BG60687B1 - Специфични свързващи вещества - Google Patents

Специфични свързващи вещества Download PDF

Info

Publication number
BG60687B1
BG60687B1 BG96346A BG9634692A BG60687B1 BG 60687 B1 BG60687 B1 BG 60687B1 BG 96346 A BG96346 A BG 96346A BG 9634692 A BG9634692 A BG 9634692A BG 60687 B1 BG60687 B1 BG 60687B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
human antibody
ser
preformed
tyr
vai
Prior art date
Application number
BG96346A
Other languages
English (en)
Other versions
BG96346A (bg
Inventor
Martine E Verhoeyen
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB898926045A external-priority patent/GB8926045D0/en
Priority claimed from GB909019552A external-priority patent/GB9019552D0/en
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of BG96346A publication Critical patent/BG96346A/bg
Publication of BG60687B1 publication Critical patent/BG60687B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fireproofing Substances (AREA)
  • Paper (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до преоформено човешко антитяло или негов фрагмент със специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза (PLAP), получено чрез пренасяне на определящи комплементарността зони (CDR) от миша анти-PLAP хибридомна клетъчна линия Н17Ег в човешка антитяло вариабилна структура. Преоформената молекула може да бъде използвана при третирането или диагностицирането на рака.

Description

Това изобретение се отнася до специфични свързващи вещества и специално до полипептиди, съдържащи аминокиселинни последователности, които се свързват специфично към други протеинови и непротеинови материали. По-специално, изобретението се отнася до получаването на такива специфични свързващи вещества чрез генното инженерство.
Природните антитяло молекули се състоят от два идентични тежковерижни и два идентични лековерижни полипептида, които са ковалентно свързани чрез дисулфидна връзка (фиг. 13 от приложените фигури представя във вид на диаграма типичната структура на едно антитяло от IgG клас).Всяка от веригите е нагъната в няколко дискретни области. N-терминалните области на всичките вериги са различни по последователност и поради това се наричат вариращи зони (V-зони). V-зоните на една тежка (VH) и една лека (VL) верига се свързват да оформят свързващо антиген място. Модулът, оформен чрез комбинираните VH и VL области се означава като Fv (вариращ фрагмент) на антитялото. С-терминалните крайща на тежките и леките вериги са по-постоянни по последователност и поради това се означават като постоянни зони. Тежковерижните постоянни зони са съставени от няколко области например тежката верига на гама изотопа (IgG) се състои от три области (СН1, СН2 и СН3) и една свързваща зона, която свързва СН1 и СН2 областите. Лигандите на двете тежки вериги са ковалентно свързани чрез дисулфидни мостове. Леките вериги имат една контактна област, която се прикрепва към СН1 областта. Константните зони на молекулата антитяло са включени в ефекторни функции като лизиране на комплемент и избистряне чрез така наречената чрез зависеща от антитялото клетъчна цитотоксичност (ADCC). Класическото разграждане на едно антитяло с протеазен папаин дава три фрагмента. Един фрагмент се състои от СН2 и СНЗ области и, тъй като кристализира лесно, се нарича Fc-фрагмент. Другите два фрагмента се означават като Fab (свързващ антиген) фрагменти, които са идентични и съдържат цялата лека верига, комбинирана с VH и СН1 областта. Когато се използва пепсин, протеолитичното разграждане е такова, че двата Fab остават свързани и оформят ( Fab) фрагмент. Всяка от областите е представена от един екзон в генетично равнище.
Самите вариращи зони съдържат всяка три грозда от хипервариабилни остатъка в структура от повече последователности. Тези хипервариабилни зони взаимодействат с антигена и се наричат комплемент определящи зони (CDR). По-запазените последователности се наричат структурни зони (Fr) (виж /9/). Рентгенови проучвания на антителата показват, че CDR оформят звена, които изпъкват от горната страна на молекулата, докато Fr предлагат бета-слойна структура.
При един вариант на изпълнение изобретението се отнася до така наречените “преоформени” или “остарели” човешки антитела например имуноглобулини, имащи по същество човешка константна и структурна зона, но в които определящите допълнителни зони (CDR) отговарят на тези установени в нечовешки имуноглобулин и отговарят също на преоформени фрагменти антитяло.
Общите принципи, по които такива преоформени човешки антитела и фрагменти могат да се произвеждат са за сега добре известни /8/, /17/, /25/ и /27/. Изчерпателен списък на подходящи литературни източници посочен по-долу.
Преоформени човешки антитела и фрагменти се използват специално при диагностициране и третиране ин виво на заболявания при хора, тъй като по същество човешките протеини е по-малко вероятно да индуцират нежелани реакции, когато бъдат приложени на хора и желаната специфичност придавана чрез CDR може да бъде повишена като гостоприемника е животно, напр. мишка, от където могат да бъдат получени антитела с подбрана специфичност много по-лесно. Вариабилните области на веригата могат да бъдат клонирани от не-човешко антитяло и CDR, присадени в човешка вариабилна структура чрез методиките на генното инженерство за създаване на преоформено човешко антитяло или фрагмент. За постигане на този резултат е необходимо да се идентифицират и посочат последователностите най-малкото на CDR в избраното нечовешко антитяло и за предпочитане цялостната последователност на нечовешка вариабилна зона, за да се позволи идентифициране на потенциално важни взаимодействия на CDRструктури.
Изобретението предлага, един специфичен свързващ полипептид със специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза (PLAP). Приемаме, че полипептидът, продуциран чрез методика на рекомбинантна ДНК е най-малкото различен от природно съществуващо или природно индуцираното свързващо вещество ,което има идентична специфичност. Обратно, синтетичният полипептид се продуцира чрез изкуствено инсертиране на последователност от амино киселини за получаване на нова идентична на природната молекула. Синтетичният полипептид може да е еквивалентен на интактно обикновено антитяло или еквивалентен на множествен или едноверижен фрагмент на такова антитяло или може да е просто материал, който включва една или повече последователности, което допринася за желаната способност за специфично свързване.
Изобретението предлага едно преоформено човешко антитяло, или негов фрагмент, което има античовешка плацентарна алкално фосфатазна (PLPA) специфичност.
По-специално, изобретението предлага преоформено човешко антитяло или преоформен фрагмент на човешко антитяло, което има анти-човешка плацентарна алкално фосфатазна специфичност, съдържащ една или повече CDR посочени на фигури 1 и 2 в придружаващите фигури. За предпочитане, преоформеното антитяло или фрагмент от изобретението съдържа всичките три CDR посочени на фигура 1 от приложените фигури, в една човешка тежковерижна вариабилна зона на структурата. Обратно, или в допълнение, преоформеното антитяло или фрагмент от изобретението, съдържа и трите CDR, посочени на фигура 2 от придружаващите фигури, в една човешка лековерижна променлива зона на структурата.
Друг вариант на изпълнение на изобретението е специфично преоформено антитяло или преоформен фрагмент на антитяло, съдържащо една протеинова последователност, както е посочено на фигура 10 и/или на фигура 11. Други важни приложения на изобретението са един експресионен вектор, включващ ДНК последователност, както е посочено на фигура 11 и/или 10 от приложените фигури и един експресионен вектор, включващ една ДНК последователност, кодираща една или повече протеинови последователности, означени като CDR във фигура 1 и/или фигура 2 от приложените фигури.
Важна страна на изобретението е стабилна гостоприемникова клетъчна линия, съдържаща един чужд ген, който е причина гостоприемниковата клетъчна линия да продуцира специфично свързващо вещество според изобретението. Това може да бъде стабилна гостоприемникова клетъчна линия, съдържаща един чужд ген, кодиращ най-малко една от амино киселинните последователности, означени като CDR във фигура 1 и/или фигура 2 от придружаващите фигури, заедно с протеинова структура, която позволява кодираната амино киселицна последователност, когато е експресирана, да функционира като CDR със специфичност за PLAP.
Изобретението предлага по-специално една безсмъртна клетъчна линия, или дрожди или друга еукариотична или прокариотична клетка, като бактериум, продуцираща преоформено антитяло или фрагмент.
Друг важен аспект на изобретението е синтетично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен фрагмент на човешко антитяло, имащо специфичен еквивалент като този на гама-1, капа-анти PLAP моноклонално антитяло, секретирано от миша хибридомна клетъчна линия Н17Е2.
Изобретението предлага също два нови плазмида pSVgptHu2vHPLAP-HulgGl и PSVneoHuvkPLAP-Hack и тези плазмиди могат да бъдат използвани при продуциране на синтетично специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен фрагмент на човешко антитяло.
Тези плазмиди се съдържат в нови щамове на E.coli NCTC 12389 NCTC 12390 съответно.
Други страни на изобретението са:
(а) Една ДНК последователност, кодираща едно преоформено човешко антитяло с тежковерижна вариабилна зона, имащо специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, както се съдържа в E.coli NCTC12389.
(в) Една ДНК последователност, кодираща преоформено човешко антитяло с лековерижна вариабилна зона, имащо специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, както се съдържа в E.coli NCTC 12390.
(c) Едно преоформено човешко антитяло с тежковерижна вариабилна Зона, имаща специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, продуцируема посредством експресионния вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12389.
(d) Едно преоформено човешко антитяло с лековерижна вариабилна зона, имаща специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, продуцируема посредством експресионен вектор, съдържащ се в E.Coli NCTC 12390.
(e) Преоформено човешко антитяло или преоформен фрагмент на човешко антитяло, съдържащ най-малкото една променлива зона както (С) или (d) по-горе.
Възможно е специално приложение на изобретението поради това, че преоформено човешко антитяло или фрагмент, притежаващо анти-PLAP специфичност и включващо комбинация от CDR (която може, примерно, да бъде клонирана от миши анти-PLAP имуноглобулин) имаща амино киселинна последователност, идентифицирана като CDR1, CDR2 и CDR3 съответно във фигура 1 и 2 от придружаващите фигури, която съответно представлява тежковерижна променлива зона (vH) и лековерижна променлива зона (vk) на миши анто-PLAP моноклонално антитяло, което ние сме клонирани и подредили по последователност. В случая с интактно антитяло, или фрагмент съдържащ най-малкото една тежковерижна променлива зона и най-малкото една лековерижна променлива зона, преоформеното антитяло или неговия фрагмент съдържа за предпочитане всичките шест CDR от източник, различен от човека. За да бъдат най-ефективни при свързване, CDR трябва за предпочитане да бъдат разположени относително едно към друго в същия порядък както се явява в оригиналното не-човешко антитяло. Например vH CDR трябва да са в човешка vH структура и в реда, в който се се явяват в не-човешко антитяло.
Както ще стане ясно на специалистите в тази област, CDR последователностите и окръжаващите структурни последователности може да са обект на малки модификации и варирания, без да бъде значимо понижена съществената специфична свързваща способност. Такива малки модификации и варирания може да са налице или на генетично ниво или в аминокиселинната последователност, или и в двете.
Съответно, изобретението обхваща синтетични (преоформени) антитела и фрагменти, които са функционално еквивалентни с тези описани тук и имащи точно определени генетична или аминокиселинна последователност.
Изобретението може също да се приложи при продуциране на би-специфични антитела ,имащи две Fab части с различна специфичност, при което една от специфичностите е свързана с преоформена променлива верижна зона, включваща една или повече CDR, както са посочени на фигури 1 и 2 от придружаващите фигури.
Изобретението може също да се приложи при продуциране на така наречените едноверижни антитела (например както е посочено в Genex ЕР-А-281604), а също и на полизахаридно свързани антитела (виж Hibritex ЕР-А-315456) и други модифицирани антитела.
Може да бъде използвана всяка константна човешка зона (например гама 1,2, и 4-тип).
Фрагментите антитяло, които запазват полезни специфични свързващи свойства могат да бъдат Fab2,Fab, Fv, Vh или vk фрагменти. Те може да произхождат от интактно преоформено антитяло, например чрез протеазно разграждане, или да бъдат продуцирани като такива чрез генно инженерство.
Важен аспект на изобретението е преоформено човешко анти-PLAP антитяло или фрагмент, както е определено по-горе, което да е свързано към или включено във вещество, което е способно да забавя или да спира растежа на ракови клетки, или да е свързано към предполагаемо вещество, което е възможно да бъде открито, докато е вътре в човешкото тяло. Изобретението също включва инжекционни състави във фармацевтично приемлив носител, като физиологичен разтвор, разредител на плазма или липозоми. Изобретението също включва използването при един метод за третиране на рак у човека, от преоформено човешко анти-PLAP антитяло при фрагмент, както е определено по-горе. Изобретението включва освен това, използването на такова антитяло или негов фрагмент за производство на медикамент за терапевтично приложение с оглед облекчаване на пациентите, заболели от рак за приложение на такова антитяло или фрагмент при производството на диаг ностични състави за ин виво диагностика при хора.
Fc зоната на антитялото, използвайки само пътища и механизъм на разположение в тялото, като лизиране на комплементи и зависеща от антитялото клетъчна цитотоксичност, може да бъдат използвани за повлияване обратно растежа на ракови клетки. При това приложение, не е необходимо към преоформеното антитяло да бъде свързан допълнителен реагент.
Примери за вещества, пригодни да влияят обратно върху растежа на ракови клетки включват радиоизотопи, като Итрий 90 и йод 131; лекарствени средства като метотрексат, токсини като рицин или части от него; и ензими, които могат примерно да превърнат неактивните в активни лекарствени средства на мястото на свързване на антитялото.
Използваните за визуализиране вещества включват радиоизотопи, генериращи гама лъчи, като Индий 111 и Технециум 99; радиоизотопи генериращи позитрони, като мед 64; и пасивни вещества като барий, който действа като контрастно вещество за рентгенови лъчи, и Гадолинум в nmr/esr сканиране.
С оглед свързване на метал, като например радиоизотоп, към специфичното свързващо вещество от изобретението може да е необходимо да се използва удвояващ или хелатен агент. Разработени са голям брой подходящи хелатни съединения и указания за това могат да се намерят например в US патент 4824986, 4831175, 4923985 и 4622420. Методиките, включващи използването на хелатни съединения са описани например в US патенти 4454106, 4722892 в /12/, /10/, /1/ и /11/.
Използването на радиобелязани антитела и фрагменти при визуализиране на рак и лечение на хора е описано например в ЕР 35265.
Антитяло реагентите по изобретението може да бъдат използвани за идентифициране, например чрез серумно изпитване или изобразяване и/или за третиране на PLAP-продуциращ рак. Такъв рак може да е например рак на гърдата, рак на яйчника и рак на дебелото черво, или може да се проявява като течности както при плеврални изливи.
Частите от vH и VL зоните, които за удобство са означени като CDR /виж 9/ може да не са единствените белези, които има нуж да да бъдат пренесени от не-човешкото моноклонално антитяло. Понякога, повишена активност на антитялото, с оглед на специфичност и/или афинитет, може да бъде постигната в преоформено човешко антитяло, ако известни нечовешки структурни последователности са запазени в преоформеното човешко антитяло. Целта е да се запази важния тридименсионален протеин като структура, свързана е CDR, което е подкрепено чрез контакт със структурните остатъци.
Нормалния изходен пункт, то който може да бъде получено едно преоформено антитяло съгласно изобретението, е клетка (за предпочитане обезсмъртена клетъчна линия), произхождаща от гостоприемник, различен от човека (например мишка), която експресира антитяло със специфичност срещу човешки PLAP. Такава клетъчна линия може, например, да е хибридомна клетъчна линия получена чрез обикновената технология за моноклонално антитяло. За предпочитане, експресираното антитяло има висок афинитет и висока специфичност за PLAP, защото трябва да се приеме, че известна загуба на афинитет и/или специфичност може да се появи по време на пренасяне на тези свойства до човешко антитяло или фрагмент съгласно методите по изобретението. Чрез подбор на ниско афинитетно или високо специфично антитяло като родителско антитяло, вероятността че крайното преоформено антитяло или фрагмент също ще проявяват ефективни свързващи свойства се повишава.
Следващият стадий е клониране на сДНК от клетки, експресиращи селекционираното не-човешко антитяло и съгласуване и идентифициране на вариабилните области на веригата, включително последователностите кодиращи CDR. Включените процедури могат сега да бъдат разглеждани като рутинни за тази област, въпреки че са още трудни.
Ако задачата е да се продуцира преоформено цялостно човешко антитяло, или най-малкото негов фрагмент, който ще съдържа както тежка, така и лека вариабилна област, ще е необходимо да се посочи последователността на сДНК, свързана с тези области.
След като веднъж са анализирани сДНК последователност или последователности, е необходимо да се приготвят един или повече реплициращи се експресионни вектори ,съдържа щи ДНК последователност, която кодира наймалкото една вариабилна област от антитялото, която вариабилна област съдържа човешки структурни зони заедно с една или повече сДНК, получени от избрано не-човешко антиPLAP антитяло. ДНК последователността във всеки вектор трябва да включва подходящи регулаторни последователности, необходими да осигурят ефективно транскрибиране и транслиране на гена, специално един промотер и лидерна последователност, работно свързана към вариабилната последователност на областта. При една типична процедура за продуциране на преоформено антитяло или фрагмент съгласно изобретението може да е необходимо да се продуцират два експресионни вектора, един съдържащ ДНК последователност за преоформена човешка лека верига и друга последователност за преоформена човешка тежка верига. Експресионните вектори трябва да са в състояние да трансформират избрана клетъчна линия, в която ще започне продуциране на преоформено антитяло или фрагмент. Такава клетъчна линия може да бъде, например, стабилна не-продуцираща миелома клетъчна линия, образци от която (като NSO и SP-2) са лесно достъпни търговски. Алтернатива е използването на бактериална система като E.coli, в качеството на експресионно средство за преоформеното антитяло или фрагмент. Крайните стадии на процедурата, поради това включват трансформиране на избраната клетъчна линия или организъм при използване на експресионния вектор или вектори, и след това култивиране на трансформираната клетъчна линия или организъм да даде преоформено човешко антитяло или фрагмент.
Само като пример, в настоящото описание са посочени в подробности етапите, посредством които могат да бъдат получени подходящи експресионни вектори. Манипулирането с ДНК материал в подходящо съоръжена лаборатория понастоящем е добре разработена област, а необходимата процедура е добре известна на специалистите. Голям брой подходящи геномни и ДНК библиотеки, плазмиди, рестрикционни ензими и различни реагенти и среди, които се изискват за извършване на такива манипулации, са достъпни търговски от доставчиците на лабораторни материали. Например, гении и ДНК библиотеки могат да бъдат закупени от Clontex Lab, Inc. Етапите, посочени като примерни по-долу, са само ръководство за четящия това описание и изобретението не е в никакъв случай зависимо от наличието на един или повече специални изходни материали. На практика, добре запознатото лице има широк обхват материали, от които да избира и може да използва и да пригажда публикуваната технология с помощта на придобит опит и материали, които не са лесно достъпни в научна обстановка. Например голям брой от плазмидите спадат в тази категория, тъй като са така широко използвани и взаимно обменяни в рамките на съответното научно общество, че могат да бъдат разглеждани като обикновени материали.
Примери
Използваната процедура за получаване на преоформени анти-PLAP човешки антитела е описана в подробности по-долу посредством примери само, съобразно с придружаващите фигури от които:
фигура 1 показва сДНК последователност, кодираща миша тежковерижна вариабилна зона, имаща анти-PLAP специфичност. Трите класически CDR са посочени заедно с една амино киселинна последователност, бележеща сДНК кода.
Фигура 2 показва сДНК последователност кодираща за миша лековерижна вариабилна зона, имаща анти-PLAP специфичност.
Фигури За и Зв заедно показват пътя, по който може да бъде получен експресионен вектор, кодиращ човешка тежка верига, включваща CDR от фигура 1,
Фигури 4а и 4в заедно посочват един подобен път за трансформиране за получаване на експресионен вектор кодиращ преоформена човешка лека верига включваща CDR от фигура 2.
Фигура 5 показва плазмида PU12-IgEnh, който съдържа една енхансерна последователност, използвана по начина, съответно на фиг.4 до 4в.
Фигура 6 показва източника на плазмид pBGS18-TlgGt, използван по начина от фигура Зв.
Фигура 7 показва източника на плазмида pHGS18-HuCk, използван по начина от фигура 4в.
Фигура 8 показва синтетичните две олигонуклеотидни последователности I и II използвани за клониране на сДНК последова телностите от фигури 1 и 2.
Фигура 9 показва шест синтетични олигонуклеотидни последователности III до VIII, използвани по начина, посочен на фигури За-4в.
Фигури 10 и 11 показват сДНК и амино киселинните последователности на получените преоформени човешки тежко- и лековерижни вариабилни зони съответно.
Фигура 12 показва в графична форма относителната специфична анти-PLAP свързваща активност на резултиращото преоформено човешко антитяло.
Фигура 13 представя във вид на диаграма структурата на едно типично антитяло (имуноглобулинова) молекула.
Експерименталните методи за прилагане на изобретението сами по себе си не са необичайни и включват непосредствено клониране и техниката на мутагенеза, както са описани най-общо например в /25/, /17/ и /27/ . Обратно, ако подходяща ДНК последователност е вече известна в подробности (чертежите придружаващи това описание включват последователност свързана с анти-PLAP специфичност) , преоформените човешки гени за вариабилните зони може да бъдат синтетизирани ин витро (виж /8/). Лабораторните съоръжения и реактиви за синтетизиране на дългите олигонуклеотиди са лесно достъпни и така както се развива методиката в това направление, това става практически възможно да се синтетизират прогресивно по-дълги последователности.
На разположение са подробни лабораторни ръководства, покриващи всички страни на рекомбинантните ДНК методики (например /18/).По смисъла на изобретението антигенната свързваща зона на мишо анти-PLAP антитяло се присажда върху човешки структурни зони. Резултиращото преоформено човешко антитяло (означавано Hu2PLAP) има свързващи характеристики, сходни с тези на изходното мишо антитяло.
Такива преоформени антитела може да бъдат използвани ин виво за диагноза и третиране на човешки рак, например рак на яйчниците и семинома и се очаква най-малкото да намаляват проблемите за имунен отговор при пациентите, наблюдавани често при прилагането на не-човешки антитела. Подобно преимущество е посочено за преоформеното КАМПАТ-1 антитяло от лит.източник 6.
Методи:
(а) Клониране и определяне на последователност на миши гени от варируема зона
Информационна РНК се изолира от миша хибридомна линия Н17Е2, която секретира -1, -анти-PLAP антитяло, описано в /24/ . Първата верига сДНК се синтетизира чрез първично обработване с олигонуклеотиди I и И (виж фигура 8) допълнително към 5' краищата на СН1 и Ск екзони съответно. Втората верига сДНК се получава, както е описано в лит.източник /5/.
Киназни EcoRI линкери се свързват към понастоящемдвойно верижната сДНК (която се третира първо с EcoRI метилаза, за протекция на вероятни вътрешни EcoRI сайтове), последвано от клониране в разграден с EcoRI pUC9 (виж/26/) и трансформиране на щам E.coli TG2 (вж/4/).
Колонии, съдържащи гени за миша анти-PLAP-vH (MovHPLAP) и миша анти-PLAP vk (MovkPLAP) се идентифицират чрез колонийна хибридизация с 2 сонди, състоящи се съответно от 32Р-белязана първа верига сДНК на анти-PLAP vH и vk. Позитивните клонове се охарактеризират чрез обработка на плазмид, последвано от EcoRI разграждане и анализ върху 1,5 процента агарозен гел. Инсерти в пълния им размер (около 450 вр) се субклонират в EcoRI място на М13тр18 (виж /15/).Това дава клонове с инсерти в двете ориентации, улесняващо определянето на нуклеотидната последователност на цялостния инсерт, чрез метода с дидеокси верижно терминиране (виж /19/).
Нуклеотидните последователности и тяхното транслиране в амино киселинни последователности на гените на зрялата вариабилна зона MovHPLAP и MovkPLAP, са посочени на фигури 1 и 2. Инсертите 450 вр включват една сигнална последователност и 5' нетранслирани последователности и линкери, които не са посочени на фигурите.
(в) Присаждане на миши анти-PLAP CDR върху човешки структурни зони
Общата методика е описана твърде обстойно в /I/, /25/, /17/ и /27/.
Основните структури, използвани за преоформяне са M13mp9HuvHLys /25/ и MI3mp9HuvkLys /17/, които съдържат съответно структурните зони на тежковерижната променлива зона на човешки “NEW” и леко верижна променлива зона на човешки “RE1”. И двете човешки антитела са подробно охарактеризирани и докладвани (виж съответно /20/ и /2/.
CDR в тези структури (фигури За и 4а) се заместват от сайт-насочена мутагенеза с олигонуклеотиди, кодиращи анти-PLAP, фланкирани от поне 12 нуклеотида във всеки край, кодиращ съответните човешки структурни остатъци. Тези олигонуклеотиди са показани на фигура 9.
При настоящото изобретение ние намерихме за полезно да съхраним амино киселините Phe 27 и Thr 30 на мишата vHPLAP във vH областта на преоформеното човешко антиPLAP антитяло. В олигонуклеотид III с 24 нуклеотида прикачени към 5' края на CDR 1, мишите Phe 27 и Thr 30 кодони са посочени с курсив на фигура 9.
Мутагенезата се извършва както е описано в /17/. Получените в резултат вариабилни зони са наименовани Hu2vHPLAP и HuvkPLAP и са посочени на фигура 10 и 11.
с) Сбор от гени от преоформено човешко антитяло в експресионни вектори
Следващият стадий включва използването на енхансер на миша тежка верига IgEnh, описан в /14/ където енхансера се съдържа в един 1 kb Xbal фрагмент на плазмида pSv-v 1. Този 700 bp Xbal/EcoRl субфрагмент на фрагмента 1 kb ХЬ1 е достатъчен за да придаде повишена активност.
Преоформените човешки гени, така както са получени съгласно пункт (в) по-горе се изразяват от М13 вектора като Hindlll - BamHI фрагменти. Гените на тежковерижната вариабилна зона се клонират във вектор на база psv2gpt (виж /13/), а гените на лековерижната вариабилна зона се клонират във вектор на база psv2neo (виж /21/). И двете съдържат имуноглобулиновия тежковерижен енхансер IgEnh. В базирания на psv2gpt антитяло експресионен вектор (виж фигури 4в - 4с) съдържащият Xbal/EcoRI енхансерен фрагмент се клонира в уникалното EcoRI място на psv2gpt вектора (след лигиране EcoRI лиганд към запълнения в Хва1 край на фрагмента). Векторът pSvgptMovHLyS-MoIgGl (виж /25/) се използва като източник на psvgpt-базирания вектор съдържащ IgEnh енхансер.
В pSvneo базирания антитяло експресионен вектор (виж фигури 5а - 5b), lkb Xbal енхансерът, съдържащ фрагмент се клонира в pUC12 (виж /26/), който дава плазмида pUC12-IgEnh, виж фигура 5. Енхансерът може тогава да бъде отрязан като 700 bp EcoRI/ Hind III фрагмент (действа всяка ориентация на енхансера) и се клонира в PSv2neo - произхождащия вектор pSvneo MSN 409 както е посочено на фигура 4а) получен чрез отстраняване на HindiII мястото в pSvneo. Възможно е да се използва PSv2gpt като алтернативен вектор за лековерижно експресиране, като на практика няма нужда от ново селекциониране.
Hu2vHPLAP генът се свързва към човешка гама 1 константна зона (виж /23/), клониран в началото като един 8kb Hindlll фрагмент в Hindlll мястото на pBGS18 (виж /22/) и тогава в pSv2gpt експресионния вектор като BamHI фрагмент (виж фигури Зв и 6). Трябва да бъде отбелязано че в /23/ има една грешка във фигура 1: последните (3') две места са BamHI, последвани от Hindlll, а не обратното. Това е потвърдено от /3/.
Генът HuvkPLAP е свързан към човешка С капа константна зона (виж /7/) също се клонира като BamHI фрагмент (виж фигури 4в и 7). Източникът на човешки Ск, използван съгласно фигура 7 е даден от /7/. 12 kb BamHI фрагментът от ембрионална ДНК, (клонирана в гама Ch28 векторна система) се субклонира в BamHI мястото на плазмида pBR 322.
(d) Експресиране в миеломни клетки Ко-трансфектиране на експресионните плазмиди PsvgptHu2vHPLAP-HuIgGl и pSvneo HuvkPLAP-HuCk (фигури Зв и 4в) в NSO милеомни клетки се извършва чрез електропорация (виж /16/), след линеаризиране на Pvul. Подбират се трансфектоми в микофенолна киселина, съдържаща среда за селектиране на клетки, изразяващи gpt генен продукт, и подбрани за продукция на антитяло и за антиPLAP активност чрез изследването ELISA.
Позитивни клонове се субклонират чрез ограничаващо разреждане и чисти клонове се изследват отново за анти-PLAP активност, и най-добрите продуциращи клонове се отглеждат в свободна от серум среда за продуциране на антитяло.
(e) Свързваща способност на преоформените човешки антитела.
Практическото приложение на преоформени човешки антитела изисква достатъчно свързваща ефективност. Ако родителското антитяло има твърде висока ефективност, тогава може да бъде толерирано известно намаляване по време на преоформянето. Свързващата ефективност се диктува от много фактори, един от които е афинитета на антитялото за антиген, в този случай плацентарна алкална фосфатаза. Полезен начин за демонстриране свързващата способност на преоформеното антитяло е да се посочи, че то има подобна крива на разреждане на антитялото, когато се свързва към антиген, адсорбиран към повърхността на пластмасово кладенче. Такива криви се получават както следва при използване на родителско мишо анти-PLAP антитяло и преоформено човешко антитяло, получено чрез по-горната процедура.
Плочки с много кладенчета (Костар 6595, PETG) се покриват с плацентарна алкална фосфатаза (5 микрограма/мл) в буфериран с фосфат физиологичен разтвор pH 7, 37°С, 2 часа). Плочките се промиват в буфериран с фосфат физиологичен разтвор преди блокирането с желатин (0,02 процента в същия буфер) за един чдс, при стайна температура, тогава се промиват четири пъти с буфериран с фосфат физиологичен разтвор с добавен Туин 20 (0,15 процента) и тогава използван.
Свързването на антитяло се извършва в буфериран с фосфат физиологичен разтвор с Туин 20 при стайна температура за един час, последвано от четири промивания в буфер.
Визуализиране на свързано антитяло става с конюгирани с хрянова преоксидаза анти-глобулини (анти-човешки IgG за преоформено антитяло и анти-миши IgG за родителска молекула). Конюгатът (Сигма) в буфер (1:1000) се инкубира един час при стайна температура, последвано от четири промивания, както по-горе. Развиването на оцветяване (45 минути) става с тетраметил бензиден (0,01 процент) и кислороден преоксид (1: 200 или 100 обема) в цитратен буфер с pH 6,5. Реакцията се спира с 2М солна киселина.
Контролите показват незначително оцветяване, дължащо се на неспецифично свързване на конюгат или на свързване на антитяло към кладенче на, несъдържащи плацентарна алкална форсфатаза. Резултатите, посочени на фигури 12, са изразени като процент от максималното оцветяване (свързване). Двете криви са сходни, което показва значително и полезно равнище на свързваща ефективност за преоформеното антитяло от изобретението.
(f) Депозирани плазмиди
Щамове E.coli съдържащи палзмиди използвани в горната процедура са депозирани, съгласно указанията на Договора от Будапеща, в Националната колекция на 19 април 1990 под следните номера:
NCTC 12389: К12, TGI E.coli съдържащ плазмида pSvgptHu2DHPLAP-HuIgGl
NCTC 12390: KI2, TGI E. coli, съдържащ плазмида
PSvneoHuvkPLAP-HuCk.

Claims (29)

  1. Патентни претенции
    1. Синтетично специфично свързващо вещество със специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, съдържащо една или повече от амино киселинните последователности:
    (I) Ser Tyr Gly Vai Ser (II) Vai He Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu lie Ser (III) Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Vai Gly Ala Met Glu Tyr (IV) Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr Vai Ala (V) Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu (VI) Gin His His Tyr Vai Ser Pro Trp Thr
  2. 2. Преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, със специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, съдържащо една или повече от амино киселинните последователности:
    (I) Ser Tyr Gly Vai Ser (II) Vai He Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu He Ser (III) Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Vai Glu Ala Met Glu Tyr (IV) Arg Ala Ser Glu Asn He Tyr Ser Tyr Vai Ala (V) Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu (VI) Gin His His Tyr Vai Ser Pro Trp Thr
  3. 3. Едно преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент съгласно претенция 2, което има най-малкото една тежковерижна вариабилна зона включваща следните CDR
    CDR1: Ser Tyr Gly Vai Ser
    CDR2: Vai lie Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu lie Ser
    CDR3: Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Vai Gly Ala Met Glu Tyr.
  4. 4. Преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, съгл. претенция 2, който има най-малкото една лековерижна вариабилна зона, включваща следните CDR:
    CDR1: Arg Ala Ser Glu Asn lie Tyr Ser Tyr Vai Ala
    CDR2: Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu CDR: Gin His His Tyr Vai Ser Pro Trp Thr.
  5. 5. Преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент съгл.претенция 2, който има най-малкото една тежковерижна вариабилна зона съгл. претенция 3 и най-малкото една лековерижна вариабилна зона съгл. претенция 5.
  6. 6. Преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент съгл. претенция 2, включващо най-малкото една тежковерижна вариабилна зона, която обхваща цялата амино киселинна последователност, посочена на фигура 10 от придружаващите фигури.
  7. 7. Преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент съгл. претенция 2, включващо най-малкото една лековерижна вариабилна зона, която обхваща цялата амино киселинна последователност, посочена на фигура 11 от придружаващите фигури.
  8. 8. Синтетично специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, със специфичност еквивалентна на тази на гама-1, капа анти-PLAP моноклонално антитяло, секретирано от миша хибридомна клетъчна линия Н17Е2.
  9. 9. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия, продуцираща синтетично специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло, преоформен човешки антитяло фрагмент съгласно всяка една от претенциите от 1 до 8, резултат от включването в клетъчната линия на чужд ген, кодиращ синтетичното специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антителен фрагмент.
  10. 10. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия съгласно претенция 9, която носи чужд ген, включващ една или повече от нуклеотидните последователности:
    (I) AGT TAT GGT GTA AGC (ID GTA АТА TGG GAA GAC GGG AGC АСА ААТ TAT CAT ТСА GCT СТС АТА ТСС (III) ССС CAC ТАС GGT AGC AGC ТАС GTG GGG GCT ATH GAA ТАС (IV) CGA GCA AGT GAA АТТ АТТ ТАС AGT TAT GTA GCA (V) ААТ GCA ААА ТСС ТТА GCA GAC (VI) CAA CAT CAT TAT GTT AGT CCG TGG ACG
  11. 11. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия съгласно претенция 9, която носи чужд ген включващ цялата нуклеотидна последователност, посочена на фигура 10 от придружаващите фигури.
  12. 12. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия съгласно претенция 9, която носи чужд ген, включващ цялата нуклеотидна последователност посочена на фигура 11 от придружаващите фигури.
  13. 13. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия съгласно претенция 9, която носи чужд ген кодиращ:
    (а) най-малкото една от амино киселите последователности:
    (I) Ser Tyr Gly Vai Ser (II) Vai He trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu He Ser (iii) Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Vai Gly Ala Met Glu Tyr (IV) Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu (V) Gin His His Tyr Vai Ser Pro Trp Thr и (в) една протеинова структура, която позволява кодираната амино киселинна последователност, когато бъде експресирана да функционира като GDR и да има специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза.
  14. 14. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия съгл. претенция 9, която носи чужд ген, кодиращ цялата амино киселинна последователност, посочена на фигура 1 от придружаващите фигури.
  15. 15. Стабилна гостоприемникова клетъчна линия съгл. претенция 9, която носи чужд ген, кодиращ цялата амино киселинна последователност, посочена на фигура 11 от придружаващите фигури.
  16. 16. Плазмид pSVgptHu2VHPLAPHuIgGl.
  17. 17. Плазмид pSVneoHu VkPLAP-HuCk
  18. 18. Приложение на плазмид съгласно претенция 16 или претенция 17 за получаване на синтетично специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент.
  19. 19. E.coli NCTC 12389.
  20. 20. Е. coli NCtC 12390.
  21. 21. ДНК последователност, кодираща преоформено човешко антитяло тежковерижна вариабилна зона, притежаваща специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, включена щам E.coli NCTC 12389.
  22. 22. ДНК последователност, кодираща преоформено човешко антитяло лековерижна вариабилна зона, със специфичност за човешка плацентарна алкална фосфатаза, включена
    В щам E.coli NCTC 12390.
  23. 23. Преоформено човешко антитяло тежковерижна вариабилна зона, която има специфичност за човешка алкална плацентарна фосфатаза, получена с участието на експресионен вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12389.
  24. 24. Преоформено човешко антитяло лековерижна вариабилна зона, със специфичност за човешка алкална фосфатаза, получена с участието на експресионния вектор, съдържащ се в E.coli NCTC 12390.
  25. 25. Преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, съдържащ най-малкото една вариабилна зона съгласно претенция 23 или претенция 24.
  26. 26. Синтетично специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, съгласно всяка една от претенциите от 1 до 8 или претенция 24, свързано към или включено във вещество, пригодно да забавя или да прекратява растежа на ракови клетки или свързано към вещество пригодно да бъде откривано докато е още в човешкото тяло.
  27. 27. Инжекционен състав, включващ синтетично специфично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, съгласно претенция 26 заедно с фармацевтично приемлив носител.
  28. 28. Приложение на синтетично специфично свързващо вещество, преоформен човешки антитяло фрагмент, съгласно всяка от претенциите от 1 до 8 или претенция 25, за получаване на средство за терапевтично при ложение при рак по хората, или за производство на диагностичен състав за ин виво диагностика на хора.
  29. 29. Приложение на синтетично свързващо вещество, преоформено човешко антитяло или преоформен човешки антитяло фрагмент, съгласно претенция 26, при метод за терапия на рак по хората или за изобразяване.
BG96346A 1989-11-17 1992-05-15 Специфични свързващи вещества BG60687B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898926045A GB8926045D0 (en) 1989-11-17 1989-11-17 Specific binding agents
GB909019552A GB9019552D0 (en) 1990-09-07 1990-09-07 Specific binding agents
PCT/GB1990/001755 WO1991007500A1 (en) 1989-11-17 1990-11-14 Specific binding agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG96346A BG96346A (bg) 1993-12-24
BG60687B1 true BG60687B1 (bg) 1995-12-29

Family

ID=26296218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG96346A BG60687B1 (bg) 1989-11-17 1992-05-15 Специфични свързващи вещества

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0429242B1 (bg)
JP (1) JPH05501357A (bg)
KR (2) KR970007782B1 (bg)
AT (1) ATE123815T1 (bg)
AU (1) AU652923B2 (bg)
BG (1) BG60687B1 (bg)
CA (1) CA2066670A1 (bg)
DE (1) DE69020112T2 (bg)
DK (1) DK0429242T3 (bg)
ES (1) ES2075169T3 (bg)
FI (1) FI922220A7 (bg)
GR (1) GR3017407T3 (bg)
HU (1) HUT64600A (bg)
NO (2) NO303066B1 (bg)
RO (1) RO110262B1 (bg)
WO (1) WO1991007500A1 (bg)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9019553D0 (en) * 1990-09-07 1990-10-24 Unilever Plc Specific binding agents
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
JP5297742B2 (ja) * 2008-09-26 2013-09-25 株式会社青木科学研究所 金型用粉体含有油性潤滑剤、これを用いた静電塗布方法、及び静電塗布装置
EP3383920B1 (en) * 2015-11-30 2024-01-10 The Regents of the University of California Tumor-specific payload delivery and immune activation using a human antibody targeting a highly specific tumor cell surface antigen
WO2019240934A1 (en) * 2018-06-12 2019-12-19 Promab Biotechnologies, Inc. Plap-car-effector cells
WO2022161314A1 (zh) 2021-01-27 2022-08-04 信达生物制药(苏州)有限公司 针对cd16a的单域抗体及其用途
AU2022366987A1 (en) 2021-10-14 2024-05-16 Arsenal Biosciences, Inc. Immune cells having co-expressed shrnas and logic gate systems
CN114014933B (zh) * 2021-11-17 2023-05-02 福州迈新生物技术开发有限公司 抗plap蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
CN121773140A (zh) * 2023-08-25 2026-03-31 泰诚思生物医药私人有限公司 抗alpp/alppl2抗体、抗体-药物偶联物及其用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product

Also Published As

Publication number Publication date
ATE123815T1 (de) 1995-06-15
KR970007783B1 (ko) 1997-05-16
NO980656L (no) 1992-05-15
EP0429242B1 (en) 1995-06-14
DK0429242T3 (da) 1995-10-16
GR3017407T3 (en) 1995-12-31
FI922220L (fi) 1992-05-15
HU9201619D0 (en) 1992-08-28
CA2066670A1 (en) 1991-05-18
AU6736990A (en) 1991-06-13
WO1991007500A1 (en) 1991-05-30
JPH05501357A (ja) 1993-03-18
KR970007782B1 (ko) 1997-05-16
NO921941D0 (no) 1992-05-15
EP0429242A3 (en) 1991-06-05
DE69020112D1 (de) 1995-07-20
BG96346A (bg) 1993-12-24
RO110262B1 (ro) 1995-11-30
NO303066B1 (no) 1998-05-25
EP0429242A2 (en) 1991-05-29
FI922220A0 (fi) 1992-05-15
FI922220A7 (fi) 1992-05-15
DE69020112T2 (de) 1995-11-02
HUT64600A (en) 1994-01-28
ES2075169T3 (es) 1995-10-01
AU652923B2 (en) 1994-09-15
NO980656D0 (no) 1998-02-16
KR920703837A (ko) 1992-12-18
NO921941L (no) 1992-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU653167B2 (en) Specific binding agents
RU2112037C1 (ru) Гибридное моноклональное антитело, взаимодействующее с cd4-антигеном т-хелперных клеток человека, и способ его получения
CA2035899C (en) Chimeric anti-cea antibody
Yazaki et al. Mammalian expression and hollow fiber bioreactor production of recombinant anti-CEA diabody and minibody for clinical applications
US4978745A (en) Immunoreactive heterochain antibodies
EP0338745A1 (en) Method for producing recombinant DNA proteins
Verhoeyen et al. Construction of a reshaped HMFG1 antibody and comparison of its fine specificity with that of the parent mouse antibody
BG60687B1 (bg) Специфични свързващи вещества
US5645817A (en) Granulocyte-binding antibody constructs, their preparation and use
US20090220520A1 (en) Recombinant method for the production of a monoclonal antibody to CD52 for the treatment of chronic lymphocytic leukemia
RU2102479C1 (ru) Химерное моноклональное антитело, взаимодействующее с человеческой плацентарной щелочной фосфатазой, вариабельная область тяжелой гамма-цепи химерного моноклонального антитела, вариабельная область легкой k-цепи химерного моноклонального антитела, фрагмент кднк, кодирующий вариабельную область тяжелой гамма-цепи химерного моноклонального антитела и фрагмент кднк, кодирующий вариабельную область легкой k-цепи химерного моноклонального антитела
EP0370581A1 (en) Anti-hCG antibodies