотворяване на малтоза и галактоза.
Клетки от бозайници са предпочитан гостоприемник за експресиране на нуклеотидни сегменти, кодиращи имуноглобулини или техни фрагменти. Виж Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, NY, 1987). Разработени са известен брой подходящи за гостоприемник клетъчни линии, способни за подбор на интактни хетероложни белтъци и включват СНО клетъчни линии, различни COS клетъчни линии, HeLa клетки, L клетки и миеломни клетъчни линии. Експресионни вектори за тези клетки могат да включват контролиращи експресията последователности, като начало на репликацията, промотор, енхенсер (Queen et al., ImmunoLRev. 89:49 (1986)), и необходими за процесирането информационни места, като свързващи рибозоми места, места за РНКснаждане, места на полиаденилиране и завършващи транскрипцията последователности. Предпочитани контролиращи експресията последователности са промотори, произхождащи от ендогенни гени, цитомегаловирус, SV40, аденовирус, говежди папилома вирус и подобни. Виж, Co et al., JJmmunol. 148:1149(1992).
Алтернативно, антитяло кодиращи последователности могат да бъдат включени в трансгени за въвеждане в генома на трансгенни животни и последваща експресия в млякото на трансгенно животно (например, съгласно методи описани в UD 5,741,957, US 5,304,489, US 5,849,992, всички включени тук чрез цитат в тяхната цялост). Подходящи трансгени включват кодиращи последователности за лека и/или тежка верига, в оперативна връзка с промотор или енхенсер от специфичен ген за млечна жлеза, като казеин или бета лактоглобулин.
Вектори съдържащи ДНК сегментите, които представляват интерес, могат да бъдат пренесени в клетката гостоприемник с добре известни методи, в зависимост от типа клетъчен гостоприемник. Например, трасфекция с калциев хлорид обикновено е използувана за прокариотни клетки, докато третиране с калциев фосфат, електропорация, липофекция, biolistics или трансфекция на базата на вирус, могат да бъдат използувани за други клетъчни гостоприемници. Други методи използувани за трансфопмиране клетки от бозайници включват използуването на полибрен, сливане на протопласти, липозоми, електропорация и микроинжектиране (виж общо, Sambrook et al., по-горе). За произвеждане на трансгенни животни, трансгени могат да бъдат микроинжектирани в оплодени ооцити или могат да бъдат включени в генома на ембрионални стволови клетки, и ядрата на такива клетки да бъдат пренесени в енуклеирани ооцити.
Веднъж експресирани, антителата могат да бъдат пречистени съгласно стандартни процедури в тази област, включително HPLC пречистване, колонна хроматография, гелна електрофореза и подобни (виж общо, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982)).
4. Други терапевтични агенти
Терапевтични агенти за приложение в настоящите методи включват също Т-клетки, които се свързват с компонент на плака, като Αβ пептид. Например, Т-клетки могат да бъдат активирани срещу Αβ пептид, чрез експресиране на човешки МНС клас I ген и човешки β-261 микроглобулин ген от една клетъчна линия от насекоми, при което се формира празен комплекс по повърхността на клетките и може да се свързва с Αβ пептид. Т-клетки, които са били в контакт с клетъчната линия стават специфично активирани срещу пептида. Виж Peterson et al., US 5,314,813. Клетъчни линии от насекоми, експресиращи МНС клас II антиген, могат подобно да бъдат използувани да активират CD4 Т-клетки.
5. Носители белтъци
Някои агенти за индуциране на имунен отговор съдържат съответния епитоп за индуциране на имунен отговор срещу амилоидни отлагания, но са твърде малки за да бъдат имуногенни. В такъв случай, пептиден имуноген можа да бъде свързан с подходящ носител за да подпомогне предизвикването на имунен отговор. Подходящи носители включват серумни албумини, keyhole limpet hemocyanin, имуноглобулинови молекули, тироглобулин, овалбумин, тетанус токсоид или токсоид от други патогенни бактерии, като дифтерия, Е.со//, холера или Н.pylori, или атенюирано токсиново производно. Други носители включват Т-клетьчни епитопи, които се свързват с множествени МНС алели, например, най-малко 75% от всички човешки МНС алели. Такива носители понякога са известни в тази област като “универсални Т-клетъчни епитопи”. Примери за универсални Т-клетъчни епитопи включват:
Инфлуенца хемаглугинин: НА307-319 PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO: 1)
PADRE (общи остатъци са надебелени) AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2)
Малария CS: ТЗ епитоп EKKIAKMEKASSVFNV (SEQ ID NO: 3)
Хепатит В повърхностен антиген: HBsAgi^s FFLLTRILTI (SEQ ID
NO: 4)
Heat Shock Protein 65: hsp65163.i7i DQSIGDLIAEAMDKVGNEG (SEQ ID NO: 5)
Bacille Calmette-Guerin QVHFQPLPPAWKL (SEQ ID NO: 6) Тетанус токсоид: ΤΤ830.β44 QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 7) Тетенус токсоид: TWae? FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 8)
HIV gp120 T1: KQIINMWQEVGKAMYA. (SEQ ID NO: 9)
Други носители за стимулиране или повишаване на имунния отговор включват цитокини като IL-1, IL-1a и β пептиди, IL-2, yINF, IL10, GM-CSF и хемокини, като М1Р1а и β и RANTES. Имуногенни агенти могат съицо да бъдат свързани с пептиди, които повишават транспорта през тъкани, както е описано в O’Mahony, WO 97/17613 и WO 97/17614.
Имуногенни агенти могат да бъдат свързани с носители чрез химично кръстосано свързване. Техники за свързване на имуноген с носител включват образуване на дисулфидни връзки, като се използува №сукцинимидил-3-(2-пиридил-тио)пропионат (SPDP) и сукцинимидил 4-(№малеимидометил)цикпохексан-1-карбоксилат (SMCC) (ако пептидът няма сулфхидрилна група, такава може да бъде осигурена чрез добавка на цистеинов остатък). Тези реагенти създават една дисулфидна връзка между тях и пептидни цистеинови остатъци на белтъка и една амидна връзка чрез ε-амино на лизин, или други свободни амино групи в други аминокиселини. Различни такива дисулфид/амид-образуващи агенти са описани в Immun.Rev. 62, 185 (1982). Други бифункционални свързващи агенти образуват по-скоро тиоетер отколкото дисулфидна връзка. Много от тези тио-етеробразуващи агенти са търговски достъпни и включват реактивни естереи на 6-малеимидокапронова киселина, 2-бромоцетна киселина и 2-йодоцетна киселина, 4-(№малеимидо-метил)циклохексан-163 карбоксилова киселина. Карбоксилните групи могат да бъдат активирани чрез комбинирането им със сукцинимид или 1-хидрокси-2нитро-4-сулфонова киселина, натриева сол.
Имуногенни пептиди могат също да бъдат експресирани като слети белтъци с носители (т.е. хетероложни пептиди). Имуногенният пептид може да бъде свързан при неговия амино- край, неговия карбокси- край или и при двата с носител. По избор, множествени повтори на имуногенния пептид могат да бъдат налице в слетия белтък. По избор, имуногенният пептид може да бъде свързан с множествени копия на хетелорожен пептид,например, при двата N и С краищата на пептида. Някои носители пептиди служат да индуцират отговор на помощна Т клетка срещу пептида носител. Индуцираните помощни Т-клетки на свой ред индуцират В-клетъчен отговор срещу имуногенния пептид, свързан с носителя пептид.
Някои агенти на изобретението съдържат слят белтък, в който един N-краен фрагмент от Αβ е свързан при неговия С-край с носител пептид. При някои агенти, N-терминалният остатък на фрагмента от Αβ съставлява N-крайния остатък на слетия белтък. Съответно, такива слети белтъци са ефективни при индуциране на антитела, които се свързват с епитоп, който изисква N-терминалният остатък на Αβ да бъде в свободна форма. Някои агенти на изобретението съдържат множество от повтори на един N-терминален сегмент от Αβ, свързан при С-края с едно или повече копия на носител пептид. N-терминалният фрагмент на Αβ, включен в такива слети белтъци, понякога започва при Αβ1-3 и завършва при Αβ7-11. Αβ1-7, Αβ1-3, 1-4, 1-5 и 3-7 са предпочитан N-краен фрагмент от Αβ. Някои слети белтъци съдържат различни N-крайни сегменти от Αβ в тандем. Например, един слят белтък може да съдържа Αβ1-7, следван от Αβ1-3, следван от хетероложен пептид.
При някои слети (фузионни) белтъци, N-терминален сегмент от Αβ е слят при неговия N-терминален край с хетероложен носител пептид. Същото разнообразие от N-терминални сегменти от Αβ може да бъде използувано както при С-терминални сливания. Някои слети белтъци съдържат хетероложен пептид, свързан с N-края на един Νтерминален сегмент от Αβ, който на свой ред е свързан с един или повече допълнителни N-терминални сегменти от Αβ в тандем.
Някои примери на слети белтъци, подходящи за приложение в изобретението, са показани по-долу. Някои от тези слети белтъци съдържат сегменти от Αβ свързани с епитопи на тетанус токсоид, такива както са описани в US 5,196,512, ЕР 378,881 и ЕР 427,347. Някои слети белтъци съдържат сегменти от Αβ, свързани с носители пептиди, описани в US 5,736,142. Някои хетероложни пептиди са универсални Т-клетъчни епитопи. В някои методи, агентът за въвеждане е просто единичен слят белтък с един Αβ сегмент, свързан с хетероложен сегмент в линейна конфигурация. В някои методи, агентът е мултимер на слети белтъци, представени с формулата 2Х, в която х е цяло число от 1-5. Предпочитано х е 1,2 или 3, като 2 е найпредпочитано. Когато х е две, такъв мултимер има четири слети белтъци, свързани в предпочитана комбинация, означена като МАР4 (виж US 5,229,490). Епитопите на Αβ са подчертани.
МАР4 конфигурацията е показана по-долу, където разклонените структури са получени чрез иницииране на пептидна синтеза при N терминалните и тези на страничната верига амини на лизин. В зависимост от броя пъти, когато лизин е включен в последователността и има възможност да се разклонява, получената структура ще представя множество N краища. При този пример, са получени четири идентични N краища на разклонената лизинсъдържаща сърцевина. Такава множественост силно повишава готовността за отговор на сродни В клетки.
Пептид-^,
Пептид*^
KGG
Пептид
Пептид
AN90549 (Αβ 1-7/тетанус токсоид 830-844 в МАР4 конфигурация): DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 10)
AN90550 (Αβ 1-7/тетанус токсоид 947-967 в МАР4 конфигурация): DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 11)
AN90542 (Αβ 1-7/гетанус токсоид 830-844+ 947-967 в линейна конфигурация):
DAEFRHDQYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 12)
AN90576: (Αβ 3-9)/гетанус токсоид 830-844 в МАР4 конфигурация):
EFRHDSGQYUKANSKFIGITEL (SEQ ID N0: 3)
Пептид описан в US 5,736,142 (изцяло в линейна конфигурация)
AN90562 (Αβ 1-7/пептид) AKXVAAWTLKAAADAEFRHD (SEQ ID NO: 14)
ΑΝ90543(Αβ1-7χ3/πβπτπΑ):
DAEFRHDDAEFRHDDAEFRHDAKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15)
Други примери на слети белтъци (имуногенен епитоп на Αβ подсилен) включват
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHDzDAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO:
16)
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 17)
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 18)
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 19)
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR (SEQ ID NO: 20)
PKYVKQNTLKLAT- DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD (SEQ ID NO: 21)
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- DAEFRHD (SEQ ID NO: 22) DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO:
23)
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT (SEQ ID NO. 24) DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNVQYIKANSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 25) DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 26)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEDAEFRHD (SEQ ID NO: 27)
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 238) на една двуразклонена верига пептид lys-Gly-Cys пептид
EQVTNVGGAISQAVHAAHAEINEAGR (синуклеин слет белтък в МАР-4 конфигурация; SEQ ID NO: 29)
Същите или сходни белтъци носители и методи на свързване могат да бъдат използувани за създаване на иммуногени, за употреба при създаване на антитела срещу Αβ, за приложение при пасивна имунизация. Например, Αβ или един фрагмент, свързани с носител, могат да бъдат въвеждани на лабораторни животни при произвеждането на антитела срещу Αβ.
6. Нуклеинова киселина кодираща терапевтични агенти
Имунни отговори срещу амилоидни отлагания, могат също да бъдат ицдуцирани чрез въвеждане на нуклеинови киселини, кодиращи
подбрани пептидни имуногени, или антитела и техните компоненти вериги да бъдат използувани за пасивна имунизация. Такива нуклеинови киселини могат да бъдат ДНК или РНК. Сегмент на нуклеинова киселина, кодиращ имуноген, обикновено е свързан с регулаторни елементи, като промотор и енхенсер, което позволява експресия на ДНК сегмента в предвидени прицелни клетки на пациент. За експресия в кръвни клетки, както е желателно за индукция на имунен отговор, промоторни и енхенсерни елементи от гени на лека или тежка верига на имуноглобулин или CMV главен междинен ранен промотор и енхенсер, са подходящи за насочване на експресията. Свързаните регулаторни елементи и кодиращи последователности, често са клонирани в един вектор. За въвеждане на двойноверижни антитела, двете вериги могат да бъдат клонирани в един и същи или в отделни вектори.
На разположение са известен брой вирусни вектори, включително ретровирусни системи (виж например, Lawrie and Tumin, Cur.Opin.Genet.Develop. 3, 102-109, 1993); адено-свързани вирусни вектори (виж например, Zhou et al.,J.Exp.Med. 179, 1867, 1994), вирусни вектори от шарковото семейство, включително vaccinia вирус и птичите шаркови вируси, вирусни веектори от alpha virus genus като тези произхождащи от Sindbis and Semiliki Forest Viruses (виж, например, Dubensky et al., J.Virol. 7Q, 508-519, 1996), вирус на венецуелски конски енцефалит (виж US 5,643,576) и рабдовируси, като вируса на везикуларния стоматит (виж WO 96/34625) и папилома вируси (Ohe et al., Human Gene Therapy 6, 325-333 (1995)] Woo et al., WO 94/12629 и Xiao & Brandsma, Nucleic Acids Res. 24, 2630-2622, 1996).
ДНК кодираща имуноген, или вектор съдържащ същата, може да бъде пакетирана в липозоми. Подходящи липиди и сродни аналози са описани от US 5,208,036, 5,264,618, 5,279,833 и 5,283,185.
Вектори и ДНК кодиращи имуноген, могат също да бъдат абсорбирани със, или свързани със зърнисти носители, примери за които включват полиметил метакрилат полимери и полилактиди и поли(лактид-когликолиди), виж например, McGee et al., J.Micro Encap. (1996).
Вектори за генна терапия или гола ДНК, могат да бъдат предоставени in vivo чрез въвеждане у пациент, обикновено чрез системно въвеждане (например, интравенозно, интраперитонеално, интраназално, стомашно, интрадермално, интрамускулно, подкожно или чрез интракраниална инфузия) или топично приложение (виж ф например, US 5,399,346). Такива вектори могат по-нататък да включват улесняващи агенти като бупивикаин (US 5,593,970). ДНК може също да бъде въведена като се използува генна пушка. Виж Xiao & Brandsma, по-горе. ДНК кодираща имуноген е преципитирана по повърхността на микроскопични метални зрънца. Микропрожектилите са ускорявани с ударна вълна или разширяващ се газ хелий и проникват в тъканите на дълбочина от няколко клетъчни слоеве. Например, подходящо е The Accel™ Gene Delivery Device произведено от Agracetus, Inc., (Middleton, Wl) . Алтернативно, гола ДНК може да премине през кожата в кръвния ток, просто чрез нанасяне на ДНК върху кожата с химично или механично дразнене ® (виж WO 95/05853).
В следващ вариант, вектори кодиращи имуногени могат да бъдат предоставени на клетките ex vivo, като клетки експлантирани от даден пациент (например, лимфоцити, костно мозъчни аспирати, тъканна биопсия) или универсални донорни хематопоетични стволови клетки, последвано от реимплантация на клетките у пациент, обикновено след подбор за клетки, които имат включен вектор.
7. Скрининг на антитела за очистваща активност
Пример XIV описва методи за подбор на антитяло за активност при очистване на амилоидно отлагане. За да се направи подбор за активност срещу амилоидно отлагане, тъканна проба от пациент с амилоидоза, като например мозъчна тъкан при болест на Alzheimer, или животински модел с характерна амилоидна патология, е поставяна в контакт с патогенни клетки, носещи Fc рецептор, като микроглиялни клетки и антитяло, което е тестирано в среда in vitro. Фагоцитиращи клетки могат да бъдат първична култура или клетъчна линия, като BV-2, С8-В4 или ТНР-1. Тези компоненти са комбинирани върху стъкла за микроскопиране, за улесняване на микроскопския контрол, или множество реакции могат да бъдат проведени паралелно в ямки на микротитрационна платка. В такъв формат отделно миниатюрно стъкло за микроскопиране може да бъде поставено в отделни ямки или в не-микроскопски формат за откриване, като ELISA детектиране на Αβ. Предпочитано са правени серии от измервания на количеството амилоидно отлагане в in vitro реакционна смес, започвайки от изходната стойност преди протичане на реакцията и една или повече тестирани стойности по време на реакцията. Антигенът може да бъде открит чрез оцветяване, например, с флуоресцентно белязано антитяло срещу Αβ или друг компонент на амилоидни плаки. Антитялото използувано за оцветяване може да бъде или да не бъде същото, което ще се тестира за очистваща активност. Намаление по отношение на изходното количество амилоидни отлагания по време на реакцията показва, че тестираното антитяло има очистваща активност. Такива антитела е възможно да бъдат полезни за профилактика или лечение на болест на Alzheimer или други амилоидогенни заболявания. Както е описано по-горе, експерименти проведени в подкрепа на настоящето изобретение, разкриват, използувайки такъв тест, че антитела срещу NAC фрагмент
ΊΟ на синуклеин, са ефективни да изчистват амилоидни плаки, характерни за болестта на Alzheimer.
D. Пациенти податливи на схеми за анти-амилоидно третиране
Пациенти податливи на третиране, включват индивиди с риск от заболяване, но не проявяващи симптоми, както и пациенти които имат проявени симптоми на амилоидоза. В случая с болестта на Alzheimer, в действителност всеки е в риск от заболяване на Alzheimer, ако той или тя живеят достатъчно дълго. Следователно, настоящите методи могат да бъдат прилагани профилактично към общата популация, без да е необходимо от някакво определяне на риска за дадения пациент. Настоящите методи са особено полезни за индивиди, за които е известно, че имат генетичен риск за болест на Alzheimer или някакво наследствено амилоидно заболяване. Такива индивиди включват тези, които имат роднини, които страдат от това заболяване и такива, чийто риск е определен чрез анализ на генетични или биохимични маркери. Генетични маркери за риск от болест на Alzheimer, включват мутации в АРР гена, по-специално мутации в позиция 717 и позиции 670 и 671, означени съответно като Hardy и шведска мутации (виж Hardy, TINS, по-горе). Други маркери за риск са мутации в пресенилните гени, PS1 и PS2 и АроЕ4, фамилна анамнеза за AD, хиперхолестеролемия или атеросклероза. Индивиди страдащи понастоящем от болест на Alzheimer, могат да бъдат разпознати по характерна деменция, както и наличието на рискови фактори, описани по-горе. В допълнение, на разположение са известен брой диагностични тестове за идентифициране на индивиди с AD. Такива включват измерване на CSF tau и Αβ42 нива. Повишен tau и понижени Αβ42 нива означават наличие на AD. Индивиди страдащи от болест на Alzheimer, могат да бъдат диагностицирани с MMSE или ADRDA критерии, както е описано в раздела Примери.
При асимптомни пациенти, третирането може да започне на всякаква възраст (например, 10, 20, 30). Обикновено, обаче не е необходимо да се започне лечение докато пациентът не навърши 40, 50, 60 или 70 години. Третирането обикновено предвижда множество дозировки за известен период от време. Третирането може да бъде контролирано чрез определяне на антитяло или активирани Тклетъчни или В-клетъчни отговори спрямо терапевтичния агент (например, Αβ пептид) за определено време, по указанията описани тук в Пример I и II. Ако липсва отговор, показана е бустерна имунизация. В случая с пациенти с потенциален синдром на Down, третирането може да започне преди раждането чрез въвеждане на терапевтичния агент у майката или непосредствено след раждането.
Други форми на амилоидоза често остават не диагностицирани , независимо, че се подозира специално предразположение за заболяването. Основен симптом е наличието на сърдечно или бъбречно заболяване у пациент на средна до напреднала възраст, който има признаци за друго органно засягане. Нисък волтаж или екстремни отклонения на оста на електрокардиограмата и задебелена камерна тъкан, могат да бъдат показателни за сърдечно засягане. Протеинурия е симптом за бъбречно ангажиране. Може също да се подозира чернодробно засягане, ако се открие хепатомегалия при физикално изследване на пациента. Периферна невропатия също е обичайна проява при някои форми на амилоидози; може също да бъде открита автономна невропатия, характеризираща се с постурална хипотония. Амилоидоза трябва да бъде подозирана у всеки, който е с прогресираща невропатия от неопределен произход. Окончателна диагноза на заболяването може да бъде направена като се използуват биопсични методи, където са достъпни засегнатите орган(и). За системни амилоидози, може да бъде използуван аспириран мастен тампон или проби от ректална биопсия. Биопсичният материал се оцветява с Congo red, като положителните проби проявяват ябълково зелено двойно пречупване под микроскоп с поляризована светлина.
Е. Схеми за третиране
При профилактични приложения, фармацевтични препарати или медикаменти се въвеждат у пациент, предразположен към, или в риск от дадено заболяване, в количество, което е достатъчно да елиминира или да намали риска, или да забави началото на заболяването. При терапевтични приложения, препаратите или медикаментите се въвеждат у пациент, който е подозрителен, или действително страдащ от такова заболяване, в количество, което е достатъчно да лекува, или поне да спре, симптомите на заболяването и неговите усложнения. Количество, което е адекватно да изпълни това, се определя като терапевтично или фармацевтично ефективна доза. И при двата режима - профилактичен и терапевтичен, агентите обикновено се прилагат в няколко дозировки докато се постигне достатъчен имунен отговор. Обикновено имунният отговор е контролиран и повторни дозировки са давани ако имунният отговор започне да намалява.
Ефективните дози на препаратите на настоящето изобретение, за третиране на гореспоменатите условия, варират в зависимост от много различни фактори, включително начина на въвеждане, прицелното място, физиологичното състояние на пациента, дали пациентът е човек или животно, други прилагани медикаменти, и дали третирането е профилактично или терапевтично. Обикновено пациентът е човек, но при някои заболявания, като прион протеин-свързаната болест луда крава, пациентът може да бъде бозайник, като говедо. Дозировките за третиране е необходимо да бъдат титрирани за оптимизиране безопасност и ефикасност. Количеството имуноген зависи от това дали също се въвежда адювант, като при по-високите дозировки обикновено се изисква отсъствие на адювант. В зависимост от имуногенността на дадената комбинация, количеството имуноген за въвеждане може да варира от 1цд-550 цд за пациент и обикновено от 5-500 цд за инжекция при приложение на човек. Понякога се използува по-голяма доза от 0.55 mg за инжекция. Обикновено най-малко около 10, 20, 50 или 100 цд се използуват за всяка инжекция при човек. Сроковете за инжектиране могат значително да варират от един път дневно, до един път годишно, до един път на десет години, с известни предпочитани последователни “бустери” от имуноген. Общо, съгласно предоставените тук указания, ефективните дозировки могат да бъдат контролирани чрез получаване на течна проба от пациента, обикновено проба от кръвен серум, и определяне антитяло тигъра, получен срещу имуногена, като се използуват добре известни методи в тази област и пряко приложими за измерване на специфичен антиген. В идеалния случай, проба се взима преди началното дозиране; последващи проби се взимат и се титруват след всяка имунизация. Общо, схема за доза или дозировка, която осигурява откриваем титър, желателно най-малко четири пъти по-висок от контролните или “изходни” нива при серумно разреждане 1:100, като изходно е дефинирано по отношение на контролния серум или по отношение на изходна платка в ELISA тестове. Предпочитани са титри 1:1000 или 1:5000 съответно на настоящото изобретение.
На какьвто и да е ден, на който се дава дозировка от имуноген, дозировката обикновено е по-висока от около 1цд/пациент и предпочитано по-висока от Юцд/пациент, ако се въвежда също и адювант и най-малко по-висока от 10 цд/пациент и обикновено повисока от 100 цд/пациенг в отсъствие на адювант. Дози за индивидуалните имуногени, подбрани съгласно настоящето изобретение, са определени в съответствие със стандартно дозиране и титрационни методи, приети във връзка с предоставените тук указания. Типичната схема се състои от една имунизация, последвана от бустерни инжекции на периоди от време, като 6-седмични интервали. Друга схема се състои от една имунизация, последвана от бустерни инжекции 1,2 и 12 месеца по-късно. Друга схема включва една инжекция на всеки два месеца от живота. Алтернативно, бустерните инжекции могат да бъдат на неравномерна основа, както се указва чрез мониториране на имунния отговор.
За пасивна имунизация с антитяло, дозировките са в рамките от около 0.0001 до 100mg/kg, по-често 0.01 до 5mg/kg, телесно тегло на гостоприемника. Например дозировките могат да бъдат 1 mg/kg телесно тегло или 10mg/kg телесно тегло. Една примерна схема на третиране включва въвеждане един път на две седмици или един път месечно, или един път на 3 до 6 месеца. При някои методи се въвеждат едновременно две или повече моноклонални антитела с различна свързваща специфичност, в който случай дозировката на всяко въведено антитяло е в указаните граници. Обикновено антитяло се въвежда многократно. Интервалите между отделните дозировки могат да бъдат седмични, месечни или годишни. Интервалите могат също да бъдат неправилни, според данните от измерените кръвни нива на антитяло срещу Αβ у пациента. Алтернативно, антитялото може да бъде прилагано като комбинация със забавено освобождаване, при който случай се изисква по-рядко приложение. Дозировката и честотата варират в зависимост от полуживота на антитялото у пациента. Общо, човешки антитела проявяват по-дълъг полуживот, последвани от хуманизирани антитела, химерни антитела и не-човешки антитела. Дозировката и честотата на приложение могат да варират в зависимост от това дали третирането е профилактично или терапевтично. За профилактично приложение се въвеждат относително ниски дозировки на относително по-редки интервали за дълъг период от време. Някои пациенти продължават да получават третиране за остатъка от техния живот. Терапевтично приложение, в относително висока дозировка на относително по-кратки интервали, понякога се изисква докато се редуцира прогресирането на заболяването или се прекрати, и предпочитано докато пациентът прояви частично или пълно подобрение на симптомите на заболяването. След това на пациента може да бъде приложен профилактичен режим.
Дозите за нуклеинови киселини кодиращи имуногени варират от 10 ng до 1д, 100 ng до 100 mg, 1цд до 10mg или 30-300 дд ДНК на пациент. Дозите за инфекциозни вирусни вектори варират от 10-100 или повече, вириони за доза.
Агенти за индуциране на имунен отговор могат да бъдат прилагани парентерално, топично, интравенозно, орално, подкожно, интраперитонеално, интраназално или интрамускулно за профилактично и/или терапевтично третиране. Типичните начини на въвеждане на имуногенния агент са интрамускулен (i.m.), интравенозен (i.v.) или подкожен (s.c.), въпреки че и други начини могат да бъдат еднакво ефективни. Интрамускулната инжекция найчесто се прави на ръката или в мускулите на крака. При някои методи, агентите се инжектират директно в тъканта, където са натрупани отлаганията, например с интракраниално инжектиране. Интрамускулното инжектиране или интравенозната инфузия са предпочитани за въвеждане на антитяло. При някои методи, дадени терапевтични антитела са инжектирани директно в черепа. При някои методи, антителата са въведени като препарат със забавено освобождаване или устройство, като Medipad™ device.
Агенти на изобретението могат по избор да бъдат прилагани в комбинация с други агенти, които са поне отчасти ефективни за третиране на амилоидогенно заболяване. В случая с болестта на
Alzheimer и синдрома на Down, при който амилоидните отлагания се откриват в мозъка, агентите на изобретението могат също да бъдат въведени в съчетание с други агенти, които повишават преминаването на агентите на изобретението през кръвно-мозъчната бариера. Понататък, терапевтични коктейли съдържащи имуногени, предвидени да провокират имунен отговор срещу повече от един амилоиден компонент, също са планирани от настоящето изобретение, както и комбинация от антитяло насочено срещу компонент на плака и имуноген насочен срещу друг различен компонент на плака.
Имуногенни агенти на изобретението, като пептиди, понякога се въвеждат в комбинация с адювант. Могат да бъдат използувани различни адюванти в комбинация с пептид, като Αβ, за предизвикване на имунен отговор. Предпочитани адюванти увеличават вътрешния имунен отговор срещу имуноген, без да предизвикват конформационни промени в имуногена, който засяга качествената форма на отговора. Предпочитаните адюванти включват алуминиев хидроксид и алуминиев фосфат, ЗОе-О-ацетилиран монофосфорил липид A (MPL™) (виж GB 2220211 (RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, понастоящем част от Corixa). Stimilon™ QS-21 e тритерпен гликозид или сапонин, изолиран от кората на дървото Quillaja Saponaria Molina в Южна Америка (виж Kensil et al., in Vaccine Design: The Structure and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); US Patent No. 5,057,540), (Aquila BioPhrmaceuticals, Farmingham, МА). Други адюванти са емулсии масло във вода (като сквален или фъстъчено масло), по избор в комбинация с имунни стимуланти, като монофосфорил липид А (виж Stoute et al., N.Engl.J.Med. 336, 86-91 (1997). Друг адювант е CpG (WO 98/40100). Алтернативно, Αβ може да бъде свързан с адювант. Обаче, такова свързване не трябва съществено да променя конформацията на Αβ, така че да засяга природата на имунния отговор спрямо нея.
Адюванти могат да бъдат въведени като компонент на терапевтичен състав с активен агент или могат да бъдат въведени отделно преди, конкурентно със, или след въвеждане на терапевтичния агент.
Предпочитан клас адюванти са алуминиеви соли (alum), като алуминиев хидроксид, алуминиев фосфат, алуминиев сулфат. Такива адюванти могат да бъдат използувани със или без други имуностимулиращи агенти, като MPL или 3-DMP, QS-21, полимерни или мономерни аминокиселини като полиглугаминова киселина или полилизин. Друг клас адюванти са масло във вода емулсионни комбинации. Такива адюванти могат да бъдат използувани със или без други специфични имуностимулиращи агенти, като мурамил пептиди (например И-ацетилмурамил-Ь-треонил-О-изоглутамин (thrMDP), Н-ацетил-нормурамил-Ь-аланил-О-изоглугамин (nor-MDP), Nацетилмурамил-1_-аланил-1>изоглутаминил-1--аланин-2-(Т-2’дипалмитоил-8П-глицеро-3-хидроксифосфорилокси)-етиламин (МТР-РЕ), Nацетилглюксаминил-Н-ацетилмуламил-1_-А1-Е)-изоглю-1--Ала-дипалмитокси пропиламид (DTP-DPP) терамид™, или други компоненти на стената на бактериалната клетка. Масло във вода емулсии включват (a) MF59 (WO/4837), съдържащ 5% сквален, 0.5% Tween 80 и 0.5% Span 85 (по избор съдържащ различни количества от МТР-РЕ) комбиниран в субмикронни частици, като се използува микрофлуидайзер като Model 110Y microfluidizer (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, съдържащ 10% сквален, 0.4% Tween 8, 5% плуроновблокиран полимер L121 и thr-MDP, микрофлуидизиран в субмикронна емулсия или разбъркан на вортекс за получаване емулсия с по-големи частици и (с) Ribi™ адювант система (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, МТ), съдържаща 2% сквален, 0.2% Tween 80 и един или повече компоненти на бактериалната клетъчна стена, от група състояща се монофосфорил липид А, трехалоза димиколат (TDM) и скелет на клетъчната стена (CWS), предпочитано MPL + CWS (Detox™). Друг клас предпочитани адюванти са сапонинови адюванти, като Stimulon™ (QS-21; Aquila, Framingham, МА) или частици произведени от него като ISCOMs (имуностимулиращи комплекси) и ISCOMATRIX. Други адюванти включват Непълен адювант на Freund (IFA), цитокини, като интерлевкини (IL-1, IL-2 и IL-12), макрофаг колониен стимулиращ фактор (M-CSF) и тумор некрозис фактор (TNF). Такива адюванти обикновено са на разположение от търговски източници.
Един адювант може а бъде въведен с имуноген като единичен препарат или може да бъде въведен преди, конкурентно със или след въвеждане на имуногена. Имуноген и адювант могат да бъдат пакетирани и доставени в същото стъкло или могат да бъдат пакетирани в отделни шишета и смесени преди употреба. Имуноген и адювант обикновено са пакетирани с етикет указващ предвиденото терапевтично приложение. Ако имуноген и адювант са пакетирани поотделно, пакетирането обикновено включва инструкции за смесване преди употреба. Изборът на адювант и/или носител зависи от такива фактори като стабилност на комбинацията, съдържаща адюванта, начин на въвеждане, схема за дозировка и ефикасност на адюванта за видовете, които се ваксинират. При хора, предпочитан фармацевтично приемлив адювант е този, който е потвърден за приложение при човек от съответните регулаторни органи. Примери за такива предпочитани адюванти за хора, включват alum, MPL и QS-
21. По избор, два или повече различни адюванти могат да бъдат използувани едновременно. Предпочитани комбинации включват alum с MPL, alum с QS-21, MPL с QS-21 и alum, QS-21 и MPL заедно. Може също да бъде използуван Непълен адювант на Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)), по избор в комбинация c всеки от alum, QS-21 и MPL и всички техни комбинации.
. i^-vM.rfrranHaasiia
Агенти на изобретението често са въвеждани като фармацевтични препарати, съдържащи активен терапевтичен агент и различни други фармацевтично приемливи компоненти. Виж Remington's Pharmaceutical Science (19th ed., 1995). Предпочитаната форма зависи от предвидения начин на въвеждане и терапевтичното приложение. Препаратите могат също да включват, в зависимост от желаната комбинация, фармацевтично приемливи, не-токсични носители или разредители, които са определени като вехикулуми, обикновено използувани за комбиниране на фармацевтичните препарати за въвеждане на животни или хора. Разредителят е избиран така, че да не повлиява биологичната активност на комбинацията. Примери за такива разредители са дестилирана вода, физиологичен фосфатно-буфериран разтвор, Ringer’s разтвори, декстрозен разтвор, разтвор на Hank’s. В допълнение, фармацевтичният препарат или комбинация могат да включват също други носители, адюванти или не-токсични, не-терапевтични, неимуногенни стабилизатори и подобни.
Фармацевтичните препарати могат да включват също големи, бавно метаболизируеми макромолекули като белтъци, полизахариди като хитозан, полимлечни киселини, полигликолови киселини и кополимери (като латекс функционализпрана сефароза, агароза, целулоза и подобни), полимерни аминокиселини, аминокиселинни кополимери и липидни агрегати (като маслени капки или липозоми). В допълнение тези носители могат да функционират като имуностимулиращи агенти (т.е. адюванти).
За парентерално въвеждане, агенти на изобретението могат да бъдат въвеждани като инжектируеми дозировки на разтвор или суспензия във физиологично приемлив разредител с фармацевтичен носител, който може да бъде стерилна течност като вода, масла, физиологичен разтвор, глицерол или етанол. В допълнение, спомагателни субстанции, като овлажняващи или емулгиращи агенти, повърхностно активни вещества, pH буфериращи субстанции и подобни могат да присъствуват в препаратите. Други компоненти на фармацевтичните препарати са петрол, от животински, растителен или синтетичен произход например, фъстъчено масло, соево масло и минерално масло. Общо, гликоли като пропилен гликоли и полиетилен гликол са предпочитани течни носители, по-специално за инжекгируеми разтвори. Антитела могат да бъдат въведени във формата на депо инжекции или имплант-препарат, които могат да бъдат коминирани по такъв начин, че да разрешават забавено освобождаване на активната съставка. Един примерен препарат съдържа моноклонално антитяло при 5mg/ml, комбинирано във воден буфер съдържащ 50тМ L-хистидин, 150mM NaCl, доведен до pH 6.0 със HCI.
Обикновено, препаратите са изготвени като инжекгируеми, течни разтвори или суспензии; твърди форми подходящи за разтвори във, или суспензии във, течни вехикулуми могат да бъдат изготвени преди инжектиране. Препаратът може също да бъде емулгиран или инкапсулиран в липозоми или микро частици като полилактид, полигликолид, или кополимер, за повишаване ефекта на адюванта, както е обсъдено по-горе (виж Langer, Science 249, 1527 (1990) и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119 (1997). Агентите на настоящето изобретение могат да бъдат въведени във форма на депо инжекция или имплант-препарат, който може да бъде комбиниран по такъв начин, че да позволява забавено или пулсово освобождаване на активната съставка.
Допълнителни комбинации подходящи за други начини на въвеждане включват орални, интраназални и белодробни комбинации, супозитории и трансдермални форми за приложение.
За супозитории, свързващите вещества и носители включват например, полиалкилен гликоли или триглицериди; такива супозитории могат да бъдат направени от смеси, съдържащи активната съставка в обсега на 0.6% до 10%, предпочитано 1-2%. Оралните комбинации включват ексципиенти, като фармацевтична степен на чистота манитол, лактоза, нишесте, магнезиен стеарат, натриев захарин, целулоза и магнезиев карбонат. Тези препарати са във формата на разтвори, суспензии, таблетки, пилюли, капсули, комбинации със забавено освобождаване или прахове и съдържат 1095% активна съставка, предпочитано 25-75%.
Топичното приложение може да се осъществява чрез трансдермално или инградермално въвеждане. Топичното приложение може да бъде улеснено чрез едновременно въвеждане на агента с холера токсин или детоксикирани деривати, или техни субединици, или други подобни бактериални токсини (виж Glenn et al., Nature 391, 851 (1998)). Едновременно въвеждане може да бъде постигнато като се използуват компонентите във вид на смес или като свързани молекули, получени чрез химично кръстосано свързване, или експресия като слет белтък.
Алтернативно, трансдермално въвеждане може да бъде постигнато като се използува кожен пластир или като се използуват трансферозоми (Paul et al., Eur.JJmmunol. 25, 3521-24 (1995; Cevc et al., Biochim.Biophys.Acta 1368,201-15 (1998)).
F. Методи за диагноза
Изобретението предоставя методи за откриване на имунен отговор срещу Αβ пептид у пациент, страдащ от болест на Alzheimer. Методите са особено полезни за мониториране курса на лечение, приложен на пациент. Методите могат да бъдат използувани за контрол на терапевтичното третиране на пациенти със симптоми и за профилактично третиране на безсимптомни пациенти. Методите са полезни за контрол на активна имунизация (например, антитяло получено в отговор на въвеждане на имуноген) и пасивна имунизация (например, измерване ниво на въведено антитяло).
1. Активна имунизация
Някои методи предвиждат определяне изходната стойност на имунен отговор у пациент, преди въвеждане на една дозировка от агент и сравняване на тази стойност със стойност на имунния отговор след третиране. Значително повишение (т.е. по-голямо от обикновената граница на експерименталната грешка при повторни измервания на същата проба, изразено като стандартно отклонение от средната на такива измервания) стойността на имунния отговор, сигнализира за положителен резултат от третирането (т.е. въвеждането на агента е постигнало или повишило имунен отговор). Ако стойността на имунния отговор не се променя значимо, или намалява, това показва отрицателен резултат от третирането. Общо, пациенти подложени на начален курс на третиране с имуногенен агент, се очаква да покажат повишение на имунния отговор с последващи дозировки, който евентуално достига плато. Въвеждането на агент обикновено продължава докато имунният отговор нараства. Достигането на плато е индикатор, че прилагането на третиране може да бъде прекъснато или дозировката или честотата да бъдат намалени.
При други методи, се определя контролна стойност (т.е. средна стойност и стандартно отклонение) на имунния отговор за контролна популация. Обикновено индивидите в контролната популация не са получавали предварително третиране. Измерените стойности за имунен отговор у пациент след въвеждане на терапевтичен агент, са сравнявани с контролната стойност.
Значително повишение в сравнение с контролната стойност (например, по-голямо в сравнение с едно стандартно отклонение на средната стойност) сигнализира за положителен резултат от третирането. Липсата на значимо нарастване или понижение, показват отрицателен резултат от третирането. Въвеждане на агент общо продължава докато нараства имунния отговор в сравнение с контролната стойност. Както преди, достигането на плато в сравнение с контролните стойности е показател, че прилагането на третиране може да бъде прекъснато или намалено по отношение на дозировка и честота.
При други методи, контролна стойност за имунен отговор (например, средна стойност и стандартно отклонение) е определяна за контролна популация от индивиди, които са имали третиране с терапевтичен агент и чийто имунни отговори са достигнали плато в отговор на третиране. Измерените стойности на имунния отговор у пациента, са сравнени с контролната стойност. Ако измереното ниво у пациента на е значимо различно (например, повече от едно стандартно отклонение) от контролната стойност, третирането може да бъде прекъснато. Ако нивото у пациента е значително под контролната стойност, основателно е да се продължи въвеждането на агента. Ако нивото у пациента продължава да бъде под контролната стойност, тогава е индицирана промяна на схемата на третиране, например използуване на друг адювант.
При други методи, пациент, който не получава третиране в момента, но е получил предишен курс на третиране, е контролиран за имунен отговор, за определяне дали е наложително възобновяване на третирането. Измерената стойност за имунния отговор у пациента, може да бъде сравнена със стойност за имунен отговор, достигнат преди от пациента, след предишен курс на третиране. Значително намаление в сравнение с предишно измерване (т.е. по-голямо в сравнение с обикновена граница на грешката при повторни измервания на същата проба), е показател, че третирането може да бъде възобновено. Алтернативно, измерената стойност у пациента, може да бъде сравнена с контролна стойност на популация от профилактично третирани пациенти, които остават безсимптомни от заболяване, или популация от терапевтично третирани пациенти, които показват подобрение на характеристиките на заболяването. Във всички тези случаи, значително намаление по отношение но контролното ниво (т.е. повече от едно стандартно отклонение) е показател, че третирането на пациента трябва да бъде възобновено.
Тъканната проба за анализ обикновено е кръв, плазма, серум, слуз или гръбначно-мозъчна течност от пациента. Пробата е анализирана за индикация за имунен отговор срещу амилоиден компонент, който представлява интерес, като която и да е форма на Αβ пептид. Имунният отговор може да бъде определен по наличието, например, на антитела или Т-клетки, които специфично се свързват с компонента, който е от интерес, като Αβ пептид. ELISA методи за откриване на антитела, специфични срещу Αβ са описани в раздела Примери и могат да бъдат приложени за други пептидни антигени. Методи за откриване на реактивни Т-клетки са известни в тази област.
2. Пасивна имунизация
Общо, процедурите за контролиране на пасивна имунизация са сходни с тези за контрол на активна имунизация, описани по-горе. Обаче, антитяло профилът след пасивна имунизация, обикновено показва един непосредствен пик на антитяло концентрацията, последван от експоненциален спад. Без последваща дозировка, спадът приближава нивата преди третиране за един период от дни до месеци, в зависимост от полу-живота на въведеното антитяло.
Например, полу-животът на някои човешки антитела е от порядъка на 20 дни.
При някои методи, изходното измерване на антитяло срещу Αβ у пациент, е правено преди въвеждане, второ измерване е правено наскоро след това, за определяне максимума на нивото на антитялото и едно или повече следващи измервания са правени на интервали за контрол спада на антитяло нивата. Когато нивото на антитялото е спаднало до изходната стойност или до предварително определен процент от пика под изходната стойност (например, 50%, 25% или 10%), прилагана е следваща дозировка от антитяло. При някои методи, максимум или последващи измерени нива по-малки от изходните, са сравнени с референтни нива, определени предварително, за съставяне на схема за полезно профилактично или терапевтично третиране при други пациенти. Ако измереното антитяло ниво е значително по-ниско от референтното ниво (например, помалко от средната стойност минус едно стандартно отклонение на референгната стойност у популация от пациенти, с подобрение от третиране), индицирано е въвеждане на допълнителна дозировка от антитялото.
3. Диагностични китове
По-нататък изобретението предоставя диагностични китове за изпълнение на диагностични методи, описани по-горе. Обикновено, такива китове съдържат агент, който специфично се свързва с антитела срещу компонент на амилоидна плака, като Αβ , или реагира с Т-клетки, специфични за компонента. Китът може също да съдържа и белег. За откриване на антитела срещу Αβ, белегът обикновено е във формата на белязани анти-идиотипни антитела. За откриване на антитела, агентът може да бъде доставен предварително свързан с твърда фаза, като с ямките на микротитрационна платка. За откриване
НИЩИМ на реактивни Т-клетки, белегът може да бъде доставен като 3Нтимидин, за измерване на пролиферативния отговор. Китовете обикновено съдържат маркировка, предоставяща указания за използуване на кита. Маркировката може също да включва схема или друг съответен режим, свързващ нивата на измерения белег с нивата на антитела срещу Αβ или Т-клетки реактивни с Αβ. Терминът маркировка се отнася до всякакъв писмен или регистриран материал, който е приложен към, или по друг начин придружава кита по всяко време на неговото производство, транспорт, продажба или употреба. Например, терминът маркировка обхваща рекламни листовки и брошури, опаковачен материали, инструкции, аудио или видео касети, компютерни дискове, както и надписи отпечатани директно върху китовете.
ПРИМЕРИ
1. ПРОФИЛАКТИЧНА ЕФИКАСНОСТ НА Αβ СРЕЩУ БОЛЕСТ НА AZHEIMER (AD)
Тези примери описват приложение на Αβ42 на трансгенни мишки, свръхекспресиращи АРР, с една мутация в позиция 717 (APP7i7->f), което ги предразполага към развитие на Alzheimer-подобна © невропатология. Създаването и характеристиката на тези мишки (PDAPP мишки) са описани в Games et al., Nature, по-горе. Тези животни, в тяхната хетерозиготна форма, започват да отлагат Αβ от 6месечна възраст нататък. На 15-месечна възраст, те имат нива на Αβ отлагане, еквивалентни на тези наблюдавани при болест на Alzheimer. PDAPP мишки са инжектирани с агрегиран Αβ42 (агрегиран Αβ42) или фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Агрегиран Αβ42 е подбран поради неговата способност да индуцира антитела срещу множествени епитопи на Αβ.
А. МЕТОДИ
1. Източник на мишки
Тридесет PDAPP хетерогенни женски мишки са разпределени в следните групи: 10 мишки за ижектиране с агрегиран Αβ42 (една междувременно е починала), 5 мишки за инжектиране с PBS/адювант или PBS и 10 неинжектирани контроли. Пет мишки са инжектирани с пептиди, произхождащи от последователността на серумен амилоиден протеин (SAP).
2. Получаване на имуногени
Получаване на агрегиран Αβ42: два милиграма Αβ42 (US Peptides Inc, lot K-42-12) са разтворени в 0.9 ml вода и са доведени до 1 ml чрез добавка на 0.1 ml 10х PBS. Разтворът е разбъркван на вортекс и е инкубиран за една нощ на 37°С, при които условия пептидът агрегира. Неизползуваният Αβ е съхраняван като сух лиофилизиран прах на -20°С до следващата инжекция.
Трябва да се отбележи, че когато са използувани търговски достъпни пептиди, сухите тегла могат да включват соли към теглата; теглата съобщени във всички Примери тук, ако друго не е указано, включват соли към теглата. Точните маси на пептидите могат да © бъдат определени, като се използуват стандартни тестове на препарата, като определяне на азот, във връзка с известния препарат.
3. Изготвяне на инжекции
За всяка инжекция, ЮОцд агрегиран Αβ42 н PBS за мишка, са емулгирани 1:1 с Пълен адювант на Freund (CFA) до краен обем 400μΙ емулсия за първата инжекция, последвана от бустер със същото количество имуноген в Непълен адювант на Freund (IFA) на 2 седмици. Две допълнителни дози в IFA са давани на месечни интервали.
Последващите имунизации са правени на месечни интервали в 500μΙ PBS. Инжекциите са правени интраперитонеално (i.p.).
PBS инжекциите следват същата схема и мишките са инжектирани с 1:1 смес от PBS/адювант по 400μ1 на мишка, или 500μΙ PBS на мишка. SAP инжекции следват по подобен начин същата схема, като е използувана дозировка от 100цд за инжекция.
4. Титриране кръвопусканията от мишки, тъканен препарат и имунохистохимия
Горните методи са описани по-долу в Общи материали и методи.
В. РЕЗУЛТАТИ
PDAPP мишки са инжектирани с агрегиран Αβ42 (агрегиран Αβ42), SAP пептиди или фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Една група от PDAPP мишки е оставена като неинжекгирани, положителни контроли. Титрите на мишките срещу агрегиран Αβ42, са контролирани всеки втори месец от четвъртата бустерна имунизация, докато мишките станат на възраст една година. Мишките са убивани на 13 месечна възраст. На всички изследвани периоди от време, осем от деветте с агрегиран Αβ42 мишки, развиват висок антитяло титър, който се запазва висок през целите серии от инжектирания (титри повисоки от 1/10000). Деветата мишка имаше нисък, но измерим титър от около 1/1000 (Фиг.1, Таблица 3). SAP-инжектираните мишки имаха титри от 1:1000 до 1:30,000 за този имуноген , със само една мишка превишаваща 1:100,000.
ТАБЛИЦАЗА
Титри при 50% от максималната O.D. Мишки инжектирани с агрегиран Αβ
Въу / PDAPP (месеци) #100 #101 #102 #103 #104 #105 #106 #107 #108
4 70000 150000 15000 120000 1000 15000 50000 60000 100000
6 15000 65000 30000 55000 300 15000 15000 50000 60000
8 20000 55000 50000 50000 400 15000 18000 50000 60000
10 40000 20000 60000 50000 900 15000 50000 20000 40000
12 25000 30000 60000 40000 2700 20000 70000 25000 20000
ТАБЛИЦА ЗВ Титри при 50% от максималната O.D. PBS инжектирани мишки върху двата имуногена при 1/00
Възраст на PDAPP (месеци) #113 #114 #115 #116 #117
6 <4xbkg <4xbkg <4xbkg <4xbkg <4xbkg
10 5xbkg <4xbkg <4xbkg <4xbkg <4xbkg
12 <4xbkg <4xbkg <4xbkg <4xbkg <4xbkg
Серуми от PBS-третирани мишки са титрирани срещу агрегиран Αβ42 на шест, десет и дванадесет месеца. При 1/100 разреждане, PBS мишките, когато са титрирани срещу агрегиран Αβ42, са малко повече от 4 пъти по-ниски от изходната стойност на определен срок от изследването, или с други думи, те са по-малко от 4 пъти изходната стойност на всички интервали от време (Таблица 3). SAP-специфичният отговор е незначителен на всички тези интервали от време, като всички титри са по-малки от 300.
Седем от деветте мишки в третираната с агрегиран Αβ42 група, нямат откриваем амилоид в техните мозъци. За разлика от тях, мозъчна тъкан от мишки в SAP и PBS групите съдържат многобройни амилоидни отлагания в хипокампа, както и във фронталната кора и в cortex cinguli. Видът на отлагането е сходен с този на нетретираните контроли, с характерно ангажиране на раними субобласти, като външния молекуларен слой и хипокампалния gyrus dentatus. Една мишка от Αβ1-42 инжектираната група има силно намалено амилоидно натрупване, ограничено в хипокампа. Една изолирана плака е идентифицирана в друга ΑβΙ-42-третирана мишка.
Количествен анализ на образи на амилоидното натрупване в хипокампа, потвърждава драматично намаление достигнато в Αβ1-42 (АМ792)-третирани животни (Фиг.2). Медиалните стойности за амилоидното натрупване в PBS групата (2.22%) и за нетретираната контролна група (2.65%), са значително по-високи от тези за имунизирани с AN 1792 (0.00%, р=0.0005). За разлика от това, медианната стойност за групата имунизирана със SAP пептиди (SAPP) е 5.74%. Мозъчна тъкан от нетретирани, контролни мишки, съдържат многобройни Αβ амилоидни отлагания, визуализирани с Αβспецифичното моноклонално антитяло (mAb) 3D6 в хипокампа, както и в cortex retrosplenialis. Сходна картина на амилоидно отлагане е наблюдавана също у имунизирани със SAPP или PBS мишки (Фиг.2). В допълнение, при тези последни три групи има характерно ангажиране на раними субобласти на мозъка, класически наблюдавани при AD, такива като външният молекуларен слой на хипокампалния gyrus dentatus във всичките три групи.
Мозъците, които не съдържат Αβ отлагания, също са свободни от невритни плаки, които обикновено се визуализират у PDAPP мишки с човешкото АРР антитяло 8Е5. Всички мозъци от останалите групи (SAP-инжектирани, PBS и неинжектирани мишки) имат многобройни невритни плаки, типични за нетретирани PDAPP мишки. Малък брой невритни плаки бяха налице в една мишка третирана с AN1792, и единично струпване на дистрофични неврити е открито във втора мишка третирана с AN1792. Анализи на образи в хипокампа и показани във Фиг.З, демонстрират действително елиминиране на дистрофични неврити у А№792-третирани мишки (медиана 0.00%), сравнени с PBS реципиентите (медиана 0.28%, р= 0.0005).
Астроцитозна характеристика на свързано с плаки възпаление, отсъствува също в мозъците на ΑβΙ-42-инжектираната група. Мозъците от мишки в другите групи съдържат обилни и струпани GFAP-положителни астроцити, типични за Αβ свързана с плака глиоза. Една подгрупа от GFAP-реагирали стъкла са контрастно ** оцветени с Thioflavin S за локализиране на Αβ отлагания. GFAPположителните астроцити са свързани с Αβ плаки в SAP, PBS и нетретираните контроли. Липса на такова свързване е намерено в плака-негативните Αβ1-42 третирани мишки, докато минимална свързана с плака глиоза е идентифицирана у една мишка, третирана с ΑΝ1792.
Анализи на образи, представени на Фиг.4 за cortex retrosplenialis, потвърждават че намалението на астроцитозата е значимо с медианна стойност от 1.56% за тези третирани с AN1792, спрямо медианни стойности по-големи от 6% за групи, имунизирани © със SAP пептиди, PBS или нетретирани (р=0.0017).
Данни от една подгрупа от Αβ1-42 и PBS-инжектирани мишки, показва че свързана с плака МНС II имунореактивност отсъства у Αβ1-42 инжектирани мишки, в съответствие с липсата на Αβ-свързан възпалителен отговор.
Срези от мозъци на мишки също са реагирали със специфично mAb, с едно моноклонално антитяло, специфично за МАС-1, белтък на клетъчната повърхност. МАС-1 (CD11b) е член на интегрин семейство и съществува като хетеродимер с CD18. CD11b/CD18 комплексът присъствува по моноцити, макрофаги, неугрофили и естествени клетки убийци (Mak and Simard). Присъщият на мозъка МАС-1-реактивен клетъчен тип изглежда, че е микроглия, въз основа на сходна фенотипна морфология в МАС-1 имунореагирали срези. Свързаното с МАС-1 белязане е по-малко в мозъците на мишки третирани с AN1792, в сравнение с PBS контролната група, едно откритие, което е в съответствие с липсата на Αβ-индуциран възпалителен отговор.
С. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Липсата на Αβ плаки и реактивни невронални и глиялни промени в мозъците на ΑβΙ-42-инжектираните мишки показва, че няма или че изключително малко амилоид е отложен в техните мозъци и отсъстват патологични последствия, като глиоза и невритна патология. PDAPP мишки третирани с Αβ1-42 проявяват по същество същата липса на патология както контролните нетрансгенни мишки. Следователно, Αβ1-42 инжекциите са високо ефективни за предотвратяване отлагането или за очистване на човешки Αβ от мозъчна тъкан, и елиминиране на последващи невронални и възпалителни дегенеративни промени. Така, въвеждането на Αβ пептид може да има профилактичен и терапевтичен благоприятен ефект при профилактиката на AD.
II. ПРОУЧВАНЕ НА ДОЗА ОТГОВОР
Групи от женски Swiss Webster пет седмични мишки (N=6 в група), са имунизирани с 300,100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.4 или 0.13 ug Αβ, комбиниран в CFA/IFA, въведен интраперитонеално. Три дози са прилагани на двуседмични интервали, последвани от четвърта доза след един месец. Първата доза е емулгирана с CFA и останалите дози са емулгирани с IFA. За измерване на антитяло титрите е правено кръвопускане на животните 4-7 дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза. На животни в една подгрупа от трите групи, тези имунизирани с 11, 33 или 300 pg антиген, е правено допълнително кръвопускане на приблизително месечни интервали, в продължение на четири месеца след четвъртата имунизация, за контрол на намалението на антитяло отговора в рамките на един обхват от дози на имуногенни комбинации. Тези животни получават една последна пета имунизация седем месеца след началото на проучването. Те са убивани една седмица по-късно, за измерване антитяло отговорите срещу AN1792 и за провеждане на А токсикологични анализи.
Наблюдаван е намаляващ доза отговор от 300 до 3.7 pg и отсъствие на отговор при двете най-ниски дози. Средните антитяло титри са около 1:1000 след 3 дози и около 1:10,000 след 4 дози от 11300 pg антиген (виж Фиг.5).
Антитяло титрите нарастват драматично за всички, освен групата с най-ниска доза, след третата имунизация, с нарастване на GMTs от 5 до 25-кратно. Ниски антитяло отговори след това са откриваеми дори у 0.4 pg реципиентите. Групите с 1.2 pg и 3.2 pg имат сравними титри, с GMTs от около 1000 и четирите най-високи дози дават струпвания с GMTs от около 25,000, с изключение на ЗЗрд © групата, с по-нисък GMT от 3000. След четвъртата имунизация, нарастването на титъра е по-умерено за повечето групи. Има ясен доза отговор при групите с по-ниска доза антиген от 0.14 pg до 11 pg, бидейки в границите от неоткриваемо антитяло за реципиенти с 0.14 I pg до GMT от 36,000 за реципиенти с 11 pg. Отново, титри за четирите групи с най-висока доза от 11 до 300 pg образуват струпвания. Така след две имунизации, антитяло тигърът е зависим от дозата на антигена за широкия обхват от 0.4 до 300 pg. При третата имунизация, титрите на четирите най-високи дози са сравними и те остават в плато след допълнителна имунизация.
Един месец след четвъртата имунизация, титрите бяха 2- до
З-пъти по-високи при ЗООрд групата, в сравнение с тези измерени в кръв взета пет дни след имунизация (Фиг.6). Това наблюдение насочва, че максимумът на антитяло отговора се появява след повече от 5 дни след имунизация. Едно по-умерено (50%) нарастване е наблюдаване по това време у ЗЗцд групата. При 300 цд групата, два месеца след последната доза, GMTs стръмно намаляват до около 70%. След още един месец, намалението е по-малко стръмно при 45% (100цд) и около 14% за 33 и 11 pg дозите. Така, степента на намаление на титрите от циркулиращи антитела, след прекъсване на © имунизацията, изглежда че са двуфазни, със стръмно намаление през първия месец след максималния отговор, последвано от по-умерена степен на намаление след това.
Антитяло титрите и кинетиките на отговора на тези Swiss Webster мишки, са сходни с тези на млади хетерозиготни PDAPP I трансгенни мишки, имунизирани по паралелен начин. Дозировки j ефективни да индуцират имунен отговор у хора, обикновено са сходни ’ с дозировките, които са ефективни при мишки.
i III. ПОДБОР ЗА ТЕРАПЕВТИЧНА ЕФИКАСНОСТ СРЕЩУ : Q УСТАНОВЕНА AD
Тази проба е планирана да тестира имуногенни агенти за ! активност при задържане или отменяне невропатологични
J характеристики на AD у възрастни животни. Имунизации с дълъг 42 | аминокиселини Αβ (ΑΝ1792) са започнати в такъв период от време, » когато амилоидни плаки са вече налице в мозъците на PDAPP мишки.
I
През периода от време използуван в това проучване, . нетретирани PDAPP мишки развиват известен брой невродегенеративни промени, които наподобяват тези открити при AD (Games et al., по-горе и Johnson-Wood et al., Proc.NatLAcad.Sci.USA 94, 1550-1555 (1997)). Отлагането на Αβ в амилоидни плаки е свързано с дегенеративен невронален отговор, състоящ се от абнормни аксонални и дендритни елементи, наречени дистрофични неврити. Амилоидни отлагания, които са заобиколени от и съдържат дистрофични неврити, са наречени невритни плаки. При AD и при PDAPP мишката, дистрофичните неврити имат отчетливо глобуларна структура, те са имунореактивни с един блок от антитела, които разпознават АРР и цитоскелетни компоненти, и проявяват комплекс от субклетъчни дегенеративни промени на ултраструктурно ниво. Тези характеристики позволяват съответни на заболяването, селективни и репродуцируеми измервания на образуването на невритна плака у PDAPP мозъци. Дистрофичният невронален компонент на PDAPP невритните плаки лесно се визуализира с антитяло, специфично за човешки АРР (моноклонално антитяло 8Е5) и може директно да бъде измерван с компютерен анализ на образи. Следователно, в допълнение на измерването, ефектите на AN 1792 върху образуването на амилоидна плака, контролирани са ефектите от това третиране върху развитието на невритна дистрофия.
Астроцитите и микроглията са не-невронални клетки, които отговарят и отразяват степента на невронално увреждане. GFAPположителни астроцити и MHC-ll-положителна микроглия обикновено се наблюдават при AD и тяхното активиране нараства с тежестта на заболяването. Следователно, контролирано е също развитието на реактивна астроцитоза и миклоглиоза у AN1792-третирани мишки.
А. Материали и методи
Четиридесет и осем, хетерозиготни женски PDAPP мишки, на възраст 11 до 11-5 месеца, получени от Charles River са произволно разделени на две групи: 24 мишки, които да бъдат имунизирани със 100gg AN1792 и 24 мишки, които да бъдат имунизирани с PBS, всеки
комбиниран с адювант на Freund. AN1792 и PBS групите са разделени отново когато достигнат -15 месечна възраст. На 15-месечна възраст, приблизително половината от всяка група на AN1792-третираните и PBS-третираните животни са евтанизирани (п=10 и 9, съответно), останалите продължават да получават имунизации до приключване на -18-месечна възраст (п=9 и 12, съответно). Общо 8 животни (5 AN 1792, 3 PBS) са умрели по време на проучването. В допълнение към имунизираните животни, са включени едногодишни (п=10), 15месечни (п=10) и 18-месечни (п=10) нетретирани PDAPP мишки, за сравнение на ELISAs за измерване нивата на Αβ и АРР нивата в мозъка; животните на възраст една година също са включени в имунохистохимичните анализи.
Методологията беше както в Пример I, ако друго не е указано. US Peptides lot 12 и California Peptides lot ME0339 на AN1792 са използувани за получаване на антигена за шест имунизации, въведени преди 15-месечния срок. California Peptides lots МЕ0339 и МЕ0439 са използувани за получаване на антиген за шестте имунизации, приложени преди 15-месечния срок. California МЕ0339 и МЕ0439 са използувани за трите допълнителни имунизации, приложени между 15 и 18 месеца.
За имунизации, 100gg AN1792 в 200μΙ PBS или само PBS са емулгирани 1:1 (обем:обем) в Пълен адювант на Freund (CFA) или Непълен адювант на Freund (IFA), или PBS в краен обем 400μΙ. Първата имунизация е предоставена с CFA като адювант, следващите четири дози са приложени с IFA и последните четири дози с PBS, без добавен адютант. Правени са общо девет имунизации за един период от седем месеца, по двуседмична схема за първите три дози, последвана от четири-седмичен интервал за останалите инжекции. Третираната четири месеца група, евтаназирана на 15-месечна възраст, е получила първите 6 имунизации.
В. Резултати
1. Ефекти на Αβ42 (ΑΝ1792) третиране върху амиилоидно натрупване
Резултатите от AN1792 третиране върху коровото амилоидно натрупване, определени с количествен анализ на образи, са представени във Фиг.7. Медианната стойност на коровото амилоидно натрупване е 0.28% в група от нетретирани 12-месечни PDAPP мишки, една стойност, която е представителна за натрупване на плаки у мишки в началото на проучването. На 18 месеца, амилоидното натрупване нараства над 17-кратно до 4.8% у PBS-третираните мишки, докато АИ1792-третираните мишки имат силно намалено амилоидно натрупване от само 0.01% , особено по-малко в сравнение с 12-месечните нетретирани и 15-месечните и 18-месечните PBSтретирани групи. Амилоидното натрупване е значително редуцирано у AN 1792 реципиентите, на 15 (96% намаление; р=0.003) и 18(>99% намаление; р=0.0002) месеца.
Обикновено, коровото амилоидно отлагане у PDAPP мишки започва във фронталната и ретросплениалната кора (RSC) и напредва във вентро-латерално направление, за включване на темпоралната и енториналната кора (ЕС). Малко или никакъв амилоид е намерен в ЕС на 12-месечни мишки, приблизителната възраст, на която AN 1792 е въведен за пръв път. След 4 месеца третиране с AN1792, амилоидното отлагане е силно намалено в RSC и прогресивното ангажиране на ЕС е изцяло елиминирано с AN 1792 третирането. Последното наблюдение показва, че AN1792 напълно спира прогресирането на амилоид, който нормално би навлизал в темпоралната и вентралната кора, както и спира или възможно отменя отлагането в RSC.
Дълбоките ефекти от третирането с AN 1792 върху развитието на корови амилоидни натрупвания у PDAPP мишки, по-нататък са демонстрирани при 18-месечната група, която е третирана в продължение на седем месеца. Почти пълно отсъствие на коров амилоид е намерено у АМ1792-третирана мишка, с тотална липса на дифузни плаки, както и с намаление на компактните отлагания.
2. Клетъчни и морфологични промени свързани с Αβ42 (AN1792) третиране
Намерена е една популация от Αβ-положителни клетки в мозъчни области, които обикновено съдържат амилоидни отлагания. Забележително е, че в някои мозъци от AN 1792 реципиенти, са намерени много малко или никакви екстрацелуларни корови амилоидни плаки. По-голямата част от Αβ имунореактивостта, изглежда че се съдържа в клетките с голяма или със струпвания сома. Фенотипно, тези клетки наподобяват активирана микроглия или моноцити. Те са имунореактивни с антитела, разпознаващи лиганди, експресирани от активирани моноцити и микроглия (МНС II и CD11b) и понякога са свързани със стената или лумена на кръвоносни съдове. Сравнение на съседни срези, белязани с Αβ и МНС П-специфични антитела, разкрива че сходни характеристики на тези клетки се разпознават от двата класа антитела. Детайлно изследване на АИ1792-третирани мозъци разкрива, че МНС ll-положителните клетки са ограничени в съседство на ограничения амилоид, който остава у тези животни. При използуваните условия на фиксация, клетките не са имунореактивни с антитела, които разпознават Т клетъчни (CD3, CD3e) или В клетъчни (CD45RA, CD45RB) лиганди или левкоцитен общ антиген (CD45), но са реактивни с едно антитяло разпознаващо левкосиалин (CD43), който реагира кръстосано с моноцити. Не са намерени такива клетки в никоя от PBS-третираните мишки.
PDAPP мишките неизменно развиват тежко амилоидно отлагане във външния молекуларен слой на хипокампалния gyrus dentatus. Отлагането образува отчетлива ивица в perforant пътя, една област, която класически съдържа амилоидни плаки при AD. Характерният изглед на тези отлагания у PBS-третирани мишки, наподобява този, характеризиран преди у нетретирани PDAPP мишки. Амилоидното отлагане се състои от дифузни и компактни плаки в непрекъсната ивица. За разлика от това, в известен брой мозъци на АИ1792-третирани мишки, тази характеристика е драстично променена. Хипокампалното амилоидно отлагане не съдържа повече дифузен амилоид, характерът на ивици е напълно разкъсан. Вместо това, присъствуват известен брой необичайни точковидни структури, които са реактивни с анти-Αβ антитела, някои от които изглежда, че са амилоид-съдържащи клетки.
МНС ll-положителни клетки често са наблюдавани в съседство с екстрацелуларен амилоид у АИ1792-третирани животни. Картината на свързване на Αβ-положителните клетки с амилоид, е много сходна у няколко мозъци от АМ1792-третирани мишки. Разпространението на тези моноцитни клетки е ограничено в съседство с отложения амилоид и изцяло отсъствува в други мозъчни области, лишени от Αβ плаки.
Количествен анализ на образи на МНС II и МАС 1-белязани срези, разкрива тенденция към повишена имунореактивност в RSC и хипокампа на АИ1792-третирани мишки, сравнена с PBS групата, която достига значимост с измерване на MAC I реактивност в хипокампа.
Тези резултати са показателни за активно, клетъчно-медиирано отстраняване на амилоид в мозъчни области носещи плаки.
100
3. AN1792 ефекти върху Αβ нивата: ELISA определения (а) Корови нива
У нетретирани PDAPP мишки, медианното ниво на тотален Αβ в мозъчната кора на 12 месеца е 1,600ng/g, което нараства до 8,700 ng/g на 15 месеца (Таблица 4). На 18 месеца стойността е 22,000 ng/g, едно нарастване от над 10 пъти по време на експеримента. PBSтретирани животни имат 8,000ng/g тотален Αβ на 15 месеца, който нарастват до 19,000 ng/g на 18 месеца. За разлика от това, AN1792третирани животни имат 81% по-малко тотален Αβ на 15 месеца (1,600 ng/g) в сравнение с PBS-имунизираната група. Значително помалко (р=0.0001) тотален Αβ (5,200 ng/g) е намерен на 18 месеца, когато са сравнени AN1792 и PBS групите (Таблица 4), което представлява 72% намаление на Αβ, който при други условия е налице. Сходни резултати са получени когато са сравнени корови нива на Αβ42, по-точно АМ792-третираната група съдържа по-малко Αβ42, но в този случай разликите между ΑΝ1792 и PBS групите са значителни на 15 месеца (р=0.04) и 18 месеца (р=0.0001, Таблица 4).
Таблица 4: Медианни Αβ нива (ng/g) в мозъчната кора
Нетретирани PBS AN1792
Възраст Общо Αβ42 (η) Общо Αβ42 (η) Общо Αβ42 (η)
12 1,600 1,300 (10)
15 8,700 8,300 (10) 8,600 7,200 (9) 1,600 1,300* (10)
18 22,200 18,500 (10) 19,000 15,900 (12) 5,200** 4,000** (9)
*р = 0.0412 **р= 0.0001 (Ь) Хипокампални нива
При нетретирани PDAPP мишки, медианните хипокампални ниви за тоталния Αβ на 12-месечна възраст са 15,000ng/g, които нарастват до 51,000 ng/g на 15 месеца и по-нататък до 81,000ng/g на 18 месеца (Таблица 5). Подобно, PBS имунизирани мишки показват
101 стойности 40,000 ng/g и 65,000 ng/g на 15 месеца и на 18 месеца, съответно. AN1792 имунизирани животни показват по-малко тотален Αβ, съответно 25,000 ng/g и 51,000 ng/g на съответния 15-месечен и 18-месечен срок. Стойността за 18-месечната АМ1792-третирана група е значително по-ниска от тази на PBS третираната група (р=0.0105; Таблица 5). Измерване на Αβ42 представя същия характер на резултатите, по-точно нивата в АМ1792-третираната група са значително по-ниски от тези в PBS групата (39,000 ng/g спрямо 57,000 ng/g, съответно; р=0.002) на 18-месечното отчитане (Таблица 3).
Таблица 5: Медианни Αβ нива (ng/g) в хипокампа
Нетретирани PBS AN1792
Възраст Общо Αβ42 (η) Общо Αβ42 (η) Общо Αβ42 (Π)
12 15,500 11,100 (10)
15 51,500 44,400 (10) 40,100 35,70 (9) 24,50 22,100 (10)
18 80,800 64,200 (10) 65,400 57,10 (12) 50,90 38,900** (9)
* р= 0.0105 ** р = 0.0022 (с) Малкомозъчни нива
При 12-месечни нетретирани PDAPP мишки, медианното малкомозъчно ниво на тотален Αβ е 15ng/g (Таблица 6). На 15 месеца, тази медиана нараства до 28 ng/g и на 18 месеца е нараснала до 35 ng/g. PBS-третирани животни представят медианни тотални Αβ стойности от 21 ng/g на 15 месеца и 43 ng/g на 18 месеца. АМ1792-третирани животни е установено, че имат 22ng/g тотален Αβ на 15 месеца и значително по-малко (р=0.002) тотален Αβ на 18 месеца (25 ng/g), в сравнение със съответната PBS група (Таблица 6).
102
Таблица 6: Медианни Αβ нива (ng/g) в малък мозък
Нетретирани PBS AN1792
Възраст тотален АЬ (п) тотален АЬ (П) тотален АЬ (П)
12 15.6 (10)
15 27.7 (10) 20.8 (9) 21.7 (10)
18 35.0 (10) 43.1 (12) 24.8* (9)
* р = 0.0018
4. Ефекти от AN1792 третиране върху АРР нива
АРР-а и пълноразмерна АРР молекула съдържат цялата или част от Αβ последователността и биха могли потенциално да бъдат повлияни от генерирането на АМ1792-насочен имунен отговор. В изследвания до момента, е отбелязано леко нарастване нивата на АРР с нарастване на невропатологията у PDAPP мишка. В кората, нива на ΑΡΡ-α/FL (пълноразмерен) или АРР-a по същество не са променени от третиране, с изключение, че АРР-a е редуциран с 19% на 18-месечен срок у АМ1792-третирани, спрямо PBS-третираната група. 18-месечните АМ1792-третирани АРР стойности, не са значимо различни от стойностите за 12-месечни и 15-месечни нетретирани и 15-месечни PBS групи. Във всички случаи АРР стойностите се запазват в границите на нормалните, установени у PDAPP мишки.
5. Ефекти на AN1792 третиране върху невродегенеративната и глиозната патология
Натрупването на невритни плаки е значително редуцирано във фронталната кора на АИ1792-третирани мишки в сравнение с PBS групата на 15 (84%; р=0.03) и 18 (55%; р=0.01) месечна възраст (Фиг.8). Медианната стойност на натрупването от невритни плаки нараства от 0.32% до 0.49% в PBS групата между 15 и 18 месечна възраст. Това се различава от силно намаленото развитие на невритни плаки у AN1792 групата, с медианни стойности за
103 натрупване на невритни плаки от 0.05% и 0.22% при 15 и 18 месечните групи, съответно.
Имунизации с AN1792 изглежда, че се понасят добре и реактивната астроцитоза също значително е намалена в RSC на АМ1792-третирани мишки, в сравнение с PBS групата на 15 (56%; р=0.011) и 18 (39%; р=0.028) месечна възраст (Фиг.9). Медианни стойности на процента астроцитоза у PBS групата нарастват между 15-ия и 18-ия месец от 4.26% до 5.21%. А1М1792-третиране потиска развитието на астроцитоза на двата срока до 1.89% и 3.2%, съответно. Това насочва, че невропилът не е увреден от процеса на очистване.
6. Антитяло отговори
Както е описано по-горе, 11-месечни, хетерозиготни PDAPP мишки (N=24), са получили серия от 5 имунизации със 100цд AN1792, емулгиран с адювант на Freund и въведени интраперитонеално на 0, 2, 4, 8 и 12 седмици и една шеста имунизация само с PBS (без адювант на Freund) на 16-та седмица. Като отрицателна контрола, една паралелна група от 24 съвпадащи по възраст трансгенни мишки, са получили имунизации с PBS емулгиран със същите адюванти и приложен по същата схема. На животните е правено кръвопускане три до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза. Антитяло отговори срещу AN1792 са измервани с ELISA. Геометричните средни титри (GMT) за животните, които са имунизирани с AN1792, са приблизително 1,900, 7,600 и 45,000 съответно след втората, третата и поеледната(шеста) дози. Не е измерено Αβспецифично антитяло у контролни животни, след шестата имунизация.
Приблизително половината от животните са третирани допълнително три месеца, получавайки имунизации на около 20, 24 и 27 седмици. Всяка от тези дози е предоставена само в PBS като вехикулум, без адювант на Freund. Много антитяло титри остават
1(М непроменени през този период от време. В действителност, антитяло титрите изглежда, че се запазват стабилни от четвъртото до осмото кръвопускане, съответствуващо на един период покриващ петата до деветата инжекция.
За определяне дали Αβ-специфичните антитела предиз-, виквани чрез имунизация, които се откриват в серуми на AN1792третирани мишки, също са свързани с отложен в мозъка амилоид, една подсерия от срези от AN1792- и PBS-третирани мишки е реагирала с антитяло, специфично за мишо IgG. За разлика от PBS групата, Αβ плаки в АМ792-третирани мозъци, са покривани с ендогенен IgG. Тази разлика между двете групи е наблюдавана в 15- и 18-месечните групи. Особено изненадваща е липсата на белязане в PBS групата, независимо от наличието на тежко амилоидно натрупване в тези мишки. Тези резултати показват, че имунизация със синтетичен Αβ белтък, гени ри ра антитела, които разпознават и се свързват in vivo с Αβ в амилоидни плаки.
7. Кпетъчно-медиирани имунни отговори
Отделяни са слезките от девет AN 1792-имунизирани и 12 PBS-имунизирани 18-месечни PDAPP мишки, седем дни след деветата имунизация. Изолирани са спленоцити и са култивирани за 72 часа в присъствието на Αβ40, Αβ42 или Αβ4Ο-1 (обратно подреждане на белтъка). Митогенът Con А служи като положителна контрола. Получени са оптимални отговори с >1.7μΜ белтък. Клетки от всичките девет АШ792-третирани животни пролиферират в отговор на Αβ1-4Ο или Αβ1-42 белтък, с еднакви ниво на включване за двата белтъка (Фиг. 10, Горен блок). Няма отговор срещу Αβ40-1 обратния белтък. Клетки от контролни животни не отговарят на никой от Αβ белтъците (Фиг. 10, Долен блок).
105
С. Заключение
Резултатите от това проучване показват, че AN 1792 имунизация на PDAPP мишки, притежаващи налични амилоидни отлагания, забавя и предотвратява прогресивно амилоидно отлагане и забавя последващи невропатологични промени у възрастния мозък на PDAPP мишки. Имунизации с AN1792 по същество задържат развитието на амилоид в структури, които нормално са податливи на амилоидоза. Така, въвеждането на Αβ пептид има терапевтично благоприятен ефект при лечение на AD.
® IV. ПОДБОР НА Αβ ФРАГМЕНТИ
100 PDAPP мишки на възраст 9-11 месеца, са имунизирани с 9 различни области от АРР и Αβ, за определяне кой епитоп предава ефикасния отговор. Деветте различни имуногени и една контрола са инжектирани интраперитонеално, както е описано по-горе. Имуногените включват четири човешки Αβ пептидни конюгати 1-12, 13-28, 3242,1-5, всички свързани с овче анти-мишо IgG чрез цистинова връзка; един АРР полипептид аминокиселини 592-695, агрегиран човешки Αβ1-40, агрегиран човешки Αβ 25-35 и агрегиран Αβ42 от гризач. Агрегиран Αβ42 и PBS са използуани съответно като положителна и © отрицателна контроли. Използувани са 10 мишки за третирана група. Титрите са контролирани както по-горе, и мишките са евтаназирани на края на 4 месеца от инжекциите. Хистохимично, Αβ нива и токсикологични анализи са определяни след смъртта.
А. Материали и метод
1. Получаване на имуногени
Получаване на свързани Αβ пептиди: четири човешки Αβ пептидни конюгати (аминокиселинни остатъци 1-5, 1-12,13-28 и 33-42, всеки конюгиран с овчи анти-миши IgG) са получени чрез свързване
106 посредством изкуствено добавен цистеин към Αβ пептида, като е използуван кръстосано-свързващия реагент сулфо-EMCS. Αβ пептидните деривати са синтезирани със следните крайни аминокиселинни последователности. Във всеки случай, локализацията на вмъкнатия цистеинов остатък е указана с подчертаване. Αβ13-28 пептидното производно има също два глицинови остатъка, добавени преди карбоксилния краен цистеин, както е указано.
Αβ1-12 пептид NH2-DAEFRHDSGYEVC-COOH (SEQ ID NO: 30) Αβ1-5 пептид NH2-DAEFRC-COOH (SEQ ID NO: 31)
Αβ33-42 пептид ИН2-С-амино-хептаноева киселина-GLMVGGWIACOOH (SEQ ID NO: 32)
Αβ13-28 пептид Ac-NH-HHQKLVFFAEDVGSNKGGC-COOH (SEQ ID NO: 33)
За подготовка на свързваща реакция, десет mg овчи ангимищи IgG (Jackson Immuno Research Laboratories) са диализирани за една нощ срещу ЮтМ натриев борат буфер, pH 8.5. След това диализираното антитяло е концентрирано до обем от 2 ml, като е използувана Amicon Centriprep tube. Десет mg sulfo-EMCS [И(у-малеимидокупроилокси)сикцинимид] (Molecular Sciences Co.) е разтворен в 1 ml дейонизирана вода. Добавен е на капки 40-кратен моларен излишек от sulfo-EMCS с разбъркване към овчи анти-миши IgG и след това разтворът е разбъркван за още 10 минути. Активираният овчи анти-миши IgG е пречистен и обменен с буфер чрез пропускане през 10ml колона за гел филтрация (Pierce Presto Column, получена от Pierce Chemicals), балансирана с 0.1М NaPO4, 5mM EDTA, pH 6.5. Антитяло съдържащи фракции, идентифицирани по абсорбция при 280nm, са обединявани и разредени до концентрация приблизително 1mg/ml, като са използувани 1.4mg за OD като еикстинкционния
107 коефициент. 40-кратен моларен излишек от Αβ пептид е разтварян в 20 ml 10mM Na РОД, pH 8.0, с изключение на Αβ33-42 пептид, от който 10mg най-напред са разтваряни в 0.5 ml DMSO и след това са разредени до 20ml с ЮтМ NaPO4 буфер. Към всеки от пептидните разтвори са прибавени 10ml активиран овчи анти-миши IgG и са разклащани чрез завъртане на стайна температура за 4 часа. Получените конюгати са концентрирани да краен обем по-малък от 10ml като е използувана Amicon Centriprep tube и след това са диализирани срещу PBS, за буферен обмен на буфера и отстраняване на свободния пептид. Конюгатите са пропускани през филтри с големина на порите 0.22цт за стерилизация и след това са разпределени на фракции от 1 mg и съхранявани замразени на -20°С. Концентрациите на конюгатите са определяни с ВСА protein assay (Pierce Chemicals) c конски IgG за стандартна крива. Конюгирането е документирано с нарастване молекулното тегло на коюгираните пептиди, в сравнение с това на активиран овчи анти-миши IgG. Αβ1-5 овчи анти-миши конюгат е едно обединение от две конюгирания, остатъците са от единичен препарат.
2. Получаване на агрегирани Αβ пептиди
Човешки 1-40 (AN1528; California Peptides Inc., Lot ME0541), човешки 1-42 (AN1792; California Peptides Inc., Lots Me0339 и ME0439), човешки 25-35 и от гризачи 1-42 (California Peptides Inc., Lot ME0218) пептиди са свежо разтворени за изготвяне на набор от' инжекции от лиофилизирани прахове, които са били съхранявани изсушени на -20°С. За тази цел, 2mg пептид са добавяни към 0.9 ml дейонизирана вода и сместа е разбърквана на вортекс за получаване на относително еднороден разтвор или суспензия. От четирите, AN1528 е единственият пептид, който е разтворим на този етап. Порция от 100 μΙ 10Х PBS (1 X PBS: 0.15 М NaCI, 0.01 Μ натриев фосфат, pH
108
7.5) след това е добавяна на всеки етап когато AN1528 започне да преципитира. Суспензията е разбърквана на вортекс и инкубирана за една нощ на 37°С, за употреба на следващия ден.
Получаване на рВхб белтък: Експресионен плазмид, кодиращ рВхб, един слет белтък състоящ се от 100-аминокиселинна бактериофаг MS-2 полимераза N-терминална лидерна последователност, последвана от аминокиселини 592-695 на АРР (βΑΡΡ) е описан от Oltersdorf et al., J.Biol.Chem. 265, 4492-4497 (1990). Плазмидът е трансфектиран в E.coli и белтъкът е експресиран след индукция на промотора. Бактериите са лизирани в 8М урея и рВхб е w частично пречистен чрез препаративна SDS PAGE. Фракции съдържащи рВхб са идентифицирани чрез Western blot като е използувано заешко анти-рВхб поликлонално антитяло, обединявани са, концентрирани са като е използувана Amicon Centriprep tube и са диализирани срещу PBS. Чистотата на препарата, определена с Coomassie Blue оцветена SDS PAGE , е приблизително 5 до 10%.
В. Резултати и Обсъждане
1. План на изследването
Сто мъжки и женски, 9- до 11-месечни хитирозиготни PDAPP © трансгенни мишки са получени от Charles River Laboratory и Taconic Laboratory. Мишките са разпределени в 10 групи за да бъдат имунизирани с различни участъци от Αβ и АРР, комбинирани с адюванг на Freund. Животните са разпределени така, че да съвпадат по пол, възраст, произход и източник на животните в групи, колкото е възможно по-близо. Имуногените включват четири Αβ пептиди, произхождащи от човешка последователност, 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42, всяка конюгирана с овчи анти-миши IgG; четири агрегирани Αβ пептиди, човешки 1-40 (ΑΝ1528), човешки 1-42 (ΑΝ1792), човешки 2535 и от гризачи 1-42; и един слет полипептид, означен като рВхб,
109 съдържащ АРР аминокиселинни остатъци 592-695. Една десета група е имунизирана с PBS, комбиниран с адювант като контролна.
За всяка имунизация, 100gg от всеки Αβ пептид в 200 μΙ PBS или 200цд от АРР производното рВхб в същия обем от PBS, или само PBS, са емулгирани 1:1 (обем:обем) с Пълен адювант на Freund (CFA) до краен обем 400μΙ за първата имунизация, последвана от бустер на същото количество имуноген в Непълен адювант на Freund (IFA) за следващите четири дози и с PBS за последната доза. Имунизациите са правени интраперитонеално по двуседмична схема за първите три дози, след това по месечна схема. За измерване на антитяло титрите, на животните е правено кръвопускане четири до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза. Животните са евтанизирани приблизително една седмица след последната доза.
2. Αβ и АРР нива в мозъка
След около четири месеца от имунизацията с различни Αβ пептиди или АРР производни, мозъците са отделяни от перфузирани с физиологичен разтвор животни. Едната хемисфера е обработена за хистохимичен анализ, а втората е използувана за количествено определяне нивата на Αβ и АРР. За измерване концентрацията на различните форми бета амилоиден пептид и амилоиден прекурсорен белтък, хемисферите са сецирани и са изготвяни хомогенати от хипокампална, корова и малкомозъчни области в 5М гуанидин. Те са разредени и нивото на амилоид или АРР е определяно чрез сравнение със серии разреждания от стандарти с известна концентрация на Αβ пептид или АРР в ELISA формат.
Медианната концентрация на тотален Αβ за контролната група, имунизирана с PBS е 5.8 пъти по-висока в хипокампа отколкото в мозъчната кора (медиана 24,318ng/g хипокампална тъкан, сравнена с 4,221 ng/g за мозъчната кора). Медианното ниво в малкия мозък на
110 контролната група (23.4 ng/g тъкан) е около 1000 пъти по-ниско, в сравнение с това в хипокампа. Тези нива са сходни с тези, които сме съобщили по-рано за хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки на същата възраст (Johnson-Woods et al., 1997, по-горе).
За мозъчната кора, една подгрупа от третираните групи има медианни тотални Αβ и Αβ1-42 нива, които се различават значимо от тези на контролната група (р<0.05), тези животни са получили ΑΝ1792, от гризачи Αβ1-42 или Αβ1-5 пептидния конюгат, както е показано на Фиг.11. Медианните нива на тотален Αβ са редуцирани със 75%, 79% и 61%, съответно, сравнени с контролата за тези третирани групи. Няма забележими корелации между Αβ-специфични антитяло титри и Αβ нива в коровата област на мозъка за всяка от групите.
В хипокампа, медианното намаление на тотален Αβ, свързан с ΑΝ1792 третиране (46%, р=0.0543), не е толкова голямо, като това наблюдавано в мозъчната кора (75%, р=0.0021). Обаче, степента на намаление е далеч по-голяма в хипокампа, отколкото в мозъчната кора, чисто намаление от 11,186 ng/g тъкан в хипокампа, спрямо 3,171 ng/g тъкан в мозъчната кора. За групи от животни, които са получавали Αβ1-42 или Αβ1-5 от гризачи, медианните тотални Αβ нива, са намалени съответно с 36% и 26%. Обаче, като се има предвид малкия брой на групата и голямата вариабилност в нивата на амилоиден пептид между отделните животни в рамките на двете групи, това намаление не е значимо. Когато са измерени нивата на Αβ1-42 в хипокампа, никое от индуцираните от третиране намаления не достига значимост. Така, поради по-малкото натрупване на Αβ в мозъчната кора, промените в тази област са по-чувствителен показател за ефектите от третирането. Промените в Αβ нивата, измерени с ELISA в мозъчната кора, са сходни, но не идентични, с резултатите от имунохистохимчния анализ (виж по-долу).
Ill
Измерван е също тотален Αβ в малкия мозък, една област, която обикновено е минимално засегната от AD патология. Никоя от медианните Αβ концентрации, на която и да е от групите, имунизирани с различни Αβ пептиди или АРР производно не се различава от тази на контролната група в тази област на мозъка. Този резултат насочва, че не-патологичните нива на Αβ не са засегнати от третиране.
Определяна е също АРР концентрация с ELISA в мозъчната кора и малкия мозък на третирани и контролни мишки. Използувани са два различни АРР теста. Първият, означен ΑΡΡ-α/FL, разпознава АРРалфа (а, секретираната форма на АРР, която е разцепена в рамките на Αβ последователността), и пълноразмерни форми (FL) на АРР, докато вторият разпознава само АРР-а. За разлика от свързаното с третиране намаление на Αβ в една подгрупа на третираните групи, нивата на АРР са непроменени във всички третирани, в сравнение с контролните животни. Тези резултати показват, че имунизациите с Αβ пептиди не са изчерпващи АРР; по-точно ефектът от третирането е специфичен за Αβ.
В резюме, тоталните Αβ и Αβ1-42 нива са значително намалени в мозъчната кора при третиране с AN 1792, Αβ1-42 или Αβ1-5 конюгат от гризачи. В хипокампа, тоталният Αβ е значително намален само след третиране с AN1792. Никои други свързани с третиране промени в Αβ или АРР нивата в хипокампа, мозъчната кора или малкомозъчни области не са значими.
3. Хистохимични анализи
Мозъци от една подгрупа на шест групи, са обработени за имунохистохимичен анализ, три групи имунизирани с Αβ пептидните конюгати Αβ1-5, Αβ1-12 и Αβ13-28; две групи имунизирани с пълноразмерни Αβ агрегати AN1792 и AN1528 и PBS -третираната контролна група. Резултатите от анализи на образи на амилоидно
112 натрупване в мозъчни срези от тези групи са представени на Фиг. 12. Има значими намаления на амилоидното натрупване в корови области на три от третираните групи спрямо контролните животни. Найгол ямото намаление на амилоидното натрупване е наблюдавано в групата получаваща AN1792, където средната стойност е намалена с 97% (р=0.001). Значими намаления са наблюдавани също за животните третирани с AN1528 (95%, р=0.005) и Αβ1-5 пептидния конюгат (67%, р=0.02).
Резултатите получени от количествено определяне на тотален Αβ или Αβ1-42 с ELISA и амилоидно натрупване чрез анализ на образи, се различават в известна степен. Третирането с AN1528 има известно влияние върху нивото на коровото амилоидно отлагане, когато е измерено с количествен анализ на образи, но няма върху концентрацията на тотален Αβ в същата област, когато е измерено с ELISA. Разликата между тези два резултата е възможно да се дължи на спецификите на тестовете. Анализът на образи измерва всички форми на Αβ, разтворима и неразтворима, мономерна и агрегирана. Тъй като се счита, че болестната патология е свързана с неразтворимата, свързаната с плака форма на Αβ, техниката на анализ на образи може да има по-голяма чувствителност за разкриване ефектите от третирането. Обаче тъй като ELISA е по-бърз и по-лесен тест, той е много полезен за целите на скрининга. Освен това той може разкрие, че свързаното с третиране намаление на Αβ е по-голямо за свързания с плака отколкото за тоталния Αβ.
За определяне дали Αβ-специфичните антитела, предизвикани с имунизация у третираните животни, реагират с отложения мозъчен амилоид, една подгрупа срези от третирани животни и контролни мишки са реагирали с антитяло специфично за миши IgG. За разлика от PBS групата, Αβ-съдържащите плаки са покрити с ендогенен IgG за животни, имунизирани с Αβ пептидните из конюгати Αβ1-5, Αβ1-12 и Αβ13-28; и пълноразмерните Αβ агрегати ΑΝ1792 и ΑΝ1528. Мозъци от животни имунизирани с другите Αβ пептиди или АРР пептидът рВхб не са анализирани с този тест.
4. Измерване на антитяло титри
Правено и кръвопускане на мишките четири до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората имунизация, за общо пет кръвопускания. Антитяло титрите са измервани като Αβ1-42свързващо антитяло, като е използувана сандвич ELISA с пластмасови много-ямкови платки, покрити с Αβ1-42. Както е показано на Фиг. 13, максимални антитяло титри са предизвикани след четвъртата доза, за тези четири имунизационни комбинации, които предизвикват най-високи титри от АМ1792-специфични антитела: ΑΝ1792 (максимален GMT: 94,647), ΑΝ1528 (максимален GMT: 88,231), Αβ1-12 конюгат (максимален GMT: 47,216) и Αβ1-42 от гризачи (максимален GMT:10,766). Титрите за тези групи намаляват в известна степен след петата и шестата дози. За оставащите пет имуногена, максимални титри са достигнати след петата или шестата доза и не са с много по-ниска величина в сравнение с тези от четирите с най-високи титри групи: Αβ1-5 конюгат (максимален GMT: 2,356), рВхб (максимален GMT: 1,986), Αβ13-28 конюгат (максимален GMT: 1,183), Αβ33-42 конюгат (максимален GMT: 658), Αβ25-35 (максимален GMT: 125). Измерени са също антитяло титри срещу хомоложни пептиди, като е използуван същия сандвич ELISA формат за една подгрупа от имуногени, тези групи, които са имунизирани с Αβ1-5, Αβ13-28, Αβ25-35, Αβ33-42 или Αβ1-42 от гризачи. Тези титри са приблизително същите като тези измерени срещу Αβ1-42, с изключение на Αβ1-42 имуногена от гризачи, в който случай антитяло титрите срещу хомоложния имуноген са около два пъти по-високи. Величината на АМ1792-специфичният антитяло титър на отделни
114 животни или средните стойности на третираните групи не корелират с ефикасността, измерена като намаление на Αβ в мозъчната кора.
5. Лимфопролиферативни отговори
Αβ-зависима лимфопролиферация е измерена като са използувани клетки от слезка, отделени приблизително една седмица след последната, шеста имунизация. Свежо получени клетки, 105 за ямка, са култивирани за 5 дни в присъствието на Αβ1-40 в концентрация 5μΜ за стимулация. Клетки от една подгрупа на седем от десетте групи, също са култивирани в присъствието на обратния пептид Αβ40-1. Като положителна контрола, допълнително клетки са култивирани с Т клетъчен митоген, РНА и като отрицателна контрола, клетките са култивирани без добавен пептид.
Лимфоцити от едно болшинство животни пролиферират в отговор на РНА. Няма значими отговори срещу Αβ40-1 обратен пептид. Клетки от животни имунизирани с по-големи агрегирани Αβ пептиди, ΑΝ1792, Αβ1-42 от гризачи и ΑΝ1528 силно пролиферират когато са стимулирани с Αβ1-40, с най-високи импулси на минута (срт) у реципиентите на AN 1792. Едно животно във всяка от групите имунизирани с Αβ1-12 конюгат, Αβ13-28 конюгат и Αβ25-35, пролиферира в отговор срещу Αβ1-40. Останалите групи получаващи Αβ1-5 конюгат, Αβ33-42 конюгат рВхб или PBS нямат животни с Αβстимулиран отговор. Тези резултати са обединени в Таблица 7 подолу.
115
Таблица 7
Имуноген Конюгат Αβ аминокиселини Отговарящи
Αβ1-5 Да 5-mer 0/7
Αβ1-12 Да 12-mer 1/8
Αβ13-28 Да 16-mer 1/9
Αβ25-35 11-mer 1/9
Αβ33-42 Да 10-mer 0/10
Αβ1-40 40-mer 5/8
Αβί-42 42-mer 9/9
τΑβΙ-42 42-mer 8/8
рВхб 0/8
PBS O-mer 0/8
Тези резултати показват, че AN1792 и AN1528 стимулират силни Т клетъчни отговори, по-вероятно от CD4+ фенотип. Отсъствието на Αβ-специфичен Т клетъчен отговор у животни имунизирани с Αβ1-5 не е учудващо, тъй като пептидните епитопи разпознати от CD4+ Т клетки, обикновено са с 15 аминокиселини дължина, въпреки че покъси пептиди могат понякога да функционират с по-малко ефикасност. Така болшинството от помощните Т клетъчни епитопи за четирите конюгати пептиди е възможно да присъствуват в IgG конюгата участник, но не в Αβ областта. Тази хипотеза е подкрепена от много ниската честота на пролиферативни отговори за животни, във всяка от тези третирани групи. Тъй като Αβ1-5 конюгатът е ефективен при значително намалено ниво на Αβ в мозъка, при видимото отсъствие на Αβ-специфични Т клетки, ключовият ефекторен имунен отговор, индуциран с имунизация с този пептид, изглежда, че е антитяло.
Липсата на Т-клетъчен и нисък антитяло отговор от слет пептид рВхб, обхващащ АРР аминокиселини 592-695, включително всички от Αβ остатъците, може да се дължи на слабата имуногенност
116 на този специален препарат. Слабата имуногенност на Αβ25-3δ агрегат вероятно се дължи на пептида, който е твърде малък за да е възможно да съдържа добър Т клетъчен епитоп, който да помогне за индуцирането на антитяло отговор. Приема се, че конюгирането на този пептид с носител белтък, може да го направи по-имуногенен.
V. Получаване на поликлонални антитела за пасивна протекция
125 не-трансгенни мишки са имунизирани с Αβ, плюс адювант и са евтаназирани на 4-5 месеца. Взимана е кръв от имунизираните мишки. IgG е отделян от другите кръвни компоненти. Антитялото специфично за имуногена може частично да бъде пречистено с афинитетна хроматография. Получено е средно около 0.5-1 mg имуноген-специфично антитяло за мишка, което общо прави 60120 mg.
VI. Пасивна имунизация с антитела срещу Αβ
Групи от 7-9-месечни PDAPP мишки, всяка инжектирана с 0.5mg в PBS поликлонално анти-Αβ или специфични анти-Αβ моноклонални антитела, както е показано по-долу. Всички препарати от антитела са пречистени, за да са с ниски нива на ендотоксин. Моноклонални антитела могат да бъдат получени срещу един фрагмент, чрез инжектиране фрагмента или по-дълга форма на Αβ у мишка, изготвяйки хибридоми и скрининг на хибридоми за антитяло, което специфично се свързва с желан фрагмент от Αβ, без да се свързва с други не-припокриващи се фрагменти от Αβ.
ϋτ)ΐι«ηΐ№ΐιι
117
Таблица 8
Антитяло Епитоп
2НЗ Αβ 1-12
10D5 Αβ 1-12
266 Αβ 13-28
21F12 Αβ 33-42
Мишо поликлонално анти-човешко Αβ42 Анти-агрегиран Αβ42
Мишки са инжектирани интраперитонеално за един период от 4 месеца, за подържане концентрацията на циркулиращо антитяло, © измерен с ELISA тигър по-голям от 1/1000, определен с ELISA срещу Αβ42 или други имуногени. Титрите са контролирани както по-горе и мишките са евтаназирани на края на 6 месеца от инжекциите. Хистохимично, Αβ нива и токсикология са правени след смъртта. Десет мишки са използувани за група. Допълнителни проучвания върху пасивна имунизация са описани в Примери XI и XII по-долу.
VII. Сравнение на различни адюванти
Този пример сравнява CFA, alum, масло-във вода емулсия и MPL за капацитет да стимулират имунен отговор.
р
А. Материали и методи
1. План на изследването
Сто женски Hartley линия, шест-седмични морски свинчета, получени от Elm Hill Breeding Laboratories, Chelmsford, MA, ca разпределени в десет групи за да бъдат имунизирани с AN1792 или негово палмитоирано производно, комбинирани с различни адюванти. Седем групи са получили инжекции с AN1792 (33 pg ако друго не е определено) комбиниран с a) PBS, Ь) адювант на Freund, с) MPL, d) сквален, е) MPL/сквален, f) ниска доза alum или д) висока доза alum (300 pg AN1792). Две групи са получили инжекции с палмитоирано
118 производно на AN1792 (33μρ), комбинирано с a)PBS или Ь) сквален. Една последвна, десета група е получила само PBS без антиген или допълнителен адювант. За групата получаваща адювант на Freund, първата доза е емулгирана с CFA и останалите четири дози с IFA. Антиген е прилаган в доза ЗЗцд за всички групи с изключение на групата с висока доза alum, която получава 300 μρ AN1792. Инжекциите са прилагани интраперитонеално за CFA/IFA и интрямускулно в m.qadriceps на задния крак алтернативно на дясната и лявата страна за всички други групи. Първите три дози са давани по двуседмична схема, последвани от две дози на месечен интервал). За измерване на антитяло титрите е правено кръвопускане шест до седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза.
2. Получаване на имуногени
Два mg Αβ42 (California Peptide, Lot ME0339) са прибавяни към 0.9 ml дейонизирана вода и сместа е разбърквана на вортекс за получаване на относително равномерна суспензия. Добавена е порция от 100μΙ 10Х PBS (1Х PBS, 0.15 М NaCl, 0.01 M натриев фосфат, pH 7.5). Суспензията е разбърквана отново на вортекс и инкубирана за една нощ на 37°С за употреба на следващия ден. Неизползуван Αβ1-42 е съхраняван с осушител като лиофилизиран прах на -20°С.
Палмитоилирано производно на AN1792 е изготвено чрез свързване на палмйтинов анхидрид, разтворен в диметил формамид, с амино крайния остатък на AN1792, преди отстраняването на насцентния пептид от смолата, чрез третиране с хидрофлуорна киселина.
За получаване на имуногенна комбинация, дози с Пълен адювант на Freund (CFA) (група 2), 33 μρ AN1792 в 200μΙ PBS са емулгирани 1:1 (обем:обем) с CFA в краен обем 400 μΙ за първата
119 имунизация. За последващи имунизации, антигенът е емулгиран по подобен начин с Непълен адювант на Freund (IFA).
За изготвяне комбинирани дози с MPL за групи 5 и 8, лиофилизиран прах (Ribi ImmunoChemResearch, Inc., Hamilton, MT) e прибавян към 0.2% воден триетиламин до крайна концентрация 1mg/ml и е разбъркан на вортекс. Сместа е загрята до 65 -70°С за 30 секунди, за създаване на леко опалесцираща, равномерна суспензия от мицели. Разтворът е свежо изготвян за всяка серия от инжектирания. За всяка инжекция в група 5, 33yg AN 1792 в 16.5 μΙ PBS, 50 цд MPL (50μΙ) и 162 μΙ PBS са размесени в боросиликатна епруветка непосредствено преди употреба.
За изготвяне на комбинирани дози с ниската масло във вода емулсия, AN1792 в PBS е прибавен към 5% сквален, 0.5% Tween 80, 0.5% Span 85 в PBS за достигане концентрация на крайна единична доза от 33μg AN1792 в 250 μΙ (група 6). Сместа е емулгирана чрез пропускане 15-20 пъти през дву-камерно, ръчно устройство, докато капките на емулсията изглеждат да са приблизително равни на стандартни латексови зърна с диаметър до Ι.Ομτη, когато се наблюдават под микроскоп. Получената суспензия е опалесцентна, млекоподобна. Емулсиите са свежо изготвяни за всяка серия от инжекции. За група 8, MPL в 0.2% триетиламин е прибавян при концентрация 50μg за доза, към сквален и детергентна смес за емулгиране, както е отбелязано по-горе. За палмитоиловото производно (група 7), 33μg за доза палмитоил^Н-Ар1-42 е прибавен към сквален и е разбъркван на вортекс. Добавени са Tween 80 и Span 85 като са разбърквани на вортекс. Тази смес е прибавена към PBS за достигане крайна концентрация от 5% сквален, 0.5% Tween 80, 0.5% Span 85 и сместа е емулгирана както е отбелязано по-горе.
За изготвяне на комбинирани дози с alum (групи 9 и 10), AN1792 в PBS е прибавен към Alhydrogel (алуминиев хидроксид гел,
120
Accurate, Westbury, NY) за достигане концентрация от 33μρ (ниска доза, група 9) или 300gg (висока доза, група 10) AN1792 за 5mg alum в краен обем на дозата 250μΙ. Суспензията внимателно е размесена за 4 часа на стайна температура (RT).
3. Измерване на антитяло титри
Правено е кръвопускане на морски свинчета шест до седем дни след имунизация, започвайки след втората имунизация, общо четири кръвопускания. Антитяло титри срещу Αβ42 са измервани с ELISA, както е описано в Общи материали и методи.
4. Обработка на тъканта
След около 14 седмици, всички морски свинчета са евтаназирани чрез прилагане на СО2. Събирана е гръбначно-мозъчна течност, мозъците са отделяни и са сецирани три мозъчни области (хипокамп, мозъчна кора и малък мозък), които са използувани за измерване концентрацията на тоталния Αβ белтък, като е използувана ELISA.
В. Резултати
1. Антитяло отговори
Има широк обхват за потентността на различни адюванти, когато се определят като антитяло отговор срещу AN1792 след имунизация. Както е показано на Фиг.14, когато AN1792 е въведен в PBS, не е открито антитяло след две или три имунизации и незначителни отговори са открити след четвъртата и петата дози, с геометрични средни титри (GMTs) от около 45. Масло във вода емулсията индуцира умерени титри след третата доза (GMT 255), които са подържани след четвъртата доза (GMT 301) и намаляват с
121 последната доза (GMT 54). Има ясен антиген доза отговор за AN 1792, свързан с alum, като ЗООцд са по-имуногенни за всички срокове в сравнение с ЗЗцд. На максимума на антитяло отговора, след четвъртата имунизация, разликата между двете дози е 43% с GMTs от около 1940 (ЗЗцд) и 3400 (300 цд). Антитяло отговорът срещу ЗЗтд AN 1792 плюс MPL е много сходен с този създаден с почти 10-кратно по-висока доза от антиген (ЗООцд) свързан с alum. Добавянето на MPL към масло във вода емулсията, намалява потентността на комбинацията в сравнение с тази, в която MPL е единствен адювант, с около 75%. Палмитоилирано производно на AN1792 е напълно неw имуногенно, когато е приложено в PBS и дава по-умерени титри, когато е представено в масло във вода емулсия с GMTs 340 и 105 за третото и четвъртото кръвопускане. Най-високи антитяло титри са получени с адювант на Freund, с максимум GMT от около 87,000, една стойност, която е около ЗО-кратно по-голяма в сравнение с GMTs на следващите две най-мощни комбинации, MPL и висока доза AN1792/alum.
Най-обещаващи адюванти, идентифицирани в това проучване са MPL и alum. От двата, MPL изглежда, че е предпочитан поради това, че 10-кратно по-ниска доза антиген е необходима за © получаване на същия антитяло отговор, както този получен с alum.
Отговорът може да бъде повишен чрез повишаване дозата на антиген и/или адювант и чрез оптимизиране на имунизационната схема. Емулсията масло във вода е много слаб адювант за AN1792 и добавянето на масло във вода емулсия към MPL адювант понижава вътрешната активност на адювант MPL самостоятелно.
122
2. Αβ нива в мозъка
На около 14 седмици морските свинчета са дълбоко анестезирани, взимана е гръбначно-мозъчна течност (CSF) и са отделяни мозъците на една подгрупа от групите, имунизирани с адювант на Freund (група 2), MPL (група 5), alum с висока доза, 300μρ, AN 1792 (група 10) и имунизираната с PBS контролна група (група 3). За измерване нивото на Αβ пептид, една хемисфера е сецирана и са правени хомогенати в 5М гуанидин от хипокампална, корова и малкомозъчна области. Те са разредени и количествено са определяни чрез сравнение със серии от разреждания на Αβ стандартен белтък с известни концентрации в ELISA формат. Нивата на Αβ белтък в хипокампа, мозъчната кора и малкия мозък са сходни за всичките четири групи, независимо от широкия диапазон на антитяло отговори срещу Αβ, предизвикани с тези комбинации. Средни Αβ нива от около 25ng/g тъкан са измерени в хипокампа, 21 ng/g в мозъчната кора и 12 ng/g в малкия мозък. Така, наличието на висок титър от циркулиращо антитяло срещу Αβ за почти три месеца у някои от тези животни, не променя общите Αβ нива в техните мозъци. Нивата на Αβ в CSF също са много сходни между групите. Липсата на голям ефект на ΑΝ1792 имунизация върху ендогенния Αβ показва, че имунният отговор е фокусиран върху патологичните образования на Αβ.
VIII. Имунен отговор срещу различни адюванти у мишки
За това проучване са използувани шест-седмични женски
Swiss Webster мишки, с 10-13 животни за група. Имунизации са правени на следните дни -0,14,28,60,90 и 20, приложени подкожно, в обем на дозата 200 μΙ. PBS е използуван като буфер за комбинациите. На животните е правено кръвопускане седем дни след всяка имунизация, започвайки след втората доза, за анализ на
123 антитяло титрите с ELISA. Режимът на третиране за всяка група е обобщен в Таблица 9. Таблица 9
Експериментален дизайн на проучване 010
Група N* Адювант* Доза Антиген Доза (ug)
1 10 MPL 12.5 gg AN1792 33
2 10 MPL 25 gg AN1792 33
3 10 MPL 50 gg AN1792 33
4 13 MPL 125 gg AN1792 33
5 13 MPL 50 gg AN1792 150
6 13 MPL 50 gg AN1528 33
7 10 PBS ANI792 33
8 10 PBS None
9 10 Squalene емулгиран 5% AN1792 33
10 10 Squalene примесен 5% AN1792 33
11 10 Alum 2 mg AN1792 33
12 13 MPL + Alum 50 gg/2 mg AN1792 33
13 10 QS-21 5 gg AN1792 33
14 10 QS-21 10 gg AN1792 33
15 10 QS-21 25 AN1792 AN1792 33
16 13 QS-21 25AN1792 AN1792 150
17 13 QS-21 25AN1792 AN1528 33
18 13 QS-21 + MPL 25 gg/50 gg AN1792 33
19 13 QS-21 + Alum 25 gg/2 mg AN1792 33
Забележки: а Брой на мишките във всяка група в началото на експеримента.
ь Отбелязани са адювантите. Буферът за всички комбинации е PBS. За група 8, няма адюванти и няма антиген.
124
ELISA титрите на антитела срещу Αβ42 във всяка група са представени на Таблица 10, по-долу.
Таблица 10
Геометрични средни антитяло титри
Седмица на к| зъвопускянс
Третирана група 2.9 5.0 8.7 12.9 16.7
1 248 1797 2577 6180 4177
2 598 3114 3984 5287 6878
3 1372 5000 7159 12333 12781
4 1278 20791 14368 20097 25631
5 3288 26242 13229 9315 23742
6 61 2536 2301 1442 4504
7 37 395 484 972 2149
8 25 25 25 25 25
9 25 183 744 952 1823
10 25 89 311 513 817
11 29 708 2618 2165 3666
12 198 1458 1079 612 797
13 38 433 566 1080 626
14 104 541 3247 1609 838
15 212 2630 2472 1224 1496
16 183 2616 6680 2085 1631
17 28 201 375 222 1540
18 31699 15544 23095 6412 9059
19 63 243 554 299 441
Таблицата показва, че най-високи титри са получени за групи 4, 5 и 18, при които адювантите са 125mg MPL, 50 mg MPL и QS-21 плюс MPL.
IX. Терапевтична ефикасност на различни адюванти
Проучване за терапевтична ефикасност е проведено у PDAPP тренсгенни мишки с един набор от адюванти, подходящи за приложение при хора, за определяне тяхната способност да потенцират имунни отговори срещу Αβ и да индуцират имунномедиирано очистване от амилоидни отлагания в мозъка.
125
Сто и осемдесет мъжки и женски, 7.5 до 8.5 -месечни хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки са получени от Charles River Laboratories. Мишките са разпределени в девет групи, включващи 15 до 23 животни в група, за да бъдат имунизирани с AN1792 или AN1528, комбинирани с различни адюванти. Животните са разпределени така, че да съвпадат по пол, възраст, произход с животните в групата възможно най-близко. Адювантите включват alum, MPL и QS-21, всеки комбиниран с двата антигена и адювант на Freund (FA), комбиниран само с AN 1792. Допълнителна група е имунизирана с AN 1792, комбиниран в PBS буфер плюс кансервант thlmerosal, без адювант. Една девета група е имунизирана само с PBS като отрицателна контрола.
Получаване на агрегирани Αβ пептиди: човешки Αβ1-4Ο (ΑΝ1528; California Peptides Inc., Napa, СА; Lot ME0541) и човешки Αβ1-42 (ΑΝ1792; California Peptides Inc., Lot ME0439) пептиди са свежо разтворени за получаване на всеки набор от инжекции от лиофилизирани прахове, които са съхранявани изсушени на -20°С. За тази цел, 2 mg пептид са прибавяни към 0.9 ml дейонизирана вода и сместа е разбърквана на вортекс, за получаване на относително еднороден разтвор или суспензия. AN1528 е разтворим на този етап, за разлика от AN 1792. След това е добавена порция от 10ΟμΙ 10XPBS (1Х PBS. 0.15М NaCl, 0.01 М натриев фосфат, pH 7.5) на който етап AN 1528 започва да преципитира. Суспензиите са разбърквани отново на вортекс и са инкубирани за една нощ на 37°С, за употреба на следващия ден.
За изготвяне комбинирани дози с alum (Групи 1 и 5), Αβ пептид в PBS е добавен към Alhydrogel (2% воден алуминиев хидроксид гел, Saegeant, Inc., Clifton, MJ) за достигане концентрации от 100 цд Αβ пептид за 1 mg alum, Добавен е 10Х PBS до краен обем
126 на дозата 200 μΙ в 1XPBS. След това суспензията е разбърквана внимателно за около 4 часа на RT преди инжектирането.
За изготвяне комбинирани дози с MPL (Групи 2 и 6), лиофилизиран прах (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; Lot 67039-E0896B) е прибавен към 0.2% воден триетиламин, до крайна концентрация 1mg/ml и е разбъркван на вортекс. Сместа е загрята до 65-70°С за 30 секунди, за създаване на леко опалесцираща еднородна суспензия от мицели. Разтворът е съхраняван на 4°С. За всеки набор от инжекции, 100μg пептид за една доза в 50 μΙ PBS, 50 μg MPL за доза (50μΙ) и 100μΙ PBS за доза, са смесени в боросиликатна епруветка непосредствено преди употреба.
За изготвяне на комбинирани дози с QS-21 (Групи 3 и 7), лиофилизиран прах (Aquila, Framingham, МА; Lot A7018R) е прибавен към PBS, pH 6.6-6.7 до крайна концентрация 1mg/ml и са разбъркани на вортекс. Разтворът е съхраняван на -20°С. За всеки набор от инжекции, ЮОрд пептид за доза в 50 μΙ PBS, 25μο QS-21 за доза в 25μΙ PBS и 125μΙ PBS за доза, са смесени в боросиликатна епруветка непосредствено преди употреба.
За изготвяне на комбинирани дози с адювант на Freund (Група 4), 100μg AN1792 в 200μΙ PBS е емулгиран 1:1 (обем:обем) с Пълен адювант на Freund (CFA) в краен обем 400μΙ за първата имунизация. За последващи имунизации, антигенът е емулгиран по подобен начин с Непълен адювант на Freund (IFA). За комбинациите съдържащи адювантите alum, MPL или QS-21, 100 μg за доза AN 1792 или AN1528 е комбиниран с alum (1mg за доза) или MPL (50 μο за доза) или QS-21 (25 μρ за доза) в краен обем 200μΙ PBS и е въведен с подкожна инокулация на гърба между лопатките. За групата получаваща FA, 100 μg AN1792 е емулгиран 1:1 (обем:обем) с Пълен адювант на Freund (CFA) в краен обем 400 μΙ и въведен интраперитонеално за първата имунизация, последвана от бустер със
127 същото количество имуноген в Непълен адювант на Freund (IFA) за следващите пет дози. За групата получаваща AN1792 без адювант, Юцд AN1792 е комбиниран с 5цд thimerosal в краен обем 50μΙ PBS и е приложен подкожно. Деветата, контролна група получава само 200μΙ PBS приложен подкожно. Имунизациите са правени по двуседмична схема за първите три дози, след това по месечна схема, след което на дни 0, 16, 26, 56, 85 и 112. За измерване на антитяло титрите на животните е правено кръвопускане шест до седем дни след всяка имунизация, започвайки от втората доза. Животните са евтаназирани Ф приблизително една седмица след последната доза. Резултатите са определени с ELISA тест за Αβ и АРР нива в мозък и чрез имунохистохимично определяне наличието на амилоидни плаки в мозъчни срези. В допълнение, определяни са Αβ-специфични антитяло титри и Αβ-зависими пролиферативни и цитокинови отговори.
Таблица 10 показва, че най-високи антитяло титри срещу Αβ1-42 са предизвикани с FA и ΑΝ1792, титри, които имат максимум след втората имунизация ( пик GMT: 75,386) и след това намаляват с 59% след последната, шеста имунизация. Максималният среден титър президвикан от MPL с ΑΝ1792 е 62% по-нисък от този ® произведен с FA (пик GMT: 28,867) и е достигнат рано в имунизационната схема, след 3 дози, последван от спад до 28% от максималната стойност след шестата имунизация. Максималният среден титър произведен с QS-21 комбиниран с ΑΝ1792 (GMT: 1,511) е около 5-кратно по-нисък от този получен с MPL. В допълнение, кинетиките на отговора са по-бавни, тъй като се изисква допълнителна имунизация за достигане на максимален отговор. Титри получени от alum-свързан AN 1792 са гранично по-високи, в сравнение с тези получени с QS-21 и кинетикити на отговора са по-бързи. За AN1792 приложен в PBS с thimerosal, честотата и размерът на титрите са
128 малко по-големи в сравнение с този само с PBS. Максималните титри получени с MPL и AN1528 (пик GMT 3099) са около 9-кратно по-ниски от тези с AN1792. Свързан с alum AN1528 е много слабо имуногенен, с ниски титри получени само у някои животни. Не са наблюдавани антитяло отговори у контролни животни, имунизирани само с PBS.
Таблица 11
Геометрични средни антитяло титри
Седмица на кръвопускане
Геометрични средни антитяло титри
Седмица на кръвопускане
Третиране 3.3 5.0 9.0 13.0 17.0
Alum/ 102 1,081 2,366 1,083 572
AN1792 (12/21)” (17/20) (21/21) (19/21) (18/21)
MPL/ 6241 28,867 1,1242 5,665 8,204
AN1792 (21/21) (21/21) (21/21) (20/20) (20/20)
QS-21/ 30 227 327 1,511 1,188
AN1792 (1/20) (10/19) (10/19) (17/18) (14/18)
CFA/ 10,076 61,279 75,386 41,628 30,574
AN1792 (15/15) (15/15) (15/15) (15/15) (15/15)
Alum/ 25 33 39 37 31
AN1528 (0/21) (1/21) (3/20) (1/20) (2/20)
MPL/ 184 2,591 1,653 1,156 3,099
AN1528 (15/21) (20/21) (21/21) (20/20) (20/20)
QS-21/ 29 221 51 820 2,994
AN1528 (1/22) (13/22) (4/22) (20/22) (21/22)
PBS plus 25 33 39 37 47
Thimerosal (0/16) (2/16) (4/16) (3/16) (4/16)
PBS 25 25 25 25 25
(0/16) (0/16) (0/15) (0/12) (0/16)
Забележки: а Геометрични средни антитяло титри, измерени срещу Αβ1-42 ь Брой на отговарящи за дадена група
129
Резултатите от AN1792 или AN1528 третиране с различни адюванти, или thimerosal върху корово амилоидно натрупване у 12месечни мишки, получени с ELISA, са представени на Фиг.15. У PBS контролните PDAPP мишки, медианното ниво на тотален Αβ в кората на 12 месеца е 1,817 ng/g. Изключително редуцирани нива на Αβ са наблюдавани у мишки третирани с AN1792 плюс CFA/IFA. Обаче, както е показано в Примери I и III ефектите от имунизация за редуциране Αβ нивата, са съществено по-големи у 15-месечни и 18месечни мишки. Така, предвижда се, че допълнителни комбинации, по-специално ΑΝ1792 плюс alum, AN1792 плюс MPL и AN1792 плюс QS-21 препарати, ще осигурят по-положителни резултати при третиране на по-възрастни мишки. За разлика от това, AN1792 плюс консервант thimerosal, показва медианно ниво на Αβ почти същото като това у PBS третираните мишки. Сходни резултати са получени когато са сравнени корови нива на Αβ42. Медианното ниво на Αβ42 у PBS контроли е 1624 ng/g. Изключително редуцирани нива от 403, 1149, 620 и 714 са наблюдавани у мишки третирани с AN 1792 плюс CFA/IFA, AN1792 плюс alum, AN1792 плюс MPL и AN1792 плюс QS-21 съответно, с редукция достигаща статистическа значимост (р=0.05) за AN1792 CFA/IFA третираната група. Медианното ниво у AN1792 thimerosal третираните мишки е 1619 ng/g Αβ42.
X. Анализ за токсичност
Тъкани са взимани за хистопатологично изследване на края на проучванията, описани в Примери II, III и VII. В допълнение, хематология и клинична химия са правени на последни кръвни проби от Примери III и VI. Изследвани са повечето от главните органи, включително мозък, бели дробове, лимфна тъкан, стомашно-чревен тракт, черен дроб, бъбреци, надбъбреци и полови жлези. Въпреки, че са наблюдавани спорадични лезии у изследваните животни, няма
130 очевидни разлики в засегнатите тъкани или тежестта на лезиите, между AN1792 третирани и нетретирани животни. Няма уникални хистопатологични лезии отбелязани у AN1528 -имунизирани животни, в сравнение с PBS-третирани или нетретирани животни. Няма също разлики в клинико-химичния профил между групите с адювант и PBS третираните животни в Пример VI. Въпреки че има значителни повишения на някои от хематологичните параметри между животни третирани с AN1792 и адювант на Freund в Пример VI в сравнение с PBS третирани животни, този тип ефекти са очаквани от третиране с адювант на Freund и придружаващият перитонит и не показват някакви нежелани ефекти от AN1792 третирането. Въпреки че не е част от токсикологичната оценка, мозъчната патология на PDAPP мишка усилено е изследвана като част от крайната ефикасност. Няма данни от третиране, които са свързани с нежелан ефект върху мозъчната морфология, както е отбелязано в някои от проучванията. Тези резултати показват, че AN1792 третиране е добре поносимо и най-малкото е съществено лишено от странични ефекти.
XI. Терапевтично третиране с анти-Αβ антитела
Експериментите описани в този отдел са проведени за да се тестира способността на различни моноклонални и поликлонални антитела срещу Αβ да инхибират натрупването на Αβ в мозъка на хетерогеенни трансгенни мишки.
А. Проучване 1
1. План на проучването
Шестдесет мъжки и женски, хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки, на възраст 8.5 до 10.5 месеца, са получени от Charles River Laboratory. Мишките са разпределени в шест групи за да бъдат третирани с различни антитела насочени срещу Αβ. Животните са
131 разпределени да съвпадат по пол, възраст, произход и източник на животните в групите възможно най-близко. Както е показано на Таблица 12, антителата включват четири миши Αβ-специфични моноклонални антитела, 2НЗ (насочено срещу Αβ остатъци 1-12), 10D5 (насочено срещу Αβ остатъци 1-16), 266 (насочено срещу Αβ остатъци 13-28 и свързващо се с мономерни, но не с агрегиран ΑΝ1792), 21F12 (насочено срещу Αβ остатъци 33-42). Пета група е третирана с фракция от Αβ-специфично поликлонално антитяло (получено чрез имунизация с агрегиран AN 1792). Отрицателна контрола групата е получила разредителя, PBS, самостоятелно без антитяло.
Моноклоналните антитела са инжектирани в доза около 10mg/kg (приемайки, че мишките са с тегло 50д). Инжекциите са прилагани интраперитонеално всеки седем дни, средно да подържат анти-Αβ титри над 1000. Въпреки че по-ниски титри са измерени за mAb 266, тъй като то не се свързва добре с агрегирания AN1792, използуван като захващащ антиген в теста, същата схема за дозировка е подържана за тази група. Групата получаваща моноклонално антитяло 2НЗ е прекъсната в рамките на първите три седмици, тъй като антитялото се изчиства твърде бързо in vivo. На животните е правено кръвопускане преди всяко дозиране, за измерване на антитяло титрите. Третирането е продължило за период от 6 месеца, общо 196 дни. Животните са евтаназирани една седмица след последната доза.
132
Таблица 12
Експериментален дизайн на проучване 006
Третирана група N* Третиране антитяло Антитяло Специфичност Антитяло И30ТИП
1 9 попе (PBS само) NAb ΝΑ
2 10 Поликлонално ΑβΙ-42 смесен
3 0 mAbc2H3 Αβ1-12 IgGl
4 8 mAb 10D5 Αβ1-16 IgGl
5 б mAb 266 Αβ13-28 IgGl
6 8 mAb21F12 Αβ33-42 IgG2a
Забележки
a. Брой на мишките в група при завършване на експеримента. Всички групи започват с 10 животни в група.
b. NA: не приложим
c. mAb: моноклонално антитяло
2. Материали и методи
а. Получаване на антитела
Анти-Αβ поликлоналното антитяло е изготвено от кръв събрана от две групи животни. Първата група се състои от 100 женски Swiss Webster мишки на възраст 6 до 8 седмици. Те са имунизирани на дни 0, 15 и 29 със ЮОцд AN1792, комбиниран с CFA/IFA. Четвъртата инжекция е правена на 36-ия ден с половината от дозата на AN1792. Животните са обезкървявани при убиването на 42-ия ден, отделян е серум и серумите са обединявани за получаване общо на 64 ml. Втората група се състои от 24 женски мишки изогенни с PDAPP мишките, но не-трансгенни за човешкия АРР ген, на възраст 6 до 9
133 седмични. Те са имунизирани на дни 0,14, 28 и 56 със 100μρ ΑΝ1792, комбиниран с CFA/IFA. Тези животни също са обезкървени при убиването на 63-ия ден, отделян е серум и е обединяван за общо обем 14 ml. Двете серии серуми са обединени. Антитяло фракцията е пречистена с помощта на последващи цикли на утаяване с 50% наситен амониев сулфат. Последният преципитат е диализиран срещу PBS и тестиран за ендотоксин. Нивото на ендотоксин беше по-малко OTlEU/mg.
Анти-Αβ моноклоналните антитела са получени от асцитна течност. Течността най-напред е делипидирана чрез добавка на концентриран натриев декстран сулфат към ледено-студена асцитна течност, чрез разбъркване върху лед за достигне на крайна концентрация 0.238%. След това е добавян с разбъркване концентриращ СаС12 за постигане на крайна концентрация 64тМ. Този разтвор е центрофугиран на 10,000х g и утайката е отстранявана. Надстоящата течност е разбърквана на лед с равен обем наситен амониев сулфат прибавян на капки. Разтворът е центрофугиран отново на 10,000 х g и надстоящата течност е отстранявана. Утайката е ресуспендирана и диализирана срещу 20тМ Tris-HCI, 0.4 М NaCl, pH 7.5. Тази фракция е нанесена на Pharmacia FPLC Sepharose Q колона и елюирана с обратен градиент от 0.4М до 0.275 М NaCl в 20mM Tris-HCI, pH 7.5.
Антитяло максимумът е идентифициран чрез абсорбция при 280nm и съответните фракции са обединявани. Пречистеният антитяло препарат е характеризиран чрез измерване белтъчната концентрация с помощта на ВСА метод и на чистотата, като е използувана SDS-PAGE. Обединеното количество е тестирано за ендотоксин. Нивото на ендотоксин е по-малко от 1EU/mg титри, титри по-малки от 100 условно са означени като стойност на тигъра 25.
134
3. Αβ и АРР нива в мозъка:
След около шест месеца третиране с различни анти-Αβ антитяло препарати, мозъците са отделяни от животните след перфузия с физиологичен разтвор. Едната хемисфера е обработена за имунохистохимичен анализ, а втората е използувана за количествено определяне на Αβ и АРР нива. За измерване концентрациите на различни форми бета амилоиден пептид и амилоиден прекурсорен протеин (АРР), хемисферите са сецираи и са изготвени хомогенати в 5М гуанидин от хипокампална, корова и малкомозъчна области. Те са разреждани серийно и е определяно количествено нивото на амилоиден пептид или АРР чрез сравнение със серии от разреждания на стандарти от Αβ пептид или АРР, с известни концентрации в ELISA формат.
Нивата на тотален Αβ и Αβ1-42, измерени чрез ELISA в хомогенати от мозъчната кора и хипокампа и нивото на тоталния Αβ в малкия мозък са представени на Таблици 11, 12 и 13, съответно. Медианната концентрация на тотален Αβ за контролната група, инокулиран с PBS, е 3.6-кратно по-висока в хипокампа отколкото в кората (медиана 63,389 ng/g хипокампална тъкан, сравнена със 17,818 ng/g за мозъчната кора). Медианното ниво в малкия мозък на контролната група (30.6 ng/g тъкан) е повече от 2,000-кратно по-ниско от това в хипокампа. Тези нива са сходни с тези, които ние съобщихме по-рано за хетерозиготни PDAPP трансгенни мишки на тази възраст (Johnson-Woods et al., 1997).
За мозъчната кора, една третирана група има медианно Αβ ниво, измерено като Αβ1-42, различаващо се значимо от това на контролната група (р<0.05), тези животни са получавали поликлонално анти-Αβ антитяло, както е показано в Таблица 13. Медианното ниво на Αβ1-42 е намалено със 65% , сравнено с контролата за тази третирана група. Медианните нива на Αβ1-42 също са значимо намалени с 55%,
135 сравнени с контролата в една допълнителна група, тези животни са дозирани с mAb 10D5 (р =0.0433).
с: ю <0 co
CD □Г
S
Средни стойност 3. ELISA стойност 12621+/-5738 4454+/-3347 6943+/-3351 7489+/-6921 11005+/-6324
Total Αβ ι ELISA | стойност 16150+/- 7456* 5912+/- 4492 9695+/- 6929 9204+/- 9293 12481+/- 7082
CO X _ 05 o. C <n «Ί Ά 1 I ГЧ 1
Αβ42 πω o • X •X frl H- iz 0.0071 0.0433 0.1255 0.7003
1 ω o X g 13802 4892 6214 00 oo 13578
X X 1
X § S % Промяна !Z Ю 4 VD tn 1 o 5 *n •
Total Αβ ъ ο е ω 04 1 0.0055 6ΙΟΓΟ 0.1255 0.2898
< 0_ о I ELISA стойност' 1 00 00 ^4 6160 7915 9144 15158
< & σχ o 00 Ό 00
1 т п о 2 Третирана Група PBS T 4 5 « o S. 5 ί § s c mAb 10D5 x© X© <4 1 Ξ СЧ i
NA: не приложим е. Стандартно отклонение
136
В хипокампа, медианният процент намаление на тоталния Αβ, е свързан с третиране с поликлонално анти-Αβ антитяло (50%, р= 0.0055) не е толкова голям както наблюдавания за мозъчната кора (65%) (Таблица 14). Обаче, абсолютната величина на намалението е почти 3-кратно по-голям в хипокампа, в сравнение с кората, чисто намаление от 31,683 ng/g тъкан в хипокампа, срещу 11,658 ng/g тъкан в мозъчната кора. Когато е измерено като ниво на найамилоидогенните форми на Αβ, Αβ1-42, отколкото като тотален Αβ, намалението постигнато с поликлоналното антитяло е значимо (р=0.0025). Медиалните нива в групите третирани с mAb 10D5 и 266 са намалени съответно с 33% и 21% .
137
HIPPOCAMPUS Средни ι ! 1 $ CQ < ELISA Стойност о г’Т 1 ί О оо 04 Ά 24853+/-18262 $ «—< Ο* <η ТГ \ο СП [32919+/-25372 1 50305+/-23927
CO. 4 -3 ί ELISA стойност 00 О сп m •-4 1 + ΜΊ on 00 30058+/-22454 οι m νο 00 ^-4 + 00 •η 136419+/-27304 j 1 57327+/-28927
S X е 1 % Промяна ί -50 m 4-4 ΟΙ I 04 ΓΗ 1
iP стойност ί 0.0025 1 0.0543 ι 10.0990 ι 10.8099 ι
Αβ42 ELISA стойност Οι Ο) 3 27127 1 36290 1 143034 ι 147961 ι
% Промяна δ Ο «η 1 1 -26 I 1 1 Ο\ I
Total Αβ р | стойност’ ’ί 0.0055 10.0675 ι 10.0990 1 1 0.7728
ELISA стойност” 163389 1 31706 146779 1 148689 1 151563 1
Οχ ο 00 ο οο
ex И H fr tz> Вч Ο X 5 см 15 ξ *-g £ § 1П Q ο 1 Ό \ο ΟΙ mAb21F12 |
Стандартно отклонение
138
Тоталнен Αβ е измерен също в малкия мозък (Таблица 15). Тези групи, третирани с поликлоналното анти-Αβ и 266 антитялото показват значими намаления нивата на тоталния Αβ (43% и 46%, р=0.0033 и р=0.0184, съответно) и групата третирана с 10D5 има близко значимо намаление (29%, р=0.0675).
Таблица 15
МАЛЪК МОЗЪК
Третирана група № Медиани Средни
Total Αβ Total Αβ
ELISA Стойность P стойност* % Промяна ELISA стойност
PBS 9 30.64 NAd ΝΑ 40.00+/-31.89'
Поликлонално anti-Ap42 10 17.61 0.0033 -43 18.15+/-4.36
mAb 10D5 8 21.68 0.0675 -29 27.29+/-19.43
mAb 266 6 16.59 0.0184 -46 19.59+/-6.59
mAb 21F12 8 29.80 >0.9999 -3 32.88+/-9.90
Забележки:
a. Брой на животните в група в края на експеримента
b. Ng/g тъкан
c. Mann Whitney анализ
d. ΝΑ: не приложим
e. Стандартно отклонение
Определяна е също концентрацията на АРР с ELISA в мозъчната кора и малкия мозък от антитяло-третирани и контролни, PBS-третирани мишки. Използувани са два различни АРР тестове. Първият, означен като APP-ot/FL, разпознава АРР-алфа (а, секретираната форма на АРР, която е разцепена в Αβ последователността), пълноразмерните форми (FL) на АРР, докато вторият
139 разпознава само ΑΡΡ-α. За разлика от свързаното с третиране намаление на Αβ в една подгрупа от третираните групи, нивата на АРР са действително непроменени във всички от третираните, сравнени с контролните животни. Тези резултати показват, че имунизациите с Αβ антитела разрушават Αβ без да разрушават АРР.
В резюме, Αβ нива са значително намалени в мозъчната кора, хипокампа и малкия мозък у животни, третирани с поликлоналното антитяло, предизвикано срещу ΑΝ1792. В по-малка степен моноклонални антитела срещу амино-терминалната област на Αβ1-42, специфично аминокиселини 1-16 и 13-28 също показват значими ефекти от третиране.
4. Хистохимични анализи:
Морфологията на Αβ-имунореактивните плаки в една подгрупа мозъци от мишки на PBS, поликлонално Αβ42, 21F12, 266 и 10D5 третирани групи е сравнена качествено с тази от предишни проучвания, в които са следвани стандартните имунизационни процедури с Αβ42.
Най-обширни промени в степента и изгледа на амилоидни плаки се появяват у животните имунизирани с поликлоналното Αβ42 антитяло. Намаляването на амилоидното натрупване, еродираната морфология на плаките и клетъчно-свързаната Αβ имунореактивност, близко наподобява ефектите, предизвикани от стандартната имунизационна процедура. Тези наблюдения подкрепят резултатите от ELISA, при които са постигнати значими намаления на тоталния Αβ и Αβ42 чрез въвеждане на поликлоналното Αβ42 антитяло.
В подобни качествени оценки, амилоидни плаки в 10D5 групата също са редуцирани по брой и вид, с известни данни за клетъчно-свързана Αβ имунореактивност. Главните разлики не са видими когато са сравнени 21F12 и 266 групите с PBS контролите.
140
3. Измерване на антитяло титри:
На една подгрупа от три произволно избрани мишки от всяка група е правено кръвопускане, непосредствено преди всяка интраперитонеална инокулация, общо 30 кръвопускания. Антитяло титрите са измерени като ΑβΙ-42-свързване на антитяло, като е използувана сандвич ELISA с пластмасови мулти-ямкови платки, покрити с Αβ1-42, както е описано подробно в Общи материали и методи. Средни титри за всяко кръвопускане са представени на Фигури 16-18 съответно за поликлоналното антитяло и ©моноклоналните антитела 10D5 и 21F12. Титрите са около 1:1000 за този период от време за препарата от поликлоналното антитяло и малко над това ниво за 10D5- и 21Р12-третираните животни.
5. Лимфопролиферативни отговори
Αβ-зависима лимфопролиферация е измерена като са използувани клетки от слезка, събрани осем дни след последната антитяло инфузия. Свежо събрани клетки, 105 за ямка, са култивирани за 5 дни в присъствие на Αβ1-40 при концентрация 5μΜ за стимулация. Като положителна контрола, допълнителни клетки са култивирани с Т клетъчен митоген, РНА, и като отрицателна контрола, © клетки са култивирани без добавен пептид.
Спленоцити от възрастни PDAPP мишки, пасивно имунизирани с различни анти-Αβ антитела, са стимулирани in vitro с AN 1792 и са измервани пролиферативните и цитокинови отговори. Целта на тези изследвания е да се определи, дали пасивната имунизация улеснява наличието на антиген и така да индуцира Т клетъчни отговори, специфични за AN 1792. Не са наблюдавани АМ1792-специфични пролиферативни или цитокинови отговори у мишки, пасивно имунизирани с анти-Αβ антителата.
141
В. Проучване 2
Във второ проучване, третиране с антитяло 10D5 е повторено и са тестирани две допълнителни анти-Αβ антитела, моноклонални антитела 3D6 (Αβμ5) и 16С11 (Αβ33.42)· Контролни групи са получили PBS или несъответно изотип-сдвоено антитяло (ТМ2а). Мишките са по-възрастни (11.5-12-месечни хетерозигоотни) в сравнение с предишното проучване; иначе, експерименталният дизайн е същия. Отново, след шест месеца третиране, 10D5 редуцира натрупването на плаки с повече от 80% в сравнение с PBS или изотип-сдвоените антитяло контроли (р=0.003). Едно от другите антитела срещу Αβ, 3D6, е еднакво ефективно, предизвикващо 86% намаление (р=0.003). За разлика от това, третото антитяло срещу пептида, 16С11, няма никакъв ефект върху натрупването на плаки. Сходни открития са получени с Αβ42 ELISA измервания. Тези резултати демонстрират, че антитяло отговор срещу Αβ пептид, в отсъствие на Т клетъчен имунитет, е достатъчен да намали амилоидно отлагане у PDAPP мишки, но не всички анти-Αβ антитела са ефикасни. Антитела насочени срещу епитопи съдържащи аминокиселини 1-5 или 3-7 от Αβ са особено ефикасни.
Тези проучвания демонстрират, че пасивно въведени антитела срещу Αβ намаляват степента на отлагане на плаки у миши модел на болест на Alzheimer. Когато са задържани на умерени серумни концентрации (25-75цд/т1), антителата получават достъп до централната нервна система в нива достатъчни за декорират βамилоидни плаки. Навлизането на антитела в централната нервна система не се дължи на абнормно пропускане на кръвно-мозъчната бариера, тъй като няма повишение на съдовия пермеабилиитет, според измерване с Evans Blue у PDAPP мишки. В допълнение, концентрацията на антитяло в мозъчния паренхим на възрастни PDAPP мишки е същата както у не-трансгенни мишки,
142 представляваща 0.1% от антитяло концентрацията в серума (по отношение на изотип).
С. Проучване 3: Контрол на антитяло свързване
За определяне дали антитела срещу Αβ могат да действуват директно в централната нервна система, мозъци взети от перфузирани с физиологичен разтвор мишки на края на Пример XII, са изследвани за наличие на периферно-въведени антитела. Нефиксирани криостатни мозъчни срези са излагани на действие на флуоресцентен реагент срещу миши имуноглобулин (кози анти-миши lgG-СуЗ). Плаки в мозъци на 10D5 и 3D6 групите са силно декорирани с антитяло, докато в 16С11 групата няма оцветяване. За разкриване напълно степента на отлагане на плаки, серийни срези от всеки мозък най-напред са имунореагирали с анти-Αβ антитяло и след това с вторичен реагент. 10D5 и 3D6, след периферно въвеждане, получават достъп до повечето плаки в централната нервна система. Отлагането на плаки е силно редуцирано в тези третирани групи, в сравнение с 16С11 групата. Тези данни показват, че периферно въведени антитела могат да навлизат в централната нервна система, където те могат директно да предизвикат амилоидно очистване. Възможно е 16С11 също да има достъп до плаките, но да е неспособно да се свързва с плаките.
XII. Профилактика и лечение на хора
За определяне безопасност при хора е проведено единична доза фаза I изпитване. Терапевтичен агент е въвеждан в нарастваща дозировка на различни пациенти, започвайки от около 0.01 от нивото на предвиждана ефикасност и нараствайки с един фактор от три докато се достигне около 10 пъти ефективната миша дозировка.
Фаза II на изпитването е проведена за определяне на терапевтичната ефикасност. Пациенти с ранна до средна болест на
143
Alzheimer, определена като са използувани критериите на Alzheimer’s disease and related Disorders Association (ADRDA) (Асоциация на болест на Alzheimer и сродни нарушения), са подбрани за вероятна AD. Подходящи пациенти са оценявани по 12-26 степенния Mini-mental Stat Exam (MMSE) )Мини-ментален щатски изпит). Други критерии за подбор са възможността пациентите да преживеят продължителността на изследването и липсата на усложняващи причини, като употребата на придружаващи медикаменти, които могат да повлияват. Изходните определения за функциите на пациента са правени с класически психометрични измервания, като MMSE и ADAS, която е сравнителна скала за оценка на пациентите, чието състояние и функция са свързани с болест на Alzheimer. Тези психометричните скали предоставят мярка за прогресиране състоянието на Alzheimer заболяването. Подходящи скали за качеството на живот могат също да бъдат използувани за контрол на третирането. Прогресирането на заболяването може също да бъде контролирано с MRI. Кръвни профили на пациенти могат също да бъдат контролирани, включително проби за имуноген-специфични антитела и Т-клетъчни отговори.
След изходните измервания, пациентите получават лечение. Те са произволно разпределени и третирани с терапевтичен агент или плацебо по слеп начин. Пациентите са контролирани най-малко на шест месеца. Ефикасността е определяна по специфично намаление прогресирането на третирана група в сравнение с плацебо група.
Втора фаза II на проучването е проведена за оценка превръщането на пациенти с ранна загуба на паметта от не-Alzheimer заболяване, понякога обозначавано като възрастово-свързано нарушение на паметта (AAMI) или леко когнитивно нарушение (MCI), във възможна болест на Alzheimer, определена с ADRDA критерии. Пациенти с висок риск за превръщане в болест на Alzheimer, са
144 подбрани от не-клинична популация чрез скрининг на референтна популация за ранни симптоми за загуба на памет или други затруднения, свързани с npe-Alzheimer симптоматология, фамилна анамнеза за болест на Alzheimer, генетични рискови фактори, възраст, пол и други особености, намерени, че предсказват висок риск за болест на Alzheimer. Събрани са изходни данни за подходящи метрични единици, включително MMSE и ADAS, заедно с други метрични единици, предвидени да оценят една по-нормална популация. Тези популации от пациенти са разделени на подходящи групи за сравнение с плацебо срещу алтернативни дозировки с ® агента. Тези популации от пациенти са последвани от интервали от около шест месеца и крайния срок за всеки пациент е в зависимост дали той или тя са се превърнали във възможна болест на Alzheimer, както е определено с критериите на ADRDA на края на наблюдението.
XIII. Общи материали и методи
1. Измерване на антитяло титри
На мишките е правено кръвопускане чрез малък срез на опашната вена и събиране около 200μΙ кръв в микро центрофужна епруветка. На морските свинчета е правено кръвопускане, като най© напред е избръснато място на задния крак и след това използувайки игла с размер 18 е пробивана метатарзалната вена и кръвта е събирана в микро центрофужни епруветки. Кръвта е оставяна да се съсири за един час на стайна температура (RT), разбърквана е на вортекс и след това е центрофугирана на 14,000х g за 10 минути, за отделяне съсирека от серума. След това серумът е прехвърлен в чиста центрофужна епруветка и съхраняван на 4°С докато се титрира.
Антитяло титрите са измерени с ELISA. 96-ямкови платки (Costar El А платки) са покрити със 100μΙ разтвор съдържащ 10цд/т1
Αβ42 или SAPP или други антигени, както е отбелязано във всеки от
145 отделните протоколи в Well Coating Buffer (Буфер за покриване на ямки) (0.1 М натриев фосфат, pH 8.5, 0.1% натриев азид) и са държани за една нощ на стайна температура. Ядките са аспирирани и са добавени серуми в ямките, започвайки при 1/100 разреждане в стандартен разредител (0.014 М натриев фосфат, pH 7.4, 0.15 М NaCl, 0.6% говежди серум албумин, 0.05% thimerosal). Направени са седем серийни разреждания на пробите направо в платките, на трикратни етапи за достигане крайно разреждане от 1/218,700. Разрежданията са инкубирани в покритите ямки на платките за един час на RT. След ©това платките са измити четири пъти с PBS съдържащ 0.05% Tween
20. Второто антитяло, кози анти-миши Ig конюгиран с пероксидаза от хрян (получена от Boehringer Mannheim), е добавен към ямките като ΊΟΟμΙ1/3000 разреждане в стандартен разредител и са инкубирани за един час на RT. Платките са измити отново четири пъти cPBS, Tween 20. За развитие на хромогена, 100μΙ Slow ТМВ (3,3’,5,5’-тетраметил бензидин от Pierce Chemicals) са добавени към всяка ямка и са инкубирани за 15 минути на RT. Реакцията е прекъсвана чрез добавка на 25μΙ 2М H2SO4. Интезитета на оцветяването е отчитан на Molecular Devices Vmax при (450nm - 650nm).
Титрите са определени като реципрочни на серумното © разреждане, което дава % максималната OD. Максимална OD обикновено е взимана от едно начално 1/100 разреждане, с изключение на случаите с много високи титри, в който случай е необходимо по-високо начално разреждане за определяне на максималната OD. Ако 50% пункт попадне между две разреждания, се прави линейна екстраполация за изчисление на крайния титър. За изчисление на геометрични средни антитяло титри, титри, които са помалки от 100 условно, са означени със стойност на тигъра от 25.
146
2. Лимфоцитен пролиферативен тест
Мишките са анестезирани с изофлуран. Отделени са слезките и са изплакнати два пъти с 5 ml PBS, съдържащ 10% топлинно инактивиран фетален говежди серум (PBS-FBS) и след това са хомогенизирани в 50° Centricon unit (Dako A/S, Denmark) в 1.5 ml PBSFBS за 10 секунди при 100 об.мин. в Medimachine (Dako), последвано от филтриране през найлоново сито със 100 микрона големина на порите. Спленоцитите са измити отново с 15ml PBS-FBS, след това са утаени чрез центрофугиране на 200 х g за 5 минути. Червените кръвни клетки са лизирани чрез ресуспендиране на утайката в 5 ml буфер, съдържащ 0.15 М NH4CI, 1М КНСОЗ, 0.1 М NaEDTA, pH 7.4 за 5 минути на RT. След това левкоцитите са измити както по-горе. Свежо изолирани клетки от слезка (105 клетки за ямка) са култивирани в три повторения в 96-ямкови U-дънни третирани за клетъчни култури микротитрационни платки (Coming, Cambridge, МА) в RPMI 1640 среда (JRH Biosciences, Lenexa, KS), допълнена с 2.5 mM L глугамин, 1% пеницилин/стрептомицин и 10% топлинно-инактивиран FBS, за 96 часа на 37°С. Различни Αβ пептиди, Αβ1-16, Αβ1-40, Αβ1-42 или Αβ40-1 белтък с обратна последователност, също са добавени в дози в границите на 5 до 0.18 микромоларни на четири етапа. Клетки в контролни ямки са култивирани с Concanavalin A (Con A) (Sigma, cat.# С-5275, при 1микрограм/т1) без добавен белтък. Клетките са белязани пулсово за последните 24 часа с 3Н-тимидин (1цС|/ямка, получен от Amersham Corp .Arlington Heights IL). След това клетките са събрани върху UniFilter платки и са изброени в Top Count Microplate Scintillation Counter (Packard Instruments, Downers Grove, IL). Резултатите са изразени като импулси на минута (срт) включена радиоактивност в неразтворими макромолекули.
м
147
3. Препарат от мозъчна тъкан
След евтаназия, мозъците са отделени и едната хемисфера е обработена за имунохистохимичен анализ, докато три мозъчни области (хипокамп, мозъчна кора и малък мозък) са сецирани от другата хемисфера и са използувани за определяне концентрацията на различни Αβ белтъци и АРР форми, като са използувани специфични ELISAs (Johnson Wood et al., по-горе).
Тъканите определени за ELISAs са хомогенизирани в 10 обема ледено студен гуанидинов буфер (5.0 М гуанидин-HCI, 50тМ Трис-HCI, pH 8.0). Хомогенатите са размесени чрез внимателно разклащане като е използуван Adams Nutator (Fisher) за 3-4 часа на RT, след това са съхранявани на -20°С преди количественото определяне на Αβ и АРР. Предварителни експерименти показват, че анализираният материал е стабилен при тези условия на съхранение, и че синтетичен Αβ белтък (Bachem) може количествено да бъде възстановен когато е прибавен в хомогенати от контролна мозъчна тъкан от миши котила (Johnson-Wood et al., по-горе).
4. Определяне на Αβ нива
Мозъчните хомогенати са разредени 1:10 с ледено-студен казеинов разредител (0.25% казеин, PBS, 0.05% натриев азид, 20цд/т1 апротинин, 5 mM EDTA pH 8.0, 10 цд/т1 леупептин) и след това са центрофугирани при 16,000 х д за 20 минути на 4°С. Синтетичните Αβ белтъчни стандарти (1-42 аминокиселини) и АРР стандартите са изготвени да включват 0.5 М гуанидин и 0.1% говежди серум албумин (BSA) в крайния състав. “Тоталната” Αβ сандвич ELISA използува моноклонално антитяло 266, специфично за аминокиселини 13-28 от Αβ (Seubert et al.), като захващащо антитяло и биотинилирано моноклонално антитяло 3D6, специфично за аминокиселини 1-5 от Αβ (Johnson-Wood et al.), като репортерно антитяло. Моноклоналното
148 онтитяло 3D6 не разпознава секретиран АРР или пълноразмерен АРР, но открива само Αβ видове с амино-крайна аспаргинова киселина. Този тест има по-ниска граница на чувствителност от -50ng/ml (11 пМ) и не проявява кръстосана реактивност към ендогенния миши Αβ белтък при концентрация до 1ng/ml (JohnsonWood еу al., по-горе).
Αβ1-42 специфичната сандвич ELISA използува πιΑβ 21F12 , специфично за аминокиселини 33-42 от Αβ (Johnson-Wood et al.), като захващащо антитяло. Биотинилирано ηηΑβ 3D6 е също репортерното антитяло в този тест, което има по-ниска граница на чувствителност от ® около 125 цд/т1 (28 μΜ, Johnson-Wood et al.). За Αβ ELISAs, 100μΙ от mAp 266 (при 1Ομο/ΓπΙ) или ηηΑβ 21F12 при (δμρ/πηΙ) са нанесени да покрият ямките на 96-ямкови имунотест платки (Costar) чрез инкубация за една нощ на RT. Разтворът е отстранен чрез аспириране и ямките са блокирани чрез добавка на 200μΙ 0.25% човешки серум албумин в PBS буфер за най-малко един час на RT. Блокиращият разтвор е отстраняван и платките са съхранявани изсушени при 4°С до употреба. Платките са рехидратирани с буфер за измиване [Трисбуфериран физиологичен разтвор (0.15М NaCl, 0.01 М Трис-HCI, pH 7.5), плюс 0.05% Tween 20] преди употреба. Пробите и стандартите са © добавени по три успоредни порции от 100μΙ за ямка и са инкубирани за една нощ на 4°С. Платките са измити най-малко три пъти с буфер за измиване между всеки етап от теста. Биотинилираното πιΑβ 3D6, разредено до 0.5цд/т! в буфер за казеинов тест (0.25% казеин, PBS, 0.05 Tween 20, pH 7.4), е добавено и инкубирано в ямките за 1 час на RT. Авидин-пероксидаза от хрян конюгат (Avidin-HRP получена от Vector, Burlingame, СА), разреден 1:4000 в буфер за казеинов тест, е добавен към ямките за 1 час на RT. Колориметричният субстрат Slow TMB-ELISA (Pierce), е добавен и е оставен да реагира за 15 минути на RT, след което ензимната реакция е прекъсвана чрез добавяне на
149 μΙ 2Ν H2SO4. Реакционният продукт е определен количествено като е използуван Molecular Devices Vmax, измервайки разликата на абсорбцията при 450 nm и 650 nm.
5. Определяне на АРР нива
Използувани са два различни АРР теста. Първият, означен като ΑΡΡ-α/FL, разпознава APP-alpha(a) и пълноразмерни (FL) форми на АРР. Вторият тест е специфичен за APP-a. APP-a/FL тестът разпознава секретиран АРР, включително първите 12 аминокиселини от Αβ. Тъй като репортерното антитяло (2НЗ) не е специфично за азакачващото-място (a-clip-site), намиращо се между аминокиселини 612-613 от АРР695 (Esch et al., Science 248, 1122-1124 (1990)); този тест разпознава също пълноразмерен АРР (АРР-FL). Предварителни експерименти, използувайки имобилизирани АРР антитела срещу цитоплазмената опашка на АРР-FL за изчерпване мозъчни хомогенати от АРР-FL, насочват, че приблизително 30-40% от APP-a/FL е FL (данните не са представени). Захващащото антитяло за APP-a/FL и АРР-a тестовете е mAb 8Е5, предизвикано срещу аминокиселини 444 до 592 от АРР695 формата (Games et al., по-горе). Репортерното mAb за ΑΡΡ-α/FL теста е mAb 2НЗ, специфично за аминокиселини 597-608 от АРР695 (Johnson-Wood et al., по-горе) и репортерното антитяло за АРР-а теста е биотинилирано производно на mAb 16Н9, предизвикано срещу аминокиселини 605 до 611 от АРР. По-ниската граница на чувствителност на APP-aFL теста е около 11ng/ml (150 рМ) (JohnsonWood et al.) и тази на АРР-а специфичен тест е 22ng/ml (0.3 пМ). За двата АРР теста, mAb 8Е5 е нанесено да покрие ямките от 96-EIA платки, както е описано по-горе за mAb 266. Пречистен, рекомбинангно секретиран АРР-а, е използуван като референтен стандарт за АРР-а теста и ΑΡΡ-α/FL теста (Esch et al., по-горе). Пробите от мозъчен хомогенат в 5 М гуанидини са разредени 1:10 в
150 стандартен разредител за ELISA ( 0.014 М фосфатен буфер, pH 7.4, 0.6% говежди серум албумин, 0.05% thimerosal, 0.5М NaCI, 0.1% NP40). След това те са разредени 1:4 в стандартен разредител съдържащ 0.5М гуанидин. След това разредените хомогенати са центрофуирани при 16,000х g за 15 секунди на RT. АРР стандартите и пробите са добавени към платката в две успоредни проби и са инкубирани за 1.5 часа на RT. Биотинилираното репортерно антитяло 2НЗ или 16Н9 е инкубирано с проби за 1 час на RT. Стрептавидиналкална фосфатаза (Boehringer Mannheim), разредена 1:1000 със стандартен разредител, е инкубирана в ямките за 1 час на RT. Флуоресцентният субстрат 4-метил-умбелиферил-фосфат е добавен за 30 минутна инкубация на RT и платките са отчитани на Cytofluor tm 2350 fluorimeter (Millipore) при 356 nm облъчване и 450 nm емисия.
6. Имунохистохимия
Мозъците са фиксирани за три дни на 4°С в 4% параформалдехид в PBS и след това са съхранявани от един до седем дни на 4°С в 1% параформалдехид в PBS докато бъдат сецирани. Коронарни срези с дебелина 40μ са рязани на вибратом на RT и са съхранявани в криопротектор (30% глицерол, 30% етилен гликол във фосфатен буфер) на -20°С преди имунохистохимична обработка. За всеки мозък, шест срези на нивото на дорзалния хипокамп, всеки отделен чрез последователни 240цт интервали, са инкубирани за една нощ, с едно от следните антитела: (1) биотинилирано анти-Αβ (mAb, 3D6, специфично за човешки Αβ), разредено до концентрация 2μg/ml в PBS и 1% конски серум; или (2) биотинилирано mAb специфично за човешки АРР, 8Е5 , разредено до концентрация Зμg/ml в PBS и 0.1% конски серум; или (3) тАЬ специфично за глиялен кисел белтък (GFAP; Sigma Chemical Co.), разредено 1:500 с 0.25% Triton-X-100 и 1% конски серум, в Трие151 буфериран физиологичен разтвор, pH 7.4 (TBS); или (4) mAb специфично за CD11b, МАС-1 антиген, (Chemicon International), разреден 1:100 с 0.25% Triton-Х-ЮО и 1% заешки серум в TBS; или (5) mAb специфично за МНС II антиген, (Pharmingen) разредено 1:100 с 0.25% Тритон-Й-100 и 1% заешки серум в TBS; или (6) плъшо mAb специфично за CD 43 (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS или (7) плъшо mAb специфично за CD 45RA (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (8) плъшо моноклонално Αβ специфично за CD 45RB (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (9) плъшо моноклонално Αβ специфично за CD 45 (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS; или (10) биотинилирано поликлонално от хамстер Αβ специфично за CD3e (Pharmingen) разредено 1:100 с 1% заешки серум в PBS или (11) плъшо mAb специфично за CD3 (Serotec) разредено 1:200 с 1% заешки серум в PBS; или с (12) разтвор на PBS без първично антитяло, съдържащ 1% нормален конски серум.
Срези реагирали с антитяло разтворите, изброени в 1,2 и 6-12 са претретирани с 1.0%Triton-X-100, 0.4% водороден прекис в PBS за 20 минути на RT, за блокиране на ендогенната пероксидаза. След това те са инкубирани за една нощ на 4°С с първично антитяло. Срези реагирали с 3D6 или 8Е5, или CD3e mAb, след това са реагирали за един час на RTc пероксидаза от хрян-авидин-комплекс с компонентите “А” и “В” на кита, разреден 1:75 в PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, СА). Срези реагирали c антитела специфични за CD 45RA, CD 45RB, CD 45, CD3 и PBS разтвора без първично антитяло, са инкубирани за един час на RT с биотинилиран антиплъши IgG (Vector), разреден 1:75 в PBS или биотинилиран антимиши IgG (Vector), разреден в PBS, съответно. След това срезите са реагирали за един час на RT с пероксидаза от хрян-авидин-биотин152 комплекс c компонентите А” и В” от кита, разредени 1:75 в PBS (Vector Elite Standard Kit, Vector Labs, Burlingame, CA).
Срезите са третирани в 0.01% водороден прекис, 0.05% 3,3’диаминобензидин (DAB) на RT. Срезите определени за инкубация с GFAP-, МАС-1 и МНС ll-специфични антитела са претретирани с 0.6% водороден прекис на RT за блокиране ендогенната пероксидаза, след това са инкубирани за една нощ с първичното антитяло на 4°С. Срезите реагирали с GFAP антитяло са инкубирани за един час на RT с биотинилиран анти-миши IgG правен у кон (Vector Laboratories, Vectastain Elite ABC Kit), разреден 1:200 c TBS. След това срезите са реагирали за един час с авидин-биотин-пероксидаза комплекс (Vector Laboratories; Vectastain Elite ABC Kit), разреден 1:1000 c TBS. Срезите инкубирани c МАС-1 или MAC ll-специфично моноклонално антитяло като първично антитяло, са реагирали последователно са един час на RT с биотинилиран анти-миши IgG направен у заек, разреден 1:200 cTBS, последвани от инкубация за един час с авидин-биотинпероксидаза комплекс, разреден 1:1000 с TBS. Срези инкубирани с GFAP-, МАС-1 и МАС ll-специфични антитела след това са визуализирани чрез третиране на RT с 0.05% DAB, 0.01% водороден прекис, 0.04% никелов хлорид, TBS за 4 и 11 минути, съответно.
Имунобелязани срези са монтирани върху предметни стъкла (VWR, Superfrost slides), изсушени са на въздух за една нощ, потапяни са в Propar (Anatech) и са покрити с покривни стъкла, като е използувана Permount (Fisher) като монтираща среда.
За контрастно оцветяване на Αβ плаки, една подгрупа от
GFAP-положителни срези са монтирани върху Suprfrost предметни стъкла и са инкубирани във воден 1% Thioflavin S (Sigma) за 7 минути, последвано от имунохистохимична обработка. След това срезите са дехидратирани и просветлени в Ргораг, след това са покрити с покривни стъкла и монтирани с Permount.
153
7. Анализ на образи
За количествена оценка на имунореактивните стъкла е използувана Videometric 150 Image Analysis System (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD), свързана c Nikon Micropho t-FX микроскоп чрез CCD видео камера и Sony Trinitron монитор. Образът на среза е съхраняван във видео буфер и е определян праг на базата на цвят и насищане, за да се подбере и изчисли тоталната pixel площ, заета от имунобелязаните структури. За всеки срез, хипокампа е очертаван на ръка и е изчислявана тоталната pixel площ, заета от хипокампа. ©Процентът амилоидно натрупване е измерван като: (фракцията от хипокампалната площ, съдържаща Αβ отлагания, имунореактивни с гпАЬ 3D6) х 100. Подобно, процентът невритно натрупване е измерен като : (фракцията от хипокампалната площ, съдържаща дистрофични неврити, реактивни с моноклонално антитяло 8Е5) х 100. C-lmaging System (Compix, Inc., Camberry Township, PA), оперираща със Simple 32 Software Application Program е свързана c Nikon Microphot-FX микроскоп, чрез Optronics камера и е използувана за количествено определяне процента от ретросплениялната кора (retrosplenial cortex), зает от GFAP-положителни астроцити и МАС-I- и МАС П-положителна микроглия. Образът на имунореактивния срез е съхраняван във видео © буфер и е определян монохром-базирания праг за подбор и изчисление на тоталната pixel площ, заета от имунобелязани клетки. За всеки срез, ретросплениапната кора (RSC) е очертавана на ръка и е изчислявана тоталната pixel площ заета от RSC. Процентът астроцитоза е дефиниран като (фракцията от RSC, заета от GFAPреактивни астроцити) х 100. Подобно, процентът микроглиоза е определен като: (фракцията от RSC заета от МАС-I- или МНС llреактивна микроглия) х 100. За всички анализи на образи, шест срези на нивото на дорзалния хипокамп, всеки отделен от последователни 240μτη интервали, са определени количествено за всяко животно. Във
154 всички случаи, статусът от третиране на животните е неизвестен за наблюдаващия.
XIV: Ex vivo скрининг тест за активност на антитяло срещу амилоидни отлагания
Въведен е ex vivo тест, при който първични микроглиялни клетки с култивирани с нефиксирани криостаатни срези от PDAPP миши или човешки AD мозъци, за да се изследват ефектите на антитела върху очистване на плаки. Микроглиялни клетки са получени ф от мозъчна кора на неонатални DBA/2N мишки (1-3 дневни). Мозъчната кора е раздробена механично в HBSS’ (Hank’s Balanced Salt Solution, Sigma - Hank’s балансиран солеви разтвор) c 50 μοΛηΙ ДНКаза I (Sigma). Дисоциираните клетки са филтрувани със 100gm кпетъчена цедка (Falcon) и са центрофугирани на 1000 об.мин. за 5 минути. Утайката е ресуспендирана в среда за развитие (DMEM с високо глюкозно съдържание, 10% FBS, 25ng/ml rmGM-CSF), и клетките са посети с плътност от 2 мозъка за Т-75 пластмасови шишета за култивиране (матраци). След 7-9 дни, шишетата са завъртани в орбитална клатачка при 200 об.мин. за 2 часа на 37°С. ф Клетъчната суспензия е центрофугирана на 1000 об.мин. и е суспендирана в средата за тестиране.
10-μτη криостатни срези от PDAPP миши или човешки AD мозъци (post mortem интервал < 3 часа) са монтирани размразени върху покрити с полилизин кръгли покривни стъкла и са поставени в ямките на 24-ямкови платки за култивирани. Покривните стъкла са измити двукратно със среда за тестиране, състояща се от H-SFM (Hybridoma-serum free medium Gibco BRL - Хибридома безсерумна среда) с 1% FBS, глутамин, пеницилин/стрептомицин и 5ng/ml rmGMCSF (R&D). Добавени са контролни или анти-Αβ антитела в 2х концентрацията (5pg/ml крайна) за един час. След това микро
155 глиялните клетки са посети с плътност 0.8 х 10s клетки/ml среда за тестиране. Културите са подържани във влажна среда в инкубатор (37°С, 5% СО2) да 24 часа или по-дълго. На края на инкубацията, културите са фиксирани с 4% параформалдехид и са пермеабилизирани с 0.1% Triton-X-100. Срезите са оцветени с биотинилирано 3D6 последвано от стрептавидин/СуЗ конюгат (Jackson ImmunoResearch). Екзогенните микроглиялни клетки са визуализирани с ядрено багрило (DAPI). Културите са наблюдавани с инвертен флуоресцентен микроскоп (Nikon, ТЕ300) и фото микроснимки са правени със SPOT дигитална камера като е изпозувана SPOT програма (Diagnostic instruments). За Western blot анализ, културите са екстрахирани с 8М урея, разредени са 1:1 в редуциращ трицин буфер и са нанесени на 16% трицин гел (Novex). След пренос върху имобилон, блотовете са третирани с 5цд/т1 раЬАр42, последвано от HRP-конюгирано анти-мишо антитяло и са проявени с ECL (Amersham).
Когато тестът е правен със срези от PDAPP мозъци в присъствието на антитяло 16С11 (едно от антителата срещу Αβ, което не е ефикасно in vivo), β-амилоидните плаки остават интактни и не се наблюдава фагоцитоза. За разлика от това, когато съседни срези са култивирани в присъствието на 10D5, амилоидните отлагания са изчезнали в обширни области и микроглиялните клетки показват многобройни фагоцитни мехурчета, съдържащи Αβ. Идентични резултати са получени с AD мозъчни срези, 10D5 индуцирана фагоцитоза на AD плаки, докато 16С11 е неефективно. В допълнение, тестът предоставя сравними резултати, когато е проведен с миши или човешки микроглиялни клетки и с миши или заешки, или от бозайници антитела срещу Αβ.
Таблица 16 показва, че резултати получени с няколко антитела срещу Αβ, като сравнява тяхната способност да индуцират
156 фагоцитоза в in vivo тест и да редуцират in vivo натрупване на плаки в проучвания с пасивен пренос. Въпреки че 16С11 и 21F12 се свързват с агрегиран синтетичен Αβ пептид с висока активност, тези антитела са неспособни да реагират с β-амилоидни плаки в нефиксирани мозъчни срези, не могат да предизвикат фагоцитоза в ex vivo тест и не са ефикасни in vivo. 10D5, 3D6 и поликлонално антитяло срещу Αβ са активни и с трите измервания. 22С8 антитялото се свързва посилно с форма аналог на природен Αβ, в която аспаргинова киселина в позиции 1 и 7 е заменена с изо-аспаргинова киселина. Тези резултати показват, че ефикасността in vivo се дължи на директно антитяло медиирано очистване на плаките в централната нервна система и че ex vivo тестът е предсказващ за in vivo ефикасност.
Същият тест е използуван за тестиране очистването от едно антитяло срещу фрагмент от синуклеин означен като NAC. Показано е, че синуклеин е свързан с амилоидна плака белтък. Антитяло срещу NAC е поставяно в контакт с проба от мозъчна тъкан, съдържаща амилоидни плаки, микроглиялни клетки, както преди. Използуван е заешки серум като контрола. Последващ контрол показва подчертано намаление броя и големината на плаките, което е показателно за очистваща активност на антитялото.
157
Таблица 16 Тестът ex vivo е предсказващ за in vivo ефикасност
Антитяло Изотип Афинитет за агрегиран Αβ(ρΜ) Свързване с β-амилоидни плаки Ex vivo ефикасност In vivo ефик.
Моноклонално
3D6 lgG2b 470 + + +
10D5 lgG1 43 + + +
16С11 lgG1 90 - - -
21F12 lgG2a 500 - - -
ТМ2а lgG1 - - - -
Поликлонално
1-42 МИКС 600 + + +
Използувана е конфокална мокроскопия за потвърждение, че Αβ е интернализиран по време на ex vivo теста. В присъствие на контролни антитела, екзогенните микроглиялни клетки остават в конфокална равнина над тъканта, няма фагоцитни мехурчета, съдържащи Αβ и плаките се запазват интактни в среза. В присъствие на 10D5, почти целият материал от плаките се съдържа в мехурчета в екзогенните микроглиялни клетки. За определяне съдбата на интернализпрания пептид, 10D5 третирани култури са екстрахирани с 8М урея на различни срокове и са изследвани с Western blot анализ. На срок от един час, когато не се е появила още фагоцитоза, реакцията с поликлонално антитяло срещу Αβ разкрива силна 4 kD ивица (съответствуваща на Αβ пептида). Αβ имунореактивността намалява на първия ден и отсъствува на 3-ия ден. Така антитяломедиираната фагоцитоза на Αβ води до неговата деградация.
За определяне дали фагоцитоза в ex vivo тест е Fcмедиирана, са изготвени F(ab’)2 фрагменти на анти-Αβ антитяло 3D6. Въпреки че F(ab’)2 фрагменти запазват цялата си активност да реагират с плаки, те са неспособни да индуцират фагоцитоза с микроглиялни клетки. В допълнение, фагоцитоза с цяло антитяло
158 може да бъде блокирана с реагент срещу миши Fc рецептори (антиCD16/32). Тази данни показват, че in vivo очистване на Αβ се появява чрез FC-рецептор медиирана фагоцитоза.
XV: Преминаване на антитела през кръвно-мозъчната бариера
Описаният тук експеримент е проведен за да предостави информация относно способността на антитела да преминават в мозъка след интравенозно инжектиране и да предостави средства за измерване концентрацията на антитялото, достигнало мозъка след интарвенозно инжектиране в периферна тъкан на нормални или PDAPP мишки. Такива измервания са полезни за предсказване и определяне на ефективните дозировки.
PDAPP или контролни нормални мишки са перфузирани с 0.9% NaCI. Мозъчни области (хипокамп или мозъчна кора) са сецирани и бързо замразени. Мозъчната тъкан е хомогенизирана в 0.1% TritonХ-100 + протеазни инхибитори. Определян е имуноглобулин в екстракти чрез ELISA. Fab’2 кози анти-миши IgG са нанесени да покрият RIA платка като захващащ реагент. Серумът или мозъчните екстракти са инкубирани за 1 час. Изотипите са открити с анти-миши lgG1-HRP или lgG2a-HRP или lgG2b-HRP (Caltag). Антитела, независимо от изотипа, са налице в централната нервна система в концентрация, която е 1:1000, от тази открита в кръвта. Например, когато концентрацията на lgG1 е три пъти по-голяма от тази на lgG2a в кръвта, тя е също три пъти lgG2a в мозъка, и двете присъствуващи при 0.1% от съответните техни нива в кръвта. Този резултат е наблюдаван в трансгенните и нетрансгенни мишки - така че PDAPP мишките нямат уникално пропускане на кръвно-мозъчната бариера.
Въпреки че горното изобретение е описано подробно с цел яснота и разбиране, очевидно е, че някои модификации могат да
159 бъдат приложени в рамките на обсега на приложените претенции. Всички публикации и патентни документи цитирани тук, са включени чрез цитат в тяхната цялост за всякакви цели, в същата степен както ако всеки от тях е индивидуално представен.

Claims (57)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Фармацевтичен състав, съдържащ агент, който е ефективен да индуцира имунен отговор срещу амилоиден компонент у пациент и фармацевтичен ексципиент.
  2. 2. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, където амилоидният компонент е фибрилен пептид или белтък.
  3. 3. Фармацевтичен състав съгласно претенция 2, където амилоидният компонент е производен на фибрилен прекурсорен белтък, подбран от група, състояща се от белтъци или пептиди, състоящи се от Серумен амилоид А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β протеин прекурсор (β-ΑΡΡ), Бета2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоиден полипептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мугантни белтъци, белтъчни фрагменти и техни протеолитични пептиди.
  4. 4. Фармацевтичен състав съгласно претенция 3, където споменатият агент индуцира имунен отговор, насочен срещу неоепитоп, образуван от споменатия фибрилен белтък или пептид, с оглед фибрилен прекурсорен белтък.
  5. 5. Фармацевтичен състав съгласно претенция 3, където споменатият амилоиден компонент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, AApoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, ΑΒ2Μ, AScr, Acai, ΑΙΑΡΡ и синуклеин-NAC фрагмент.
    мшм·
    161
  6. 6. Фармацевтичен състав съгласно претенция 5, където споменатият агент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, ААроА1, Agel, Acys, Αβ, АВ2М, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент.
  7. 7. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, където споменатият състав съдържа агент, който е ефективен да индуцира имуногенен отговор срещу най-малко два различни амилоидни компоненти.
  8. 8. Фармацевтичен състав съгласно претенция 1, където споменатият агент е пептид, свързан с носител белтък.
  9. 9. Фармацевтичен състав съгласно всяка от претенции 1 до 8, където съставът включва адювант.
  10. 10. Фармацевтичен състав съгласно претенция 9, където споменатият адювант е подбран от група състояща се от QS21, монофосфорил липид, alum и адювант на Freund.
  11. 11. Метод за профилактика и лечение на нарушение, характеризиращо се с амилоидно отлагане у бозайник, характеризиращ се с това, че се въвежда у индивид дозировка от агент, който е ефективен да произведе имунен отговор срещу амилоиден компонент, характерен за споменатото нарушение.
  12. 12. Метод съгласно претенция 11, където споменатият амилоиден компонент е фибрилен белтък или пептид.
    162
  13. 13. Метод съгласно претенция 12, където споменатият имунен отговор е насочен срещу фибрилен компонент, произхождащ от прекурсорен белтък, подбран от група състояща се от Серумен амилоид А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β прекурсорен протеин (β-ΑΡΡ), Бета2 микроглобулин, прион прекурсорен белтък (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоиден полипептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мутантни белтъци, белтъчни фрагменти или техни пептиди.
  14. 14. Метод съгласно претенция 13, където споменатият агент индуцира имунен отговор, насочен срещу неоепитоп, образуван със споменатия амилоиден компонент, с оглед на споменатия прекурсорен белтък.
  15. 15. Метод съгласно претенция 13, където споменатият амилоиден компонент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, Ab2M, AScr, Acai, AIAPP и синуклеинNAC фрагмент.
  16. 16. Метод съгласно претенция 15, където споменатият агент е подбран от група състояща се от АА, AL, ATTR, AapoAl, Agel, Acys, Αβ, АВ2М, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент.
  17. 17. Метод съгласно претенция 11, където споменатият агент е ефективен да индуцира имуногенен отговор срещу най-малко два различни амилоидни компоненти.
    163
  18. 18. Метод съгласно претенция 17, където споменатото приложение включва въвеждане на най-малко два амилоидни фибрилни компонента.
  19. 19. Метод съгласно претенция 11, където споменатият агент е пептид, свързан с носител белтък.
  20. 20. Метод съгласно всяка от претенции 11-19, където споменатото приложение по-нататък включва адювант.
  21. 21. Метод съгласно претенция 20, където споменатият адювант е подбран от група състояща се от QS21, монофосфорил липид, alum и адювант на Freund.
  22. 22. Метод съгласно претенция 11, където споменатият имуногенен отговор се характеризира със серумен титър най-малко 1:1000, по отношение на споменатия амилоиден компонент.
  23. 23. Метод съгласно претенция 22, където споменатият серумен титър е най-малко 1:5000, по отношение на споменатия фибрилен компонент.
  24. 24. Метод съгласно претенция 11, където споменатият имунологичен отговор се характеризира със серумно количество имунореактивност, съответствуващо на по-високо около четири пъти ниво на серумна имунореакгивност, спрямо измереното преди третирането в контролна серумна проба.
    164
  25. 25. Метод съгласно претенция 24, където споменатото серумно количество имунореактивност е измерено при серумно разреждане от около 1:100.
  26. 26. Метод за определяне прогнозата за пациент, подложен на третиране за амилоидно нарушение, характеризиращ се с това, че се измерва серумното количество имунореактивност на пациент срещу подбран амилоиден компонент, където серумното количество имунореактивност на пациента, което е най-малко четири пъти над изходното контролно ниво на серумна имунореактивност, е показателно за прогноза на подобрено състояние по отношение на споменатото нарушение.
  27. 27. Метод съгласно претенция 26, където серумното количество имунореактивност на пациент срещу подбран амилоиден компонент, е характеризирано със серумен титър от най-малко около 1:1000.
  28. 28. Метод съгласно претенция 27, където споменатото серумно количество имунореактивност на пациент срещу споменатия подбран амилоиден компонент, се характеризира със серумен титър от най-малко 1:5000.
  29. 29. Метод за профилактика или лечение на заболяване, характеризиращо се с амилоидно отлагане у пациент, характеризиращ се с това, че на споменатия пациент се въвежда ефективна дозировка антитяло или антитяло фрагмент, който специфично се свързва с амилоиден компонент, присъствуващ в споменатото отлагане.
    165
  30. 30. Метод съгласно претенция 29, където споменатият амилоиден компонент е фибрилен компонент.
  31. 31. Метод съгласно претенция 30, където споменатото антитяло или антитяло фрагмент, се свързва с епитоп на споменатия фибрилен компонент.
  32. 32. Метод съгласно претенция 31, където антитялото или антитяло фрагментът се свързва специфично със споменатия фибрилен компонент, без да се свързва с прекурсор на споменатия фибрилен компонент.
  33. 33. Метод съгласно претенция 30, където антитялото е човешко антитяло срещу споменатия фибрилен компонент, изготвено от В клетки на човек, имунизиран с епитоп на фибрилен компонент.
  34. 34. Метод съгласно претенция 30, където споменатият фибрилен компонент е производно на прекурсорен белтък, подбран от групата състояща се от Серум Амилоид А протеин (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β протеин прекурсор (β-ΑΡΡ), Вета2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоид полипептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мугантни белтъци, белтъчни фрагменти или техни пептиди.
  35. 35. Метод съгласно претенция 34, където споменатият амилоид фибрилен компонент е подбран от групата състояща се от АА, AL,
    166
    ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, AB2M, AScr, Acai, AIAPP и синуклеин-NAC фрагмент.
  36. 36. Метод съгласно претенция 29, където споменатото приложение включва въвеждане на антитела, които се свързват с най-малко два фибрилни компоненти.
  37. 37. Метод съгласно претенция 29, където споменатата ефективна дозировка се характеризира с ниво на серумното количество имунореактивност у пациента, срещу споменатия амилоиден компонент, което е най-малко около четири пъти по-високо от серумното ниво на имунореактивност срещу споменатия компонент, измерено преди третирането в контролна серумна проба.
  38. 38. Метод съгласно претенция 29, където антитялото или антитяло фрагмент е въведен с носител като фармацевтичен състав.
  39. 39. Метод съгласно претенция 29, където антитялото или антитяло фрагментът е въведен интраперитонеално, орално, подкожно, интрамускулно, интраназално, топично или интравенозно.
  40. 40. Метод съгласно претенция 29, където антитялото е приложено чрез въвеждане у пациент на полинуклеотид, кодиращ най-малко една антитяло верига и където полинуклеотидът е експресиран да произвежда антитяло веригата у пациента.
  41. 41. Метод съгласно претенция 40, където полинуклеотидът кодира тежка и лека вериги на антитялото, който полинуклеотид е експресиран да произвежда тежката и леката вериги у пациента.
    167
  42. 42. Метод съгласно претенция 29, където антитялото или антитяло фрагментът е въведено в множествени дозировки за един период от най-малко шест месеца.
  43. 43. Метод съгласно претенция 29, където антитялото е въведено като състав със забавено освобождаване.
  44. 44. Фармацевтичен състав за профилактика или лечение на заболяване, характеризиращо се с амилоидно отлагане у пациент, съдържащ ефективна дозировка от антитяло или антитяло фрагмент, който се свързва специфично с ами лой ден компонент, присъствуващ в споменатото отлагане.
  45. 45. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатият амилоиден компонент е фибрилен компонент.
  46. 46. Фармацевтичен състав съгласно претенция 45, където споменатото антитяло се свързва с епитоп на споменатия фибрилен компонент.
  47. 47. Фармацевтичен състав съгласно претенция 46, където антитялото специфично се свързва със споменатия фибрилен компонент, без да се свързва с прекурсор на споменатия фибрилен компонент.
  48. 48. Фармацевтичен състав съгласно претенция 46, където антитялото е човешко антитяло срещу споменатия компонент, изготвено от В клетки от човек, имунизиран с епитоп на фибрилен компонент.
    168
  49. 49. Фармацевтичен състав съгласно претенция 45, където споменатият амилоид фибрилен компонент произхожда от прекурсорен белтък, подбран от група състояща се от Серумен Амилоид А белтък (ApoSSA), имуноглобулин лека верига, имуноглобулин тежка верига, ΑροΑΙ, транстиретин, лизозим, фиброген а верига, гелзолин, цистатин С, Амилоид β протеин прекурсор (β-ΑΡΡ), Бета2 микроглобулин, прион прекурсорен протеин (РгР), атриален натриуретичен фактор, кератин, островен амилоид пептид, пептиден хормон и синуклеин; включително мутантни белтъци, белтъчни фрагменти или техни пептиди.
  50. 50. Фармацевтичен състав съгласно претенция 49, където споменатият фибрилен компонент е подбран от групата, състояща се от АА, AL, ATTR, AapoAl, Alys, Agel, Acys, Αβ, ΑΒ2Μ, AScr, Acai, ΑΙΑΡΡ и синуклеин-NAC компонент.
  51. 51. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатият състав включва антитела или антитяло фрагменти, които се свързват с най-малко два амилоид фибрилни компоненти.
    Q
  52. 52. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатата ефективна дозировка се характеризира с количество антитяло или антитяло фрагмент, ефективно да произвежда у пациент ниво на серумна имунореактивност срещу споменатия амилоиден компонент, което е най-малко четири пъти по-високо от серумното ниво на имунореактивност срещу споменатия компонент, измерено преди третиране в контролна серумна проба.
  53. 53. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където фармацевтичният състав включва носител.
    169
  54. 54. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където фармацевтичният състав е комбиниран за приложение интраперитонеално, орално, подкожно, интрамускулно, интраназално, топично или интравенозно.
  55. 55. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където фармацевтичният състав включва полинуклеотид, кодиращ наймалко една антитяло верига, ефективен да експресира антитяло веригата у пациента.
  56. 56. Фармацевтичен състав съгласно претенция 55, където полинуклеотидът кодира тежки и леки вериги на антитялото, който полинуклеотид е способен на експресия за да произвежда тежките и леките вериги у пациенти.
  57. 57. Фармацевтичен състав съгласно претенция 44, където споменатият фармацевтичен състав е комбиниран като препарат със забавено освобождаване.
BG106140A 1999-06-01 2001-11-23 Фармацевтичен състав, използван за профилактика, и лечение на амилоидогенно заболяване BG65756B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13701099P 1999-06-01 1999-06-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG106140A true BG106140A (bg) 2002-08-30
BG65756B1 BG65756B1 (bg) 2009-10-30

Family

ID=22475417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG106140A BG65756B1 (bg) 1999-06-01 2001-11-23 Фармацевтичен състав, използван за профилактика, и лечение на амилоидогенно заболяване

Country Status (31)

Country Link
US (8) US7977316B2 (bg)
EP (2) EP2364719B1 (bg)
KR (3) KR100930559B1 (bg)
CN (2) CN101091795A (bg)
AT (1) ATE495755T1 (bg)
AU (1) AU5316300A (bg)
BG (1) BG65756B1 (bg)
BR (1) BR0011103A (bg)
CA (1) CA2375104C (bg)
CY (1) CY1111639T1 (bg)
CZ (1) CZ302971B6 (bg)
DE (1) DE60045550D1 (bg)
EA (1) EA200101250A1 (bg)
EE (1) EE05492B1 (bg)
ES (2) ES2362029T3 (bg)
HK (1) HK1045117B (bg)
HR (1) HRP20010893A2 (bg)
HU (1) HU229986B1 (bg)
IL (3) IL146563A0 (bg)
IS (1) IS2925B (bg)
MX (1) MXPA01012293A (bg)
NO (1) NO20015758L (bg)
NZ (2) NZ556622A (bg)
PL (1) PL202217B1 (bg)
PT (1) PT1185296E (bg)
SG (2) SG147274A1 (bg)
SK (1) SK288207B6 (bg)
TR (1) TR200103469T2 (bg)
UA (1) UA81216C2 (bg)
WO (1) WO2000072876A2 (bg)
ZA (1) ZA200109662B (bg)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9706957D0 (en) 1997-04-05 1997-05-21 Smithkline Beecham Plc Formulation
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7588766B1 (en) 2000-05-26 2009-09-15 Elan Pharma International Limited Treatment of amyloidogenic disease
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US6913745B1 (en) 1997-12-02 2005-07-05 Neuralab Limited Passive immunization of Alzheimer's disease
US6761888B1 (en) 2000-05-26 2004-07-13 Neuralab Limited Passive immunization treatment of Alzheimer's disease
US7790856B2 (en) 1998-04-07 2010-09-07 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US7179892B2 (en) 2000-12-06 2007-02-20 Neuralab Limited Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
US6905686B1 (en) 1997-12-02 2005-06-14 Neuralab Limited Active immunization for treatment of alzheimer's disease
US6787523B1 (en) 1997-12-02 2004-09-07 Neuralab Limited Prevention and treatment of amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US20030147882A1 (en) 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
GB9820525D0 (en) 1998-09-21 1998-11-11 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
WO2000048630A1 (en) 1999-02-17 2000-08-24 Csl Limited Immunogenic complexes and methods relating thereto
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
ES2275570T3 (es) 1999-12-08 2007-06-16 Intellect Neurosciences, Inc. Peptidos amiloides beta quimericos.
GB0000891D0 (en) * 2000-01-14 2000-03-08 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
BRPI0108676B8 (pt) 2000-02-24 2021-05-25 Lilly Co Eli anticorpos humanizados que sequestram peptídeo amilóide beta e seus usos no tratamento de condições caracterizadas por formação de placas amiloides, bem como composição farmacêutica que compreende os referidos anticorpos
US7485616B2 (en) 2000-04-05 2009-02-03 University Of Tennessee Research Foundation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
AU2007200047B2 (en) * 2000-07-07 2009-11-26 Bioarctic Neuroscience Ab Prevention and treatment of Alzheimer's disease
EP1309341A2 (en) 2000-07-07 2003-05-14 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
US7700751B2 (en) 2000-12-06 2010-04-20 Janssen Alzheimer Immunotherapy Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide
TWI255272B (en) 2000-12-06 2006-05-21 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
ES2437875T3 (es) 2001-04-30 2014-01-14 Eli Lilly And Company Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide
US7320790B2 (en) 2001-04-30 2008-01-22 Eli Lilly And Company Humanized antibodies
US6906169B2 (en) * 2001-05-25 2005-06-14 United Biomedical, Inc. Immunogenic peptide composition comprising measles virus Fprotein Thelper cell epitope (MUFThl-16) and N-terminus of β-amyloid peptide
PT1944040E (pt) 2001-08-17 2012-10-31 Univ Washington Método de avaliação para a doença de alzheimer
WO2003051374A2 (en) * 2001-12-17 2003-06-26 New York State Office Of Mental Health SEQUESTRATION OF Aβ IN THE PERIPHERY IN THE ABSENCE OF IMMUNOMODULATING AGENT AS A THERAPEUTIC APPROACH FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF BETA-AMYLOID RELATED DISEASES
CA2471092A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-10 Antigenics Inc. Compositions comprising immunoreactive reagents and saponins, and methods of use thereof
MY139983A (en) 2002-03-12 2009-11-30 Janssen Alzheimer Immunotherap Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2004006861A2 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Mindset Biopharmaceuticals Usa Inc. Peptides and methods of screening immunogenic peptide vaccines against alzheimer's disease
US20070213512A1 (en) * 2002-10-01 2007-09-13 Krafft Grant A Amyloid beta peptide analogs and assemblies thereof
US9034337B2 (en) 2003-10-31 2015-05-19 Prothena Biosciences Limited Treatment and delay of outset of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8697082B2 (en) 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US20080014194A1 (en) 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
TW200509968A (en) * 2002-11-01 2005-03-16 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic disease
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
DE602004027348D1 (de) 2003-02-10 2010-07-08 Applied Molecular Evolution Abeta-bindende moleküle
US8663650B2 (en) 2003-02-21 2014-03-04 Ac Immune Sa Methods and compositions comprising supramolecular constructs
ES2246105B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Araclon Biotech, S.L. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
SI1633189T1 (sl) 2003-05-19 2017-12-29 Prothena Biosciences Limited Skrajšani fragmenti alfa-sinukleina pri bolezni Lewyjevih telesc
US7358331B2 (en) 2003-05-19 2008-04-15 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in Lewy body disease
PE20050627A1 (es) 2003-05-30 2005-08-10 Wyeth Corp Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo
US7807171B2 (en) 2003-07-25 2010-10-05 Ac Immune Sa Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers
WO2005047860A2 (en) 2003-11-08 2005-05-26 Elan Pharmaceuticals, Inc. Antibodies to alpha-synuclein
WO2005080435A1 (ja) 2004-02-20 2005-09-01 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. モノクローナル抗体およびその利用
SE0401601D0 (sv) 2004-06-21 2004-06-21 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril specific antibodies and uses thereof
BRPI0513959A (pt) 2004-07-30 2008-05-20 Rinat Neuroscience Corp anticorpos dirigidos contra o peptìdeo beta-amilóide, suas composições farmacêuticas, kit e métodos de fabricação dos mesmos
MX2007001679A (es) 2004-08-09 2007-05-23 Elan Pharm Inc Prevencion y tratamiento de la enfermedad sinucleinopatica y amiloidogenica.
TW200636066A (en) 2004-12-15 2006-10-16 Elan Pharm Inc Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
WO2006066089A1 (en) 2004-12-15 2006-06-22 Neuralab Limited Humanized amyloid beta antibodies for use in improving cognition
GT200600031A (es) 2005-01-28 2006-08-29 Formulacion anticuerpo anti a beta
PL2289909T3 (pl) 2005-11-30 2015-04-30 Abbvie Inc Sposób przeszukiwania, proces oczyszczania niedyfundujących oligomerów Abeta, selektywne przeciwciała przeciw niedyfundującym oligomerom Abeta i sposób wytwarzania tych przeciwciał
RU2432362C2 (ru) 2005-11-30 2011-10-27 Эбботт Лэборетриз Моноклональные антитела и их применения
NZ629387A (en) * 2005-11-30 2016-01-29 Abbvie Inc Monoclonal antibodies against amyloid beta protein and uses thereof
RU2429244C2 (ru) 2006-03-23 2011-09-20 Байоарктик Ньюросайенс Аб Улучшенные селективные в отношении протофибрилл антитела и их применение
US8784810B2 (en) 2006-04-18 2014-07-22 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of amyloidogenic diseases
US8153376B2 (en) * 2006-09-25 2012-04-10 Universiteit Maastricht Means and methods for diagnosing and/or treating a subject at risk of developing heart failure
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
HRP20140049T1 (hr) 2007-01-05 2014-02-28 University Of Zürich Anti beta-amiloid antitijela i njihova upotreba
KR20120017469A (ko) 2007-01-05 2012-02-28 유니버시티 오브 취리히 질환 특이적 결합 분자 및 표적을 제공하는 방법
HUE025225T2 (en) 2007-02-23 2016-02-29 Prothena Biosciences Ltd Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic diseases
PL2118300T3 (pl) 2007-02-23 2015-11-30 Prothena Biosciences Ltd Zapobieganie i leczenie synukleinopatii i amyloidozy
US8147833B2 (en) 2007-02-23 2012-04-03 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP2124952A2 (en) 2007-02-27 2009-12-02 Abbott GmbH & Co. KG Method for the treatment of amyloidoses
US8003097B2 (en) 2007-04-18 2011-08-23 Janssen Alzheimer Immunotherapy Treatment of cerebral amyloid angiopathy
EP2149584B1 (en) * 2007-04-20 2017-12-13 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method for enhancing immune response with peptide
PT2182983E (pt) 2007-07-27 2014-09-01 Janssen Alzheimer Immunotherap Tratamento de doenças amiloidogénicas com anticorpos anti-abeta humanizados
WO2009018625A1 (en) * 2007-08-09 2009-02-12 Sylvan Pharmaceuticals Pty Ltd. Treatment of prion protein related diseases
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
PT2282758T (pt) 2008-04-29 2019-02-12 Bioarctic Ab Anticorpos e vacinas para uso em métodos terapêuticos e diagnósticos para perturbações relacionadas com a alfa-sinucleína
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
AU2009328505B2 (en) 2008-12-19 2014-11-27 Panima Pharmaceuticals Ag Human anti-alpha-synuclein autoantibodies
CA2789963C (en) 2010-02-26 2019-09-03 Bioarctic Neuroscience Ab Protofibril-binding antibodies and their use in therapeutic and diagnostic methods for parkinson's disease, dementia with lewy bodies and other alpha-synucleinopathies
KR20110111594A (ko) * 2010-04-05 2011-10-12 서울대학교산학협력단 알파-시뉴클레인 유래 곱슬 아밀로이드 섬유의 제조방법, 이를 이용한 하이드로젤의 제조 방법 및 그 이용 방법
ES2684475T3 (es) 2010-04-15 2018-10-03 Abbvie Inc. Proteínas que se unen a beta amiloide
CN103037891A (zh) * 2010-06-03 2013-04-10 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 治疗糖尿病的方法和能够治疗糖尿病的组合物
CN102311499A (zh) * 2010-07-09 2012-01-11 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种癌症治疗用人源化单克隆抗体及其制备及应用
EP3527220A1 (en) 2010-08-12 2019-08-21 AC Immune S.A. Vaccine engineering
CN103298833B (zh) 2010-08-14 2015-12-16 Abbvie公司 β淀粉样蛋白结合蛋白
AR083561A1 (es) 2010-10-26 2013-03-06 Ac Immune Sa Preparacion de una construccion antigenica
CN102807621B (zh) * 2011-06-01 2016-04-13 厦门大学 包含白喉毒素无毒突变体crm197或其片段的融合蛋白
HUE041391T2 (hu) 2011-06-23 2019-05-28 Biogen Int Neuroscience Gmbh Anti-alfa-szinukleinkötõ molekulák
SI2579042T1 (sl) 2011-10-04 2014-09-30 Affiris Ag Postopek za detektiranje Ass-specifičnih protiteles v biološkem vzorcu
EP3166970B1 (en) 2014-07-10 2021-03-10 BioArctic AB Improved a-beta protofibril binding antibodies
CN105616405B (zh) * 2014-11-05 2021-05-07 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 依达拉奉在制备用于预防和治疗脑淀粉样血管病的药物中的应用
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
US9879080B2 (en) 2015-01-28 2018-01-30 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US10633433B2 (en) 2015-01-28 2020-04-28 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US10464999B2 (en) 2015-01-28 2019-11-05 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
EP3070096A1 (en) * 2015-03-19 2016-09-21 Ludwig-Maximilians-Universität München A peptide or collection of peptides derived from amyloid precursor protein
CA3004494A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 The University Of British Columiba Epitopes in amyloid beta mid-region and conformationally-selective antibodies thereto
US10772969B2 (en) 2015-11-09 2020-09-15 The University Of British Columbia N-terminal epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto
US10759837B2 (en) 2015-11-09 2020-09-01 The University Of British Columbia Anti-amyloid beta antibodies binding to a cyclic amyloid beta peptide
US10265497B2 (en) * 2015-11-24 2019-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for treating dementia
CN109476729A (zh) 2016-07-18 2019-03-15 英属哥伦比亚大学 淀粉样蛋白β的抗体
US20180125920A1 (en) 2016-11-09 2018-05-10 The University Of British Columbia Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions
KR20250153860A (ko) 2016-11-17 2025-10-27 코그니토 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 시각 자극을 통한 신경 자극 방법 및 시스템
RU2746325C1 (ru) 2017-06-29 2021-04-12 Зе Трастис Оф Коламбия Юниверсити Ин Зе Сити Оф Нью-Йорк Химерные антитела для лечения заболеваний, характеризующихся отложением амилоида
US12286469B2 (en) 2017-07-18 2025-04-29 The University Of British Columbia Humanized antibodies binding to amyloid-beta (A-beta)
AU2018308088B2 (en) 2017-07-25 2025-05-29 Truebinding, Inc. Treating cancer by blocking the interaction of TIM-3 and its ligand
US11382974B2 (en) * 2017-08-01 2022-07-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for treatment of amyloid deposition diseases
IL272773B2 (en) 2017-08-22 2024-06-01 Biogen Ma Inc Pharmaceutical preparations containing anti-amyloid cell antibodies
CN111757730A (zh) 2017-10-06 2020-10-09 普罗塞纳生物科学有限公司 检测甲状腺素运载蛋白的方法
CU24731B1 (es) 2017-10-06 2025-01-15 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos anti-transtiretina
KR102706443B1 (ko) 2017-10-10 2024-09-11 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 치매를 예방, 경감 및/또는 치료하기 위한 시스템 및 방법
US10960225B2 (en) 2017-10-10 2021-03-30 Massachusetts Institute Of Technology Systems and methods for preventing, mitigating, and/or treating dementia via visual stimulation that binds higher order brain regions, reduces neurodegeneration and neuroinflammation, and improves cognitive function
CU20200042A7 (es) 2017-11-29 2021-03-11 Prothena Biosciences Ltd Formulación liofilizada de un anticuerpo monoclonal contra la transtirretina
GB201720975D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Anti-alpha synuclein antibodies
GB201720970D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
US12018069B2 (en) 2018-06-28 2024-06-25 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods and compositions for imaging amyloid deposits
CN115359999B (zh) 2018-11-02 2026-04-10 台达电子企业管理（上海）有限公司 变压器模块及功率模块
US20210400932A1 (en) * 2018-11-09 2021-12-30 Neurimmune Ag Patient-derived amyloid xenograft non-human animal model
AU2020214796A1 (en) 2019-01-30 2021-07-29 Truebinding, Inc. Anti-Gal3 antibodies and uses thereof
KR102135130B1 (ko) * 2019-02-15 2020-07-17 충북대학교 산학협력단 트랜스타이레틴 단백질에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도
WO2021242776A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking galectin-3
EP4236988A4 (en) * 2020-10-30 2024-10-30 Rush University Medical Center INTRANASAL IMMUNOTHERAPY FOR THE TREATMENT OF ALZHEIMER'S DISEASE
CN115475247B (zh) * 2021-06-16 2024-02-20 厦门大学 β2-微球蛋白或其抑制剂的制药用途
WO2023099788A1 (en) * 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
TWI824398B (zh) * 2022-01-27 2023-12-01 慈濟學校財團法人慈濟大學 一種肌動蛋白重組調節物之抑制劑用於製備治療睡眠剝奪引起之記憶退化之藥物之用途
EP4630812A1 (en) * 2022-12-05 2025-10-15 Neurimmune AG Cyclic compounds and their use in assays for detecting antibodies

Family Cites Families (203)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US14692A (en) * 1856-04-15 Improved diaphragm fluid-meter
US573547A (en) * 1896-12-22 smith
US73655A (en) * 1868-01-21 Improvement in safety-pockets
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4443427A (en) * 1982-06-21 1984-04-17 Sidney Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibody
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5208036A (en) 1985-01-07 1993-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω, (ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω, (ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4666829A (en) 1985-05-15 1987-05-19 University Of California Polypeptide marker for Alzheimer's disease and its use for diagnosis
DE3687751T2 (de) * 1985-09-19 1993-05-27 Toray Industries Kolonne zum entfernen von beta-2-mikroglobulin.
US4641473A (en) * 1985-12-23 1987-02-10 Trezza Ronald F Clip construction for wall arrangement
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5231170A (en) * 1986-08-27 1993-07-27 Paul Averback Antibodies to dense microspheres
GB8625435D0 (en) * 1986-10-23 1986-11-26 Erba Farmitalia Human apolipoprotein ai
US5220013A (en) * 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US5187153A (en) * 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5290762A (en) * 1986-12-24 1994-03-01 John Lezdey Treatment of inflammation
DE3702789A1 (de) 1987-01-30 1988-08-18 Bayer Ag Vorlaeuferprotein des apc-polypeptids, dafuer codierende dna und diagnostische verwendung der dna und des proteins
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
GB8720115D0 (en) * 1987-08-26 1987-09-30 Cooper G J S Treatment of diabetes mellitus
US4883666A (en) * 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US5583112A (en) * 1987-05-29 1996-12-10 Cambridge Biotech Corporation Saponin-antigen conjugates and the use thereof
US5571499A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5641474A (en) * 1987-06-24 1997-06-24 Autoimmune, Inc. Prevention of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5849298A (en) * 1987-06-24 1998-12-15 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of bovine myelin
US5869054A (en) * 1987-06-24 1999-02-09 Autoimmune Inc. Treatment of multiple sclerosis by oral administration of autoantigens
EP0359783B2 (en) 1987-06-24 2002-04-17 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
US5645820A (en) 1987-06-24 1997-07-08 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens
US5571500A (en) * 1987-06-24 1996-11-05 Autoimmune, Inc. Treatment of autoimmune diseases through administration by inhalation of autoantigens
US5004697A (en) * 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
CA1339014C (en) 1987-10-08 1997-03-25 Ronald E. Majocha Antibodies to a4 amyloid peptide
US5231000A (en) * 1987-10-08 1993-07-27 The Mclean Hospital Antibodies to A4 amyloid peptide
AU2728588A (en) 1987-10-23 1989-05-23 Genetics Institute Inc. Composition and method for treating cancers characterized by over-expression of the c-fms proto-oncogene
US5266561A (en) * 1988-01-11 1993-11-30 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of type 2 diabetes mellitus
AU3056289A (en) 1988-01-13 1989-08-11 Mclean Hospital Corporation, The Genetic constructs containing the alzheimer brain amyloid gene
US5785973A (en) * 1988-02-01 1998-07-28 Praxis Biologics, Inc. Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
WO1990012871A1 (en) 1989-04-14 1990-11-01 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Cerebrovascular amyloid protein-specific monoclonal antibody sv17-6e10
AU5525090A (en) 1989-04-14 1990-11-16 Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Monoclonal antibody to amyloid peptide
HU212924B (en) 1989-05-25 1996-12-30 Chiron Corp Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5262303A (en) * 1989-10-13 1993-11-16 Trustees Of Boston University Ligand/anti-ligand assays for adherent proteins
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
CA2070281C (en) 1989-12-20 2005-08-23 David Allen Hafler Improved treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of auto antigens
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
CA2077340A1 (en) 1990-03-02 1991-09-03 Howard L. Weiner Enhancement of the down-regulation of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
EP0451700A1 (en) 1990-04-10 1991-10-16 Miles Inc. Recombinant APP minigenes for expression in transgenic mice as models for Alzheimers's disease
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991016628A1 (en) * 1990-04-24 1991-10-31 The Regents Of The University Of California Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
ATE153534T1 (de) 1990-04-27 1997-06-15 John Mcmichael Verfahren und zusammensetzung zur behandlung von erkrankungen des zns hervorgerufen durch abnormales beta-amyloid-protein
US5753624A (en) * 1990-04-27 1998-05-19 Milkhaus Laboratory, Inc. Materials and methods for treatment of plaquing disease
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
AU8081491A (en) 1990-06-01 1991-12-31 Cetus Corporation Compositions and methods for identifying biologically active molecules
US5593970A (en) 1990-06-11 1997-01-14 Biochem Pharma Inc. Heterocyclic anthracycline analogs
US5387742A (en) * 1990-06-15 1995-02-07 Scios Nova Inc. Transgenic mice displaying the amyloid-forming pathology of alzheimer's disease
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5780587A (en) * 1990-08-24 1998-07-14 President And Fellows Of Harvard College Compounds and methods for inhibiting β-protein filament formation and neurotoxicity
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
EP0550675A1 (en) 1990-09-28 1993-07-14 Cephalon, Inc. Transgenic animals with alzheimer's amyloid precursor gene
CA2092905C (en) 1990-10-15 2002-01-08 Howard L. Weiner Treatment of autoimmune diseases by oral administration of autoantigens
WO1992013069A1 (en) 1991-01-21 1992-08-06 Imperial College Of Science, Technology & Medicine Test and model for alzheimer's disease
US5192753A (en) * 1991-04-23 1993-03-09 Mcgeer Patrick L Anti-rheumatoid arthritic drugs in the treatment of dementia
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5871907A (en) 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5672805A (en) 1991-07-18 1997-09-30 The Regents Of The University Of California Transgenic mice expressing the neurotoxic C-terminus of β-amyloid precursor protein
US5434050A (en) 1991-08-13 1995-07-18 Regents Of The University Of Minnesota Labelled β-amyloid peptide and methods of screening for Alzheimer's disease
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
JP2001524926A (ja) 1991-09-18 2001-12-04 アフィマックス テクノロジーズ ナームロゼ フェンノートシャップ オリゴマーの雑多ライブラリーの集合体を合成する方法
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0620849B1 (en) 1992-01-07 2003-06-25 Elan Pharmaceuticals, Inc. Transgenic animal models for alzheimer's disease
US5679348A (en) * 1992-02-03 1997-10-21 Cedars-Sinai Medical Center Immunotherapy for recurrent HSV infections
AU685047B2 (en) 1992-02-11 1998-01-15 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Dual carrier immunogenic construct
US5314813A (en) 1992-02-19 1994-05-24 Scripps Research Institute Drosophila cell lines expressing genes encoding MHC class I antigens and B2-microglobulin and capable of assembling empty complexes and methods of making said cell lines
KR950700082A (ko) 1992-02-28 1995-01-16 로버트 씨. 비숍 바이스탠더(bystander)에 의한 자가면역질환을 처치하는 방법
ATE179210T1 (de) * 1992-03-17 1999-05-15 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Gentechnologisch hergestellte antikörper
EP0561087B1 (en) 1992-03-20 1999-08-04 N.V. Innogenetics S.A. Mutated form of the beta-amyloid precursor protein gene
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5441870A (en) * 1992-04-15 1995-08-15 Athena Neurosciences, Inc. Methods for monitoring cellular processing of β-amyloid precursor protein
US5604102A (en) 1992-04-15 1997-02-18 Athena Neurosciences, Inc. Methods of screening for β-amyloid peptide production inhibitors
GB9209118D0 (en) 1992-04-28 1992-06-10 Sb 120 Amsterdam Bv Vaccine compositions
US5766846A (en) * 1992-07-10 1998-06-16 Athena Neurosciences Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production
US5837672A (en) * 1992-07-10 1998-11-17 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide
WO1994001772A1 (en) 1992-07-13 1994-01-20 The Children's Medical Center Corporation SCREEN FOR ALZHEIMER'S DISEASE THERAPEUTICS BASED ON β-AMYLOID PRODUCTION
US6680182B1 (en) 1992-07-31 2004-01-20 Acambis Research Limited Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria
US5958883A (en) * 1992-09-23 1999-09-28 Board Of Regents Of The University Of Washington Office Of Technology Animal models of human amyloidoses
ES2204910T3 (es) 1992-10-01 2004-05-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Bibliotecas quimicas combinatorias complejas codificadas con señales.
US5605811A (en) * 1992-10-26 1997-02-25 Athena Neurosciences, Inc. Methods and compositions for monitoring cellular processing of beta-amyloid precursor protein
DE667959T1 (de) * 1992-10-26 2000-04-20 Dale B Schenk VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN FÜR DEN NACHWEIS VON LÖSLICHEM-g(b)-AMYLOIDPEPTID.
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
ATE199392T1 (de) 1992-12-04 2001-03-15 Medical Res Council Multivalente und multispezifische bindungsproteine, deren herstellung und verwendung
EP0683234B2 (en) 1993-01-25 2007-06-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against beta-amyloid or their derivative and use thereof
US5955317A (en) * 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
CA2115900A1 (en) 1993-02-22 1994-08-23 Gerald W. Becker Pharmaceutical screens and antibodies
ATE157882T1 (de) * 1993-03-23 1997-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
US5643562A (en) * 1993-03-29 1997-07-01 Queen's University Of Kingston Method for treating amyloidosis
AU687805B2 (en) * 1993-04-27 1998-03-05 United Biomedical Inc. Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines
AU7043894A (en) 1993-05-28 1994-12-20 Miriam Hospital, The Composition and method for (in vivo) imaging of amyloid deposits
ATE215124T1 (de) 1993-07-30 2002-04-15 Medeva Holdings Bv Rekombinante tetc-fusionsprotein enthaltene impfstoffzusammensetzungen
US5724322A (en) * 1993-08-10 1998-03-03 Sony Corporation Apparatus for recording and/or reproducing a recording medium with editing function
US5728385A (en) * 1993-08-12 1998-03-17 Classen Immunotherapies, Inc. Method and composition for an early vaccine to protect against both common infectious diseases and chronic immune mediated disorders or their sequelae
AU705889B2 (en) 1993-08-26 1999-06-03 Regents Of The University Of California, The Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory peptides
AU698962B2 (en) 1993-09-14 1998-11-12 Epimmune, Inc. Alteration of immune response using pan DR-binding peptides
US5446650A (en) * 1993-10-12 1995-08-29 Tektronix, Inc. Logic signal extraction
DE69429925T2 (de) 1993-10-20 2002-10-02 Duke University, Durham METHODE ZUR BINDUNG VON MATERIAL AN DAS Beta-AMYLOID-PEPTID
CN1134156A (zh) 1993-11-02 1996-10-23 阿菲马克斯技术公司 合成和筛选多种分子
US5744368A (en) 1993-11-04 1998-04-28 Research Foundation Of State University Of New York Methods for the detection of soluble amyloid β-protein (βAP) or soluble transthyretin (TTR)
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5434170A (en) * 1993-12-23 1995-07-18 Andrulis Pharmaceuticals Corp. Method for treating neurocognitive disorders
US5877218A (en) 1994-01-10 1999-03-02 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
US5877399A (en) * 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
WO1995020666A2 (en) * 1994-01-27 1995-08-03 Regents Of The University Of Minnesota Transgenic non-human mammals with progressive neurologic disease
JPH09511492A (ja) * 1994-02-03 1997-11-18 ザ ピコワー インスティテュート フォア メディカル リサーチ アミロイドーシスの前進性グリコシル化終末産物仲介モジュレーション用組成物及び方法
JPH10500112A (ja) 1994-05-06 1998-01-06 ファーマコピーア，インコーポレイテッド 組合せ ジヒドロベンゾピラン ライブラリー
AU686818B2 (en) * 1994-05-25 1998-02-12 John Mcmichael Materials and methods for treatment of plaquing diseases
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
US5663046A (en) 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US6417178B1 (en) * 1994-07-19 2002-07-09 University Of Pittsburgh Amyloid binding nitrogen-linked compounds for the antemortem diagnosis of alzheimer's disease, in vivo imaging and prevention of amyloid deposits
US6114133A (en) * 1994-11-14 2000-09-05 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41)
US5688651A (en) 1994-12-16 1997-11-18 Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. Prevention of protein aggregation
US5786180A (en) 1995-02-14 1998-07-28 Bayer Corporation Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide
EP0815134B1 (en) 1995-03-14 2002-06-05 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Modulators of amyloid aggregation
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE19518147B4 (de) * 1995-05-17 2013-09-05 Günther Nath UV-stabiler Flüssigkeitslichtleiter
WO1996039176A1 (en) 1995-06-05 1996-12-12 Brigham & Women's Hospital USE OF ORAL TOLERANCE TO SUPPRESS BOTH Th1 AND Th2 IMMUNE RESPONSES AND TO SUPPRESS ANTIBODY PRODUCTION
US5948763A (en) * 1995-06-07 1999-09-07 New York University Peptides and pharmaceutical compositions thereof for treatment of disorders or diseases associated with abnormal protein folding into amyloid or amyloid-like deposits
ATE214603T1 (de) * 1995-06-30 2002-04-15 American Cyanamid Co Stabile makrolide und makrolide imptstoff- zusammensetzungen
US5671500A (en) * 1995-08-07 1997-09-30 Balk; Brett Overhead door spring shield system
AU6898996A (en) * 1995-08-21 1997-03-12 Cytrx Corporation Compositions and methods for growth promotion
JP3713074B2 (ja) 1995-08-30 2005-11-02 栄研化学株式会社 血清アミロイドａを認識するモノクローナル抗体
DE852011T1 (de) * 1995-09-14 2001-10-11 Scripps Res Inst La Jolla Für natives prp-sc spezifische antikörper
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
NZ322175A (en) 1995-11-10 1999-02-25 Elan Corp Plc Peptides which enhance transport across tissues and methods of identifying the same
WO1997021728A1 (en) 1995-12-12 1997-06-19 Karolinska Innovations Ab PEPTIDE BINDING THE KLVFF-SEQUENCE OF AMYLOID $g(b)
JPH09178743A (ja) 1995-12-27 1997-07-11 Oriental Yeast Co Ltd 可溶性ａｐｐの定量法
US6150091A (en) * 1996-03-06 2000-11-21 Baylor College Of Medicine Direct molecular diagnosis of Friedreich ataxia
CA2216425C (en) 1996-03-23 2003-08-12 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Tetanus toxin functional fragment antigen and tetanus vaccine
CA2183901A1 (en) 1996-08-22 1998-02-23 Johanna E. Bergmann Targets for therapy and diagnosis of alzheimer's disease and down syndrome in humans
US6057367A (en) * 1996-08-30 2000-05-02 Duke University Manipulating nitrosative stress to kill pathologic microbes, pathologic helminths and pathologically proliferating cells or to upregulate nitrosative stress defenses
US6797495B2 (en) * 1996-11-05 2004-09-28 The Regents Of The University Of California Somatic cells with ablated PrP gene and methods of use
AU753688B2 (en) 1997-03-10 2002-10-24 Ottawa Civic Loeb Research Institute Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
IL132040A (en) * 1997-03-31 2004-07-25 Alza Corp Prolonged release transfer system and method
US8173127B2 (en) * 1997-04-09 2012-05-08 Intellect Neurosciences, Inc. Specific antibodies to amyloid beta peptide, pharmaceutical compositions and methods of use thereof
EP2006303A1 (en) * 1997-04-09 2008-12-24 Intellect Neurosciences, Inc. Recombinant antibodies specific for Beta-Amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof
US5972269A (en) * 1997-06-17 1999-10-26 Taurus International Manufacturing, Inc. Method of forming cavities in ceramic or metal injection molded parts using a fugitive core
AU8269898A (en) 1997-06-27 1999-01-19 Regents Of The University Of California, The Drug targeting of a peptide radiopharmaceutical through the primate blood-brain barrier in vivo with a monoclonal antibody to the human insulin receptor
IT1293511B1 (it) 1997-07-30 1999-03-01 Gentili Ist Spa Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati
EP1001987B1 (en) 1997-08-01 2010-12-15 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Composition and method for the detection of diseases associated with amyloid-like fibril or protein aggregate formation
US6004925A (en) * 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6923964B1 (en) * 1997-12-02 2005-08-02 Neuralab Limited Active immunization of AScr for prion disorders
TWI239847B (en) * 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
US7964192B1 (en) * 1997-12-02 2011-06-21 Janssen Alzheimer Immunotherapy Prevention and treatment of amyloidgenic disease
IL136251A0 (en) 1997-12-03 2001-05-20 Fujisawa Pharmaceutical Co Soft pellet drug composition and methods for the preparation thereof
EP1033998B1 (en) 1997-12-03 2005-10-19 Neuralab, Ltd. Suppressing beta-amyloid-related changes in alzheimer's disease
FR2777015B3 (fr) 1998-02-23 2000-09-15 Financ De Biotechnologie Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives
NO314086B1 (no) 1998-05-08 2003-01-27 Gemvax As Peptider og farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, nukleinsyresekvenser som koder for slike peptider, plasmider og virusvektoreromfattende slike DNA-sekvenser samt anvendelse av disse for fremstilling avfarmasöytiske preparater til
CA2328612A1 (en) 1998-05-19 1999-11-25 Yeda Research And Development Co., Ltd. Activated t cells, nervous system-specific antigens and their uses
DE69942274D1 (de) 1998-05-21 2010-06-02 Univ Tennessee Res Foundation Methoden zur amyloidentfernung mit anti-amyloid-antikörper
US20030147882A1 (en) * 1998-05-21 2003-08-07 Alan Solomon Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies
AU778270C (en) 1999-01-19 2005-07-21 Pharmacia & Upjohn Company Gamma-irradiation sterilized polyethylene packaging
EP1146898A1 (en) * 1999-01-22 2001-10-24 Matthew John During Vaccine-mediated treatment of neurological disorders
UA81216C2 (en) 1999-06-01 2007-12-25 Prevention and treatment of amyloid disease
AR024558A1 (es) 1999-06-01 2002-10-16 Neuralab Ltd Composiciones del peptido a-beta y procesos para producir las mismas
WO2000077178A1 (en) 1999-06-16 2000-12-21 Boston Biomedical Research Institute IMMUNOLOGICAL CONTROL OF β-AMYLOID LEVELS IN VIVO
US6294171B2 (en) * 1999-09-14 2001-09-25 Milkhaus Laboratory, Inc. Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies
NZ540564A (en) 1999-11-29 2007-04-27 Neurochem Int Ltd Vaccine for the prevention and treatment of Alzheimer's and amyloid related diseases
ES2275570T3 (es) 1999-12-08 2007-06-16 Intellect Neurosciences, Inc. Peptidos amiloides beta quimericos.
ES2248283T3 (es) 2000-02-21 2006-03-16 Pharmexa A/S Nuevo procedimiento para reducir los niveles de amiloide.
BRPI0108676B8 (pt) 2000-02-24 2021-05-25 Lilly Co Eli anticorpos humanizados que sequestram peptídeo amilóide beta e seus usos no tratamento de condições caracterizadas por formação de placas amiloides, bem como composição farmacêutica que compreende os referidos anticorpos
US7485616B2 (en) 2000-04-05 2009-02-03 University Of Tennessee Research Foundation Methods of investigating, diagnosing, and treating amyloidosis
US6713450B2 (en) 2000-05-22 2004-03-30 New York University Synthetic immunogenic but non-amyloidogenic peptides homologous to amyloid β for induction of an immune response to amyloid β and amyloid deposits
EP1309341A2 (en) 2000-07-07 2003-05-14 Lars Lannfelt Prevention and treatment of alzheimer's disease
EP1172378A1 (en) 2000-07-12 2002-01-16 Richard Dr. Dodel Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
US20020009445A1 (en) * 2000-07-12 2002-01-24 Yansheng Du Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease
IT1319277B1 (it) 2000-10-24 2003-09-26 Chiesi Farma Spa Proteine di fusione utili per il trattamento di immunizzazione dellamalattia di alzheimer.
IL139308A0 (en) 2000-10-26 2001-11-25 Marikovsky Moshe Peptides from amyloid precursor protein which inhibit tumor growth and metastasis
AU2002246734A1 (en) 2000-12-27 2002-08-12 University Of Texas Health Science Center Houston Prion isomers, methods of making, methods of using, and compositions and products comprising prion isomers
US20020147882A1 (en) * 2001-04-10 2002-10-10 Pua Khein Seng Universal serial bus flash memory storage device
EP1251138B1 (en) * 2001-04-19 2006-07-26 Hermann Dr. Schätzl Prion protein dimers useful for vaccination
WO2003000714A2 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Panacea Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for preventing protein aggregation in neurodegenerative diseases
EP1283030B1 (en) * 2001-08-06 2013-10-02 Kao Corporation Conditioner composition
EP1545576A2 (en) * 2002-07-30 2005-06-29 Esperion Therapeutics Inc. Methods of using non-human animal apoliprotein a-i protein
CN102186504B (zh) * 2008-09-18 2018-04-06 西塞医疗中心 用于检测阿尔兹海默病的光学方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR100930559B1 (ko) 2009-12-09
EP2364719B1 (en) 2013-11-13
IS6170A (is) 2001-11-21
BR0011103A (pt) 2002-03-19
NZ587223A (en) 2011-12-22
EE200100645A (et) 2003-02-17
US20110287049A1 (en) 2011-11-24
SK288207B6 (sk) 2014-07-02
SG147274A1 (en) 2008-11-28
CA2375104C (en) 2013-12-24
SG147275A1 (en) 2008-11-28
ES2445799T3 (es) 2014-03-05
EP2364719A1 (en) 2011-09-14
HUP0201205A3 (en) 2004-07-28
CN101091795A (zh) 2007-12-26
BG65756B1 (bg) 2009-10-30
US20080248029A1 (en) 2008-10-09
HUP0201205A2 (en) 2002-08-28
KR20020025884A (ko) 2002-04-04
HK1045117A1 (en) 2002-11-15
NZ556622A (en) 2009-03-31
US20110177066A1 (en) 2011-07-21
US20090285809A1 (en) 2009-11-19
HK1045117B (en) 2011-08-05
KR20100099355A (ko) 2010-09-10
MXPA01012293A (es) 2002-11-07
ZA200109662B (en) 2003-05-23
US20090285822A1 (en) 2009-11-19
NO20015758D0 (no) 2001-11-26
CZ302971B6 (cs) 2012-01-25
ATE495755T1 (de) 2011-02-15
IL146563A (en) 2010-11-30
SK17182001A3 (sk) 2002-09-10
US7977316B2 (en) 2011-07-12
IL207166A (en) 2013-11-28
CN1377278A (zh) 2002-10-30
IL146563A0 (en) 2002-07-25
WO2000072876A3 (en) 2001-05-03
US8124081B2 (en) 2012-02-28
WO2000072876A2 (en) 2000-12-07
UA81216C2 (en) 2007-12-25
EP1185296B1 (en) 2011-01-19
ES2362029T3 (es) 2011-06-27
HU229986B1 (en) 2015-04-28
CA2375104A1 (en) 2000-12-07
US20110064734A1 (en) 2011-03-17
HK1160392A1 (en) 2012-08-17
US20110182893A1 (en) 2011-07-28
HRP20010893A2 (en) 2003-04-30
IL207166A0 (en) 2010-12-30
PT1185296E (pt) 2011-04-19
CY1111639T1 (el) 2015-10-07
PL352717A1 (en) 2003-09-08
US20080248023A1 (en) 2008-10-09
CZ20014154A3 (cs) 2002-11-13
TR200103469T2 (tr) 2002-05-21
PL202217B1 (pl) 2009-06-30
NO20015758L (no) 2002-01-30
KR101142772B1 (ko) 2012-05-18
AU5316300A (en) 2000-12-18
DE60045550D1 (de) 2011-03-03
EA200101250A1 (ru) 2002-06-27
IS2925B (is) 2015-06-15
KR20090071673A (ko) 2009-07-01
EE05492B1 (et) 2011-12-15
EP1185296A2 (en) 2002-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6936246B1 (en) Passive immunization of ASCR for prion disorders
US7977316B2 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic diseases
US6923964B1 (en) Active immunization of AScr for prion disorders
US6710226B1 (en) Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer&#39;s disease characteristics
US7964192B1 (en) Prevention and treatment of amyloidgenic disease
US8535673B2 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
AU2005202644B2 (en) Prevention and treatment of amyloidogenic disease
HK1160392B (en) Determination of the prognosis of a patient undergoing treatment for alzheimer&#39;s disease