BG65715B1 - Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки - Google Patents

Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки Download PDF

Info

Publication number
BG65715B1
BG65715B1 BG108155A BG10815503A BG65715B1 BG 65715 B1 BG65715 B1 BG 65715B1 BG 108155 A BG108155 A BG 108155A BG 10815503 A BG10815503 A BG 10815503A BG 65715 B1 BG65715 B1 BG 65715B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
dna
monoclonal antibody
cells
specific
synthetic peptide
Prior art date
Application number
BG108155A
Other languages
English (en)
Other versions
BG108155A (bg
Inventor
Чавдар ВАСИЛЕВ
Андрей ЧОРБАНОВ
Вихра ЙОМТОВА
Original Assignee
Чавдар ВАСИЛЕВ
Андрей ЧОРБАНОВ
Вихра ЙОМТОВА
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Чавдар ВАСИЛЕВ, Андрей ЧОРБАНОВ, Вихра ЙОМТОВА filed Critical Чавдар ВАСИЛЕВ
Priority to BG108155A priority Critical patent/BG65715B1/bg
Priority to PCT/BG2004/000010 priority patent/WO2005023871A1/en
Publication of BG108155A publication Critical patent/BG108155A/bg
Publication of BG65715B1 publication Critical patent/BG65715B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до средство за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки, по-специално при системен лупус еритематозус, което представлява биспецифично химерно моноклонално антитяло. Изобретението се отнася и до метод за получаване на химерното моноклонално антитяло и до приложението му за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки.

Description

Област на техниката
Изобретението се отнася до средство за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки, по-специално при системен лупус еритематозус.
Предшестващо състояние на техниката
Известно е, че поради съчетание на недостатъчно изяснени генетични фактори и на въздействия от окръжаващата среда, при около 2 % от хората се развиват различни автоимунни заболявания. При тези пациенти имунната система започва да атакува собствените си органи и тъкани със специфични автоантитела или с автореактивни Т-лимфоцити. В резултат на тази автоимунна атака, се отключва възпалителен процес, който в повечето случаи води до унищожаване или до сериозно увреждане на прицелния орган или тъкан. В зависимост от броя на атакуваните органи, автоимунните заболявания се разделят на системни и органо-специфични.
Системният лупус еритематозус е типично системно автоимунно заболяване. При него в серума се появяват автоантитела със специфичност към двойноверижна (нативна) ДНК, към хроматин, рибозоми и към други нуклеопротеинови комплекси /1,2/. С напредването на болестта се засягат бъбреците (гломерулонефрит), централната нервна система (психози), ставите (артрити), кожата и други органи и тъкани. Съвременните противовъзпалителни и имуносупресивни средства забавят развитието, но не повлияват първопричината на заболяването. Освен това те имат и вредни странични въздействия.
Логична мишена за терапевтична интервенция при пациенти с лупус еритематозус са патологичните ДНК-специфични В клетки. Пречупването на толерантността към ДНК и появата на В клетки с подобни рецептори се разглежда от повечето изследователи като основна причина за отключване на болестта.
Поради важната роля, която играят В клетките, секретиращи автоантитела към нативна ДНК в индуцирането на системния лупус еритематозус, тяхното селективно отстраняване или потискане е важна цел в опитите за контрол над заболяването.
Известни са също генетично предразположени към лупус еритематозус животни (US 6232522), при които се проследяват характерните имунни отговори и критични прояви, наподобяващи заболяването при хора. Известно е също, че при мишки линия (NZB х NZW) F1, които спонтанно развиват подобно на лупус заболяване, свързаните с него автоантитела се секретарят от В-1 клетките. Продължителното и избирателно отстраняване на тези клетки от найранна възраст предотвратява развитието на гломерулонефрита и значително увеличава продължителността на живота при тези животни /3/. Този подход не е ефективен при пациенти с лупус и при мишки от линията MRL/lpr, също развиващи спонтанно лупусоподобно заболяване, тъй като анти-ДНК специфичните В клетки при тях са от типа В-2.
Изследванията на Coutts, S. М. et al., 1996 и Furie, R., et al., 2001 са показали, че за избирателното инактавиране на патологични В клетки може да се предизвика едносигнална енергия по антиген-специфичен начин. За тази цел повърхностният имуноглобулинов рецептор на В клетките се ангажира със структура, която съдържа олиговалентни В клетъчни епитопи, имобилизирани върху неимуногенен носител. Такава структура не трябва да съдържа Т клетъчни епитопи. Пример за такъв В клетъчен толероген е LJP394, който in vivo инактивира В клетките, специфични за нативната ДНК при BXSB мишки, развиващи спонтанна, наподобяваща лупус болест. Прилагането на този имуномодулатор удължава преживяемостта им и води до потискане на бъбречното увреждане. LJP394 вече е показал обещаващи резултати и при втората фаза от клиничните изпитания /4,5/.
Известен е подход, при който прилагането на MRL/lpr мишки с лупус на фосфорилиран пептид от автоантигена рибонуклеопротеин предизвиква понижение нивото на антителата срещу ДНК от клас IgG и на съдържанието на белтък в урината /6/. Известен е също подход, свързан във въвеждането на моноклонално антитяло-агонист, специфично към ко-рецептора CD 13 7 потиска активността на лупуса при същия тип мишки /7/.
65715 Bl
Публикации на WO 9941285А1, WO 00011732 и ЕР 1210375А1, ЕР 1292621 Al описват средства и методи за диагностика и повлияване на лупус посредством свързване на Fc рецептора на имуноглобулинови молекули, като рецепторите са избрани от групата, включваща Рсалфа рецептор (РсалфаЯ) или FcraMa рецептор (FcraMaR).
В WO 2001/009186 (PCT/US2000/020158) е описано терапевтично средство, което се състои от най-малко една част, която се свързва към Fc рецептор, напр. FcraMa рецептор или Рсалфа рецептор и най-малко една друга част, която се свързва към друга мишена, като антиген или туморна клетка или патоген. Поради това, тези молекули могат да бъдат използвани за индуциране или повишаване на имунен отговор, както in vivo, така и in vitro, срещу обичайно неимуногенен протеин.
В нито един от цитираните патентни документи, обаче, не се споменава за свързване на FcraMaRIlB рецептора.
Постижение в това отношение има Haemerling U. (1975), който разполага с моноклоналното антитяло Lyl7.2, свързващо се специфично с човешкия потискащ рецептор FcraмаВПв, но не и с активиращия рецептор FcraMaRIIa /8/.
Известно е, че когато имунен комплекс, съставен от антиген и IgG се свърже едновременно с FcraMaR за Fc-фрагмента на IgG от тип Пв (FcraMaRIlB) и с мембранния имуноглобулинов рецептор на В клетката, нейната активност се потиска /9/. Това е единственият рецептор от групата на FcraMaRII, който В клетките експресират на повърхността си (фиг. 1). Установено е също, че FcraMaRIlB, трансфектиран в В лимфоцити, неекспресиращи Fc рецептори, ефективно потиска активността на клетките по горепосочения механизъм /10/. Мишки с дефект на FcraMaRIlB реагират с повишена продукция на антитела към Т-зависими или Т-независими антигени /11/.
Известен е пептид с аминокиселинна последователност DWEYSVWLSN, който наподобява в антигенно отношение нативната ДНК. Доказано е, че той се разпознава от патологичните миши IgG антитела срещу нативната ДНК, освен това при имунизиране на мишки с пептида се индуцира синтезата на антитела със съща та специфичност и се наблюдават типичните за лупуса бъбречни увреждания /12/.
Известно е също, че плъша хибридома 2.4G2, регистрирана в АТСС под номер НВ-197, секретира моноклонално антитяло, специфично към двете изоформи на мишия рецептор CD32 (или FcraMaRII)-FcraMaRIIa и FcraMaRIlB.
Техническа същност на изобретението
По своята същност изобретението представлява химерно моноклонално антитяло за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки. Както е изяснено по-горе, някои от болестните автоимунни процеси, в това число системният лупус еритематозус, се характеризират с продуцирането на автоантитела, специфични към нативната ДНК. За селективното потискане на патологични ДНК-специфични клетки, съгласно изобретението, е създадено средство, представляващо химерна молекула от моноклонално антитяло, което да се свързва специфично, както с инхибиращия В-клетъчен рецептор, така и с имуноглобулиновите рецептори на В клетки с антинативна ДНК специфичност. За получаването на това средство, съгласно изобретението, се използва предварително модифициран синтетичен пептид от 10 аминокиселини, по-специално пептидът DWEYSVWLSN, който в антигенно отношение наподобява нативна ДНК и към чийто С-край е добавен линкер, представляващ хексаметиленова група (Фигура 2).
Същевременно, плъша хибридома 2.4G2 (АТСС НВ-197), секретираща моноклонално антитяло срещу мишия рецептор CD32 (FcraMaRII), се култивира в безбелтъчна среда СНО (Gibco, Gaithersburg, MD) при температура 37°С в атмосфера с относителна влажност 90% и съдържание на 5% въглероден двуокис. След завършване на култивирането, секретираното в средата моноклонално антитяло се пречиства чрез преципитация с амониев сулфат. Полученото моноклонално антитяло не съдържа имуноглобулини с друга специфичност и неимуноглобулинови онечиствания и е със степен на чистота 90-95 %.
След етапа на пречистване, се осъществява свързване на полученото по описания начин моноклонално антитяло с модифицирания синтетичен пептид DWEYSVWLSN, посредством 1етил-3(3'-диметиламинопропил)карбоимидин.НС1
65715 Bl (EDC). За целта, предварително се изготвя разтвор на 0,4 mg пептид в диметилформамид/ фосфатен буфер в съотношение 1:9 и на EDC във фосфатен буфер pH 6,0-0.3 mg/ml. Към разтвора на антитялото се добавя разтвор на пептида и EDC и обемът се довежда до 150 ml с фосфатен буфер pH 6,0. Реакционната смес се инкубира в продължение на 16 h при +4°С с постоянно разбъркване. След това тя се диализира при +4°С за 16 h срещу 200 обема фосфат-буфериран физиологичен разтвор с pH 7.0. Полученият разтвор се концентрира до краен обем 20 ml, използвайки ултрафилтрация през филтри с големина на порите 5 kDa (от Amicon, Millipore Corp.). Той съдържа химерна антитялова молекула, съставена, от една страна, от моноклонално антитяло срещу мишия рецептор CD32, (изоформи FcraMaRIIa и РсгамаКПв), а от друга - от модифицирания пептид DWEYSVWLSN, Химерната молекула притежава способността да се свързва специфично, както с инхибиращия В-клетъчен рецептор FcraMaRIIb, така и с имуноглобулиновите рецептори на В-клетките с антинативна ДНК специфичност. Тази биспецифичност на химерата се проявява, както когато тя включва цялата молекула моноклонално антитяло, така и нейни F(ab’)2 или Fab фрагменти. Тя се проявява също, ако част от молекулата на моноклоналното антитяло от животински произход е заместена с участъци от човешка имуноглобулинова молекула.
Белтъчното съдържание на разтвора се определя спектрофотометрично при 280 nm. Чистотата на получената химера се анализира с използването на SDS-PAGE при нередуциращи условия.
Фиг. 3 илюстрира факта на свързването на пептида DWEYSVWLSN към молекулата на моноклоналното антитяло, доказан с метода обратно-фазова HPLC.
С помощта на метода проточна цитометрия (Фигура 4) се доказва, че няма промяна в способността за свързване към мишия рецептор CD32 след конюгирането на моноклоналното антитяло, получавано от хибридома2.4О2 (АТСС НВ-197) с пептида.
Възможността на полученото съгласно изобретението химерно моноклонално антитяло да се свързва специфично с рецептора CD32 (FcraMaRIIb) и да потиска селективно патологични ДНК-специфични В клетки, е изследвана, как то в in vitro, така и in vivo експерименти.
За целта, имуномодулиращият ефект на конструираната хибридома се определя най-напред в условия in vitro върху слезкови клетки, получени от болни от лупус мишки MRL/lpr, които синтезират и секретират в средата антитела от клас IgG, специфични към ДНК. Култивирането се провежда или в присъствието на бактериален липополизахарид, или в присъствието на химерното моноклонално антитяло, съгласно изобретението, както и на същата концентрация от контролна химера, съставена от моноклоналното антитяло 2.4G2, конюгирано с пептид, съдържащ същите аминокиселини, както и пептида DWEYSVWLSN, но с разместена последователност. Резултатите показват, че химерата съгласно изобретението, потиска секрецията на IgG антитела специфични срещу нативна ДНК (Фигура 5).
Нивото на антителата от клас IgG срещу двойноверижна ДНК се явява показател за активността на болестния процес.
Количеството на отделения с урината белтък (мярка за бъбречното увреждане при лупус) се определя със стандартни сухи тестове (Bayer, UK). Здравото животно не отделя белтък в урината си и присъствието на последния свидетелства за наличието на болестен процес на бъбреците.
Проведените изследвания in vivo имат за цел да докажат, че химерната молекула, съгласно изобретението, се свързва специфично с рецептора FcraMaRIIb, и деактивира патологичните ДНК-специфични В клетки, като по този начин отслабва активността на болестния автоимунен процес. Резултатите показват, че прилагането на химера съгласно изобретението на животни със системен лупус, води до отслабване проявите на болестта, потиска развитието на бъбречното усложнение и удължаване на живота им.
Пояснение на приложените фигури
Фигура 1 показва едновременното ангажиране на имуноглобулиновия антигенен рецептор и на инхибиращия FcraMaRIIb върху Вклетката, което води до нейното деактивиране.
Фигура 2. Схематичен вид на конструираната химерна молекула. С малки кръгчета е представен линкерът, а с квадратчета - декапептидът.
65715 Bl
Фигура 3. Обратно-фазов HPLC анализ на неконюгираното антитяло 2.4G2 и на химерната молекула, съгласно изобретението.
Фигура 4. Анализ чрез проточна цитометрия на способността на химерната молекула да се свързва с В клетъчния рецептор FcraMaRIIb:
А - негативна контрола - само клетки
В - търговски препарат на 2.4G2 + антиплъше-биотинилирано антитяло + стрептавидинFITC
С - химера съгласно изобретението + антиплъше-биотинилирано антитяло + стрептавидин-FITC
D - търговски препарат на 2.4G2 антитяло (0.5 microg/епруветка) + търговски препарат на 2.4G2-FITC (10 microg/епруветка)
Е - химера съгласно изобретението (2.0 microg/епруветка) + търговско 2.4G2 антитялоFITC (10 microg/епруветка)
Фигура 5 показва in vitro инхибиране продукцията на анти-ДНК антитела:
С ромбове е означено нивото на антителата при култивиране на клетките в присъствието на 100 ng/ml химерна молекула, съгласно изобретението.
С квадрати - в присъствието на 100 ng/ml контролна химерна молекула.
С триъгълници - в присъствието на добавен буфериран физиологичен разтвор.
С кръгчета - в присъствието на 10 microg/ ml бактериален липополизахарид.
Стандартните отклонения от средната стойност бяха под 5%.
Фигура 6. Нива на антинативни ДНК IgG антитела при млади 7-седмични MRL/lpr мишки, третирани два пъти седмично в продължение на 6 седмици с по 20 microg химерни молекули:
Квадрати - инжектирани с буфериран физиологичен разтвор.
Триъгълници - с контролна химерна молекула.
Кръгове - с химерна молекула, съгласно изобретението.
Фигура 7. Ниво на протеинурията при млади 7-седмични MRL/lpr мишки, третирани два пъти седмично в продължение на 6 седмици с по 20 microg химерни молекули:
Квадрати - инжектирани с буфериран физиологичен разтвор.
Триъгълници - с контролна химерна молекула.
Кръгове - с химерната молекула, обект на изобретението.
Фигура 8. Нива на антинативна ДНК IgG антитела при зрели 17-седмични MRL/lpr мишки третирани два пъти седмично в продължение на 6 седмици с по 20 microg на доза химерни молекули:
Квадрати - с буфериран физиологичен разтвор.
Триъгълници - с контролна химерна молекула.
Кръгове - с химерната молекула, съгласно изобретението.
Фигура 9. Ниво на протеинурията при зрели 17-седмични MRL/lpr мишки, третирани два пъти седмично в продължение на 6 седмици с по 20 microg химерни молекули:
Квадрати - инжектирани с буфериран физиологичен разтвор.
Триъгълници - с контролна химерна молекула.
Кръгове - с химерната молекула, обект на изобретението.
Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения.
Пример 1. Получаване на химерно моноклонално антитяло
108 клетки от плъшата хибридома 2.4G2 (АТСС НВ-197), секретиращамоноклонално антитяло срещу мишия рецептор CD32, по-специално FcraMaRIIb, се култивира в безбелтъчна среда СНО (Gibco, Gaithersburg, MD) и при температура от 37°С, в атмосфера с относителна влажност 90%, съдържаща 5% въглероден двуокис.
След завършване на култивирането, секретираното в средата моноклонално антитяло се пречиства чрез преципитация с амониев сулфат. За целта се смесват равни обеми надутайка и наситен разтвор на амониев сулфат и сместа се оставя за 16 h при +4°С с постоянно разбъркване. След центрофугиране за 30 min при 5 000 х g, надутаечната течност се отстранява и утайката се ресуспендира в 10 пъти по-малък от първоначалния обем фосфат-буфериран физиологичен разтвор pH 7.0 и диализира двукратно срещу 500 обема от същия буфер.
След етапа на пречистване се осъществява свързването на полученото моноклонално ан5
65715 Bl титяло със синтетичния пептид, модифициран по описания по-горе начин, с помощта на 1-етил3(3'-диметиламинопропил) карбоимидин.НС1 (EDC). Предварително се приготвят следните разтвори: 1,5 mg/ml моноклонално антитяло във фосфатен буфер pH 6.0; 0,4 mg/ml пептид в диметилформамид/фосфатен буфер и 0,3 mg/ml EDC във фосфатен буфер pH 6,0. Към 10 ml от разтвора на антитялото се добавят 7,5 ml разтвор на пептида и 3,75 ml EDC и обемът се довежда до 150 ml с фосфатен буфер pH 6,0. Реакционната смес се инкубира за 16 h при +4°С с постоянно разбъркване. След това тя се диализира при +4°С за 16 h срещу 200 обема фосфат-буфериран физиологичен разтвор с pH 7.0. Разтворът на получената химерна молекула се концентрира до краен обем 20 ml, използвайки ултрафилтрация през филтри с големина на порите 5 kDa (Amicon, Millipore Corp.).
Белтъчното съдържание на разтвора се определя спектрофотометрично при 280 nm. Чистотата на получената химера се анализира с използването на SDS-PAGE при нередуциращи условия.
Фигура 3 илюстрира фактът на свързването на пептида DWEYSVWLSN към молекулата на моноклоналното антитяло срещу рецептора CD32, доказан с метода обратно-фазова HPLC.
В резултат се получава химерно моноклонално антитяло, което притежава способността да се свързва със специфичния си антиген-миши рецептор CD32. Последното се доказва с помощта на метода проточна цитометрия (Фигура 4), след прилагането на който се доказва, че няма промяна в способността на свързване към мишия рецептор CD32 както на изходното моноклонално антитяло, така и на химерното, получено след химично конюгиране с пептида.
Пример 2. Определяне имуномодулиращия ефект на конструираната хибридома в условия in vitro
Слезкови клетки, получени от болни от лупус мишки MRL/lpr, култивирани in vitro, синтезират и секретират в средата антитела от клас IgG, специфични към ДНК. Култивирането се провежда в присъствие на 5 microg/ml бактериален липополизахарид от Е. coli, или в присъствието на 100 ng/ml от химерата съгласно изобретението, или в присъствието на същата концентрация от контролна химера, съставена от моноклоналното антитяло 2.4G2, конюгирано с пептида WSLDYWNESV, който съдържа същите аминокиселини, както и пептидът DWEYSVWLSN, но с разместена тяхна последователност. Резултатите показват, че химерата съгласно изобретението, потиска секрецията на IgG антитела срещу нативна ДНК (Фигура 5).
Пример 3. Методи за измерване нивото на антителата от клас IgG срещу нативна ДНК и на концентрацията на белтъка в урината
Нивото на антителата от клас IgG срещу нативна ДНК се определя с имуноензимен метод (ELISA) по описана в литературата методика/13/. Появата на тези автоантитела съпътства появата на заболяването и нивата им корелират с активността на болестния процес.
Двойноверижна ДНК от телешки тимус (Sigma) се обработва с нуклеаза S1 за отстраняване на неизбежно присъстващите в подобни препарати участъци от едноверижна ДНК и се биотинилира с използването на кит за биотинилиране на нуклеинови киселини (Vector Laboratories, UK). Разреждания от изследваните течности (супернатанта от клетъчни култури или серуми), започвайки от 1:50 до 1:2700 се смесват със стандартно количество разтвор на биотинилирана ДНК и след инкубация сместа се премества в ямките на плака, натоварена предварително с авидин. След ново инкубиране и промиване, присъствието на адсорбирани върху плаката миши IgG се определя с добавяне на конюгат на анти-мише IgG антитяло с алкална фосфатаза.
Количеството на отделения с урината белтък, който е мярка за бъбречното увреждане при лупус се определя със сух тест за анализ на урина (Bayer, UK).
Пример 4. Изследване имуномодулиращата активност на химерното моноклонално in vivo при млади животни
Способността на полученото съгласно изобретението химерно моноклонално антитяло да се свързва специфично с прицелните рецептори (FcraMaRIIb и имуноглобулинов В-лимфоцитен рецептор с ДНК-специфичност), е анализирана в опити in vivo.
За целта се сформира група от 15 женски
7-седмични MRL/lpr мишки, които на тази възраст са все още здрави, но появата на първите белези на автоимунното заболяване лупуса е
65715 Bl предстоящо. Група от пет мишки се третира два пъти седмично по венозен път с 0,1 ml фосфатбуфериран физиологичен разтвор в продължение на 6 седмици. На втора група от 5 животни се прилага по 20 microg от химерата, съгласно изобретението, а на друга група от 5 животни по 20 microg от контролната химера съгласно Пример 2. Веднъж на две седмици от животните се взима кръв, серумите се замразяват и съхраняват при -20°С, след което се определя нивото на анти-ДНК антителата от клас IgG.
Резултатите показват, че венозното въвеждане по описаната схема на приложение на химерата, съгласно изобретението, води до забавяне повишаването нивото на анти-ДНК антителата и на появата на белтък в урината (Фиг. 6 и 7).
Пример 5. Изследване имуномодулиращата активност на химерното моноклонално in vivo при възрастни животни с напреднала форма на лупус
Група от 15 броя 17-седмични MRL/lpr мишки се разделя на три подгрупи от по 5 животни. На тази възраст те са вече в напреднала фаза на заболяването. Първата група от пет мишки се третира два пъти седмично по венозен път, както в Пример 4 с 0,1 ml фосфат-буфериран физиологичен разтвор, на втора група от 5 животни се прилагат по 20 microg от химерата, съгласно изобретението, а на трета група от 5 животни - по 20 microg от контролната химера съгласно Пример 2.
При животните, получили физиологичен разтвор по венозен път, кинетиката на нивото на анти-ДНК антителата показва възходящ ход, максималните нива се достигат към 19-та седмица, после следва малко понижение и само едно животно от групата доживява края на експеримента (23-та седмица).
Венозното въвеждане на химерата, съгласно изобретението, има за резултат поддържане на постоянно ниско ниво на болестните антиДНК-антитела в първите 4 седмици след започване на инфузиите, докато контролната химера показва междинни резултати (Фиг. 8).
Прилагането на химерата, съгласно изобретението, води до задържане нивото на протеинурията на едно и също ниво до края на опита, докато при третираната с физиологичен разтвор група тя достига до много високи стойности (15 g/Ι) преди да настъпи смъртта на животните от тази група.

Claims (9)

  1. Патентни претенции
    1. Средство за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки, по-специално при системен лупус еритематозус, характеризиращо се с това, че представлява химерно моноклонално антитяло, което се свързва специфично, както с инхибиращ В клетъчен рецептор, така и с мембранния имуноглобулинов рецептор на автореактивни В клетки.
  2. 2. Средство за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че химерното моноклонално антитяло е съставено от нативно антитяло и предварително модифициран синтетичен пептид, имитиращ в антигенно отношение двойноверижна ДНК.
  3. 3. Метод за получаване на средство за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че включва свързване на предварително модифициран синтетичен пептид, имитиращ в антигенно отношение двойноверижна ДНК, с моноклонално антитяло срещу инхибиращ В-клетъчен рецептор в присъствие на 1-етил-3(3'-диметиламинопропил) карбоимидин.НС1 и последващо инкубиране, диализиране и концентриране на разтвора.
  4. 4. Метод за получаване на средство съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че предварително модифицираният синтетичен пептид, имитиращ в антигенно отношение двойноверижна ДНК, се състои от 10 аминокиселини.
  5. 5. Метод за получаване на средство съгласно претенции от 1 до 4, характеризиращ се с това, че предварително модифицираният синтетичен пептид има аминокиселинна последователност DWEYSVWLSN.
  6. 6. Метод за получаване на средство съгласно претенции от 1 до 5, характеризиращ се с това, че за предварителното модифициране на синтетичния пептид, се добавя хексаметиленова група в неговия С-край.
  7. 7. Метод за получаване на средство съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че моноклоналното антитяло срещу инхибиращ В-клетъчен рецептор е получено от плъша хибридома АТСС НВ-197.
    65715 Bl
  8. 8. Метод за получаване на средство съгласно претенции от 1 до 3 и 7, характеризиращ се с това, моноклоналното антитяло е в интактна форма, фрагментирано до F(ab’)2 или Fabфрагменти, или част от молекулата му е заместена с участъци от човешка имуноглобулинова молекула.
  9. 9. Приложение нахимерното моноклонално антитяло съгласно претенции от 1 до 8 за селективно потискане на патологични ДНК-специфични В клетки.
BG108155A 2003-09-04 2003-09-04 Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки BG65715B1 (bg)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG108155A BG65715B1 (bg) 2003-09-04 2003-09-04 Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки
PCT/BG2004/000010 WO2005023871A1 (en) 2003-09-04 2004-06-08 An agent for selective suppression disease-associated auto-reactive b-cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG108155A BG65715B1 (bg) 2003-09-04 2003-09-04 Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG108155A BG108155A (bg) 2005-06-30
BG65715B1 true BG65715B1 (bg) 2009-08-31

Family

ID=34230300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG108155A BG65715B1 (bg) 2003-09-04 2003-09-04 Средство за селективно подтискане на патологични днк - специфични в клетки

Country Status (2)

Country Link
BG (1) BG65715B1 (bg)
WO (1) WO2005023871A1 (bg)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BG65954B1 (bg) * 2005-01-05 2010-07-30 Чавдар ВАСИЛЕВ Средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни в-клетки

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999041285A1 (en) * 1998-02-17 1999-08-19 Medarex, Inc. Treating and diagnosing macrophage-mediated diseases using fc receptor ligands
WO2000011732A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Eveready Battery Company, Inc. Battery constructions having increased internal volume for active components
WO2001009186A2 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-fc receptor binding agents
US6232522B1 (en) * 1990-01-31 2001-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Non-human animal model for systemic lupus erythematosis
EP1210375A1 (fr) * 1999-07-29 2002-06-05 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Proteines recombinantes, et complexes moleculaires derives de ces proteines, analogues a des molecules impliquees dans les reponses immunitaires
EP1292621A1 (en) * 2000-06-05 2003-03-19 University of Tennessee Corporation Compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9516760D0 (en) * 1995-08-16 1995-10-18 Sandoz Ltd Organic compounds
US6001964A (en) * 1995-09-20 1999-12-14 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Peptides which bind to anti-double stranded DNA antibody
JP2001061471A (ja) * 1999-07-29 2001-03-13 Gsf Forschungszentrum Fuer Umwelt & Gesundheit Gmbh 細胞株２．４Ｇ２より誘導される、マウスκ鎖を好ましくは産生しない細胞株
ATE423571T1 (de) * 2001-10-12 2009-03-15 Schering Corp Verwendung von bispezifischen antikörpern gegen einen aktivierenden rezeptor fcepsilonri und gegen einen inhibierenden rezeptor ox2ra (cd200ra) zur regulierung der immunantworten

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6232522B1 (en) * 1990-01-31 2001-05-15 Oklahoma Medical Research Foundation Non-human animal model for systemic lupus erythematosis
WO1999041285A1 (en) * 1998-02-17 1999-08-19 Medarex, Inc. Treating and diagnosing macrophage-mediated diseases using fc receptor ligands
WO2000011732A1 (en) * 1998-08-21 2000-03-02 Eveready Battery Company, Inc. Battery constructions having increased internal volume for active components
EP1210375A1 (fr) * 1999-07-29 2002-06-05 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Proteines recombinantes, et complexes moleculaires derives de ces proteines, analogues a des molecules impliquees dans les reponses immunitaires
WO2001009186A2 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 Medarex, Inc. Therapeutic compounds comprised of anti-fc receptor binding agents
EP1292621A1 (en) * 2000-06-05 2003-03-19 University of Tennessee Corporation Compositions and methods for the endocytic presentation of immunosuppressive factors

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005023871A1 (en) 2005-03-17
BG108155A (bg) 2005-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0743856B1 (en) Antigen-based heteropolymers for treating autoimmune diseases
Erb et al. Role of macrophages in the generation of T helper cells. IV. Nature of genetically related factor derived from macrophages incubated with soluble antigens
CA2146647C (en) Treatment of autoimmune and inflammatory disorders
US5958409A (en) Method for treating multiple sclerosis
JPH09509053A (ja) Ｔ−細胞抗原、並びにｔ−細胞介在状態の診断及び処理へのそれらの使用
US5422258A (en) Methods for producing high affinity anti-human IgE-monoclonal antibodies which binds to IgE on IgEabearing B cells but not basophils
CA2090317A1 (en) Homoconjugated immunoglobulins
CZ456090A3 (cs) Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky
WO1996000084A1 (en) Use of autoantibodies for tumor therapy and prophylaxis
CN110179989B (zh) 治疗狼疮的方法和组合物
Bruijn et al. Pathogenesis of experimental lupus nephritis: a role foranti-basement membrane and anti-tubular brush border antibodiesin murine chronic graft-versus-host disease
EP0585224A1 (en) MONOCLONAL ANTIBODIES WHICH BIND TO SECRETED AND MEMBRANE-BOUND IgE, BUT NOT TO IgE ON BASOPHILS
Pelletier et al. Down modulation of Heymann's nephritis by mercuric chloride
US5620686A (en) Antigen-antibody conjugates
Marusić-Galesić et al. Cellular immune response to the antigen administered as an immune complex in vivo
BG65954B1 (bg) Средство за селективно подтискане активността на патологични автореактивни в-клетки
WO2005023871A1 (en) An agent for selective suppression disease-associated auto-reactive b-cells
RU2500427C2 (ru) Лекарственное средство для лечения функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта и способ лечения функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта
AU654679B2 (en) Antigen-antibody conjugates
WO1990001066A1 (en) Porcine polyclonal and monoclonal antibodies
McManus et al. Mouse c1q: light and electron microscopic immunohistochemical localization.
Gilhus et al. Thymic lymphoepitheliomas and skeletal muscle expressing common antigen (s)
HK1028554A (en) Method for treating multiple sclerosis
WO1992021240A1 (en) Suppressor t-cell hybridoma
Andrew PhD thesis [no title]