CZ308201B6 - Diagnostické zkoušky pro parvovirus B19 - Google Patents
Diagnostické zkoušky pro parvovirus B19 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308201B6 CZ308201B6 CZ2003-3516A CZ20033516A CZ308201B6 CZ 308201 B6 CZ308201 B6 CZ 308201B6 CZ 20033516 A CZ20033516 A CZ 20033516A CZ 308201 B6 CZ308201 B6 CZ 308201B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- nucleic acid
- parvovirus
- probe
- Prior art date
Links
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 title claims abstract description 109
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 104
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 97
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 87
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 208000007985 Erythema Infectiosum Diseases 0.000 claims abstract description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 71
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 47
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 47
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 41
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 39
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 29
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 29
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 29
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 23
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 claims description 22
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 claims description 22
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims description 11
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 9
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 3
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 43
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 82
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 80
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 49
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 31
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 31
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 31
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 22
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 description 20
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 description 20
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 239000002585 base Substances 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 16
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 15
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 15
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 14
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 14
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 8
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 8
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 5
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 4
- 101150100956 VSP2 gene Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 4
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 3
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- XUVKSPPGPPFPQN-UHFFFAOYSA-N 10-Methyl-9(10H)-acridone Chemical compound C1=CC=C2N(C)C3=CC=CC=C3C(=O)C2=C1 XUVKSPPGPPFPQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 2
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007826 nucleic acid assay Methods 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 2
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- COAABSMONFNYQH-TTWCUHKNSA-N (2r,3s,4s,5r,6s)-2-(hydroxymethyl)-6-(oxiran-2-ylmethylsulfanyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1SCC1OC1 COAABSMONFNYQH-TTWCUHKNSA-N 0.000 description 1
- PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-aminopentanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PSLCKQYQNVNTQI-BHFSHLQUSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010037497 3'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150022075 ADR1 gene Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N COP(O)=O Chemical class COP(O)=O QCMYYKRYFNMIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 101710118188 DNA-binding protein HU-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000121268 Erythroparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 208000001951 Fetal Death Diseases 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101150026303 HEX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710144128 Non-structural protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710199667 Nuclear export protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001244 Tli polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091061763 Triple-stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- MGPYJVWEJNTXLC-UHFFFAOYSA-N [6-[6-[2-cyanoethoxy-[di(propan-2-yl)amino]phosphanyl]oxyhexylcarbamoyl]-6'-(2,2-dimethylpropanoyloxy)-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound C12=CC=C(OC(=O)C(C)(C)C)C=C2OC2=CC(OC(=O)C(C)(C)C)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)NCCCCCCOP(N(C(C)C)C(C)C)OCCC#N)C=C21 MGPYJVWEJNTXLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 229940121357 antivirals Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N dithiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 231100000479 fetal death Toxicity 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005283 ground state Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011330 nucleic acid test Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008298 phosphoramidates Chemical class 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000010572 single replacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- MSTPNDZQVGSTET-UHFFFAOYSA-M sodium;2-anilino-6-sulfanylidene-1h-1,3,5-triazine-4-thiolate Chemical compound [Na+].N1C(=S)N=C([S-])N=C1NC1=CC=CC=C1 MSTPNDZQVGSTET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 description 1
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Primery a sondy pro způsob detekce infekce lidským parvovirem B 19 odvozené z konzervovaných oblastí genomu parvoviru B 19. Rovněž se popisují diagnostické zkoušky s použitím těchto primerů a sond založené na nukleových kyselinách.
Description
Tento vynález se obecně týká virové diagnostiky. Konkrétně se tento vynález týká zkoušek založených na nukleových kyselinách pro přesnou diagnostiku infekce parvovirem B19 a primeru a sond používaných při těchto zkouškách.
Dosavadní stav techniky
Lidský parvovirus B19 je členem čeledi Parvoviridae, rodu Erythrovirus a je to malý ikosaedrální virus bez obálky s lineární jedno vláknovou molekulou DNA o zhruba 5600 nukleotidech. Virový genom kóduje tři hlavní proteiny, VP1, VP2 a NS1. Viz Shade a kol., J. Virol., 58. 921 - 936 (1986) a obrázek 1 zde. VP1 (83 kDa) a VP2 (58 kDa) jsou strukturními proteiny kapsidy. Tyto dva proteiny se kódují v přesahujících čtecích rámcích od nukleotidů zhruba 2444 až 4789 a zhruba 3125 až 4789. VP2 tvoří 95 % kapsidy a větší protein VP1 pouze 5 % kapsidy. VP1 je potřebný pro zralou konformaci virů. NS1 (77 kDa) je nestruktumí protein a je přítomen pouze v nukleární frakci infikovaných buněk a chybí v cytoplasmě a intaktních virionech v séru.
Parvovirus B19 byl poprvé objeven v krevním séru normálních dárců krve a je to jediný člen čeledi Parvoviridae, který je patogenní pro člověka. Tento virus souvisí s širokým rozmezím chorobných projevů. Lidský parvovirus B19 normálně způsobuje asymptomatickou či mírnou infekci u dětí, která se sama o sobě omezuje. U dospělých může parvovirus B19 způsobit vyrážku, přechodnou symetrickou polyartralgii a artritidu. Parvovirus B19 souvisí s přechodnou aplastickou krizí (TAC) u pacientů, jejichž základním onemocněním jsou hemolytické poruchy. Chronická infekce B19 a persistentní anémie se uvádějí u pacientů s akutní leukémií a ohroženou imunitou, s vrozenými nedostatky imunity, s ATDS a po transplantaci kostní dřeně. Parvovirus B19 rovněž souvisí se smrtí plodu u těhotných žen.
Ve většině zemí se infekce virem B19 vyskytuje obecně v dětství, takže zhruba 50 % dětí ve věku 15 let má protilátky proti B19. Výskyt protilátek proti B19 se může dále v průběhu života zvyšovat a u starších osob dosahuje hodnot vyšších než 90 %.
Uvažuje se, že v případě infekce lidským parvovirem B19 nastává počáteční virová replikace v dýchacích cestách. Poté se virus zaměřuje na buňky v kostní dřeni. To vede k virové replikaci ve velkém měřítku s udávanou viremií mezi 102 až 1014 částic/ml nastávající 7 až 10 dní po infekci, avšak před nástupem symptomů. Vymizení viremie se časově shoduje s detekcí specifických protilátek IgM, jejichž hodnota zůstává zvýšená po dobu 2 až 3 měsíců. Protilátky IgG proti B19 se detekují několik dní po výskytu protilátek IgM a přetrvávají po celý život.
Nepřítomnost lipidové obálky a omezený obsah DNA činí parvovirus B19 mimořádně odolným vůči fýzikálně chemické inaktivaci. Parvovirus B19, zejména při vysoké koncentraci, dokáže snést konvenční tepelné zpracování krevních produktů a byl dokumentován přenos B19 podáním faktoru VIII zpracovaného rozpouštědlem s detergentem a faktoru VIII a IX zpracovaného horkou parou nebo horkem za sucha.
Lidský parvovirus B19 nemůže růst v konvenčních buněčných kulturách, takže laboratorní detekce a izolace tohoto viru je mimořádně obtížná. Proto je po mnoho let jediných zdrojem antigenu sérum od viremických pacientů. Ve snaze obejít tyto problémy se vyrábějí rekombinantní antigeny pro použití v sérologických zkouškách. Viz například Sisk a Berman, Biotechnology, 5, 1077 - 1080 (1987), patent US 6204044. Imunoenzymatické zkoušky založené na zachycení IgM se používají pro detekci IgM proti B19 a pro diagnostiku čerstvé infekce B19. Diagnostická výkonnost řady komerčně dostupných zkoušek však není homogenní. Navíc
- 1 CZ 308201 B6 diagnostické zkoušky založené na IgM nemohou detekovat virus v průběhu viremického stádia infekce a jakmile vzniknou IgM protilátky, mohou zůstávat v krevním oběhu po několik měsíců po skončení viremie.
Vysoký výskyt protilátek proti B19 u normální populace spolu se skutečností, že vysoká viremie obvykle přetrvává pouze po dobu jednoho týdne, činí sérologické zkoušky špatně proveditelnými. Navíc u pacientů s ohroženou imunitou může být sérologická diagnóza nespolehlivá.
Hybridizační zkoušky založené na nukleových kyselinách, jako je blotování a hybridizace in sítu, byly použity pro detekci B19. Tyto zkoušky mají obecně detekční meze 1 až 0,1 pg virové DNA (zhruba 104 až 105 virových částic). PCR má vyšší citlivost (zhruba 100 genomových kopií). Avšak DNA hybridizační způsoby jsou časově náročné a jejich použití je omezené a PCR se špatně prakticky provádí pro screening velkých počtů vzorků.
Proto zůstává potřeba vývoje spolehlivých diagnostických zkoušek pro detekci parvoviru B19 ve viremických vzorcích, aby se předešlo přenosu viru krevními a plasmatickými deriváty nebo těsným osobním stykem.
Podstata vynálezu
Tento vynález se zakládá na objevu jedinečných primeru a sond pro použití ve zkouškách pomocí nukleových kyselin stejně tak jako na vývoji citlivé a spolehlivé diagnostické zkoušky založené na nukleových kyselinách pro detekci DNA parvoviru B19 v biologických vzorcích od potenciálně infikovaných osob. Způsoby, které se zde popisují, používají DNA extrahovaného vzorku jako templát pro amplifikaci zachovaných genomových oblastí sekvence B19 s použitím amplifikace zprostředkované transkripcí (TMA) stejně jako v 5' nukleázové zkoušce, jako je způsob TaqMan™. Tyto způsoby umožňují detekci DNA B19 ve viremických vzorcích majících titry virů pouhých 103 virových částic/ml. V souladu s tím lze infikované vzorky identifikovat a vylučovat z transfuze stejně tak jako z přípravy krevních derivátů.
V souladu s výše uvedeným se v jednom provedení vynález týká způsobu detekce infekce lidským parvovirem B19 v biologickém vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje (a) izolování nukleové kyseliny z biologického vzorku s podezřením na obsah DNA lidského parvoviru B19, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje cílovou sekvenci;
(b) amplifikaci cílové sekvence pomocí nukleokyselinové polymerázy mající nukleázovou aktivitu ve směru od 5' k 3', dvojice primeru schopných hybridizace k cílové sekvenci a oligonukleotidovou sondu navrženou tak, aby hybridizovala k 3'vzhledem k jednomu z primeru v aplifikační sekvenci, kde (i) uvedená dvojice primeru sestává ze sense primeru SEQ ID NO: 88 a antisense primeru SEQ ID NO: 89;
(ii) 5'-konec sondy obsahuje fluorescenční reportérové barvivo a 3-konec sondy je blokován za účelem zabránění extenze sondy a obsahuje barvivo, které zháší fluorescenci 5fluoroforu;
(iii) během amplifikace polymeráza štěpí oligonukleotidovou sondu, když tato je hybridizovaná k cílové sekvenci, čímž dochází k oddělení molekuly reportéru od molekuly zhášeče; a
-2CZ 308201 B6 (iv) při provádění amplifikace se monitoruje fluorescence molekuly reportéru, přičemž fluorescence odpovídá tomu, že došlo k amplifikaci nukleové kyseliny.
V souladu s tím se jedno ztělesnění tohoto vynálezu zaměřuje na způsob detekce infekce lidským parvovirem B19 v biologickém vzorku. Tento způsob zahrnuje:
(a) izolaci nukleové kyseliny z biologického vzorku, u kterého je podezření, že obsahuje DNA lidského parvoviru B19, kde tato nukleové kyselina zahrnuje cílovou sekvenci RNA, (b) reakci izolované nukleové kyseliny parvoviru B19 s prvním oligonukleotidem, který zahrnuje první primer obsahující komplexační sekvenci dostatečně komplementární k 3'-terminální části cílové sekvence pro spojení s ní, kde tento první primer dále zahrnuje promotor pro DNAdependentní RNA polymerázu 5' a je operabilně připojený ke komplexační sekvenci, kde se reakce provádí za podmínek zajišťujících tvorbu komplexu oligonukleotid/cílová sekvence a zahájení syntézy DNA, (c) extenzi prvního primerů reakcí extenze používající cílovou sekvenci jako templát s obdržením prvního produktu extenze primem DNA komplementárního k cílové sekvenci.
(d) zpracování produktu extenze primem DNA dmhým oligonukleotidem, který zahrnuje dmhý primer obsahující komplexační sekvenci dostatečně komplementární k 3'-terminální části produktu extenze primem DNA tak, aby se vytvořil komplex za podmínek zajišťujících tvorbu komplexu oligonukleotid/cílová sekvence a zahájení syntézy DNA, (e) extenzi konce 3' dmhého primem v reakci extenze DNA s obdržením dmhého produktu extenze primem DNA, čímž se obdrží templát pro DNA-dependentní RNA polymerázu, (f) použití templářů pro vytvoření více kopií RNA cílové sekvence s použitím DNA-dependentní RNA polymerázy, která rozpoznává promotorovou sekvenci a (g) autokatalytické opakování kroků (b) až (f) s použitím RNA kopií z kroku (f) pro amplifikaci cílové sekvence, kde uvedený první a dmhý primer mají polynukleotidové sekvence SEQ ID NO: 88 a 89.
V určitých ztělesněních tento způsob dále obsahuje kroky:
(h) přidání značené oligonukleotidové sondy k produktu kroku (g), kde tato oligonukleotidová sonda je komplementární k části cílové sekvence za podmínek zajišťujících hybridizaci sondy s cílovou sekvencí s obdržením komplexu sonda/cílová sekvence a (i) detekce přítomnosti či nepřítomnosti značky ukazující na přítomnost či nepřítomnost cílové sekvence.
V dalších ztělesněních je touto značkou akridiniumester.
V následujícím textu se zkratka „SEQ ID NO:“ a výraz „číslo identifikace sekvence“ používají vzájemně zaměnitelně.
V určitých ztělesněních různých výše popsaných způsobů se zajišťuje vnitřní kontrola. Tuto vnitřní kontrolu lze odvodit od sekvence na obrázku 12 (číslo identifikace sekvence: 92). V dalších ztělesněních tato vnitřní kontrola zahrnuje sekvenci identifikačního čísla 90.
-3 CZ 308201 B6
Rovněž může být vytvořena diagnostická testovací souprava obsahující oligonukleotidové příměry a pokyny pro provádění diagnostického testu. Uvedená testovací souprava může obsahovat oligonukleotidovou sondu zahrnující hybridizační sekvenci specifickou pro parvovirus B19 o zhruba 10 až zhruba 50 nukleotidech připojenou k akridiniumesterové značce.
Tyto a další aspekty tohoto vynálezu jsou zřejmé s odkazem na následující podrobný popis a připojené výkresy.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 je diagram znázorňující genom lidského parvoviru B19, zobrazující různé kódovací oblasti viru. Zobrazují se tři fragmenty PCR, jeden se zhruba 700 bp odpovídající polohám nukleotidu 2936 až 3635 genomu parvoviru B19 popsanému v Shade a kol., J. Virol., 58. 921 - 936 (1986), jeden se zhruba 370 bp v rámci fragmentu 700 bp odpovídající polohám nukleotidu 3073 až 3442 genomu parvoviru B19 popsanému v Shade a kol., J. Virol., 58, 921 936 (1986) a jeden se zhruba 214 bp odpovídající polohám nukleotidu 4728 až 4941 genomu parvoviru B19 popsanému v Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986).
Obrázky 2A až 2U (čísla identifikace sekvence 1-21) zobrazují sekvence DNA z různých izolátu parvoviru B19 včetně sekvencí odpovídajících polohám nukleotidu 2936 až 3635 genomu parvoviru B19 popsanému v Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986) (fragment 700 bp z obrázku 1). Obrázek 2A (číslo identifikace sekvence 1) je odpovídající sekvence z izolátu CH47-26, obrázek 2B (číslo identifikace sekvence 2) je odpovídající sekvence z izolátu CH48-29, obrázek 2C (číslo identifikace sekvence 3) je odpovídající sekvence z izolátu CH33-2, obrázek 2D (číslo identifikace sekvence 4) je odpovídající sekvence z izolátu CH33-3, obrázek 2E (číslo identifikace sekvence 5) je odpovídající sekvence z izolátu CH33-4, obrázek 2F (číslo identifikace sekvence 6) je odpovídající sekvence z izolátu CH42-7, obrázek 2G (číslo identifikace sekvence 7) je odpovídající sekvence z izolátu CH42-18, obrázek 2H (číslo identifikace sekvence 8) je odpovídající sekvence z izolátu CH42-19, obrázek 21 (číslo identifikace sekvence 9) je odpovídající sekvence z izolátu CH46-23, obrázek 2J (číslo identifikace sekvence 10) je odpovídající sekvence z izolátu CH1-1, obrázek 2K (číslo identifikace sekvence 11) je odpovídající sekvence z izolátu CH1-6, obrázek 2L (číslo identifikace sekvence 12) je odpovídající sekvence z izolátu CH2-8, obrázek 2M (číslo identifikace sekvence 13) je odpovídající sekvence z izolátu CH2-10, obrázek 2N (číslo identifikace sekvence 14) je odpovídající sekvence z izolátu CH2-11, obrázek 20 (číslo identifikace sekvence 15) je odpovídající sekvence z izolátu CH5-13, obrázek 2P (číslo identifikace sekvence 16) je odpovídající sekvence z izolátu CH7-22, obrázek 2Q (číslo identifikace sekvence 17) je odpovídající sekvence z izolátu CH13-27, obrázek 2R (číslo identifikace sekvence 18) je odpovídající sekvence z izolátu CH14-33, obrázek 2S (číslo identifikace sekvence 19) je odpovídající sekvence z izolátu CH62-2, obrázek 2T (číslo identifikace sekvence 20) je odpovídající sekvence z izolátu CH64-2 a obrázek 2U (číslo identifikace sekvence 21) je odpovídající sekvence z izolátu CH67-2.
Obrázky 3A až 3C (číslo identifikace sekvence 22) ukazují sekvenci pro fragment zhruba 4,7 kbp PCR ukázaný na obrázku 1 z klonu 2-B1 parvoviru B19. Sekvence je fragment o 4677 nukleotidech odpovídající polohám nukleotidu 217 až 4893, jak popisuje Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986). Znázorněná sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec plné délky parvoviru B19, který kóduje NS1, VP1 a VP2 plus další nepřeložené sekvence 5' a 3'.
Obrázky 4A až 4C (číslo identifikace sekvence 23) ukazují sekvenci pro fragment PCR zhruba 4,7 kbp ukázaný na obrázku 1 z klonu 2-B6 parvoviru B19. Sekvence je fragment o 4677 nukleotidech odpovídající polohám nukleotidu 217 až 4893, jak popisuje Shade a kol., J. Virol.,
-4CZ 308201 B6
58. 921 - 936 (1986). Znázorněná sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec plné délky parvoviru B19, který kóduje NS1, VP1 a VP2 plus další nepřeložené sekvence 5' a 3'.
Obrázky 5A (číslo identifikace sekvence 24) a 5B (číslo identifikace sekvence 25) ukazují nukleotid NS1, respektive proteinové sekvence z klonu 2-B1 parvoviru B19.
Obrázky 6A (číslo identifikace sekvence 26) a 6B (číslo identifikace sekvence 27) ukazují nukleotidové, respektive proteinové sekvence VP1 z klonu 2-B1 parvoviru B19.
Obrázky 7A (číslo identifikace sekvence 28) a 7B (číslo identifikace sekvence 29) ukazují nukleotidové, respektive proteinové sekvence VP2 z klonu 2-B1 parvoviru B19.
Obrázky 8A (číslo identifikace sekvence 30) a 8B (číslo identifikace sekvence 31) ukazují nukleotidové, respektive proteinové sekvence NS1 z klonu 2-B6 parvoviru B19.
Obrázky 9A (číslo identifikace sekvence 32) a 9B (číslo identifikace sekvence 33) ukazují nukleotidové, respektive proteinové sekvence VP1 z klonu 2-B6 parvoviru B19.
Obrázky 10A (číslo identifikace sekvence 34) a 10B (číslo identifikace sekvence 35) ukazují nukleotidové, respektive proteinové sekvence VP2 z klonu 2-B6 parvoviru B19.
Obrázky 11A až 11Z (číslo identifikace sekvence 62 - 87) znázorňují sekvence DNA z různých izolátu parvoviru B19, které zahrnují sekvence odpovídající polohám nukleotidu 2936 až 3635 genomu parvoviru B19, jak popisují Shade a kol., J. Virol., 58. 921 - 936 (1986) (fragment 700 bp z obrázku 1).
Obrázek 11A (číslo identifikace sekvence 62) je odpovídající sekvence z izolátu
CH80-1, obrázek 11B (číslo identifikace sekvence 63) je odpovídající sekvence z izolátu
CH81-3, obrázek 11C (číslo identifikace sekvence 64) je odpovídající sekvence z izolátu B19SCL1-4, obrázek 11D (číslo identifikace sekvence 65) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL2-1, obrázek 11E (číslo identifikace sekvence 66) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL3-1, obrázek 11F (číslo identifikace sekvence 67) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL4-3, obrázek 11G (číslo identifikace sekvence 68) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL5-2, obrázek 11H (číslo identifikace sekvence 69) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL6-2, obrázek 111 (číslo identifikace sekvence 70) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL7-3, obrázek 11J (číslo identifikace sekvence 71) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL8-2, obrázek 11K (číslo identifikace sekvence 72) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL9-1, obrázek 11L (číslo identifikace sekvence 73) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL9-9, obrázek 11M (číslo identifikace sekvence 74) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL10-2, obrázek 11N (číslo identifikace sekvence 75) je odpovídající sekvence z izolátu B19SCL11-1, obrázek 110 (číslo identifikace sekvence 76) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL12-1, obrázek IIP (číslo identifikace sekvence 77) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL13-3, obrázek 11Q (číslo identifikace sekvence 78) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL14-1, obrázek 11R (číslo identifikace sekvence 79) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL15-3, obrázek 11S (číslo identifikace sekvence 80) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL16-2, obrázek 11T (číslo identifikace sekvence 81) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL17-1, obrázek 11U (číslo identifikace sekvence 82) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL18-1, obrázek 11V (číslo identifikace sekvence 83) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL19-1, obrázek 11W (číslo identifikace sekvence 84) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL20-3, obrázek 11X (číslo identifikace sekvence 85) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL21-3, obrázek 11Y (číslo identifikace sekvence 86) je odpovídající sekvence z izolátu
B19SCL122-11, obrázek 11Z (číslo identifikace sekvence 87) je odpovídající sekvence z izolátu B19SCL2-14.
Obrázek 12 (číslo identifikace sekvence 92) znázorňuje příklad sekvence, od které lze odvodit vnitřní kontrolu (IC) pro zachycení cílové sekvence a amplifikaci.
Podrobný popis vynálezu
Praxe tohoto vynálezu používá, pokud se nepopisuje jinak, konvenční způsoby chemie, biochemie, způsoby rekombinantní DNA a virologie, které patří do rámce zkušeností v oboru. Tyto způsoby se v plném znění vysvětlují v literatuře. Viz například Fundamental Virology, 2. vydání, díl I & II (B. N. Fields a D. M. Knipe, red.), A. L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., se současným dodatkem), Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manuál (2. vydání 1989), Methods In Enzymology (S. Colowick a N. Kaplan, red., Academie Press, Inc.), Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, red., 1984), A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
Je třeba poznamenat, že v tomto popisu a v připojených nárocích formy jednotného čísla zahrnují možnosti odkazu na množné číslo, pokud obsah zřejmě nepřikazuje jinak. Tak například odkaz na „antigen“ zahrnuje směs dvou či více antigenů a podobně.
V celém textu se používají následující zkratky aminokyselin:
| Alanin: Ala (A) Asparagin: Asn (N) Cystein: Cys (C) | Arginin: Arg (R) Kyselina aspartová: Asp (D) Glutamin: Gin (Q) |
Kyselina glutamová: Glu (E) Glycin: Gly (G)
| Histidin: His (H) Leucin: Leu (L) Methionin: Met (M) Prolin: Pro (P) Threonin: Thr (T) Tyrosin: Tyr (Y) | Isoleucin: He (I) Lysin: Lys (K) Fenylalanin: Phe (F) Serin: Ser (S) Tryptofan: Trp (W) Valin: Val (V) |
I. Definice
Při popisu tohoto vynálezu se používají následující pojmy a uvažují se tak, jak se vysvětlují níže.
Pojmy „polypeptid“ a „protein“ se týkají polymeru aminokyselinových zbytků a neomezují se minimální délkou produktu. Proto se do této definice zahrnují peptidy, oligopeptidy, dimery, multimery a podobně. Tato definice zahrnuje proteiny plné délky a jejich fragmenty. Tyto pojmy též zahrnují postexpresní modifikace polypeptidu, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci a podobně. Dále se pro účely tohoto vynálezu „polypeptid“ týká proteinu, který zahrnuje modifikace, jako jsou delece, adice a substituce (obecně svou povahou konzervativní) nativní sekvence, pokud protein uchovává svou požadovanou aktivitu. Tyto modifikace mohou být úmyslné, jako je mutageneze zaměřená na místo, nebo mohou být náhodné, jako jsou mutace hostitele poskytující proteiny či chyby následkem amplifikace PCR.
Polypeptid parvoviru B19 je polypeptid, jak se definuje výše, odvozený od proteinu kódovaného genomem B19, jako je tomu od nestruktumích proteinů, NS1 a NS2, stejně tak jako od proteinů z virové kapsidy, VP1 (zhruba 781 aminokyselin do délky) nebo VP2 (zhruba 554 aminokyselin do délky). Reprezentativní sekvence NS1, VP1 a VP2 se znázorňují zde na obrázcích 5 až 10. Polypeptid se nemusí fýzicky odvozovat od parvoviru B19, avšak může se též obdržet syntetickým či rekombinantním způsobem. Navíc se tento polypeptid může odvozovat od různých kmenů a izolátu parvoviru B19. Mezi těmito kmeny a izoláty jsou známy četné konzervované a proměnné oblasti a obecně aminokyselinové sekvence, například epitopů
-6CZ 308201 B6 odvozených od těchto oblastí, budou mít vysoký stupeň sekvenční homologie, to jest aminokyselinové sekvenční homologie vyšší než 30 %, přednostně vyšší než 40 % při přiřazení dvou sekvencí. Proto se například pojem polypeptid „VP1“ týká nativního VP1 z kteréhokoliv z různých kmenů a izolátu parvoviru B19. Jsou známy úplné genotypy a sekvence pro výše popsané proteiny mnohých kmenů a izolátu parvoviru B19. Viz například Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986), Gallinella a kol., J. Virol. Methods, 41, 203 - 211 (1993). Navíc jsou též známy epitopy z parvoviru B19 odvozené od těchto oblastí. Viz například patent US 5 436 127 a mezinárodní publikace č. WO 91/12269.
Pojmy „analog“ a „mutein“ se týkají biologicky aktivních derivátů referenční molekuly nebo fragmentů těchto derivátů, které si uchovávají požadovanou aktivitu, jako je imunoreaktivita v diagnostických zkouškách. Obecně se pojem „analog“ týká sloučenin majících nativní polypeptidovou sekvenci a strukturu s jednou či více aminokyselinovými adicemi, substitucemi (obecně konzervativními svou povahou) a/nebo delecemi vzhledem k nativní molekule, pokud tyto modifikace nenarušují imunogenní aktivitu. Pojem „mutein“ se týká peptidů majících jedno či více peptidových mimik („peptoidů“) jako jsou ta, která se popisují v mezinárodní publikaci č. WO 91/04282. Přednostně má analog muteinu alespoň stejnou imunoaktivitu jako nativní molekula. Způsoby přípravy polypeptidových analogů a muteinů jsou známy v oboru a popisují se dále níže.
Zvláště preferované analogy zahrnují substituce, které jsou svou povahou konzervativní, to jest takové substituce, které nastávají ve skupině aminokyselin, které jsou příbuzné svými postranními řetězci. Specificky se aminokyseliny obecně dělí do čtyř skupin: (1) kyselé - aspartát a glutamát, (2) bazické - lysin, arginin, histidin, (3) nepolární - alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan a (4) bez elektrického náboje polární - glycin, asparagin, glutamin, cystein, serin, threonin, tyrosin. Fenylalanin, tryptofan atyrosin se někdy zařazují jako aromatické aminokyseliny. Například lze rozumně očekávat, že jednotlivá náhrada leucinu isoleucinem nebo valinem, aspartátu glutamátem a threoninu serinem nebo podobná konzervativní náhrada aminokyseliny strukturně podobnou aminokyselinou nebude mít velký vliv na biologickou aktivitu. Například může daný polypeptid zahrnovat až zhruba 5 až 10 konzervativních nebo nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo dokonce až zhruba 15 až 25 konzervativních či nekonzervativních aminokyselinových substitucí nebo kterékoliv celé číslo mezi 5 až 25, pokud zůstane uchovaná požadovaná funkce molekuly. Ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno určit oblasti dané molekuly, které mohou tolerovat změnu, s odkazem na vynesení HoppAVoods a Kyte-Doolittle dobře známá v oboru.
Pojem „izolovaný“ při odkazu na polypeptid znamená, že daná molekula je oddělená a diskrétní vůči celému organismu, ve kterém se molekula nachází v přírodě nebo je přítomná v podstatě v nepřítomnosti dalších biologických makromolekul téhož typu. Pojem „izolovaný“ vzhledem k polynukleotidu znamená molekulu nukleové kyseliny prostou jako celek nebo část sekvencí normálně připojených k této molekule v přírodě nebo sekvence existující v přírodě, avšak mající heterologní sekvence, které se k ní připojují neboje tato molekula odpojená od chromozomu.
Polynukleotid „odvozený od“ nebo „specifický pro“ určenou sekvenci se týká polynukleotidové sekvence, která zahrnuje souvislou sekvenci zhruba alespoň 6 nukleotidů, přednostně alespoň zhruba 8 nukleotidů, lépe alespoň zhruba 10 až 12 nukleotidů, a dokonce ještě lépe alespoň zhruba 15 až 20 nukleotidů odpovídajících, to jest identických či komplementárních, oblasti určené nukleotidové sekvence. Odvozený polynukleotid nemusí být nezbytně odvozen fyzicky od dané nukleotidové sekvence, avšak může se vytvořit jakýmkoliv způsobem včetně, avšak bez omezení, chemické syntézy, replikace, reverzní transkripce nebo transkripce, která je založená na informaci poskytnuté sekvencí bází v oblasti (oblastech), od kterých se polynukleotid odvozuje. Jako takový může představovat orientaci stejného nebo opačného smyslu ve srovnám s původním polynukleotidem.
-7CZ 308201 B6 „Homologie“ se týká procenta podobnosti mezi dvěma polynukleotidy nebo dvěma polypeptidovými zbytky. Dvě DNA nebo dvě polypeptidové sekvence jsou „v podstatě homologní“ navzájem, pokud sekvence vykazují alespoň zhruba 50 %, přednostně alespoň zhruba 75 %, lépe alespoň zhruba 80 % až 85 %, přednostně alespoň zhruba 90 % a nejlépe alespoň zhruba 95 % až 98 % sekvenční podobnosti podél definované délky těchto molekul. Pojem v podstatě homologní, jak se zde používá, se rovněž týká sekvencí vykazujících úplnou identitu se specifikovanou sekvencí DNA nebo polypeptidu.
Pojem „identita“ se obecně týká přesné korespondence nukleotid po nukleotidu nebo aminokyselina po aminokyselině ve dvou polynukleotidových, respektive polypeptidových sekvencích. Procento identity lze určit přímým srovnáním sekvenční informace mezi dvěma molekulami přiřazením sekvencí, počítáním přesného počtu souhlasu mezi dvěma přiřazenými sekvencemi, dělením délky kratší sekvence a násobením výsledku číslem 100.
Při analýze homologie a identity lze použít snadno dostupné počítačové programy, jako je ALIGN, M. O. Dayhoff, v Atlas of Protein Sequence and Structure, Μ. Ο. Dayhoť, red., 5 Suppl., 3, 353 358, National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C, který přizpůsobuje lokální algoritmus homologie Smithe a Watermana, Advances in Appl. Math., 2, 482 - 489 (1981) pro analýzu peptidů. Programy pro stanovení nukleotidové sekvenční homologie jsou k dispozici ve Wisconsin Sequence Analysis Package, verze 8 (lze obdržet od Genetics Computer Group, Madison, WI), například programy BESTFIT, FASTA a GAP, které se rovněž zakládají na algoritmu Smithe a Watermana. Tyto programy se snadno používají s parametry standardního nastavení doporučenými výrobcem a popisovanými ve výše citovaném Wisconsin Sequence Analysis Package. Například lze procentickou homologii konkrétní nukleotidové sekvence s referenční sekvencí stanovit pomocí algoritmu homologie Smithe a Watermana se standardní skorovací tabulkou a trestnými body za mezeru (gap penalty) šesti nukleotide vých poloh.
Dalším způsobem určení procenta homologie v souvislosti s tímto vynálezem je použití souboru programů MPSRCH s autorským právem University of Edinburgh, který vypracovali John F. Collins a Shane S. Sturrok a distribuuje jej IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Z tohoto výběru souborů programů lze použít Smithův Watermanův algoritmus, kde se používají pro skórovací tabulku parametry standardního nastavení (například trestné body otevření mezery 12, extenze mezery 1 a mezera 6). Z obdržených údajů odráží hodnota „Match“ (odpovídající přiřazení) „sekvenční homologii“. Další vhodné programy pro výpočet procenta identity či podobnosti mezi sekvencemi jsou v oboru dobře známy, například další program přiřazování je BLAST používaný s parametry standardního nastavení. Například lze použít BLASTN a BLASTP s následujícími parametry standardního nastavení: genetický kód = standardní, filtr = žádný, vlákna = obě, zkrácení = 60, očekávání = 10, Matrice = BLOSUM62, popisy = 50 sekvencí, třídění = vysokým skóre, databáze = neredundantní, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS překlady + protein Swiss + aktualizace Sp + PIR. Podrobnosti těchto programů lze nalézt na následující internetové adrese: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternativně lze homologii stanovit hybridizací polynukleotidů za podmínek vytvářejících standardní duplexy mezi homologními oblastmi s následující digescí jednovláknově specifickou nukleázou (nukleázami) a stanovením velikosti fragmentů po digesci. Sekvence DNA, které jsou v podstatě homologní, lze identifikovat Southemovou hybridizací, například za přísných podmínek, jak se definují pro daný systém. Definice příslušných hybridizačních podmínek patří do rámce zkušeností v oboru. Viz například Sambrook a kol., výše, DNA Cloning, výše, Nucleic Acid Hybridization, výše.
„Operabilně připojený“ se týká uspořádání elementů, ve kterých se složky, které se takto popisují, konfigurují tak, aby plnily svou požadovanou funkci. Znamená to, že daný promotor operabilně připojený na sekvenci nukleové kyseliny je schopný provést transkripci a v případě kódovací sekvence expresi kódovací sekvence, pokud jsou přítomny vhodné transkripční faktory
- 8 CZ 308201 B6 atd. Promotor nemusí nutně přiléhat k sekvenci nukleové kyseliny, pokud působí tak, že řídí její transkripci a/nebo expresi. Například mohou být mezi promotorovou sekvencí a kódovací sekvencí zasahující nepřeložené a dosud nepřepsané sekvence, jako jsou transkribované introny, a promotorovou sekvenci lze stále považovat za „operabilně připojenou“ ke kódovací sekvenci.
Pojem „rekombinantní“, jak se zde používá pro popis molekuly nukleové kyseliny, znamená genomový, cDNA, virový, semisyntetický či syntetický původ, který vzhledem k jeho původu manipulace nesouvisí s celým polynukleotidem nebo jeho částí, se kterým souvisí v přírodě. Pojem „rekombinantní“ při použití vzhledem k proteinu nebo polypeptidu znamená polypeptid obdržený expresí rekombinantního polynukleotidů. Obecně se daný gen klonuje a poté exprimuje v transformovaných organismech, jak se popisuje dále níže. Hostitelský organismus exprimuje cizí gen s obdržením proteinu za podmínek exprese.
Pojem „kontrolní element“ se týká polynukleotidové sekvence, která pomáhá při transkripci a/nebo translaci nukleotidové sekvence, ke které se připojuje. Tento pojem zahrnuje promotory, transkripční terminační sekvence, vzestupné regulační domény, polyadenylační signály, nepřeložené oblasti včetně 5'-UTR a 3'-UTR a, pokud je to vhodné, vedoucí sekvence a enhancery, které společně zajišťují transkripci a translaci kódovací sekvence v hostitelské buňce.
Pojem „promotor“, jak se zde používá, je regulační oblast schopná vázat polymerázu a zahajovat transkripci nukleotidové sekvence v sestupném směru (směr 3'), ke které se operabilně připojuje. Pro účely tohoto vynálezu zahrnuje promotorova sekvence minimální počet bází či elementů nezbytných pro zahájení transkripce dané sekvence při hladinách detekovatelných nad pozadím. V rámci promotorové sekvence je místo zahájení transkripce, stejně tak jako proteinové vazebné domény (sekvence konsensu), odpovědné za vazbu RNA nebo DNA polymerázy. Promotor může být například sekvence nukleové kyseliny, která se rozpoznává DNA-dependentní RNA polymerázou („transkriptázou“) jako signál pro vazbu s nukleovou kyselinou a zahajuje transkripci RNA ve specifickém místě. Pro vazbu tyto transkriptázy obecně vyžadují DNA, která je dvouvláknová v části obsahující promotorovou sekvenci a její komplement. Templátová část (sekvence, která se má přepisovat) nemusí být dvouvláknová. Jednotlivé DNA-dependentní RNA polymerázy rozpoznávají řadu různých promotorových sekvencí, které se význačně mění ve své účinnosti jako promotory transkripce. Jestliže se některá RNA polymeráza váže na promotorovou sekvenci pro zahájení transkripce, není promotorova sekvence částí přepisované sekvence. Vytvořené RNA transkripty tedy nebudou zahrnovat tuto sekvenci.
Řídicí sekvence „řídí transkripci“ nukleotidové sekvence, jestliže se RNA nebo DNA polymeráza váže s promotorovou sekvencí a přepisuje přiléhající sekvenci.
„DNA-dependentní DNA polymeráza“ je enzym, který syntetizuje kopii komplementární DNA z templářů DNA. Příklady jsou DNA polymeráza I z E. coli a bakteriofágová T7 DNA polymeráza. Veškeré známé DNA-dependentní DNA polymerázy vyžadují pro zahájení syntézy komplementární primer. Za vhodných podmínek může DNA-dependentní DNA polymeráza syntetizovat kopii komplementární DNA z templátu RNA.
„DNA-dependentní RNA polymeráza“ nebo „transkriptáza“ je enzym, který syntetizuje více kopií RNA z dvouvláknové nebo částečně dvouvláknové molekuly DNA mající (obvykle dvouvláknovou) promotorovou sekvenci. Molekuly RNA („transkripty“) se syntetizují ve směru 5' až 3' počínaje od specifické polohy sestupně od promotoru. Příklady transkriptáz jsou DNA-dependentní RNA polymeráza z E. coli a bakteriofágů T7, T3 a SP6.
„RNA-dependentní DNA polymeráza“ nebo „reverzní transkriptáza“ je enzym, který syntetizuje komplementární kopii DNA z templářů RNA. Všechny známé reverzní transkriptázy jsou rovněž schopny vytvářet kopii komplementární DNA z templátu DNA, takže zahrnují jak RNA- tak DNA-dependentní DNA polymerázy. Pro zahájení syntézy s oběma templáty RNA a DNA se požaduje primer.
-9CZ 308201 B6 „RNAsa H“ je enzym, který degraduje, část ribonukleové kyseliny duplexu RNA:DNA. Tyto enzymy mohou být endonukleázy nebo exonukleázy. Většina reverzních transkriptázových enzymů normálně obsahuje aktivitu RNAsy H navíc ke své polymerázové aktivitě. Avšak jsou k dispozici i jiné zdroje RNAsy H bez související polymerázové aktivity. Degradace může vést k oddělení RNA z komplexu RNA.DNA. Alternativně může RNAsa H jednoduše zkracovat RNA v různých místech, takže se části RNA oddělují nebo umožňují enzymům odvíjet části RNA.
Pojmy „polynukleotid“, „oligonukleotid“, „nukleová kyselina“ a „molekula nukleové kyseliny“ se zde používají pro polymemí formu nukleotidů jakékoliv délky, buď ribonukleotidů nebo deoxyribonukleotidů. Tento termín se týká pouze primární struktury molekuly. Proto tento pojem zahrnuje trojvláknové, dvouvláknové a jednovláknové DNA stejně tak jako trojvláknové, dvouvláknové a jednovláknové RNA. Rovněž zahrnuje modifikace například methylací a/nebo zakrytím (capping) a nemodifikované formy polynukleotidů. Konkrétněji pojmy „polynukleotid“, „oligonukleotid“, „nukleová kyselina“ a „molekula nukleové kyseliny“ zahrnují polydeoxyribonukleotidy (obsahující 2-deoxy-D-ribosu), polyribonukleotidy (obsahující Dribosu), jakýkoliv jiný typ polynukleotidů, který je N- nebo C-glykosid purinové nebo pyrimidinové báze a další polymery obsahující nenukleotidové základní řetězce, například polyamidové (například peptidové nukleové kyseliny (PNA)) a polymorfolinové (komerčně dostupné od Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon jako Neugene) polymery a další syntetické sekvenčně specifické polymery nukleových kyselin s podmínkou, že tyto polymery obsahují nukleotidové báze v konfiguraci, která umožňuje párování bází a sestavování bází v řetězci, jako je tomu v DNA a RNA. Nezamýšlí se zde žádný rozdíl v délce mezi pojmy „polynukleotid“, „oligonukleotid“, „nukleová kyselina“ a „molekula nukleové kyseliny“ a tyto termíny se mohou navzájem zaměňovat. Tyto pojmy se týkají pouze primární struktury molekuly. Proto tyto pojmy zahrnují například 3'-deoxy-2',5'-DNA, oligodeoxyribonukleotid N3'P5' fosforamidát, 2'-Oalkyl-substituované RNA, dvouvláknové a jednovláknové DNA stejně tak jako dvouvláknové a jednovláknové RNA, hybridy DNA:RNA a hybridy mezi PNA, DNA nebo RNA a rovněž zahrnují známé typy modifikací, například značky, které jsou v oboru známy jako methylace, „caps“, substituce jednoho či více přirozených nukleotidů analogem, intemukleotidové modifikace, jako jsou například modifikace s vazbami bez náboje (například methyl-fosfonáty, fosfotriestery, fosforamidáty, karbamáty atd.) se záporně nabitými vazbami (například fosforothioáty, fosforodithioáty atd.), s pozitivně nabitými vazbami (například aminoalkylfosforoamidáty, aminoalkylfosforotriestery), modifikace obsahující připojené zbytky, jako jsou například proteiny (včetně nukleáz, toxinů, protilátek, signálních peptidů, poly-Llysinu atd.), modifikace s interkalovanými složkami (například akridin, psoralen atd.), modifikace obsahující chelatační složky (například kovy, radioaktivní kovy, bor, oxidativní kovy atd.), modifikace obsahující alkylátory, modifikované vazby (například alfa anomemí nukleové kyseliny atd.) stejně tak jako nemodifikované formy polynukleotidů nebo oligonukleotidu. DNA je zejména deoxyribonukleová kyselina.
Pojem „oblast cílové nukleové kyseliny“ nebo „cílová nukleová kyselina“ označuje molekulu nukleové kyseliny s „cílovou sekvencí“, která se má amplifíkovat. Cílová nukleová kyselina může být buď jedno vláknová nebo dvouvláknová a může zahrnovat další sekvence kromě cílové sekvence, které se nemusí amplifíkovat. Pojem „cílová sekvence“ se týká konkrétní nukleotidové sekvence cílové nukleové kyseliny, která se má amplifíkovat. Cílová sekvence může zahrnovat oblast hybridizující sondu obsaženou v rámci cílové molekuly, se kterou sonda tvoří za požadovaných podmínek stabilní hybrid. Pojem „cílová sekvence“ může též zahrnovat komplexační sekvence, se kterou oligonukleotidové primery poskytují komplex a extenzi s použitím cílové sekvence jako templátu. Jestliže je cílová nukleová kyselina původně jedno vláknová, týká se pojem „cílová sekvence“ též sekvence komplementární k „cílové sekvenci“ přítomné v cílové nukleové kyselině. Pokud je „cílová nukleová kyselina“ původně dvouvláknová, týká se pojem „cílová sekvence“ obou vláken plus (+) a minus (-)·
- 10 CZ 308201 B6
Pojem „primer“ nebo „oligonukleotidový primer“, jak se zde používá, se týká oligonukleotidu, který zahajuje syntézu komplementárního vlákna DNA za podmínek, za kterých se vyvolává extenze primerů, to jest za přítomnosti nukleotidů a prostředku indukujícího polymerizaci, jako je DNA nebo RNA polymeráza a za vhodné teploty, pH, koncentrace kovu a soli. Primer je přednostně jednovláknový pro dosažení maximální účinnosti při amplifikaci, avšak může být alternativně dvouvláknový. Jestliže je dvouvláknový, zpracuje se nejprve pro rozdělení jeho vláken před použitím pro přípravu produktů extenze. Denaturační krok se obvykle uskuteční teplem, avšak může se alternativně provádět s použitím alkálií s následnou neutralizací. Primer je tedy komplementární k templářů a tvoří komplex vodíkovým můstkem nebo hybridizací s templátem s obdržením komplexu primer/templát pro zahájení syntézy polymerázou, s extenzí adicí kovalentně vázaných bází připojených na konci 3' komplementárním k templátu v průběhu syntézy DNA.
Pojem „sonda“ nebo „oligonukleotidová sonda“, jak se zde používá, se týká struktury obsahující polynukleotid, jak se definuje výše, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny komplementární k sekvenci nukleové kyseliny přítomné v hledané cílové nukleové kyselině. Polynukleotidové oblasti sond se mohou skládat z DNA a/nebo RNAa a/nebo syntetických nukleotidových analogů. Když se má použít oligonukleotidová sonda v 5' nukleázové zkoušce, jako je způsob TaqMan™, bude sonda obsahovat alespoň jednu fluorescenční látku a alespoň jednu zhášející látku, která se zpracuje působením 5'endonukleázové aktivity polymerázy použité při reakci pro detekci jakýchkoliv amplifikovaných sekvencí cílového oligonukletidu. V této souvislosti bude mít oligonukleotidová sonda dostatečný počet fosfodiesterových vazeb přiléhajících k jejímu konci 5', takže použitá nukleázová aktivita 5' až 3' může účinně degradovat vázanou sondu pro oddělení fluorescenčních a zhášejících látek. Když se použije oligonukleotidová sonda ve způsobu TMA, bude vhodně značená, jak se popisuje níže.
Je zřejmé, že hybridizační sekvence nemusí vykazovat dokonalou komplementaritu pro zajištění stabilních hybridů. V mnoha situacích se tvoří stabilní hybridy, ve kterých méně než 10 % bází jsou nesprávně přiřazené, ignorující smyčky čtyř či více nukleotidů. V souhlasu s tím, jak se zde používá, týká se pojem „komplementární“ oligonukleotidu, který tvoří stabilní komplex se svým „komplementem“ za podmínek zkoušek, ve kterém je homologie zhruba 90 % nebo vyšší.
Pojmy „hybridizovat“ a „hybridizace“ se týkají tvorby komplexů mezi nukleotidovými sekvencemi, které jsou dostatečně komplementární pro vytvoření komplexů párováním bází podle Watsona-Cricka. Jestliže se primer hybridizuje s cílovým templátem, jsou tyto komplexy (či hybridy) dostatečně stabilní, aby sloužily jako primery, například k tomu, aby DNA polymeráza zahájila syntézu k DNA.
Pojem „vazebný pár“, jak se zde používá, se týká prvních a druhých molekul, které se spolu specificky vážou, jako jsou komplementární polynukleotidové páry schopné tvorby duplexů nukleových kyselin. „Specifická vazba“ prvního člena vazebného páru k druhému členu vazebného páru ve vzorku se prokazuje vazbou prvního člena k druhému členu nebo naopak s větší afinitou či specifičností než k jiným složkám ve vzorku. Vazba mezi Cleny vazebného páru je obvykle nekovalentní. Pokud souvislost neukazuje zřejmě jinak, jsou pojmy „afinitní molekula“ a „cílový analyt“ používané tak, že označují první, respektive druhé členy vazebného páru.
Pojmy „specifická vazebná molekula“ a „afinitní molekula“ se používají zaměnitelným způsobem a týkají se molekuly, která se selektivně váže chemicky nebo fyzikálně s detekovatelnou látkou přítomnou ve vzorku. „Selektivní vazbou“ se rozumí, že se molekula preferovaně váže na daný cíl nebo že se váže s větší afinitou na tento cíl než na jiné molekuly. Například molekula DNA se váže k v podstatě komplementární sekvenci, a nikoliv k nepříbuzným sekvencím.
- 11 CZ 308201 B6 „Teplota tání“ nebo „Tm“ dvouvláknové DNA se definuje jako teplota, při které se ztrácí polovina šroubovicové struktury DNA následkem zahřívám či jiné disociace vodíkových můstků mezi páry bází, například zpracováním kyselinou či alkálií nebo podobně. Tm molekuly DNA závisí na její délce a na složení bází. Molekuly DNA bohaté na páry bází GC mají vyšší Tm než molekuly s páry bází AT. Oddělená komplementární vlákna DNA se spontánně znovu spojují nebo anelují s vytvořením komplexní DNA, jestliže se teplota sníží pod hodnotu Tm. Nejvyšší hybridizace nukleových kyselin nastává zhruba při 25 °C pod Tm. Tm Lze stanovit s použitím následujícího vztahu: Tm = 69,3 + 0,41 (GC) % [Marmur a kol., J. Mol. Biol., 5, 109 - 118 (1962)].
Pojem „biologický vzorek“, jak se zde používá, se týká vzorku tkáně či tekutiny izolované od osoby, který obvykle obsahuje protilátky tvořené touto osobou. Obvyklé vzorky obsahující tyto protilátky jsou známé v oboru a zahrnují, avšak bez omezení, krev, krevní plazmu, krevní sérum, stolici, moč, kostní dřeň, žluč, spinální tekutinu, lymfatickou tekutinu, vzorky kůže, sekretů kůže, vzorky z respiračního, střevního a urogenitálního traktu, slzy, sliny, mléko, krvinky, orgány, bioptické vzorky a též vzorky buněčné kultury in vitro zahrnující, avšak bez omezení, upravovaná média z růstu buněk a tkání v prostředí kultury, například rekombinantní buňky a buněčné komponenty.
Pojmy „značka“ a „detekovatelná značka“, jak se zde používají, se týkají molekuly schopné detekce včetně, avšak bez omezení, radioaktivních izotopů, fluorescenčních látek, chemiluminiscenčních látek, chromoforů, enzymů, enzymových substrátů, enzymových kofaktorů, enzymových inhibitorů, chromoforů, barviv, kovových iontů, kovových solů, ligandů (například biotinu, avidinu, strepavidinu nebo haptenů) a podobně. Pojem „fluorescenční látka“ se týká látky nebo její části, která je schopná vykazovat fluorescenci v detekovatelném rozmezí.
II. Způsoby provádění vynálezu
Před podrobným popisem tohoto vynálezu je třeba si uvědomit, že se tento vynález neomezuje na konkrétní formulace či parametry postupu jakýmkoliv způsobem. Je též třeba si uvědomit, že terminologie, která se zde používá pouze pro účely popisu jednotlivých ztělesnění tohoto vynálezu, není omezující.
I když lze použít řadu kompozicí a způsobů podobných či ekvivalentních těm, které se zde popisují, preferují se látky a způsoby popisované zde.
Jak se poznamenává výše, tento vynález se zakládá na objevu nových primeru a sond a diagnostických způsobů pro přesné stanovení infekce parvovirem B19 v biologickém vzorku. Tyto způsoby se zakládají na citlivých detekčních technikách na bázi nukleových kyselin, které umožňují identifikaci cílových sekvencí nukleové kyseliny parvoviru B19 ve vzorcích obsahujících malá množství viru.
Původci tohoto vynálezu zde zejména charakterizují oblasti genomu parvoviru B19, které jsou vhodnými cíli pro diagnostické zkoušky. Primery a sondy odvozené od těchto oblastí jsou mimořádně použitelné pro detekci infekce parvovirem B19 v biologických vzorcích.
Primery a sondy parvoviru B19 popisované výše se používají ve zkouškách založených na nukleových kyselinách pro detekci infekce lidským parvovirem B19 v biologických vzorcích. Konkrétně se primery a sondy pro použití v těchto zkouškách přednostně odvozují od fragmentu zhruba 4,7 kb genomu parvoviru B19 odpovídajícího polohám nukleotidů 217 až 4678 podle Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986).
Nukleotidové sekvence pro tuto oblast ze dvou různých izolátu parvoviru B19 jsou zobrazené na obrázcích 3 A až 3C a 4A až 4C. Jak se popisuje výše, obsahuje tento fragment kódovací oblasti NS1, VP1 aVP2.
- 12 CZ 308201 B6
Zvláště preferované primery a sondy pro použití v těchto zkouškách se určují z vysoce zachovaných oblastí genomu parvoviru B19, aby se umožnila detekce infekce parvovirem B19 způsobené různými izoláty. Jak se zde popisuje, nachází se jedna vysoce zachovaná oblast genomu parvoviru B19 v oblasti 700 bp, která se rozprostírá mezi polohami 2936 až 3635 číslovanými podle genomu parvoviru B19, jak jej popisuje Shade a kol., 58, 921 - 936 (1986). Tato oblast je uvnitř oblasti VP1 tohoto genomu. Sekvence této oblasti z 21 různého izolátu parvoviru B19 je zde znázorněná na obrázcích 2A až 2U. Sekvence z dalších 20 izolátu ukazují obrázky 11A až 11Z. Srovnání sekvencí ukazuje, že tato oblast vykazuje od zhruba 98 % do 99,5 % sekvenční homologie od jednoho izolátu ke druhému, takže je vysoce žádanou cílovou sekvencí. Pro návrh primeru a sond je rovněž vítaná oblast 370 bp nalezená ve VP1, která překlenuje nukleotidové polohy zhruba 3073 až 3442, číslované podle Shade a kol., 58, 921 - 936 (1986) stejně tak jako fragment 214 bp zobrazený na obrázku 1, který je v poloze 3' fragmentu 4,7 kb a rozprostírá se v polohách nukleotidu 4728 až 4941 číslovaných podle Shade a kol., 58. 921 -936(1986).
Oblasti 4,7 kbp, 700 bp a 370 bp se snadno obdrží z dalších izolátu s použitím částí sekvence parvoviru B19 přítomných v těchto konkrétních oblastech jako primeru v PCR reakcích, jako jsou ty, které se zde popisují, stejně tak jako patentech US 4 683 195, 4 683 202 a 4 889 818 a na základě sekvencí, které se zde poskytují. Další způsob obdržení nukleotidových sekvencí s požadovanými sekvencemi je anelování komplementárních souborů přesahujících syntetických oligonukleotidu připravených v konvenčním automatickém polynukleotidovém syntetizátoru s následnou ligací s příslušnou DNA ligázou a amplifikací ligované nukleotidové sekvence prostřednictvím reakce PCR. Viz například Jayaraman a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 4084 - 4088 (1991). Když se sekvence připraví či izolují, mohou se klonovat do kteréhokoliv vhodného vektoru či replikonu. Ten, kdo má zkušenost v oboru, zná četné vektory a výběr příslušného klonovacího vektoru je otázkou volby. Vhodné vektory zahrnují, avšak bez omezení, plazmidy, fágy, transposony, kosmidy, chromosomy nebo viry, které jsou schopné replikace při spojení s vhodnými řídicími elementy. Rekombinantní klony se snadno identifikují restrikční enzymatickou analýzou a polyakrylamidovou či agarózovou gelovou elektroforézou s použitím způsobů dobře známých v oboru a popisovaných v příkladech níže.
Primery a sondy pro použití v těchto zkouškách se odvozují od těchto sekvencí a snadno se připraví standardními způsoby, například syntézou v tuhé fázi fosforoamiditovou chemickou cestou, jak popisují patenty US 4458066 a 4415732, Beaucage a kol., Tetrahedron, 48, 2223 - 2311 (1992) a Applied Biosystems User Bulletin č. 13 (1. dubna 1987). Další způsoby chemické přípravy zahrnují například fosfotriesterový způsob popsaný Narangem a kol., Meth. Enzymol., 68, 109 (1979) a fosfodiesterový způsob popsaný Brownem a kol, Meth. Enzymol., 68, 90 (1979). Poly(A) nebo poly(C) nebo další nekomplementámí nukleotidové extenze lze zahrnout do sond stejnými způsoby. Hexaethylenoxidové extenze lze připojit k sondám způsoby známými v oboru, Cload a kol., J. Am. Chem. Soc, 113. 6324 - 6326 (1991), patent US 4 914 210, Levenson a kol., Durand a kol., Nucleic Acids Res., 18, 6353 - 6359 (1990) a Hom a koi., Tet. Lett., 27. 4705 - 4708 (1986). Obvykle jsou sekvence primem v rozmezí mezi 10 až 75 nukleotidů délky, jako je 15 až 60, 20 až 40 atd., obvykleji v rozmezí mezi 18 až 40 nukleotidů délky a o jakékoliv délce mezi udanými hodnotami rozmezí. Obvyklá sonda je v rozmezí mezi 10 a 50 nukleotidů délky, jako je 15 až 40, 18 až 30 atd. a o jakékoliv délce mezi těmito hodnotami rozmezí.
Navíc, lze sondy připojovat ke značkám pro detekci. Existuje několik prostředků známých pro derivatizaci oligonukleotidu s reaktivními funkčními skupinami, které umožňují přidání značky. Například existuje několik dostupných přístupů pro biotinylační sondy, takže lze prostřednictvím avidinu připojit radioaktivní, fluorescenční, chemiluminiscenční enzymatické nebo elektrondenzní značky. Viz například Broken a kol., Nucl. Acids Res., 5, 363 - 384 (1978), kteří popisují použití značek feritin-avidin-biotin a Chollet a kol., Nucl. Acids Res., 13. 1529 - 1541
- 13 CZ 308201 B6 (1985), kteří popisují biotinylaci konců 5' oligonukleotidu prostřednictvím aminoalkylfosforamidového spojovacího článku. Je též několik dostupných metod pro přípravu amino-derivatizovaných oligonukleotidu, které jsou již značené fluorescenčním typem nebo jinými typy sloučenin derivatizovaných aminoreaktivními skupinami, jako je skupina isothiokyanátu, N-hydroxysukcinimidu či podobně, viz například Connolly, Nucl. Acids Res., 15, 3131 - 3139 (1987), Gibson a kol., Nucl. Acids Res., 15, 6455 - 6467 (1987) a patent US 4605735, Miyoshi a kol. Jsou též k dispozici způsoby přípravy sulfhydryl-derivatizovaných oligonukleotidu, které mohou reagovat s thiol-specifickými značkami, viz například patent US 4757141, Fung a kol., Connolly a kol., Nucl. Acids, 13, 4485 - 4502 (1985) a Spoat a kol., Nucl. Acids Res., 15, 4837 - 4848 (1987). Souborný referát o způsobech značených fragmentů DNA popisují Matthews a kol., Anal. Biochem., 169. 1 -25 (1988).
Sondy mohou být značeny fluorescenčně například spojováním s fluorescenční molekulou s neligujícím koncem sondy. Vodítka pro volbu příslušných fluorescenčních značek lze nalézt v Smith a kol., Meth. Enzymol., 155. 260 - 301 (1987), Karger a kol., Nucl. Acids Res., 19. 4955 - 4962 (1991), Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1989) (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Preferované fluorescenční značky zahrnují fluorescein a jeho deriváty, jako se popisuje v patentu US 4318846 a v Lee a kol., Cytometry, 10, 151 - 164 (1989) a 6-FAM, JOE, TAMRA, ROX, HEX-1, HEX-2, ZOE, TET-1 nebo NAN-2 a podobně.
Navíc lze sondy značit akridiniumesterem (AE) s použitím níže popsaných způsobů. Současné technologie umožňují umístění značky AE ve kterémkoliv místě sondy. Viz například Nelson a kol. (1995) „Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence“ v Nonisotopic, Probing. Blotting and Sequencing, L. J. Kricka (red.) Academie Press, San Diego, CA, Nelson a koi. (1994) „Application of the Hybridization Protection Assay (HPA) to PCR“ v The Polymeráze Chain Reaction, Mullis a koi. (red.) Birkhauser, Boston, MA, Weecks a koi., Clin. Chem., 29, 1474 . 1479 (1983), Berry a koi., Clin. Chem., 34, 2087 - 2090 (1988). Molekulu AE lze přímo připojit k sondě chemickým způsobem spojovacího článku, který není založený na nukleotidech, který umožňuje umístění značky do kteréhokoliv místa v sondě. Viz například patenty US 5585481 a 5185439.
V určitých ztělesněních se přidává vnitřní kontrola (IC) nebo vnitřní standard sloužící pro kontrolu zachycení a amplifikace cíle. Přednostně zahrnuje IC sekvenci, která se liší od cílové frekvence, je schopná hybridizace s použitými sekvencemi sondy pro oddělení nukleotidů specifických pro organismus ze vzorku a je schopna amplifikace. Použití IC umožňuje kontrolu separačního procesu, amplifikačního procesu a detekčního systému a umožňuje sledování výkonu a kvantitativního vyjádření zkoušky pro vzorek (vzorky). Reprezentativní sekvence, ze které lze obdržet IC, je znázorněná na obrázku 12. IC lze zahrnout v jakékoliv vhodné fázi, například do pufiru pro cytolýzu. V jednom ztělesnění obsahuje IC ssDNA M13 s obsahem nukleotidové sekvence z parvoviru B19 a jedinečnou sekvenci, která hybridizuje se vzorkem, například obsahující sekvence z oblasti VP1, kde se cílová sekvence modifikuje substitucí či delecí 5 až 20 bází či více, přednostně 5 až 15 bází, jako je 5, 10 nebo 15 bází nebo jakýkoliv počet v těchto rozmezích. Substituované či vypuštěné báze se přednostně vyskytují po celé délce cílové sekvence, takže se nahrazují pouze 2 nebo 3 po sobě následující sekvence. Proto například, jestliže je cílová sekvence CTACTTGCTGCGGGAGAAAAACACCT (číslo identifikace sekvence 91), potom se tato sekvence může substituovat například AGCTAGACCTGCATGTCACTG (číslo identifikace sekvence 90) v IC.
Tuhý nosič může dále zahrnovat sondy specifické pro vnitřní standard (sonda IC), čímž se usnadňuje zachycení při použití sondy IC. Sonda IC se může případně spojovat s detekovatelnou značkou, která je odlišná od detekovatelné značky cílové sekvence. Ve ztělesněních, ve kterých je detekovatelnou značkou některý fluorofor, lze IC kvantifikovat spektrofotometricky a mezí detekčních studií. Obvykle se počet kopií IC, které neinterferují s cílovou detekcí, určí titrací IC s pevnou m. j. (mezinárodní jednotkou) cíle přednostně při spodní mezi a standardní křivka se
- 14 CZ 308201 B6 obdrží zřeďováním vzorku mezinárodně přijatých mezinárodních jednotek. Pro kvantifikaci parvoviru B19 lze použít osmičlenný panel 8000 m. j. až 125 m. j.
V dalším ztělesnění se IC, jak se zde popisuje, spojuje s RNA izolovanou ze vzorku podle standardních způsobů známých tomu, kdo má zkušenost v oboru a popisovaných zde. RNA se poté podrobí reverzní transkripci s použitím reverzní transkriptázy pro obdržení kopie DNA. Sekvence cDNA lze případně amplifikovat (například reakcí PCR) s použitím značených primeru. Produkty amplifikace se oddělí, obvykle elektroforézou, a množství radioaktivity (přímo úměrné množství amplifikováného produktu) se stanoví. Množství mRNA ve vzorku se poté vypočítá srovnáním se signálem poskytnutým známými standardy.
Primery a sondy popisované výše lze použít v polymerázové řetězové reakci (PCR) pro detekci infekce parvovirem B19 v biologických vzorcích. PCR je způsob amplifikace požadované sekvence cílové nukleové kyseliny obsažené v molekule nukleové kyseliny nebo ve směsi molekul. V průběhu PCR se používá pár primeru v přebytku pro hybridizací s komplementárními vlákny cílové nukleové kyseliny. Oba primery se podrobí extenzi polymerázou s použitím cílové nukleové kyseliny jako templářů. Produkty extenze se samy stávají cílovými sekvencemi po disociaci od původního cílového vlákna. Nové primery se poté hybridizují a podrobí extenzi polymerázou a cyklus se opakuje s geometrickým vzrůstem počtu molekul cílové sekvence. Způsob PCR pro amplifikaci cílových sekvencí nukleové kyseliny ve vzorku je dobře známý v oboru a popisuje se například v Innis a kol. (red.), PCR Protocols (Academie Press, NY 1990), Taylor (1991), Polymeráze chain reaction: basic principles and automation, v PCR: A Practical Approach, McPherson a koi., (red.) IRL Press, Oxford, Saiki a koi., Nature, 324, 163 (1986) a v patentech US 4683195, 4683202 a 4889818.
PCR konkrétně používá relativně krátké oligonukleotidové primery, které obklopují cílovou nukleotidovou sekvenci, jež se má amplifikovat, orientované takovým způsobem, že jejich konce 3' jsou obráceny proti sobě a každý z primeru směřuje směrem k druhému. Polynukleotidový vzorek se extrahuje a denaturuje, přednostně teplem a hybridizuje s prvním a druhým primerem, které jsou přítomny v molámím přebytku. Polymerizace se katalyzuje za přítomnosti čtyř deoxyribonukleotid-trifosfátů (dNTP: dATP, dGTP, dCTP a dTTP) s použitím primer- a templát-dependentního polynukleotidového polymerizačního prostředku, jako je kterýkoliv enzym schopný tvorby produktů extenze primeru, například polymeráza I DNA E. coli, polymeráza I DNA Klenowova fragmentu, polymeráza DNA T4, termostabilní polymerázy DNA izolované z Thermus aquaticus (Taq), dostupné z řady zdrojů (například Perkin Elmer), Thermus thermophilus (United States Biochemicals), Bacillus stereothermophilus (Bio-Rad) nebo Thermococcus litoralis („Vent“ polymeráza, New England Biolabs). To vede ke dvěma „dlouhým produktům“, které obsahují příslušné primery připojené svými konci 5' kovalentně k nově syntetizovaným komplementům původních vláken. Reakční směs se poté vrátí do stavu podmínek polymerizace, například snížením teploty, inaktivací denaturačního prostředku nebo přídavkem další polymerázy a zahájí se druhý cyklus. Tento druhý cyklus poskytuje obě původní vlákna, oba dlouhé produkty z prvního cyklu, oba nové dlouhé produkty replikované z původních vláken a oba „krátké produkty“ replikované z dlouhých produktů. Dlouhé produkty mají sekvenci cílové sekvence s primerem připojeným na každém konci. Při každém dalším cyklu se vytvoří další dva dlouhé produkty a řada krátkých produktů rovná počtu dlouhých a krátkých produktů zbývajících na konci předchozího cyklu. Tím počet krátkých produktů obsahujících cílovou sekvenci roste exponenciálně s každým cyklem. Přednostně se PCR provádí s komerčně dostupným tepelným cyklovačem, například Perkin Elmer.
Ribonukleové kyseliny lze amplifikovat reverzní transkripcí mRNA do cDNA a poté provedením reakce PCR (RT-PCR), jak se popisuje výše. Alternativně lze použít jeden enzym pro oba kroky, jak se popisuje v patentu US 5322770. mRNA se též může podrobit reverzní transkripci do cDNA s následující reakcí ligázy s asymetrickou mezerou (RT-AGLCR), jak popisuje Marshall a kol., PCRMeth. App., 4, 80 - 84 (1994).
- 15 CZ 308201 B6
Fluorogenní 5' nukleázová zkouška, známá jako zkouška TaqMan™ (Perkin-Elmer) je vysoce účinným a přizpůsobivým detekčním systémem na bázi PCR pro cílové nukleové kyseliny. Proto primery a sondy odvozené od oblastí genomu parvoviru B19, které se zde popisují, lze použít v analýzách TaqMan™ pro detekci přítomnosti infekce v biologickém vzorku. Analýza se provádí v souvislosti s termálním cyklováním sledováním tvorby fluorescenčních signálů. Systém zkoušky se obejde bez analýzy gelovou elektroforézou a je schopen vytvořit kvantitativní údaje umožňující stanovení počtu cílových kopií.
Fluorogenní 5' nukleázová zkouška se vhodným způsobem provádí s použitím například DNA polymerázy AmpliTaqGold™, která vykazuje endogenní 5' nukleázovou aktivitu pro digesci vnitřní oligonukleotidová sondy značené fluorescenčním reportérovým barvivém a zhášejícím prostředkem [viz Holland a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 7276 - 7280 (1991) a Lee a kol., Nucl. Acids Res., 21, 3761 - 3766 (1993)]. Výsledky zkoušky se detekují měřením změn fluorescence nastávajících v průběhu cyklu amplifikace tak, jak se fluorescenční sonda zpracovává digesci, odpojením značek barviva a zhášejícího prostředku a vzrůstem fluorescenčního signálu, který je přímo úměrný amplifikaci cílové DNA.
Produkty amplifikace lze detekovat v roztoku nebo s použitím pevných nosičů. V tomto způsobu se navrhuje sonda TaqMan™ pro hybridizací s cílovou sekvencí v požadovaném produktu PCR. Konec 5' sondy TaqMan™ obsahuje fluorescenční reportérové barvivo. Konec 3' sondy se blokuje, aby se zabránilo extenzi sondy a obsahuje barvivo, které bude zhášet fluorescenci fluoroforu 5'. Během následující amplifikace se fluorescenční značka odštěpí, pokud jev reakci přítomná aktivita 5' exonukleázy. Excise 5' fluoroforu vede ke vzrůstu fluorescence, který lze detekovat.
Konkrétně se oligonukleotidová sonda tvoří takovým způsobem, aby byla v nehybridizovaném stavu alespoň v jedné jednovláknové konformaci, kde zhášející molekula je dostatečně blízko k reportérové molekule pro zhášení fluorescence reportérové molekuly. Oligonukleotidová sonda je též v alespoň jedné konformaci při hybridizací s cílovým polynukleotidem, takže zhášející molekula není dostatečně blízko k reportérové molekule, aby zhášela fluorescenci reportérové molekuly. Přijetím těchto hybridize váných a nehybridizo váných konformaci vykazuje reportérova molekula a zhášející molekula na sondě různé intenzity fluorescenčního signálu v případech, kdy je sonda hybridizovaná a nehybridizovaná. Tím lze stanovit, zda je sonda hybridizovaná či nehybridizovaná na základě změny intenzity fluorescence reportérové molekuly, zhášející molekuly nebo jejich kombinace. Navíc, jelikož lze sondu konstruovat tak, aby zhášející molekula zhášela reportérovou molekulu, když sonda není hybridizovaná, lze sondu konstruovat tak, aby reportérova molekula vykazovala omezenou fluorescenci, pokud není sonda hybridizovaná nebo digerovaná.
V souhlasu s tím se tento vynález týká způsobu amplifikace cílové nukleotidové sekvence parvoviru B19 s použitím polymerázy nukleové kyseliny mající nukleázovou aktivitu 5' až 3', jednoho či více primeru schopných hybridizace s cílovou frekvencí B19 a oligonukleotidové sondy schopné hybridizace s cílovou sekvencí 3' B19 vzhledem k primeru. V průběhu amplifikace polymeráza digeruje oligonukleotidovou sondu, když je hybridizovaná s cílovou sekvencí, čímž odděluje reportérovou molekulu od zhášející molekuly. Provede se amplifikace a sleduje se fluorescence reportérové molekuly s fluorescencí odpovídající výskytu amplifikace nukleové kyseliny. Reportérova molekula je přednostně fluoresceinovým barvivém a zhášející molekula je přednostně rhodaminovým barvivém.
I když délky primeru a sond se mohou měnit, sekvence sond se volí takovým způsobem, aby měly nižší teplotu tání než sekvence primeru. Proto jsou sekvence primeru obecně delší než sekvence sondy. Obvykle jsou sekvence primeru v rozmezí délek mezi 10 a 75 nukleotidy, obvykleji v rozmezí 20 až 45 nukleotidů. Obvyklá sonda je v rozmezí délek mezi 10 a 50 nukleotidy, obvykleji 15 až 40 nukleotidů délky.
- 16 CZ 308201 B6
Pokud se použije pevný nosič, může se oligonukleotidová sonda připojit k pevnému nosiči různými způsoby. Například se může sonda připojovat k pevnému nosiči připojením terminálního nukleotidu 3' nebo 5' sondy k pevnému nosiči. Přednostněji se sonda připojuje k pevnému nosiči spojovacím článkem, který slouží pro zajištění vzdálenosti sondy od pevného nosiče. Tento spojovací článek má délku alespoň 15 až 30 atomů, přednostněji alespoň 15 až 50 atomů. Požadovaná délka spojovacího článku bude záviset na konkrétním užitém pevném nosiči. Například spojka o 6 atomech je obecně dostatečná, pokud se jako pevný nosič používá zesíťovaný polystyren. V oboru je známá řada spojovacích článků, které lze použít pro připojení oligonukleotidové sondy k pevnému nosiči. Tento spojovací článek může být tvořen kteroukoliv sloučeninou, která významně neinterferuje s hybridizací cílové sekvence se sondou připojenou k pevnému nosiči. Tento spojovací článek může být tvořen homopolymemím oligonukleotidem, který lze snadno připojovat automatizovanou syntézou. Alternativně lze použít polymery, jako je polyethylenglykol opatřený funkčními skupinami. Tyto polymery se preferují oproti homopolymemím oligonukleotidům, jelikož významně neinterferují s hybridizací sondy s cílovým oligonukleotidem. Zvláště se preferuje polyethylenglykol.
Preferují se taková spojení mezi pevným nosičem, spojovacím článkem a sondou, která se neštěpí v průběhu odstraňování chránících skupin báze za bazických podmínek při vysoké teplotě. Příklady preferovaných spojení zahrnují karbamátová a amidová spojení.
Příklady preferovaných typů pevných nosičů pro imobilizaci oligonukleotidové sondy zahrnují skla s definovanými póry, skleněné destičky, polystyren, polystyrénové kuličky potahované avidinem, celulózu, nylon, akrylamidový gel a aktivovaný dextran.
Ohledně podrobného popisu zkoušky TaqMan™, chemikálií a podmínek pro jejich použití viz například Holland a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 88, 7276 - 7280 (1991), patent US 5538848, 5723591 a 5876930.
Sekvence parvoviru B19, které se zde popisují, lze též použít jako bázi pro amplifikační eseje zprostředkované transkripcí (TMA). TMA poskytuje způsob identifikace cílové sekvence nukleové kyseliny přítomné ve velmi malých množstvích v biologickém vzorku. S použitím způsobů přímých zkoušek může být obtížné či nemožné tyto sekvence detekovat. TMA je konkrétně izotermální, autokatalytický systém amplifikace cílové nukleové kyseliny, který může zajistit více než bilion kopií RNA cílové sekvence. Zkoušky lze provádět kvalitativně pro přesné zjištění přítomnosti či nepřítomnosti cílové sekvence v biologickém vzorku. Tato zkouška může též poskytnout kvantitativní měřítko množství cílové sekvence v koncentračním rozmezí několika řádů. TMA poskytuje způsob autokatalytické syntézy četných kopií cílové sekvence nukleové kyseliny bez opakující se manipulace reakčních podmínek, jako je teplota, iontová síla a pH.
Obecně TMA zahrnuje následující kroky: (a) izolaci nukleové kyseliny včetně RNA z daného biologického vzorku, u kterého je podezření na infekci parvovirem B19 a (b) spojení do jedné reakční směsi (i) izolované nukleové kyseliny, (ii) prvního a druhého oligonukleotidového primeru, kde první primer má komplexační sekvenci dostatečně komplementární k terminální části 3' cílové sekvence RNA, pokud je přítomná (například vlákno (+)) pro vytvoření komplexu s touto sekvencí a druhý primer má komplexační sekvenci dostatečně komplementární k terminální části 3' cílové sekvence jejího komplementu (například vlákno (-)), aby s ní vytvořil komplex, kde první oligonukleotid dále obsahuje sekvenci 5' ke komplexační sekvenci zahrnující promotor, (iii) reverzní transkriptázy nebo RNA- a DNA-dependentní DNA polymerázy, (iv) enzymatické aktivity, která selektivně degraduje vlákno RNA komplexu RNA-DNA (jako je RNAsa H) a (v) RNA polymerázy, která rozpoznává promotor.
Složky reakční směsi lze kombinovat postupně nebo najednou. Reakční směs se inkubuje za podmínek, kdy se vytváří oligonukleotid/cílová sekvence včetně podmínek primingu DNA a syntézy nukleové kyseliny (včetně ribonukleotid-trifosfátů a deoxyribonukleotid-trifosfátů) po dobu dostatečnou pro zajištění četných kopií cílové sekvence. Reakce se s výhodou uskuteční za
- 17 CZ 308201 B6 podmínek vhodných pro udržování stability reakčních složek, jako jsou enzymatické složky a bez požadavku na modifikaci či manipulaci reakčních podmínek v průběhu amplifikační reakce. V souhlasu s tím může reakce nastávat za podmínek, které jsou v podstatě izotermální a zahrnují v podstatě konstantní iontovou sílu a pH. Reakce ve vhodných případech nevyžaduje denaturační krok pro separaci komplexu RNA-DNA poskytnutého první reakcí extenze DNA.
Vhodné DNA polymerázy zahrnují reverzní transkriptázy, jako je reverzní transkriptáza viru ptačí myeloblastosy (AMV) (dodává například Seikagaku America, Inc.) a reverzní transkriptáza Moloney ova viru myší leukémie (MMLV) (dodává například Bethesda Research Laboratories).
Promotory či promotorové sekvence vhodné pro inkorporaci v příměrech jsou sekvence nukleových kyselin (buď přirozených, produkovaných synteticky nebo produkovaných restrikční digesci), které se specificky rozpoznávají RNA polymerázou, která je rozpoznává a váže se na tyto sekvence a zahajuje proces transkripce s obdržením RNA transkriptů. Sekvence může případně obsahovat nukleotidové báze procházející mimo skutečné rozpoznávací místo pro RNA polymerázu, které mohou zajišťovat větší stabilitu či citlivost vůči degradačním procesům nebo zvýšenou transkripční účinnost. Příklady použitelných promotorů zahrnují ty, které se rozpoznávají určitými bakteriofágovými polymerázami, jako jsou polymerázy od bakteriofágů T3, T7 nebo SP6 nebo promotor E. coli. Tyto RNA polymerázy jsou snadno dostupné z komerčních zdrojů, jako jsou New England Biolabs a Epicentre.
Některé z reverzních transkriptáz vhodné pro použití v těchto způsobech vykazují aktivitu RNAsy H, jako je AMV reversní transkriptáza. Může se však preferovat přidání exogenní RNAsy H, jako je RNAsa Η E. coli, dokonce i při použití reverzní transkriptázy AMV. RNAsu H lze snadno obdržet od Bethesda Research Laboratories.
Transkripty RNA obdržené těmito způsoby mohou sloužit jako templáty pro obdržení dalších kopií cílové sekvence výše popsanými mechanismy. Systém je autokatalytický a amplifikace nastává autokatalytický bez nutnosti opakované modifikace či změny reakčních podmínek, jako je teplota, pH, iontová síla či podobně.
Detekci lze provádět s použitím řady různých způsobů, včetně přímého sekvenování, hybridizace sekvenčně specifických oligomerů, gelové elektroforézy a hmotnostní spektrometrie. Tyto způsoby mohou využívat heterogenních či homogenních formátů, izotopických či neizotopických značek, stejně tak jako použití bez značek.
Jedním preferovaným způsobem detekce je použití oligonukleotidových sond specifických pro cílové sekvence odvozených od výše popsaných fragmentů 4,7 kbp, 700 bp, 370 bp a 214 bp. Tyto sondy lze použít ve zkouškách ochrany hybridizace (HPA). V tomto ztělesnění se sondy vhodným způsobem značí akridiniumesterem (AE), vysoce chemiluminiscenční molekulou. Viz například Nelson a kol. (1995) „Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence“ v Nonisotopic Probing, Blotting and Sequencing, Kricka L. J. (red.) Academie Press (HPA) to PCR“ v The Polymeráze Chain Reaction, Mullis a koi., (red.) Birkhauser, Boston, MA, Weeks a koi., Clin. Chem., 29, 1474 - 1479 (1983), Berry a koi., Clin. Chem., 34, 2087 - 2090 (1988). Jedna molekula AE se přímo připojuje k sondě s použitím chemického spojovacího článku, který není založený na nukleotidech a umožňuje umístění značky do jakéhokoliv místa sondy. Viz například patenty US 5585481 a 5185439. Chemiluminiscence se spouští reakcí s alkalickým peroxidem vodíku s obdržením excitovaného N-methylakridonu, který následně přechází do základního stavu s emisí fotonu. Navíc AE způsobuje hydrolýzu esteru, která poskytuje nechemiluminiscenční methylakridiniovou karboxylovou kyselinu.
Když se molekula AE váže kovalentně na sondu nukleové kyseliny, probíhá hydrolýza rychle za mírně alkalických podmínek. Když je sonda značená AE přesně komplementární cílové nukleové kyselině, je rychlost hydrolýzy AE značně snížená. Proto lze detekovat hybridizované a nehybridizované sondy značené AE přímo v roztoku bez nutnosti fyzického oddělení.
- 18 CZ 308201 B6
ΗΡΑ obecně zahrnuje následující kroky: (a) sonda značená AE se hybridizuje s cílovou nukleovou kyselinou v roztoku po dobu zhruba 15 až 30 min. Poté se přidá mírně alkalický roztok a AE připojený na nehybridizovanou sondu se hydrolyzuje. Tato reakce trvá zhruba 5 až 10 min. Zbývající hybridně připojený AE se detekuje jako míra množství přítomné cílové látky. Tento krok trvá zhruba 2 až 5 s. Přednostně se provádí diferenciální krok hydrolýzy při téže teplotě jako hybridizační krok, obvykle při 50 až 70 °C. Alternativně lze provádět druhý diferenciální krok hydrolýzy při teplotě místnosti. To umožňuje použití zvýšených pH, například v rozmezích 10 až 11, s obdržením větších rozdílů v rychlosti hydrolýzy mezi hybridizovanou a nehybridizovanou sondou značenou AE. HPA se popisuje podrobně například v patentech US 6004745, 5948899 a 5283174.
TMA se popisuje podrobně například v patentu US 5399491. V jednom příkladu typické zkoušky se izolovaný vzorek nukleové kyseliny, u kterého je podezření, že obsahuje cílovou sekvenci parvoviru B19 smísí s koncentrátem pufru obsahujícím pufir, soli, horečnaté ionty, nukleotidtrifosfáty, primery, dithiothreitol a spermidin. Reakční směs se případně inkubuje při teplotě zhruba 100 °C po dobu zhruba 2 min pro denaturaci jakékoliv sekundární struktury. Po ochlazení na teplotu místnosti se přidá reverzní transkriptáza, RNA polymeráza a RNAsa H a směs se inkubuje po dobu 2 až 4 h při teplotě 37 °C. Výsledek reakce lze poté vyhodnotit denaturaci proteinu přídavkem roztoku sondy, inkubací po dobu 20 min při teplotě 60 °C, přidáním roztoku pro selektivní hydrolýzu nehybridizované sondy inkubací reakce po dobu 6 min při teplotě 60 °C a měřením zbývající chemiluminiscence v luminometru.
Oligonukleotidové molekuly podle tohoto vynálezu lze též použít při amplifíkaci na bázi sekvence nukleových kyselin (NASBA). Tento způsob je enzymatickým procesem zaměřeným na promotor, který indukuje in vitro nepřetržitou homogenní a isothermální amplifíkaci specifické nukleové kyseliny s obdržením RNA kopií této nukleové kyseliny. Reakční prostředky pro provedení NASBA zahrnují první primer DNA s koncem 5' obsahující promotor, druhý primer DNA, reverzní transkriptázu, RNAsu Η, T7 RNA polymerázu, NTP a dNTP. S použitím NASBA se vytvoří velká množství jednovláknové RNA z buď jednovláknové RNA nebo DNA nebo dvouvláknové DNA. Když se má amplifikovat RNA, slouží ssRNA jako templát pro syntézu prvního vlákna DNA prodloužením prvního primeru obsahujícího rozpoznávací místo RNA polymerázy. Toto vlákno DNA dále slouží jako templát pro syntézu druhého, komplementárního DNA vlákna prodloužením druhého primeru s obdržením dvou vláknového aktivního RNA polymerázového promotorového místa a druhé vlákno DNA slouží jako templát pro syntézu velkých množství prvního templátu, ssRNA, s pomocí RNA polymerázy. Způsob NASBA je známý v oboru a popisuje se například v evropském patentu 329 822, mezinárodní patentové přihlášce WO 91/02814 a petentech US 6063603, 5554517 a 5409818.
Sekvence parvoviru B19, které se zde popisují, jsou rovněž použitelné pro způsoby hybridizace a amplifíkace nukleových kyselin využívajících rozvětvených molekul DNA. Při zkoušce s bazickou hybridizací nukleových kyselin se stanovovaná jednovláknová složka nukleové kyseliny hybridizuje s jedno vláknovou sondou nukleové kyseliny a detekují se výsledné duplexy. Pozměnění tohoto základního schématu umožňuje oddělení duplexů pro detekci z cizorodých materiálů a/nebo pro amplifíkaci signálu, který se detekuje. Jedním způsobem amplifíkace signálu je amplifíkace multimerů, což jsou polynukleotidy s prvním segmentem hybridizujícím specificky na stanovovanou nukleovou kyselinu nebo vlákno nukleové kyseliny vázané na stanovovanou složku a iterace druhého segmentu, který specificky hybridizuje se značenou sondou. Amplifíkace je teoreticky přímo úměrná počtu iterací druhého segmentu. Multimery mohou být lineární či rozvětvené. V těchto způsobech jsou použitelné dva obecné typy rozvětvených multimerů: ve tvaru vidličky a ve tvaru hřebínku. Způsoby přípravy a použití rozvětvených molekul nukleových kyselin jsou známy v oboru a popisují se například v patentu US 5849481.
- 19 CZ 308201 B6
V dalším aspektu tohoto vynálezu se provedou dvě či více výše popsaných zkoušek pro ověření přítomnosti organismů. Například, jestliže první zkouška používá transkripcí zprostředkovanou amplifikaci (TMA) pro amplifikaci nukleových kyselin k detekci, potom se provede alternativní zkouška testování nukleové kyseliny (NAT), například s použitím amplifikace PCR, RT PCR a podobně, jak se zde popisuje. Tímto způsobem lze parvovirus B19 specificky a selektivně detekovat, dokonce i když vzorek obsahuje jiné organismy, jako je například virus HIV a virus hepatitidy B.
Lze si snadno uvědomit, že návrhy zkoušek, které se zde popisují, jsou předmětem značné variace a v oboru je známá řada formátů. Popisy výše se udávají pouze jako vodítko a ten, kdo má zkušenost v oboru, může snadno modifikovat popsané protokoly s použitím způsobů dobře známých v oboru.
Výše popsané reakční prostředky pro zkoušku včetně primeru, sond, nosičů s navázanými sondami stejně tak jako dalších detekčních prostředků lze dodávat v soupravách s vhodnými návody a dalšími nezbytnými reakčními složkami pro provádění zkoušek, jak se popisují výše. Souprava bude běžně obsahovat v jednotlivých nádobkách kombinaci primeru a sond (buď již navázaných na pevnou matrici nebo odděleně s reakčními prostředky pro jejich vazbu s matricí), kontrolní formulace (pozitivní a/nebo negativní), značená činidla, pokud formát zkoušky některá vyžaduje a činidla pro vytvoření signálu (například substrát enzymu), pokud značka nevytváří signál přímo. Instrukce (například písemné, na pásce, VCR, CD-ROM a podobně) pro provedení zkoušky se obvykle zahrnují do soupravy. Souprava může též obsahovat v závislosti na konkrétní použité zkoušce další balené reakční prostředky a materiály (to jest promývací pufry a podobně). Standardní zkoušky, jako jsou ty, které se popisují výše, lze provádět s použitím těchto souprav.
III. Způsoby provedení experimentů
Níže se popisují příklady specifických ztělesnění pro provádění tohoto vynálezu. Příklady se nabízejí pouze pro ilustrativní účely a nezamýšlejí se v tom smyslu, že by omezovaly jakýmkoliv způsobem rozsah tohoto vynálezu.
Je snaha o zajištění přesnosti vzhledem k hodnotám (například množství, teploty atd.), avšak je třeba připustit určitou experimentální chybu a odchylku.
Enzymy v následujících případech pocházejí z komerčních zdrojů a používají se podle návodů výrobce. Nitrocelulózové filtry a podobně byly rovněž zakoupeny z komerčních zdrojů.
Při izolaci DNA fragmentů se provádějí veškeré manipulace s DNA pode standardních způsobů, pokud se nepopisuje jinak. Viz Sambrook a kol., výše. Restrikční enzymy, T4 DNA ligáza, E. coli, DNA polymeráza I, Klenowův fragment a další biologické prostředky lze obdržet od komerčních dodavatelů a použít podle návodů výrobce. Fragmenty dvouvláknové DNA se oddělují na agarózových gelech.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Extrakce nukleové kyseliny parvoviru B19 pro PCR
Vzorky lidského séra dříve pozitivně testované na lidský parvovirus B19 buď zkouškou IgM nebo zkouškou PCR se obdrží z komerčních zdrojů a použijí pro izolaci DNA pro následné experimenty PCR. Vzorky se ukládají do použití při teplotě 80 °C.
-20 CZ 308201 B6
DNA se extrahuje z 0,2 ml séra s použitím souboru QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA) podle specifikací výrobce s následujícími úvahami. Nosič DNA se přidá k pufru pro rozpuštění struktur pro zvýšení vazby a výtěžku nukleové kyseliny. Konkrétně se přidá množství 5,6 pg na vzorek polyadenylové kyseliny 5' (Sigma, St. Louis, MO) nebo poly-dA (Roche, Indianapolis, IN). Dále se DNA parvoviru B19 eluuje 200 pl pufru AE (Qiagen) místo vodou.
Příklad 2
Detekce vzorků pozitivních na nukleovou kyselinu parvoviru B19 pomocí PCR
Používají se dva různé způsoby PCR pro amplifikaci fragmentů parvoviru B19. Jeden způsob popsaný podrobně níže se používá pro amplifikaci fragmentů zhruba 700 bp, 370 bp a 214 bp (viz obrázek 1). Způsob High Fidelity Expand PCR (Roche) se používá pro amplifikaci fragmentů zhruba 4,7 kb. Fragment zhruba 700 bp odpovídá polohám nukleotidu 2936 až 3635 genomu parvoviru B19, jak popisují Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986). Zhruba 370 bp se vyskytuje ve fragmentu 700 bp v polohách nukleotidu 3 073 až 3442. Fragment zhruba 4,7 kb je fragment nukleotidu 4677 odpovídající polohám nukleotidu 217 až 4893 podle Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986).
Pro amplifikaci fragmentů B19 zhruba 700 bp, 370 bp a 214 bp se používají primery udané v tabulce 1.
Tabulka 1
| Oblast | Sekvence | Product PCR | Genomová |
| primerů | |||
| VP-5 | AGGAAGTTTGCCGGAAGTFC (č. id. sekvence: 36) | 370 bp | VPi |
| VP-.3 | GTGCTGAAACTCTAAAGGTG <č. id. sekvence: 37) | 370 bp | VPl |
| VPž-5 | GACATGGATATGAAAAGCCTOAAG (č id. sekvence: 38 | ) 2íí bp | |
| VPI/VP2 | |||
| VF2-.3 | aiTG'iTCATATCTGGTTAAGl'ACr (č. id. sekvence: 39) | 214 bp | |
| VP1/VP2 | |||
| Klsp | ATAAATCCATATACTCATT (č. id. sdwencc:40) | 700 bp | |
| VP1/VP2 | |||
| K-2sp | CTAAAGT.4TCCTGACCTTG (¢. id. sekvencemi) | 700 bp | |
| VP1/VP2 |
Pro tento experiment se PCR provádí v konečném objemu 100 pl s použitím 2 pl purifikované DNA parvoviru B19 (purifikace podle popisu výše), po 0,2 mM každého deoxynukleotidtrifosfatu a 1,25 jednotek Přu DNA polymerázy (Stratagene, La Jolla, CA). Amplifikační profil zahrnuje denaturaci při teplotě 94 °C po dobu 2 min, anelování primerů při 37 °C po dobu 3 min a extenzi při 72 °C po dobu 3 min po 35 cyklů. Předběžná inkubace 3 min při 94 °C pro zajištění počáteční denaturace a konečná po dobu 7 min při teplotě 72 °C pro zajištění plné extenze fragmentů předchází před těmito 35 PCR cykly, respektive následuje po nich. PCR produkty se podrobí elektroforéze na 7% polyakrylamidových gelech, obarví ethidium-bromidem a vizualizují pod zdrojem ultrafialového světla. Purifikace amplifikovaných fragmentů se provádí pomocí soupravy QiaQuick PCR (QIAGEN).
-21 CZ 308201 B6
PCR pro amplifikaci fragmentu 370 bp B19 se provádí, když se pás 700 bp na polyakrylamidových gelech nezobrazuje. Materiál 700 bp se použije pro PCR s použitím primeru ukázaných v tabulce 1.
Souprava High Fidelity Expand PCR (Roche) se používá pro amplifikaci fragmentu 4,7 kb parvoviru B19 následujícím způsobem. Použije se souprava High Fidelity Expand PCR (Roche) a primery Hicks-5 (5' CCCGCCTTATGCAATGCAAATGGGCAG3') (číslo identifikace sekvence 42) a Hicks 3 (5' TTGTGTTAGGCTGTCTTATAGG3') (číslo identifikace sekvence 43) podle doporučení dodavatele. Podmínky amplifikace jsou 94 °C po dobu 1 min, 50 °C po dobu 2 min a 68 °C po dobu 4 min pro 35 nebo 45 cyklů. Provádí se též předběžná inkubace při 94 °C po dobu 2 min a dodatečná inkubace při 75 °C po dobu 7 min. Produkty PCR se separují na 1% agarových gelech a purifikují purifikační soupravou PCR Purification (Promega, Madison, WI).
Příklad 3
Klonování fragmentů DNA parvoviru B19
Fragmenty PCR se klonují do vektorů TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Klonování do těchto vektorů se značně usnadňuje, jestliže amplifikovaná DNA obsahuje při svém konci 3' jeden deoxyadenosin (A). V souhlasu s tím se používá katalytická reakce pro přidání koncového 3' (A). Reakční směs obsahuje 1,25 mM dATP, 0,5 jednotek Taq polymerázy (Perkin Elmer, Boston, MA) a reakce pokračuje při teplotě 72 °C po dobu 15 min.
Fragmenty PCR se klonují do vektoru pCR2.1-TOPO s použitím klonovací soupravy Invitrogen TA (TOPO™ TA CloningR Kit s One Shot TOP 10 Electrocompetent Cells) podle specifikací výrobce. Bakteriální buňky se inkubují při teplotě 37 °C na destičkách Luria Broth obsahujících ampicilin o koncentraci 100 pg/ml, 0,66 mM EPTG a 0,033 % X-Gal. Několik bílých kolonií se naočkuje do 4 ml ampicilinu Luria-Broth (100 pg/ml) a inkubuje přes noc při teplotě 37 °C za třepání. Tři ml těchto kultur se použijí pro přípravu DNA plazmidu pomocí soupravy QIAprep Miniprep (QIAGEN). Rekombinantní klony se identifikují restrikční enzymovou analýzou s EcoRI (New England a Biolabs) a provede se elektroforéza na 7% polyakrylamidovém nebo 1% agarózovém gelu, jak se popisuje výše.
Pro stanovení sekvencí DNA klonů se připraví velká množství plazmidů z rekombinantních klonů jako výše a DNA se suspenduje v TE (10 mM TRIS-HC1, pH 8,0, 1 mM EDTA) o koncentraci 0,2 mg/ml. Stanovení nukleotidové sekvence fragmentu parvoviru B19 se provádí s použitím systému Applied Biosystems Model 373 (nebo Model 377) DNA Sequencer.
Obrázky 2A až 2U (čísla identifikace sekvence 1 až 21) zobrazují sekvence DNA z 21 izolátu parvoviru B19, purifikované, amplifikované a sekvenované, jak se popisuje výše, odpovídající polohám nukleotidu 2936 až 3635 genomu parvoviru B19 popsanému v Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986) (fragment 700 bp znázorněný na obrázku 1 a popsaný výše). Obrázek 2A (číslo identifikace sekvence 1) je sekvence z izolátu CH47-26, obrázek 2B (číslo identifikace sekvence 2) je sekvence z izolátu CH48-29, obrázek 2C (číslo identifikace sekvence 3) je sekvence z izolátu CH33-2, obrázek 2D (číslo identifikace sekvence 4) je sekvence z izolátu CH33-3, obrázek 2E (číslo identifikace sekvence 5) je sekvence z izolátu CH33-4, obrázek 2F (číslo identifikace sekvence 6) je sekvence z izolátu CH42-7, obrázek 2G (číslo identifikace sekvence 7) je sekvence z izolátu CH42-18, obrázek 2H (číslo identifikace sekvence 8) je sekvence z izolátu CH42-19, obrázek 21 (číslo identifikace sekvence 9) je sekvence z izolátu CH46-23, obrázek 2J (číslo identifikace sekvence 10) je sekvence z izolátu CH1-1, obrázek 2K (číslo identifikace sekvence 11) je sekvence z izolátu CH1-6, obrázek 2L (číslo identifikace sekvence 12) je sekvence z izolátu CH2-8, obrázek 2M (číslo identifikace sekvence 13) je sekvence z izolátu CH2-10, obrázek 2N (číslo identifikace sekvence 14) je sekvence z izolátu CH2-11C, obrázek 20 (číslo identifikace sekvence 15) je sekvence z izolátu CH5-13, obrázek
-22 CZ 308201 B6
2P (číslo identifikace sekvence 16) je sekvence z izolátu CH7-22, obrázek 2Q (číslo identifikace sekvence 17) je sekvence z izolátu CH13-27, obrázek 2R (číslo identifikace sekvence 18) je sekvence z izolátu CH14-33, obrázek 2S (číslo identifikace sekvence 19) je sekvence z izolátu CH62-2, obrázek 2T (číslo identifikace sekvence 20) je sekvence z izolátu CH64-2 a obrázek 2U (číslo identifikace sekvence 21) je sekvence z izolátu CH67-2.
Obrázky 11A až 11Z (čísla identifikace sekvence 62 až 87 znázorňují sekvence DNA z dalších 26 izolátu parvoviru B19, purifikované, amplifikované a sekvenované, jak se popisuje výše, odpovídající polohám nukleotidů 2936 až 3635 genomu parvoviru B19 jak popisují Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986) (fragment 700 bp znázorněný na obrázku 1 a popsaný výše). Obrázek 11A (číslo identifikace sekvence 62) je sekvence z izolátu CH80-1, obrázek 11B (číslo identifikace sekvence 63) je sekvence z izolátu CH81-3, obrázek 11C (číslo identifikace sekvence 64) je sekvence z izolátu B19SCL1-4, obrázek 11D (číslo identifikace sekvence 65) je sekvence z izolátu B19SCL2-1, obrázek 11E (číslo identifikace sekvence 66) je sekvence z izolátu B19SCL3-1, obrázek 11F (Číslo identifikace sekvence 67) je sekvence z izolátu B19SCL3-1, obrázek 11G (číslo identifikace sekvence 68) je sekvence z izolátu B19SCL5-2, obrázek 11H (číslo identifikace sekvence 69) je sekvence z izolátu B19SCL6-2, obrázek 111 (číslo identifikace sekvence 70) je sekvence z izolátu B19SCL7-3, obrázek 11J (číslo identifikace sekvence 71) je sekvence z izolátu B19SCL8-2, obrázek 11K (číslo identifikace sekvence 72) je sekvence z izolátu B19SCL9-1, obrázek 11L (číslo identifikace sekvence 73) je sekvence z izolátu B19SCL9-9, obrázek 11M (číslo identifikace sekvence 74) je sekvence z izolátu B19SCL10-2, obrázek 11N (číslo identifikace sekvence 75) je sekvence z izolátu B19SCL11-1, obrázek 110 (číslo identifikace sekvence 76) je sekvence z izolátu B19SCL12-1, obrázek 1 IP (číslo identifikace sekvence 77) je sekvence z izolátu B19SCL13-3, obrázek 1 IQ (číslo identifikace sekvence 78) je sekvence z izolátu B19SCL14-1, obrázek 1 IR (číslo identifikace sekvence 79) je sekvence z izolátu B19SCL15-3, obrázek 11S (číslo identifikace sekvence 80) je sekvence z izolátu B19SCL16-2, obrázek 11T (číslo identifikace sekvence 81) je sekvence z izolátu B19SCL17-1, obrázek 11U (číslo identifikace sekvence 82) je sekvence z izolátu B19SCL18-1, obrázek 11V (číslo identifikace sekvence 83) je sekvence z izolátu B19SCL19-1, obrázek 11W (číslo identifikace sekvence 84) je sekvence z izolátu B19SCL20-3, obrázek 11X (číslo identifikace sekvence 85) je sekvence z izolátu B19SCL21-3, obrázek 11Y (číslo identifikace sekvence 86) je sekvence z izolátu B19SCL22-11, obrázek 11Z (číslo identifikace sekvence 87) je sekvence z izolátu B19SCL2-14.
Srovnání sekvencí ukazuje zhruba 98% až 99,5% sekvenční homologii této sekvence 700 bp mezi různými izoláty.
Obrázky 3 A až 3 C (číslo identifikace sekvence 22) ukazují sekvenci pro fragment zhruba 4,7 kbp PCR znázorněný na obrázku 1 a popsaný výše pro klon 2-B1 parvoviru B19. Sekvence znázorněná na obrázcích je nukleotidový fragment 4677 odpovídající polohám nukleotidu 217 až 4893 podle Shade a kol., J. Virol., 58. 921 - 936 (1986). Znázorněná sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec plné délky parvoviru B19 kódující NS1, VP1 a VP2 plus další nepřeložené sekvence 5' a 3'. Sekvenovaný fragment obsahuje další nukleotid v nekódovací oblasti 5' mezi nukleotidovými polohami 367 a 368 sekvence B19, jak popisuje Shade a kol., J. Virol., 58. 921 -936(1986).
Obrázky 4A až 4C (číslo identifikace sekvence 23) ukazují sekvenci pro fragment zhruba 4,7 kbp PCR znázorněný na obrázku 1 z klonu 2-B6 parvoviru B19. Sekvence představuje fragment nukleotidu 4677 odpovídající polohám nukleotidu 217 až 4893, jak popisuje Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986). Znázorněná sekvence obsahuje otevřený čtecí rámec plné délky parvoviru B19 kódující NS1, VP1 a VP2 plus další nepřeložené sekvence 5' a 3'. Sekvenovaný fragment obsahuje další nukleotid v nekódovací oblasti 5' mezi polohami nukleotidu 367 a 368 sekvence B19, jak popisuje Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936(1986).
-23 CZ 308201 B6
Příklad 4
Klonování a exprese rekombinantních proteinů NS1, VP1 a VP2 parvoviru B19
Fragmenty kódující NS1, VP1 a VP2 (viz obrázek 1) se amplifikují s použitím fragmentu 4,7 kb parvoviru B19 klonovaného do pCR2.1-TOPO (popsaného výše). Konkrétně se primery PCR (viz níže) vybírají pro PCR z oblastí NS1, VP1 a VP2 parvoviru B19. Pro usnadnění klonování těchto oblastí se do restrikčních míst expresních vektorů kvasinek Xbal, HindlII a Sáli zavádějí primery podle požadavků.
Primery používané pro klonování a amplifikaci fragmentů parvoviru B19 pro expresi rekombinantní ch proteinů NS1, VP1 a VP2 kvasinek se zakládají na sekvencích obdržených výše a jsou to následující primery:
NS1-5 (primer téhož smyslu)
5' ATACTCTCTAGACAAAACAAAATGGAGCTATTTAGAGGGGTGCTO AAGTTTCT- 3' (číslo identifikace sekvence 44)
NS1-3 (primer opačného smyslu)
5' GAGTATGTCGACTTACTCATAATCTACAAAGCTTTGCAATCCAGACAG3' (číslo identifikace sekvence 45)
5' ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGAGTAAAGAAAGTGGCAAATGGTGGGAAAGT3' (číslo identifikace sekvence 46)
5' GAGTATGTCGACTTACAATGGGTGCACACGGCTTTTGGCTGTCCACAATTC3' (číslo identifikace sekvence 47)
ATACTCAAGCTTACAAAACAAAATGACTTCAGTTAATTCTGCAGAAGCCAGCA-
CT3 (číslo identifikace sekvence 48)
PCR se syntetizují, purifikují a suspendují ve 300 pl dH2O a stanoví se jejich optické hustoty při 260 nm. Reakční směs obsahuje 0,25 ng templátu, 100 pmol každého primeru, po 10 μΐ 1,25 mM každého dNTP a 1 jednotku Taq polymerázy (Perkin Elmer, Boston, MA) v konečném objemu 50 μΐ. Podmínky amplifikace jsou 94 °C po dobu 1 min, 50 °C po dobu 2 min a 68 °C po dobu 4 min po 35 cyklů. Pro zajištění plné extenze fragmentů se přidává dodatečná inkubace 7 min při teplotě 75 °C. Pro ověření PCR syntézy elektroforézou na 1% agarovém gelu se používají alikvóty 5 μΐ. Celkový produkt PCR se poté podrobí elektroforéze a fragmenty vykazující očekávané rozměry se purifikují z gelů s použitím purifikační soupravy PCR Purification (Promega) podle návodů dodavatele. Zhruba 0,8 pg purifikované PCR DNA se digeruje s příslušnými restrikčními enzymy (Roche) po dobu 3 h a 37 °C a produkty se dále purifikují použitím purifikační soupravy Promega PCR Purification.
Plazmid pBS24.1 se používá pro heterologní expresi rekombinantní ch proteinů parvoviru B19. Tento kvasinkový expresní vektor obsahuje sekvence 2 μ a invertované opakované motivy (IR) pro autonomní replikaci v kvasinkách, terminátor α-faktoru pro zajištění ukončení transkripce a leu2-d a URA3 kvasinek pro selekci. Původ replikace ColEl a β-laktamasový gen jsou rovněž
-24 CZ 308201 B6 přítomné pro šíření a selekci v E. coli (Pichuantes a kol. (1996) „Expression of Heterologous Gene Products in Yeast“. V: Protein Engineering: A Guide to Design and Production, kapitola 5. J. L. Cleland a C. Craik, red., Wiley-Liss, Inc., New York, N. Y. str. 129 - 161. PlazmidpBS24.1 se digeruje BamHI/Sall a defosforyluje s 10 jednotkami alkalické fosfatasy telecího střeva (Boheringer Manhaeim, Indianapolis, IN) za podmínek doporučených dodavatelem. Digerované a purifikované fragmenty PCR se smísí s pB524.1 digerovaným BamHI/SalI, a s fragmentem DNA obsahujícím hybridní promotor kvasinek ADH2/GAPDH (Cousens a kol., Gene, 61, 265 - 275 (1987)) digerovaný buď BamHI/SfuI nebo BamHI/HindlII v závislosti na restrikčních místech přítomných ve fragmentech PCR, které se mají klonovat. Ligace se provede soupravou Roche Rapid Ligation podle návodu v této soupravě. Ligační směs se poté použije pro transformaci HB101 kompetentních buněk E. coli a transformanty se selektují na mističkách Luria-Broth obsahujících ampicilin o koncentraci 100 pg/ml po inkubaci přes noc při teplotě 37 °C. Pro každou transformaci se vybere několik kolonií a očkuje do 3 ml Luria-Broth s ampicilinem o koncentraci 100 pg/ml a inkubuje za třepání při teplotě 37 °C přes noc.
DNA plazmidu se připraví s použitím 1,5 ml kultur a soupravy QIAprep Miniprep (QIAGEN). Rekombinační klony se identifikují analytickou restrikční enzymovou analýzou s BamHI-SalI. Přípravy rekombinantních plazmidů ve velkém měřítku se provedou pro sekvenování k ověření nukleotidové sekvence fragmentů klonovaného parvoviru B19.
Expresní plazmidy kvasinek vykazující očekávanou sekvenci pro NS1, VP1 a VP2 se použijí pro transformaci kvasinek následujícím způsobem. Kompetentní buňky AD3 Saccharomyces cerevisiae [Mat a, trpl+, ura3-52, prbl-1122, pep4-3, prcl-407, [cir°],::pDM15(pGAP/ADRl::G418R)], leu2(AAD)] se transformují plazmidovými DNA kódujícími NS1, VP1 nebo VP2 klonovanými, jak se popisuje výše. Volba kvasinkových rekombinantních složek se dosáhne dvěma průběhy na uracil-deficientních mističkách s následujícím jedním průběhem na leucin-deficientních mističkách po inkubaci při teplotě 30 °C po dobu 48 až 72 h. Kultury poté rostou v leucin-deficientním médiu a poté v YEP obohaceném 2 % glukosy (Pichuantes a kol., Proteins: Struct. Funct. Genet, 6, 324 - 337 (1989)) po dobu 48 h před ověřením exprese rekombinantních proteinů.
Sekvence pro různé proteiny ze dvou různých izolátu ukazují obrázky 5 až 10. Konkrétně obrázky 5A (číslo identifikace sekvence 24) a 5B (číslo identifikace sekvence 25) ukazují NS1 nukleotidové respektive proteinové sekvence z klonu 2-B1 parvoviru B19. Obrázky 6A (číslo identifikace sekvence 26) a 6B (číslo identifikace sekvence 27) ukazují nukleotidové respektive proteinové sekvence VP1 z klonu 2-B1 parvoviru B19. Obrázky 7A (číslo identifikace sekvence 28) a 7B (číslo identifikace sekvence 29) ukazují sekvence nukleotidu respektive proteinu VP2 z klonu 2-B1 parvoviru B19. Obrázky 8A (číslo identifikace sekvence 30) a 8B (číslo identifikace sekvence 31) ukazují sekvence nukleotidu respektive proteinu NS1 z klonu 2-B1 parvoviru B19. Obrázky 9A (číslo identifikace sekvence 32) a 9B (číslo identifikace sekvence 33) ukazují sekvence nukleotidu respektive proteinu VP1 z klonu 2-B6 parvoviru B19. Obrázky 10A (číslo identifikace sekvence 34) a 10B (číslo identifikace sekvence 35) ukazují sekvence nukleotidu respektive proteinu VP2 z klonu 2-B6 parvoviru B19.
Příklad 5
Detekce a kvantitativní vyhodnocení DNA parvoviru B19 pomocí TaqMan™
Selektivní diagnostický způsob pro detekci infekce parvovirem B19 se navrhuje následujícím způsobem. Konkrétně se použije způsob PCR TagMan™ pro detekci a kvantitativní vyhodnocení DNA parvoviru B19. Kvantitativní PCR vyžaduje účinnou extrakci nukleové kyseliny. Objem krevní plazmy/krevního séra použitého pro extrakci DNA rovněž ovlivňuje citlivost detekce. Používají se dva způsoby pro izolaci nukleové kyseliny z 0,5 ml plazmy/séra. Konkrétně se DNA extrahuje (a) vazbou na silikagel a (b) anelováním na cílově specifické oligonukleotidy.
-25 CZ 308201 B6 (a) Izolace nukleové kyseliny vazbou na silikagel
Za přítomnosti vysokých koncentrací chaotropní soli, jako je guanidinium-isothiokyanát, se nukleové kyseliny vážou na silikagel. Nukleové kyseliny o malé velikosti molekuly se vážou na silikagel účinněji za podmínek kyselého pH. Vázané nukleové kyseliny se účinně eluují v alkalickém pufru s nízkým obsahem solí při vysokých teplotách. Použití magnetizovaných kuliček místo obvyklého silikagelu značně usnadňuje promývací a eluční kroky izolace nukleových kyselin. Magnetická fáze se používá pro zachycení částic silikagelu s navázanou nukleovou kyselinou, čímž se eliminuje centrifugace požadovaná pro sedimentaci běžných částic silikagelu. Pufr pro rozrušení struktur pochází od Organon-Teknika (Durham, NC). Tento purf obsahuje guanidinium-isothiokyanát pro solubilizaci proteinů a inaktivní RNAsy a DNAsy. Detergent Triton X-100 dále usnadňuje solubilizaci a rozbití buněčných struktur a nukleárních proteinů, čímž se uvolňuje nukleová kyselina. Činidlo pro rozrušení struktur se okyselí pro zvýšení vazby nukleové kyseliny a použije se 50 pl alkalického elučního pufru pro eluci vázané nukleové kyseliny. Po izolaci nukleové kyseliny se stanoví přítomnost DNA parvoviru provedením způsobu TaqMan™ PCR, jak se popisuje níže.
(b) Izolace nukleové kyseliny anelováním cílově specifických oligonukleotidu
I když použití magnetizovaných silikagelových kuliček značně usnadňuje rychlé a snadné zpracování v průběhu promývacích a elučních kroků, je izolace nukleové kyseliny stále pracná a časově náročná. Proto se používá jednostupňový záchyt specifické cílové nukleové kyseliny z krevní plazmy nebo krevního séra pomocí magnetických kuliček. Aby tento krok byl použitelný pro široké rozmezí zkoušek zachycení virových nukleových kyselin, používají se generické magnetické kuličky spojené s oligo dT. Magnetické oligo (dT) kuličky Sera-Mag (Seradyn, Indianapolis, IN) s oligo dT délky Hmerů se používají v kombinaci se záchytovými oligonukleotidy obsahujícími 20 póly A' při konci 3' přiléhajícím k použité sekvenci specifické pro parvovirus (určené při konci níže popsané sekvence).
Záchytové oligonukleotidy opačného smyslu se odvozují od fragmentu 700 bp a jsou to následující oligonukleotidy:
VSPC1 ~ AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATCCrrAAC-AGCAATTTCTGATA (nt 3492 až 3514)(*) (číslo identifikace sekvence 49)
VS.PC2 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACGCCCTGTAGTGCTGTCAG (nt 3549 až
3568) (číslo identifikace sekvence 50)
VSPC3 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATACCCAAATAGGAAGTTCTG (nt 3639 až 3660) (číslo identifikace sekvence 51)
VSPC4 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAATGCTGATTCTTCACTTGC (nt 3737 až 3759) (číslo identifikace sekvence 52)
VSPC5 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAATGCTGTACCTCCTGTACCTA (nt 3789 až
3808) (číslo identifikace sekvence 53)
-26 CZ 308201 B6
VSPC6 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCCCTCTAAATTTTCTGGG (nt 3838 až
38.57) (číslo identifikace sekvence 54)
VSPC7 - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCCTAATGTGTCAGGAACC (ní 3910 až
3929) (číslo identifikace sekvence 55) (*) Číslování nukleotidů je podle Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986).
Magnetické kuličky se suspendují v pufru pro rozpuštění struktur Novagen (Madison, WI) a řada sedmi záchytových oligonukleotidu (VSPC1 až VSPC7 popsaných výše) se testuje individuálně nebo v kombinaci pro zachycení parvoviru B19 DNA z panelu FD A Center for Biologie Evaluation and Research, U.S. Department of Health and Human Services (FDA - CBER).
(c) Promývání kuliček promývacím pufrem
Po zachycení se kuličky promyjí s pufrem obsahujícím 10 mM Hepes, pH 7,5 v 0,3M NaCl a 0,5 % NP-40. Po zpracování séra pufrem pro rozpuštění struktur, hybridizací, magnetické adsorpci kuliček a odstranění pufru pro zachycení struktur se ke kuličkám přidá 1,5 ml promývacího pufru. Po obvyklém míchání vířivým pohybem, magnetické adsorpci a odstranění promývacího pufru se kuličky promyjí podruhé 0,5 ml téhož pufru, takže se mohou zhustit pro snadnou suspenzi ve 100 ml univerzálního pufru PCR obsahujícího všechny složky pro Taqmanovu zkoušku. Kuličky se zachycenou DNA se převedou na destičku TaqMan pro detekci PCR TaqMan, jak se popisuje níže. Několik oligonukleotidových kombinací je účinných při zachycení B19, jak detekuje zkouška TaqMan™.
Způsob TaqManTM jmenovitě zachycuje značenou cílovou nukleovou kyselinu jako amplikony DNA. Alternativou je amplifikace zachycené cílové látky jako RNA. Pro tento účel oligonukleotidy amplifikace obsahují primer specifický pro parvovirus B19 s promotorovou sekvenci T7 pro tvorbu amplikonu RNA RNA polymerázou T7. Amplifikační primery (VSA1A3 popisované níže) odvozené od sekvence 700 bp odpovídající nukleotidům 2936 až 3635 genomu parvoviru B19 popisované v Shade a kol., J. Virol., 58, 921 - 936 (1986) se testují ohledně jejich schopnosti amplifikace. Používají se následující primery:
Primery amplifikace vlákna stejného smyslu
VSA1 - AA.TTCTAA.TACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCATATACTCATTGGACT~GT ínt 2942 až 2961) (číslo identifikace sekvence 56)
VSA2 - AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCCAGAGCACCATTATAA (nt
72 až 32 88'* (číslo identifikace sekvence 57)
VSA3 - AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAAGGCACAATGCCAGTGTGGAAA (nt 3317 až 3333) (číslo identifikace sekvence 58)
-27 CZ 308201 B6
VSP2 - GTGCTGAAACTCTAAAGGT (primer opačného smyslu - nt
3424 až 3442) (číslo identifikace sekvence 59)
Reakční složky soupravy RNamplifire (Qiagen) se používají pro zjišťování účinnosti amplifikace s použitím 50 kopií parvoviru DNA jako cíle v konečném objemu 20 ml. Amplifikační primery se testují jednotlivě nebo v kombinaci s použitím VSP2 jako druhého primeru. Po 1 h inkubace při teplotě 42 °C podle doporučení výrobce se alikvót amplifikovaného materiálu zředí lOOkrát pro detekci zkouškou TaqMan™ pro vyhodnocení účinnosti amplifikačních primeru. Kombinace dvou amplifikačních primeru VSA2 a VSA3 s VSP2 je vysoce účinná při tvorbě amplikonu RNA.
Citlivost zkoušky TaqMan™, vhodnost PCR primeru a optimální reakční podmínky se stanoví použitím DNA plazmidu s obsahem výše popsaného fragmentu 4,7 kb. Tento fragment zahrnuje oblast VP1, stejně tak jako oblasti NS1 a VP2 (viz obrázek 1). Používají se amplifikační primery odvozené od oblasti VP1, jak se popisuje podrobně níže. Číslování je podle autorů Shade a kol., J. Virol., 58. 921 - 936 (1986). X znázorňuje 5'-fluorescein fosforamidit a Z DABCYL-dT, obě látky se obdrží od Glen Research Corporation, Sterling, VA. Čísla po pravé straně sekvence udávají nukleotidy v příměrech ze sekvence parvoviru B19.
VSF1 - GGAGGCMAGGTTTGCA (primer téhož smyslu nt 3334 až,
3 5 0) (číslo identifikace sekvence 60 = SEQ ID NO: 60)
VSPŽ ~ GTGCTGAAACTCTAAAGGT (primer opačného smyslu - nt
3424 až .3442) (číslo identifikace sekvence 59)
V5PPR1 ~ XCCCATGGAGATATTTAGATTZ {sonda - nt 3379 až 3398) (číslo identifikace sekvence 61)
Vpara
TCCATATGACCCAGAGCACCA (nt 3262 až 3282) (číslo identifikace sekvence 88)
Vpara 9: TTTCCACTGGCATTGTGGC (přiměř opačného smyslu - nt
3315 až 3333) (číslo identifikace sekvence 89)
VparalO: XAGCTAGACCTCKIATGTCACTGZ, kde X je Fam a 3 je
Tamra (nt 3286 až 3310) (číslo identifikace sekvence 90)
Koncentrace DNA plazmidu se určí spektrofotometricky a provede se sériové zředění s obdržením 5000 až 10kopií/20 pl. Reakční směs v konečném objemu 50 μΐ obsahuje 20 μΐ vzorku, 1 x Gold Taq amplifikační pufr (Perkin Elmer) s 3,2 mM chloridu horečnatého, po 300 μΜ každého dNTP, 1 pmol každého z amplifikačních primeru, 0,4 pmol sondy a 1 jednotku enzymu AmpliTaq. Reakční podmínky jsou 10 min při teplotě 90 °C pro aktivaci enzymů s následujícími 45 cykly 30 s při 95 °C střídavě s 60 °C v sekvenčním detektoru ABI 7700.
-28 CZ 308201 B6
Při použití páru primeru VSP1 a VSP2 generujících produkt PCR 109 bp a sondy VSPPR1 lze detekovat pouhých 10 kopií/zkouška. Jelikož objem vzorkuje 20 pl, v konečném objemu 50 pl, ukazuje se, že lze způsobem TaqManTM extrahovat a detekovat vzorky krevní plazmy obsahující pouhých 50 kopií/ml DNA parvoviru B19. Jelikož parvovirus je virus s vysokým titrem, lze extrahovat a užívat pro analýzu objemy krevní plazmy/séra 50 pl.
Při použití vzorku pozitivního na DNA parvoviru B19 FDA-CBER (106 kopií/ml) detekuje způsob TaqManTM již 50 kopií na zkoušku. S cílem korelovat nukleovou kyselinu s imunitním titrem se množství DNA vyjadřuje kvantitativně v několika vzorcích pozitivních na protilátku.
Popisují se tedy nové sekvence parvoviru B19 a detekční zkoušky s použitím těchto sekvencí.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob detekce infekce lidským parvovirem B19 v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) izolování nukleové kyseliny z biologického vzorku s podezřením na obsah DNA lidského parvoviru B19, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje cílovou sekvenci;(b) amplifíkaci cílové sekvence pomocí nukleokyselinové polymerázy mající nukleázovou aktivitu ve směru od 5' k 3', dvojice primeru schopných hybridizace k cílové sekvenci a oligonukleotidovou sondu navrženou tak, aby hybridizovala k 3'vzhledem k jednomu z primeru v amplifikační sekvenci, kde (i) uvedená dvojice primeru sestává ze sense primeru SEQ ID NO: 88 a antisense primeru SEQ ID NO: 89;(ii) 5-konec sondy obsahuje fluorescenční reportérové barvivo a 3-konec sondy je blokován za účelem zabránění extenze sondy a obsahuje barvivo, které zháší fluorescenci 5fluoroforu;(iii) během amplifíkace polymeráza štěpí oligonukleotidovou sondu, když tato je hybridizovaná k cílové sekvenci, čímž dochází k oddělení molekuly reportéru od molekuly zhášeče; a (iv) při provádění amplifíkace se monitoruje fluorescence molekuly reportéru, přičemž fluorescence odpovídá tomu, že došlo k amplifíkaci nukleové kyseliny.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že reportérem je fluorescenční barvivo.
- 3. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že zhášečem je rhodaminové barvivo.
- 4. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že uvedená nukleokyselinová polymeráza je Thermus aquaticus - Taq polymeráza.
- 5. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že krok izolace zahrnuje anelaci nukleové kyseliny k cílově specifickému vychytávacímu oligonukleotidu, přičemž tento vychytávací oligonukleotid má polynukleotidovou sekvenci vybranou ze SEQ ID NO: 49 až 55.-29 CZ 308201 B6
- 6. Způsob detekce infekce lidským parvovirem B19 v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje (a) izolování nukleové kyseliny z biologického vzorku s podezřením na obsah DNA lidského parvoviru B19, kde uvedená nukleová kyselina obsahuje cílovou sekvenci;(b) reakci izolované nukleové kyseliny parvoviru B19 s prvním oligonukleotidem, který zahrnuje první primer obsahující komplexační sekvenci dostatečně komplementární k 3'-koncové části cílové sekvence, aby se s ní komplexoval, přičemž uvedený první primer dále zahrnuje promotor pro DNA-dependentní RNA polymerázu 5' a je operabilně vázaný ke komplexační sekvenci, přičemž reakce se provádí za podmínek zajišťujících tvorbu komplexu oligonukleotid/cílová sekvence a zahájení syntézy DNA;(c) extenzi prvního primem při extenzní reakci s použitím cílové sekvence jakožto templátu, za vzniku prvního produktu extenze DNA primem komplementárního k cílové sekvenci;(d) reakci produktu extenze DNA primem s druhým oligonukleotidem, který zahrnuje dmhý primer obsahující komplexační sekvenci dostatečně komplementární k 3'-koncové části produktu extenze DNA primem, aby se s ní komplexoval za podmínek, které zajišťují tvorbu komplexu oligonukleotid/cílová sekvence a zahájení syntézy DNA;(e) extenzi 3'-konce dmhého primem při DNA extenzní reakci za vzniku dmhého produktu extenze DNA primem, čímž vznikne templát pro DNA-dependentní RNA polymerázu;(f) použití uvedeného templátu pro produkci více kopií RNA cílové sekvence s použitím DNAdependentní polymerázy, která rozpozná sekvenci promotom; a (g) autokatalytické opakování kroků (b) až (f) s použitím kopií z kroku (f) za účelem amplifíkace cílové sekvence, přičemž první a dmhý primer má polynukleotidovou sekvenci ze SEQ ID NO: 88 a 89.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že dále zahrnuje následující kroky:(i) přidání označené oligonukleotidové sondy k produktu z kroku (f), přičemž tato oligonukleotidová sonda je komplementární k části cílové sekvence za podmínek, které zajišťují hybridizaci sondy k cílové sekvenci za vzniku komplexu sondaxilová sekvence; a (j) detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti značky jakožto indikátom přítomnosti nebo nepřítomnosti cílové sekvence.
- 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že značkou je akridiniový ester.
- 9. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dále zahrnuje poskytnutí vnitřní kontroly.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že vnitřní kontrola zahrnuje SEQ ID NO: 90.
- 11. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že umožňuje detekci DNA B19 ve viremických vzorcích, které mají virové titry sníženy až na 103 virových částic/ml.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US30207701P | 2001-06-28 | 2001-06-28 | |
| US36595602P | 2002-03-19 | 2002-03-19 | |
| US36922402P | 2002-03-29 | 2002-03-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20033516A3 CZ20033516A3 (cs) | 2005-02-16 |
| CZ308201B6 true CZ308201B6 (cs) | 2020-02-26 |
Family
ID=28794978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003-3516A CZ308201B6 (cs) | 2001-06-28 | 2002-06-28 | Diagnostické zkoušky pro parvovirus B19 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6936442B2 (cs) |
| EP (1) | EP1537235B1 (cs) |
| JP (5) | JP2005511004A (cs) |
| KR (2) | KR100888377B1 (cs) |
| CN (1) | CN1324147C (cs) |
| AU (2) | AU2002318450B2 (cs) |
| BG (1) | BG66283B1 (cs) |
| BR (1) | BRPI0211191B8 (cs) |
| CA (2) | CA2451756A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ308201B6 (cs) |
| ES (1) | ES2537549T3 (cs) |
| HK (1) | HK1080516B (cs) |
| HU (1) | HU230244B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA03011802A (cs) |
| NO (1) | NO337901B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ530602A (cs) |
| PL (1) | PL210849B1 (cs) |
| RU (1) | RU2301263C2 (cs) |
| SK (1) | SK15752003A3 (cs) |
| WO (1) | WO2003002753A2 (cs) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003020742A1 (en) | 2001-08-31 | 2003-03-13 | Gen-Probe Incorporated | Assay for detection of human parvovirus b19 nucleic acid |
| US8242254B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-08-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| WO2005071401A2 (en) * | 2004-01-15 | 2005-08-04 | Chiron Corporation | Homogeneous multiplex assay for nucleic acid targets |
| US20060057643A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Mccarthy Laurence R | Methods and compositions for detecting erythrovirus genotypes |
| WO2006137939A2 (en) * | 2004-11-09 | 2006-12-28 | Gen-Probe Incorporated | Compositions and methods for detecting group a streptococci |
| US7572584B2 (en) * | 2005-06-02 | 2009-08-11 | The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency | Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment |
| US8058000B2 (en) * | 2005-06-02 | 2011-11-15 | The United States Of America As Represented By The U.S. Environmental Protection Agency | Species-specific primer sets and identification of species-specific DNA sequences using genome fragment enrichment |
| DE102006034844B3 (de) * | 2006-07-27 | 2007-12-06 | DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH | Zusammensetzungen und Verfahren zur Amplifikation von Hepatitis A-Viren (HAV) und/oder Parvoviren B19 (PB19) mittels Multiplex-PCR |
| CA2673770A1 (en) | 2007-01-16 | 2008-07-24 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Human erythrovirus |
| NZ582019A (en) * | 2007-06-14 | 2012-07-27 | Univ Oklahoma State | Vaccines containing canine parvovirus genetic variants |
| US8227583B2 (en) * | 2007-06-14 | 2012-07-24 | The Board Of Regents For Oklahoma State University | Vaccines containing canine parvovirus genetic variants |
| WO2009038840A2 (en) * | 2007-06-14 | 2009-03-26 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious contaminant viruses |
| KR101061009B1 (ko) * | 2008-07-23 | 2011-09-01 | 경상대학교산학협력단 | 바이러스 진단 방법 및 시스템 |
| EP3257859B1 (en) | 2009-02-26 | 2020-09-23 | Gen-Probe Incorporated | Assay for detection of human parvovirus nucleic acid |
| US9598739B1 (en) | 2009-03-13 | 2017-03-21 | Grifols Therapeutics Inc. | Human erythrovirus |
| US9744228B2 (en) | 2010-04-07 | 2017-08-29 | Norvartis Ag | Method for generating a parvovirus B19 virus-like particle |
| EP3009522B1 (en) | 2011-07-15 | 2019-09-04 | Gen-Probe Incorporated | Method for detecting hepatitis a virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays |
| CN103451320B (zh) * | 2013-08-09 | 2015-05-06 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 人细小病毒B19三种基因型的实时荧光定量PCR检测方法及其通用检测引物、TaqMan探针与试剂盒 |
| US9410172B2 (en) * | 2013-09-16 | 2016-08-09 | General Electric Company | Isothermal amplification using oligocation-conjugated primer sequences |
| CN110845581A (zh) | 2014-03-10 | 2020-02-28 | 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 | 用于治疗(包括预防)细小病毒感染及相关疾病的组合物和方法 |
| CN103820581B (zh) * | 2014-03-17 | 2016-01-13 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 一种检测人细小病毒b19的试剂盒和方法 |
| JP6414409B2 (ja) * | 2014-07-29 | 2018-10-31 | 株式会社微生物化学研究所 | 弱毒化パルボウイルスおよび弱毒化パルボウイルスを用いたワクチン |
| WO2016071926A1 (en) * | 2014-11-05 | 2016-05-12 | Indian Council Of Medical Research | In-vitro detection of human parvovirus 4 |
| TWI735433B (zh) * | 2015-03-27 | 2021-08-11 | 美商再生元醫藥公司 | 偵測生物污染物之組成物及方法 |
| CN105158471A (zh) * | 2015-08-24 | 2015-12-16 | 北京中检安泰诊断科技有限公司 | 人细小病毒B19型IgM抗体检测试剂盒及其制备方法 |
| CN114410836B (zh) * | 2021-12-17 | 2024-03-01 | 上海交通大学医学院附属仁济医院 | 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法 |
| CN116769971A (zh) * | 2023-07-24 | 2023-09-19 | 苏州天隆生物科技有限公司 | 检测人细小病毒b19的双靶标引物探针组、试剂盒及检测方法 |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5516630A (en) | 1983-09-30 | 1996-05-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Methods of detecting hepatitis A virus |
| US5283174A (en) | 1987-09-21 | 1994-02-01 | Gen-Probe, Incorporated | Homogenous protection assay |
| CA2020958C (en) * | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| NL8902301A (nl) | 1989-09-14 | 1991-04-02 | Rijksuniversiteit | Humaan parvovirus b19 eiwitten, hun produktie en hun gebruik in diagnostische assays en vaccins. |
| US6379885B1 (en) * | 1989-09-14 | 2002-04-30 | Rijksuniversiteit Te Leiden | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| US6204044B1 (en) * | 1989-09-14 | 2001-03-20 | Caroline Sarah Brown | Human parvovirus B19 proteins and virus-like particles, their production and their use in diagnostic assays and vaccines |
| DE4003826C2 (de) | 1990-02-08 | 1995-11-23 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Peptide der Kapsidproteine VP1 oder VP2 des Parvovirus B19 |
| WO1994010294A1 (en) | 1992-10-23 | 1994-05-11 | New York University | Human monoclonal antibodies to human parvovirus and methods of making and using thereof |
| US5449608A (en) | 1993-03-22 | 1995-09-12 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Parvovirus B19 receptor and parvovirus B19 detection |
| JPH06293798A (ja) | 1993-04-06 | 1994-10-21 | Shin Etsu Chem Co Ltd | ヒトパルボウイルスｂ１９のエピトープ関連ペプチド |
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| AU3698595A (en) | 1994-09-22 | 1996-04-09 | Hans Wolf | Dna sequence and protein of the non-structural reading frame i of the human parvovirus b19 |
| US6004044A (en) * | 1995-05-03 | 1999-12-21 | Itt Cannon, Inc. | Optoelectric connector |
| JPH0910000A (ja) | 1995-06-26 | 1997-01-14 | Nippon Sekijiyuujishiya | ヒトパルボウイルスの検出方法及びそのための試薬 |
| WO1997018327A1 (fr) * | 1995-11-13 | 1997-05-22 | Shionogi & Co., Ltd. | Diagnostic des maladies associees aux spasmes coronariens |
| AU6267596A (en) | 1995-12-14 | 1997-07-03 | Steritech, Inc. | Inactivation of non-enveloped virus |
| US6094338A (en) * | 1997-07-09 | 2000-07-25 | Mitsubishi Chemical Corporation | Electric double-layer capacitor |
| WO1999018227A1 (en) | 1997-10-08 | 1999-04-15 | Advanced Research And Technology Institute | Chimeric parvovirus-based recombinant vector system that specifically targets the erythroid lineage |
| DE19752898A1 (de) | 1997-11-28 | 1999-08-05 | Centeon Pharma Gmbh | Verfahren zum Nachweis hoher Vierenkonzentrationen im Blutplasma und/oder Blutserum mittels der Polymerasekettenreaktion |
| CA2318880C (en) * | 1998-02-04 | 2010-07-27 | Applied Biosystems, Llc | Determination of a genotype of an amplification product at multiple allelic sites |
| RU2146372C1 (ru) * | 1998-04-16 | 2000-03-10 | Гематологический научный центр РАМН | Способ определения парвовируса б19 |
| US6238860B1 (en) * | 1998-11-05 | 2001-05-29 | Dyax Corp. | Binding moieties for human parvovirus B19 |
| US6642033B1 (en) | 1999-07-20 | 2003-11-04 | V.I. Technologies, Inc. | Nucleic acids for detecting parvovirus and methods of using same |
| AU781570B2 (en) * | 1999-07-23 | 2005-06-02 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide amplification method |
-
2002
- 2002-06-28 ES ES02748013.6T patent/ES2537549T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-28 RU RU2004102205/13A patent/RU2301263C2/ru active
- 2002-06-28 EP EP02748013.6A patent/EP1537235B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-28 CA CA002451756A patent/CA2451756A1/en not_active Abandoned
- 2002-06-28 WO PCT/US2002/020684 patent/WO2003002753A2/en not_active Ceased
- 2002-06-28 PL PL368049A patent/PL210849B1/pl unknown
- 2002-06-28 HK HK06100271.4A patent/HK1080516B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-06-28 AU AU2002318450A patent/AU2002318450B2/en not_active Ceased
- 2002-06-28 CZ CZ2003-3516A patent/CZ308201B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-06-28 MX MXPA03011802A patent/MXPA03011802A/es active IP Right Grant
- 2002-06-28 CA CA2779653A patent/CA2779653C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-06-28 CN CNB028128168A patent/CN1324147C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-28 NZ NZ530602A patent/NZ530602A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-06-28 KR KR1020037017171A patent/KR100888377B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-28 JP JP2003508717A patent/JP2005511004A/ja active Pending
- 2002-06-28 HU HU0600779A patent/HU230244B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-06-28 SK SK1575-2003A patent/SK15752003A3/sk unknown
- 2002-06-28 KR KR1020087029745A patent/KR100944674B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2002-06-28 BR BRPI0211191A patent/BRPI0211191B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-06-28 US US10/187,253 patent/US6936442B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-12-19 NO NO20035732A patent/NO337901B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-13 BG BG108526A patent/BG66283B1/bg unknown
-
2005
- 2005-05-23 US US11/135,189 patent/US20050221300A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-11-05 AU AU2007231822A patent/AU2007231822B2/en not_active Ceased
-
2008
- 2008-08-21 JP JP2008213329A patent/JP2009011324A/ja not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-11-11 JP JP2011247977A patent/JP2012075440A/ja not_active Withdrawn
-
2013
- 2013-12-27 JP JP2013271027A patent/JP6026401B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-07-28 JP JP2016148172A patent/JP2016182149A/ja not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Shade R. O. et al.: Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolated from the serum of a child during aplastic crisis 1986 J. Virol. 58(3):921-36 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6026401B2 (ja) | パルボウイルスｂ１９についての診断アッセイ | |
| US10801078B2 (en) | Methods and compositions for detecting BK virus | |
| AU2002318450A1 (en) | Diagnostic assays for parvovirus B19 | |
| EP2904120B1 (en) | Methods and reagents for detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses | |
| MXPA05006158A (es) | Identificacion de oligonucleotidos para la captura, deteccion y cuantificacion del virus del nilo occidental. | |
| CA2489346C (en) | Identification of oligonucleotides for the capture, detection and quantitation of hepatitis a viral nucleic acid | |
| AU2012261529B2 (en) | Methods and compositions for detecting BK virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20210628 |