BG108526A

BG108526A - Изследвания за диагностициране на parvovirus b19

Info

Publication number: BG108526A
Application number: BG108526A
Authority: BG
Inventors: Sergio Pichuantes; Venkatakrishna Shyamala
Original assignee: Chiron Corporation
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2004-01-13
Publication date: 2004-09-30
Also published as: CA2451756A1; EP1537235A2; PL368049A1; NO20035732L; HK1080516A1; NZ530602A; BRPI0211191B1; CZ20033516A3; CN1636071A; RU2301263C2; MXPA03011802A; SK15752003A3; JP2014061007A; KR100888377B1; US20030170612A1; NO20035732D0; EP1537235B1; PL210849B1; EP1537235A4; AU2002318450B2

Description

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Човешкия Parvovirus В19 е член на сеймеството на Parvoviridae, род Erythrovirus и е малък 22-nm двадесетостеннен вирус без обвивка с линейна едноверижна ДНК молекула от приблизително 5,600 нуклеотида. Вирусният геном кодира три главни протеина, VP1, VP2 и NS1. виж Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936 и фигура 1, от настоящото. VP1 (83 kDa) и VP2 (58 kDa) са структурни протеини от капсида. Двата протеина се кодират в препокриващи се рамки на разчитане от приблизителен брой нуклеотиди 2444 до 4789 и от приблизително 3125 до 4789, съответно. VP2 съставня 95% от капсида, а големия VP1 протеин единствено 5% от капсида. VP1 е необходим за зрялата конформация на вируса. NS1 (77 kDa) е неструктурен протеин и присъства единствено в ядрената фракция на инфектирани клетки и липсва в цитоплазмата и в интактен вирион в серумите.

Parvovirus В19 е открит първоначално в серуми от © нормални кръвни донори и е единствения член на семейството на Parvoviridae, известен да е патогенен при хора. Вирусът се асоциира със широк кръг болестни прояви. Човешкият Parvovirus В19 обикновено причинява асимптомна или самоограничаваща се инфекция при деца. При възрастни, Parvovirus В19 може да причини обрив, преходнасиметрична полиартралгия и артрит. Parvovirus В19 се асоциира с преходна апластична криза (ТАС) при пациенти с подчертани химолитични смущения. Съобщава се за хронична В19 ф инфекция и персистираща анемия при имунокомпрометирани пациенти с остра анемия, вроден имунодефицит, СПИН, и след трансплантация на костен мозък. Parvovirus В19 се асоциира, също така с ембрионалана смърт при бременни жени.

В повечето страни, В19 вирусна инфекция обикновено се среща в детска възраст, като приблизително 50% от децата имат анти-В19 антитела до възраст от 15 години. Преобладаването на В19 антитялото може после да се увеличи по време на живота и да достигне стойности повисоки от 90% при възрастни индивиди.

При човешка Parvovirus В19 инфекция, първоначално вирусна реепликация се предполага, че се състои в респираторния тракт. След това, вирусът се насочва към клетки от костния мозък. Това води до широкомащабна вирусна репликация със съобщения за виремия от 10² до 10¹⁴частици/ml, което се случва 7-10 дни след инфектирането, но преди проявата на симптоми. Прекратяването на виремията съвпада с откриването на специфични IgM антитела, които се запазват във високи нива в продължение на два, три месеца. С Анти-В19 IgG антитела се откриват няколоко дни след появата на IgM антителата и остават през останалата част на живота.

Липсата на липидна обвивка и ограниченото съдържание на ДНК прави Parvovirus В19 изключително резистентен на физикохимично инактивиране. Документирано е Parvovirus В19, особено във високи концентрации, че може да издържи на конвенционално температурно инактивиране на кръвни продукти и предаване на Parvovirus В19 чрез прилагане на разтворител-детергент-обработен фактор VIII и поточно- или 0 сухо-изсушен фактор VIII и XI препарати.

Човешки Parvovirus В19 не може да се култивира в конвенционални клетъчни култури, което прави лабораторното откриване и изолиране на вируса изключително трудно. Следователно, в продължение на много години, единственият източник на антиген се състоял в серуми от виремични (с вирус) пациенти. В опит да се преодолеят тези проблеми са продуцирани рекомбинантни антигени, за използване в серологични изследвания. Виж Sisk and Berman, Biotechnology (1987) 5:1077-1080; U.S. Patent No 6,204,044. изследвания на имуноензиматично улавяне на IgM са използвани за откриване на анти-В19 IgM, както и за диагностициране на скорошна В19 инфекция, диагностичното изпълнение на на голям брой достъпни на пазара тестове, въпреки това, не е хомогенно. В допълнение, основани на IgM диагностични тестове не могат да открият вируса по време на виремичния етап на инфекцията, и щом като се синтезират IgM антитела, те могат да останат в кръвообръщението в продължение на няколко месеца след края на виремията.

Широкото разстпространение на В19 антитела в О нормалнан популация, заедно с факта, че силната виремия обикновено се задържа само за една седмица, прави използването на серологично основаващи се тестове непрактично. В допълнение, при имунокомпрометирани пациенти, серологичната диагноза може да е несигурна.

Изследвания, базиращи се на хибридизирането на нуклеинови киселини, като dot blot и in situ хибридизиране, са използвани за откриване на В19. тези изследвания обикновено имат ограничения на откриваемост от 0,1 pg 0 вирусна ДНК (~10⁴-10⁵ вирусни частици). PCR е с по-голяма чувствителност (-100 геномни копия). Въпреки това, техниките за хибридизиране на ДНК са трудоемки и ограничени по отношение на използването е PCR е непрактично за скриниране на голям брой проби.

Поради това, остава необходимост от развитието на сигурни диагностични тестове за откриване на Parvovirus В19 във виремични проби, с цел да се предотврати предаването на вируса чрез кръвни и плъзмени производни или чрез близък личен контакт.

СЪДЪРЖАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се основава на откриването на единствени праймери и проби за използване при изследвания, базиращи се на нуклеинови киселини, както и на развитието на чувствителен, сигурен диагностичен тест, базиращ се на нуклеинови киселини за откриване на Parvovirus В19 ДНК в биологични проби от потенциално инфектирани индивиди. Описаните в настоящото техники използват екстрахирана проба ДНК, като матрица за амплифициране на консервативни © геномни области от В19 последователност, при използване на транскрипционно медиирана амплификация (ТМА), както и при 5’ нуклеазни изследвания, като TaqMan™ техника. Методите дават възможност за откриване на В19 ДНК във виремични проби, притежаващи вирусни титри, толкова ниски, колкото 10³вирусни частици /ml. В сйответствие, инфектираните проби могат да се идентифицират и да се изключат от преливане на кръв, както и от приготвянето на кръвни производни продукти. Пробите и праймерите, описани в настоящото, са полезни, © също така, при например, стандартни хибридизационни методи, както при основаващи се на PCR техники, амплифициране на основата на последователности на нуклеинови киселини (NASBA) и изследвания, които използват разклонени ДНК молекули.

В съответствие, при един вариант за изпълнение, настоящото изобретение е насочено към метод за откриване на инфекция на човешки Parvovirus В19 в биологични проби. Методът се състои от:

(а) изолира се нуклеинова киселина от биологична проба, за която се подозира, че съдържа ДНК от човешки

Parvovirus B19, където нуклеиновата киселина включва РНКова последователност мишена;

(b) изолираната нуклеинова киселина на Parvovirus В19 влиза в реакция с един първи олигонуклеотид, който съдържа един първи праймер, съдържащ последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна на 3’терминален участък от РНК-ова последователност мишена за създаване на комплекс с нея, при което първият праймер съдържа, също така, промотор за ДНК-зависима РНК © полимераза 5’ и операционно свързана към последователността образуваща комплекс, като реагирането са осъществява при условия, които обезпечават образуването на комплекс олигонуклеотид/ мишена последователност и инициирането на синтез на ДНК;

(c) удължава се първият праймер при едан реакция на удължаване, като се използва РНК-овата последователност мишена, като матрица за получаване на първия продукт на удължаване на ДНК праймера, комплементарен на РНК-овата

U последователност мишена;

(d) отделяне на първия продукт на удължаване на ДНК праймера от РНК-овата последователност мишена, при използванена ензим, който избирателно разгражда РНК-овата последователност мишена;

(e) третира се продукта на удължаване на ДНК праймера с втори олигонуклеотид, който съдържа втори праймер, включващ последователност, образуваща комплекс, достатъчно комплементарна на 3’-терминалния участък на продукта на удължаване на ДНК праймера с него, при условия, обезпечаващи образуването на олигонуклеотид/мишена последователност комплекс и инициаране на синтез на ДНК;

(f) удължава се 3’-терминуса на втория праймер при реакцията за удалжаването на ДНК, за да се получи втори продукт на удължаване на ДНК праймера, като по този начин се продуцира матрица за ДНК-зависимата РНК полимераза;

(д) матрицата се използва за продуциране на множество РНК копия на последователността мишена, като се използва ДНК-зависима РНК полимераза, която разпознава © промоторната последователност; и (h) използват се РНК копията от етап (д), автокаталитично повоторение на етапите (Ь) до (д) за амплифициране на последователността мишена.

При някои варианти за изпълнение на изобретението, методът включва, също така, етапите на :

(i) прибавя се олигонуклеотидната проба към продукта от етап (h), при което олигонуклеотидната проба става комплементарна на участък от последователността мишена , при условия, които обезпечават хибридизация на пробата с последователността мишена, за да образуват комплекс проба:мишена; и (j) открива се присъствието или отсъствието на маркар, като индикация за присъствие или отсъствие на последователността мишена.

При един друг вариант за изпълнение, се бележи с акридинов естер.

При друг вариант за изпълнение, първият и вторият праймери, и пробата, които се използват в методите, произлизат от VP1 областта на генома на човешки Parvovirus

В19, както и от полинуклеотидната последователност, посочена на коя да е от фигурите 2A-2U или 11А-11Z.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението е насочено към метод за откриване на инфекция на човешки Parvovirus В19 в биологична проба. Методът включва:

(а) изолира се нуклеинова киселина от биологична проба, за която се подозира, че съдържа ДНК от човешки Parvovirus В19, където нуклеиновата киселина включва РНКова последователност мишена;

© (Ь) изолираната нуклеинова киселина на Parvovirus В19 влиза в реакция с един първи олигонукпеотид, който съдържа един първи праймер, съдържащ последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна на 3’терминален участък от РНК-овата последователност мишена за създаване на комплекс с нея, при което първият праймер съдържа, също така, промотор за ДНК-зависима РНК полимераза 5’ и е операционно свързана към последователността образуваща комплекс, като първият q праймер съдържа последователност, произлезла от полинуклеотидната последователност, посочена на коя да е от фигурите 2A-2U или фигурите 11A-11Z и реакцията се провежда при условия, които обезпечават образуването на комплекс олигонуклеотид/мишена последователност и инициирането на синтеза на ДНК;

(с) удължава се първият праймер при едан реакция на удължаване, като се използва РНК-овата последователност мишена, като матрица за получаване на първия продукт на удължаване на ДНК праймера, комплементарен на РНК-овата последователност мишена;

(d) отделя се първия продукт на удължаване на ДНК праймера от РНК-овата последователност мишена, при използване на ензим, който избирателно разгражда РНК-овата последователност мишена;

(e) третира се продукта на удължаване на ДНК праймера с втори олигонуклеотид, който съдържа втори праймер, включващ последователност, образуваща комплекс, достатъчно комплементарна на 3’-терминалния участък на продукта на удължаване на ДНК праймера с него, при което © вторият праймер произлиза от полинуклеотидната последователност, посочена на коя да е от фигурите 2A-2U или фигурите 11A-11Z и третирането се провежда при условия, които обезпечават образуването на комплекс олигонуклеотид/мишена последователност и инициирането на синтеза на ДНК;

(д) матрицата се използва за продуциране на множество РНК копия на последователността мишена, като се използва ДНК-зависима РНК полимераза, която разпознава промоторната последователност; и (h) използват се РНК копията от етап (д), автокаталитично повоторение на етапите (Ь) до (д) за амплифициране на последователността мишена;

(i) прибавя се проба на олигонуклеотид, белязан с акридинов естер към продукта от етап (h), при което олигонуклеотидната проба става комплементарна на участък от последователността мишена, като пробата произлиза от полинуклеотидна последователност, посочена на коя да е от фигурите 2A-2U, като пробата се прибавя при условия, които обезпечават хибридизирането на пробата с последователността мишена, за да образуват комплекс проба:мишена; и (j) открива се присъствието или отсъствието на маркер, като индикация за присъствие или отсъствие на последователността мишена.

а) изолира се нуклеинова киселина от биологична проба, за която се подозира, че съдържа ДНК от човешки Parvovirus В19, където нуклеиновата киселина включва РНК-ова последователност мишена;

(b) прибавят се един или повече праймери, способни да q хибридизират към РНК-ова последователност мишена, където единият или повече праймери произлизат от полинуклеотидната последователност, посочена на която и да е фигура от 2A-2U и фигури 11А до 11Z;

(c) удължават се единият или повече праймери, като се използва полимераза;

При някои варианти за изпълнение на изобретението, РНК-овата последователност мишена от етап (а) се транскрибира обратно, за да осигури сДНК и методът може да включва, осван това, амплифициране на сДНК, при използване на полимеразна верижна леакция (RT-PCR) или

асиметрична gap лигазна верижна реакция (RT-AGLCR). При други варианти за изпълнение, полимеразате е термостабилна полимераза, като, но без да се ограничава до, Taq полимераза или Vent полимераза. В допълнителни варианти за изпълнение, полимеразата е Е. coli ДНК полимераза I, Klenow фрагмент от Е. coli ДНК полимераза I, или Т4 ДНК полимераза.

При някои варианти на различните методи, описани погоре, се предоставя вътрешен контрол. Ватрешният контрол може да произлиза от последователност на фигура 12 (SEQ ID N0:92). При други варианти за изпълнение, вътрешният контрол включва SEQ ID N0:90.

При допълнителни варианти за изпълнение, изобретението се отнася до метод за откриване на инфекция на човешки Parvovirus В19 в биологичнан проба. Методът включва:

а) изолира се нуклеинова киселина от биологична проба, за която се подозира, че съдържа ДНК от човешки Parvovirus В19, където нуклеиновата киселина включва последователност мишена;

(Ь) изолираната нуклеинова киселина на Parvovirus В19 влиза в реакция с откриваемо маркирана проба, достатъчно комплементарна към и способна да хибридизира с последователност мишена, при което пробата произлиза от полинуклеотидната последователност, посочена на която и да е от фигури 2A-2U и фигури 11A-11Z, и освен това, където реагирането се провежда при условия, обезпечаващи образуването на комплекс проба/мишена последователност; и (с) открива се присъствието или отсъствието на маркер, като индикация за присъствие или отсъствие на последователност мишена.

При други варианти за изпълнение, изобретението се отнася до полинуклеотид, който съдържа нуклеотидна последователност, включваща която и да е от нуклеотидните последователности, посочени на фигури 2A-2U или фигури 11A-11Z.

При допълнителни варианти за изпълнение, С изобретенето се отнася до полинуклеотид, както по-горе, където нуклеотидната последователност се състои от нуклеотидна последователност, посочена на фигури 2А, 2В, 2С, 2D, 2Е, 2F, 2G, 2Н, 2I, 2J, 2К, 2L, 2М, 2N, 20, 2Р, 2Q, 2R, 2S, 2Т, 2U, 11А, 11В, 11С, 11D, 11Е, 11F, 11G, 11Н, 11J, 11К, 11L, 11М, 11N, 110, 11Р, 11Q, 11R, 11S, 11Т, 11U, 11V, 11W, 11Х, 11Y и 11Z.

При още по-други варианти за изпълнение, въпросното изобретение се отнася до полинуклеотид, включващ q нуклеотидна последователност, съдържаща която и да е от нуклеотидните последователности, посочени на фигури ЗА-ЗС или 4А-4С.

При допълнителни варианти за изпълнение, изобретението е насочено към полинуклеотид, както по-горе, където нуклеотидната последователност се състои от нуклеотидна последователност, посочена на посочени на фигури ЗА-ЗС или 4А-4С.

При друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до олигонуклеотиден праймер, състоящ се от промоторна област, който разпознава ДНК-зависима РТК полимераза, операционно свързана към човешки Parvovirus В19-специфична образуваща комплекс последователност от приблизително 10 до приблизително75 нуклеотида. При някои варианти за изпълнение, промоторната област е Т7 промотор и посочената полимераза е Т7 РНК полимераза. Допълнително, човешки Parvovirus В19-специфична последователност може да е образувата от VPI областа на генома на човешки Parvovirus В19, както от полинуклеотидната последователност, посочена на коя да е © от фигури 2A-2U или 11А-11Z.

При други варианти за изпълнение, изобретението се отнася до олигонуклеотиден праймер от Т7 промотор, операционно свързан с човешки Parvovirus В19-специфична, образуваща комплекс последователност от приблизително 10 до приблизително 75 нуклеотида, където човешката Parvovirus В19-специфична образуваща комплекс последователност произлиза от полинуклеотидна последователност, посочена на коя да е от фигури 2A-2U или 11 А-11Z.

д При друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до олигонуклеотидна проба, включваща Parvovirus В19-специфична хибридизираща последователност от приблизително 10 до приблизително 50 нуклеотида, свързани към маркер от акридинов естер. При някои варианти за изпълнение, човешка Parvovirus В19-специфична хибридизираща последователност е от VP1 областта на генома на човешки Parvovirus В19, както и от полинуклеотидна последователност, посочена на коя да е от фигури 2A-2U или 11A-11Z.

При друг допълнителана вариант, изобретението се отнася до диагностичен тест комплект, включващ един или повече олигонуклеотидни праймери, описани в настоящото, и инструкции за провеждане на диагностичния тест. При някои варианти, тест комплектът съдържа, освен това, олигонуклеотидна проба, съдържаща Parvovirus В19специфична хибридизираща последователност от приблизително 10 до приблизително 50 нуклеотида, свързани към маркер от акридинов естер.

Тези, както и други аспекти на настоящото изобретение ще се изяснят от следващото подробно описание и прилежащите фигури.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 е диаграмно представяне на генома на човешки Parvovirus В19, което обрисува различните кодиращи области на вируса. Три PCR фрагмента са изобразени, единия с приблизително700 Ьр, съответстващ на нуклеотидни позиции 2936-3635 от генома на Parvovirus В19, описан в Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936; един c приблизително 370 bp в 700 bp фрагмента, съответстващ на нуклеотидни позиции 3073-3442 от генома на Parvovirus В19, описан в Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936; и един c приблизително 214 bp, съответстващ на нуклеотидни позиции 4728-4941 от генома на Parvovirus В19, описан в Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921936.

Фигури 2A до 2U (SEQ ID NOS 1-21) показват ДНК последователности от различни Parvovirus В19 изолати, които включват последователности, съответстващи на нуклеотидни позиции 2936-3635 от генома на Parvovirus В19, описан от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936 (700 bp фрагментът от фигура 1). Фигура 2А (SEQ ID N0:1) е съответната последователност от изолат СН47-26; Фигура 2В (SEQ ID N0:2) е съответната последователност от изолат СН48-29; Фигура 20 (SEQ ID N0:3) е съответната последователност от изолат СНЗЗ-2; Фигура 2D (SEQ ID N0:4) е съответната последователност от изолат СНЗЗ-З; Фигура 2Е (SEQ ID N0:5) е съответната последователност от изолат СНЗЗ-4; Фигура 2F (SEQ ID N0:6) е съответната последователност от изолат СН42-7; Фигура 2G (SEQ ID N0:7) е съответната последователност от изолат СН42-18; Фигура 2Н (SEQ ID N0:8) е съответната последователност от изолат СН42-19; Фигура 2I (SEQ ID N0:9) е съответната последователност от изолат СН46-23; Фигура 2J (SEQ ID N0:10) е съответната последователност от изолат СН1-1; Фигура 2К (SEQ ID N0:11) е съответната последователност от изолат СН1-6; Фигура 2L (SEQ ID N0:12) е съответната последователност от изолат СН2-8; Фигура 2М (SEQ ID N0:13) е съответната последователност от изолат СН2-10; Фигура 2N (SEQ ID N0:14) е съответната последователност от изолат СН2-11С; Фигура 20 (SEQ ID N0:15) е съответната последователност от изолат СН5-13; Фигура 2Р (SEQ ID N0:16) е съответната последователност от изолат СН7-22; Фигура 2Q (SEQ ID N0:17) е съответната последователност от изолат СН13-27; Фигура 2R (SEQ ID N0:18) е съответната последователност от изолат СН 14-33; Фигура 2S (SEQ ID N0:19) е съответната последователност от изолат СН62-2; Фигура 2Т (SEQ ID N0:20) е съответната последователност от изолат СН64-2;

Фигура 2U (SEQ ID N0:21) е съответната последователност от изолат СН67-2.

Фигури ЗА-ЗС (SEQ ID N0:22) показва последователност за приблизително 4,7 kbp PCR фрагмент, показан на фигура 1 от Parvovirus В19 клон 2-В1. Последователността е фрагмент от 4677 нуклеотида, съответстващ на нуклеотидтни позиции 217-4893 от Shade et al, J. Virol. (1986) 58:921-936. Изобразената последователност съдържа отворена рамка на четен в пълна дължина на Parvovirus В19, която кодира NS1, VP1 и VP2, и допълнителни 5’ и 3’ натранслирани последователности.

Фигури 4А-4С (SEQ ID N0:23) показва последователност за приблизително 4,7 kbp PCR фрагмент, показан на фигура 1 от Parvovirus В19 клон 2-В6. Последователността е фрагмент от 4677 нуклеотида, съответстващ на нуклеотидтни позиции 217-4893 от Shade et al, J. Virol. (1986) 58:921-936. Изобразената последователност съдържа отворена рамка на четен в пълна дължина на Parvovirus В19, която кодира NS1, VP1 и VP2, и допълнителни 5’ и 3’ натранслирани последователности.

Фигури 5А (SEQ ID N0:24) и 5В показват (SEQ ID N0:25) NS1 нуклеотина и протеинова последователности, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В1.

Фигури 6А (SEQ ID N0:26) и 6В (SEQ ID N0:27) показват VP1 нуклеотина и протеинова последователности, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В1.

Фигури 7А (SEQ ID N0:28) и 7В (SEQ ID N0:29) показват VP2 нуклеотина и протеинова последователности, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В1.

Фигури 8А (SEQ ID N0:30) и 8B показват (SEQ ID N0:31) NS1 нуклеотина и протеинова последователности, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В6.

Фигури 9А (SEQ ID N0:32) и 9В показват (SEQ ID N0:33) VP1 нуклеотина и протеинова последователности, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В6.

Фигури 10А (SEQ ID N0:34) и 10В показват (SEQ ID N0:35) VP2 нуклеотина и протеинова последователности, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В6.

Фигури 11А до 11Z (SEQ ID NOS:62-87) изобразяват ДНК последователности от различни изолати на Parvovirus В19, които включват последователности съответстващи на нуклеотидни позиции 2936-3635 от генова на Parvovirus В19, описан от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936 (700 bp фрагмента от фигура 1). Фигури 11А (SEQ ID N0:62) е съответната последователност от изолат СН80-1; Фигури 11В (SEQ ID N0:63) е съответната последователност от изолат СН81-3; Фигури 11С (SEQ ID N0:64) е съответната последователност от изолат B19SCL1-4; Фигури 11D (SEQ ID N0:65) е съответната последователност от изолат B19SCL2-1; Фигури 11Е (SEQ ID N0:66) е съответната последователност от изолат B19SCL3-1; Фигури 11F (SEQ ID N0:67) е съответната последователност от изолат B19SCL4-1; Фигури 11G (SEQ ID N0:68) е съответната последователност от изолат B19SCL5-2; Фигури 11Н (SEQ ID N0:69) е съответната последователност от изолат B19SCL6-2; Фигури 111 (SEQ ID N0:70) е съответната последователност от изолат B19SCL7-3; Фигури 11J (SEQ ID N0:71) е съответната последователност от изолат B19SCL8-2; Фигури 11К (SEQ ID N0:72) е съответната последователност от изолат B19SCL9-1; Фигури 11L (SEQ ID N0:73) е съответната последователност от изолат B19SCL9-9; Фигури 11М (SEQ ID N0:74) е съответната последователност от изолат B19SCL10-2; Фигури 11N (SEQ ID N0:75) е съответната последователност от изолат B19SCL111; Фигури 110 (SEQ ID N0:76) е съответната последователност от изолат B19SCL12-1; Фигури 11Р (SEQ ID N0:77) е съответната последователност от изолат B19SCL3-3; Фигури 11Q (SEQ ID N0:78) е съответната последователност от изолат B19SCL14-1; Фигури 11R (SEQ ID N0:79) е съответната последователност от изолат B19SCL15-3; Фигури 11S (SEQ ID N0:80) е съответната последователност от изолат B19SCL16-2; Фигури 11Т (SEQ ID N0:8165) е съответната последователност от изолат B19SCL17-1; Фигури 11U (SEQ ID N0:82) е съответната последователност от изолат B19SCL18-1; Фигури 11V (SEQ ID N0:83) е съответната последователност от изолат B19SCL19-1; Фигури 11W (SEQ ID N0:84) е съответната последователност от изолат B19SCL203; Фигури 11Х (SEQ ID N0:85) е съответната последователност от изолат B19SCL21-3; Фигури 11Y (SEQ ID N0:86) е съответната последователност от изолат B19SCL2211; Фигури 11Z (SEQ ID N0:87) е съответната последователност от изолат B19SCL2-14.

Фигура 12 (SEQ ID N0:92) изобразява примерна последователност, от която вътрешен конторл (IC) може да произлезе, за улавяне на мишената и ампбифициране.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

В практиката, настоящото изобретение използва, ако не е уточнено нещо друго, конвенционални методи на химията, биохимията, рекомбинантни ДНК техники и вирусология, във възможностите на специалиста в областа. Такива техники са обяснено напълно в литератиурата. Виж например, Fundamental Virologyq 2^nd edition, vol. I&ll (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.); A.L. Lehninger, Biochemistry (World Publischers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual (2^nd edition, 1989); Methods in Enzymology (S. CoIowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.,); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Трябва да се отбележи, че както се използва в заявката и прилежащите патентни претенции, формите в единствено число включват множественит форми, ако съдържанието не означава друго. Така, например, литературните отпратка “антиген включва смес от повече от два или повече антигена, и други подобни.

Използват се следните съкращения на аминокиселини в текста:

Аланин : Ala (А)

Аспарагин : Asn (N)

Цестуен : Cys (С)

Глутаминова киселина: Glu (Е)

Хистидин : His (Н)

Левцин : Leu (L)

Метионин : Met (М)

Пролин : Pro (Р)

Треонин : Thr (Τ) Тирозин : Tyr (Υ) Аргинин : Arg (R) Аспаргинова киселина : Asn (D) Глутаминова киселина : Glu (Q) Глицин : Gly (G) Изолевцин : Ile (I) Лизин : Lys (K) Фенилаланин : Phe (F) Серин : Ser (S) Триптофан : Trp (W) Валин : Vai (V)

I. Дефиниции

При описанието на настоящото изобретение, се използват следните термини, и се счита, че се дефинират, както е посочено по-долу.

Термините “полипептид” и протеин” се отнасят до полимер на аминокиселинен остатък и не се ограничават до минимална дължина на продукта. Следоватерно, пептиди, олигопепетиди, димери, мултимери, и други подобни, се включват в дефитицията. Термините включват, също така, постекспресионни модификации на полипептида, например, гликозилиране, ацетилиране, фосфорилиране, и други подобни. Освен това, за целите на настоящото изобретение, “полипептид” се отнася до протеин, който включва модификации, като делеции, прибавяния и замествания (найобщо консервативни в природата), до нативна последователност, до толкова, доколкото протеинът поддържа желаната активност. Тези модификации могат да са преднамерени, като чрез сайт-насочен мутагенез, или могат да са случайни, като чрез мутации в гостоприемника, който продуцира протеините, или грешки, дължащи се на PCR амплифициране.

Полипептид от Parvovirus В19, както е дефиниран погора, произлезъл от протеин, кодиран от генома на В19, както от неструктурни протеини, NS1 и NS2, така и от протеини, които образуват вирусния капсид, VP1 (приблизително 781 аминокиселини дължина) или VP2 (приблизително 554 аминокиселини дължина). Представителни NS1, VP1 и VP2 последователности са показани на фигури 5-10 в настоящото. Полипептидът не се нуждае от това, физически да произлиза от Parvovirus В19, но може да е синтетично или рекомбинантно продуциран. Освен това, полипептидът може да произлиза от който и да е от различните щамове и изолати на Parvovirus В19. Известни са голям брой консерванитивни и вариабилни области измежду тези щамове и изолати и, найобщо, аминокиселинните последователности на, например, епитопи, произлизащи от тези области, беха имали висока степен на хомоложност на последователностите, например хомоложност на аминокиселини от повече от 30%, за предпочитане повече от 40%, когато две последователности са линеаризирани. Така, например, терминът “VP1” полипептид се отнася до нативен VP1 от който и да е от различните щамове и изолати на Parvovirus В19. Пълният генотип и последователности на горните протеини на много щамове на Parvovirus В19 са известни. Виж например, Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936; Gallinella et al., J. Virol.

Methods (1993) 41:203-211. Също така са известни епитопи на Parvovirus В19, произлизащи от тези области. Виж например патент на САЩ № 5,436,127; и международна заявка № WO91/12269.

Термините “аналог” и “мутеин” се отнасят до биологичноактивни производни на сраванителната молекула, или фрагменти на такива производни, които задържат желаната активност, като имунореактивност при диагностичните изследвания. Най-общо, терминът “аналог” се отнася до съединения, които притежават нативни полипептидни последователности и структури с едно или повече прибавяния, замествания (обикновено консервативни в прородата) и/или делеции на аминокиселини, свързани с нотивната молекула, до толкова, доколкото модификациите да не разрушават имуногенната активност. Терминат “мутеин” се отнася до пептид, който притежава един или повече миметици на пептиди (“пептоиди”), като описаните в международна заявка № WO91/04282. За предпочитане, аналогът или мутеинът имат най-малкото подобна имуноактивност, като нативната молекула. Методи за получаване на аналози на полипептиди и мутеини са известни от предшестващото състояние на техниката и са описани по-долу.

Изключително предпочитани аналози включват замествания, които са консервативни в природата, например, тази замествания, които протичат в семайство аминокиселини, които са свързани по тяхните странични вариги. Поспециално, аминокиселините обикновено се разделят на четири семейства: (1) кисели - аспартат и глутамат; (2) основни - лизин, аргинин, хистидин; (3) неполярни - аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаредени полярни - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин понякога се класифицират, като ароматни аминокиселини. Например, разумно е да се предскаже, че едно изолирано заместване на ревцин с изолевцин или валин, адин аспартат с глутамат, треонин със серин, или подобно консервативно заместване на аминокиселина със структурно свързана аминокиселина, няма © да има голям ефект върху биологичната активност. Например, полипептидът, представляващ интерес може да съдържа приблизително 5-10 консервативни или неконсервативни аминокиселинни замествания, или даже до 15-25 консервативни замествания на аминокиселини, или което и да е цяло число между 5-25, дотолкова, доколкото желаното действие на молекулата да остане интактно. Специалистът в областа може лесно да определи областите на молекулата, представляваща интерес, които могат да допуснат промяна в q сравнение с Hoppe/Woods and Kyte-Doolittle plots, така както е известно от предшестващото състояние на техниката.

Под “изолиран” се има предвид, когато се отнася до полипептид, който е отделен от посочената молекула и недвързан от целия организъм, с който молекулата се намира в природата или присъства отсъствието по същество на други биологични макромолекули от същия вид. Терминът “изолиран”, по отношение на полинуклеотида е молекула нуклеинова киселина, лишена, като цяло или в частност, от нормални последователности , асоциирани с него в природата; или последователност, както съществува в

природата, но с хетероложни последователности в асоциоция с тях; или молекула, дисоциирана от хромозомата.

Полинуклеотидна “произлезла от” или “специфична за” означена последователност се отнася до полинуклеотидна последователност, която съдържа съседна последователност от най-малко приблизително 6 нуклеотида, за предпочитане най-малко приблизително 8 нуклеотида, по-предпочитано наймалко приблизително 10-12 нуклеотида, и даже попредпочитано най-малко приблизително 15-20 нуклеотида, съответстващи, например, на съответни или комплементарни на, област от означена последователност. Произлезлият полинуклеот не е задължително произлезъл от нуклеотидна последователност, която представлява интерас, но може да се генерира по който и да е начин, включително, но без да се ограничава до, химичен синтез, репликация, обратна транскрипция или транскрипция, което се базира на информецията, предоставена чрез последователността на базите в областта(ите), от която произлиза полинуклеота. Като такава, тя може да представлява или сенс или антисенс ориентация на оригиналния полинуклеотид.

“Хомоложност” се отонася до процента на сходство между два полинуклеотида или две полинуклеотидни частици. Две ДНК, или две полинуклеотидни последователности са “хомоложни по същество” една на друга, когато последователностите проявяват най-малкото приблизително 50%, за предпочитане най-малкото приблизително 70%, по предпочитано най-малкото приблизително 80%-85%, за предпочитане най-малкото приблизително 90%, и найпредпочитано най-малкото приблизително 95%-98% подобност на последователности при една определена дължина на молекули. Както се използва в настоящото, хомоложност по същество се отнася, също така, до последователности, проявяващи пълна идентичност на определена ДНК или полипептидна последователност.

Най-общо, “идентичен” се отнася до точно съответствие на нуклеотид-към-нуклеотид или аминокиселина-кьмаминокиселина на два полинуклеотидни последователности, съответно. Процентът на иденчиност може да се определи чрез директно сравняване на информацията от последователността между две молекули чрез линеаризиране на последователности, преброяване на точния брой на съответствя между две линеаризирани последователности, разделяне на дължината на по-късата последователност, и умножение на резултата по 100.

Лесно достъпни компютърни програми могат да се използват в помощ на анализирането на хомоложността и идентичността, като ALIGN, Dayhoff, Μ. 0. in Atlas of Protein Sequence and Structure M. 0. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, които адаптират алгоритъма на локалната хомоложност на Smith and Waterman Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981 за пептиден анализ. Програми за определяне на хомоложност на нуклеотидна последователност се предоставят от Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (предоставен от Genetics Computer Group, Medison, Wl) например, BESTFITT, FASTA и GAP програми, които се основават, също така, на алгоритъма на Smith and Waterman. Програмите лесно се използват със заложените по подразбиране параметри, препоръчани от производитела и описани в от Wisconsin Sequence Analysis Package, посочен по-долу. Например, процентът на хомоложност на посочена нуклеотидна последователност към посочена за справка последователност може да се опраедели при използване на алгоритъм на хомоложност на Smith and Waterman с таблица на резултатите по подразбиране и дар penalty от шест нуклеотидни позициии.

Друг метод за определяне на процента на хомоложност в контакста на настоящото изобретение е използването на MPSRCH пакетиране на програми, защитени с авторско право от Университета в Edinburg, разаработени от John F. Collins and Shane S. Sturrock, и разпространявани от IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, СА). От този комплект пакети, алгоритъма на Smith and Waterman може да се използва , когато параметрите по подразбиране се използват за таблицата с резултатите (например, отворен gap penalty от 12, удължаване на gap penalty на някой, и дар от шест. От генерираните данни от стойността на “съвпадение” се отразява хомоложността на последователностите. Други подходящи програми за изчисляване на процент на идентичност или на сходство между две последователности се обикновено известни от предшестващото състояние на техниката, например, друга програма за линеаризиране BLAST, използвана с параметрите по подразбиране. Например, BLASTIN и BLASTP могат да се използват при употреба на следните параметри по подразбиране: генетичен код = стандартен; филтър = няма; верижност = и двете; скъсяване = 60; очакван = 10; Матрица = BLOSUM62; описания = 50 последователности; сортиране по = НАЙ-ВИСОК РЕЗУЛТАТ; база данни = не прекалена, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS транслация + Swiss протеин + Spupdate + PIR. Подробности за тези програми могат да се открият на следните Интернет адреси : http://www.ncbi.nlm.QOv/cqi-bin/BLAST.

Алтернативно, хомоложност може да се определи чрез хибридизиране на полинуклеотиди при условия, при които образуват стабилни дуплекси между хомоложни области, последвано от смилане с специфични-за-единични-вериги нуклеази, и определяне на размера на сляните фрагменти. ДНК последователности, които са хомоложни по същество могат да се идентифицират при експеримент на хибридизиране по Southern при, например, строги условия, както е дефинирано за тази определена система. Дефинирането на подходящите условия на хибридизиране е в уменията на спациалиста в областа. Виж например, Sambrook, et al., по-горе; DNA cloning, по-горе; Nucleic Acid Hybridization, no-rope.

“Операционно свързани” се отнася до подреждане на елементи, при което компонентите, така описани, се конфигурират, така че да изпълнят желаната функция. Следователно, определен промотор, операционно свързан към последователност на нуклеинова киселина е способен да извърши транскрибирането, и в случай на кодираща последователност, експресията на кодиращата последователност, когато същинските транскрибиращи фактори присъстват. Не е необходимо промоторът да е съседен на последователността на нуклеиновата киселина, доколкото тя функционира да насочва транскрибирането и/или експресията. Следователно, например, намесването на нетранслирани, но вече транскрибирани последователности може да присъства между промоторната последователност и кодиращата последователност, както могат транскрибирани интрони, и промоторната последователност може, все още, да се приема за “операционно свързана” към кодиращата последователност.

“Рекомбинантен”, както се използва в настоящото за описване на молекула нуклеинова киселина, означава полинуклеотид от геномен, сДНК, вирусен, полусинтетичен, или синтетичен произход, която въз основа на произхода си или манипубиране, не е асоциирана с всички, или част от, полинуклеотиди, с които е асоциирана в природата. Терминът “рекомбинантен”, както се използва по отношение на протеин или полипептид, означава полипептид, продуциран чрез експресиране на рекомбинантен полинуклеотид. Най-общо, генът представляващ интерес се клонира и се експресира след това в трансформирани организми, както е описано подолу. Организмът гостоприемник експресира чуждиятт ген, за да продуцира протеина, при условия на експресия.

“Контролен елемент” се отнася до полинуклеотидна последователност, която спомога при транскрибцията и/или транслацията на нуклеотидната последователност, към която е свързан. Турминът обхваща промотори, последователности за края на транскрибцията, upstream регулаторни домени, сигнали за полиаденилиране, нетранслирани области, включително 5’-UTRs и 3’- UTRs, и когато е подходящо, лидерни последователности и енхансери, които колективно осигуряват транскрибцията и транслацията на кодираща последователности в клетка гостоприемник.

“Промотор”, както се използва в настоящото, е регулаторна област, способна да свързва полимераза и да инициира транскрибция на downstream (3’ посока) нуклеотидна последователност, операционно свързана към нея. За целите на настоящото изобретение, промоторна последователност включва минималния брой бази или елементи, необходими да инициират транскрибция на последователността, представляваща интерес, при откриваеми степени над фона. В промоторната последователност е сайт за иницииране на транскрибцията, както и домени за свързване на протеини (консенсус последователности), отоговорни за свързването на РНК или ДЗНК полимераза. Например, промоторът може да е последователност на нуклеинова киселина, която се разпознава от ДНК-зависима РНК полимераза (“транскриптаза”), като сигнал за свързване към нуклеинова киселина и начало на транскрибция на РНК при специфичен сайт. За свързване, такива транскриптази, обикновено изискват ДНК, която двуверижна в участъка, съдържащ промоторната последователност и нейния комплемент; участъкът на матрицата (последователност, която трябва да се транскрибира) не е необходимо да е двуверижен. Отделни ДНК-зависими РНК полимерази разпознават голямо разнообразие от промоторни последователности, които подчертано могат да варират по тяхната ефикастност за съдействие на транскрибцията. Когато РНК полимераза се свързва към промоторна последователност, за да инициира транскрибция, тази промоторна последователност не е част от транскрибираната последователност. Следователно, РНК30 овите транскрипти, получени по този начин, не включват тази последователност.

Контролна последователност “насочва транскрибцията” на нуклеотидна последователност, когато РНК или ДНК полимераза се свържи към промоторната последователност и транскрибира прилежащата последователност.

“ДНК-зависима ДНК полимераза” е ензим, който синтезира комплементарно ДНК копие от ДНК матрица. Примери са ДНК полимераза I от Е. coli и ДНК полимераза от бактериофаг Т7. Всички известни ДНК-зависими ДНК полимерази изискват комплементарен праймер, за иницииране на синтеза. При подходящи условия, ДНКзависима ДНК полимераза може да синтезира комплементарно ДНК копие от РНК матрица.

“ДНК-зависима РНК полимераза” или “транскриптаза” е ензим, който синтезира множество РНК копия от двуверижна или частично двуверижна ДНК молекула, притежаваща (обикновено двуверижна) промоторна последователност. РНК молекулите (“транскрипти”) се синтезират в 5’ към 3’ посока, като се започва от специфична позиция, точно downstream от промотора. Примери за транскриптази са ДНК-зависима РНК полимераза от Е. coli и от бактериофаг Т7, ТЗ и SP6.

“РНК-зависима ДНК полимераза” или “обратна транскриптаза” е ензим, който синтезира комплементарно копие на ДНК от РНК матрица. Всички известни обратни транскриптази също имат способност да правят комплементарно ДНК копие от ДНК матрица; следователно, те са както РНК-, така и ДНК-зависими ДНК полимерази.

Необходим е праймер за иницииране на синтез с двете - РНК и ДНК матрици.

“РНаза Н” е ензим, който разгражда РНК-овия участък от РНК:ДНК дуплекса. Тези ензими могат да са ендонуклеази или екзонуклеази. Повечето обратно транскриптазни ензими, нормално съдържат РНаза Н активност допълнително към тяхната полимеразна активност- въпреки това, други източници на РНаза Н са достъпни без асоциирана полимеразна активност. Разграждането може да доведе до разделяне на РНК от РНК:ДНК комплекс. Алтернативно, РНаза Н може просто да срязва РНК на различни места, така че тези участъци от РНК се стопяват или позволяват ензимите да развият участъци от РНК.

Термините “полинуклеотид, “олигонуклеотид”, “нуклеинова киселина” и “молекула на нуклеинова киселина” се използват в настоящото, като включват полимерна форма на нуклеотиди с каквато и да е дължина, било то рибонуклеотиди или дезоксирибонуклеотиди. Този термин ксе отнася единствено до първична структура на молекулата. Следователно, терминът включва три-, дву- и едноверижна ДНК, така както и три-, дву- и едноверижна РНК. Тя включва, също така, и модификации, както чрез метилиране и/или чрез покриване и немодифицирани форми на полинуклеотида. Поспециално, термините “полинуклеотид”, “олигонуклеотид”, “нуклеинова киселина” и “молекула на нуклеинова киселина” включват полидезоксирибонуклеотиди (съдържащи 2-дезоксиD-рибоза), полирибонуклеотиди (съдържащи D-рибоза), който и да е друг вид полинуклеотид, който е N- или С-гликозид на пуринова или пиримидинова база, и други полимери, съдържащи не-нукпеотидни скелети, например, полиамид, (неепример, пептидни нуклеинови киселини (PNAs)) и полиморфолино (достъпен в търговската мрежа от Anti-Virals, Inc., Corvillis, Oregon, като Neugene) полимери, и други синтетични специфични за последователността полимери на нуклеинови киселини, при условие, че полимерите съдържат нуклеобази в конфигурация, която позволява сдвояване на базите и струпване на бази, както се открива при ДНК и РНК. Не се предвижда разграничаване по дължина между термините “полинуклеотид”, “олигонуклеотид”, “нуклеинова киселина” и “молекула на нуклеинова киселина” и тези термини се използват като взаимозаменяеми. Тези термини се отнасят единствено до първична структура на молекулата. Следователно тези термини включват, например, 3’-дезокси2’,5’-ДНК, олигодезоксирибонуклеотид МЗ’ Р5’ фосфорамидати, 2’-О-алкил-заместена РНК, дву- и едноверижна ДНК, така както и дву и едноверижна РНК, ДНК:РНК хибриди, и хибриди между PNAs и ДНК или РНК, и включват, също така, известни видове на модификации, например, маркери, които са известни от предшестващото състояние на техниката, метилиране, “caps”, заместване на един или повече срещащи се естествено в природата нуклеотида с адин аналог, междунуклеотидни модификации, като например, тези с незаредени връзки (например, метил фосфонати, фосфотриестери, фосфорамидати, карбамати, и т.н.), с отрицателно заредени връзки (например, фосфоротиоати, фосфородитиоати, т.н.), и с положително заредени връзки (например, аминоалкилфосфорамидати, аминоалкилфосфотриестери), тези съдържащи висящи части, като например, протеини (включително нуклеази, токсини, антитела, единични пептиди, поли-1_-лизин, и др.), тези с интеркалиращи средства (разделящи) (например, акридин, псорален и т.н.), тези съдържащи хелатори (например, метали, радиоактивни метали, бор, оксидативни метали и т.н.), тези съдържащи алкилиращи средства, тези с модифицирани връзки (например, абфа аномерни нуклеинови киселини, и т.н.), както и немодифицирани форми на полинуклеотиди или олигонуклеотиди. По-специално, ДНК е дезоксирибонуклеинова киселина.

Както се използва в настоящото, “област мишена на нуклеинова киселина “ или “нуклеинова киселина мишена” означава молекула нуклеинова киселина с “последователност мишена”, за амплифициране. Нуклеиновата киселина мишена може са е както едноверижна, така и двуверижна и може да включва други последователности, освен последователността мишена, които не могат да се амплифицират. Терминът “последователност мишена” се отнася до определена нуклеотидна последователност от нуклеинова киселина мишена, каято трябва да се амплифицира. Последователността мишена може да включва хибридизираща с проба област, съдържаща се в молекулата мишена, с която пробата ще образува стабилен хибрид при желани условия, “последователността мишена” може да съдържа, също така, образуваща комплекс последователност, към която се свързват в комплекс олигонуклеотидни праймери и може да се удължи, при използване на последователността мишена, като матрица. Когато нуклеиновата киселина мишена е оригинална едноверижна, телминът “последователност мишена” се отнася, също така, до последователност, комплементарна на “последователността мишена”, както присъства в нуклеиновата киселина мишена. Ако “нуклеиновата киселина мишена” е оригинално двуверижна, телминът “последователност мишена” се отнася до и до двете, както до (+), така и до (-) веригите.

Терминът “праймер” или “олигонуклеотиден праймер”, както се използва в настоящото, се отнася до олигонуклеотид, който действа за иницииране на синтеза на комплементарна ДНК верига, когато се постави при условия, при които се индуцира синтезът на продукт от удължаването на праймера, т.е, в присъствие на нуклеотиди и индуциращи полимеризация средства, като ДНК или РНК полимераза и при подходяща температура, pH, концунтрация на метали, и концентрация на соли. За предпочитане, праймерът е едноверижен за максимална ефикастност при амплификацията, но може алтернативно да е двуверижен. Ако е двуверижен, праймерът първо се третира за отделяне на неговите вериги преди да се използва за получаване на продуктите на удължаването. Този етап на денатуриране характерно се извършва чрез топлинна обработка, но може алтернативно да се проведе при използване на ооснови, с последващо неутрализиране. Следователно, “праймер”-ът е комплементарен на матрицата, и образува комплекс чрез водородна връзка или хибридизиране с матрицата, за да се получи праймер/матрица комплекс, за иницииране на синтез чрез полимераза, който се удължава чрез прибавянето на ковалентно свързани бази, свързани при 3’ края комплементарно към матрицата в процеса на синтез на ДНК.

Както се използва в настоящото, терминът “проба” или “олигонуклеотидна проба” се отнася до структура, която се състои от полинуклеотид, както е дефинирано по-горе, който съдържа последователност на нуклеинова киселина, комплементарна на последователност на нуклеинова киселина, присъстваща в анализираната нуклеиновата киселина мишена. Полинуклеотидните области на пробите могат да съставени от ДНК, и/или РНК, и/или синтетични нуклеотидни аналози. Когато една “олигонуклеотидна проба” трябва да се използва при 5’ нуклеазно изследване, като TaqMan™ пробата ще съдържа най-малко едно флуоресциращо средство и най-малко един гасител, който се смила чрез 5’ ендонуклеазна активност на полимераза, която се използва в реакцията, с цел да се открие каквато и да амплифицирана олигонуклеотидна последователност мишена. В този контекст, олигонуклеотидната проба трябва да има достатъчен брой фосфодиестерни връзки, съседни на неговия 5’ край, така че 5' до 3’ използваната нуклеазна активност може ефикасно да разгради свързаната проба, за да раздели флуоресциращото средство и гасителя. Когато се използва олигонуклеотидна проба в ТМА техника, тя трябва да е подходящо маркирана, както се описва по-долу.

Оценява се, че хибридизиращите последователности не трябва да имат перфектна комплементарност, за да доставят стабилни хибриди. В много ситуации, стабилни хибриди се образуват, където по-малко от 10% от базите съответстват, като се игнорират бримките от четири или повече нуклеотида. В съответствие, както се използва в настоящото, терминът “комплементарен” се отнася до олигонуклеотид, който образува стабилен дуплекс с неговия “комплемент” при условия, при които обикновено има приблизително 90% или повече хомоложност.

Теермините “хибридизира” и “хибрид” се отнасят до образуването на комплекси между нуклеотидни последователности, които са достатъчно комплементарни, за да образуват комплекси чрез Watson-Crick образуване на базови двойки. Когато праймер “хибридизира” с мишена (матрица), такива комплекси (или хибриди) са достатъчно стабилни, за да обслужват стимулирането функцията необходима за, например, ДНК полимеразата да инициира синтеза на ДНК.

Както се използва в настоящото, терминът “ свързани двойки” се отнася до първи и втори молекули, които специфично се свързват една към друга, като комплементарни полинуклеотидни двойки, способни да образуват дуплекси на нуклеинови киселини, “специфично свързване” на парвия член от свързваната двойка към втория член от свързаната двойка в проба, се доказва чрез свързването на първия член към втория член, или обратното, с по-голям афинитет, отколкото другите компоненти в пробата. Свързването между членовете на свързаните двойки е характерно нековалентно. Ако контекстът не посочва ясно друго нещо, термините “афинитет на молекула” и “анализирана мишена” се използват в настоящото, що се отнася до парвия и втория членове на свързващата двойка, съответно.

Термините “специфично-свързваща молекула” и “афинитетна молекула” се използват взаимозаменяемо в настоящото и се отнасят до молекула, която се свързва селективно по химически или физически начини към откриваемо вещество, присъстващо в пробата. Под “селективно свързване” се има предвид, че молекулата се свързва за предпочитане към мишената, представляваща интерес, или се свързва с по-голям афинитет към мишената, отколкото към други молекули. Например, ДНК молекула се свързва към комплементарна по същество последователност, а не към несвързани последователности.

“Температурата на топене” или “Тт” на двуверижна ДНК се дефинира, като температурата, при която половината от спиралната структура на ДНК се загубва поради загряване или друго дисоцииране на водородните връзки между базовите двойки, например, чрез третиране с киселина или основа. Тт на ДНК молекулата зависи от нейната дължина и от нейния състав на бази. ДНК молекули, богати на GC базови двойки имат по-висока Тт, отколкото тези, които имат изобилие от АТ базови двойки. Разделените комплементарни вериги на ДНК спонтанно се реасоциират или се хибридизират, за да образуват дуплексна ДНК, когато теемпературата е по-ниска от Тт. Най-високата степен на хибридизиране на нуклеинови киселини се проявява приблизително при 25°С под Тт. Тт може да се определя при използване на следното отнасяне: Tm=69,3+0,41(GC)% (Marmuret al.,(1962) J.Mol.Biol. 5:109-118).

Както се използва в настоящото, “биологична проба” се отнася до проба тъкан или течност, изолирана от субект, която обикновено включва аантитела, продуцирани от субекта. Характерно, проби, които съдържат такива антитела са известни от прадшестващото състояние на техниката включват, но без да се ограничават до, кръв, плазма, серум, фекалиини вещества, упина, костан мозък, жлъчка, гръбначномозъчна течност, лимфна течност, проби от кожа, секреции от кожата, дишането, черва, и генитало-уринарния тракт, сълзи, кърма, кръвни клетки, органи, биопсии, и проби от съдържимото на in vitro клетъчни култури, включително, но без да се ограничава до, кондиционирана среда, получена от култивиранетона клетки, тъкани в култураална среда, например, рекомбинантни клетки, и клетъчни компоненти.

Както се използва в настоящото, термините “маркер” и “откриваемо макиран” се отнасят до молекула, способна да открива, включително, но без да се ограничава до, радиоактивни изотопо, флуоресценцентни средства, хемилуминисцинтни средства, хромофори, енцимни субстрати, ензимни кофактори, ензимни инхибитори, хломофори, багрила, метални йони, метални соли, лиганди (непример, биотин, авидин, стрептавидин или хептени) и други подобни. Терминът “флуоресценцентно средствао” се отнася до вещество или негова част, което е способно да проявява флуоресценция в степен на откриване.

II. Начини за осъществяване на изобретението

Преди подробно да се опише настоящото изобретение, трябва да се разбере, че изобретението не се ограничава до определени формулировки или, че параметрите на процесите, като такива, могат да варират. Трябва да се разбира, освен това, че използваната терминология в настоящото е с единствена цел да се опишат определени варианти за осъществяване на изобретението, и не се счита за ограничаваща.

Въпреки големия брой състави и методи, подобни или еквивалентни на тези, описани в настоящото могат да се използват в практиката на изобретението, в настоящото са описани предпочитаните материали и методи.

Както е отбелязано по-горе, настоящото изобретение се основава на откритието на нови праймери и проби и диагностични методи за прецизно откриване на инфекция от Parvovirus В19 в биологична проба. Методите се оснавават на чувствителни техники за определяне на нуклеинови киселини, които позволяват идентифициране на последователности на нуклеинови кесулене мишена на Parvovirus В19 в проби, съдържащи малки количества вирус.

По-специално, изобретателите на настоящото, охарактеризират области в генома на Parvovirus В19, които са желани мишени за тестове за диагностика. Праймери и проби, произлезли от тези области са изключително полезни за откриване на биологичнин проби на Parvovirus В19.

Праймери и проби на Parvovirus В19, описани по-горе, се използват при анализите, базирани на нуклеинови киселини, за откриване на инфекциа от човешки Parvovirus В19 в биологични проби.

По-специално, праймери и проби за използване тези изследвания, за предпочитане, рпроизлизат от 4,7 kb фрагмент приблизително, от генома на Parvovirus В19, съответстващ на нуклеотидни позиции 217-4678 от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. нуклеонидните последователности от тази област от два различни изолата на Parvovirus В19 са изобразени на фигури ЗА-ЗС и 4А-4С, в настоящото.

Както е обяснено по-горе, фрагментът съдържа NS1, VP1 и VP2 кодиращи области.

Изключително предпочетени праймери и проби, за използване при настоящите изследвания се проектират от високо консервативни области на генома на Parvovirus В19, за да се позволи откриването на инфекция от Parvovirus В19, причинена от различни изолати. Както се описва в настоящото, високо консервативни области на генома на Parvovirus В19 се ткриват в 700 Ьр област, простираща се на нуклеотидни позиции 2936-3635, номерирани спрямо генома на Parvovirus В19, описан от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921936. Тази област се открива в VP1 областа на генома. Последователността на тази област от 21 различни изолати на Parvovirus В19 е показана в настоящото на фигури 2A-2U. Последователностите от допълнителни 26 изолата са показани на фигури 11A-11Z, в настоящото. Сравнение на последователностите показва, че тази област показва от приблизително 98% до 99,5% хомоложност на последователностите от изолат до изолат, което я прави сило жалана последователност мишена.също така желана за проектирането на проби и праймери е 370 kb област, открита в VP1, която се разпростира приблизително над нуклеотидни позиции 30703-3442, номерирани относително по Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936, како и 214 kb фрагмент, изобразен на фигура 1, който се среща в 3’ участъка на 4,7 kb фрагмент и обхваща нуклеотидни позиции 4728-4941, оотносително номерирани по Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936.

Областите 6,7 kbp, 700 kbp и 370 kbp се получават лесно от допълнителни изолати, при използване на участъци от последователност на Parvovirus В19, откирата в тези специални области, като праймери в PCR реакции, като тези, описани в настоящото, както и в патнети на САЩ No 4,683,195; 4,683,202 и 4,889,818, и осоновани на последователността, осигурени от настоящото. Друг метод за получаване на нуклеотидини последователности с желани последователности е хибиридизирането на комплементарни комплекти от припокриващи се синтетични олигонуклеотиди, продуцирани в конвенционален, автоматичен синтезатор на полинуклеотиди, последвано от лигиране с подходящи ДНК лигази и амплифициране на лигираната нуклеотидна последователност чрез PCR. Виж например, Jayarman et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. След като веднъж последователностите са получени или изолирани, те могат да се клонират в подходящ вектор или репликон. Многобройни вектори на клониране са известни на специалистите в областа, и селекцията на подходящ вектор за клониране е въпрос на избор. Подходящи вектори включват, без да се ограничават до, плазмиди, фаги, транспозони, космиди, хромозоми или вируси, които способни на репликация, когато се асоциират с присъщ контроленн елемент.

Рекомбинантни клонове лесно се идентифицират чрез анализ с рестрикционни ензими и полиакриламизна или агарозна електрофореза, при използване на техники, добре езвостни от предшестващото състояние на техниката и описани в примерите за изпълнение на изобретението, подолу.

Праймери и проби за използване при изследването произлизат от тези последователности и лесно се синтезират чрез стандартни техеники, например, твърдо-фазов синтез от химията на фосфорамидити, както се описва в патенти на САЩ Nos 4,458,066 и 4,415,732; Beucage et al., (1992) Tetrahedron 48:2223-2311; и Applied Biosystems User Bulletin No. 13 (01. 04.1987). Други методи на химичен синтез включват, напаример, фосфотриестерния метод, описан от Narang et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:90 и фосфодиестерния © метод , описан от Brown et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:109.

Poly(A) или poly(C), или други некомплементарни нуклеотидни удължения могат да се инкорпорират в проби при използване на същите методи. Хексаетилен оксидно удължаване може да се присъедини към проби чрез методи, известни от предшестващото състояние на техниката. Cload et al., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113:6324-6326; патент на САЩ № 4,914,210 на Levenson et al.,; Durant et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:63536359; и Horn et al., (1986) Tet. Lett. 27:4705-4708. характерно, Спраймерните последователности са в граници между 10-75 нуклеотида дължина, като 15-60, 20-40 и така нататък, поспециално в граници между 18040 нуклеотида дължина, и която и да е дължина в границите на установената дължина. Типичнатат проба е с дължина в граници между 10-50 нуклеотида дължина, както и 15-40, 18-30, и така нататък, и която и да е дължина между усутановените граници.

Освен това, пробите могат да се присъединят към маркери за откриване. Съществуват няколкоко известни начина за получаване на производни на олигонуклеотиди с реактивни функционални групи, които позволяват прибавянето на маркер. Например, няколко подхода са достъпни за биотинилиране на проби, така че, разиоактивни, флуоресцентни, хемилуминесцентни, ензимни или електронни плътни маркери могат да се прикрепят чрез авидин. Виж например, Broken et al., Nucleic Acids Res. (1978) 5:363-384, където се описва използването на феритин-авидин-биотин маркери: и Chollet et al., Nucleic Acids Res. (1985) 13:1529-1541, където се описва биотинилиране на 5‘ краищата на олигонуклеотиди чрез аминоалкил-фосфорамидно линкерно средство. На разположение са известен брой методи за синтезиране амино-производни олигонуклеотиди, които лесно се бележат чрез фруоресцентни или друг вид съединения, произлезли чрез амино-реактивни групи, като изотиоцианат, N-хидроксисукционимид, или подобни, виж например Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15:3131-3139, Gibson et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6455-6467 и патент на САЩ No 4,605,735 на Miyoshi et al. на разположение са, също така, и методи за сиинтезиране на сулфхидрилови производни олигонуклеотиди, които могат да влузат в реакция с тиолспецифични маркери, виж например, патент на САЩ № 4,757,141 на Fung et al., Connolly et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:4485-4502 и Spoat et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:4837-4848. понятен преглед на методолигии за белязане на ДНК фрагменти се предоставя в Matthews et al., Anal. Biochem. (1988)169:1-25.

Например, проби могат да се маркират флуоресцентно чрез свързване на флуоресцентна молекула към не-лигирания терминус на пробата. Ръководство за избор на подходящи флуоресцентни маркери може да се открие в Smith et al., Meth.

Enzymol. (1987) 155:260-301; Karger et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4955-4962; Haugland (1989) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Предпочитани флуоресцентни маркери включват флуоресцеин и негови производни, както се описва в патент на САЩ № 4,318,846 и Lee et al., Cytometry (1989) 10:151-164, и 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 или NAN-2, и други подобни.

Допълнително, пробите могат да се маркират с акридинов естер (АЕ), при използване на техниките, описани по-долу. Настоящите технологии позволяват АЕ маркер да се постави в каквато и да е позиция в пробата. Виж, например, Nelson et al., (1995) “ Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence” in Nonisotope Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L.J.(ed.) Acedemic Press, San Diego, CA; Nelson et al., (1994) “Application of the Hybridisation Protection Assays (HPA) to PCR” in the Polymerase Chain Reaction, Muulis et al., (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34:20872090. АЕ молекула може директно да се прикрепи към проба, чрез използване химията на не-нуклеотидно-основаващо се линкерно средство, който да позволява разполагането на маркери в която и да е позиция в пробата. Виж, например, патент на САЩ № 5,585,481.

При някои варианти за изпълнение на изобретението, се прибавя вътрешен контрол (IC) или вътрешен стандарт, за да служи като контрол за залавянето на мишената и амплифицирането. За предпочитане, IC включва последователност, която се различава от последователността мишена, е способен да хибридизира с последователностите на пробата, използвани за разделяне на олигонуклеотидите специфични за организма от пробата, и е способен да амплифицира. Използванеот на IC позволява конторлирането на процеса на разделяне, процеса на амплифициране, и системата за откриване, и позволява проследяването на изпълнението на изследването и количественото определяне на пробите. Представителна последователност, от която може да се получи IC е показана на фигура 12. IC може да се включи в която и да е подходяща точка, например, в лизисния буфер. При един вариант за изпълнение, IC включва М13 ssflHK съдържаща нуклеотидна последователност от Parvovirus В19 и единствена последователност, която хибридизира с пробата, например, съдържаща последователности от VP1 областта, където последователността мишена се модифицира чрез заместване или делетиране на 5-20 бази или повече, за предпочитане 515 бази, като 5, 10 или 15 бази или което и да е число в тези граници. Заместените или делетирани бази, за предпочитане, се срещат по цялата дължина на последователността мишена, така че само 2 или 3 последователни последователности се заместват. Така например, ако последователността мишена е

CTACTTGCTGCGGGAGAAAAACACCT (SEQ ID N0:91), след което последователността може да се замести с, например, AGCTAGACCTGCATGTCACTG (SEQ ID N0:90) в IC.

Твърдата подложка може допълнително да включва проби, специфични за вътрешен стандарт (IC проба), като по този начин се улеснява заляването, когато се използва IC проба. IC пробата може, по желание, да се прикрепи към откриваем маркер, който е различен от откриваемия маркер за последователността мишена. При варианти за изпълнение, при които откриваемия маркер е флуорофор, IC може да се определи количествено спектрофотометрично и чрез изследване на граници на откриване. Характерно, броят копия на IC, който не интерферира с откриваемата мишена се определя чрез титруване на IC с фикисирана IU мишена, за предпочитане в по-ниския край, и се построява стандартна Q крива чрез разреждане на проба на международно приет IU.

За количествено определяне на Parvovirus В19, може да се използва осем-членен панел от 8000IU-125IU.

При друг вариант за изпълнение, IC, както е описано в настоящото, се комбинира с РНК, изолирана от пробата, съгласно дтандартни техники, известни на специалистите в областа, и описана в настоящото. След това РНК се подлага на обратно транскрибиране при изполчване на облатна транскритпаза, за да се осигури копие на ДНК. сДНК q последователности могат, при желание, да се амплифицират (например, чрез PCR), при използване на маркирани маркери. Продуктите на амплификацията се разделят определя се, характерно чрез електрофореза, и количеството на радиоактивност (пропорционално на количеството на амплифицирания продукт). Количеството на иРНК в пробата, след това, се изчислява чрез сравняване със сигнала, продуциран по известните стандарти.

Праймерите и пробите, описани по-гореу могат да се използват в техники, основаващи се на полимеразна верижна реакция (PCR), за откриване на инфекция от Parvovirus В19 в

биологични проби. PCR е техника за амплифициране на желана последователност на нуклеинова киселина мишена, съдържаща се в молекула на нуклеинова киселина или смес от молекули. При PCR, се използва двойка проймери в излишък за хибридизиране с комплементарните вериги на нуклеиновата киселина мишена. Всеки праймер се удължава чрез полимераза, при използаве на нуклеиновата киселина мишена, като мишена. Продуктите на удължаването стават последователности мишени, сами те, след отделяне от оргиналната верига мишена. След това, нови праймери се хибридизират и се удължават чрез полимераза, и цикълът се повтаря за геометрично нарастване на броя на молекулите последователности мишени. PCR методът за амплифициране на последователностите на нуклеинови киселини мишени е добре известен от предшестващото състояние на техниката и е описан в, например,Innis et al., (eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) Polymerase Chain Reaction: basic principle and automation, in PCR: A Practical Approach, McPherson et al., (eds.) IRL Pres, Oxford; Saiki et al., (1986) Nature 324:163; така както и патенти на САЩ № 4,683,195; 4,683,202 и 4,889,818.

По-специално, PCR използва относително къси олигонуклеотдини праймери, които ограничават нуклеотидната последователност мишена, която трябва да се амплифицира, ориентирани са така, че тяхните 3’ краища да са един срещу друг, всеки праймер се удължава до другия. Полинуклеотидната проба се екстрахира и се денатурира, за предпочитане чрез загряване, и се хибридизира с парви и втори ппраймери, които присъстват в моларен излишък.

Полимеризирането се катализира в присъствие на четири дезоксирибонуклеотидни трифосфата (dNTPs—dATP, dGTP, dCTP и dTTP) при използване на зависимо от праймера и от матрицата полимеризиращо полинуклеотиди средство, като който и да е ензими, способен да продуцира продукти на удължаванете на праймера, например, ДНК полимераза I от Е. coli, фрагмент на Klenow от ДНК полимераза I, Т4 ДНК полимераза, термостабилни ДНК полимерази, изолирани от Thermus aquqticus (Taq), достъпни от многобройни източвици Q (например, Perkin Elmer), Thermus thermophilus (United States

Biochemicals), Bacillus stereothermophilus (Bio-Rad), или Thermococcusnlitoralis (“Vent” polynerase, New England Biolabs). Резултатите в два “дълги продукта, които съдържат съответните праймери в тяхните 5’ краища, ковалентно свързани към ново синтезираните комплементи на оригиналните вериги. След това, реакционната смес се връща при условия на полимеризиране, например, чрез понижаване на температурата, инактивиране на денатуриращо средство, ф или добавяне на повече полимераза, и се инициира втори цикъл. Вторият цикъл предоставя двете оригинални вариги, двата дълги продукта от първия цикъл, два нови дълги продукта, репликирани от оригиналните вериги, и два къси продукта”, репликирани от дългите продукти. Късите продукти притежават последователност на последователността мишена с праймер на всеки край. На всеки допълнителен цикъл се продуцират допълнително два нови дълги продукта и известен брой каси продукти, равен на броя на къси и дълги продукти, оставащи в края на предишния цикъл. Следователно, броят на къси продукти, съдържащи последователността мишена нараства експоненциално с всеки цикъл. За предпочитане, PCR се провежда с достъпен в търговската мрежа термично средство за провеждане на циклите, например, Perkin Elmer.

РНК-и могат да се амплифицират чрез обратно транскрибиране на иРНК в сДНК, и след това да се проведе PCR (RT-PCR), както е описано по-горе. Алтернативно, единичен ензим може да ке използва за двата етапа, описани в патент на САЩ № 5,322,770. иРНК също може да бъде обратно транскрибирана в сДНК, със следваща асиметрична © дар лигазна верижна реакция (RT-AGLCR), както е описано от

Marshall et al., (1994) PCR Meth. App. 4:80-84.

Флуорогенното 5’ нуклеазно изследване, известно като TaqMan™ изследване (Parkin-Elmer) е мощна и всестранна PCR-основана система за откриване на нуклеинови киселини мишени. Оттук, праймери и проби, произлезли от области от генома на Parvovirus В19, описан в настоящото, могат да се използват в TaqMan™ изследването за откриване присъствието на инфекция в биологичнан проба. Анализът се Ф провежда заедно с термичен цикъл при проследяване на генерирането на флуоресцентни сигнали. Системата на изследването се освобождава от необходимостта от гел елекгрофоретимен анализ, и има възможност да генерира количествени данни, позволяващи определянето на брой копия мишени.

Флуорогенното 5’ нуклеазно изследване се провежда конвенционално при използване на, например, AmpliTaq Gold™ ДНК полимераза, която има ендогенна 5’ нуклеазна активност, за да се смели вътрешна олигонуклеотдна проба, маркирана и с двете, флуоресцетно репортер багрило и гасител (виж Hollander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:7276-7280; и Lee et al., Nucl. Acids. Res. (1993) 21:37613766. Изселдването води до откриване чрез измерване на промени във флуоресцецията, което протича по време на цикъла на амплифициране, като флуоресцетната проба се смила, отделя се багрилния и гасителния маркери и се причинява нарастване на флуоресцетния сигнал, който е пропорционален на амплифицирането на ДНК-та мишена.

Продуктите на амплифицирането могат да се открият в разтвор или при използване на твърди подложки. При този метоз, TaqMan™ пробата се проектира за хибридизиране към последователност мишена в желания PCR продукт. 5’ краят на TaqMan™ пробата съдържа флуоресцетно репортер багрило. 3’ краят на пробата се блокира, за да се предотврати удължаването на пробата и съдържа багрило, което ще изгаси флуоресценцията на 5’ флуорофора. По време на последващото ампбифициране, 5’ флуоресцентният маркер се отцепва, ако полимера с 5’ екзонуклеазна активност присъства в реакцията. Изрязването на 5’ флуорофора води да нарастване на флуоресценцията, което може да се открие.

По-специално, олигонуклеотдната проба се конструира така, че пробата да съществува поне в една еденоверижна конформация, когато е нехибрпидизирана, където молекулата на гасителя е достатъчно близо до репортер молекулата, за да погаси флуоресценцията на репортер молекулата. Олигонуклеотидната проба съществува, също така, в поне една конформация, където е хибридизирана с полинуклеоид мишена, така че молекулата на гасителя да не е разположена достатъчно близо до репортер молекулата, за да се загаси флуоресценцията на репортер молекулата. Чрез приемане на тези хибридизирани и нехибридизирани конформации, репортер молекулата и молекулата на гасителя върху тази проба проявяват различен интензитет на флуоресцентния сигнал, когато пробата е хибридизиране или нехибридизирана. Като резултат от това е възможно да се определи дали ппробата е хибридизиране или е нехибридизирана, на основата на промяна на интензитета на флуоресценция на репортер молекулата, молекулата на гасителя, или на тяхната комбинация. В допълнение, поради това, че пробата може да се проектира така, че молекулата на гасителя да загаси репортер молекулата, когато пробата е нехибридизирана, пробата може да се проектира така, че репортер молекулата да проявява ограничена флуоресценция, освен ако пробата не е хибридизирана или смляна.

В съответствие, настоящото изобретение се отнася до методи за амплифициране на Parvovirus В19 мишена нуклеотидна последователност при използване на полимераза на нуклеинова киселина, притежаваща 5’ до 3’ нуклеазна активност, адин или повече праймери способни да хибридизират към последователноста на Parvovirus В19 мишена, и една олигонуклеотдна проба способна да хибридизира към последователността 3’ на Parvovirus В19 мишена по отношение на праймера. По време на амплифицирането, полимеразата смила олигонуклеотдната проба, когато е хибридизирана към последователност мишена, като по този начин се разделя репортер молекулата от молекулата на гасителя. По време на протичането на амплифицирането, флуоресценцията на репортер молекулата се проследява, с флуоресценция съответстваща на наличието на амплифициране на нуклеинова киселина. За предпочитане, репортер молекулата е флуоресцеиново багрило, а гасителната молекула е за предпочитане родаминово багрило.

Докато дължината на праймерите и пробите може да варира, последователностите на пробите се избират така, че да имат по-ниска тимпература на топене от последователностите на праймера. Следователно, последователностите на праймера са обикновено по-дълги от последователностите на пробите. Характерно, последователностите на праймерите са с дължина от порядъка между 10-75 нуклеотида, по-характерно в граници между 20-45. типичната проба е в граници между 10-50 нуклеотида дължина, по-типично 15-40 нуклеонида дължина.

Ако се използва твърда подложка, олигонуклеотдната проба може да се прикачи към твърдата подложка по найразнообразни начини. Например, пробата може да се прикачи към твърдата подложка чрез прикрепяне на 3’ или 5’ крайния нуклеотид на пробата към твърдата подложка. Попредпочитано, пробата се прикрепя към твърдата подложка чрез линкер, който служи за отдалечаване на пробата от твърдата подложка. Линкерът е обисновено от най-малко 1530 атома дължина, по-предпочитано най-малко 15-50 атома дължина. Необходимата дължина на линкера ще зависи от конкретната използвана твърда подложка. Например, линкер с дължина шест атома обикновено е достатъчна, когато се използва силно омрежен полистирол като твърда подложка.

Голямо разнообразие от линкери са известни от предшестващото състояние на техниката, които могатда се използват за прикрепяне на олигонуклеотдната проба към твърдата подложка. Линкерът може да се образува от което и да е съединение, което не се намесва значително при хибридизирането на последователността мишена към пробата, която е прикрепена към твърдата подложка. Линкерът може да се образува от хомополимерен олигонуклеотд, който лисно може да се прибави върху линкера чрез автоматизиран синтез. Алтернативно, полимери като полиетиленгликол с функционални групи могат да се използват като бинкери. Такива полимери се предпочитат пред хомополимерните олигонуклеотди, поради това, че те не се намесват значително при хибридизирането на пробата към олигонуклеотда мишена. Особено предпочитан е полиетиленгликола.

Връзките между твърдата подложка, линкера и пробата, за предпочитане не се разцепват по време на отделянето предпазващите базите групи, при основни условия при висока температура. Примери за предпочитани връзки включват карбаматни и амидни връзки.

Примери за предпочитани видове твърди подложки за имобилизиране на олигонуклеотдна проба включват стъкло с контролирани пори, стъклени блюда, полистирен, полистиренови перли с обвивка от авидин, целулоза, найлон, акриламиден гел и активиран декстран.

За подробно описание на TaqMan ™ изследването, реагентите и условията за използване в настоящото, виж например, Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991)

88:7276-7280; патенти на САЩ № 5,538,848; 5,723,591 и 5,876,930.

Последователностите на Parvovirus В19, описани вм ностоящото, могат да се използват, също така, като основа за транскрипционно медиирана амплификация (ТМА). ТМА предоставя метод за идентифициране на последователности на нуклеинови киселини мишени, присъстващи в много малки количества в биологочина проба. Такива последователности могат да се трудни или невъзможни за идентифициране при © използване на директни методи на изследване. По-специално,

ТМА е изотермично, автокаталитична система за амплифициране на нуклеинова киселина мишена, което може да предостави повече от милиард РНК копия на последователност мишена. Изследването може да се проведе качествено, за да се открие правилно присъствието или отсъствието на последователност мишена в биологична проба. Изследването може, също така, да достави количествени измервания на количеството последователност ф мишена над границата на концентрация от различна степен на сила. ТМА предоставя метод за автокаталитично синтезиране на множество копия на последователност на нуклеинова киселина мишена без повтарящи се манипулации на условията на реакцията, като температура, йонна сила и pH.

Обикновено ТМА включва следните етапи: (а) изолиране на нуклеиновата киселина, включително РНК, от биологична проба, представляваща интерес, за което се предполага, че е инфектирана с Parvovirus В19; и (Ь) комбиниране в реакционна смес (i) изолираната нуклеинова киселина, (ii) първи и втори олигонуклеотдни праймери, като първият праймер има последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна към 3’ терминален участък от РНК последователност мишена, ако присъства (например (+) веригата), за да образува комплекс с нея, и вторият праймер, който притежава образуваща комплекс последователност, достатъчно комплементарна към 3’ терминалния участък на последователността мишена на нейния комплемент (например (+) веригата), за да образува комплекс с нея, при което първият олигонуклеотд включва, освен това, 5’ последователност за последователността, образуваща комплекс, която включва промотор, (iii) обратна транскриптаза или РНК и ДНК зависима полимераза, (iv) ензимна активност, която селективно разгражда РНК веригата на РНК-ДНК комплекса (като РНаза Н) и (ν) РНК полимераза, която разпознава промотора.

Съставните части на реакционната смес могат да се комбинират постепенно или наведнъж. Реакционната смес се инкубира при условия, при които се образува олигонуклеотд/последователност мишена, включващ прикрепване на ДНК праймер и условия за синтезиране на нуклеинова киселина (включително рибонуклеотид трифосфати и дезоксирибонуклеотид трифосфати) за достатъчен период от време за предоставяне на множество копия от последователността мишена. С предимство, реакцията се провежда при условия, които са подходящи за поддържани на стабилността на реакционните съставки, като съставката ензими и без да има необходимост от модифициране или манипулиране на условията на реакцията по време на провеждането на реакцията на амплифициране. в съответствие, реакцията може да се проведе при условия, при които по същество са изотермични и включват по същество констнастна йонна сила и pH. Конвенционално, реакцията не се нуждае от етап на денатуриране, за да се разделиРНК-ДНК комплекса, продуциран чрез първата реакция на удължаване на ДНК-та.

Подходящи ДНК полимерази включват обратни транскриптази, като обратна транскриптаза от вирус на птича миелобластома (AMV) (на разположение от, например, Seikagaku America, Inc.) и обратна транскриптаза на Moloney вируса на миша левкимия (MMLV) (на разположение от, например, Bethesda Research Laboratories).

Промотори или промоторни последователности, подходящи за инкорпориране вв праймери са последователности на нуклеинови киселини (или естествено съществуващи в природата или продукт на рестрикционно смилане), които специфично се разпознават от ЛНК полимераза, която разпознава и свързва тази последователност и инициира процеса на транскрибиране, при който се продуцират РНК транскриптите. По жератние, последователността може да включва нуклеотидни бази извън същинския сайт на разпознаване на РНК полимеразате, които могат да придадат стабилност или чувствителност на процеса на процесите на разпадане или да усилат ефикастността на транскрибиране. Примери за полезни промотори включват тези, които се разпознават от някои бактериофаги, като тези от бактериафаги ТЗ, Т7 или SP6, или промотор от Е. coli. Тези РНК полимерази са лесно достъпни от търговската мрежа, като New England Biolabs и Epicentre.

Някои от обратните транскриптази подходящи за използване при тези методи имат РНаза Н активност, като AMV обратна транскриптаза. Може да се предпочете, въприки това, да се прибави екзогенна РНаза Н, като РНаза Н от Е. coli, даже когато се използва AMV обратната транскриптаза. РНаза Н ледно се доставя от, например, Bethesda Research Laboratories.

РНК транскриптите, продуцирани по тези методи могат да послужат за матрици за продуциране на допълнителни копия на последователност мишена посредством гореописаните механизми. Системата е автокаталитична и амплифицирането става антокаталитично, лез необходимост от повторно модифицирани и променящи се условия на реакцията, като температируа, pH, йонна сила и други подобни.

Откриването може да се направи при използване на многообразни методи, включително директно секвениране.хибридизиране със специфични за последователността олигомери, гел електрофореза и масс спектрометрия. Тези методи могат да използват хетерогенни или хомогенни формати, изотопни или неизотопни маркери, така както и без маркери въобще.

Един предпочитан метод на аткриване е използването на специфични за последователността олигонуклеотидни проби, произлезли от 4,7 kbp, 700 bp и 214 bp фрагменти, описани погоре. Пробите могат да се използват при изследвания за предпазване на хибридизация (НРА). При този вариант за изпълнение, пробите се маркират конвенционално с акридинов естер (АЕ), високолуминесцентна молекула. Виж например, Nelson et al., (1995) “ Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence” in Nonisotope Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L.J.(ed.) Acedemic Press, San Diego, CA; Nelson et al., (1994) “Application of the Hybridisation Protection Assays (HPA) to PCR in the Polymerase Chain Reaction, Muulis et al., (eds.) Birkhauser, Boston, MA; Weeks et al., Clin. Chem. (1983) 29:1474-1479; Berry et al., Clin. Chem. (1988) 34:20872090. Една AE молекула се прикрепя директно към пробата, като се използва химия на ненуклеотид-основаващо се средство, което позволява поставянето на маркер на което и да е място в пробата. Виж, например, патенти на САЩ № 5,585,481 и 5,185,439. Хемилуминесценцията се задейства чрез реагиране с алкален хидроген пероксид, който дава един възбуден N-метил акридон, който след това силно спада до нормално състояние с излъчване на фотон. Допълнително, АЕ причинява естерна хидролиза, което води до нехемилуминесцентна-метил акридинова карбоксилна киселина.

Когато АЕ молекулата е ковалентно прикрепена към проба нуклеинова киселина, хидролизата е бърза, при умерено алкални условия. Когато АЕ-белязана проба е изцяло комплементарна на нуклеиновата киселина мишена, скоростта на хидролизата е силно понижена. Следователно, хибридизирана и нехибридизирана АЕ-белязана проба може да се открие директно в разтвор, без необходимост от физично разделяне.

НРА обикновено се състои от следните етапи: (а) АЕбелязаната проба се хибридизира с нуклеиновата киселина мишена в разтвор за приблизително 15 до 30 минути. След това се добавя умерено алкален разтвор и АЕ прикрепен към хибридизираната проба се хидролизира. Реакцията се провежда за приблизително 5 до 10 минути. Останалото хибрид-асоцииран АЕ се открива, като измерване на количеството на присъстващата мишена. Този етоп отнема приблизително 2 до 5 секунди. За предпочитане, етапът на диференциална хидролиза се провежда при същата температура, както и етапа на хидролизиране, характерно, от 50 до 70°С. Алтернативно, може да се проведе втори етап на © диференциална хидролиза при стайна температура. Това позволява дасе използват високи pH стойности, например, в граници от 10 до 11, което води до по-големи разлики в скороста на хидролиза между хибридизирана и нехибридизирана АЕ-маркирана проба. НРА се описва подробно в, например, патенти на САЩ № 6,004,745; 5,948,899 и 5,283,174.

ТМА се описва подробно в, например, патент на САЩ № 5,399,491. При един пример за характерно изследване, проба 0 на нуклеинова киселина, за която се предполага, че съдържа последователност мишена на Parvovirus В19, се смесва с буфериран концентрат, съдържащ буфер, соли, магнезий, нуклеотид трифосфати, праймери, дитиотреитол, и спермидин. По желание, реакцията се инкубира при приблизително 100°С за приблизително две минути, за да се денатурира каквато и да е вторична структура. След охлаждане до стайна температура, се прибавят обратна транскриптаза, РНК полимераза, и РН-аза Н и сместта се инкубира за два до четири часа при 37°С. След това реакцията може за де се изследва чрез денатуриране на продукта, прибавяне на разтвор на проба, инкубиране 20 минути при 60°С, прибавяне на разтвор за селективно хидролизиране на нехибридизиралата проба, инкубиране на реакцията шест минути про 60°С, и измерване на останалата хемилуминесценция в луминометър.

Олигонуклеотидните молекули на настоящото изобретение могат, също така, да се използват при осоноваващо се на последователности на нуклеинови киселини амплифициране (NASBA). Този метод е насочен към © промотора ензимен процес, който включва in vitro непрекъснато, хомогенно и изотермално амплифициране на специфична нуклеинова киселина, за да се осигурят РНК копия на нуклеиновата киселина. Реагентите за провеждане на NASBA включват пълви ДНК праймер с 5’ опашка, съдържаща промотор, втори ДНК праймер, обратна транскриптаза, РН-аза Η, Т7 РНК полимераза, NTP’s и dNTP’s. като се използва NASBA, големи количества едноверижна РНК се генерират или от едноверижната РНК или ДНК, или от q двуверижната ДНК. Когато РНК трябва да се амплифицира, ssPHK служи като матрица за синтезата на първа ДНК верига чрез удължаване на парви праймер, съдържащ сайт за разпознаване на РНК полимераза. Тази ДНК верига, на свой ред, служи като матрица за синтезата на дтора, комплементарна ДНК верига чрез удължаване на втори праймер, което дава двуверижен активен сайт за промотор на РНК-полимераза, а втората ДНК верига служи като матрица за синтез на големи количества от първата матрица, ssPHK-та, с помоща на РНК полимераза. NASBA техниката е известна от предшестващото състояние на техниката и се описва в, например, Европейски Патент 329,822, заявка на Международен патент № WO91/02814, и патенти на САЩ 6,063,603 и 5,409,818.

Последователностите на Parvovirus В19, описани в настоящото са полезни, също така, за техники на хибридизиране на нуклеиноваи киселини и амплифициране., които използват разклонени ДНК молекули. При основното изследване на хибридизирането на нуклеинови киселини се открива едноверижна анализирана нуклеинова киселина, хибридизирана към маркирана едноверижна проба на нуклеинова киселина и водеща до дуплекси.варианти на тази основна схема са разработени, за да се улесни разделянето на дуплекси, за да се открият от външен материал и/или за да се амплифицира сигнал, който се открива. Един метод за амплифициране на сигнала използва амплипифицирани мултимери, които са полинуклеотиди с първи сегмент, който хибридизира към арализирана нуклеинова киселина или верига на нуклеинова киселина, свързана към анализираната и повтаряна на втория сегмент, които хибридизират специфично към маркираната проба. Амплифицирането теоретично е пропорционално на броя на повторения на втория сегмент. Мултимерите могат да са или линейни или разклонени. Използват се два общи вида разклонени мултимери при тези техники: вилообразни (разцепени) и гребеновидни. Методи за получаване и използване на разклонени молекули на нуклеинови киселини са известни от предшествмащото състояние на техниката и са описани в, например, патент на САЩ № 5,849,481.

При един друг аспект на настоящото изобретение, два или повече от описаните по-горе тестове се провеждат, за да се потвърди присъствието на организъм. Например, ако първият тест използва медиираното от транскрипцията амплифициране (ТМА) за да се амплифицират нуклеиновите киселини за откриване, тогава алтернативно се провежда изследване за тестване на нуклеинови киселини (NAT), например, при използване на PCR амплифициране, RT PCR и други подобни, както е описано в настоящото. Следователно, Parvovirus В19 може специфично и селективно да се открие, даже когато пробата съдържа други организми, като H)V, и вируса на хепатит В, например.

Както е видно, проектирането на изследвания, описани в настоящото, е обект на големи вариации, и много формати, известни от предшестващото състояние на техниката. Горните описания са представени просто за опътване и специалистът в областа лесно може да модифицира описаните протоколи, при използване на техники, добре известни от предшестващото състояние на техниката.

Горе-описаните реагенти на изследванията, включително праймери, проби, твърди носители с прикрепени проби, така както и други реагенти за откриване, могат да се доставят на комплекти (китове), с подходящи инструкции и други необходими реагенти, с цел да се проведат изследванията, описани по-горе. Комплекта съдържа, обикновено, в различни контейнери, комбинацията от праймери и проби (или вече свързани към твърд носител или разделени, с реагенти за свързването им към матрикса), контролни лекарствени форми (позитивна и/или негативна контрола), маркирани реагенти, когато формата на изследването изисква това и реагенти генериращи сигнали (например, ензимен субстрат) ако маркерът не генерира директно сигнал. Инструкции (например, написани, записани, VCR, CD-ROM, и други) за провеждане на изследването се включват обикновено в комплекта. Комплектът може да съдържа, също така, в зависимост от определеното използвано изследване, други пакетирани реагенти и материали (т.е., промивни буфери и други подобни). Стандартни изследвания, като описаните по-горе, могат да се проведат при използване на тези комплекти.

Ill ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА ЧАСТ

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Следват примери на специфични варианти за изпълнение на изобретението. Примерите се предлагат с

илюстративна цел	единствено,	и	не	се	считат	за
ограничаващи обхвата на	настоящото	изобретение,	по
какъвто и да е начин.
Направени са	осилия	да	се	осигури	точност	по

отношение на използавите числа (например, количества, температури и др.), но се допуска да са направени някои експериментални грешки и отклонения.

При следващите примери, ензимите се доставят от търговската мрежа, и се използват съгласно опътването на производителя. Нитроцелулозни филтри и други такива също се доставят от търговската мрежа.

При изолирането на ДНК фрагменти, с изключение на това когато е отбелязано, всички манипулации с ДНК се провеждат съгласно старндартни процедури. Виж, Sambrook et al., по-горе. Рестрикционни ензими, Т₄ ДНКлигаза, Е. coli, ДНК полимераза I, фрагмент на Klenow и други биологични реагенти могат да се доставят от пазарни доставчици и да се използват според препоръките на производителя. Двуверижни ДНК фрагменти се разделят върхе агарозни гелове.

ПРИМЕР 1

Екстрахиране на нуклеинова киселина на Parvovirus В19 за PCR

Проби от човешки серум, които са дали положителни проби за човешки Parvovirus В19 или чрез IgM или PCR тестове се получават от търговската мрежа и се използват за изолиране на ДНК за последващи PCR експерименти. Пробите се съхраняват при -80°С до използването им.

ДНК се екстрахи от 0,2 mL серум, при използване на QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Valencia, СА) според указанията на производителя, при следните съображения. Носител на ДНК се добавякъм лизисния буфер за да се засили свързването на нуклеиновата киселина и добива. Поспециално, прибавя се едно количество от 5,6 pg на проба полиаденилова киселина 5’ (Sigma, St. Louis, МО) или поли-dA (Roche, Indianapolis, IN). Допълнително, ДНК на Parvovirus В19 се елюира с 200 pL буфаран АЕ (Qiagen), вместо с вода.

ПРИМЕР 2

Откриване чрез PCR на положителни проби на нуклеинова киселина на Parvovirus В19

Използват се две различини PCR процедури за амплифициране на фрагменти на Parvovirus В19. един метод, описан подробно по-долу, се използва за амплифициране на фрагменти от приблизително 700 bp, 370Ьр и 214 Ьр (виж фигура 1). За амплифициране на фрагменти от приблизително

4,7 kb се използва High Fidelity Expand PCR (Roche). Фрагментътт от приблизително 700 Ьр съответства на нуклеотидини позиции 2936-3635 на генома на Parvovirus В19, описан в Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. Приблизително 370 bp се среща в 700 Ьр фрагмента при нуклеотидни позиции 3073-3442. Приблизително 4,7 kb фрагментът е 4677 нуклеотиден фрагмент, съответстващ на нуклеотидни позиции 217-4893 от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. C цел да се амплифицира фрагментите на Parvovirus В19 от приблизително 700 Ьр, 370 Ьр и 214 Ьр, се използва праймерът, показан на таблица 1.

ТАБЛИЦА 1

Област на праймера	Последователност	PCR продукт	Гено мен
VP-5	AGGAAGTTTGCCGGAAGTTC (SEQ ID NO: 36)	370 bp	VP1
VP-3	GTGCTGAAACTCTAAAGGTG (SEQ ID NO: 37)	370 bp	VP1
VP-5 VP1/VP2	GACATGGATATGAAAAGCCTGAAG (SEQ ID NO: 38)	214 bp
VP2-3 VP1/VP2	GTTGTTCATATCTGGTTAAGTACT (SEQ ID NO: 39)	214 bp
K-1sp VP1/VP2	ATAAATCCATATACTCATT (SEQ ID NO: 40)	700 bp
K-2sp VP1/VP2	CTAAAGTATCCTGACCTTG (SEQ ID NO: 41)	700 bp

За този експеримент, PCR се провежда в краен обем от

100 μΙ_, при използване на 2 μΙ_ пречистена ДНК от Parvovirus

В19 (пречистена, както е описано по-горе), 0,2 тМ от всеки дезокси нуклеотид трифосфат и 1,25 единици Pfu ДНК полимераза (Stratagene, La Jolla, СА), профилът на амплифициране включва денатуриране при 94°С за 2 минути, хибридизиране на праймера при 37°С ца 3 минути, и удължаване при 72°С за 3 минути в продължение на 35 цикъла. 3-минутно предварително инкубиране при 94°С, за да ® се осигури началното денатуриране и крайно 7-минутно инкубиране на 72°С, за да осигури пълното удължаване на фрагментите, предхождат и следват, съответно, 35-те PCR цикъла. PCR продуктите се подлагат на електрофореза върху 7% полиакриламидни телове, оцветяват се с етидиев бромид и се визуализират под UV източник. Пречистване на амплифицираните фрагменти се провежда при използване на QiaQuick PCR комплект за пречистване (QIAGEN).

Серия PCR за ампрлифициране на 370 bp В19 фрагмент С се провежда, когато 700 Ьр ивицата не се визуализира върху полиакриламидните гелове. 700 Ьр ДНК материалът се използва за серията PCR, при използване на праймери, показани на таблица 1.

High Fidelity Expand PCR (Roche) се използва за амплифициране на Parvovirus В19 фрагмент от 4,7 kb, както следва. High Fidelity Expand PCR (Roche) и праймери Hicks-5 (5’ CCCGCCTTATGCAAATGGGCAG 3’) (SEQ ID NO: 42) и Hicks-3 (5’ TTGTGTTAGGCTGTCTTATAGG 3’) (SEQ ID NO: 43) се използват според препоръките на производителя.

Условията на амплифициране са 94°С за 1 минута, 50°С за 2 минути, и 68°С за 4 минути за 35 или 45 цикъла. Прединкубиране при 94°С за 2 минути и след-инкубиране при 75°С за 7 минути също се включват. PCR продуктите се разделят върху 1 % агарозни гелове и се пречистват при използване на PCR Purification kit (Promega, Madison, Wl).

ПРИМЕР 3

Клониране на ДНК фрагменти на Parvovirus В19

О PCR фрагментите се клонират в ТОРО-ТА вектори (Invitrogen, Carlsbad, СА). Клонирането в тези вектори е силно улеснено, когато амплифицираната ДНК съдържа единичен дезоксиаденозин (А) при нейния 3’ край. В съответствие, се използва каталитична реакция за прибавяне на 3’ (А) главичка. Реакционната смес съдържа 1,25 mM dATP, 0,5 единици Taq полимераза (Perkin Elmer, Boston, МА) и се извършва при 72°С за 15 минути.

PCR фрагменти се клонират в pCR2.1-TOPO вектор, при 0 използване на Invitrogen ТА cloning kit (ТОРО™ Cloning® Kit with One Shot ТОРЮ Electrocomponent Cells) следвайки инструкциите на производителя. Бактериалните клетки се инкубират при 37°С върху Luria Broth блюда, съдържащи ампицилин при 100 pg/ml, 0,66 тМ IPTG и 0,033% X-Gal. Голям брой бели колонии се инокулират в 4 mL Luria Broth ампицилин (100 pg/ml) и се инкубират през цялата нощ при 37°С с разклащане. Три милилитра от нощните култури се използват за приготвяне на плазмидна ДНК чрез използване на QIAprep Miniprep kit (QIAGEN). Рекомбинантните клонове се идентифицират чрез анализ с рестрикционни ензими с EcoRI |New England and Biolabs) и 7% полиакриламидна или 1 % агарозна гел електрофореза, както е описано по-горе.

С цел да се определят ДНК последователностите на клоновете, големи количества плазмиди от рекомбинантните клонове се приготвят, както по-горе, и ДНК се суспендира в ТЕ (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 тМ EDTA) при 0,2 mg/ml. Определянето на нуклеотидата последователност на фрагментите на Parvovirus В19 се провежда при използване на Applied Biosystems Model 373 ( или модел 377) ДНК секвенаторна система.

Фигери 2А до 2U (SEQ ID NOS: 1-21) изобразяват ДНК последователности от 21 изолата на Parvovirus В19, пречистени, амплифицирани и секвенирани, както е описано по-горе, което отговаря на нуклеотидни позиции 2936-3635 на генома на Parvovirus В19, описан от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936 (700 bp фрагментът от фигура 1 и описан по-горе). Фигура 2А (SEQ ID NO: 1) е последователността от изолат СН47-26; фигура 2В (SEQ ID NO: 2) е последователността от изолат СН48-29; Фигура 2С (SEQ ID NO: 3) е последователността от изолат СНЗЗ-2; Фигура 2D (SEQ ID NO: 4) е последователността от изолат CH33-263; Фигура 2Е (SEQ ID NO: 5) е последователността от изолат СНЗЗ-4; Фигура 2F (SEQ ID NO: 6) е последователността от изолат СН42-7; Фигура 2G (SEQ ID NO: 7) е последователността от изолат СН42-18; Фигура 2Н (SEQ ID NO: 8) е последователността от изолат СН42-2619; Фигура 2I (SEQ ID NO: 9) е последователността от изолат СН46-23; Фигура 2J (SEQ ID NO: 10) е последователността от изолат СН1-1; Фигура 2К (SEQ ID NO: 11) е последователността от изолат CH1-6; Фигура 2L (SEQ ID NO: 12) е последователността от изолат CH2-8; Фигура 2М (SEQ ID NO: 13) е последователността от изолат СН2-10; Фигура 2N (SEQ ID NO: 14) е последователността от изолат СН2-11; Фигура 20 (SEQ ID N0: 15) е последователността от изолат СН5-13; Фигура 2Р (SEQ ID N0: 16) е последователността от изолат СН7-22; Фигура 2Q (SEQ ID N0: 17) е последователността от изолат СН13-27; Фигура 2R (SEQ ID N0: 18) е последователността от изолат СН14-18; Фигура 2S (SEQ ID N0: 19) е последователността от изолат СН62-2; Фигура 2Т (SEQ ID N0: 20) е последователността от изолат СН64-2; Фигура 2U (SEQ ID N0: 21) е последователността от изолат СН67-2.

Фигури 11А до 11Z (SEQ ID N0: 62-87) изобразяват ДНК последователности от допълнителни 26 изолата на Parvovirus В191 пречистени, амплифицирани и секвенирани, както е описано по-горе, което отговаря на нуклеотидни позиции 29363635 на генома на Parvovirus В19, описан в Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936 (700 bp фрагмента от фигура 1 и аписон по-горе). Фигура 11А (SEQ ID N0: 62) е последователността от изолат СН80-1; фигура 11В (SEQ ID N0: 63) е последователността от изолат СН81-3; фигура 11С (SEQ ID N0: 64) е последователността от изолат B19SCL1-4; фигура 11D (SEQ ID N0: 65) е последователността от изолат B19SCL2-1; фигура 11Е (SEQ ID N0: 66) е последователността от изолат B19SCL3-1; фигура 11F (SEQ ID N0: 67) е последователността от изолат B19SCL4-3; фигура 11G (SEQ ID N0: 68) е последователността от изолат B19SCL5-2; фигура 11Н (SEQ ID N0: 69) е последователността от изолат B19SCL6-2; фигура 111 (SEQ ID N0: 70) е последователността от изолат B19SCL7-3; фигура 11J (SEQ ID N0: 71) е последователността от изолат B19SCL8-2; фигура 11К (SEQ ID N0: 72) е последователността от изолат B19SCL9-1; фигура 11L (SEQ ID N0: 73) е последователността от изолат B19SCL9-9; фигура 11М (SEQ ID N0: 74) е последователността от изолат B19SCL10-2; фигура 11N (SEQ ID N0: 75) е последователността от изолат B19SCL11-1; фигура 110 (SEQ ID N0: 76) е последователността от изолат B19SCL12-1; фигура 11Р (SEQ ID N0: 77) е последователността от изолат B19SCL13-3; фигура 11Q (SEQ ID N0: 78) е последователността от изолат B19SCL14-1; фигура 11R (SEQ ID N0: 79) е последователността от изолат B19SCL15-3; фигура 11S (SEQ ID N0: 80) е последователността от изолат B19SCL16-2; фигура 11Т (SEQ ID N0: 81) е последователността от изолат B19SCL17-1; фигура 11U (SEQ ID N0: 82) е последователността от изолат B19SCL18-1; фигура 11V (SEQ ID N0: 83) е последователността от изолат B19SCL19-1; фигура 11W (SEQ ID N0: 84) е последователността от изолат B19SCL20-3; фигура 11Х (SEQ ID N0: 85) е последователността от изолат B19SCL21-3; фигура 11Y (SEQ ID N0: 86) е последователността от изолат B19SCL22-11; фигура 11Z (SEQ ID N0: 87) е последователността от изолат B19SCL2-14.

Сравняването на последователностите показва приблизително 98% до 99,5% хомоложност на последователностите от тази 700 Ьр последователност между различните изолати.

Фигури ЗА-ЗС (SEQ ID NO: 22) показват последователността на приблизително 4,7 kbp PCR фрагмент, показан на фигура 1 и описан по-горе, от Parvovirus В19 клон 2В1. Изобразената последователност на фигурите е 4677 нуклеотиден фрагмент, сйответстващ на нуклеотидни позиции 217-4893 по Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. Изобразената последователност съдържа пълната дължина на отворената рамка на разчитане на Parvovirus В19, която кодира NS1, VP1 и VP2, плюс допълнителни 5’ и 3’ нетранслирани последователности. Секвенираният фрагмент съдържа един допълнителен нуклеотид в 5’ некодиращата област между нуклеотидни позиции 367 и 368 на последователноста на Parvovirus В19, посочена от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. фигури 4A-4C (SEQ ID NO: 23) показва последователността на приблизително 4,7 kbp PCR фрагмент, показана на фигура 1 на Parvovirus В19 клон 2-В6. последователността е 4677 нуклеотиден фрагмент, съответстващ на нуклеотидни позиции 217-4893 по Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. изобразената последователност съдържа пълната дължина на отворената рамка на разчитане на Parvovirus В19, която кодира NS1, VP1 и VP2, плъс допълнително 5’ и 3’ нетранслирани последователности. Този секвениран фрагмент съдържа допълнителен нуклеотид в 5’ некодиращата област между нуклеотидни позиции 367 и 368 на последователността на Parvovirus В19 докладвана от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936.

ПРИМЕР 4

Клониране и експресиране на Parvovirus В19, VP1 и VP2 рекомбинантни протеини

Фрагменти, кодиращи NS1, VP1 и VP2 (виж фигура 1) се амплифицират при използване на 4,7 kb фрагмент на Parvovirus В19, клониран в pCR2.1-TOPO (описан по-горе). Поспециално, PCR праймери (виж по-долу) се проектират зъ PCR на NS1, VP1 и VP2 области на Parvovirus В19. за да се улесни клонирането на тези области в дрождеви експресионни вектори, Xbal, Hindlll и Sall рестрикционни сайтове се въвеждат в праймерите, каквото е изискването.

Използваните праймери за клониране и амплифициране на фрагменти от Parvovirus В19 за дрождева експресия в NS1, VP1 и VP2 рекомбинантни протеини се основават на последоватлностите, получени по-горе и са както следва:

NS1-5 (сенс праймер)

5’ ATACTCTCTAGACAAAACAAAATGGAGCTATTTAGAGGGG TGCTTCAAGTTTCT 3’ (SEQ ID NO :44)

NS1-3 (анти-сенс праймер)

5’GAGTATGTCGACTTACTCATAATCTACAAAGCTTTGCAAT

CCAGACAG 3’ (SEQ ID NO :45)

VP1-5SN (сенс праймер)

5’ ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGAGTAAAGAAAGTGG CAAATGGTGGGAAAGT 3’ (SEQ ID NO :46)

VP ALL-3 (анти-сенс праймер)

5’ GAGTATGTCGACTTACAATGGGTGCACACGGCTTTT GGCTGTCCACAATTC 3’ (SEQ ID NO :47)

VP2-5SN (сенс праймер)

5’ ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGACTTCAGTTAATT CTGCAGAAGCCAGCACT 3’ (SEQ ID NO :48)

PCR праймери се синтезират, пречистват и се © суспендират в 300 pL dH₂O и се определя тяхната оптическа плътност при 260 nm. Реакционната смес съдържа 0,25 ng чатрица, 100 pmol от всеки праймер, 10 pL 1,25 mM от всеки dNTP и 1 единица Taq полимераза (Perkin Elmer, Boston, МА) в краен обем от 50 pL. Условията на амплифицирането са 94°С за 1 минута, 50°С за 2 минути, и 68°С за 4 минути, в продължение на 35 цикъла. Прибавят се 7-минутно постинкубиране при 75°С, за да се осигури пълното удалжаване на фрагментите. Аликвотни части от 5 pL се използват за © проверка на PCR синтеза чрез електрофореза върху 1% агарозни гелове. Целият PCR продукт след това се подлага на електрофореза и фрагментите, които проявяват очакваните размери се пречистват от теловете при използване на PCRPurification kit (Promega), като се спазват инструкциите на производителя. Приблизително 0,8 pg пречистена PCR ДНК се смилат с подходящи рестрикционни ензими (Roche) за 3 часа при 37°С и продуктите се причистват, след това, чрез използване на Promega PCR Purification kit.

Плазамид .BS24.1 се използва за хетероложна експресия на Parvovirus В19 рекомбинантни проетеини. Дрождевият експресионен вектор съдържа 2 μ последователности и обратни ровтори (IR) за автономно реплиткиране в дрожди, осфактор терминатор за осигуряване завършването на транскрипцията, и дрождев Ieu2-d и URA3 за селекция. Со1Е1 началото на репликация и β-лакгамазния ген също присъстват за размножаване и селекциониране на Е. coli (Pichuantes et al., (1996) “Expression of Heterologous Gene Products in Yeast” In: © Protein Engineering: A Guide to Design and Production, Chapter

5. J.L. Ckeand and C. Craik, eds., Wiley-Liss, Inc. , New York, N.Y. pp. 129-161. Плазмид pBS24.1 се смила c BamHI/Sacll и се дефосфорилира c 1- единици телешка чревна алкална фосфатаза (Boeringer Manheim, Indianapolis, IN) при условия, препоръчани от производителя. Смляните и пречистени фрагменти се смесват с BamHI/Sacll смлян pBS24.1 и ДНК фрагмент, съдържащ дрождев хибриден промотор ADH2/GAPDH (Cousens et al., (1987) 61:265-275) смляни или с ф BamHI/Sful или с BamHI/Hindlll, според рестрикционните сайтове в PCR фрагментите, които трябва да се клонират. Сместта за лигиране се използва, след това, за трансформиране на Е. coli НВ101 компетентни клетки и трланнсформантите се селекционират в Luria-Broth блюда, съдържащи ампицилин 100 pg/ml, след инкубиране през цялата нощ при 37°С. Няколко колонии от всяко трансформиране са взимат и се инкубират в 3 mL Luria-Broth ампицилин при 100 цд/т1 и се инкубират при 37°С, при разклащане през цялата нощ.

Плазмидна ДНК се приготвя при използване на 1,5 mL култури и QIAprep Miniprep kit (QUIAGEN). Рекомбинантни клонове се идентифицират чрез аналитичен рестрикционен ензимен анализ с BamHI-Sall. Препарати в голям мащаб на рекомбинатни плазмиди се приготвят за получаване на секвениране, за да се потвърди нуклеотидната последователност на клонираните Parvovirus В19 фрагменти.

Дрождеви експресионни плазмиди проявяващи очаквана последователност за NS1, VP1 и VP2 се използват за трансформиране на дрожди, както следва. Компетентни Saccharomyces cerevisiae AD3 клетки [Mat a, trpl+, ura3-52, prbl1122, pep4-3, prcl-407, [cir°],::pDM15(pGAP/ADR1::G148^R)], leu2(AAD)J се трансформират c плазмидна ДНК-и, кодиращи NS1, VP1 и VP2, клонирани както е описано по-горе, селекционирането на рекомбинантните дрожди се извършва на два тура на блюда с недостиг на урацил, с последващ тур на блюда с недостиг на лавцин, след инкубиране на при 30°С за 48-72 часй. След това, културите се развиват в среда с недостиг на левцин, а после с добавка на YEP с 2% глюкоза (Pichuantes et al., Proteins: Struct. Funct. Genet. (1989) 6:324337) в продължение на 48 часа преди да се провери експресията на рекомбинантни протеини.

Секвенирането на различни протеини от два различни изолата са показани на фигури 5-10. По-специално, фигури 5А (SEQ ID N0:24) и 5В (SEQ ID N0:25) показват последователностите на NS1 нуклеотид и протеин, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В1. Фигури 6А (SEQ ID N0:26) и 6В (SEQ ID N0:27) показват VP1 нуклеотидна и протеинова последователност, съответно, от Parvovirus В19

Λ.

клон 2-Β1. Фигури 7А (SEQ ID N0:28) и 7B (SEQ ID N0:29) показват VP2 нуклеотидна и протеинова последователност, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В1. NS1 нуклеотидна и протеинова последователност, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В6. Фигури 9А (SEQ ID N0:32) и 9В (SEQ ID N0:33) показват VP1 нуклеотидна и протеинова последователност, съответно, от Parvovirus В19 клон 2-В6. Фигури 10А (SEQ ID N0:34) и 10В (SEQ ID N0:35) показват VP2 нуклеотидна и протеинова последователност, съответно, от Parvovirus В19 © клон 2-В6.

ПРИМЕР 5

Откриване и количествено определяне на Parvovirus В19 ДНК чрез TaqMan™

Чувствителен диагностичен метод за откриване на

Parvovirus В19 инфекция се проектира както следва. Поспециално се използва TaqMan™ PCR технология за откриване и количествено определяне на ДНК на Parvovirus U В19.количествения PCR изисква ефикасно екстрехиране на нуклеинова киселина. Използваното количество на плазма/серум за екстрахиране на ДНК също влияе върху чувствителноста на откриване. Използват се два подхода за изолиране на нуклеинова киселина от 0,5 ml плазма/серум. поспециално, ДНК се екстрахира чрез (а) свързване към силициев двуоксид; и (Ь) хибридизиране към олигонуклеотиди специфични за мишени.

(а) Изолиране на нуклеинова киселина чрез свързване към силициев двуоксид

В присъствие на високи концентрации на хаотропни соли, като гуанидин изоцианат, нуклеинови киселини свързани към силициев двуоксид. Нуклеиновикиселини с малки размери се свързват по-ефикасно към силициев двуоксид при условия на кисело pH. Свързаните нуклеинови киселини ефикасно се елюират в слаба сол, алкален pH буфер при висока температура. Заместването на магнезиниран силициев двуоксид с редовен силициев двуоксид силно улеснява етапите на промиване и елюиране на изолирана нуклеинова киселина. Магнитизирана основа се използва за залавяне на частиците нуклеинови киселини свързани към силициев двуоксид, като по този начин се елиминира центрофугирането, което се изисква за утаяване на частици на редовен силициев двуоксид.

Използваният лизисен буфер е от Organon-Teknika (Durham, NC). Този лизисен буфер съдържа гуанидин изотиоцианат за постигане на разтвримост на протеините и за инактивиране на РН-ази и ДН-ази. Детергентът Triton Х-100 допълнително улеснява процеса на разтваряне и дезинтегриране на клетъчната структура и ядрени протеини, като така се отделя нуклеиновата киселина. Лизисният реагент се подкислява, за да се заели свързването на нуклеиновата киселина, и 50 μΙ алкален буфер за елюиране се използват за елюиране на свързаната нуклеинова киселина. След изолирането на нуклеиновата киселина, присъствието на ДНК от Parvovirus В19 се определя чрез провеждане на TaqMan™ PCR, както е описано по-долу.

(Ь) изолиране на нуклеинова киселина чрез хибридизиране към специфични към мишената олигонуклеотиди

Въпреки че използването на магнитизиран силициев двуоксид много улеснява бързото и лесно боравене по време на етапите на промиване и елюиране, изолирането на нуклеинова киселина е все още е трудоемко и изисква време. Затова се използва едноетапното залавяне на специфична нуклеинова киселина мишенва от плазмата или серума, при използване на магнитни перли. За да се направи това приложимо за голямо разнообразие от тестове за залавяне на нуклеинова киселина се използват генерични магнитни перли, прикрепени към обиго dT. Sera-Mag магнитни олиго (dT) перли (Seradyn, Indianapolis, IN) с олиго dT с 14-мерна дължина се използват в комбинация с Capture олигонуклеотиди, съдържащи 20 поли A’s при 3’ края граничещ с използваната специфична Parvovirus последователност (проектирана на края на описаната по-долу последователност).

Използваните антисенс олигонуклеотиди за залавяне произлизат от 700 Ьр фрагмент и са както следва:

VSPC1-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCTTAACAGCAATTT CTGATA (nt 3492-3514) (*) (SEQ ID NO :49)

VSPC2-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCCCTGTAGTGCTGT

CAG (nt 3549-3568) (SEQ ID NO :50)

VSPC3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATACCCAAATAGGAA GTTCTG (nt 3639-3660) (SEQIDNO :51)

VSPC4-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAATGCTGATTCTTCA CTTGC (nt 3737-3759) (SEQ ID NO :52)

VSPC5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCTGTACCTCCTG ф TACCTA (nt 3789-3800) (SEQ ID NO :53)

VSPC6-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCCTCTAAATTTT CTGGG (nt 3838-3857) (SEQ ID NO :54)

VSPC7-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCCTAATGTGTCA GGAACC (nt 3910-3929) ф (SEQ ID NO :55) (*) Нуклеотидните номера са съгласно Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936

Магнитните перли се суспендират в Novagen лизисен буфер (Madison, WI) и серия от седем олигонуклеотида за залавяне (VSPC1- VSPC7, описан по-горе) се тества индивидуално или в комбинация, за заловена ДНК на Parvovirus В19 от панел, получен от FDA Center for Biologic and Research, U.S. Department of Health and Human Services (FDACBER).

(с) Промиване на перлите с промивен буфер

Сед залавянето, перлите се промиват с буфер, съдържащ 10 mM Hepes, буфериран до pH 7,5 в 0,3 М NaCl., и 0,5% NP-40. след обработване на серума с лизисен буфер, хибридизиране, магнитна абсорбция на перлите, и отстраняване на лизисния буфер, 1,5 ml от промивния буфер се добавят към перлите. След рутинното вортексиране, магнитната абсорбция, и отстраняването на промивния буфер, перлите се промиват дтори път в 0,5 ml от същия буфер, така че магнитнтие перли да могат да се приведат в компактната маса, за по-лесно суспендиране в 100 ml Universal PCR буфер, съдържащ всичики реагенти за TaqMan изселдване. Перлите със заловената ДНК се прехвърлят в TaqMan™ блюда за откриване чрез TaqMan™ PCR, както е описано по-длу. Няколко комбинации на олигонуклеотиди са ефикасни при залавянето на В19, както се открива чрез TaqMan™ изследване.

По-специално, TaqMan™ технологията амплифицира заловената нуклеинова киселина мишена, като ДНК ампликони. Едена алтернатива е мплифицирането на заловената мишена като РНК. За тази цел, заловените олигонуклеотиди се състоят от Parvovirus В19-специфичен праймер с Т7 промоторна последователност, с цел да се генерира РНК ампликони, при използване на Т7 РНК полимераза. Три амплификационни праймера (VSA1-A3, описани по-долу, произлезли от 700 Ьр последователност, съответстваща на нуклеотиди 2936-3635 на Parvovirus В19 генома, описан от Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936 се тастват за тяхната способност за амплифициране. Праймерите са както следва: сенс верига на амплификационни праймери VSA1-AATTCTAATATGACTCACTATAGGGAGAAGGCCATATAC TCATTGGACTGT (nt 2942-2961) (SEQ ID NO :56)

VSA2-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAGAGC ф ACCATTATAA (nt 3272-3288) (SEQ ID NO :57)

VSA3-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCACAATG CCAGTGGAAA (nt 3317-3333) (SEQ ID NO :58)

Реагенти от кит за амплифициране на РНК (Qiagen) се използват за проучване на ефикастността на амплифицирането, при използване на 50 копия на ДНК от Parvovirus като мишени в един краен обем от 20 ml. Амплификационните праймери се тестват по отделно или в комбинация при използване на VSP2 като втори праймер. След инкубиране за един час при 42°С, както се препоръчва от производителя, една аликвотна част от амплифицирания материал се разтваря 100-кратно, за изследване чрез TaqMan™ изследване, за да се установи ефикастноста на амплификационните праймери. Комбинация от два амплификационни праймера, VSA2 и VSA3 с VSA2 е силно ефикасна при генериране на РНК ампликони.

Чувствителноста на TaqMan™ изследването, стабилноста на PCR праймерите и оптималните условия на реакцията се установяват при използване на плазмидна ДНК съдържаща

4,7 kb фрагмента, описан по-горе, този фрагмент включва VP1 областа, както и NS1 и VP2 областите (виж фигура 1). Използват се PCR амплификационни праймери, произлизащи © от VP1 областа, както са дадени подробно по-долу.

Номерирането е относително по Shade et al., J. Virol. (1986) 58:921-936. X представлява 5’-флуоресцеин фосфорамидит, a Z представлява DABCYL-dT, и двете получени от Glen Research Corporation, Srerling, VA. Номерата, посочени от дясната страна на последователността се отнасят до нуклеотидите в праймерите от последователността на Parvovirus В19.

ф VSP1-GGAGGCAAAGGTTTGCA (сенс праймер-nt 3334-3350) (SEQ ID NO :60)

VSP2-GTGCTGAAACTCTAAAGGT (анти-сенс праймер-(п! 3424-3442) (SEQ ID NO :59)

VSPPR1-XCCCATGAAGATATTTAGATTZ (проба nt 3379-3398) (SEQ ID NO :61)

Vpra 8: TCCATATGACCCAGAGCACCA (nt 3262-3460) (SEQ ID NO :88)

Vpra 9: TTTCCACTGGCATTGTGGC (анти-сенс праймер-nt 3313-3331) (SEQ ID NO :89)

Vpra 10: X AGCTAGACCTGCATGTCACTG Z, където X e Fam, a Z e Tamra. (nt 3286-3310) (SEQ ID NO :90)

Концентрацията на плазмидна ДНК се изчислява на спектрофотометрично и се провежда серийно разреждане, за © да се получат 5,000-10 копия/20 μΙ. Реакционната смес в краен обем от 50 μΙ съдържа 20 μΙ проба, 1 X Gold Taq амплификационен буфер (Perjin Elmer) с 3,2 mM MgCI₂, 300 μΜ от всеки от dNTPs, 1 pmol от всеки от амплификационните праймери, 0,4 pmol от пробата, и 1 еденица AmpliTaq ензим. Реакционните условия включват 10 минути при 95°С за активиране на ензима, следвано от 45 цикъла по 30 секунди при 95°С, като се редуват с 60°С в ABI 7700 Sequence Detector.

© Чрез използавен на праймерната двойка VSP1 и VSP2, който генерира 109 bp PCR продукт и проба VSPR1, се откриват най-малко до 10 копия. Тъй като обема на пробата е 20 μΙ в краен обем 50 μΙ, това подсказва, че плазмените проби съдържащи най-малко 50 копия/ml от Parvovirus В19 ДНК биха могли да се екстрахират и да се открият чрез TaqMan™ технология. Тъй като Parvovirus е високо титърен вирус, плазма/серум обеми от 50 μΙ биха могли да се екстрахират и да се използват за аналис.

При използване на FDA-CBER Parvovirus В19 ДНК положителна проба (10⁶ копия/ml) TaqMan™ технологията открива поне 50 копия на изследване. В опит да се свържи нуклеиновата киселина и имунотитъра, заредената вирусна ДНК се изследва количествено при няколкопозитивни на антитяло проби.

В съответствие, описват се нови последователности на човешки Parvovirus В19 и изследвания за откриване, които използват тези последователности. От горе-изложеното, става ф ясно, че въпреки че са описани специфични варианти за получаване на изобретението са описани в настоящото с илюстративна цел, различни модификазции могат да се направят без да се излиза от идеята и обхвата му.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Метод за откриване на инфекция от човешки Parvovirus В19 в биологична проба, където (a) се изолира нуклеинова киселина от биологична проба, за която се предполага, че съдържа човешки Parvovirus В19, характеризиращ се с това че посочената нуклеинова киселина включна РНК последователност мишена;

(b) изолираната нуклеинова киселина на човешки Parvovirus В19 влиза в реакция с един първи олигонуклеотид, който съдържа един първи . праймер, включващ последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна към 3’-терминалния участък на последователността мишена на РНК за образуване на комплекс с него, като посоченият първи праймер съдържа, освен това, промотор за ДНК зависима РНК полимераза 5’ и е операционно свързан към последователността образуваща комплекс, при което реагирането се провежда при условия осигуряващи образуването на комплекс олигонуклеотид/ последователност мишена и иницииране на синтеза на ДНК;

(c) удължава се първият праймер при една реакцияна удължаване чрез използване на РНК последователността мишена, като матрица, до получаване на продукт на удължаването на първиия ДНК праймер, комплементарен на РНК последователността мишена;

(d) разделя се продукта от удължаването на пръвия ДНК праймер от РНК последователността мишена при използване на ензим, който избирателно разгражда РНК последователността мишена;

(e) третира се продукта от удължаването на ДНК праймера с втори олигонуклеотид, съдържащ втори праймер, включващ последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна на 3’-терминалния участък на продукта на удължаването на ДНК праймера, за образуване на комплекс с него при условия осигуряващи образуването на комплекс олигонуклеотид/последователност мишена и иницииране на синтеза на ДНК;

(f) удължава се 3’-терминуса на втория праймер в реакция за удължаване на ДНК до получаване на продукта на удължаването на втория ДНК праймер, като се получава матрица за ДНК-зависима РНК полимераза;

(д) използва се матрицата да получаване на множество РНК копия на последователността мишена, при използване на ДНК-зависима РНК полимераза, разпознаваща промоторната последователност; и (h) използват се РНК копията от етап (д), аавтокаталитично се повтарят етапи (Ь) до (д) за амплифициране на последователността мишена.
2. Метод, съгласно претенция 1, който включва освен това етапите на:

(i) прибавя се маркирана олигонуклеотидна проба към продукта от етап (h), характеризиращ се с това че, посочената олигонуклеотидна проба е комплементарна на участък от посочената последователност мишена, при условия, които предоставят възможност за хибридизиране на посочената проба с посочената последователност мишена за да се образува комплекс проба:мишена ; и (j) открива се присъствието или отсъствието на маркер, като означение за присъствие или отсъствие на последователност мишена.
3. Метод, съгласно претенция 2, характеризиращ се с твоа, че посоченият маркер е акридинов естер.
4. Метод, съгласно претенция 2, характеризиращ се с твоа, че посочените първи и втори праймери, и посочената проба произлизат от VP1 областа на генома на човешки Parvovirus В19.
5. Метод, съгласно претенция 4, характеризиращ се с твоа, че посочените първи и втори праймери, и посочената проба произлизат от нуклеотидна последователност посочена на коя да е от фигури 2A-2U или фигури 11А-11Z.
6. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че предоставя, освен това, вътрешен контрол в етап (Ь).
7. Метод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че вътрешният контрол произлиза от последователността от фигура 12 (SEQ ID N0:92).
8. Метод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че вътрешният контрол включва SEQ ID N0:90.
9. Метод за откриване на инфекция от човешки Parvovirus В19 в биологична проба, като посоченият метод включва:

(a) се изолира нуклеинова киселина от биологична проба, за която се предполага, че съдържа човешки Parvovirus В19, характеризиращ се с това че посочената нуклеинова киселина включна РНК последователност мишена;

(b) изолираната нуклеинова киселина на човешки Parvovirus В19 влиза в реакция с един първи олигонуклеотид, който съдържа един първи праймер, включващ последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна към 3’-терминалния участък на последователността мишена на РНК за образуване на комплекс с него, като посоченият първи праймер съдържа, освен това, промотор за ДНК зависима РНК полимераза 5’ и е операционно свързан към последователността образуваща комплекс, при което посоченият първи праймер включва последователност произлизаща от полинуклеотидната последователност изобразена на коя да е от фигури 2A-2U или фигури 11A-11Z, като реагирането се провежда при условия осигуряващи образуването на комплекс олигонуклеотид/последователност мишена и иницииране на синтеза на ДНК;

(c) удължава се първият праймер при една реакция на удължаване чрез използване на РНК последователността мишена като матрица, до получаване на продукт на удължаването на първиия ДНК праймер, комплементарен на РНК последователността мишена;

(d) разделя се продукта от удължаването на пръвия ДНК праймер от РНК последователността мишена при използване на ензим, който иизбирателнолно разгражда РНК последователността мишена;

(е) третира се продукта от удължаването на ДНК праймера с втори олигонуклеотид, съдържащ втори праймер, включващ последователност образуваща комплекс, достатъчно комплементарна на 3’-терминалния участък на продукта на удължаването на ДНК праймера, за образуване на комплекс с него, при което посоченият втори праймер произлиза от полинуклеотидна последователност, изобразена на коя да е фигура от 2A-2U или фигура 11A-11U, като реакцията протича при условия осигуряващи образуването на комплекс олигонуклеотид/последователност мишена и иницииране на синтеза на ДНК;

(f) удължава се 3’-терминуса на втория праймер в реакция за удължаване на ДНК до получаване на продукта на удължаването на втория ДНК праймер, като се получава матрица за ДНК-зависима РНК полимераза;

(д) използва се матрицата за получаване на множество РНК копия на последователността мишена, при използване на ДНК-зависима РНК полимераза, разпознаваща промоторната последователност; и (h) използват се РНК копията от етап (д), автокаталитично се повтарят етапи (Ь) до (д) за амплифициране на последователността мишена.

(i) прибавя се маркирана с акридинов естер олигонуклеотидна проба към продукта от етап (h), характеризиращ се с това че, посочената олигонуклеотидна проба е комплементарна на участък от посочената последователност мишена, като посочената проба произлиза от полинуклеотидна последователност, изобразена на коя да е фигура от 2A-2U или фигура 11A-11U, като посочената проба си прибавя при условия, които предоставят възможност за хибридизиране на посочената проба с посочената последователност мишена за да се образува комплекс проба:мишена; и (j) открива се присъствието или отсъствието на маркер, като означение за присъствие или отсъствие на последователността мишена.
10. Метод, съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че предоставя, освен това, вътрешен контрол в етап (Ь).
11. Метод, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че вътрешният контрол произлиза от последователността от фигура 12 (SEQ ID N0:92).
12. Метод, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че вътрешният контрол включва SEQ ID N0:90.
13. Метод за амплифициране на нуклеотидна последователност мишена на Parvovirus В19, характеризиращ се с това, че:

(a) изолира се нуклеинова киселина от биологична проба, за която се предполага, че съдържа ДНК от човешки Parvovirus В19, като посочената нуклеинова киселина включва РНК последователност мишена;

(b) прибавят се един или повече праймери способни да хибридизират с РНК последователността мишена, при което посочените един или повече праймери произлизат от полинуклеотидна последователност, изобразена на коя да е фигура от 2A-2U или фигура 11А-11U;

(c) прибавя се олигонуклеотидна проба, способна да хибридизира към РНК последователността мишена 3’ отнасяща се към единия или повече праймери;

(d) удължават се единия или повече праймери при използване на полимераза.
14. Метод, съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че РНК последователността мишена от етап (а) се транскрибира обратно, за получаване на сДНК.
15. Метод, съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че освен това се амплифицира сДНК-та при използване на полимеразна верижна реакция (RT-PCR) или асиметрична дар лигазна верижна реакция (RT-AGLCR).
16. Метод, съгласно претенция ТЗ, характеризиращ се с това, че полимеразата е термостабилна полимераза.

ф
17. Метод, съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че термостабилната полимераза е Taq полимераза или Vent полимераза.
18. Метод, съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че полимеразата е Е. coli ДНК полимераза I, Klenow фрагмент от Е. coli ДНК полимераза I, или Т4 ДНК полимераза.
19. Метод, съгласно претенция ТЗ, характеризиращ се с това, че освен това в етап (Ь) се предоставя вътрешен ф контрол.
20. Метод, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че вътрешният контрол произлиза от последователноста на фигура 12 (SEQ ID N0:92).
21. Метод, съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че вътрешният контрол съдържа SEQ ID N0:90.
22. Полинуклеотид, включващ нуклеотидна последователност, която включва която и да е от нуклеотидните последователности, изобразени на фигури 2А2U или фигури 11A-11Z.
23. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2А.
24. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои . от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2В.
25. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2С.
26. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2D.
27. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2F. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2Е.
28. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2F.
29. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2G.
30. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2Н.
31. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2I.
32. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2J.
33. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2К.
34. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2L.
35. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2М.
36. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2N.
37. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 20.
38. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна © последователност, изобразени на фигура 2Р.
39. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2Q.
40. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2R.
41. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2S.
42. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2Т.
43. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 2U.
44. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11 А.
45. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11 В.
46. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11С.
47. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11D.
48. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11 Е.
49. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11F.
50. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11G.
51. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Н.
52. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 111.

®
53. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11J.
54. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11К.
55. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, © характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11L.
56. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11М.
57. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11 N.
58. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 110.
59. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Р.
60. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Q.
61. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11R.
62. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11S.
63. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Т.
64. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура11U.
65. Полинуклеотид, съгласно претенция22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11V.
66. Полинуклеотид, съгласно претенция22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11W.
67. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Х.
68. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Y.
69. Полинуклеотид, съгласно претенция 22, характеризиращ се с това, че посочената нуклеотидна последователност се състои от нуклеотидна последователност, изобразени на фигура 11Z.
70. Полинуклеотид, съдържащ нуклеотидна последователност, която включва която и да е нуклеотидна последователност, изобразена на фигури ЗА-ЗС или 4А-4С.
71. Полинуклеотид, съгласно претенция 70, характеризиращ се с твоа, че се състои от нуклеотидна последователност, изобразена на фигури ЗА-ЗС.
72. Полинуклеотид, съгласно претенция 70, характеризиращ се с твоа, че се състои от нуклеотидна последователност, изобразена на фигури 4А-4С.
73. Олигонуклеотиден праймер, състоящ се от промоторна област, която се разпознава от ДНК-зависима РНК полимераза операционна свързана към последователност специфично образуваща комплекс с човешки Parvovirus В19 от приблизително 10 до приблизително 75 нуклеотида.
74. Олигонуклеотиден праймер, съгласно претенция 73, характеризиращ се с това, че посочената промоторна област е Т7 прломотор и посочената полимераза е Т7 РНК полимераза.
75. Олигонуклеотиден праймер, съгласно претенция 73, характеризиращ се с това, че посочената последователност специфично образуваща комплекс с човешки Parvovirus В19 е от VP1 областа на генома на човешки Parvovirus В19.
76. Олигонуклеотиден праймер, съгласно претенция 75, характеризиращ се с това, че посочената последователност специфично образуваща комплекс с човешки Parvovirus В19 произлиза от полинуклеотидна последователност, изобразена на коя да е от фигури 2A-2U.
77. Олигонуклеотиден праймер, състоящ се от Т7 промотор, операционно свързан към последователност специфично образуваща комплекс с човешки Parvovirus В19 от приблизително 10 до приблизително 75 нуклеотида, където посочената последователност специфично образуваща комплекс с човешки Parvovirus В19 произлиза от нуклеотидна последователност, изобразена на коя да е от фигури 2A-2U или фигури 11A-11Z.

100
78. Олигонуклеотидна проба, състояща се от последователност специфично хибридизираща с човешки Parvovirus В19 от приблизително 10 до приблизително 50 нуклеотида, свързани към маркер на акридинов естер.
79. Олигонуклеотидна проба, съгласно претенция 78, характеризираща се с това, че посочената последователност специфично хибридизираща с човешки Parvovirus В19 е от VP1 областа на генома на човешки Parvovirus В19.
80. Олигонуклеотидна проба, съгласно претенция 79, характеризираща се с това, че посочената последователност специфично хибридизираща с човешки Parvovirus В19 произлиза от полинуклеотидна последователност, изобразена на фигури 2A-2U или фигури 11A-11Z.
81. Комплект за диогностичен тест съдържащ праймер, съгласно претенция 73, и инструкции за провеждане на диагностичния тест.
82. Комплект за диогностичен тест, съгласно претенция 81, съдържащ освен товаолигонуклеотидна проба, която включва последователност специфично хибридизираща с човешки Parvovirus В19 от приблизително 10 до приблизително 50 нуклеотида, свързани към маркер на акридинов естер.
83. Метод за откриване на инфекция от човешки Parvovirus В19 в биологична проба, характеризиращ се с това, че:

(а) изолира се нуклеинова киселина от биологична проба, за която се подозира, че съдържа ДНК от човешки Parvovirus В19, където нуклеиновата киселина включва последователност мишена;

101 (b) изолираната нуклеинова киселина на Parvovirus В19 влиза в реакция с откриваемо маркирана проба, достатъчно комплементарна на и способна да хиибридизира с последователноста мишена, при което пробада произлиза от полинуклеотидна последователност, изобразена на фигури 2A-2U или фигури 11A-11Z, и където реагирането са осъществява при условия, които обезпечават образуването на комплекс проба/мишена последователност и;

(c) открива се присъствието или отсъствието на маркер, като индикация за присъствие или отсъствие на последователността мишена.