SK302004A3 - Heterocyklické zlúčeniny a ich použitie ako inhibítory D-Ala-D-Ala ligázy - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predmetný vynález sa týka heterocyklických zlúčenín a ich použitia napríklad pri profylaxii a/alebo medicinálnej liečbe bakteriálnych infekcií a ich použitia napríklad ako antiseptických činidiel, sterilizačných činidiel alebo dezinfekčných činidiel.

Doterajší stav techniky

Patogénne procesy, pri ktorých mikroorganizmy negatívne pôsobia na dané subjekty, sú všeobecne zložité a vyžadujú definovanú sekvenciu dejov, ktoré zahrňujú viaceré mikrobiálne zložky. Pokiaľ sa uvedené procesy ponechajú bez kontroly, môže proliferácia organizmov poškodiť daný subjekt, čo môže viesť ku vyvinutiu chronickej infekcie alebo dokonca ku úmrtiu. Často je nevyhnutné podporiť obranné mechanizmy pomocou exogénnych faktorov, akými sú antibiotiká, za účelom odstránenia infekčného organizmu z daného subjektu.

Časom a čiastočne taktiež nerozvážnym použitím existujúcich antibiotických liečebných režimov sa organizmy stávajú stále viac rezistentné voči rôznym exogénnym faktorom, ktoré sú v súčasnej dobe k dispozícii. Tak napríklad bola opísaná rezistencia baktérií voči fluórchinolónom a β-laktámom, pričom je nanajvýš pravdepodobné, že počas nasledujúcej dekády táto rezistencia ešte vzrastie. V celosvetovom meradle vzrastá počet opísaných izolátov rezistentných na fluórchinolóny, ktoré spôsobujú infekčný zápal pľúc. Ďalej bol zaznamenaný vážny pokles citlivosti kmeňov E. coli na β-laktámy (akým je napríklad amoxicilín), pričom tento pokles je spôsobený prítomnosťou

256/B enzýmov R-TEm a ďalej pokles citlivosti kmeňov E. coli na kotrimoxazol a trimethoprim. Tieto správy sú len konkrétnymi príkladmi nutnosti a neustále požiadavky po objavení a vyvinutí nových antimikrobiálnych liečiv za účelom zaistenia alternatívnych a účinnejších liečebných režimov proti stále viac rezistentným mikroorganizmom.

Podstata vynálezu

Predmetný vynález sa týka heterocyklických zlúčenín, kompozícií zahrňujúcich tieto zlúčeniny a spôsobov použitia uvedených zlúčenín a uvedených kompozícií. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu a kompozície zahrňujúcej tieto zlúčeniny sú vhodné na liečenie ochorení alebo symptómov ochorení. Predmetom tohto vynálezu sú rovnako spôsoby prípravy zlúčenín podľa tohto vynálezu a spôsoby identifikácie zlúčenín s požadovanou biologickou aktivitou.

Predmetný vynález je založený na zistení, že niektoré heterocyklické zlúčeniny sú potenciálne biologicky aktívne, konkrétnejšie že vykazujú účinok proti enzýmu označovanému ako D-alanyl-D-Alanínligáza (ďalej len “D-Ala-DAla ligáza; E. C. 6.3.2.4). Ako je schematicky znázornené nižšie, predpokladá sa, že D-Ala-D-Ala ligáza zohráva kritickú úlohu pri raste bakteriálnej bunky, ktorá spočíva v katalýze syntézy D-alanyl-D-alanínu (ďalej len “D-Ala-D-Ala), čo je jeden zo stavebných blokov používaných na sieťovanie peptidoglykánu, ktorý je základom biosyntézy bakteriálnej bunkovej steny. Uvažuje sa, že uvedený enzým vytvára peptidovú väzbu, ktorá nakoniec po zosieťovaní peptidoglykánového štruktúrneho rámca poskytuje miesto transacylácie (viď. publikácia Ellsworth a spolupracovníci, Chemistry & biology, 1996, 3, 37-44). Bez nadväznosti na akúkoľvek teóriu týkajúcu sa mechanizmu účinku nových zlúčenín podľa predmetného vynálezu sa predpokladá, že tieto nové zlúčeniny sa viažu ku D-Ala-D-Ala ligáze v mieste, v ktorom dochádza ku viazaniu adenozíntrifosfátu (ATP) a nie v mieste, v ktorom dochádza ku viazaniu D-Ala, čo robí uvedené zlúčeniny kompetitívnymi k ATP. V tomto ohľade sa teda zlúčeniny podľa predmetného vynálezu líšia od ostatných inhibítorov D-Ala-D32 256/B

Ala ligázy, akými sú cykloserín a dipeptidfosfonátové analógy, čo sú kompetitívne inhibítory D-alanínu, o ktorých sa predpokladá, že sa viažu ku uvedenému enzýmu v mieste, v ktorom dochádza ku viazaniu D-alanínu.

Všeobecne sú predmetom tohto vynálezu vzorcov (I a II) zlúčeniny všeobecných

a ich použitie.

256/B

Jedným aspektom predmetného vynálezu je zlúčenina všeobecného vzorca

R³

kde

A a B môžu nezávisle na seba predstavovať atóm dusíka alebo skupinu CR⁷, kde

R⁷ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogéna/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu (akou je napríklad atóm vodíka, alebo substituovaná alebo nesubstituovaná, lineárna, rozvetvená alebo cyklická alkylová skupina, alkenylová skupina, alkinylová skupina, arylová skupina, aralkylová skupina alebo alkarylová skupina, alebo derivát jednej alebo viacerých z týchto skupín, v ktorom je jeden alebo viac atómov uhlíka a/alebo atómov vodíka nahradených heteroatómom (akými sú napríklad aminoskupiny, alkylaminoskupiny, hydroxylová skupina a alkoxylové skupiny, tiolové skupiny, halogény, nitroskupiny, fenolové skupiny alebo iné substituované aromatické alebo alifatické skupiny));

R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne skupiny všeobecného vzorca NR⁵R⁶ kde

R⁵ a R⁶ môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-obsahujúcu funkčnú skupinu;

256/B ♦ *

R je atóm vodíka, alkylová skupina, aminoskupina, hydroxylová skupina, alkoxylová skupina alebo alkylaminoskupina;

R⁴ predstavuje uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu; s tou podmienkou, že (1) pokiaľ obidve skupiny AaB predstavujú atómy dusíka a obidve skupiny R⁵ a R⁶ predstavujú atómy vodíka, potom skupina R⁴ nepredstavuje skupinu -NH₂, skupinu -N(H) (metyl), skupinu -N(H) (butyl), skupinu -N(H) (hexyl), skupinu -N(H) (fenyl), skupinu -N(H) (benzyl), skupinu -N(H) (NH₂), skupinu N(H) (CH₂CH₂OH), skupinu -N(CH₂CH₂OH)₂, fenylovú skupinu, Npiperadinylovú skupinu alebo skupinu -S(etyl);

(2) pokiaľ skupina A predstavuje skupinu CH, skupina B predstavuje atóm dusíka a obidve skupiny R⁵ a R⁶ predstavujú atómy vodíka, potom skupina R⁴ nepredstavuje metylovú skupinu, izobutylovú skupinu, fenylovú skupinu, 4-metylfenylovú skupinu, 4chlórfenylovú skupinu, 4-brómfenylovú skupinu, 2-(2,5dimetoxyfenyl)etylovú skupinu alebo skupinu -CH(OCH₃)₂; a (3) pokiaľ obidve skupiny AaB predstavujú skupiny CH, potom skupina R⁴ predstavuje aminoskupinu, ktorou nie je skupina -NH₂, (3,4- dichlórfenyl)metylaminoskupina alebo (3,4-dichlórfenyl) metyléniminoskupina.

V niektorých prípadoch predstavujú obidve skupiny R⁵ a R⁶ atómy vodíka.

Skupina R⁴ môže napríklad predstavovať substituovanú alebo nesubstituovanú, lineárnu, rozvetvenú alebo cyklickú alkylovú skupinu,

2 5 6/B alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, aralkylovú skupinu alebo alkarylovú skupinu. V niektorých prípadoch skupina R⁴ obsahuje aspoň jednu arylovú skupinu. Tak napríklad môže skupina R⁴ predstavovať niektorú z nasledujúcich skupín:

v ktorých môžu skupiny R⁸ až R¹² nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu (akou je napríklad lineárna alebo rozvetvená alkylová skupina).

V ďalšom prípade, keď skupina R⁴ obsahuje arylovú skupinu, je štruktúru zlúčeniny podľa tohto vynálezu možné opísať všeobecným vzorcom

256/B kde skupiny R⁸ až R¹⁶ môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu. Skupinou R⁹ potom môže byť napríklad atóm vodíka alebo metylová skupina.

V niektorých prípadoch potom je možné štruktúru zlúčeniny podľa tohto vynálezu vystihnúť všeobecným vzorcom

R¹⁷ kde n je 1,2, 3 alebo 4; a

R¹⁷ je skupina všeobecného vzorca -NR¹⁸R¹⁹, v ktorej sú skupiny R¹⁸ a R¹⁹ nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.

256/B

Skupinou R¹⁷ potom z nasledujúcich skupín:

môže v niektorých prípadoch byť jedna

V alternatívnom uskutočnení môže skupina R⁸ predstavovať napríklad

19 skupinu -(CH₂)_nNR R , v ktorej n predstavuje číslo 1, 2, 3 alebo 4; a skupiny R¹⁸ a R¹⁹ môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.

256/B

V alternatívnom uskutočnení môže skupina R⁴ predstavovať napríklad CH₂O-arylovú skupinu, -CH₂S-arylovú skupinu, -CH=CH-arylovú skupinu alebo NH(CH₂-aryl)ovú skupinu, kde uvedenou arylovou skupinou môže byť akákoľvek aromatická skupina obsahujúca buď len atómy uhlíka a vodíka (akou je napríklad fenylová skupina, naftylová skupina, toluylová skupina) alebo i ďalšie atómy (akými sú napríklad pyrolylová skupina, pyridylová skupina, oxazolylová skupina, chlórfenylová skupina, brómnaftylová skupina).

V alternatívnom uskutočnení môže skupina R⁴ predstavovať skupinu N(CH3)R²¹, skupinu -N(CH2CH₃)R²¹, skupinu -N(CH(CH3)2)R²¹, skupinu N(benzyl)R²¹, skupinu -CH2NH₂, skupinu -NHCH₂CH₂NR²²R²³ alebo skupinu CH₂NHC(=O)R²², v ktorých môžu skupiny R²¹ až R²³ nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu. V špecifických prípadoch predstavuje skupina R²² atóm vodíka a skupina R²³ predstavuje skupinu -C(=O)R²⁴, v ktorej skupinou R²⁴ je atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu.

V ďalších prípadoch môže byť skupina R⁴ zvolená tak, že štruktúru zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné opísať všeobecným vzorcom

256/B

R²⁰ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.

V iných prípadoch môže byť skupina R⁴ zvolená tak, že štruktúru zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné opísať všeobecným vzorcom

kde

R²⁵ a R²⁵ predstavujú nezávisle na seba atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu. Skupina R²⁵ môže napríklad predstavovať atóm vodíka, alkylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu alebo aralkylovú skupinu a skupina R²⁶ môže predstavovať haloalkylovú skupinu, hydroxylovú skupinu, skupinu C(=O)NR²⁷R²⁸, skupinu C(=O)OR²⁷ alebo skupinu NR²⁷R²⁸, v ktorých skupiny R²⁷ a R²⁸ môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu. V alternatívnom prípade môže R²⁶ predstavovať skupinu -C(H) (aryl) (R²⁹), v ktorej skupinou R²⁹ je atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu. V niektorých prípadoch obsahuje skupina R²⁹ aspoň jednu acylovú skupinu (akou je napríklad karboxylátová, ketónová skupina, aldehydová skupina, esterová skupina, amidová skupina alebo tioesterová skupina). V týchto alebo iných

256/B prípadoch môže uvedenou arylovou skupinou byť naftylové skupina alebo benzotiofenylová skupina. Skupina R²⁹ môže obsahovať ahydroxykarboxylátovú skupinu (akou je napríklad skupina -C(R) (OH) (COOR'), kde skupiny R a R' môžu predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.

V ďalšom uskutočnení sa predmetný vynález týka zlúčeniny všeobecného vzorca kde

R¹ a R² sú rovnaké alebo rôzne skupiny všeobecného vzorca -NR⁵R®, v ktorých každá zo skupín R⁵ a R⁶ môže nezávisle predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-obsahujúcu funkčnú skupinu; a

R⁴ je aminoskupina, iná než skupina -NH₂ alebo skupina

256/B

V ďalšom uskutočnení sa predmetný vynález týka spôsobu inhibície Dalanyl-D-alanínligázy (D-Ala-D-Ala ligázy). Tento spôsob zahrňuje stupeň, v ktorom sa D-Ala-D-Ala ligáza vystaví pôsobeniu zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo všeobecného vzorca (II)

kde

A a B môžu nezávisle na seba predstavovať atóm dusíka alebo skupinu CR⁷, kde

R⁷ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogéna/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu;

R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne skupiny všeobecného vzorca -NR⁵R⁶, kde

R⁵ a R⁶ môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-obsahujúcu funkčnú skupinu; a

R³ a R⁴ môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu; s tou podmienkou, že obidve skupiny R³ a R⁴ nepredstavujú súčasne atómy vodíka.

Obidve skupiny R¹ a R² môžu predstavovať napríklad skupiny -NH₂.

256/B

V niektorých prípadoch môžu skupiny R³ a R⁴ nezávisle na seba predstavovať rozvetvenú alebo lineárnu alkylovú skupinu, -O-alkylovú skupinu, skupinu -O-alkyl-COOH, skupinu -O-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -O-alkyl-OH, skupinu -NR⁷R⁸, skupinu -NR⁷-alkyl-NR⁸R⁹ skupinu -NR⁷-alkyl-COOH, skupinu -NR⁷-alkyl-OH; skupinu -CONR⁷R⁸, skupinu -CONR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-alkyl-COOH, skupinu -CONR⁷-alkyl-OH, -S-alkylovú skupinu, skupinu -S-alkyl-COOH, skupinu -S-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -S-alkyl-OH, -Oarylovú skupinu, skupinu -O-aryl-COOH, skupinu -O-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -Oaryl-OH, -S-arylovú skupinu, skupinu -S-aryl-COOH, skupinu -S-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -S-aryl-OH, skupinu -NR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-aryl-COOH, skupinu -NR⁷-aryl-OH; skupinu -CONR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-arylCOOH, skupinu -CONR⁷-aryl-OH alebo skupinu -CH2NR⁵C6H4COOH; s tou podmienkou, že skupiny R³ a R⁴ nemôžu simultánne predstavovať zhodné rozvetvené alebo lineárne alkylové skupiny; skupiny R¹ a R² môžu nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka, skupinu -NH2 alebo skupinu -NR¹¹R¹², pričom aspoň jedna zo skupín R¹ a R² predstavuje skupinu -NH2; skupina R⁵ môže predstavovať nižšiu alkylovú skupinu (tj. alkylovú skupinu obsahujúcu od 1 do 6 atómov uhlíka), atóm vodíka alebo skupinu -CH2NR¹⁰C6H4CONHR⁶; kde R⁶ je alkylová skupina, skupina -alkyl-COOH, skupina -alkyl-NH₂ alebo skupina alkyl-OH; skupiny R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹ a R¹² môžu nezávisle na seba predstavovať lineárnu alkylovú skupinu, rozvetvenú alkylovú skupinu, arylovú skupinu alebo acylovú skupinu, ktoré môžu byť prípadne substituované jednou alebo viacerými funkčnými skupinami na báze kyslíka, dusíka, síry alebo halogénu; a skupinou A môže byť atóm dusíka alebo skupina CH.

Inhibovaná D-Ala-D-Ala ligáza môže obsahovať napríklad sekvenciu, ktorá je z aspoň 90 percent zhodná so sekvenciou D-Ala-D-Ala ligázy z organizmu kmeňa vybraného napríklad zo skupiny zahrňujúcej Escherichia coli, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Xylella fastidiosa, Bordetella pertussis, Tiobacillus ferrooxidans, Neisseria meningitidis, Neissseria gonorrhoeae, Buchnera aphidicola, Bacillus halodurans, Geobacter sulfurreducens, Rickettsia

256/B prowazekii, Zymomonas mobilis, Aquifex aeolicus thermophile, Thermotoga maritima, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Streptomyces toyocaensis, Amycolatopsis orientalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Sreptococcus pneumoniae, Sreptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus sublitis, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Synechocystis sp., Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis, Legionella pneumophila, Leuconostoc mesenteroides, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Vibrio cholerae a Helicobacter pyiori.

V ďalšom uskutočnení sa predmetný vynález týka spôsobu liečby pacienta. Tento spôsob zahrňuje stupeň, v ktorom sa uvedenému pacientovi podáva účinné množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo všeobecného vzorca (II)

v ktorých A, B a R¹ až R⁴ majú hore definované významy.

256/B

Predmetom tohto vynálezu je rovnako farmaceutický prostriedok, ktorý zahrňuje ktorúkoľvek z vyššie opísaných zlúčenín spolu s excipientom, ktorý je vhodný na podávanie danému subjektu.

Predmetom tohto vynálezu je rovnako spôsob liečenia subjektu s bakteriálnou mikrobiálnou infekciou. Tento spôsob zahrňuje podávanie účinného množstva vyššie opísaného farmaceutického prostriedku uvedenému subjektu. Týmto subjektom môže byť napríklad živočích, akým je cicavec (ktorého príkladom je človek, kôň, jahňa, pes, mačka, králik, myš, potkan, krava, býk, prasa), vták (ktorého príkladom je kura, hus, morka, kačica, sliepka), ryba (ktorej príkladom je losos, pstruh, sumec, karas) alebo iné hospodárske, spoločenské alebo okrasné zviera.

V ďalšom uskutočnení sa predmetný vynález týka spôsobu liečby pacienta. Uvedený spôsob zahrňuje stupeň, v ktorom sa pacientovi podáva účinné množstvo ktoréhokoľvek z vyššie uvedených zlúčenín, ato prípadne spolu s vhodným nosičom.

Ďalej sa tento vynález týka spôsobu inhibície rastu baktérií v neživých systémoch (akými sú napríklad sterilizácia, dezinfekcia alebo in vitro ničenie baktérií). Tento spôsob zahrňuje stupeň kontaktovania daného systému (napr. média, medicinálneho zariadenia, kuchynského alebo kúpeľňového povrchu, operačného sálu) s takým množstvom ktorejkoľvek z vyššie opísaných zlúčenín, ktoré je účinné na inhibíciu bakteriálneho rastu.

Pri výbere zlúčenín na použitie pri nových spôsoboch podľa tohto vynálezu je možné použiť niekoľko parametrov. Skupina týchto parametrov zahrňuje in vitro antibakteriálnu účinnosť a spektrum účinku; fyzikálno-chemické vlastnosti, akou je lipofilita a rozpustnosť, bez obmedzenia na tieto príklady. Farmakokinetické chovanie zlúčenín podľa predmetného vynálezu, ako i ich in vitro antibakteriálne účinky sú známkou toho, že zlúčeniny podľa predmetného vynálezu sú vhodné ako pre profylaxiu, tak i pre medicinálnu liečbu subjektov

256/B s bakteriálnymi infekciami a ďalej toho, že tieto zlúčeniny môžu byť použité ako antiseptiká, sterilizačné činidlá alebo dezinfekčné činidlá.

Výraz “halo”, “halogén alebo “atóm halogénu” v tomto texte znamená atóm fluóru, atóm chlóru, atóm brómu alebo atóm jódu.

Výrazy “alkylová skupina”, alkenylová skupina” a “alkinylová skupina” v tomto texte znamenajú uhľovodíkové reťazce, ktoré môžu byť lineárne alebo rozvetvené, a ktoré obsahujú uvedený počet atómov uhlíka, pokiaľ je tento špecifikovaný. Tak napríklad špecifikácia “obsahujúca od 1 do 10 atómov uhlíka označuje, že daná skupina môže obsahovať od 1 do 10 (včítane) atómov uhlíka alebo táto skupina môže byť i cyklická (a môže obsahovať napríklad jeden alebo viac kruhov). Výrazom kruh a “kruhový systém” sa v tomto texte označuje kruh obsahujúci uvedený počet atómov, pričom týmito atómami môžu byť atómy uhlíka alebo, tam kde je to uvedené, heteroatómy, akým je atóm dusíka, atóm kyslíka alebo atóm síry (ako je tomu napríklad u heterocyklylových skupín). Samotný kruh, ako i ktorékoľvek substituenty na ňom obsiahnuté, môže byť viazaný ku ktorémukoľvek atómu, ktorý umožňuje vytvorenie stabilnej zlúčeniny.

Výraz “aryl” alebo “arylová skupina” v tomto textu znamená monocyklický aromatický kruh obsahujúci 6 atómov uhlíka alebo bicyklický aromatický kruhový systém obsahujúci 10 atómov uhlíka, pričom 0, 1, 2 alebo 3 atómy v každom kruhu môžu byť substituované. Ako príklad arylovej skupiny je možné uviesť fenylovú skupinu, naftylovú skupinu apod. a ďalej heteroarylové skupiny.

Výraz “heteroaryľ alebo “heteroarylová skupina” v tomto texte znamená

5- až 8 členný monocyklický, 8- až 12 členný bicyklický alebo 11- až 14 členný tricyklický kruhový systém obsahujúci v prípade monocyklického systému 1 až 3 heteroatómy, v prípade bicyklického systému 1 až 6 heteroatómov alebo v prípade tricyklického systému 1 až 9 heteroatómov, pričom uvedené heteroatómy sú vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm kyslíka, atóm dusíka a atóm síry, pričom 0, 1, 2 alebo 3 atómy v každom kruhu môžu byť substituované. Ako príklad heteroarylovej skupiny je možné uviesť pyridylovú skupinu, furylovú skupinu atebo furanylovú skupinu, imidazolylovú skupinu,

256,'B benzimidazolylovú skupinu, pyrimidinylovú skupinu, tiofenylovú skupinu alebo tienylovú skupinu, chinolinylovú skupinu, indolylovú skupinu, tiazolylovú skupinu apod.

Výraz “hetorocyklyľ alebo “heterocyklylová skupina” v tomto texte znamená nearomaťický 5- až 8 členný monocyklický, 8- až 12 členný bicyklický alebo 11- až 14 členný tricyklický kruhový systém obsahujúci v prípade monocyklického systému 1 až 3 heteroatomy, v prípade bicyklického systému 1 až 6 heteroatómov alebo v prípade tricyklického systému 1 až 9 heteroatómov, pričom uvedené heteroatomy sú vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm kyslíka, atóm dusíka a atóm síry, pričom 0, 1, 2 alebo 3 atómy v každom kruhu môžu byť substituované. Ako príklad heterocyklylovej skupiny je možné uviesť piperizinylovú skupinu, pyrolidinylovú skupinu, dioxanylovú skupinu, morfolinylovú skupinu, tetrahydrofuranylovú skupinu apod.

Do rozsahu tohto vynálezu spadajú len také kombinácie a varianty substituentov, ktoré vedú ku vzniku stabilných zlúčenín. Výrazom stabilné” sa v tomto texte rozumejú zlúčeniny, ktoré sú natoľko stabilné, aby bola umožnená ich výroba a aby bola zachovaná integrita danej zlúčeniny po dobu, ktorá postačuje na použitie uvedených zlúčenín na účely podrobne opísané v tomto texte (napr. po dobu terapeutického alebo profylaktického podávania subjektu alebo pacientovi, alebo po dobu použitia danej zlúčeniny ako antiseptika, po dobu použitia danej zlúčeniny na impregnáciu obväzu rany, po dobu použitia danej zlúčeniny ako dezinfekčného činidla).

Pokiaľ nie je definované inak, sú všetky technické a vedecké výrazy použité v tomto texte vo významoch bežne používaných skúsenými odborníkmi v odbore. Aj keď je pri praktickom použití predmetu tohto vynálezu alebo uskutočňovaní testov podľa predmetného vynálezu možné použiť metódy a materiály podobné alebo ekvivalentné k metódam a materiálom opísaným v tomto texte, sú ďalej v texte opísané vhodné metódy a materiály pre uvedený účel. V prípade akéhokoľvek rozporu je rozhodujúce znenie tohto opisu, včítane definícií v ňom uvedených. Okrem toho, materiály, metódy a príklady opísané

256/B v tomto texte je treba považovať len za ilustratívne a nie obmedzujúce z hľadiska rozsahu tohto vynálezu.

S predmetným vynálezom je spojených niekoľko výhod vzhľadom na doterajšie spôsoby liečby. Tak napríklad, zlúčeniny podľa tohto vynálezu sa viažu ku D-Ala-D-Ala ligáze s vysokou špecificitou v mieste, v ktorom dochádza ku viazaniu adenozíntrifosfátu (ATP) a z výsledkov biochemických testov vyplýva, že sú kompetitívnymi voči ATP. Niektoré zlúčeniny opísané týmto vynálezom majú svoje funkčné skupiny interagujúce s proteínom situované tak, že sú schopné sa viazať ku jednému alebo rovnako ku obom miestam D-AlaD-Ala ligázy, v ktorých dochádza ku viazaniu D-alanínu. Tieto typy nových zlúčenín (označované ako bisubstrátové analógy) môžu mať ďalej zvýšenú selektivitu a účinnosť, čo priamo súvisí so schopnosťou spojiť väzobné miesto ATP a väzobné miesto D-Ala.

Niektoré zlúčeniny podľa predmetného vynálezu môžu byť rovnako menej toxické než mnohé existujúce antibiotiká. Nové zlúčeniny podľa predmetného vynálezu sa špecificky viažu ku D-Ala-D-Ala ligáze, čo je enzým, ktorý je prítomný v baktériách, ale nie v ľudských alebo iných eukaryotických bunkách, takže nové zlúčeniny podľa tohto vynálezu všeobecne neinterferujú s biologickými systémami pacientov. Pretože sú peptidoglykány prítomné iba v baktériách a naopak nie sú vôbec prítomné v cicavčích bunkách, môže špecifická inhibícia D-Ala-D-Ala ligázy viesť ku vysoko selektívnemu antibakteriálnemu účinku.

Okrem toho môže byť so zlúčeninami podľa tohto vynálezu spojených niekoľko výhod z chemického a farmakologického hľadiska v porovnaní s existujúcimi zlúčeninami, ktoré sa používajú pri liečbe bakteriálnych infekcií. Medzi tieto výhody môže spadať ako chemická, tak i farmakologická stabilita, ako i účinnosť, rôzne rezistenčné profily, rôzne profily selektivity a nižšia miera vedľajších účinkov. Účinnosť a schopnosť nových zlúčenín podľa predmetného vynálezu sieťovať bakteriálne bunkové membrány rovnako vedie k tomu, že tieto zlúčeniny sa vhodne používajú ako antibiotiká. Do rozsahu predmetného vynálezu rovnako spadá veterinárne použitie týchto zlúčenín na liečbu infekcií

256. B u rýb, hydiny, dobytka, ďalších chovných zvierat, športových zvierat a spoločenských zvierat.

Zlúčeniny podľa predmetného vynálezu vykazujú silný široko spektrálny účinok proti reprezentatívnej skupine mikroorganizmov, ktorá zahrňuje kmene

E. coli, S. aureus, S. pneumoniae, H. influenzae a ďalšie. Tento široko spektrálny účinok rovnako vyplýva z veľmi tesnej homológie D-Ala-D-Ala ligáz uvedených 51 reprezentatívnych kmeňov mikroorganizmov, pričom štruktúra DAla-D-Ala ligázy pre každý z uvedených reprezentatívnych bakteriálnych organizmov je však vzhľadom na evolučný vývoj odlišná. Jednako len jednotlivé zlúčeniny skutočne vykazujú vyšší účinok proti špecifickým baktériám, čo rovnako vytvára priestor pre vývoj selektívnych a úzko špecifických činidiel.

Ďalšie aspekty predmetného vynálezu a výhody spojené s týmto vynálezom budú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu a zo znenia patentových nárokov.

Predmetom tohto vynálezu sú špecifické zlúčeniny, ktorých príklady sú opísané v tomto texte. Jeden aspekt predmetného vynálezu je tak tvorený ktoroukoľvek zo zlúčenín, ktoré sú konkrétne opísané v tomto texte, včítane nižšie uvedených zlúčenín všeobecného vzorca (I) a (II) kde

256/B

A a B vo všeobecnom vzorci (I) alebo (II) predstavujú nezávisle na seba -N-, skupinu -CH- alebo skupinu -CR⁷; a

R¹, R², R³, R⁴ a R⁷ sú vybrané nezávisle na seba.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu je možné syntetizovať bežnými postupmi. Vo výhodnom uskutočnení sa uvedené zlúčeniny vhodne syntetizujú z ľahko dostupných východiskových látok. Všeobecne sa zlúčeniny tu opísaných všeobecných vzorcov vhodne získavajú spôsobmi znázornenými na nižšie uvedených schémach a postupmi opísanými ďalej v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Jedným aspektom predmetného vynálezu je spôsob prípravy zlúčenín všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte, ktorý zahrňuje syntézu ktoréhokoľvek jedného alebo viacerých medzlproduktov znázornených na nižšie uvedených syntetických schémach a následnú konverziu tohto/týchto medziproduktu/medziproduktov na zlúčeniny všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte. Ďalším aspektom tohto vynálezu je spôsob prípravy zlúčenín všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte, ktorý zahrňuje syntézu ktoréhokoľvek jedného alebo viacerých medziproduktov opísaných v nižšie uvedených príkladoch uskutočnenia vynálezu a následnú konverziu tohto/týchto medziproduktu/medziproduktov na zlúčeniny všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte. Ďalším aspektom tohto vynálezu je spôsob prípravy zlúčenín všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte, ktorý zahrňuje syntézu ktoréhokoľvek jedného alebo viacerých medziproduktov opísaných v nižšie uvedených príkladoch uskutočnenia vynálezu a následnú konverziu tohto/týchto medziproduktu/medziproduktov na zlúčeniny všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte, a to s využitím jednej alebo viacerých chemických reakcií opísaných ďalej na syntetických schémach alebo v príkladoch uskutočnenia tohto vynálezu. Nukleofilné činidlá sú v danej oblasti techniky známe a sú opísané v odborných chemických článkoch a monografiách citovaných v tomto texte. Skupina chemikálii používaných pri vyššie uvedených spôsoboch môže zahrňovať napríklad rozpúšťadlá, reakčné činidlá, katalyzátory, činidlá na zavádzanie a odštiepovanie chrániacich skupín apod. Vyššie opísané spôsoby

256/B môžu rovnako zahrňovať ďalšie stupne, ktoré sa uskutočňujú buď pred alebo po stupňoch, ktoré sú konkrétne opísané v tomto texte, a ktoré slúžia na zavedenie alebo odstránenie vhodnej chrániacej skupiny, čím je v konečnom dôsledku umožnená syntéza zlúčenín všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte.

Ako je skúsenému odborníkovi z oblasti organickej chémie zrejmé, syntetické schémy v tomto texte nie sú určené na zahrnutie úplného zoznamu prostriedkov, ktorými je možné syntetizovať zlúčeniny podľa predmetného vynálezu. Okrem toho vyššie opísané syntetické stupne môžu byť uskutočnené v inom poradí za vzniku požadovanej zlúčeniny. Chemické transformácie a metodológie týkajúce sa chrániacich skupín (chránenie a odstránenie), ktoré sú vhodné pre syntézu zlúčenín opísaných v tomto texte, sú v danej oblasti techniky známe a ich skupina zahrňuje napríklad reakcie opísané v nasledujúcich publikáciách:

R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.

W. Greene a P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vydanie., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser a M. Fieser, Fieser nad Fíeser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); M.B. Smith a J. March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5. vydanie, Wiley Interscience (2001); a Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, (editor L. Paquette), John Wiley and Sons (1995), a v nasledujúcich vydaniach týchto publikácií.

Pri obvyklom postupe je možné zlúčeniny podľa tohto vynálezu hromadne testovať na antibakteriálny účinok proti mnohým rôznym bakteriálnym kmeňom. Zlúčeniny sa testujú na silu a šírku účinkov proti rôznym kmeňom za účelom identifikácie potenciálnych vedúcich zlúčenín, tj. zlúčenín s najlepšou účinnosťou. Uvedené zlúčeniny sa môžu hromadne testovať na bakteriostatický účinok (tj. na schopnosť brániť rastu baktérií) a/alebo na baktericídny účinok (tj. na schopnosť ničiť baktérie). Takto vybrané vedúce zlúčeniny môžu byť ďalej optimalizované, napríklad zmenou substituentov za vzniku odpovedajúcich derivátov. Uvedené deriváty sa môžu pripravovať po

256/B jednom alebo je možné ich pripraviť pomocou metód paralelnej alebo kombinatorickej syntézy. Vo všetkých prípadoch môžu byť uvedené deriváty testované na zistenie údajov týkajúcich sa vzťahu medzi štruktúrou a účinnosťou (SAR) danej zlúčeniny, ktoré môžu byť ďalej použité na ďalšiu optimalizáciu uvedených vedúcich zlúčenín.

Návrh, syntéza a biochemické testovanie inhibítorov ligázy

Štruktúra analógov bola navrhnutá s použitím rôznych prístupov, ktoré zahrňujú tradičnú medicinálnu chémiu, systematické vytváranie analógov (napr. systematické testovanie analógov s rôzne dlhými alkylovými reťazcami, s izostérickými funkčnými skupinami, rôznymi aromatickými substituentami), cieľovanie štruktúry zvyškov s využitím róntgenovej analýzy kryštálovej štruktúry, molekulové modelovanie a počítačové experimenty modelujúce aktívne miesto, počítačovú analýzu diverzity a iteračnú spätnú väzbu s použitím výsledkov biochemických experimentov. Uvedené analógy boli syntetizované pomocou rôznych syntetických metód, ktoré boli skôr opísané v odbornej literatúre skúsenými odborníkmi z odboru. Upravené analógy boli následne analyzované tu opísanými biochemickými metódami, čím boli získané dáta týkajúce sa účinnosti jednotlivých analógov. Rôzne vzorky niektorých analógov sú opísané v ďalšom texte.

Boli identifikované rôzne substituenty v polohe 6 a 7 chinazolínov, pteridínov, pyridopyrimidínov a pyrimidinopyrimidínov, ktoré vykazujú silný inhibičný účinok proti ligáze. Nasledujúca tabuľka 1 uvádza rôzne substituenty v polohe 6 a 7, ktoré sú schopné inhibovať ligázu (atómy vodíka nutné pre doplnenie väzbovosti atómov dusíka, kyslíka a uhlíka v jednotlivých zlúčeninách nie sú zobrazené, ale odborníkovi v oblasti organickej chémie je zrejmé, že tieto sú v uvedených zlúčeninách prítomné).

256/B

Tabuľka 1

Štruktúra	Ki (Ligáza E. co/z)/pM
í/·-! naX7	73
N N^N N (f J	31
N 1 1 JL λ λχ N-^ NX N y	37
- N /' Λ Λ') M N N N Cl	1

256/B

256/B

N	29
N ΛΛΑ-^θ	14
N Chirálnf nY/%	16
ZV^n <jYY ν^ιψ^ν^ν	3
“Y^t Y λΑΑ-pYj	9

256/B

Štruktúra	Ki (Ligáza E. colľ)/yM
	13
^CXcl	12
7¾ . λΛγγ N	2
.i?,---;© 0 Cl	12
O	92

256/B

N N ,<1Ό	14
0	0,59
N S^N rP^c>	0,50
N N^r^N N ΗΓ' Ν^~ N 1 λ3	2,9
N Ν-^γ^ϊΝ íl 1 í	1,00

256/13

N Λ	La X N N X	1 0,50
			8,7
N / ääá K N N N N—' \	“Λ
	>0 0
N			0,13
«A	''N^X'Xz	Γ5
	y I
	r N

Substitúcia N7 nižšími alkylovými skupinami

Za účelom zvýšenia účinku daných zlúčenín je možné pripraviť rôzne analógy vzniknuté substitúciou na N7 (substituent R1 v nižšie uvedenej tabuľke 2). Ako najúčinnejšie nižšie alkylové a cykloalkylové substituenty boli identifikované tieto skupiny: metylová skupina, etylová skupina, alylová skupina a cyklopropylmetylová skupina. Bolo možné uskutočniť substitúciu v a-polohe (substituent R2 v nižšie uvedenej tabuľke 2), pričom v niektorých prípadoch spôsobila substitúcia skupinou CH₃ a C₂H₅ dramatické zvýšenie účinku. Nebolo by nijako prekvapujúce, keby i iné substituenty v polohe R2 rovnako zvyšovali účinnosť inhibície ligázy. Substitúcia naftylového kruhu v polohe 4 viedla ku zvýšeniu účinku v prípadoch, keď týmto substituentom bol atóm vodíka, skupina -CH₃ alebo atóm halogénu. Bolo zistené, že nahradenie naftylového kruhu rôznymi heterocyklami (napríklad benzotiofénom) vedie ku vzniku analógov, ktoré vykazujú silný in vitro enzymatický účinok. V prípade tejto série analógov

256, B boli R-a-metylové stereoizoméry výrazne účinnejšie než odpovedajúce racemáty. V prípade S-a-metylovej stereokonfigurácie boli získané analógy s účinnosťou na širšie spektrum ligáz, avšak k tomuto rozšíreniu spektra účinnosti prišlo na úkor účinku proti ligáze E. coli, ktorá je sérii týchto analógov vlastná.

Tabuľka 2

nh2 82
	H2r	R1
N-R1	R2	Chiralita R2	R3	Ligáza E. coli (μΜ)	Ligáza Staph (μΜ)
-ch3	-ch3	R/S	H	0,718	9,28
-ch3	-c2h5	R/S	H	0,452	4,60
-ch3	-ch3	R	H	0,326	26,80
-ch3	-CH3	R/S	-ch3	0,277	12,25
-ch3	-ch3	R/S	4,5-butylén	0,240	12,00
-ch3	-CH3	R/S	Cl	0,201	4,90
-ch3	-ch3	R	F	0,104	27,00
-ch2ch3	-ch3	R/S	F	0,257	19,00
-ch2ch3	-ch3	R/S	-ch3	0,210	38,50
-ch2ch3	-ch3	R	-ch3	0,102	71,00

256/B

nh2 2 R1
N-R1	R2	Chiralita R2	R3	Ligáza E. coli (μΜ)	Ligáza Staph (μΜ)
-ch2ch=ch2	-ch3	R/S	H	0,258	30,50
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	H	0,345	17,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	Br	0,279	25,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	-ch3	0,211	37,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R/S	Cl	0,179	29,00
-CH2CH(CH2)2	-ch3	R	-ch3	0,174	62,00

β-alanínamidové analógy

Amidy syntetizované s použitím β-alanínovej spojovacej skupiny vykazujú širokospektrálne účinky. Najúčinnejším širokospektrálnym inhibítorom identifikovaným v tejto sérii bol etylénamínamidový derivát (tj. prvá zlúčenina z nasledujúcej tabuľky 3), ktorého Ki pre ligázy E. coli a H. influenzae bol nižší než 1 μΜ; a účinok tohto derivátu na ligázy S. aureus a S. pneumoniae, vyjadrený pomocou Ki, bol rádovo v jednotkách μΜ (viď. tabuľka 3). Bolo zistené, že hodnota Ki m-aminometylbenzylamínového analógu (tj. tretej zlúčeniny z tabuľky 3) bola menšia než 1 μΜ pre 3 zo 4 ligáz použitých pri danom teste účinnosti. Podobne posledná zlúčenina v tabuľke 3 bola účinná proti 3 z uvedených 4 druhov ligáz. Štvrtá zlúčenina z tabuľky 3, v ktorej bola primárna aminoskupina nahradená amidínovou skupinou, vykázala účinok podobný účinku prvej zlúčeniny.

256/B

Tabuľka 3

Štruktúra	Ligáza E. coli Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza H influezae Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Staph Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Strep Ki/ATP (μΜ) priem.
CH, ľ2 < °~\=y	~A	0,7	1,0	4,7	1,9
/-Λ /-' 0 h2n
r < aIa )=< H,N N N —/ \ /	~A	9,6	0,267	9,5	3,1
4.P H
NH, ,CH> o—7~\- f S	Λ	5,3	0,4	0,9	0,9
O-H
- CH, |H’ < /Ά Q~\=y 2^~λ-5 HN N~-^ 0		1,0	0,6	6,3	1,4

256/B

	Ligáza	Ligáza	Ligáza	Ligáza
Štruktúra	E. coli	H influezae	Staph	Strep
	Ki/ATP	Ki/ATP	Ki/ATP	Ki/ATP
	(μΜ)	(μΜ)	(μΜ)	(μΜ)
	priem.	priem.	priem.	priem.
CH, o-/	1,9	1,3	3,8	4,1
Cs 0
~'r Γ ‘	8,7	1,6	1,2	1,6
,n-hQ^N-<0 1

Karboxylové kyseliny a α-hydroxykarboxylové kyseliny

Prvá zlúčenina z tabuľky 4 bola použitá vo forme zmesi aspoň dvoch stereoizomérov prečistenej vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Kryštálová analýza komplexu proteín-ligand vytvoreného z tejto zlúčeniny odhalila prítomnosť dvoch stereoizomérov, ktorých stereochemická konfigurácia bola stanovená ako (2-R, ľ-S) a (2-S, ľ-R). Číslo 2 označuje ahydroxy polohu a číslo ľ označuje α-metyl polohu. Uvedené dva izoméry, ktoré boli pozorované sú enantiomérne, tj. sú zrkadlovými obrazmi jeden druhého. Účinnosť poslednej zlúčeniny v tabuľke 4 proti ligáze E. coli bola 143 nM. Uvedená zlúčenina mala pomerne široké spektrum účinku proti H. influenzae (566 nM), Staph (4,1 μΜ) a Strep (2,6 μΜ).

0>x,/R

Tabuľka 4

Štruktúra	Ligáza E. coli Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza H influezae Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Staph Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Strep Ki/ATP (μΜ) priem.
---NHT Λ			0,611	-	7,8	-
	HO^J
	HO ^0
NH, A	CH, -^•N —0 V- n^''n—/ V= 7	Λ	5,3	3,7	6,7	2,1
—	OH
NH, f	Chirálnp		4,2	5,7	10	14,6
	íľ ’ X
	x
	HO 0
NH, 1	Chirálný		1,4	3,5	4,3	4,3
„.ΑΧ	X1 (T
	V C

256/B

Štruktúra	Ligáza E. coli Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza H influezae Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Staph Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Strep Ki/ATP (μΜ) priem.
NB; ' OH N N H 0	0,143	0,566	4,1	2,6
„zaaJq

Vzťah medzi štruktúrou a účinnosťou (SAR) pre N7-primárne bytulamínové analógy

Maximálna in vitro účinnosť pre túto sériu analógov bola zistená v prípade, keď na dusíku N7 bol viazaný butylamínový reťazec (tj. v prípade tretej zlúčeniny z tabuľky 5). α-Metylnaftylové chirálne centrum môže byť nahradené achirálnym 2-etoxynaftylovým substituentom (viď. štvrtá zlúčenina z tabuľka 5), pričom je stále zachovaná vysoká účinnosť proti ligáze. Uvedená achirálna zlúčenina má širšie spektrum účinku proti ligáze a bolo zistené, že hodnota Ki pre túto zlúčeninu proti iigáze izolovanej z kmeňa E. coli je 102 nM.

256,B

Tabuľka 5

Štruktúra	Ligáza E. coli Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza H influezae Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Staph Ki/ATP (μΜ) priem.	Ligáza Strep Ki/ATP (μΜ) priem.
nh3		2	2,7	58	439
CH,	JU u
1 nh2
NH, I 2	—	0,457	5,5	46	81,2
CHj H,N	9
ľ 1
H2rr
NH, 1		0,135	4,2	32	23,1
ch, H-Ν^'''γΛ N^'''N'^9f	Π
y i
r NH2
r		0,105	0,52	15	4,5
H/U M 3^3	O
P
NH2

256/B

Ďalšie analógy

256/B

ΝΗ.

<

Η,Ν'

HOOC

HOOC

HOOC

Všeobecné syntetické postupy použité na syntézu analógov podľa tohto vynálezu

Syntéza pyrimidopyrimidínov

Pyrimidopyrimidínové zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné pripraviť pomocou rôznych syntetických prístupov. Pyrimidopyrimidínový sytém je možné syntetizovať v niekoľkostupňovej reakčnej sekvencii, pri ktorej sa vychádza z vhodne substituovaného amidínu (všeobecného vzorca R7C=NHNH2) a R5-substituovaného alkoxymetylénmalonitrilu. Vzniknutý kyanoaminopyrimidín môže byť kondenzovaný s guanidinom za vzniku pyrimidopyrimidínového kruhového systému. V prípade, keď skupina R7 v uvedenom kyanoaminopyrimidíne predstavuje atóm chlóru, atóm brómu alebo -S-nižšiu alkylovú skupinu, môžu byť tieto odstupujúce skupiny nahradené

256/B dusíkovými alebo kyslíkovými nukleofilmi za vzniku R7-N (alebo O)subtituovaných alkylových alebo arylových medziproduktov. Tieto medziprodukty je možné cyklizovať na odpovedajúce pyrimidopyrimidíny substituované v polohe 7.

Ďalší spôsob syntézy 7-amino-substituovaných pyrimidopyrimidínov zahrňuje nukleofilný atak amínov na 6-amino-2-bróm-pyrimidín-5-karbonitril (ako odstupujúca skupina v polohe 2 môže v tomto prípade byť použitý i atóm chlóru alebo tiometylová skupina alebo tioetylová skupina) a následnú cyklizáciu vzniknutého príslušne substituované kyanoaminopyrimidínu guanidínom.

Pokiaľ nie je uvedený atakujúci, príslušne substituovaný nukleofilný amín komerčne dostupný, je možné ho pripraviť pomocou štandardných metód používaných v organickej chémii. Jednou z týchto štandardných metód, ktoré sa používajú pri príprave zlúčenín podľa predmetného vynálezu, je reduktívna aminácia.

256/B

Pri tejto všeobecne známej metóde kondenzuje aldehyd alebo ketón s príslušne substituovaným amínom a to v prítomnosti mierneho redukčného činidla, akým je kyanoborohydrid sodný alebo kyanoborohydrid zinočnatý. β-alanínamidy a a-hydroxy-/3-alanínamidy

NH.

OH

NH.

R2

Amidy je možné syntetizovať reakciou odpovedajúcich karboxylových kyselín s rôznymi primárnymi a sekundárnymi amínmi. Na uľahčenie tohto adičného spôsobu syntézy amidov je možné do reakčnej zmesi pridať mnoho reakčných činidiel opísaných v odbornej literatúre. Do skupiny týchto reakčných činidiel spadá karbonyldiimidazol (CD1), dicyklohexylkarbodiimid (DCC), HBTU, dietylfosforokyanidát a BroP.

Butylamínové analógy

256/B

Butylamínové analógy boli syntetizované postupom zahrňujúcim niekoľko syntéznych stupňov. Všeobecne možno tento postup opísať tak, že butándiamín, ktorého jedna aminoskupina bola ochránená Boc-skupinou, reagoval za podmienok reduktívnej aminácie za vzniku príslušne substituovaného naftylmetylamínu, ktorého jedna aminoskupina bola ochránená Boc-skupinou. Tento sekundárny amín reagoval s 6-amino-5-kyano2-halopyrimidínom, vzniknutý medziprodukt bol cyklizovaný reakciou s guanidínom a po tejto cyklizácii nasledovalo odštiepenie Boc-chrániacej skupiny v kyslom prostredí, čím boli získané odchránené butándiamínové analógy.

Metódy priamej substitúcie heterocyklov

[LG]

HNR'R nebo

HOR'Rť

R⁷

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu možno pripraviť rovnako aromatickou nukleofilnou substitúciou odstupujúcich skupín v polohe 7 2,4diaminopyrimidopyrimidínu. Skupina týchto odstupujúcich skupín (označených ako [LG]) zahrnuje -Cl, -Br, -SCH3, -SC2H5 a -N(CH3)₃, bez obmedzenia na tieto príklady. Uvedeným nukleofilom, ktorý sa používa pri tejto substitúcii, môže byť -N-alkylová skupina, -N-arylová skupina alebo substituované alkylalebo arylamíny, alebo -O-alkylová skupina, O-arylová skupina, alebo substituované alkoholy alebo fenoly.

3^Ί ->'6/Β

Syntéza pterínových analógov

Všeobecne je možné 6- alebo 7-substituované pterínové analógy pripraviť reakciou aktivovaného reakčného činidla, akým je 6- alebo 7chlórmetylpterín, s nukleofilmi, akými sú amíny, pričom je možné použiť rôzne ďalšie metódy opísané v odbornej literatúre a ako syntetické reakčné činidlá na prípravu 6- alebo 7-substituovaných analógov je možné použiť i iné funkčné skupiny viazané v polohe 6- alebo 7- pterínu, akými sú brómmetylová skupina, jódmetylová skupina, hydroxymetylová skupina, aktivovaná hydroxymetylová skupina, karbonylová skupina, aktivovaná karbonylová skupina, hydroxylová skupina, atóm chlóru, atóm brómu alebo metylová skupina.

Vyššie uvedené všeobecné reakčné schémy je možné použiť na syntézu širokého rozsahu 7-substituovaných pteridínových analógov. Všeobecne možno reakciu opísať tak, že 7-chlórmety!ový derivát a príslušný amín spolu dostatočne dlho reagujú vo vhodnom rozpúšťadle, akým je N,Ndimetylformamid (DMF) alebo 2-metoxyetanol, pričom doba nevyhnutná na prebehnutie danej reakcie sa stanovuje analýzou reakčnej zmesi pomocou vysoko účinnej kvapalinovej chrómatografie (HPLC) , pomocou chrómatografie na tenkej vrstve (TLC) alebo pomocou nukleárnej magnetickej rezonancie (NMR). Následne sa odstráni uvedené rozpúšťadlo a surový produkt sa čistí vhodnou metódou, obvykle zrážaním, prekryštalizovaním, opakovaným zrážaním vhodnej soli bázou, alebo pomocou chrómatografie.

256/B

Farmaceutické prostriedky, soli zlúčenín podľa tohto vynálezu a prekurzory liečiv

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu, včítane zlúčenín tu opísaných všeobecných vzorcov sú v tomto texte definované tak, že zahrňujú i ich farmaceutický prijateľné deriváty alebo deriváty, ktoré sú prekurzormi liečiv. Výrazom “farmaceutický prijateľný derivát alebo derivát, ktorý je prekurzorom liečiva” sa v tomto texte rozumie akákoľvek farmaceutický prijateľná soľ, ester, soľ esteru alebo iný derivát zlúčeniny podľa tohto vynálezu, ktorý je po podaní pacientovi schopný poskytnúť (priamo alebo nepriamo) zlúčeninu podľa tohto vynálezu. Obzvlášť výhodnými derivátmi a prekurzorami liečiv podľa tohto vynálezu sú tie deriváty a prekurzory liečiv, ktoré zvyšujú biologickú dostupnosť zlúčenín podľa tohto vynálezu po podaní takýchto zlúčenín cicavcovi (napríklad tým, že umožnia aby orálne podaná zlúčenina bola ľahšie absorbovaná do krvi) alebo ktoré zvyšujú prísun základnej zlúčeniny do biologického systému (napr. do mozgu alebo lymfatického systému) v porovnaní so základnými zlúčeninami. Skupina výhodných derivátov, ktoré sú prekurzorami liečiv, zahrňuje deriváty, v ktorých je skupina, ktorá zvyšuje rozpustnosť vo vode alebo ktorá aktivuje transport cez črevnú stenu, viazaná ku zlúčeninám všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte. Ako konkrétny príklad je možné uviesť prípad, keď sa pripravujú esterové prekurzory liečiv, ktoré majú analógom obsahujúcim voľnú karboxylovú skupinu napomáhať v absorpcii a prenikaní cez bunkovú membránu.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu je možné modifikovať naviazaním vhodných funkčných skupín za účelom zlepšenia vybraných biologických vlastností. Typy takýchto modifikácii sú v danej oblasti techniky známe a ich skupina zahrňuje modifikácie za účelom zvýšenia biologickej penetrácie danej zlúčeniny do daného biologického systému (akým je napríklad krv, lymfatický systém, centrálny nervový systém), za účelom orálnej dostupnosti danej zlúčeniny, za účelom zvýšenia rozpustnosti pre umožnenie injekčného

256/B podávania danej zlúčeniny, za účelom zmeny metabolizmu danej zlúčeniny a za účelom zmeny rýchlosti vylučovania danej zlúčeniny.

Skupina farmaceutický prijateľných solí zlúčenín podľa tohto vynálezu zahrňuje soli odvodené od farmaceutický prijateľných anorganických a organických kyselín a báz. Ako konkrétny príklad vhodnej soli odvodenej od kyseliny je možné uviesť acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, benzénsulfonát, bisulfát, butyrát, citrát, gáfran, gáforsulfonát, cyklopentánpropionát, diglukonát, dodecylsulfát, etánsulfonát, mravčan, fumarát, glukoheptanoát, glycerofosfát, glykolát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyetánsulfonát, laktát, maleát, malonát, metánsulfonát, 2-naftalénsulfonát, nikotinát, nitrát, palmoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, fosfát, pikrát, pivalan, propionát, salicylát, sukcinát, sulfát, vínan, tiokyanát, tosytát a undekanoát. Ostatné kyseliny, akou je kyselina šťavelová, je možné použiť pri príprave solí, ktoré sú vhodné ako medziprodukty pri príprave zlúčenín podľa tohto vynálezu a ich farmaceutický prijateľných kyslých adičných solí, a to i napriek skutočnosti, že samotné tieto kyseliny nie sú farmaceutický prijateľné.

Skupina solí odvodených od príslušných báz zahrňuje soli alkalických kovov (napríklad sodné soli), soli kovov alkalických zemín (napríklad horečnaté soli), amónne soli a N(alkyl)₄ ⁺ soli. Do rozsahu tohto vynálezu rovnako spadajú kvarternizácie ktorýchkoľvek bázických, dusík-obsahujúcich skupín zlúčenín opísaných v tomto texte.

Testy inhibície D-Ala-D-Ala ligázy

Inhibícia D-Ala-D-Ala ligázy môže byť testovaná pomocou pyruvátkinázového/laktátdehydrogenázového (PK/LDH) testu opísaného v príklade 2 a v odbornej literatúre (napr. v publikácii Sarthy a spolupracovníci, Anál. Biochem., 1997, 254, 288-290). Pri procese syntézy bakteriálnej bunkovej steny katalyzuje ligáza konverziu adenozíntrifosfátu (ATP) na adenozíndifosfát (ADP) súčasne s ligáciou dvoch zvyškov D-alanínu za vzniku D-alanyl-Dalanínu. Pyruvátkináza (PK) potom regeneruje ATP z ADP vzniknutého pri

256/B tomto procese, pričom zároveň dochádza ku konverzii fosfopyruvátu na pyruvát. Laktátdehydrogenáza (LDH) katalyzuje redukciu pyruvátu na laktát konverziou NADH na NAD⁺. Monitorovaním rýchlosti produkcie NAD⁺ (napr. pomocou UVA/is spektroskopie) je možné stanoviť aktivitu D-Ala-D-Ala ligázy.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu je možné hromadne testovať na percento inhibície ako je ďalej opísané v príklade 3.

Hodnotu inhibičnej konštanty Ki a mechanizmus účinku je možné zistiť postupom opísaným v príklade 4.

Proteínová sekvencia D-Ala-D-Ala ligázy bola stanovená v rôznych kmeňoch baktérií a to s použitím štandardných biochemických metód (viď. tabuľka 5). Proteínovou sekvenciou z ktoréhokoľvek kmeňa je možné exprimovať vo vhodnom hostiteľskom organizme, akým je E. coli, pričom pri tejto expresii sa využívajú štandardné techniky používané v molekulárnej biológii.

Daná ligáza môže byť izolovaná, prečistená a použitá pri vyššie opísaných testoch na stanovenie inhibičného účinku.

In vitro testy antibakteriálneho účinku

Zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné s použitím štandardných metód hromadne testovať na antibakteriálny účinok. V príklade jedného z týchto testov, ktorý je opísaný v príklade 5, sa používa technika mikroriedenia živnej pôdy za účelom merania in vitro účinku zlúčenín podľa tohto vynálezu proti danej bakteriálnej kultúre, pričom pomocou tohto testu je možné zistiť hodnoty minimálnych inhibičných koncentrácií (MIC).

Mikrozríeďovací test antimikrobiálneho účinku

Boli pripravené zásobné roztoky testovaných zlúčenín v N,N-dimetylformamide (DMF) s koncentráciou 5 miligramov/mililiter. Pracovné roztoky testovaných zlúčenín boli pripravené z uvedených zásobných roztokov a to v MullerV 256/B

Hintonovej živnej pôde (MHB), pričom východisková koncentrácia danej zlúčeniny bola 64 mikrogramov/mililiter.

Bakteriálne inokulá boli pripravené z kultúry pestovanej cez noc (tj. z čerstvej kolónie pestovanej na agarovom pláte v 5 mililitroch MHB; kmeň H. influenzae bol pestovaný v MHB s prídavkom kvasného extraktu, hematínu a NAD), ktorá bola odstreďovaná 2x5 minút pri 3000 otáčkach za minútu (v prípade S. pneumoniae a H. influenzae 2 x 10 minút pri 3000 otáčkach za minútu) a ktorá bola rozriedená vždy v 5 mililitroch čerstvej živnej pôdy MHB tak, aby po nariedení takto získanej bakteriálnej suspenzie v jamke mikroplatne (na celkový objem 100 mikrolitrov bolo získaných 100 kolónií tvoriacich jednotky (CFU).

Jamky mikroplatne boli plnené vždy 50 mikrolitrami dvojnásobne riedených roztokov testovanej zlúčeniny, pričom východisková koncentrácia testovanej zlúčeniny bola vždy 64 mikrogramov/mililiter. Potom boli jamky naplnené 50 mikrolitrami bakteriálneho inokula, takže konečný objem zmesi obsiahnutý v každej jamke bol 100 mikrolitrov. Platne boli inkubované 18 až 24 hodín pri teplote 37 °C (kmeň S. pneumoniae bol inkubovaný v atmosfére obohatenej oxidom uhličitým).

Potom bola pomocou prístroja TECAN SpectroFluor Plus® meraná optická hustota obsahu každej jamky pri vlnovej dĺžke 590 nanometrov (OD₅₉₀) a hodnota minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) bola definovaná ako koncentrácia, pri ktorej došlo ku 90 percentnej inhibícii rastu baktérií. V jednom z príkladov, ktorý je ilustrovaný v príklade 5, bola technika mikroriedenia živnej pôdy použitá na meranie účinku zlúčenín podľa tohto vynálezu proti danej bakteriálnej kultúre za účelom zistenia hodnôt minimálnych inhibičných koncentrácií (MIC).

256/B

Antimikrobiálny agarový zrieďovací test

Tento test bol uskutočnený v podstate tak, ako je opísané v známej literatúre (viď. napríklad publikácia NCCLS. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard-Fourth Edition. NCCLS document M 11-A4. NCCLS: Wayne, Pennsylvania; 1997).

Agarové médium: Brucelový krvný agar doplnený hemínom (v množstve 5 mikrogramov/mililiter), 5 % ovčej krvi a vitamínom k/ (v množstve 1 mikrogram/mililiter).

Antimikrobíálne činidlá: Zo štandardných antimikrobiálnych práškov (akými sú napríklad azithromycin, chloramfenikol, nitrofurantoin, piperacilin, klindamycin, penicilín, imipenem) a testovanej zlúčeniny boli pripravené zásobné roztoky (obsahujúce 5120 mikrogramov danej látky/mililiter N,Ndimetylformamidu (DMF)) a tieto roztoky boli zriedené ako je uvedené v tabuľke 3 publikácie NCCLS Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic bacteria; Approved Standard-Fourth Edition 1997; M11-A4, Vol.17 No 22.

Príprava inokula: Testovacie anaeróbne kmene boli vybrané z obohateného brucelového krvného agaru. Časti piatich kolónií boli priamo suspendované v brucelovej živnej pôde tak, aby bola dosiahnutá turbidita odpovedajúca hodnote 0,5 podľa McFarlandového štandardu.

Postup: Médium bolo pripravené podľa inštrukcií výrobcu a bolo rozdelené do skúmaviek so skrutkovým uzáverom. V deň testu do príslušných skúmaviek obsahujúcich agar ochladený na teplotu 50 °C bola pridaná krv a vždy 2 mililitre roztoku s danou koncentráciou antimikrobiálneho činidla. Vzniknutá zmes média a antimikrobiálneho činidla bola vyliata do štandardných Petriho misiek (s rozmerami 15 x 100 milimetrov) a ponechaná stuhnúť. Na každú platňu bola inokulovaná kultúra každého anaeróbneho kmeňa s vopred upravenou turbiditou, pričom k tejto inokulácii bolo použité replikačné zariadenie (objem každej nanesenej kvapôčky bol približne 2

256/B mikrolitre). Inokulovaná platňa bola inkubované v anaeróbnej nádobe pri teplote 35 °C. Výsledky boli zaznamenávané po 48 hodinách inkubácie a boli vyjadrené ako hodnoty minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC).

In vivo testy antibakteriálneho účinku

Zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je rovnako možné testovať na antibakteriálne účinky na laboratórnych zvieratách. Skupina týchto in vivo štúdií zahrňuje systémové a topické modely infekcie, modely infekcie močového traktu, modely sepsy, antibiotikami sprostredkované kolitídy a starostlivosť o ranu, bez obmedzenia na tieto príklady. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu je rovnako možné testovať na zvieratách za účelom stanovenia ich farmakokinetických profilov, akými sú napríklad orálna biologická dostupnosť, orálna absorpcia, chemický polčas rozpadu, identifikácia metabolitov, stanovenie koncentrácie v sére v rôznych časoch po podaní danej zlúčeniny a rýchlosť vylučovania danej zlúčeniny.

Zvierací model systémovej bakteriálnej infekcie

Systémové modely infekcie sú opísané v odbornej literatúre. Na testovanie zlúčenín podľa tohto vynálezu je možné použiť nasledujúce podmienky: Baktérie boli 24 hodín pestované v Múller-Hintonovom agare pri teplote 37 °C. Pre každý experiment sa pripraví bakteriálna suspenzia a to tak, že sa 4 až 5 bakteriálnych kolónií inokuluje na Múller-Hintonovu živnú pôdu (MHB) a táto sa následne inkubuje 24 hodin pri teplote 37 °C, čím je získané približne 10⁹ CFU/mililiter. Samice myší BalbC sa získajú od spoločnosti Charles River. Zvieratá sa infikujú podaním jednej dávky suspenzie bakteriálnej kultúry, ktorá odpovedá odpovedajúcej LD_1Oo (tj. každému zvieraťu je podané 1 x 10⁸ CFU/100 mikrolitrov suspenzie), do chvostovej žily. Myši sa niekoľkokrát denne starostlivo klinicky vyšetrujú a zaznamenávajú sa zrejmé klinické symptómy a mortalita. Počet prežijúcich zvierat sa sleduje počas 6 dni. Azithromicin sa rozpustí v 0,5 percentnom roztoku methocelu vo fyziologickom

256/B roztoku a vzniknutý roztok sa podáva orálne. Testované zlúčeniny sa mikronizujú pomocou trecej misky a tíčika a následne sa rozpustia v roztoku methocelu vo fyziologickom roztoku s prídavkom 3 percent N,Ndimetylformamidu (DMF). Prvá dávka sa podáva 30 minút po infekcii a ďalšie dávky sa podávajú každých 12 hodín počas nasledujúcich 3 dní.

Testy biochemických a fyzikálno-chemických vlastnosti

Heterocyklické zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné optimalizovať z hľadiska ich in vitro “antibakteriálneho” účinku, a to podľa výsledkov dvoch typov metód, ktorými sú štrukturálna metóda a fyzikálnochemická metóda. Danú chemickú štruktúru je možné modifikovať použitím kombinácií substituentov za vzniku zlúčenín, ktoré uspokojujú všetky alebo niektoré z nasledujúcich kritérií : 1) vypočítaná alebo experimentálne stanovená lipofilicita (logP) zlúčeniny je v rozmedzí od 0 do 2 jednotiek logP; 2) zlúčenina je substrátom pre D-Ala-D-Ala ligázu; 3) rozpustnosť zlúčeniny vo vode je vyššia než 1 mikrogram/mililiter. Tieto fyzikálno-chemické a biochemické vlastnosti sú faktorami ovplyvňujúcimi antimikrobiálne účinky zlúčenín podľa tohto vynálezu, ktoré je možné pozorovať u daných subjektov (napr. u zvierat).

Klinické použitie heterocyklických zlúčenín podľa tohto vynálezu

Zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné použiť terapeuticky alebo profylaktický pri liečení alebo prevencii bakteriálnych infekcií a/alebo ochorení.

Predmetný vynález sa rovnako týka napríklad spôsobu narušenia vnútornej regulácie mikrobiálneho rastu u subjektu, ktorý zahrňuje stupeň, v ktorom sa uvedenému subjektu podáva zlúčenina ktoréhokoľvek zo všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte alebo farmaceutická kompozícia zahrňujúca zlúčeninu ktoréhokoľvek zo všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte. V jednom uskutočnení sa predmetný vynález týka spôsobu inhibície mikrobiálnej alebo bakteriálnej aktivity u subjektu, ktorý zahrňuje

3» ?V,/R stupeň, v ktorom sa uvedenému subjektu podáva zlúčenina ktoréhokoľvek zo všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte alebo farmaceutická kompozícia zahrňujúca zlúčeninu ktoréhokoľvek zo všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte. Vo výhodnom uskutočnení je uvedeným subjektom človek alebo zviera.

V inom uskutočnení sa tento vynález týka spôsobu liečby ochorenia alebo symptómov ochorení u subjektu, ktorý zahrňuje stupeň, v ktorom sa uvedenému subjektu podáva zlúčenina ktoréhokoľvek zo všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte alebo farmaceutická kompozícia zahrňujúca zlúčeninu ktoréhokoľvek zo všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte. Vo výhodnom uskutočnení je uvedeným subjektom človek alebo zviera.

Infekcie a infekčné ochorenia sú spôsobené rôznymi mikroorganizmami. Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu nájsť uplatnenie v medicinálnej liečbe infekčných ochorení bakteriálneho pôvodu.

Zlúčeniny, ktoré ničia mikroorganizmy alebo obmedzujú rast mikroorganizmov môžu nájsť uplatnenie pri liečbe infekcií a infekčných ochorení. Je známe, že konkrétne bakteriálne mikroorganizmy sú spojené s určitým typom infekcie a infekčného ochorenia. Príklady bakteriálnych infekcií a patogénov, ktoré ich najčastejšie spôsobujú, sú uvedené v nasledujúcich odstavcoch.

Skupina infekčných ochorení horných a dolných ciest dýchacích zahrňuje bronchitídu, sínusitídu, pneumóniu, bolesť v krku, chronické streptokokové infekcie, diftériu, akútnu epiglotitídu, chrípku, chronickú bronchitídu, zápaly stredného ucha (otitis média), pneumóniu, bronchopneumóniu, legionársku chorobu, atypickú pneumóniu, čierny kašeľ a tuberkolózu, bez obmedzenia na uvedené príklady.

Skupina mikroorganizmov spôsobujúcich infekcie dýchacích ciest zahrňuje kmene S. pyogenes, S. pneumoniae, S. aureus, H. influenzae, M. Catarrhalis, N. meningitidis, B. pertussis, Enterobacteríaceae, anaerobes, Nocardia, Pseudomonas, C. psittaci, and C. diphtheriae, bez obmedzenia na uvedené príklady.

256/B

Skupina infekcií močového traktu zahrňuje uretritídu, cystitídu, pyelonefritídu (zápal obličiek), asymptomatickú bakterúriu, zápal močového mechúra, akútny uretrálny syndróm a opakované infekcie močového traktu, bez obmedzenia na uvedené príklady.

Skupina mikroorganizmov spôsobujúcich infekcie močového traktu zahrňujú kmene E. coli, Proteus, Providentia, Pseudomonas, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Coag. neg. Staphylococci, Enterococci a C. trachomatis, bez obmedzenia na uvedené príklady.

Skupina kožných infekcií a infekcií rán zahrňuje erytrazmu, panarícium, impetigo, folikulitídu, eryzipel, celulitídu a nekrotizujúcu fasciitídu, bez obmedzenia na uvedené príklady.

Skupina mikroorganizmov spôsobujúcich kožné infekcie a infekcie rán zahrňuje kmene Streptococci, Staphylococci, P. aeruginosa, P. acnes, Clostridia, anaerobes, B. fragilis.

Skupina mikroorganizmov spôsobujúcich systémové infekcie (bakterémie) zahrňuje kmene Streptococci, Staphylococci, Enterobacteriaceae, Pseudomonas, Bacteroides sp., Neisseria, H. influenzae, Brucella, Listeria a S. typhi, bez obmedzenia na tieto príklady.

Skupina pohlavne prenosných ochorení bakteriálneho pôvodu zahrňuje adnexitídu, cervicitídu, chanchroidu, uretritídu, balanitídu, kvapavku, lymphogranuloma venereum, syfilis a ingvinálny granulóm, bez obmedzenia na tieto príklady.

Skupina mikroorganizmov spôsobujúcich pohlavne prenosné ochorenia zahrňuje kmene Chlamydia, N. gonorrhoeae, U. urealyticum, T. pallidium, G. vaginalis, H. ducreyi, C. granulomatis, Streptococci, Staphylococci a Enterobacteriae, bez obmedzenia na tieto príklady.

Skupina gastrointestinálnych infekcií bakteriálneho pôvodu zahrňuje infekcie pochádzajúce z potravy, kolitídu, enteritídu, žalúdočné vredy, vred na dvanástniku, pankreatitidu, infekcie žlčníka, choleru a týfus, bez obmedzenia na tieto príklady.

256/3

Skupina mikroorganizmov spôsobujúcich gastrointestinálne infekcie zahrňuje kmene H. pylón, C. pylori, C.duodeni, S. typhi, S. paratyphi, V. cholerae, anaerobes, Enterobacteriaceae, Staphylococci a Streptococci, bez obmedzenia na tieto príklady.

Spôsoby liečby pacientov

Heterocyklické zlúčeniny tu opísaných všeobecných vzorcov je možné podávať pacientovi a to napríklad za účelom liečby infekcie, akou je bakteriálna infekcia. Heterocyklické zlúčeniny podľa predmetného vynálezu je možné podávať napríklad vo farmaceutický prijateľnom nosiči, akým je fyziologický roztok, v kombinácii s inými liečivami a/alebo spolu s vhodnými excipientami. Heterocyklické zlúčeniny tu opísaných všeobecných vzorcov môžu byť podávané napríklad injekciou, intravenózne, intraarteriálne, subdermálne, intraperitoneálne, intramuskulárne alebo subkutánne; alebo orálne, bukálne, nazálne, transmukózne, topicky, v očnom alebo ušnom farmaceutickom prípravku alebo inhalačné, pričom uvedená zlúčenina sa podáva v dávke v rozmedzí od približne 0,001 miligramu/kilogram telesnej hmotnosti do približne 100 miligramov/kilogram telesnej hmotnosti, výhodne v dávke od 10 miligramov/dávku do 5000 miligramov/dávku, ktorá sa podáva každé 4 hodiny až každých 120 hodín, alebo podľa požiadaviek konkrétneho liečiva.

Ako je skúsenému odborníkovi zrejmé, môžu sa pacientovi podávať nižšie alebo vyššie ako hore uvedené dávky zlúčenín podľa tohto vynálezu. Konkrétna dávka zlúčeniny podľa predmetného vynálezu a liečebné režimy pre konkrétneho pacienta sú závislé od rôznych faktorov, ktorých skupina zahrňuje účinnosť konkrétne použitej zlúčeniny, vek pacienta, telesnú hmotnosť pacienta, celkový zdravotný stav pacienta, pohlavie pacienta, diétu pacienta, dobu podávania zlúčeniny, rýchlosť vylučovania zlúčeniny, závažnosť a priebeh danej choroby, daného stavu alebo symptómov, pacientovu dispozíciu k danému ochoreniu, danému stavu alebo symptómom a posúdenie ošetrujúcim lekárom.

256/B

Na zlepšenie pacientovho stavu môže byť v prípade nutnosti podávaná udržiavacia dávka zlúčeniny, kompozície alebo kombinácie podľa predmetného vynálezu. Neskoršie je možné v závislosti od symptómov znížiť dávku alebo frekvenciu podávania danej zlúčeniny alebo oboje a to na požadovanú úroveň, ktorá postačuje na udržovanie zlepšeného stavu pacienta, a keď uvedené symptómy ustúpia na požadovanú úroveň môže byť daná liečba úplne ukončená. Avšak u pacientov môže byť po opakovanom výskyte symptómov ochorenia potreba aplikovať dlhodobú intermitentnú liečbu.

V alternatívnom uskutočnení sa predmetný vynález týka spôsobov liečenia, prevencie alebo tlmenia symptómov ochorenia u cicavca, ktorý zahrňuje stupeň, v ktorom sa uvedenému cicavcovi podávajú vyššie opísané farmaceutické kompozície a kombinácie. Vo výhodnom uskutočnení je uvedeným cicavcom človek. Pokiaľ farmaceutická kompozícia podľa tohto vynálezu zahrňuje ako aktívnu zložku iba zlúčeniny podľa predmetného vynálezu, môžu uvedené spôsoby ďalej zahrňovať stupeň, v ktorom sa uvedenému cicavcovi podáva ďalšie terapeutické činidlo, akými sú napríklad makrolidové antibiotiká (ktorých príkladom je klaritromycin), inhibítory protónovej pumpy (ktorých príkladom je omeprazol), rifamycíny (akým je napríklad rifampin), aminoglykozidy (ktorých príkladom je streptomycín, gentamycin, tobramycin), penicilíny (akými sú napríklad penicilín G, penicilín V, tikarcilin), inhibítory β-laktamázy, cefalosporíny (akými sú napríklad cefazolin, cefaklor, ceftazidim) a antimykobakteriálne činidlá (akými sú napríklad isoniazid, ethambutol). Ďalšie vhodné činidlá sú uvedené v textoch a publikáciách týkajúcich sa infekčných ochorení, ktorých skupina zahrňuje napríklad publikáciu Principles and Practice of Infectious Diseases, editori G. Ľ. Mandell a spolupracovníci, 3. vydanie, Churchhill Livingstone, New York, (1990). Uvedené ďalšie terapeutické činidlo môže byť cicavcovi podávané pred, súbežne s alebo po podaní farmaceutickej kompozície obsahujúcej zlúčeniny ktoréhokoľvek všeobecného vzorca opísaného v tomto texte.

Farmaceutické kompozície podľa predmetného vynálezu zahrňujú zlúčeninu tu opísaných všeobecných vzorcov alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ; ďalšie činidlo vybrané zo skupiny zahrňujúcej protirakovinové činidlo,

256/B antivírusové činidlo, antifungálne činidlo, antibiotikum; a farmaceutický prijateľný nosič, pomocnú látku alebo vehikulum. Alternatívne farmaceutické kompozície podľa predmetného vynálezu zahrňujú zlúčeniny tu opísaných všeobecných vzorcov alebo jej farmaceutický prijateľnú soľ; a farmaceutický prijateľný nosič, pomocnú látku alebo vehikulum. Uvedené kompozície môžu prípadne rovnako zahrňovať ďalšie terapeutické činidlá, ktorých skupina zahrňuje napríklad ďalšie činidlo vybrané zo skupiny zahrňujúcej protirakovinové činidlo, antimikrobiálne Činidlo, antivírusové činidlo, antifungálne činidlo, inhibítor protónovej pumpy a antibiotikum. Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu obsahujú zlúčeniny tu opísaných všeobecných vzorcov a ďalšie terapeutické činidlá, pokiaľ sú tieto v nich prítomné, v množstvách, ktoré sú účinné na dosiahnutie modulácie mikrobiálnych alebo bakteriálnych hladín.

Výrazom “farmaceutický prijateľný nosič alebo pomocná látka sa rozumie nosič alebo pomocná látka, ktoré môžu byť podávané pacientovi spolu so zlúčeninou podľa tohto vynálezu, pričom neiikvidujú farmakologický účinok zlúčeniny podľa tohto vynálezu a nie sú toxické pri podaní v dávkach dostatočných pre dodanie terapeuticky účinného množstva danej zlúčeniny podľa tohto vynálezu do organizmu.

Skupina farmaceutický prijateľných nosičov, pomocných látok a vehikulov, ktoré môžu byť použité vo farmaceutických kompozíciách podľa tohto vynálezu, zahrňuje meniče iónov, oxid hlinitý, stearát hlinitý, lecitín, samoemulgačné systémy na dopravu liečiv (SEDDS), akým je d-atokoferolpolyetylénglykol 1000 sukcinát, povrchovo aktívne látky používané vo farmaceutických dávkových formách, akými sú produkty typu Tween alebo podobné polymérne matrice na dopravu liečiv, sérové proteíny, akým je ľudský sérový albumín, pufrovacie látky, akými sú fosfáty, glycín, kyselina sorbová, sorbát draselný, zmesi parciálnych glyceridov nasýtených rastlinných mastných kyselín, voda, soli alebo elektrolyty, akými sú protamínsulfát, hydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan draselný, chlorid sodný, soli zinku, koloidný oxid kremičitý, trikremičitan horečnatý, polyvinylpyrolidón, látky na báze celulózy, polyetylénglykol, sodná soľ karboxymetylcelulózy,

256/B polyakryláty, vosky, polyetylén-polyoxypropylénové blokové polyméry, polyetylénglykol a lanolín, bez obmedzenia na tieto príklady. Za účelom uľahčenia dodávania zlúčenín tu opísaných všeobecných vzorcov do organizmu je rovnako možné výhodne použiť cyklodextríny, akými sú α-, β- a γcyklodextrín, alebo ich chemicky modifikované deriváty, akými sú hydroxyalkylcyklodextríny, včítane 2- a 3-hydroxypropyl-p-cyklodextrínov.

Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu je možné podávať orálne, parenterálne, pomocou inhalačného spreja, topicky, rektálne, nazálne, bukálne, vaginálne alebo prostredníctvom implantovaného zásobníka, výhodne sa potom farmaceutická kompozícia podľa tohto vynálezu podáva orálne alebo injekčné. Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu byť vytvorené zo zlúčenín podľa predmetného vynálezu v kryštalickej alebo nekryštalickej forme. Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu obsahovať akékoľvek obvykle používané netoxické farmaceutický prijateľné nosiče, pomocné látky alebo vehikulá. V niektorých prípadoch môže byť pH danej kompozície upravené pomocou farmaceutický prijateľných kyselín, báz alebo pufrov a to za účelom zvýšenia stability zlúčeniny alebo jej formy obsiahnutej v uvedenej kompozícii na dodanie do organizmu. Výraz “parenterálne” tak, ako je použitý v tomto texte, v sebe zahrňuje subkutánne, intrakutánne, intravenózne, intramuskulárne, intraartikulárne, intraarteriálne, intrasynoviálne, intrasternálne, intratekálne, intralezionálne a intrakraniálne injekčné alebo infúzne techniky.

Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu mať formu sterilného injekčného prípravku, akým je napríklad sterilná injekčná vodná alebo olejnatá suspenzia. Tieto suspenzie je možné formulovať v súlade s postupmi, ktoré sú v danej oblasti techniky známe a pri ktorých sa používajú vhodné dispergačné alebo zmáčacie činidlá (ako je napríklad činidlo Tween 80) a suspendačné činidlá. Uvedeným sterilným injekčným prípravkom môže rovnako byť sterilný injekčný roztok alebo suspenzia v netoxickom, parenterálne prijateľnom riedidle alebo rozpúšťadle, akým je napríklad sterilný roztok v 1,3-butándiole. Medzi uvedené prijateľné vehikulá a rozpúšťadlá, ktoré je možné použiť podľa tohto vynálezu, patria manitol, Ringerov roztok

V “>S6/R a izotonický roztok chloridu sodného. Ďalej sa ako rozpúšťadlo alebo suspendačné médium bežne používajú sterilné netuhnúce oleje. Za týmto účelom je možné použiť akýkoľvek nedráždivý netuhnúci olej, včítane syntetických mono- a diglyceridov. Na prípravu injekčných prípravkov je možné použiť mastné kyseliny, akou je kyselina olejová a jej glyceridové deriváty, a rovnako tak prírodné farmaceutický prijateľné oleje, akým je olivový olej alebo ricínový olej, a to najmä v ich polyoxyetylovaných formách. Tieto olejové roztoky alebo suspenzie môžu rovnako obsahovať riedidlo alebo dispergačné činidlo, ktorým je alkohol s dlhým reťazcom, alebo karboxymetylcelulózu alebo podobné dispergačné činidlá, ktoré sa bežne používajú pri formulovaní farmaceutický prijateľných dávkových foriem, akými sú emulzie a/alebo suspenzie. Na formulovanie kompozícií podľa tohto vynálezu je možné použiť i ďalšie bežne používané povrchovo aktívne látky, akými sú činidlá typu Tween alebo Span, a/alebo ďalšie podobné emulgačné činidlá alebo činidlá na zvýšenie biologickej dostupnosti, ktoré sa bežne používajú pri výrobe farmaceutický prijateľných pevných, kvapalných alebo iných dávkových foriem.

Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu byť podávané orálne v akejkoľvek orálne prijateľnej dávkovej forme, ktorých skupina zahrňuje kapsuly, tablety, emulzie a vodné suspenzie, disperzie a roztoky, bez obmedzenia na uvedené príklady. V prípade tabliet na orálne použitie patrí medzi bežne používané nosiče laktóza a kukuričný škrob. Do uvedených tabliet sa tiež obvykle pridávajú lubrikačné činidlá, akým je stearát horečnatý. Medzí vhodné riedidlá na použitie v kapsulách na orálne podávanie patrí laktóza a sušený kukuričný škrob. Pokiaľ sa orálne podávajú vodné suspenzie a/alebo emulzie, môže byť daná aktívna zložka suspendovaná alebo rozpustená v olejovej fáze a zmiešaná s emulgačnými a/alebo suspendačnými činidlami. V prípade potreby môžu byť do týchto farmaceutických kompozícií pridané určité sladiace a/alebo chuťové a/alebo farbiace činidlá.

Farmaceutické kompozície podľa predmetného vynálezu sa môžu rovnako podávať vo forme rektálnych čapíkov. Tento typ kompozície je možné pripraviť zmiešaním zlúčeniny podľa tohto vynálezu s vhodným nedráždivým excipientom, ktorý je tuhý pri teplote miestnosti, avšak ktorý je kvapalný pri

256/B rektálnej teplote, takže v rekte dochádza ku jeho rozpusteniu a uvoľneniu daných aktívnych zložiek. Skupina takýchto materiálov zahrňuje kakaové maslo, včelí vosk a polyetylénglykoly, bez obmedzenia na tieto príklady.

Topické podávanie farmaceutických kompozícií podľa tohto vynálezu je obzvlášť vhodné ak požadovaná liečba zahrňuje plochy alebo orgány ľahko prístupné topickej aplikácii. Na topickú aplikáciu na kožu by mala byť farmaceutická kompozícia podľa tohto vynálezu formulovaná vo forme vhodnej masti obsahujúcej aktívne zložky suspendované alebo rozpustené v nosiči. Skupina nosičov na topické podávanie zlúčenín podľa tohto vynálezu zahrňuje minerálny olej, kvapalný petrolej, bielu vazelínu, propylénglykol, polyoxyetylénpolyoxypropylénovú zlúčeninu, emulgačný vosk a vodu, bez obmedzenia na tento zoznam. V alternatívnom prípade je možné farmaceutickú kompozíciu podľa tohto vynálezu formulovať vo forme vhodného pleťového roztoku alebo krému obsahujúceho aktívnu zlúčeninu suspendovanú alebo rozpustenú v nosiči spolu s vhodnými emulgačnými činidlami. Skupina vhodných nosičov zahrňuje minerálny olej, monostearát sorbitanu, polysorbát 60, cetylesterový vosk, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol a vodu. Farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu môžu byť topicky aplikované rovnako do spodnej časti intestinálneho traktu, a to vo forme rektálnych čapíkov alebo vo vhodnej klystírovej forme. Do rozsahu tohto vynálezu spadajú i farmaceutické kompozície vo forme topických transdermálnych náplastí.

Farmaceutické kompozície podľa predmetného vynálezu môžu byť podávané vo forme nazálneho aerosólu alebo inhalácií. Tento typ kompozície sa pripravuje v súlade s postupmi, ktoré sú v odbore formulovania farmaceutických kompozícií dobre známe, pričom môžu byť pripravené vo forme roztokov vo fyziologickom roztoku s použitím benzylalkoholu alebo iných vhodných konzervačných látok, látok podporujúcich absorpciu za účelom zvýšenia biologickej dostupnosti, fluóruhľovodíkov a/alebo rozpúšťacích alebo dispergačných činidiel, ktoré sú v danej oblasti techniky známe.

Zlúčeniny a kompozície podľa tohto vynálezu sú vhodné na použitie ako sterilizačné činidlá, antiseptiká, pomocné látky (adjuvans) v obkladoch na rany

256/B (napr. v bandážach) a ako pomocné látky pri metódach čistenia rán (žalúdočné sondy atd.).

Pri monoterapii a/alebo kombinačnej terapii za účelom prevencie a liečby mikrobiálne sprostredkovaného ochorenia sa vhodne používajú dávky antimikrobiálnych zlúčenín opísaných v tomto texte v rozmedzí od približne 0,01 miligramu/kilogram telesnej hmotnosti a deň do približne 100 miligramov/kilogram telesnej hmotnosti a deň, v alternatívnom prípade sa používajú dávky v rozmedzí od približne 0,5 miligramov/kilogram telesnej hmotnosti a deň približne 75 miligramov/kilogram telesnej hmotnosti a deň (napr. od približne 10 miligramov/dávku do 5000 miligramov/dávku). Obvykle sa farmaceutické kompozície podľa tohto vynálezu podávajú približne raz až približne šesťkrát denne alebo, v alternatívnom prípade, vo forme kontinuálnej infúzie. Uvedené podávanie je možné použiť ako trvalú alebo akútnu terapiu. Množstvo aktívnej zložky, ktoré môže byť skombinované s nosičovými materiálmi za vzniku jedinej dávkovej formy, sa mení podľa liečeného subjektu a konkrétneho režimu podávania. Typická farmaceutická kompozícia podľa tohto vynálezu obsahuje od približne 5 hmotnostných percent do približne 95 hmotnostných percent aktívnej zlúčeniny. V alternatívnom prípade obsahujú uvedené farmaceutické kompozície od približne 20 percent do približne 80 percent aktívnej zlúčeniny. Pokiaľ zlúčeniny podľa tohto vynálezu zahrňujú kombináciu zlúčeniny ktoréhokoľvek z tu opísaných všeobecných vzorcov a jedného alebo viacerých ďalších terapeutických alebo profylaktických činidiel, mala by každá z týchto zložiek, tj. zlúčeniny podľa tohto vynálezu a uvedené ďalšie činidlo, byť obvykle prítomné v dávke odpovedajúcej približne 10 až 100 percentám, výhodnejšie približne 10 až 80 percentám dávky normálne podávanej pri monoterapeutickom liečebnom režime. Uvedené ďalšie činidlá sa môžu podávať oddelene od zlúčenín podľa tohto vynálezu ako časť viacdávkového liečebného režimu. V alternatívnom prípade môžu uvedené činidlá byť časťou jedinej dávkovacej formy a môžu byť zmiešané so zlúčeninami podľa tohto vynálezu v jedinej farmaceutickej kompozícii.

Ďalšie použitie

V alternatívnom uskutočnení môžu byť inhibičné zlúčeniny opísané v tomto texte použité ako platformy alebo základné stavebné prvky, ktoré je možné využiť pri technikách kombinatorickej chémie na prípravu derivátov zlúčenín podľa tohto vynálezu a/alebo chemických knihovní zložených zo zlúčenín podľa tohto vynálezu. Uvedené deriváty alebo knihovne majú antimikrobiálne účinky a sú vhodné na identifikáciu a navrhovanie zlúčenín s antimikrobiálnym účinkom. Kombinatorické techniky vhodné na využitie v spojení so zlúčeninami opísanými v tomto texte sú v danej oblasti techniky známe a boli opísané napríklad v publikácii Obrecht, D. a Villalgrodo, J. M., Solid-Supported Combinatorial and Parallel Synthesis of Small-MolecularWeight Compound Libraries, Pergamom-EIsevier Science Limited (1998), pričom ich skupina zahrňuje syntézny postup označovaný spojením “split and pooľ (teda “rozštiep a zmiešaj”) alebo “paralelná syntéza, syntéza na pevnej fáze a v roztoku a kódovacie techniky (viď. napríklad publikácie Czarnik, A. W., Curr. Opin. Chem. Bio., 1, 60, (1997)). Jedno z uskutočnení predmetného vynálezu sa tak týka spôsobu použitia zlúčenín tu opísaných všeobecných vzorcov pre prípravu derivátov alebo chemických knihovní, ktorý zahrňuje 1) obstaranie telesa obsahujúceho veľa jamiek; 2) pridanie jednej alebo viacerých zlúčenín všeobecných vzorcov opísaných v tomto texte do každej jamky; 3) pridanie ďalšej aspoň jednej chemikálie do každej jamky; 4) izoláciu vzniknutého jedného alebo viacerých produktov z každej jamky. V alternatívnom uskutočnení sa tento vynález ďalej týka spôsobu použitia zlúčenín tu opísaných všeobecných vzorcov na prípravu derivátov alebo chemických knihovní, ktorý zahrňuje 1) prípravu jednej alebo viacerých zlúčenín tu opísaných všeobecných vzorcov naviazanej/naviazaných na pevný nosič; 2) reakciu uvedenej/uvedených jednej alebo viacerých zlúčenín tu opísaných všeobecných vzorcov naviazanej/naviazaných na pevný nosič s jednou alebo viacerými ďalšími chemikáliami; 3) izoláciu vzniknutého jedného alebo viacerých produktov z uvedeného pevného nosiča. Pri vyššie opísaných spôsoboch môžu byť ku zlúčeninám tu opísaných všeobecných vzorcov alebo ich derivátom naviazané a/alebo z nich môžu byť odštiepené “visačky”, tj. identifikátory alebo označené skupiny, a to za účelom uľahčenia sledovania,

256/B identifikácie alebo izolácie požadovaných produktov alebo ich medziproduktov. Povaha takýchto skupín je v danom odbore známa. Skupina chemikálií používaných pri vyššie opísaných spôsoboch môže zahrňovať napríklad rozpúšťadlá, reakčné činidlá, katalyzátory, chrániace skupiny a činidlá na odštiepenie chrániacich skupín apod. Príklady takých chemikálií sú opísané v rôznych textoch a monografiách týkajúcich sa chemickej syntézy a zavádzania chrániacich skupín, ktoré boli citované v predchádzajúcom texte.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu obsahovať jedno alebo viac asymetrických centier a môžu tak existovať vo forme racemátov a racemických zmesí, vo forme jediného enantioméru, jednotlivých diastereoizomérov a vo forme diastereoizomérnych zmesí. Všetky tieto izomérne formy uvedených zlúčenín spadajú do rozsahu tohto vynálezu. Zlúčeniny podľa predmetného vynálezu môžu rovnako existovať vo viacerých tautomérnych formách, pričom v týchto prípadoch zahrňuje tento vynález všetky tautomérne formy zlúčenín opísaných v tomto texte (tak napr. alkylácia kruhového systému môže viesť ku alkylácii na niekoľkých miestach, pričom do rozsahu tohto vynálezu spadajú všetky takéto reakčné produkty). Zlúčeniny podľa predmetného vynálezu môžu rovnako existovať v cis- alebo trans- alebo E- alebo Z- izomérnych formách dvojitej väzby. Do rozsahu tohto vynálezu tak opäť spadajú všetky izomérne formy takýchto zlúčenín. Do rozsahu tohto vynálezu spadajú rovnako všetky kryštalické formy tu opísaných zlúčenín.

256/B

Predmet vynálezu bude ďalej opísaný pomocou nasledujúcich príkladov. Uvedené príklady slúžia len na ilustráciu a nijako neobmedzujú rozsah tohto vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Údaje týkajúce sa kvapalinovej chrómatografie boli získané pomocou kvapalinového chromatografu Hewlett-Packard (HP) Šerieš 1090, ktorý bol pripojený k detektoru s diódovým polom, pričom vlastná chromatografia bola uskutočňovaná za nasledujúcich podmienok: kolóna Restek Allure C-18; veľkosť častíc 5 mikrometrov; dĺžka kolóny 150 milimetrov; priemer kolóny 4,6 milimetra; prietok 1 mililiter/minútu; gradientová elúcia zmesí 95 percent vody (obsahujúcej 0,1 hmotnostného percenta kyseliny trifluóroctovej (TFA))/5 percent acetonitrilu (obsahujúceho 0,1 hmotnostného percenta kyseliny trifluóroctovej (TFA)) až 100 percent acetonitrilu (obsahujúceho 0,1 hmotnostného percenta kyseliny trifluóroctovej (TFA)), pričom k uvedenej zmene polarity došlo počas 8 minút, s následnou 3 minútovou izokratickou elúciou kolóny; detekčná vlnová dĺžka 254 nanometrov. Hmotnostné spektrá boli merané buď na zariadení Agilent 1100 LC/MS alebo na LC/MS systéme Thermofinigan AQA/Gilson. ¹H NMR spektrá boli merané na zariadení Bruker AC-300MHz. Strednotlaková okamžitá chromatografia bola uskutočňovaná na systéme Combiflash Sg100c od spoločnosti Isco, Inc. Chromatografia na tenkej vrstve bola uskutočňovaná na plastových TLC platniach EM Science silica gel 60 F254. Teploty topenia boli merané v otvorených kapilarách v zariadeniach Melttemp II. Na detekciu zlúčenín na TLC platniach bolo použité ultrafialové žiarenie. Reakčné činidlá použité pri jednotlivých reakciách boli od spoločnosti Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wl, USA), Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA), Fluka Chemical Corp. (Milwaukee, Wl, USA), Fisher Scientific (Pittsburg, PA, USA), TCI America (Portland, OR, USA), Transworld Chemicals, Inc. (Rockville, MD, USA), Maybridge Chemicals Ltd. (Londýn, Veľká Británia) alebo od spoločnosti Lancaster Synthesis (Windham, NH, USA).

256/B

Príklad 1

Syntéza inhibítorov ligázy

N7-Metyl-N7-(1-naftalén-1-y]propyI)pyrimido[4,5-d]pyrimidín-2,4,7-triamín

Zlúčenina 1: K roztoku 4,25 gramov (27,2 milimolu) naftaldehydu v 30 mililitroch suchého éteru, ktorý bol umiestnený v ľadovom kúpeli, bolo pomaly pridané 13 mililitrov (3 moly) roztoku etylmagnéziumbromidu v étere. Zmes bola miešaná ďalších 30 minút pri teplote miestnosti a následne rozložená 40 mililitrami Imolárnej kyseliny chlorovodíkovej. Organická vrstva bola premytá 20 mililitrami vody, 2 x 20 mililitrami nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného, 20 mililitrami solänky a potom vysušená nad bezvodým síranom sodným. Odparením tejto organickej vrstvy bol získaný surový produkt 1_, ktorý bol bez ďalšieho prečistenia použitý v nasledujúcom reakčnom stupni.

256/B

Zlúčenina 2: Surový produkt 1 bol rozpustený v 30 mililitroch acetónu a ku vzniknutej zmesi, ktorá bola umiestnená v ľadovom kúpeli, bolo pomaly pridávané Joneovo činidlo až do trvalo hnedého zafarbenia reakčnej zmesi. Roztok bol ďalej 15 minút miešaný pri teplote miestnosti a potom k nemu bolo pridané 5 mililitrov izopropylalkoholu. Po pridaní 50 mililitrov etylacetátu bola výsledná zmes premytá 30 mililitrami vody, 2 x 30 mililitrami nasýteného roztoku hydrogénuhličitanu sodného, nasýteným roztokom chloridu sodného a organická vrstva bola vysušená nad bezvodým síranom sodným. Odparením organických rozpúšťadiel bol získaný olejovitý zvyšok, ktorý bol prečistený chromatografiou na stĺpci silikagélu, čim bolo získané 4,01 gramu ketónu 2.

Zlúčenina 3: Ku zmesi 4,01 gramu ketónu 2 a 16,3 mililitra (2 móly) metylamínu v metanole bol pridané 1,61 gramu kyanoborohydridu sodného a 160 mililitrov chloridu zinočnatého. Vzniknutá zmes bola miešaná cez noc pri teplote 50 °C a následne rozložená Imolárnou kyselinou chlorovodíkovou. Po odstránení väčšiny metanolu vo vákuu bol zvyškový roztok extrahovaný 2x15 mililitrami dichlórmetánu. Hodnota pH vodnej vrstvy bola upravená pomocou 2 molárneho roztoku hydroxidu sodného na približne 9 a následne bol produkt extrahovaný 3 x 15 mililitrami dichlórmetánu. Spojené organické vrstvy boli premyté nasýteným roztokom chloridu sodného a vysušené nad bezvodým síranom sodným. Odparením rozpúšťadla bolo získané 3,54 gramu zlúčeniny 3.

Zlúčenina 4: Zmes 2,89 gramu (14,5 milimolu) pyrimidínu 11. 3,54 gramu (15 milimolov) zlúčeniny 3 a 2,5 mililitra (18 milimolov) trietylamínu v 25 mililitroch 2-metoxyetanolu bola 2 hodiny miešaná pri teplote 80 °C. Výsledná zmes bola ochladená na teplotu miestnosti a odparením rozpúšťadla bo! získaný olejovitý zvyšok. Tento zvyšok bol rozpustený v 30 mililitroch etylacetátu a vzniknutý roztok bol trikrát premytý vodou a vysušený nad bezvodým síranom sodným. Odparením roztoku bol získaný olejovitý zvyšok, ktorý bol prečistený chromatografiou na stĺpci silikagélu, čím bolo získané 3,95 gramu produktu 4 vo forme bieleho prášku.

256/B

N7-Metyl-N7-(1 -naftalén-1 -ylpropyl)pyrimido[4,5-d]pyrimidín-2,4,7-triamín

K roztoku 3,60 gramu zlúčeniny 4 v 40 mililitroch 2-metoxyetanolu bolo pridané 24 mililitrov Imolárneho roztoku guanidínu v metanole a 16 mililitrov 1,5molárneho roztoku CH₃ONa v metanole. Zmes bola 12 hodin miešaná pri teplote 140 °C, pričom počas tejto doby znej bol pomocou Dean-Starkovho nástavca odstraňovaný metanol. Potom bola reakčná zmes ponechaná vychladnúť a odparená vo vákuu, čím bol získaný olejovitý zvyšok, ktorý bol rozpustený v 30 mililitroch metanolu. Ku uvedenému roztoku bolo na vyzrážanie produktu pridané 50 mililitrov vody. Vyzrážaný produkt bol následne prečistený kryštalizáciou z metanolu a prekryštalizovaný produkt bol trikrát miešaný v metanole. Týmto postupom bolo získané 1,95 gramu produktu vo forme bieleho prášku. Čistota tohto produktu bola podľa analýzy vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) vyššia než 99 percent.

N7-(1-Benzo[b]tiofén-3-yletyl)-N7-metylpyrimido-[4,5-d]pyrimidín-2,4,7-triamín

Zmes 2,89 gramu (14,5 milimólu) pyrimidínu 11, 2,87 gramu (15 milimolov) metylamínu 1a a 2,5 mililitra (18 milimólov) trietylamínu v 25 mililitroch 2-metoxyetanolu bola miešaná 2 hodiny pri teplote 80 °C. Reakčná zmes bola ponechaná vychladnúť na teplotu miestnosti a rozpúšťadlo bolo

3? 256/B odparené, čim bol získaný olejovitý zvyšok. Uvedený zvyšok bol rozpustený v 30 mililitroch etylacetátu a vzniknutý roztok bol trikrát premytý vodou a vysušený nad bezvodým síranom sodným. Odparením bol získaný olejovitý zvyšok, ktorý bol prečistený prekryštalizovaním zo zmesi éter/hexán. Bolo získané 3,95 gramu produktu 1b vo forme bieleho prášku.

Ku roztoku 3,71 gramu zlúčeniny la v40 mililitroch 2-metoxyetanolu bolo pridané 24 mililitrov 1 molárneho roztoku guanidínu v metanole a 16 mililitrov 1,5molárneho roztoku CbUONa v metanole. Zmes bola 12 hodín miešaná pri teplote 140 °C, pričom počas tejto doby z nej bol pomocou DeanStarkovho nástavca odstraňovaný metanol. Potom bola reakčná zmes ponechaná vychladnúť a odparená vo vákuu, čím bol získaný olejovitý zvyšok, ktorý bol rozpustený v 30 mililitroch metanolu. K uvedenému roztoku bolo na vyzrážanie produktu pridané 50 mililitrov vody. Vyzrážaný produkt bol následne prečistený kryštalizáciou z metanolu a prekryštalizovaný produkt bol trikrát miešaný v metanole. Týmto postupom bolo získané 920 miligramov produktu vo forme bieleho prášku. Čistota tohto produktu bola podľa analýzy vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) 98,52 percenta.

N7-Metyl-N7-[1-(4-metylnaftalén-1-yl)etyl]pyrimido-[4,5-d]pyrimidín-2,4,7-triamín n 746/R

Na prípravu N7-metyl-N7-[1 -(4-metylnaftalén-1 -yl)etyl]pyrimido[4,5d]pyrimidín-2,4,7-triamínu bol použitý podobný postup ako na prípravu N7-(1~ benzo[b]tiofén-3-yletyl)-N7-metylpyrimido[4,5-d]pyrimidín-2,4,7-triamínu. Bolo získané 860 miligramov konečného produktu vo forme bieleho prášku, ktorého čistota podľa analýzy vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) bola 98,80 percenta.

Syntéza 7-amino-substituovaných pyrimidopyrimidínov (zlúčenín všeobecného vzorca (IV))

NH.

(iv)

Amíny všeobecného vzorca (II) boli pripravené reduktívnou amináciou 1acetonaftónu s odpovedajúcimi amínmi (viď. schéma 2).

256'B

Schéma 2

(IIA) terc. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)etyl]amino)etyl)-karbamát

Ku roztoku 152 mikrolitrov (1 milimól) 1-acetonaftónu v 2 militroch acetonitrilu bolo pridané 189 mikrolitrov (1,2 milimolu) terc. butyl-N-(2aminoetyl)karbamátu, 126 miligramov (2 milimóly) NaBhhCN a 136 miligramov (1 milimól) bezvodého chloridu zinočnatého. Reakčná zmes bola zahrievaná v liekovke so skrutkovým uzáverom cez noc na teplotu 80 °C za neustáleho miešania magnetickým miešadlom. Vylúčená zrazenina bola odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Získaný zvyšok bol rozpustený v 3 mililitroch 0,1molárnej kyseliny chlorovodíkovej a extrahovaný 2x5 mililitrami dichlórmetánu. Spojené organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené. Surový produkt bol prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so 1.

256/B samotným dichlórmetánom a 2. zmesou dichlórmetán/metanol (10:0,1), čím bol získaný biely voskovitý produkt, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 77 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ^,3C NMR; MS (m/z): 315 (MH⁺).

(IIB) terc. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)etyl]amino}propyl)-karbamát

Ku roztoku 152 mikrolitrov (1 milimól) 1-acetonaftónu v 2 militroch acetonitrilu bolo pridané 209 mikrolitrov (1,2 milimólu) terc. butyl-N-(3aminopropyl)karbamátu, 126 miligramov (2 milimóly) NaBH₃CN a 136 miligramov (1 milimól) bezvodého chloridu zinočnatého. Reakčná zmes bola zahrievaná 70 hodín v liekovke so skrutkovým uzáverom na teplotu 80 °C za neustáleho miešania magnetickým miešadlom. Vylúčená zrazenina bola odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Získaný zvyšok bol rozpustený v 3 militroch 0,1molárnej kyseliny chlorovodíkovej a extrahovaný 1 x 5 mililitrami dichlórmetánu. Organická vrstva bola vysušená nad bezvodým síranom sodným a odparená. Surový produkt bol prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so 1. zmesou dichlórmetán/metanol (10:0,1) a 2. zmesou dichlórmetán/metanol (10:1), čím bol získaný olejovitý produkt, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 70 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 329 (MH⁺).

(IIC) terc. butyl-N-(2-{-([1-(1-naftyl)etyl]amino}butyl)-karbamát

Ku roztoku 152 mikrolitrov (1 milimól) 1-acetonaftónu v 2 mililitroch acetonitrilu bolo pridané 229 mikrolitrov (1,2 milimólu) N-Boc-1,4diaminobutánu, 126 miligramov (2 milimóly) NaBH₃CN a 136 miligramov (1 milimól) bezvodého chloridu zinočnatého. Reakčná zmes bola zahrievaná 55 hodín v liekovke so skrutkovým uzáverom na teplotu 80 °C za neustáleho miešania magnetickým miešadlom. Vylúčená zrazenina bola odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Získaný zvyšok bol rozpustený v 3 militroch 0,1molárnej kyseliny chlorovodíkovej a extrahovaný 1 x 5 mililitrami dichlórmetánu. Organická vrstva bola vysušená nad bezvodým síranom sodným a odparená. Surový produkt bol prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou s 1.

256/B zmesou dichlórmetán/metanol (10:0,1) a 2. zmesou dichlórmetán/metanol (10:1), čím bol získaný olejovitý produkt, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 80 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 343 (MH⁺).

Schéma 3

(IHA) 4-amino-2-{ [4-aminoetyl) [1-naftyl)etyl]amino}-5-pyrimidínkarbonitril

Do liekovky so skrutkovým uzáverom bolo umiestnené 199 miligramov (1 milimól) 4-amino-2-brómpyrimidín-5-karbonitrilu, 377 miligramov (1,2 milimólu) terc. butyl-N-(2-{[1-(1-naftyl)-etyl]amino}etyl)karbamátu (HA), 342 mikrolitrov (2 milimóly) Ν,Ν-diizopropyletylamínu (DIEA) a 2 mililitre 2-metoxyetanolu) a táto zmes bola 4 hodiny zahrievaná na 150 °C. Z reakčnej zmesi bol odparený 2metoxyetanol, získaný zvyšok bol rozpustený v 3 mililitroch 0,1molárnej kyseliny chlorovodíkovej a extrahovaný 2x5 mililitrami dichlórmetánu. Spojené organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené.

256/B

Surový produkt bol prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so zmesou dichlórmetán/metanol (10:0,1), čím bol získaný biely amorfný produkt.

K uvedenému amorfnému produktu bol pridaný 1 mililiter studeného 50 percentného roztoku kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne a vzniknutá zmes bola miešaná 1 hodinu pri teplote miestnosti. Roztok bol odparený, ku surovému produktu bol pridaný nasýtený roztok uhličitanu sodného a zmes bola extrahovaná 2x5 militrami dichlórmetánu. Organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené. Týmto postupom bol získaný pevný biely produkt, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 36 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 333 (MH⁺).

(IIIB) 4-amino-2-{[4-aminopropyl)[1-naftyl)etyl]amino}-5-pyrimidínkarbonitril

Do liekovky so skrutkovým uzáverom bolo umiestnené 199 miligramov (1 milimól) 4-amino-2-brómpyrimidín-5-karbonitrilu, 394 miligramov (1,2 milimolu) terc. butyl-N-(2-{[-(1naftyl)-etyl]amino}propyl)karbamátu (IIB),342 mikrolitrov (2 milimóly) Ν,Ν-diizopropyletylamínu (DIEA) a 2 mililitre 2-metoxyetanolu a táto zmes bola 5 hodín zahrievaná na 150 °C. Z reakčnej zmesi bol odparený 2metoxyetanol, získaný zvyšok bol rozpustený v 3 militroch 0,1molárnej kyseliny chlorovodíkovej a extrahovaný 2x5 mililitrami dichlórmetánu. Spojené organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené. Surový produkt bol prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so zmesou dichlórmetán/metanol (10:0,1), čím bol získaný biely amorfný produkt.

K uvedenému amorfnému produktu boli pridané 2 mililitre studeného 50 percentného roztoku kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne a vzniknutá zmes bola miešaná 1 hodinu pri teplote miestnosti. Roztok bol odparený, ku surovému produktu bol pridaný nasýtený roztok uhličitanu sodného a zmes bola extrahovaná 2x5 militrami dichlórmetánu. Organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené. Týmto postupom bol získaný pevný biely produkt, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 66 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou H NMR; C NMR; MS (m/z): 347 (MH⁺).

256/B (|11C) 4-amino-2-{ [4-aminobutyl) [1-naftyl)etyl]amino}-5-pyrimidínkarbonitril

Do liekovky so skrutkovým uzáverom bolo umiestnené 199 miligramov (1 milimól) 4-amino-2-brómpyrimidín-5-karbonitrilu, 410 miligramov (1,2 milimolu) terc. butyl-N-(2-{ [1-(1-naftyl)-etyl]amino}butyl)karbamátu (IIC), 342 mikrolitrov (2 milimóly) Ν,Ν-diizopropyletylamínu (DIEA) a 2 mililitre 2-metoxyetanolu a táto zmes bola 4 hodiny zahrievaná na 150 °C. Z reakčnej zmesi bol odparený 2metoxyetanol, získaný zvyšok bol rozpustený v 3 mililitroch 0,1molárnej kyseliny chlorovodíkovej a extrahovaný 2x5 militrami dichlórmetánu. Spojené organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené. Surový produkt bol prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so zmesou dichlórmetán/metanol (10:0,1), čím bol získaný biely amorfný produkt.

K uvedenému amorfnému produktu bolo pridané 1,5 mililitra studeného 50percentného roztoku kyseliny trifluóroctovej v dichlórmetáne a vzniknutá zmes bola miešaná 1 hodinu pri teplote miestnosti. Roztok bol odparený, ku surovému produktu bol pridaný nasýtený roztok uhličitanu sodného a zmes bola extrahovaná 3x5 militrami dichlórmetánu. Organické vrstvy boli vysušené nad bezvodým síranom sodným a odparené. Týmto postupom bol získaný biely produkt, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 54 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 361 (MH⁺).

7-substituované pyrimidopyrimídíny (zlúčeniny všeobecného vzorca (IV)) boli pripravené kondenzáciou 2-substituovaných-2,4-diamino-5pyrimidínkarbonitrilov (zlúčenín všeobecného vzorca (lll))a guanidínu (viď. schéma 4).

256/B

Schéma 4

R ,NH,

Zlúčenina IVC miligramov (0,26 milimolu) 4~amino-2-{ [4-aminobutyl) [1naftyl)etyl]amino}-5-pyrimidínkarbonitrilu (IIIC) bolo rozpustené v 1,2 mililitroch roztoku voľnej bázy guanidínu (ktorého príprava je opísaná nižšie) v 2metoxyetanole. Reakčná zmes bola miešaná 1,5 hodiny pri teplote 150 °C v liekovke so skrutkovým uzáverom. Zo zmesi bol odparený 2-metoxyetanol, ku zvyšku bola pridaná voda a po odfiltrovaní zrazeniny bol surový produkt prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so zmesou dichlórmetán/metanol/amoniak (2:1:0,1), čím bol získaný produkt vo forme pevnej bielej látky, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 42 percent.

256/B

Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 403 (MH⁺).

Zlúčeniny IVB miligramov (0,26 milimolu) 4-amino-2-{[4-aminopropyl)[1naftyl)etyl[amino}-5-pyrimidinkarbonitrilu (IIIB) bolo rozpustené v 1,3 mililitroch roztoku voľnej bázy guanidínu (ktorého príprava je opísaná nižšie) v 2metoxyetanole. Reakčná zmes bola miešaná 1,5 hodiny pri teplote 150 °C v liekovke so skrutkovým uzáverom. Zo zmesi bol odparený 2-metoxyetanol, ku zvyšku bola pridaná voda a po odfiltrovaní zrazeniny bol surový produkt prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so zmesou dichlórmetán/metanol/amoniak (2:1:0,0), čím bol získaný produkt vo forme pevnej bielej látky, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 38 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR; MS (m/z): 389 (MH⁺).

Zlúčenina IVA

100 miligramov (0,3 milimolu) 4-amino-2-{ [4-aminoetyl) [1naftyl)etyl[amino}-5-pyrimidínkarbonitrilu (IIIA) bolo rozpustené v 1,4 mililitroch roztoku voľnej bázy guanidínu (ktorého príprava je opísaná nižšie) v 2metoxyetanole. Reakčná zmes bola miešaná 1,5 hodiny pri teplote 150 °C v liekovke so skrutkovým uzáverom. Zo zmesi bol odparený 2-metoxyetanol, ku zvyšku bola pridaná voda a po odfiltrovaní zrazeniny bol surový produkt prečistený chromatografiou na silikagéli elúciou so zmesou dichlórmetán/metanol/amoniak (2:1:0,1), čím bol získaný produkt vo forme pevnej bielej látky, ktorého množstvo odpovedalo výťažku 46 percent. Štrukturálna charakteristika produktov bola uskutočnená pomocou ¹H NMR; ¹³C NMR;

MS (m/z): 375 (MH⁺).

256-B

Príprava roztoku voľnej bázy guanidínu v 2-metoxyetanole

V oddelenej nádobe bol 1 gram (44 milimólov) kovového sodíka pridaný ku 30 militrom 2-metoxyetanolu a táto zmes bola miešaná v inertnej atmosfére do rozpustenia sodíka.

V inej nádobe bo! pripravený roztok 4,2 gramu (44 milimólov) hydrochloridu guanidínu v 30 mililitroch 2-metoxyetanolu. Ku tomuto roztoku bol pridaný uvedený roztok metoxyetoxidu sodného. Po pridaní tohto roztoku došlo ku vytvoreniu bielej zrazeniny, ktorou bol chlorid sodný. Reakčná zmes bola miešaná 30 minút pri teplote 25 °C. Zrazenina bola odfiltrovaná a roztok bol uchovaný v mrazničke a použitý ako roztok voľnej bázy guanidínu.

Kyselina 3-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidín-2-yl)-(2-etoxynaftalén-1ylmetyl)amino]-2-hydroxypropiónová

Uvedená α-hydroxykarboxylová kyselina bola syntetizovaná niekoľkostupňovým postupom, pričom východiskovou zlúčeninou bol izoserín a pri syntéze boli použité metódy a podmienky podobné tým, ktoré sú podrobne opísané v tomto texte. Enantiomérne alkoholy je možné syntetizovať stereoselektívne s použitím reakcie 2-etoxynaftylmetylamínu s estermi kyseliny glycínovej (epoxidom).

256/B

N-(2-Aminoetyl)-3-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidín-2-yl)-(2-etoxynaftalén1-ylmetyl)-amino]-2-hydroxypropiónamid

Ku roztoku 200 miligramov (0,445 milimólu) kyseliny 3-[(5,7diaminopyrimido [4,5-d]pyrimidín-2-yl)-(2-etoxynaftalén-1-ylmetyl)amino]-2hydroxypiónovej v 2 mililitroch suchého Ν,Ν-dimetylformamidu (DMF) bolo pridané 249 miligramov (0,534 milimólu) činidla BroP. Zmes bola 30 minút miešaná a potom k nej bolo pridané 126 miligramov (0,979 milimólu) diizopropyletylamínu (DIEA). Zmes bola miešaná ďalších 20 minút a bolo k nej pridané 53,5 miligramu (0,89 milimólu) etyléndiamínu. Potom bola reakčná zmes 16 hodín miešaná pri teplote miestnosti a priamo prečistené preparatívnou vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou, čím bolo získané 35 miligramov (16 percent) požadovaného produktu: MS (m/z): 492 (M+H).

Všeobecný postup reakcie rôznych amínov s aromatickými ketónmi za redukčných podmienok

170,21

NH₂CH₃ 2M v methanolu

NaCNBH₃ (62,84) ZnCI₂ (136,28)

256/B

Nasledujúci postup je založený na metóde opísanej v publikácii J. Org. Chem., 1985, 50, 1927-1932.

Ku roztoku 1-acetylnaftalénu (1 ekvivalent, 1 milimól, 170 miligramov, 151 mikrolitrov) v metanolickom roztoku metylamínu (4 ekvivalenty, 4 milimóly, 2 mililitre 2 molámeho roztoku v metanole) bol pri teplote miestnosti pridaný pevný kyanoborohydrid sodný (2 ekvivalenty, 2 milimóly, 126 miligramov) a bezvodý chlorid zinočnatý (1 ekvivalent, 1 milimól, 136 miligramov). Reakčná zmes bola zahrievaná za neustáleho miešania magnetickým miešadlom v otvorenej skúmavke na teplotu 65 °C.

Priebeh reakcie bol monitorovaný buď chromatografiou na tenkej vrstve (TLC) alebo vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Po 30 minútach reakcie bolo možné v chromatograme reakčnej zmesi pozorovať niekoľko píkov. Na porovnanie bola použitá autentická vzorka N-metyl-1naftyletylamínu. Po uplynutí 1 hodiny bola reakcia hotová na viac než 50 percent. Po 4 hodinách došlo ku úplnému vymiznutiu ketónu z reakčnej zmesi a vzniknutý produkt bol na viac než 95 percent čistý, pričom bol kontaminovaný menej než 5 percentami imínu, ktorý bol mezidproduktom reakcie. Ďalšie zahrievanie reakčnej zmesi by mohlo viesť ku získaniu produktu s vyššou čistotou. Doporučená reakčná doba pre tento konkrétny ketón je aspoň 6 hodín, avšak reakčná doba sa môže meniť podľa povahy daného ketónu. Reakčné zmesi boli spracované obvyklým postupom a surové produkty boli prečistené štandardnými laboratórnymi technikami.

o

H

CN

256/B

Kyselina 3-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]pyrimidín-2-yl)-(2-etoxynaftalén-1ylmetyl)amino]propiónová

N

Terc. butylester kyseliny {4-[(5,7-diaminopyrimido[4,5-d]-pyrimidín-2-yl)-(2etoxynaftalén-1-ylmetyl)amino]butyl}-karbamovej

Suspenzia 12,37 gramu (0,025 mólu) substituovaného kyanoaminopyrimidínu, 7,16 gramu (0,075 mólu) hydrochloridu guanidínu, 5,40 gramu (0,1 mólu) pevného metoxidu sodného v 150 mililitroch metoxyetanolu bola 48 hodín zahrievaná na teplotu varu. Skončenie reakcie bolo určené na základe monitorovania vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC). Reakčná zmes bola ponechaná vychladnúť na teplotu miestnosti a vyliata do prebytku vody. Pevná látka bola izolovaná na filtri a vysušená vo vákuu, čím bolo získané 13,05 gramu surového produktu, ktorý bol bez prečistenia použitý v ďalšom stupni.

N7-(4-Aminobutyl)-N7-(2-etoxynaftalén-1-ylmetyl)pyrimido-[4,5-d]pyrimidín2,4,7-triamín

256/B gramov mono-Boc-chráneného medziproduktu bolo pomaly počas 10 minút za intenzívneho miešania pridané ku 75 mililitrom ľadovo studenej kyseliny trifluóroctovej. Skončenie reakcie bolo určené na základe analýzy vzorky pomocou HPĽC/MS. Reakčná zmes bola vyliata do ľadovo studeného 5 percentného roztoku etoxidu sodného, čím došlo ku vyzrážaniu produktu. Uvedený HPLC produkt bol izolovaný na filtri a vysušený, čím bolo získané 8,0 gramov pevného produktu: HPLC Rt = 2,882 minúty, čistota 99 percent, MS (m/z) 433 (poz).

256/B

Stupeň 1: reduktívna aminácia

20,0 gramov (0,12 mólu) uvedeného ketónu bolo rozpustené v 100 militroch (približne 2 ekvivalenty) 2 molárneho metanolického roztoku metylamínu. V inej banke, ktorá bola ochladená na 0 °C, bolo zmiešané 8,3 gramu (0,5 ekvivalentu) kyanoborohydridu sodného s približne 10 mililitrami metanolu. Vzniknutý Zn(CNBH₃)2 bol miešaný približne 5 minút pri teplote 0 °C a následne pridaný ako suspenzia ku uvedenej zmesti ketónu a amínu. Reakčná zmes bola zahrievaná cez noc ku miernemu varu, ponechaná vychladiť na teplotu miestnosti a odparená do sucha. Získaný zvyšok bol ponechaný stáť vo vysokom vákuu za účelom odstránenia zvyškov metylamínu.

Získaná pevná biela látka bola triturovaná dietyléterom, avšak táto operácia viedla ku získaniu viskózneho oleja. Lepšie výsledky sa dosiahli pri triturácii dietyléterom s prídavkom dostatočného množstva metanolu, ktoré postačovalo na zabránenie olejovateniu spracovávaného materiálu. Uvedený materiál bol odfiltrovaný, premytý éterom a ponechaný vyschnúť. Chromatografiou na tenkej vrstve (TLC) vzorky získanej pevnej látky vedľa autentickej vzorky poskytnutej ET bolo zistené, že obidve zlúčeniny majú rovnakú mobilitu. Jednako len na základe hmotnostnej bilancie odpovedalo množstvo získaného produktu viacej než 100 percentnému výťažku, na základe čoho bolo usúdené, že izolovaný produkt obsahoval ešte anorganické soli.

Pre prítomnosť kontaminujúcich solí bolo v ďalšom stupni najprv použité malé množstvo produktu, avšak neboli pozorované žiadne zrejmé problémy. Uvedená aminokyselina bola preto použitá bez ďalšieho prečistenia.

Stupeň 2; reakcia s chiórpyrimídom gramov (teoretický výťažok bol 21,8 gramu) aminokyseliny z predchádzajúceho stupňa bol rozpustené v približne 50 mililitroch etoxyetanolu. Ku tomuto roztoku bolo pridané 17,0 gramov (0,9 ekvivalentu, vztiahnuté na ketón) 4-amino-2-chlórpyrimidín-5-karbonitrilu a 42 mililitrov (2,0

256/B ekvivalenty) diizopropyletylamínu (DIEA) a reakčná zmes bola miešaná približne 2 hodiny pri teplote 80 °C (teplota olejového kúpeľa ). Po uplynutí tejto doby nebola s TLC dokázaná prítomnosť východiskového chloridu v reakčnej zmesi. Zmes bola ponechaná vychladnúť na teplotu miestnosti a zahustená na rotačnej odparke na objem 10 mililitrov. Získaná suspenzia bola zriedená približne 400 mililitrami vody a jej pH bolo upravené koncentrovanou kyselinou octovou na hodnotu 5 až 6 (podľa pH papierika), pri ktorom sa vylúčila svetložltá pevná látka. Zmes bola ponechaná stáť cez noc pri teplote 0 °C, prefiltrovaná a filtračný koláč bol premytý približne 1 litrom vody a usušený na vzduchu. Prekryštalizovaním zo zmesi voda/metanol bolo získané približne 25 gramov (69 percent) požadovaného medziproduktu. TLC (CH₂CI₂ + 10 % CH₃OH) R_f približne 0,1. Analýza TLC ukázala prítomnosť rýchlejšie sa pohybujúcej látky, jednako len jej podiel bol natoľko malý, že získaný produkt bol použitý bez ďalšieho prečistenia v nasledujúcom reakčnom stupni.

Stupeň 3: cyklizačné reakcie

Pre zvýšenie meradla reakcie bol ako rozpúšťadlo použitý etoxyetanol, ktorý umožnil zvýšiť reakčnú teplotu na približne 135 °C. 16,0 gramov (54 milimólov) medziproduktu z predchádzajúceho stupňa bolo rozpustené v približne 75 mililitroch etoxyetanolu. Ku tomuto roztoku bolo pridané 10,2 gramu (2,0 ekvivalenty) hydrochloridu guanidinu a 11,6 gramu (4,0 ekvivalenty) metoxidu sodného a reakčná zmes bola privedená v argónovej atmosfére ku miernemu varu. Na monitorovanie spotreby východiskovej zlúčeniny bola použitá chromatografia na tenkej vrstve (TLC). Po približne 30 hodinách bola reakčná zmes ponechaná vychladnúť, bolo do nej pridané dalších 5,1 gramu (1,0 ekvivalent) hydrochloridu guanidinu a 2,9 gramu (1,0 ekvivalent) metoxidu sodného a zmes bola privedená opäť do varu. Podľa chrómatografie na tenkej vrstve (TLC) bola reakcia skončená po približne 72 hodinách.

Reakčná zmes bola ponechaná vychladnúť a zahustená na rotačnej odparke na objem približne 20 mililitrov. Získaná suspenzia bola zriedená približne 600 mililitrami vody a pH zmesi bolo upravené koncentrovanou

256/B kyselinou octovou na hodnotu 5 až 6. Vyzrážaný produkt bol ponechaný cez noc pri teplote 0 °C, odfiltrovaný a postupne premytý väčším množstvom vody a väčším množstvom metanolu (za účelom odstránenia nezreagovaných východiskových zlúčenín) a usušený na vzduchu. Bolo izolované približne 13,5 gramu (približne 75 percent) produktu. Analýza vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou ukázala, že produkt obsahoval malé množstvo polárnej nečistoty, ktorá bola rovnaká s nečistotou pozorovanou pri rovnakej reakcii uskutočnenej v malom meradle. Uvedený produkt však mohol byť použitý bez ďalšieho prečistenia.

gramov (18 milimolov) terc. butylesteru kyseliny [2-(4-amino-5kyanopyrimidín-2-ylamino)etyl]karbamovej bolo rozpustené v 60 mililitroch zmesi dichlórmetán/kyselina trifluoroctová (50:50, vyjadrené v objemových dieloch). Po pridaní kvapaliny ku pevnej látke bol pozorovaný búrlivý vývoj plynov. Roztok bol následne 30 minút miešaný v inertnej atmosfére a po uplynutí tejto doby bola z reakčnej zmesi odobratá vzorka na uskutočnenie analýzy vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC), ktorá slúžila na potvrdenie, že došlo ku kvantitatívnemu odštiepeniu chrániacej skupiny. Akonáhle bolo zistené, že došlo k úplnému odštiepeniu chrániacej skupiny, bol roztok vo vákuu odparený do sucha.

256/B

V oddelenej nádobe bolo 0,675 gramu kovového sodíka pomaly pridané v inertnej atmosfére až do rozpustenia sodíka. V inej nádobe bol pripravený roztok 2,654 gramu hydrochloridu guanidínu v 30 mililitroch 2-metoxyetanolu. K tomuto roztoku bol pridaný uvedený roztok metoxyetoxidu sodného. Po zmiešaní obidvoch roztokov došlo ku vylúčeniu bielej zrazeniny chloridu sodného a vzniknutá zmes bola miešaná 50 minút. Potom bol tento roztok prefiltrovaný v inertnej atmosfére, pridaný ku surovému zvyšku zo stupňa 1 a výsledná zmes bola intenzívne miešaná. Počas 15 minút došlo ku vylúčeniu žltej zrazeniny. Táto zrazenina bola odfiltrovaná, čím bolo izolované 2,1 gramu (52 percent) N7-(2-aminoetyl)-pyrimido[4,5-d]pyrimidin-2,4,7-triamínu.

o

o

4-Aminobutylamid kyseliny 4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinyl-metyl]-Nmetylamino)benzoovej

Ku suspenzii 250 miligramov (0,73 milimolu) hemihydrochloridu kyseliny

4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinyl-metyl]-N-metylamino)benzoovej v 20 mililitroch suchého N,N-dimetylformamidu (DMF) bolo pridané 250 mikrolitrov (1,46 milimolu, 2 ekvivalenty) Ν,Ν-diizopropyletylamínu a 225 mikrolitrov (1,46 milimolu, 2 ekvivalenty) dietylkyanofosfonátu. Došlo ku rýchlemu rozpusteniu pevnej látky a vzniknutá reakčná zmes bola miešaná 4 hodiny pri teplote miestnosti. Ku roztoku bolo pridané 367 mikrolitrov (3,65 milimolu, 5 ekvivalentov) 1,4-diaminobutánu a 250 mikrolitrov (1,46 milimolu, 2 ekvivalenty) Ν,Ν-diizopropyletylamínu a výsledný roztok bol miešaný 45 minút pri teplote miestnosti. Skončenie reakcie bolo overené analýzou vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) a ku reakčnej zmesi bol pridaný pevný

256/B hydrogénuhličitan sodný. Potom bolo zo zmesi vo vákuu odstránené rozpúšťadlo a získaný zvyšok bol suspendovaný v malom množstve metanolu. Ku suspenzii bol pridaný zriedený roztok hydroxidu amónneho a po následnej filtrácii, premytí filtračného koláča vodou a usušení bolo získané 153 miligramov (53 percent) požadovaného produktu: MS (m/z) 396 (M + H), HPLC Rt = 3,80 minúty.

4-Hydroxyfenylamid kyseliny 4-(N-[2,4-diamino-6-pteridiny!-metyl]-Nmetylamino)benzoovej

Ku suspenzii 100 miligramov (0,29 milimolu) hemihydrochloridu kyseliny

4-(N-[2,4-diamino-6-pteridinyl-metyl]-N-metylamino)benzoovej v približne 6 mililitroch suchého Ν,Ν-dimetylformamidu (DMF) bolo pridané 100 mikrolitrov (0,58 milimolu, 2 ekvivalenty) Ν,Ν-diizopropyletylamínu a 90 mikrolitrov (0,58 milimolu, 2 ekvivalenty) dietylkyanofosfonátu. Došlo ku rýchlemu rozpusteniu pevnej látky a vzniknutá reakčná zmes bola miešaná 3 až 4 hodiny pri teplote miestnosti. Na prípravu 4-hydroxyfenylamidu bolo k roztoku pridané 33 miligramov (0,30 milimolu, 1,05 ekvivalentu) p-aminofenolu a 100 mikrolitrov (0,58 milimolu, 2 ekvivalenty) Ν,Ν-diizopropyletylamínu a výsledný roztok bol miešaný cez noc pri teplote miestnosti. Skončenie reakcie bolo overené analýzou vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) a ku reakčnej zmesi bol pridaný pevný hydrogénuhličitan sodný. Potom bolo zo zmesi vo vákuu odstránené rozpúšťadlo a získaný zvyšok bol suspendovaný v malom množstve metanolu. Ku suspenzii bol pridaný zriedený roztok hydroxidu amónneho a po následnej filtrácii, premytí filtračného koláča zriedenou

256/B kyselinou octovou a usušení bol získaný požadovaný produkt. Bolo získané 77 miligramov (0,19 milimolu, 64 percent) produktu: MS (m/z) 415 (M - H), HPLC Rt = 4,66 minúty.

NH.

N H.

N-Benzyl[2,4-diamino-6-pteridinylmetyl]-N-metylamín

V 15 mililitrovej liekovke so skrutkovým uzáverom, ktorá bola opatrená magnetickým miešadlom, bolo rozpustené 245,5 miligramu (261 mikrolitrov, 2,02 milimolu) N-metylbenzylamínu, tj. päťnásobný prebytok, v 4 mililitroch N,Ndimetylformamidu (DMF). Ku roztoku bolo pridané 100 miligramov (0,405 milimolu) 2,4-diamino-6-chlórmetylpterínu a zmes bola dobre premiešaná. Reakčná zmes bola miešaná 4 hodiny pri teplote 60 °C. Analýza vzorky reakčnej zmesi vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou ukázala absenciu východiskového derivátu pterínu. Zo zmesi bolo pri zníženom tlaku a teplote 60 °C odstránené rozpúšťadlo. Získaná zmes bola premytá 2 x 15 mililitrami etanolu, rozpúšťadlo bolo odstránené v prúde dusíka a získaný produkt bol 18 hodín sušený vo vysokom vákuu. Bolo uskutočnené meranie NMR a MS a získané dáta potvrdili štruktúru a čistotu produktu.

256 B

N-(a-Metyl-4-metylbenzyl) [2,4-diamino-6-pteridinylmetyl]-N-metylamín

V 15 mililitrovej liekovke so skrutkovým uzáverom, ktorá bola opatrená magnetickým miešadlom, bolo rozpustené 272 miligramov (298 mikrolitrov, 2,02 milimôlu) S-(+)-oc-4-dimetylbenzylamínu, tj. päťnásobný prebytok, v 4 mililitroch Ν,Ν-dimetylformamidu (DMF). Ku roztoku bolo pridané 100 miligramov (0,405 milimôlu) 2,4-diamino-6-chlórmetylpterínu a zmes bola dobre premiešaná. Reakčná zmes bola miešaná 4 hodiny pri teplote 60 °C. Analýza vzorky reakčnej zmesi vysoko účinnou kvapalinovou chromatografiou ukázala absenciu východiskového derivátu pterínu. Zo zmesi bolo pri zníženom tlaku a teplote 60 °C odstránené rozpúšťadlo. Získaná zmes bola premytá 2 x 15 mililitrami etanolu, rozpúšťadlo bolo odstránené v prúde dusíka a získaný produkt bol 18 hodín sušený vo vysokom vákuu. Výsledky analýzy HPLC, meranie ¹H NMR a MS bolo v súlade s predpokladanou štruktúrou produktu, pričom čistota získaného produktu bola vysoká.

Príklad 2

Stanovenie Ki D-Ala-D-Ala ligázy

Syntetické analógy z príkladu 1 boli v deň hromadného testovania rozpustené v dimetylsulfoxide (DMSO), pričom boli pripravené 100 milimolárne roztoky jednotlivých analógov a v prípade potreby bolo na rozpustenie použité miešadlo typu vortex a sonikácia. Roztoky boli až do skončenia hromadného testovania uchovávané pri teplote miestnosti.

V deň testovania bol pripravený čerstvý zásobný roztok NADH (ktorý bol získaný od spoločnosti Sigma) a to rozpustením 32 mikromólov NADH v 3,2 mililitroch dvakrát destilovanej vody. Roztok NADH bol uchovávaný na ľade. Zásobné roztoky obsahujúce 50 mM fosfoenolpyruvátu (PEP, od spoločnosti Sigma), 500 μΜ HERMES, 30 mM adenozíntrifosfátu (ATP, od spoločnosti Sigma), 200 mM D-alanínu (od spoločnosti Sigma) a 4x základný pufor (tj. 400 mM Hepes, 40 mM chloridu horečnatého a 40 mM chloridu draselného) boli

256/B rovnako skladované na ľade. Zásobný roztok pyruvátkinázy/ laktátdehydrogenázy (PK/LDH) bol rovnako získaný od spoločnosti Sigma.

Tabuľka konečných koncentrácií, ktoré boli závislé od typu hromadného testovania

Typ hromadného testu	Ki analógov Konečná koncentrácia v enzýmovej zmesi	Percento inhibície analógov Konečná koncentrácia v enzýmovej zmesi	Ki a mechanizmus inhibície analógov Konečná koncetrácia v enzýmovej zmesi
Základný pufor 4x	1x	1x	1x
NADH 10 mM	500 pM	500 μΜ	500 pM
PEP 50 mM	2 mM	2 mM	2 mM
Zmes PK/LDH	0,02 ml/ml	0,02 ml/ml	0,02 ml/ml
	zásobného	zásobného	zásobného
	roztoku enzýmu	roztoku enzýmu	roztoku enzýmu
Hermes 500 μΜ	200 nM	400 až 600 nM	200 nM

256/B

Typ hromadného testu	Ki analógov Konečná koncentrácia v enzýmovej zmesi	Percento inhibície analógov Konečná koncentrácia v enzýmovej zmesi	Ki a mechanizmus inhibície analógov Konečná koncetrácia v enzýmovej zmesi
Roztok	A	Hromadný test	A	B	C
ATP 30 mM	4 mM	20 pM	4 mM	4 mM	100 pM
D-Ala 200 mM	2 mM	64 mM	2 mM	64 mM	64 mM
Základný pufor 1x	1x	1x	1x	1x	1x

Príklad 3

Stanovenie Ki analógov pre každú sériu testovaných zlúčenín boli použité dve 96 jamkové platne, ktoré boli označené ako inhibičná, respektíve enzýmová platňa. Testovaným zlúčeninám odpovedali v jednotlivých platniach rady jamiek A-G. Adenozínu (získanému od spoločnosti Sigma), ktorý bol rozpustený v dimetylsulfoxide (DMSO) a ktorý bol použitý na porovnanie, odpovedal v jednotlivých platniach rad jamiek H.

256/B

Enzýmový roztok bol ponechaný vytemperovať na teplotu 25 °C.

Zriedené roztoky boli pripravené v inhibičnej platni, a to nasledujúcim postupom: 50 mikrolitrov dimetylsulfoxidu DMSO bolo pridané do každej jamky v stĺpcoch 1 až 11 v radoch A až G inhibičnej platni. Do každej jamky v stĺpcoch 1 až 11 v rade H bolo pridané 50 mikrolitrov dimetylsulfoxidu (DMSO). Do jamiek v stĺpci 12 v radoch A až G bolo pridané vždy 100 mikrolitrov roztoku testovanej zlúčeniny s koncentráciou 100 mM (tj. roztok prvej testovanej zlúčeniny bol pridaný do jamiek v stĺpci A, roztok druhej testovanej zlúčeniny bol pridaný do jamiek v stĺpci B atd’.). Do jamky v stĺpci 12 v rade H bolo pridané 100 mikrolitrov roztoku adenozínu s koncentráciou 100 mM.

V každom rade bolo 50 mikrolitrov roztoku testovanej zlúčeniny prenesené z jamky v stĺpci 12 do jamky v stĺpci 11, čím došlo ku premiešaniu tohto roztoku s dimetylsulfoxidom (DMSO). Následne bolo v každom rade 50 mikrolitrov roztoku z jamky v stĺpci 11 prenesené do jamky v stĺpci 10, 50 mikrolitrov roztoku z jamky v stĺpci 10 bolo prenesené do jamky v stĺpci 9 a tak ďalej až k jamke v stĺpci 2. Do jamiek v stĺpci 1 nebol prenesený žiadny roztok. Pri tomto sériovom riedení boli použité viackanálové pipetory.

Do každej jamky enzýmovej platne bolo pridané 120 mikrolitrov enzýmového roztoku. Roztoky substrátu boli ponechané ohriať na teplotu 25 °C.

Analógy podľa tohto vynálezu a enzýmy boli následne inkubované pri teplote 25 °C. Pretože reakcie boli iniciované po stĺpcoch, bolo pridávanie analógov uskutočnené rovnako po stĺpcoch. V čase t = 0 minút bolo po 5 mikrolitroch roztokov analógov v jamkách v stĺpcoch 1až 4 inhibičnej platne pridané do odpovedajúcich jamiek enzýmovej platne. V čase t = 4 minúty bolo po 5 mikrolitroch roztokov analógov v jamkách v stĺpcoch 5 až 8 inhibičnej platne pridané do odpovedajúcich jamiek enzýmovej platne. V čase t = 8 minút bolo po 5 mikrolitroch roztokov analógov v jamkách v stĺpcoch 9 až 12 inhibičnej platne pridané do odpovedajúcich jamiek enzýmovej platne. Inhibičná platňa bola následne zmrazená.

256/B

V čase t = 18 až 19 minút bol odobratý roztok substrátu a prenesený pri teplote 25 °C do UV/Vis spektrometra Spectromax®. V čase t = 20 minút bolo počas 30 sekúnd do každej jamky v stĺpcoch 1 až 4 pridané 125 mikrolitrov roztoku substrátu a bola meraná absorbancia vzniknutých zmesí pri vlnovej dĺžke 340 nanometrov. V čase t = 24 minút a t = 28 minút bol tento postup zopakovaný pre jamky v stĺpcoch 5 až 8, respektíve 9 až 12.

Koncentrácie zlúčenín podľa tohto vynálezu v jamkách v stĺpcoch 1 až 12 tak boli 0 μΜ, 1,9 pM, 3,9 pM, 7,8 pM, 15,6 pM, 31,2 pM, 62,5 pM, 125 pM, 250 pM, 500 pM, 1 mM, respektíve 2 mM.

Hodnoty zníženia absorbancie boli vynásobené -4,06 za účelom prevodu jednotiek mOD/min na nM/s (OD = XLM; λ= 6200 1/Mcm; L = 0,66 centimetra; mOD/s = 6200 x 0,66 (mM/s) x 60; (mOD/s) x 4,06 = nM/s); získaný výsledok bol vynásobený -1, pretože absorbancia NADH klesá so vzrastajúcim množstvom vznikajúceho produktu).

Pomocou programu Kaleidograph® boli zostrojené grafy závislosti rýchlosti reakcie od koncentrácie inhibítora a hodnoty Ki boli stanovené potom, čo boli na základe zistených údajov zostrojené rovnice kriviek uvedených závislostí.

Väčšinu z vyššie opísaných stupňov bolo alternatívne možné uskutočniť pomocou automatizovaného zariadenia na manipuláciu s kvapalinami SciClone. Týmito stupňami sú konkrétne: pridávanie enzýmovej zmesi na enzýmovú platňu, dávkovanie 50 mikrolitrov DMSO do jamiek v stĺpcoch 1 až 11 v radoch A až H inhibičnej platne, sériové riedenie roztokov analógov a porovnávacieho roztoku adenozínu na inhibičnej platni, pridávanie analógových inhibítorov z inhibičnej platne na enzýmovú platňu, pridávanie substrátu na enzýmovú platňu.

Príklad 4

Percento inhibície analógov podľa tohto vynálezu

256/B

Bol zopakovaný vyššie opísaný testovací postup stou výnimkou, že inhibičná platňa bola pripravená tak, že jamky obsahovali 5 mM roztoky inhibítorov (oproti sériovo zriedeným roztokom pri predchádzajúcom teste), takže konečná koncentrácia inhibítora vo výslednej reakčnej zmesi bola 100 μΜ. Aktivita enzýmu v prítomnosti dimetylsulfoxidu (DMSO) bola použitá ako 100 percentná porovnávacia aktivita.

Presné koncentrácie sú udané v hore uvedenej tabuľke.

Príklad 5

Stanovenie hodnôt Ki mechanizmu inhibície analógov podľa tohto vynálezu

Bol zopakovaný hore opísaný testovací postup, pričom boli použité tri rôzne substrátové roztoky a to každý na inej enzýmovej platni. Konečné koncentrácie v reakčných zmesiach boli nasledujúce: (A) 2 mM ATP a 1 mM Dalanínu (B) 2 mM ATP a 32 mM D-alanínu; a (C) 50 μΜ ATP a 32 mM Dalanínu. Pre všetky tri enzýmové platne bola použitá rovnaká inhibičná platňa. Na porovnanie bol pri teste použitý adenozín (od spoločnosti Sigma) a cykloserín (od spoločnosti Sigma). Presné koncentrácie sú udané v hore uvedenej tabuľke.

Príklad 6

Mikrozried’ovací test antimikrobiálneho účinku

Boli pripravené zásobné roztoky testovaných zlúčenín v N,Ndimetylformamide (DMF) s koncentráciou 5 miligramov/mililiter. Potom boli pripravené pracovné roztoky v živnej pôde Muller-Hinton (MHB) s východiskovou koncentráciou 64 mikrogramov/mililiter (tj. bol pripravený roztok 25,6 mikrolitra zásobného roztoku v 974,4 mikrolitroch MHB = roztok testovanej zlúčeniny s koncentráciou 128 mikrogramov/mililiter, ktorý bol pri nižšie opísanom procese zriedený ekvivalentným objemom bakteriálneho inokula).

256/B

Bakteriálne inokulá boli pripravené vždy z cez noc inkubovanej kultúry (tj. čerstvé kolónie pestované na agarovej platni v 5 mililitroch MHB; kmeň H. influenzae bol pestovaný v MHB s prídavkom kvasného extraktu, hematinu a NAD), ktoré boli odstreďované 2x5 minút rýchlosťou 3000 otáčok/minútu (v prípade kmeňov S. pneumoniae a H. influenzae 2x10 minút rýchlosťou 3000 otáčok za minútu) a dispergované v 5 mililitroch čerstvého média MHB, takže získaná bakteriálna suspenzia sa riedila tak, aby v každej jamke mikroplatne bolo získané 100 jednotiek tvoriacich kolóniu (CFU) (konečný objem zmesi bol 100 mikrolitrov).

Uvedené jamky mikroplatne boli následne plnené 50 mikrolitrami dvojnásobne zriedeného roztoku testovanej zlúčeniny, pričom východisková koncentrácia testovanej zlúčeniny bola 64 mikrogramov/mililiter. Jamky v stĺpcoch 2 až 12 boli plnené 50 mikrolitrami bakteriálneho inokula (konečný objem zmesi v každej jamke bol 100 mikrolitrov/jamku). Platňa bola inkubovaná 18 až 24 hodín pri teplote 37 °C (kmeň S. pneumoniae bol inkubovaný v atmosfére obohatenej oxidom uhličitým).

Potom bola pomocou prístroja TECAN SpectroFluor Plus® meraná optická hustota obsahu jednotlivých jamiek pri vlnovej dĺžke 590 nanometrov (OD₅go) a minimálna inhibičná koncentrácia (MIC) bola definovaná ako koncentrácia, pri ktorej dochádzalo ku 90 percentnej inhibícii rastu baktérií.

Príklad 7

Stanovenie minimálnej inhibičnej koncentrácie (MIC) pomocou overexpresie kmeňa E. coli

Postup opísaný v príklade 5 bol zopakovaný s nasledujúcimi modifikáciami:

Ako médium bola použitá živná pôda luria (LB) s prídavkom antibiotík (20 miligramov/liter chloramfenikolu per vektory pBAD, 100 miligramov/liter ampicilínu pre vektory pTAC pre plazmidovú selekciu) alebo M9 minimálne médium s D-manitolom ako zdrojom uhlíka.

256/B

Baktérie, ktoré boli použité pre inokulum v LB, boli pripravené takto: kultúra získaná kultiváciou cez noc bola zriedená v pomere 1:50 čerstvým médiom LB a inkubovaná na trepačke pri 250 otáčkach za minútu a teplote 37 °C. Po dosiahnutí štádia mid-log (OD₆oo = 0,5 až 1,0, po približne 3 hodinách) boi do zmesi pridaný operónový regulátor (glukóza, arabinóza alebo IPTG) a baktérie boli inkubované ďalšie 3 hodiny. Po uplynutí 3 hodín bola znovu zmeraná hodnota OD₆oo, ktorá slúžila na odhad počtu baktérií a kultúra bola zriedená médiom LB (antibiotiká - chloramfenikol alebo ampicilín a regulátory boli pridané v dvojnásobných koncentráciách). Konečné inokulum obsahovalo približne 10 000 CFU/jamku.

Baktérie, ktoré boli použité pre inokulum v M9 minimálnom médiu, boli pripravené takto: kultúra získaná kultiváciou cez noc bola odstreďovaná 2x5 minút rýchlosťou 3000 otáčok/minútu, premytá médiom M9, zriedená v pomere 1:50 M9 minimálnym médiom a ponechaná 14 hodín inkubovať pri teplote 37 °C (OD₆oo približne 500). Do zmesi bol pridaný operónový regulátor a baktérie boli inkubované ďalšie 3 hodiny. Po uplynutí 3 hodín bola znovu zmeraná hodnota OD₆₀o, ktorá slúžila na odhad počtu baktérií a kultúra bola zriedená médiom M9 minimálnym médium (antibiotiká - chloramfenikol alebo ampicilín a regulátory boli pridané v dvojnásobných koncentráciách). Konečné inokulum obsahovalo približne 10 000 CFU/jamku.

Optická hustota bola kvôli pomalšiemu rastu baktérií v minimálnom médiu odpočítaná po 24 a 48 hodinách.

Príklad 8

Protokol počítačového modelovania použitého na predikciu inhibičného účinku vybraných analógov na ligázu

Virtuálna knihovňa 7-substituovaných pteridínov bola vygenerovaná kombináciou chlórmetylpterínového jadra, ktoré je zobrazené vľavo na nižšie uvedenej schéme, so súborom komerčne dostupných amínov, a to podľa nasledujúcej reakčnej schémy:

256/B

NH

Cl + HNR,R₂

NH.

nr,r₂

Súbor 1500 komerčne dostupných amínov bol vybraný zo zoznamu Available Chemicals Directory (ACD, MDL) na základe týchto kritérií:

molekulová hmotnosť amínov < 300;

amín neobsahuje žiadne reaktívne alebo toxické funkčné skupiny;

amín má všeobecné vlastnosti pripomínajúce liečivo;

amín je dostupný od známych a spoľahlivých dodávateľov.

Odpovedajúce deriváty pteridínu boli vygenerované pomocou modulu pre stavbu analógov implementovaného do programu Cerius2 (MSI). U vygenerovaných analógov bola pomocou programu Catalyst (MSI) uskutočnená konformačná štúdia a celkom 32 000 konformérov (tj. asi 20 konformérov na jednu molekulu) bolo pomocou programu EUDOC (Mayo Clinic) vložené do aktívneho miesta D-Ala-D-Ala ligázy. Konformácia uvedeného aktívneho miesta, ktorá bola použitá pri tomto vkladaní bola odvodená z rôntgenovej zistenej kryštalografickej štruktúry komplexu medzi enzýmom, ADP a fosfinátovým inhibítorom (ktorý bol získaný z proteínovej databanky, pdb kód: 2dln) s prešmykom a minimalizáciou konformácie postranného reťazca lyzínu 215.

Zo zistených výsledkov bol následne pre každú molekulu vybraný “najlepšie viažuci” konformér. Odpovedajúca orientácia v uvedenom aktívnom mieste bola znovu skórovaná pomocou súboru skórovacích funkcií implementovaných v programe CSCORE (Tripos). Zistené výsledky boli

256/B zoradené na základe skóre zhodnosti, pričom ako sekundárne kritérium bola použitá funkcia Chemscore. Bol vybraný súbor 76 zlúčenín s najlepším skóre a tieto zlúčeniny boli znovu vkladané pomocou programu FlexX (Tripos) do aktívneho miesta, pričom bola použitá rovnaká konformácia aktívneho miesta uvedeného enzýmu. Výsledky tohto vkladania boli znovu skórované programom CSCORE. Konečný výber 50 zlúčenín bol založený na zhode medzi výsledkami získanými pomocou uvedených dvoch programov na vkladanie analógov do aktívneho miesta enzýmov. Predikované hodnoty Ki, ktoré boli vypočítané programom Chemscore na základe výsledkov získaných pri použití programu FlexX, sa pohybovali v rozmedzí od 0,1 pM do 10 pM.

Uvedené výpočty boli uskutočnené na počítači SGI Octane (2 x 250 MHz CPU, 512 MB RAM), na počítači SGI 02 (270 MHz CPU, 128 MB RAM) a na skupine desiatich počítačov SGI Indigo2 (195 MHz CPU, 512 MB RAM).

Aj keď bol predmetný vynález opísaný v spojení s jeho podrobným opisom, je treba vyššie uvedený opis chápať len ako ilustratívny a nijako neobmedzujúci rozsah predmetného vynálezu, ktorý je definovaný nasledujúcimi patentovými nárokmi. Ďalšie aspekty, výhody a modifikácie vyplývajúce alebo uskutočnené na základe predchádzajúceho textu spadajú do rozsahu nasledujúcich patentových nárokov.

Claims (37)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zlúčenina všeobecného vzorca kde

   A a B sú nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm dusíka a skupinu CR⁷, kde

   R⁷ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu;

   R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne skupiny všeobecného vzorca -NR⁵R⁶, kde

   R⁵ a R⁶ nezávisle na seba predstavujú atóm vodíka alebo uhlik-obsahujúcu funkčnú skupinu;

   R³ je vybraná zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka, alkylovú skupinu, aminoskupinu, hydroxylovú skupinu, alkoxylovú skupinu alebo alkylaminoskupinu;

   R⁴ predstavuje uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu;

   32 256/B s tou podmienkou, že pokiaľ obidve skupiny A a B predstavujú atómy dusíka a obidve skupiny R⁵ a R⁶ predstavujú atómy vodíka, potom skupina R⁴ nepredstavuje skupinu —NH₂, skupinu -N(H) (metyl), skupinu -N(H) (butyl), skupinu N(H) (hexyl), skupinu -N(H) (fenyl), skupinu -N(H) (benzyl), skupinu N(H) (NH₂), skupinu -N(H) (CH₂CH₂OH), skupinu -N(CH₂CH₂OH)₂, fenylovú skupinu, N-piperadinylovú skupinu alebo skupinu-S(etyi);

   pokiaľ skupina A predstavuje skupinu CH, skupina B predstavuje atóm dusíka a obidve skupiny R⁵ a R⁶ predstavujú atómy vodíka, potom skupina R⁴ nepredstavuje metylovú skupinu, izobutylovú skupinu, fenylovú skupinu, 4-metylfenylovú skupinu, 4-chlórfenylovú skupinu, 4brómfenylovú skupinu, 2-(2,5-dimetoxyfenyl)etylovú skupinu alebo skupinu -CH(OCH3)₂; a pokiaľ obidve skupiny A a B predstavujú skupiny CH, potom skupina R⁴ predstavuje aminoskupinu, ktorou nie je skupina -NH₂, (3,4dichlórfenyljmetylaminoskupina alebo (3,4-dichlórfenyl) metyléniminoskupina.
2. 2. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej skupina R⁴ predstavuje substituovanú alebo nesubstituovanú, lineárnu, rozvetvenú alebo cyklickú alkylovú skupinu, alkenylovú skupinu, alkinylovú skupinu, arylovú skupinu, aralkylovú skupinu alebo alkarylovú skupinu.
3. 3. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej obidve skupiny R⁵ a R⁶ predstavujú atómy vodíka.
4. 4. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej skupina R⁴ obsahuje aspoň jednu arylovú skupinu.

   32 256/B
5. 5. Zlúčenina podľa nároku 4, v ktorej je skupina R⁴ vybraná zo súboru zahrňujúceho skupiny
6. 6. Zlúčenina podľa nároku 4, kde R⁴ predstavuje skupinu

   R^{8 12} sú nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúce funkčné skupiny.
7. 7. Zlúčenina podľa nároku 4, ktorou je zlúčenina všeobecného vzorca

   32 256 B kde

   R⁸'¹⁶ sú nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúce funkčné skupiny.
8. 8. Zlúčenina podľa nároku 7, v ktorej skupina R⁹ predstavuje atóm vodíka alebo metylovú skupinu.
9. 9. Zlúčenina podľa nároku 8, ktorou je zlúčenina všeobecného vzorca

   32 256/B kde n je 1,2, 3, alebo 4; a

   R¹⁷ predstavuje skupinu všeobecného vzorca -NR¹⁸R¹⁹, v ktorej

   18 19

   R a R nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúce funkčné skupiny.
10. 10.

    Zlúčenina podľa nároku 9, v ktorej je skupina R¹⁷ vybraná zo súboru zahrňujúceho skupiny

    32 256/B
11. 11. Zlúčenina podľa nároku 7, v ktorej skupina R⁸ predstavuje skupinu všeobecného vzorca -(CH₂)_nNR¹⁸R¹⁹, kde n je 1,2, 3 alebo 4; a

    1 O 1 Q

    R a R nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúce funkčné skupiny.
12. 12. Zlúčenina podľa nároku 4, v ktorej je skupina R⁴ vybraná zo súboru zahrňujúceho -CH₂O-arylovú skupinu, -CH₂S-arylovú skupinu, -CH=CH-arylovú skupinu a NH(CH₂-aryl)ovú skupinu.

    kde

    R²⁰ je vybraná zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.

    32 256/B

    100
13. 14. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej je skupina R⁴ vybraná zo súboru zahrňujúceho skupinu -N(CH3)R²¹, skupinu -N(CH2CH₃)R²¹, skupinu -N(CH(CH₃)₂)R²¹, skupinu -N(benzyl)R²¹, v ktorých skupina R²¹ predstavuje uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.
14. 15. Zlúčenina podľa nároku 1, v ktorej je skupina R⁴ vybraná zo súboru zahrňujúceho skupinu -CH2NH2, skupinu -NHCH2CH2NR²²R²³ a skupinu -CH2NHC(=O)R²², v ktorých sú skupiny R²² až R²³ nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúce funkčné skupiny.
15. 16. Zlúčenina podľa nároku 15, v ktorej skupina R²² predstavuje atóm vodíka a skupina R²³ predstavuje skupinu -C(=O)R²⁴, v ktorej skupina R²⁴ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu.
16. 17. Zlúčenina podľa nároku 1, ktorou je zlúčenina všeobecného vzorca

    R² R³

    32 256/B

    101

    R²⁵ a R²⁶ sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúce funkčné skupiny.
17. 18. Zlúčenina podľa nároku 17, v ktorej R²⁵ predstavuje atóm vodíka, alkylovú skupinu, hydroxyalkylovú skupinu alebo aralkylovú skupinu; a R²⁶ predstavuje haloalkylovú skupinu, hydroxylovú skupinu, skupinu C(=O)NR²⁷R²⁸, skupinu C(=O)OR²⁷ alebo skupinu NR²⁷R²⁸, v ktorej sú skupiny R²⁷ a R²⁸ nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho atóm vodíka a uhlík-, dusík, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúce funkčné skupiny.
18. 19. Zlúčenina podľa nároku 17, v ktorej R²⁶ predstavuje skupinu -C(H) (aryl) (R²⁹), v ktorej skupina R²⁹ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu.
19. 20. Zlúčenina podľa nároku 19, v ktorej skupina R²⁹ obsahuje aspoň jednu acylovú skupinu.
20. 21. Zlúčenina podľa nároku 19, v ktorej arylovou skupinou je naftylová skupina alebo benzotiofenylová skupina.
21. 22. Zlúčenina podľa nároku 19, v ktorej skupina R²⁹ obsahuje ahydroxykarboxylátovú skupinu. ²³
22. 23. Zlúčenina všeobecného vzorca

    32 256/B

    102

    R² kde

    R¹ a R² sú rovnaké alebo rôzne skupiny všeobecného vzorca NR⁵R⁶, v ktorej každá zo skupín R⁵ a R⁶ predstavuje nezávisle atóm vodíka alebo uhlík obsahujúcu funkčnú skupinu; a

    R⁴ je aminoskupina, ktorou nie je skupina -NH₂ alebo skupina.
23. 24. Spôsob inhibície D-Ala-D-Ala ligázy, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje vystavenie D-Ala-D-Ala ligázy pôsobeniu zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo všeobecného vzorca (II)

    32 256/B

    103 kde

    A a B môžu nezávisle na seba predstavovať atóm dusíka alebo skupinu CR⁷, kde

    R⁷ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogéna/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu;

    R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne skupiny všeobecného vzorca -NR⁵R⁶, kde

    R⁵ a R⁶ nezávisle na seba predstavujú atóm vodíka alebo uhlík-obsahujúcu funkčnú skupinu; a

    R³ a R⁴ sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho atóm vodíka a uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu;

    s tou podmienkou, že obidve skupiny R³ a R⁴ nepredstavujú atómy vodíka.
24. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že obidve skupiny R¹ a R² predstavujú skupiny -NH₂.
25. 26. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že skupina R³ predstavuje atóm vodíka.
26. 27. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že skupiny R³ a R⁴ sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho rozvetvenú alebo lineárnu alkylovú skupinu, -O-alkylovú skupinu, skupinu -O-alkyl-COOH, skupinu -O-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu —O-alkylOH, skupinu -NR⁷R⁸, skupinu -NR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-alkylCOOH, skupinu -NR⁷-alkyl-OH; skupinu -CONR⁷R⁸, skupinu -CONR⁷32 256/B

    104 alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-alkyl-COOH, skupinu -CONR⁷-alkyl-OH, -S-alkylovú skupinu, skupinu -S-alkyl-COOH, skupinu -S-alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -S-alkyl-OH, -O-arylovú skupinu, skupinu -O-aryl-OOH, skupinu -O-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -O-aryl-OH, -S-arylovú skupinu, skupinu -S-aryl-COOH, skupinu -S-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -S-aryl-OH, skupinu -NR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-aryl-COOH, skupinu -NR⁷aryl-OH; skupinu -CONR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-aryl-COOH, skupinu -CONR⁷-aryl-OH alebo skupinu -CH2NR⁵C6H4COOH; stou podmienkou, že skupiny R³ a R⁴ nemôžu simultánne predstavovať zhodné rozvetvené alebo lineárne alkylové skupiny;

    skupiny R¹ a R² sú nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka, skupinu -NH2 alebo skupinu -NR¹¹R¹², pričom aspoň jedna zo skupín R¹ a R² predstavuje skupinu -NH2;

    skupina R⁵ predstavuje nižšiu alkylovú skupinu, atóm vodíka alebo skupinu -CH2NR¹⁰C6H₄CONHR⁶; kde R⁶ je vybraná zo súboru zahrňujúceho -alkylovú skupinu, skupinu -alkyl-COOH, skupinu -alkylNH₂ a skupinu -alkyl-OH;

    skupiny R, R, R, R, R a R sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho lineárnu alkylovú skupinu, rozvetvenú alkylovú skupinu, arylovú skupinu a acylovú skupinu, ktoré môžu byť prípadne substituované jednou alebo viacerými funkčnými skupinami na báze kyslíka, dusíka, síry alebo halogénu; a skupina A je vybraná zo súboru zahrňujúceho atóm dusíka alebo skupinu CH.
27. 28. Spôsob liečenia pacienta vyznačujúci sa tým, že zahrňuje stupeň, v ktorom sa uvedenému pacientovi podáva účinné množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) alebo všeobecného vzorca (II)

    32 256/B

    105

    RZ •R3

    R4 (I)

    R2

    R3

    R1 (II) kde

    A a B môžu nezávisle na seba predstavovať atóm dusíka alebo skupinu

    CR⁷, kde

    R⁷ predstavuje atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogéna/alebo kyslík-obsahujúcu funkčnú skupinu;

    R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne skupiny všeobecného vzorca -R⁵R⁶, kde

    R⁵ a R⁶ nezávisle na seba predstavovať atóm vodíka alebo uhlikobsahujúcu funkčnú skupinu; a

    R³ a R⁴ sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho atóm vodíka alebo uhlík-, dusík-, síru-, halogén- a/alebo kyslíkobsahujúcu funkčnú skupinu; s tou podmienkou, že obidve skupiny R³ a R⁴ nepredstavujú atómy vodíka.
28. 29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že obidve skupiny R¹ a R² predstavujú skupiny -NH2.
29. 30. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že skupina R³ predstavuje atóm vodíka.

    32 256/B

    106
30. 31. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že skupiny R³ a R⁴ sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho rozvetvenú alebo lineárnu alkylovú skupinu, -O-alkylovú skupinu, skupinu -O-alkyl-COOH, skupinu -O- alkyl-NR⁷R⁸, skupinu -O-alkylOH, skupinu-NR⁷R⁸, skupinu-NR⁷-alkyl- NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷alkyl-COOH, skupinu -NR⁷-alkyl-OH; skupinu -CONR⁷R⁸, skupinu CONR⁷-alkyl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-alkyl-COOH, skupinu -CONR⁷alkyl-OH, -S-alkylovú skupinu, skupinu -S-alkyl-COOH, skupinu -Salkyl-NR⁷R⁸, skupinu -S-alkyl-OH, -O-arylovú skupinu, skupinu -O-arylCOOH, skupinu -O-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -O-aryl-OH, -S-arylovú skupinu, skupinu -S-aryl-COOH, skupinu -S-aryl-NR⁷R⁸, skupinu -Saryl-OH, skupinu -NR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -NR⁷-aryl-COOH, skupinu -NR⁷-aryl-OH; skupinu -CONR⁷-aryl-NR⁸R⁹, skupinu -CONR⁷-arylCOOH, skupinu -CONR⁷-aryl-OH alebo skupinu -CH₂NR⁵C6H4COOH; stou podmienkou, že skupiny R³ a R⁴ nemôžu simultánne predstavovať zhodné rozvetvené alebo lineárne alkylové skupiny;

    skupiny R¹ a R² sú nezávisle na seba vybrané zo skupiny zahrňujúcej atóm vodíka, skupinu -NH2 alebo skupinu -NR¹¹R¹², pričom aspoň jedna zo skupín R¹ a R² predstavuje skupinu -NH2;

    skupina R⁵ predstavuje nižšiu alkylovú skupinu, atóm vodíka alebo skupinu -CH2NR¹⁰C6H4CONHR⁶; kde R⁶ je vybraná zo súboru zahrňujúceho -alkylovú skupinu, skupinu -alkyl-COOH, skupinu -alkylNH₂ a skupinu -alkyl-OH;

    skupiny R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹¹ a R¹² sú nezávisle na seba vybrané zo súboru zahrňujúceho lineárnu alkylovú skupinu, rozvetvenú alkylovú skupinu, arylovú skupinu a acylovú skupinu, ktoré môžu byť prípadne substituované jednou alebo viacerými funkčnými skupinami na báze kyslíka, dusíka, síry alebo halogénu; a
31. 32 256/B

    107 skupina A je vybraná zo súboru zahrňujúceho atóm dusíka alebo skupinu CH.

    32. Farmaceutický prostriedok vyznačujúci sa tým, že zahrňuje zlúčeninu 1 v kombinácii s excipientom vhodným na podávanie subjektu.
32. 33. Spôsob liečenia subjektu s mikrobiálnou infekciou, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje stupeň, v ktorom sa uvedenému subjektu podáva účinné množstvo farmaceutickej kompozície podľa nároku 32.
33. 34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že uvedeným subjektom je živočích.
34. 35. Spôsob inhibície bakteriálneho rastu v neživých systémoch, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje kontaktovanie uvedeného systému s takým množstvom zlúčeniny podľa nároku 1, ktoré je účinné na inhibíciu bakteriálneho rastu.
35. 36. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že uvedená D-Ala-D-Ala ligáza zahrňuje sekvenciu , ktorá je aspoň z 90 percent identická so sekvenciou D-Ala-D-Ala ligázy z kmeňa vybraného zo skupiny zahrňujúcej nasledujúce druhy baktérií Escherichia coli, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Xylella fastidiosa, Bordetella pertussis, Tiobacillus ferrooxidans, Neisseria meningitidis, Neissseria gonorrhoeae, Buchnera aphidicola, Bacillus halodurans, Geobacter sulfurreducens, Rickettsía prowazekii, Zymomonas mobilis, Aquifex aeolicus thermophile, Thermotoga maritima, Clostridium difficile, Enterococcus faecium, Streptomyces toyocaensis, Amycolatopsis orientalis, Enterococcus gallinarum, Enterococcus hirae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis,

    32 256/B

    108

    Sreptococcus pneumoniae, Sreptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus sublitis, Bacillus stearothermophilus, Deinococcus radiodurans, Synechocystis sp., Salmonella typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium smegmatis, Legionella pneumophila, Leuconostoc mesenteroides, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Vibrio cholerae a Helicobacter pylori.
36. 37. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje reakciu ktoréhokoľvek z medziproduktov opísaných v tomto texte s jedným alebo viacerými chemickými činidlami v jednom alebo viacerých stupňoch, za vzniku zlúčeniny podľa nároku 1.
37. 38. Produkt pripraviteľný spôsobom podľa nároku 37.