CZ456090A3 - Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky - Google Patents

Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky Download PDF

Info

Publication number
CZ456090A3
CZ456090A3 CS904560A CS456090A CZ456090A3 CZ 456090 A3 CZ456090 A3 CZ 456090A3 CS 904560 A CS904560 A CS 904560A CS 456090 A CS456090 A CS 456090A CZ 456090 A3 CZ456090 A3 CZ 456090A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
burgdorferi
antigen
vaccine
ospa
monoclonal antibodies
Prior art date
Application number
CS904560A
Other languages
English (en)
Inventor
Markus Dr. Simon
Ulrich E. Schaible
Klaus Dr. Eichmann
Michael Dr. Kramer
Wallich Dr. Reinhard
Original Assignee
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Desöffentlichen Rechts
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25885304&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ456090(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Desöffentlichen Rechts filed Critical MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Publication of CZ456090A3 publication Critical patent/CZ456090A3/cs
Publication of CZ284538B6 publication Critical patent/CZ284538B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Gram-negative bacteria
    • C07K16/1207—Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Vynález se týká očkovací látky proti boreliose, obsahující monoklonální protilátky, specifické proti antigenůn Borrelia burgdorferi, způsobu její výroby a příslušných monoklonálních protilátek.
Dosavadní stav techniky ·>
Boreiiosa,onemocnění Lyme nebo lymská horečka je v současné době nejčastějším infekčním onemocněním, které se přenáší klíšťaty. Toto onemocnění je vyvoláváno spirochetou Borrelía burgdorferi, onemocnění přenášejí na člověka především kiíšťaza kmene Ixodes. Jde o chronickou progresivní infekci, napadající řadu orgánů, jako jsou pokožka, centrální a periferní nervový systém, srdce, játra, ledviny a svalový a kostní systém. Vzhledem k tomu, že dostatečná léčby antibiotiky je obtížná, je v současné době prováděna řada výzkumů s cílem změnit a zvýšit odpověď imunitního systému na infekci uvedeným mikroorganismem. U lidí s uvedeným onemocněním byl zjištěn vysoký titr protilátek proti B. burgdorferi, tato skutečnost však nebyla ukazatelem ochrany proti infekci. Původce infekce pravděpodobně velmi rychle přechází z krevního oběhu do tkání, kde již není pro imunitní systém bezprostředně dosažitelný. To znamená, že ochrana pomocí protilátky je možná pouze bezprostředně po začátku infekce, kdy se mikroorganismus ještě nachází v krevním oběhu.
Skutečnost, že přirozená infekce B. burgdorferi byla nalezena u řady živočišných druhů vedla k pokusům vytvořit laboratorní modely pro toto onemocnění, až dosud s omezeným úspěchem. Při pokusech se specifickou odpovědí u myši bylo prokázáno, že infekce u inbredních myších kmenů, pěstovaných již delší dobu s izolátem B. burgdorferi vedla k mírným, avšak významným pathomorfologickým směnám různých orgánů, jako je mozek, srdce, plíce a ledviny, přičemž tyto změny byly srovnatelná se změnami ά lidí s tímtéž onemocněním, jak bylo uvedeno v publikaci Schaible a další, (1988),
Infect. Immun. 1, 41. Skutečnost, že se vytvořily pouze mírné změny, byla způsobena patrně poklesem schopnosti vyvolat protilátky a sníženou virulencí mikroorganismu, již dlouho pěstovaného in vitro nebo schopnostmi myší vyvinout dostatečnou imunologickou odpověc, jak bylo popsáno v publikacích Johnson a další, (1984), J. Clin. líicrobiol. 20, 747; Schwan a další (1958), Infect. and.Immun. 5c, 1837.
Vynález si klade za úkol připravit účinnou očkovací látku proti uvedenému onemocnění. X tomuto účelu je zapotřebí nejprve získat vhodný laboratorní model. Bylo nyní navrženo užít kmen myší bez funkčních T- a B-buněk, tzv. kmen Scid-myší. popsaný v publikaci Bosma a další, (1983) Nátuře 10, 52, protože tyto myši vyvinou po infekci B. burgdorferi ve formě izolátu vícesystémové onemocnění a převážně polyarthritis a karditis,
Na tomto modelu je poprvé možné zkoušet účinnost očkovacích látek proti uvedenému onemocnění.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří očkovací látka proti boreliose, onemocnění Lyme, tato očkovací látka obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen
31kD, OspA nebo 34 kD, OspB, Borrelia burgdorferi.
Očkovací látka podle vynálezu může obsahovat jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 31 kD (OspA) B. burgdorferi nebo jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro antigen 34 kD (OspB) B. burgdorferi.
Ze specifických protilátek je zepména možno použít protilátku, specifickou pro antigen%. kD B. burgdorferi z kmenů ZS7 (DSM 5527) nebo/a B31 (ATCC 35210), nebo protilátku, specifickou pro antigen 34 kD B. burgdorferi z kmenů ZS7 (DSM 5527) nebo/a B31 (ATCC 35210).
Výhodné jsou zejména očkovací látky, které obsahují protilátku proti vynálezu ze třídy IgG, zejména podtřídy IgG2b nebo IgGl.
Podstatu vynálezu tvoří také způsob výroby očkovací látky proti boreliose, který spočívá v tom, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy B. burgdorferi nebo jejich částmi vytvoří fúzí buněk hybrid, produkující monoklonální protilátku LA2 nebo monoklonální protilátky LA 25.1, LA 26.1 nebo LA 27.1. K imunizaci je možno použít kompletní organisn my B. burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
Součást podstaty vynálezu tvoří také příslušné monoklonální protilátky, a to LA-2 proti OspA, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 89091302 nebo LA-26.1 proti OspA, vylučovaná buněčnou linií hybridomu ECACC 90050406. Mimoto může jít ještě o protilátky proti OspB, a to LA-25.1, vylučovanou buněčnou linií hybridomu ECACC 90050405 a LA-27.1, vylučovanou buněčnou linií hybridomu ECACC 90050407 až 7
Použití protilátek podle vynálezu působí neočekávaně na rozdíl od použití jiných protilátek, například proti povrchovému antigenu 41 kD B. burgdorferi (Flagelin) u imunodeficientních pokusných zvířat, s výhodou Scid-myší, infikovaných životaschopnou pathogenní B. burgdorferi, zvláště kmene ZS7 zbrzdění zánětu kloubů, srdečního svalu a jater, a to úplně nebo ve značné míře.
Pathogenní organismy B. burgdorferi je možno získávat tak, že se z imunodeficientních pokusných zvířat, s výhodou myší, předem infikovaných tímto mikroorganismem mikroorganismy získají zpět, přičemž jejich pathogenita zůstává zachována.
Protilátka podle vynálezu může být zpracována na lékovou formu při použití běžných nosičů, plniv a pomocných látek.
Vynález bude dále osvětlen příklady provedení v souvislosti s přiloženými výkresy.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna DNA a řetězec aminokyselin antigenu 31 kD, OspA, B. burgdorferi.
Na obr. 2 je uvedena imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2.
Příklady provedení vynálezu /
Příklad 1
Indukce arthritis, karditis a hepatitis u Scid-myší infekcí kmenem 3. burgdorferi ZS7
Infekce myší Bv burgdorferi
Dospělé myši kmene C.3-17 Scid (homozygot pro Scid-mutaci) a C.B-17 se infikují podkožní injekcí 1 χ 105, 5 x 105, 1 x 10 6 nebo 1 χ 108 životaschopných nebo usmrcených (UV-světlo) B. burgdorferi do kořene ocasu.
- 9 Izolace B. burgdorferi z klíštat a myší
Výzkumy byly prováděny s již dlouho pěstovaným kmenem B. burgdorferi B31, ATCC 35210 a s čerstvým izolátem ZS7, DSM 5527, který byl izolován z klíštěcí samice kmene Ixodes rizinus. VSechny kmeny B. burgdorferi byly pěstovány v modifikovaném Kellyho prostředí z publikace Barbour a další, (1983) Switzerland. Curr. Microbiol.
ho
8, 123. Organismy, izolované ze středný'střeva klíštat, sterilizovaných ethanolem nebo z krve infikovaných myší byly zpočátku pěstovány v Kellyho prostředí s přidáním 8/Ug/ml kanamycinu a 230/Ug/ml fluoruracilu podle publikace Johnson a další, (1984) J. Clin. Microbil. 1, 81.
Serologické testy &. Zjištění specifických prótilátek proti B. burgdorferi se provádí běžným testem ELISA podle publikace Justus a další, (1988) V/ehrmed. Mschr. 32, 263. Standardní křivka pro obsah imunoglobulinu (lg) byla získána převrstvením vyhloubení lg proti myším (ředění 1 : 500 roztoku sera, Paesel, Frankfurt, SNR) a titrací obsahu celkového množství IgG nebo IgM proti myši (Calbiochera, LaJolla, USA). Obdobným způsobem byl měřen celkový obsah IgM a IgG v seru. Koncentrace těchto specifických protilátek se udává v /ug/ml sera, vztaženo na lg.
Imunofluorescence a barvení podle Gimmsy.
/til krve se napipetuje do zkumavek hematokritu (Becton a Dickinson, Heidelberg, NSR) a pak se odstředí při 5 000 g v odstředivce pro hematokrit (ECCO, NSR) Zkumavky se rozříznou ve fázi mezi šerem a erythrocyty a 5/Ul sera se nanese na nosič (Superior, Bad Mergentheim,
NSR). Nosič se vzorkem sera se suší ne vzduchu a pak se fixuje 100% ethanolem 1 minutu při -20 °C. Po inkubaci 1 hodinu s králičím hyperimunním šerem proti B. burgdorferi v ředění 1 : 100 při teplotě místnosti se nosič' pětkrát promyje PBS a pak se 1 hodinu barví při použití kozího antisera proti králíkům, konjugovaného s FITC (ředění 1 : 20, Jackson Lab., West Grove, USA). Psk se nosič promyje, uloží do směsi glycerolu a želatiny (Merck, Darmstadt, NSR) a okamžitě se sleduje ve fluorescenčním mikroskopu. Neošetřené kapky krve se usuší na vzduchu, fixují v methanolu, barví se podle Giemsy (0,1 %, Merck, Darmstadt, NSR), odbarví v PBS a uloží do prostředku Entellan (Merck, Darmstadt, NSR))
Histologické preparáty a postupy při barvení
Různé vnitřní orgány, jako mozek, srdce, plíce, játra, ledviny, slezina a klouby myší, infikovaných B. burgdorferi se v různé době po infekci odstraní a uchovávají bučí v kapalném dusíku pro přípravu zmrazených řezů nebo v 5% formaldehydu v PBS pro uložení do parafinu nebo methakrylátu. Pak se vytvářejí řezy o tloušíce 4 až 7/um, které se barví Hematoxylinem-Eosin a pak se ukládají do prostředku Entellan (Merck AG, Darmstadt, NSR). Imunohistologické sledování se provádí při použití systému s obsahem streptavidinu, biotinu a peroxidézy podle publikace Kramer a další, (1989) Eur. J. Immunol. 19, 151.
Následující tabulka 1 ukazuje, že organismy B. burgdorferi, izoláty ZS7 a B31 bylo možno zjistit v krvi Scid-myší, naočkovaných životaschopnými mikroorganismy, po celou dobu pokusu. Jinak bylo možno rekultivovat pouze spirochety kmene ZS7, avšak nikoliv kmene B31 in vitro. Při srovnání rekultivovaných organismů s primárním izolátem ZS7 nbbylo možno prokázat žádné změny v obsahu bílkovin nebo v profilu ]3asmidu. Po celou dobu pozorování bylo možno u Scid-myší, Infikovaných B. burgdorferi prokázat jen velmi malý nebo žádný titr irelevantních protilátek. Nebylo možno prokázat žádné protilátky typu IgMnebo IgG, specifické proti uvedenému mikroorganismu. Naprotitomu docházelo u kontrolních myší C.B-17, rovněž infikovaných, k expresi velkého množství celkových protilátek Ig a současně bylo možno prokázat vysoký titr specifických ) i
protilátek IgMca IgG proti B. burgdorferi. liezi 7 a 22 dnem po infekci izolátem ZS7 bylo možno pozorovat u Scid-myší první klinické příznaky zánětů kloubů, a to zčervenání a otok obou tibioterálních kloubů, stav se zhoršoval. Nebylo však možno pozorovat žádné takové příznaky u Scid-myší, infikovaných izoláteia ZS7 po jeho ozáření UV-světla, nebo izolátem B31, a to životaschopným, ani u kontrolních myší C.Bt17, infikovaných životaschopným izolátem ZS7.
Také histopathologicky bylo možno prokázat kloubní změny u Scid-myší, infikovaných životaschopným izolátem ZS7, jak je zřejmé z tabulky 1. Bylo možno prokázat těžké poškození kloubů, které se projevovalo zánětlivou hyperplasié synoviální výstelky, spojená s rozrušením chrupavky a/nebo kosti. Dále byl zjištěn zánět celého srdce s průnikem mononukleárních buněk do endokardu myokardu,a perikardu. Dále bylo možno pozorovat progrsivní zánět jater, přičemž bylo možno pozorovat vznik jaterní fibrosy, infiltrace mononukleárních buněk byla omezena na oblast portální žíly a velkých žil. Mimoto bylo možno pozorovat menší poškození hlavy, plic, mozku a příčně pruhovaných svalů.
•rl b
Λ β
• tC •g
X 3 «0 24 3 «ί X iH *H •H • ι · I I I ό 'J· I IA 02 ►2
O u
o.
u
O.
V)
I I I 00 LO | | m O m
o rH
XI f-t
•rl +> -rl te w K
+J
flk B
►» O O
+i 24 X
• b rH
X « i
o &C O
o
b 1
•H 4*
G. 3
» a •
• te
O a 4» 9
O •rl a rH
3 •rl •
rH •rl X X
O ta
X X t
•rH +* o
O b •rl
b -3 8
•rH o
* rH >2
t- X 24
rH
1 1 M
CQ 1 x
• •
o •rl o
b 3
Ή « rH
>09 OH O
►2 b 3
B O l-H
3
X to O X
o b O •rl
Ή 3 24 >
3 X O b
rH +i 24
9 • O
b CQ o ►
P
3
O •H
24 o O
3. 24
3 o
►2 *H
t- 3 3
rH a •H
1
ca
•
a •rl 4»
b ©
Ή e Ό
>00 *H o
►> b a.
E O
1 3
3 te
•rl b
O 3 3
w X o
• B
« CQ
X m
Γ-» c/j
N
I—I 20 20 ¢0 Ό* ·- I | CN CN 02 O ΙΠ -jΠ rO J3
C C « Ό Al
řo **r N· CN
•n< o r* O in
20 o m 00 02 ,
cn • • • •
IA 20 cn rH 1
IA m Xf 20 !
v- N* O rH
m ΙΛ r—í cn CN '
• •
<M CN ΐ
«3
Λ
JO J3 + + + + + + + c c 4 · + + ++ ++ ++ 44 +
III lilii o . .
___ *^· -a JO + . . | | | , I I I
CQ · CQ CQ . CQ O CQ · · + + + + + + c c
Δ J3 + + +4+4 + + · · 4 c c
02 02 A- cn <\i 02 Γίη n* m cn ru cn co co
O «o
O
O'0ajO2CNO2«0^J' I I «-«-ímCNCNCN—CN
ΙΑ Ό «0 CO «0 O O O o O Η Η H r· H X X X X X co
O *H c
1 3
•rl CQ •<H
HO • ϋ
>2 u m
31
II c
Γ*
W
N
ΓW
N l~~ w
CN u
ur-l > cn 3 CQ r>
M
N
Γοο
CN i rCQ II • C
U —
X «
CQ «
► b
N «
O rH
O
N •rl
O s
β o
« b
<-H «-Ι
O
B
O
X «
« >
b x
o >
o
B rl
O zrudnutí a otok tibiotarsálních kloubů, : - znamená méně než 7,5/ig/ml séra >3 «
B
N r-l >2 jD «
- 14 Příklad 2
Účinnost specifické monoklonální protilátky proti antigenu B. burgdorferi 31kD na průběh Borreliosy-Lyme u Scid-myší
Získání monoklonální protilátky
Při imunizaci myši s neporušeným imunologickým systémem dochází při infekci 3. burgdorferi k expresi polyklonálních protilátek, specifických pro B. burgdorferi, jak je zřejmé z tabulky 1.
Myší samice inbredního kmene BALB/c ve stáří 10 týdnů byly imunizovány B. burgdorferi, kmenem B31, ATCC 35 210, |smen byl homogenizován ultrazvukem. Imunizace byla prováděna následujícím způsobem:
Den 0: 200/Ug antigenu Borrelia v úplném Freundově pomocném prostředku podkožně.
Den 21, 35, 49, 63: dalších lOO^ug antigenu intrajSeritoneálně ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, obsahujícím fosfátový pufr.
Den 66:vyjmutí sleziny a získání suspenze jednotlivých buněk.
Imunní slezinné buňky byly podrobeny fúzí s myelomovou buněčnou linií Ag6-PAI standardním způsobem
- 15 při použití polyethylenglykolu podle publikace J.H.Peters,
H. Bauagarten, M. Schulze, Monoklonale Antikórper, Springer-Verlag, Heidelberg.
Produkty fúze byly naočkovány do desek s 96 vyhloubeními. Po osmi dnech byly supernatanty kultury sledovány zkouškou ELISA v pevné fázi na přítomnost specifických monoklonálních protilátek proti B. burgdorferi podle svrchu uvedené publikace J.H. Peters a dalších.
Bu*nky hybridomu z kultur, produkujících protilátky byly po zředění déle klonovány. Supernatanty kultur jednotlivých klonů byly znovu vyšetřeny zkouškou ELISA v pevné fázi, analýzou Western-Blot a immunofluorescencí. Monoklonální protilátky LA-2 podtřídy IgG2b byly produkovány monoklonální linií hybridomu a touto linií rovněž vylučovány a reagovaly při zkoušce Western-Blot se strukturou 31kDa (Osp-A) všech vyšetřovaných kmenů B. burgdorferi, mimo jiné také izoláty ZS7 a B31. Tyto protilátky byly děleny elektroforeticky na SDS-gelu a také zkouškou Western-blot pomocí bílkoviny B. Burgdorferi přeneseny na membránu. Monoklonální protilátky LA-26.1C (anti-OspA IgGl), LA 25.1 (anti-OspB, 34 kDa antigen, IgG2b) a LA 27.1 (anti OspB, 34 kDa antigen, IgGl) je možno získat a charakterizovat analogickým způsobem.
- 16 Infekce myší B. burgdorferi ZS7
Scid-myši C.B-17 byly infikovány podδ kožně v oblasti kořene ocasu množstvím 1 x 10 životaschopných jedinců izolátu B..burgdorferi ZS7.
Ošetření myší antiserem
Infikované Scid-myši byly' ošetřeny 2x týdně různými antisery. První skupině bylo podáno sérum NMS (normální myší sérum), druhé skupině sérum IMS (imunní myší sérum) a třetí skupině bylo podáno sérum s obsahem monoklonální protilátky LA-2 proti antigenu 31 kD-aB. burgdorferi. Dávka antisera byla v prvním týdnu lOC^ul nebo 100/ug pro LA-2, ve druhém týdnu 200^ul nebo 200^ug pro LA-2 a ve třetím týdnu 300/Ug nebo 300/ul pro LA-2,
Z následující tabulky 2 je zřejmé, že myši Scid, neošetřené nebo ošetřené NMS měly po 12 dnech klinické a histopathologické projevy zánětů kloubů, srdce a jater. Oproti tomu monoklonální protilátka LA-2 podstatně omezila tyto příznaky. Klinicky došlo pouze k lehkému zrudnutí a histopathologia’# pouze k marginálním změnám. Při podání IMS nebylo možno pozorovat žádné klinické projevy.
Průkaz B. burgdorferi kultivací in virro bylo možno získat pouze u neošetřených myší nebo myší, ošetřených NMS nikoliv v případě LA-2 nebo IMS.
Ρ β Φ β Ο Ό
<50 Ρ
β ο
3 σ
Χ5 >
• Ρ
CQ Ρ Ρ
Ν 3
0 Μ •3 β β Μ
•Η
β ta
φ Ρ >»
Ρ Λ
β «Ρ υ
Ο Ρ •Η
Ό 0 <50
<50 β. Ο
β φ Ρ
3 Λ ο
Λ \ Λ
0 Ρ
• Ρ 0
CQ Ρ β
Ρ ο
Ρ Ό Ρ
Ο β κ
Λί 0 Ρ
Φ <Η Λ! Λ
β
I cP
I
Ο β >> Λ!
σι υ
S Ρ
φ <50
β Ο
σ φ 1 Ρ
0 ο ο
Ρ •3 ρ Λ
Ρ JO ω ρ
Ρ β 3 Λ Ρ 0
0 Ο ϋ X! β
3 Ρ Φ
Αί β >>
JD Ρ Ό
I Ρ Ο
0 ΰ χυ CJ •Η
• β Ρ β
Ε-ι ο XD •Η
Ν Ο rd
Ρ β X
χη >»
S
I
Ό
Ρ
Ο
W β
φ >β
Ρ φ
χα β
β
Φ ta
Ρ
Ρ β
Ο t«—I I
CQ η m ιι ιι β β
CM
I c
Ρ, cu η ιι ιι β β
•3 Í?
Λ XL·
3 ε
Ο Ν
Ρ Λ! Ρ
Ρ β Ρ
Ρ Ό
3 β
β Ρ
Ό <0
3 β
β α
Ν θ
Ό) φ
Μ Ν
Λ 3
Φ Ο
Ρ β
Příklad 3
Klonování a exprese antigenu 31kD (OspA) z 3. burgdorferi ZS7
Příprava DNA
Vysokomolekulární DNA·,z kmene 3. burgdorferi ZS7 byla čištěna po kultivaci v modifikovaném Kellyho prostředí. Spirochety byly peletovány odstředěním při 10 000 g a třikrát promyty P3S-pufrem. Usušená peleta byla znovu suspendována v 10 ml TE s obsahem 10 mmol/1 tris a 1 mmol/1 EDTA při pH 4, pak byl na 15 minut při teplotě 30 °C přidán lysozym v množství 5 mg/ml, načež bala DNA uvolněna přidáním 1 ml 20% SDS. Po přidání 1,5 ml roztoku NaCl s obsahem 5 mol/1 byl roztok extrahován stejným objemem fenolu a pak chloroformem. DNA pak byla vysréžena přidáním dvou objemů absolutního ethanolu s nášlednou inkubací přes noc při teplotě -20 °C. Po odstředění byl zbytek rozpuš těn v O'^5 ml TE, pak byl inkubován s DNA-ázou, prostou RNA-ázy A (20/Ug/ml) po dobu 45 minut při teplotě 55 °C, načež byla na 1 hodinu při teplotě 37 °C přidána proteináza K v množství 0,1/Ug/ml. Pak byl přidán NaOAc do koncentrace 0,3 mol/1 a směs byla jako svrchu extrahována fenolem a chloroformem. Po vysrážení ethanolem byla DNA znovu uvedena do roztoku v TE.
- 19 Příprava genové banky
Vysokomolekulární DNA byla statisticky rozdělena na menší části působením ultrazvuku po dobu 3 sekundy. Pak byla užita T4-DNA-polymeráza (3C minut při 37 °C) a Henowův enzym (5 minut při 20 °S) k vyrovnání zakončení vzniklých fragmentů. Vzniklá DNA byla pak navázána do místa štěpení enzymu BamHI vektoru pro expresi pUEXl při použití strategie klonování použitím adaptéru podle pablikace Bresan und Stanley (1987) Nucl. Acid. fies., str. 1056. Po selekci podle velikosti při poůžití chromatografie s molekulárním sítem a prostředku Sephactyl S-1000 a po transformaci kompetentních buněk E. coli MC 1061 byl podíl re kombinantních jednotek pro tvorbu plaků (pfu) stanoven následujícím způsobem. Náhodně zvolené kolonie byly odebrány a pěstovány ve 2 ml selekčního prostředí LB s 25/Ug/ml ampicilinu až do nasycení. DNA plasmidu byla pak izolována běžným rozrušením za alkalických podmínek a pak byla rozštěpena enzymem BamHI. Více než 50 % analyzovaného plysmidu obsahovala včleněné řetězce DNA se středním průměrem - 1,5 kb
Pěstování na plotnách a screening genové banky B. burgdorferi ZS7
Buňky byly naneseny na desku s rozměrem 24 x 24 cm v množství 7 000 pfu na jedné desce a byly inkubovány přes noc při teplotě 30 °C. Po přenosu kolonií na nitrocelulosový filtr (NC) byla indukována exprese slo0 ženě bílkoviny s obsahem S-galaktosidázy dvouhodinovou inkubací při teplotě 42 °C. Filtr hyl přenesen na papír Whstman 3MM, předem zpracovaný 5% SDS a papír byl inkubován 25 minut při teplotě 95 °C. Pak byly bílkoviny podrobeny elektroblotu při použití běžného zařízení k provedení metody Western blot při použití částečně usušeného materiálu.
Po zpracování NC-filtrú DNA-ázou byly imunoreaktivní klony identifikovány za použití monoklonálních protilátek. Nespecifická vazná místa na NC-filtrech byla vysycena Čtyřhodinovou inkubací s PBS s obsahem 0,2 % hmotnostních želatiny a 3 mmol/l NaN^ při teplotě místnosti. Nakonec býly filtry inkubovány 18 hodin za stálého protřepúvání se super natanty kultury anti-31 KD monoklonálního klonu LA-2. Po důkladném promytí (PBS + 1 % objemové Tritonu X-100), pak PBS + 0,5 mol/1 chloridu sodného a nakonec PBS + 1 mol/1 chloridu sodného, každý stupeň trvá 10 minut, byly filtry inkubovány 1,5 hodin při teplotě místnosti za stálého protřepávání s králičí protilátkou proti myšímu IgG, značenou peroxidázou FCabíg v ředěná^l ; 10 000. Filtry byly znovu promyty jako svrchu a pak byly inkubovány s di-aminobenzidinem jako substrátem pro peroxidázu. Z 10^ rekombinantních pfu reagovalo 20 klonů s monoklonální protilátkou LA-2.
Analýza řetězce antigenu 31 kD (OspA)
Běžným způsobem byla izolována včleněná DNA rekombinantního kmene E. coli, klonu s positivní reakcí s protilátkou LA-2. Včleněná DNA tohoto klonu obsahovala gen OspA, který je kódem pro antigen 31 kD B. burgdor feri v celé jeho délce. Plastnid, který obsahoval tento ře* tězec, byl označen pZS-7/31-2 a byl označen podle budapešťské úmluvy a uložen do veřejné sbírky pod číslem DSM 5528.
Rekombinantní bílkovina, produkovaná tímto positivním klonem byla označena r2S7/31-2 a byl stanoven kódový řetězec DNA genu OspA. Tento řetězec je uveden v tabulce 5 společně s odvozeným řetězcem aminokyselin pro bílkovinu OspA.
Z tabulky 5 je rovněž zřejmé, že antigen 31 kD z B. burgdorferi je bílkovina, která obsahuje 273 aminokyselin.
Příprava nesložená bílkoviny
a) Klon, u nějž dochází k expresi imunoreaktivní bílkoviny rZS7/31-2 byl pěstován přes noc při 30 °C v 10 ml prostředí LB s ampicilinem. 1 ml kultury byl pak přidán ke 100 ml selekčního prostředí a materiál byl pěstován při 30 C za provzdušnovéní až do hustoty 6 x 10 buněk v 1 ml (Α^θθ = 0,2). Exprese rekombinančních bílkovin bylo dosaženo přenesením buněk do teploty 42 °C. Po zchlazení a odstředění byly buňky promyty pufrem STE, který obsahoval 10 mmoKl tris, 100 mmol/1 chloridu sodného a 1 mmol/1 EDTA při pH 6,0 a získaný materiál byl znovu uveden do suspenze v 0,6 ml pufru pro rozeušení buněk s obsahem 25 % sacharosy a 50 mmol/1 tris při pH 8,0. Po přidání 150/Ul roztoku s obsahem 10 mg/ml lysozymu byla směs inkubována 15 minut v ledu a pak ještě dalších 15 minut v ledu 'za přítomnosti lS^ul roztoku s obsahem 10 mg/ml DNA-ázy 1 za přítomnosti 5/Ul 1 mol/1 chloridu hořečnatého. Pak bylo přidáno 250/ul 4x směsi smáčedel (1 % Triton X 100, 0,5 % Deoxycholátu, 0,1 mol/1 NaCl, 10 mmol/1 tris, o pří 7,4) a směs byla znovu inkubována 5 minut v ledu. Po odstředění byla usazenina dvakrát promyta pufrem A (50 mmol/1 tris, mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 8,0) a pak byl materiál znovu uveden do suspenze v devíti objemech pufru A s obsahem 8 M močoviny a směs byla 1 hodinu inkubována při teplo tě místnosti. Pak byl vzorek zředěn devíti díly pufru B (50 mmol/1 dihydrogenfosforečnanu a hydrogenfosforečnanu draselného, 50 mol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA o pH 10,7), směs se ještě 30 minut míchá při teplotě místnosti a pH se udržuje hydroxidem draselným na hodnotě 10,7. Pak se pH rozto ku upraví na 7,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové a vzorek se dialyzuje přes noc proti pufru A při teplotě 4 °C, pak 10 minut při teplotě 4 °C, načež se odstřeluje 10 minut při teplotě 4 °C a 10 000 ot/min (rotor SS34). Supematant s obsahem rekombinantní bílkoviny se uchovává při -20 °C.
- 23 b) Vzhledem k tomu, že tento klon vylučuje iraunoreaktivní bílkovinu rZS7/31-2 také do živného prostředí, je možné čištění afinitní chromatografie přímo ze supernatantu kultury.
Příprava rekombinantní nesložené bílkoviny OspA a čištění afinitní chromatográfii
Rekombinantní bílkoviny pak byly čištěny afinitní chromatográfii. K tomuto účelu byly na aktivovanou Sepharose CL 43 kovalentně vázány čištěné monoklonální protilátky LA-2. Dialyzovaný extrakt močoviny byl s rekombfantní bílkovinou navázán na Sepharose CL 4B s myším IgG a nakonec byla tato směs přidána do sloupee LA-2-Sepharosy CL 4B. Po intenzivním promytí byla vázaná rekombinantní bílkovina podrobena eluci směsí 0,1 mol/1 glycinhydrochloridu a 0,1 mol/1 NaCl o pH g,5. Pak bylo pH této frakce neutralizováno okamžitým přidáním 1/10 objemu 0,5 mol/1 KgHFO^. Frakce s obsahem bílkoviny byly koncentrovány a dialyzovány. Pomoci elektroforézy na SDS-polyakrylamidoíém gelu byl stanoven stupeň čistoty.
Imunologická charakteristika rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2
Rekombinantní bílkovina rZS7/z31-2 byla imunologicky zkoumána. Pro srovnání byla užita rekombinantní bílkovina r831/41-9 (povrchový antigen 41 kD B. burgdorferi).
Mikrotitrační plotny s plochým dnem byly převrstveny extraktem rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 a rB31/41-9 s použitím extraktu močovinou, popřípadě extraktem kmene E. coli MC 1061, který byl použit k expresi genu. Nespecifická vazné místa byla blokována 0,2% Želatinou v roztoku chloridu sodného s obsahem fosfátového pufru. Do vyhloubení takto připravených mikrotitračních ploten byly přidány monoklonální protilátky LA-2 (anti-31 kD, Osp-A), La-l (anti-41 kD, Flagellin) a ACHT-2 (anti-a^-Antichymotrypsin).
Vázané monoklonální protilátky by- . ly uvedeny do reakce s imunoglobuliny, specifickými proti myším a značenými peroxidázou. Vázané protilátky, značené peroxidázou byly kvantitativně stanoveny pomocí orthofenylendiaminy jako substráty pro peroxidázu. Absorpce při 492 nm (A^gg) byla stanovena přímo na mikrotitrační plotně pomocí automatizovaného fotometru. Velikost absorpce je přímo úměrná množství vázané monoklonální protilátky.
- 25 Monoklonální protilátka LA-2 specificky reaguje s bílkovinou rZS7/31-2, avšak nikoliv s MC 1061 nebo r331/41-9· Kontrolní reakce monoklonální protilátky LA-1 je specifická pro rD31/41-9· Monoklonální kontrolní protilátka ACHT-2 (negativní kontrola) se neváže na žádnou z uvedených bílkovin.
V tabulce 6 je znázorněno, že dochází k expresi antigenního epitopu na rekombinantní bílkoviny rZS7/31-2 po klonování z genomu B. burgdorferi ZS7, přičemž tento antigenní epitop je specificky rozpoznáván monoklonélní protilátkou LA-2.
Příklad 4
Srovnání specifických protilátek proti antigenu 31 kD (OspA) a 34 kD (OspB) s protilátkami, které jsou specifické pro antigen 41 kD (Blagellin)
Monoklonální protilátky LA-2 a LA-26.1 rozpoznávají antigen 31 kD OspA a je možno je přiřadit k isotypu IgG2’o a IgGl. Monoklonální protilátky LA-25.1 a LA-27.1 rozpoznávají antigen 34 kD OspB a je možno je přiřadit k isotypu IgG2b a IgGl. Monoklonální protilátky LA-1O a LA-21 jsou specifické pro periplasma26 tickou bílkovinu 41 kD, spojenou s bičíky B. burgdorferi a je možno je přiřadit k isotypu IgG2a a IgGl. Všechny svrchu uvedené protilátky je možno získat způsobem podle příkladu 2. Mělo oy být stanoveno, zda také monoklonální protilátky proti jinému sntigenu B. burgdorferi poskytují Scid-myším ochranu před klinickými projevy infekce.'
Polyklonální imunní sera anti-B31(IMS) bylo odebráno z myší C57BL/6 91 dnů po podkožním poθ dání 1 x 10 organismů B. burgdorferi B31. Polyklonální anti-ZS7 IMS byle odebrána z myší C57BL/6 po 68 dnech po θ podkožním naočkování 1 x 10° organismů B. burgdorferi ZS7. Obě sera obsahovala 60/Ug/ml specifických protilátek, jak bylo mošno prokázat zkouškou ELISA podle publikace Schaible a další, J. Exp. Med. 170 (1989), 1427 - 1432. Normální myší sérum (NMS) bylo odebráno z neinfikovaných myší C57BL/6.
Od naočkování v intervalech čtyř dnů byly svrchu uvedené protilátky nebo PBS-pufr podávány pasivně intraperitoneálně Scid-myším následujícím způsobem:
den 0 a 3: 100/Ul, den 7 a 10: 200^ul, den 13 a 17: 300/Ul.
Scid-myši, ošetřené protilátkami anti-ZS7IMS, anti-B31IMS nebo monoklonální protilátkou LA-2 nevykazovaly žádné viditelné klinické příznaky zánětu kloubů
- 27 nedošlo ke zčervenání ani otoku tibiotarsálních kloubů v průběhu 21 dnů. Neobjevily se ani příznaky zánětu srdce a jater. Histopathologické vyšetření neprokázaly změnu kloubů, srdce a jater u Scid-myší, které obdržely jakoukoliv z těchto protilátek.
Také další Osp-A specifické monoklonální protilátky LA-26.1 (IgGl) a OspB specifické protilátky LA-25.1 8 LA-27.1 potlačovaly nebo zmírňovaly všechny příznaky, zde však došlo k lehkým pathologickým změnám uvedených orgánů.
Naproti tomu měly Scid-myši po podání pufru PBS, NMS nebo monoklonální protilátky proti Flagellinu (LA-10 nebo LA-21) klinické příznaky typické arthritidy, jak je zřejmé u neošetřených myší a jak je uvedeno v tabulce 3. Těžké příznaky se zvyšovaly v průběhu času po naočkování a po celou dobu pozorování se nezmírnily.
ne
Ze Scid-myší, předem ošetřených anti-ZS7IMS nebo LA-2\>ylo možno izolovat spirochety. Oproti tomu bylo možno prokázat spirochety imunofluorescencí a kultivací z krve těch Scid-myší, které byly ošetřeny podáním pufru PBS, NMS nebo monoklonálními protilátkami LA-25.1, LA-26.1, LA-27.1,
LA-10 nebo LA-21.
oo
ÍM
Λ! r-1 3 tí e<
o β φ ο η α Φ β . ο 03 4η ο 3 β 0Χ Ν Ο > 4π 0 Ό X Ο Μ 60Χ q <3 βΧ 3 β 3 3 θ (XXI μ ·Η ooo + + + + +
XH
XU
X +
(Λ
X
Ό β
(0 ο
ca •Η
I -ρ ο X Λ tím X Λ3 X 0X0 X X (ΧΛ: β χ ο υ 0 β
X XX já ca 6ο β χ χ o φ β £X Cuffl
xo CQ •rl
tí -P
o •H
ΐ £
X X
X β
tí 0
CU ř»> X
tí O
3 <30
m X
β φ
*H
X
Φ xn o
ο-
X
1 X
• XO
CQ ř>>
• a
o
» X
Ό Φ
X XJ
O o
I + + 4-1 +1 +1 β
X a
I +
'>»
Λί + + +1 +’ +1 + + +1+1 +1
JO 00 CM ÍM X tí
ÍM X (0 CO
X X
o o tí β
β β X X
X X X X Χ“ν z—*
tí β X X c CQ CQ
o o w ω Φ Φ cu CU CU
tí tí s S 60 $ 03 ca (0
X X <! 0 0 O O o
« • cu X X o
60 <30 X O ca Ph
Φ Φ <n ω O —' X rH X
tí β CQ tSJ • * •
l 1 o X UO tr\ c—
X X ÍM X ÍM ÍM CM ÍM
co w X X 1 1 1 1 t 1
CQ tí tí <4 <5 *4 <4
Ph § 0 0 3 t-3 1-4
OO ÍO tl II
C β m + it II β β uo m
II m n
II II β β m m
II II β β
X tí tí ca
Ό
OJ
XS
O
X
CO
X β
Ό >
O
XJ co β
tSJ
O
Φ •o λ
o '>>
Λ3
O
X <w o
o x;
x co
CU >β
Φ cu
X cn <3
O q
X
Ό ‘Φ *ro
XJ
O
Φ xo &
XS1
O a
rH >>
tí
Φ β
Φ o
ca
Φ β
o
X
4h
O β
a β
φ
4h β
O
Ό β
tí
N
CD tí •3 β
CU
II o
- 29 Fříklad5
Vliv antiséra myší, imunizovaných OspA na průběh onemocnění u Scid-myší
V tomto pokuse bylo prokazováno, že podání nativního OspA, izolovaného z 3. burgdorferi ZS-7 nebo rekombinantního OspA, izolovaného z bakterií E. coli, transformovaných rekombinantním plasmidem pZS-7/31-2,
DSM 5528 vyvolává u normálních myší kmene C57BL/6 tvorbu ochranných polyklonálních protilátek. V případě, že tyto protilátky jsou podány Scid-myším, chrání proti onemocnění. Bylo tedy možno prokázat, že rekombinantní OspA vyvolává ochrannou imunologickou odpověů, srovnatelnou s odpovědí na nativní OspA. Výsledky a podrobnosti pokusu jsou uvedeny v tabulce 4.
Získání rekombinantního OspA je uvedeno v příkladu 3.
Získání nativního OspA a imunizace myší tímto materiálem bude dále popsána.
Získání nativního 31kDa OápA
3,2 χ ΙΟ^θ spirochet se míchá 2 hodiny při 4 °C v 5 ml PBS/7,5 ml n-butanolu za přítomnosti in- 30 hibitoru proteézy (5 mmol/l EDTA, 5 mmol/l benzamidinu a 0,5 mmol/l PMSF) při použití magnetického míchadla. Pak se směs odstřeSuje 90 minut s 10 000 ot/min a 4 °C V odstředivce (Sorvall). Vodná fáze s obsahem povrchové bílkoviny se izoluje a třikrát promyje chloroformem. Obsah bílkoviny se zjistí extinkcí při 280 nm nebo testem BCA.
V gelu s obsahem stříbra nebo metodou
Westernblot s králičím šerem proti B. burgdorferi lze prokáooo zat pro kmen ZS7 hlavní pás s molekulovou hmotností 31 £3tíoo ccc w ΰ&Ό a slabší pásy při í®, 34/á 65/^až 68 k=j· Ve směsi butanolu a vody poskytuje kmen B31 hlavní pás při 31 k-j a slabší pásy
0 i 34 kj·.
a
Imunizace myší nativním/rekombinantním OspA
Myši C57BL6 a myši C.B-17 byly očkovány třikrát v odstupu 7 až 10 dnů podáním 5/Ug nativního OspA kmene B31 nebo 10 mg nativního OspA kmene ZS7 nebo rekombinantního OspA téhož kmene ve 100/Ul pomocného prostředku (ABM3, Fa. Sebak, Aidenbach, MSP) podkožně v oblasti kořene ocasu. Nejdříve 3 t^dny po podledním podání bylo možno odebírat sérum 3 až 4 měsíce. Obsah specifických protilátek byl stanoven metodou ELISA.
h ffl u
Cl á
CU e
(0
KO CM
m
KO o O o
Vliv specifických monoklonálních a polyklonélních protilátek proti B. burgdorferi na
•a
JO 3 O i—I M
P
X)
M c
ffl «I
P φ
X» o
c
XD
N
T5
O ►
ř
>> e*
a 1 1 P
Ό • ffl
•rl CQ Ό
O • O
CO O CU
+ 111 + 111 + 1111
CD co CO
rd O Cl P a M a z~k
c VI •
o fi X»
AS ► a
VI •rl P o M
fi ffl
► fi Ci
•H «U.
P ffl o! -u
«0 CU CU
Φ ta ffl
fi O o
CM «Η •rl
co fl P P
e a fi Φ ffl
\o KO
II II fi fi
CM
II c
<n
II fi
X) ι—1
C 3
ffl
ffl O
XJ 3 a
O
ffl • • v- r—1
T9 3
P ta
ffl X—k
·» o H
o o 3
•rl ffl \ O
fi fi o
Ό ffl CM
*i SP
ffl o
► Aí r-l
ι—1 •H r-l
3 P ·*
\ ffl z^s
O ffl r-l
o r-1 3
i—1 JO
O O
3 O
a O CM
φ •3 Nim*
VD X> X) C'-
O fi
WJ
> O »>
AS rl
XJ Ό 3
fi o \
iH CU O
XD o
ffl •3 H
C a
O K>
P •rl •V
•rl fi
Cl ffl A
ffl 00 O
CU Cl ffl
CD o c
Ci •3
P 00
Φ X
fi XD H
Ό O φ*
CU e-
Φ r-l 1 3
>» XI •rl
>> Ci ffl
AS v
P Ci
XD O
r-1 •rl u
P Ci
O 3
Ci X>
CU <B • CQ
AS ► M
XD O
3 AS
VI fi ► ffl •rl
Ci C4 ffl
DalSÍ dávky protilátek byly podány 18 (300/Ul), vždy intraperitoneálně

Claims (14)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Očkovací látka proti boreliose , onemocnění Lyme , vyznačující setím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro an tigen 31 kD , OspA nebo 34 kD , OspB , Borrelia burgdorferi
  2. 2. Očkovací látka proti boreliose , onemocnění Lyme , vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo větší počet monoklonálních protilátek, specifických pro an tigen 31 kD , OspA, Borrelia burgdorferi.
  3. 3. Očkovačí látka proti boreliose , onemocnění Lyme , vyznačující se tím, že obsahuje jednu neoo větší počet monoklonálních protilátek, specifických prc an tigen 34 kD , OspB , Borrelia burgdorferi.
  4. 4. Očkovací látka podle nároku 1, vyznačuj í cí se tím.že obsahuje protilátku, specifickou pro antige.n 31 kD Borrelia burgdorferi, kmenů ZS7, DSM 5527, nebo/a B31, ATCC 35210.
  5. 5. Očkovací látka podle nároku 1, v y z n a Č' ují cí se tím, že obsahuje protilátku, specifickou pro antigen 34 kD Borrelia burgdorferi, kmenů ZS7, DSM 5527, nebo/a B31, ATCC 35210.
  6. 6. Očkovací látka podle nároku 2, vyznač uj í cí se tím, že obsahuje monoklonální protilátku ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
  7. 7. Očkovací látka podle nároku 3, vyznačují c i se t i tn, že obsahuje monoklonální protilátku ze skupiny IgG, s výhodou podskupiny IgG2b nebo IgGl.
    - κ 3. Způsob výroby očkovací látky proti boreliose, vyznačující se tím, že se z lymfocytů nebo slezinných buněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich částmi, vytvoří fúzí buněk hybridom, produkující monoklonální protilátku LA2 podle nároku 2.
  8. 9. Způsob výroby očkovací látky proti boreliose, vyznačující se tím, že se z lymfocytů nebo slezinných 'ottněk pokusných zvířat, s výhodou myší, imunizovaných organismy Borrelia burgdorferi nebo jejich čászmi, vytvoří fúzí buněk hyb-ridom, produkující monoklonální protilátky LA 25.1, LA 26.1 a LA 27.1 podle nároku 3.
  9. 10. Způsob podle nároku 3, vyznačuj íc í se t í m , že se k imunizaci užijí kompletní organismy 3orrelia burgdorferi 331 nebo/a ZS7.
  10. 11. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t i m , že se k imunizaci užijí kompletní organismy 3orrelia burgdorferi B31 nebo/a ZS7.
  11. 12. Monoklonální protilátka LA-2 proti OspA podle nároku 2, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 39091302.
  12. 13. Monoklonální protilátka LA-25,1 proti OspA podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 90050406 .
  13. 14. Monoklonální protilátka LA-25.1 proti OspS podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 90050405.
  14. 15. Monoklonální protilátka LA-27.1 proti 0sp3 podle nároku 3, vylučovaná buněčnou linií hybrídomu ECACC 90050407.
CS904560A 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky CZ284538B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3931236 1989-09-19
DE4015911A DE4015911A1 (de) 1989-09-19 1990-05-17 Impfstoff gegen die lyme-krankheit

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ456090A3 true CZ456090A3 (cs) 1998-08-12
CZ284538B6 CZ284538B6 (cs) 1998-12-16

Family

ID=25885304

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS904560A CZ284538B6 (cs) 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky
CZ95970A CZ284616B6 (cs) 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ95970A CZ284616B6 (cs) 1989-09-19 1990-09-19 Očkovací látka, antigen, kódová rekombinantní DNA pro tento antigen, rekombinantní vektor a způsob výroby antigenu

Country Status (24)

Country Link
US (6) US5178859A (cs)
EP (5) EP0861664A3 (cs)
JP (3) JP3205932B2 (cs)
KR (2) KR100205462B1 (cs)
AT (4) ATE186646T1 (cs)
AU (1) AU651560B2 (cs)
CA (1) CA2025597C (cs)
CZ (2) CZ284538B6 (cs)
DE (5) DE4015911A1 (cs)
DK (4) DK0418827T3 (cs)
ES (4) ES2141182T3 (cs)
FI (1) FI102248B (cs)
GR (3) GR3018995T3 (cs)
HK (1) HK1002405A1 (cs)
HR (1) HRP940545B1 (cs)
HU (2) HU212716B (cs)
IE (1) IE903377A1 (cs)
NO (2) NO311767B1 (cs)
NZ (1) NZ235260A (cs)
PL (2) PL170229B1 (cs)
PT (1) PT95349B (cs)
SI (1) SI9011773B (cs)
SK (3) SK283089B6 (cs)
YU (2) YU48250B (cs)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) * 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US7094391B1 (en) * 1988-10-24 2006-08-22 The University Of Texas System Compositions and methods for administering Borrelia burgdorferi antigens
US6143872A (en) * 1988-10-24 2000-11-07 Symbicom Aktiebolag Borrelia burdorferi Osp A and B proteins and immunogenic peptides
US5777095A (en) * 1988-10-24 1998-07-07 Symbicom Aktiebolag Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90
DE4015911A1 (de) * 1989-09-19 1991-03-28 Max Planck Gesellschaft Impfstoff gegen die lyme-krankheit
US5582829A (en) * 1990-04-05 1996-12-10 Rx Technologies, Inc. Sonicated borrelia burgdorferi vaccine
CA2084413A1 (en) 1990-06-15 1991-12-16 Richard A. Flavell Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease
ATE196425T1 (de) * 1990-07-06 2000-10-15 American Home Prod Impfstoff gegen die lyme-krankheit
CA2057536C (en) * 1990-12-21 1999-10-26 John J. Dunn Cloning and expression of borrelia lipoproteins
US6221363B1 (en) * 1991-07-11 2001-04-24 Baxter Aktiengesellschaft Vaccine for the prevention of lyme disease
US6872550B1 (en) 1991-07-11 2005-03-29 Baxter Vaccine Ag Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens
DK0598816T3 (da) * 1991-08-15 1999-11-22 Deutsches Krebsforsch Osp A-proteiner fra Borrelia Burgdorferi-undergrupper, hvilke proteiner koder for gener og vacciner
US6676942B1 (en) 1991-08-15 2004-01-13 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Osp a proteins of Borrelia burgdorferi subgroups, encoding genes and vaccines
WO1993008299A1 (en) * 1991-10-18 1993-04-29 Connaught Laboratories Inc. Preparation of recombinant borrelia proteins
EP0540457A1 (en) * 1991-10-22 1993-05-05 Symbicom Ab Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis
US6303129B1 (en) * 1992-07-28 2001-10-16 Rx Technologies Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use
US6716591B1 (en) 1993-07-30 2004-04-06 Yale University B. burgdorferi polypeptides
US5656451A (en) * 1993-07-30 1997-08-12 Yale University OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi
US7008625B2 (en) 1993-11-01 2006-03-07 Research Foundation Of The State University Of New York Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi
US5558993A (en) * 1994-06-17 1996-09-24 The Regents Of The University Of California Cloned Borrelia burgdorferi virulence protein
GB9511909D0 (en) * 1995-06-12 1995-08-09 Microbiological Res Authority Vaccine
DK0894143T4 (da) * 1996-02-21 2012-07-16 Univ Texas VMP-lignende sekvenser af patogenisk Borrelia
DE19632862B4 (de) * 1996-08-14 2006-08-03 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Immunologisch aktive Proteine von Borrelia burgdorferi, dafür kodierende Nukleinsäuren sowie deren Verwendung in Testkits und als Impfstoffe
US6458555B1 (en) * 1996-08-21 2002-10-01 Gerd Bach Cytologic method of examining mucous membranes
US6060082A (en) * 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
DE19740735A1 (de) * 1997-09-16 1999-03-18 Max Planck Gesellschaft Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose
US6306623B1 (en) 1998-02-24 2001-10-23 The University Of California Leptospiral major outer membrane protein LipL32
EP1100922B1 (en) 1998-07-31 2008-02-20 Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine
WO2000056298A2 (en) * 1999-03-19 2000-09-28 Luitpold Pharmaceuticals, Inc. Treatment of lyme disease with polysulfated glycosaminoglycan formulations
WO2000078345A1 (en) * 1999-06-21 2000-12-28 Milkhaus Laboratory, Inc. Method for treatment of lyme disease
EP1311540B1 (en) 2000-08-18 2007-12-19 Research Foundation Of State University Of New York Altered ospa of borrelia burgdorferi
US7847084B2 (en) 2002-12-20 2010-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System VMP-like sequences of pathogenic Borrelia species and strains
NZ576564A (en) 2006-11-03 2012-03-30 Schering Plough Ltd Canine lyme disease vaccine
EP2155782A2 (en) 2007-03-26 2010-02-24 Dako Denmark A/S Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases
EP2167537A2 (en) 2007-07-03 2010-03-31 Dako Denmark A/S Compiled methods for analysing and sorting samples
WO2009039854A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
US10968269B1 (en) 2008-02-28 2021-04-06 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in borrelia diagnostics and disease
WO2010009735A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 Dako Denmark A/S Combinatorial analysis and repair
GB0817244D0 (en) 2008-09-20 2008-10-29 Univ Cardiff Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells
US10369204B2 (en) 2008-10-02 2019-08-06 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
US11992518B2 (en) 2008-10-02 2024-05-28 Agilent Technologies, Inc. Molecular vaccines for infectious disease
US8568989B2 (en) * 2009-11-17 2013-10-29 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of Lyme disease antibodies
US8758772B2 (en) 2011-11-04 2014-06-24 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
PL223175B1 (pl) 2012-10-22 2016-10-31 Inst Chemii Bioorganicznej Polskiej Akademii Nauk Szczepionka przeciw boreliozie, konstrukt genetyczny, rekombinowane białko, sposób otrzymywania konstruktu genetycznego, sposób otrzymywania szczepionki, sposób otrzymywania rekombinowanych białek, zastosowanie rekombinowanych białek do wytwarzania szczepionki przeciwko boreliozie
US9610336B1 (en) * 2014-07-16 2017-04-04 Amiram Katz Immunotherapy for lyme disease
US12258373B2 (en) 2018-12-17 2025-03-25 Immudex Aps Panel comprising Borrelia MHC multimers

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) * 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US4772464A (en) 1985-08-01 1988-09-20 Miles Laboratories, Inc. Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens
US4888276A (en) 1986-06-26 1989-12-19 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and composition for the diagnosis of Lyme disease
US4721617A (en) 1986-08-14 1988-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Vaccine against lyme disease
US5034515A (en) * 1987-09-22 1991-07-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Staphylococcal fibronectin receptor, monoclonal antibodies thereto and methods of use
DE4015911A1 (de) * 1989-09-19 1991-03-28 Max Planck Gesellschaft Impfstoff gegen die lyme-krankheit
DK0506868T4 (da) * 1989-12-22 2004-04-26 Mikrogen Molekularbiol Entw Immunologisk aktive proteiner fra Borrelia burgdorferi, tilhørende testkits og vaccine
CA2084413A1 (en) * 1990-06-15 1991-12-16 Richard A. Flavell Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease
ATE196425T1 (de) * 1990-07-06 2000-10-15 American Home Prod Impfstoff gegen die lyme-krankheit
CA2057536C (en) * 1990-12-21 1999-10-26 John J. Dunn Cloning and expression of borrelia lipoproteins
DK0598816T3 (da) * 1991-08-15 1999-11-22 Deutsches Krebsforsch Osp A-proteiner fra Borrelia Burgdorferi-undergrupper, hvilke proteiner koder for gener og vacciner
ES2127759T3 (es) * 1991-08-27 1999-05-01 Novo Nordisk As Composiciones de detergentes.
WO1993008299A1 (en) * 1991-10-18 1993-04-29 Connaught Laboratories Inc. Preparation of recombinant borrelia proteins
EP0625052A4 (en) * 1991-10-21 1995-07-19 Medimmune Inc SECRETION SIGNAL OF LIPOPROTEIN-ENCODING DNA CONTAINING BACTERIAL EXPRESSION VECTOR.

Also Published As

Publication number Publication date
KR100205462B1 (ko) 1999-07-01
PL170229B1 (pl) 1996-11-29
SK280285B6 (sk) 1999-11-08
ATE186646T1 (de) 1999-12-15
JP2001204467A (ja) 2001-07-31
SK283088B6 (sk) 2003-02-04
GR3018995T3 (en) 1996-05-31
PT95349B (pt) 1997-06-30
EP0418827A1 (de) 1991-03-27
PL169804B1 (pl) 1996-09-30
PT95349A (pt) 1991-05-22
FI102248B1 (fi) 1998-11-13
KR100202128B1 (en) 1999-06-15
EP0418827B1 (de) 1995-12-20
NO20014624D0 (no) 2001-09-24
US6613331B1 (en) 2003-09-02
CA2025597C (en) 2004-02-03
US5780030A (en) 1998-07-14
ATE131732T1 (de) 1996-01-15
ES2129551T3 (es) 1999-06-16
CA2025597A1 (en) 1991-03-20
HU905816D0 (en) 1991-03-28
NO311767B1 (no) 2002-01-21
JP3205932B2 (ja) 2001-09-04
NO904062L (no) 1991-03-20
YU48250B (sh) 1997-09-30
CZ284538B6 (cs) 1998-12-16
YU177390A (sh) 1993-05-28
ES2145077T3 (es) 2000-07-01
AU651560B2 (en) 1994-07-28
EP0633028B1 (de) 1999-11-17
JP3328644B2 (ja) 2002-09-30
CZ97095A3 (en) 1995-09-13
HU212716B (en) 1996-10-28
FI102248B (fi) 1998-11-13
DK0418827T3 (da) 1996-05-06
EP0643974A1 (de) 1995-03-22
GR3033675T3 (en) 2000-10-31
HUT59613A (en) 1992-06-29
SK151098A3 (en) 1999-04-13
DE59010863D1 (de) 1999-02-25
NO315905B1 (no) 2003-11-10
DE59009978D1 (de) 1996-02-01
JPH03209400A (ja) 1991-09-12
GR3032010T3 (en) 2000-03-31
HK1002405A1 (en) 1998-08-21
SK283089B6 (sk) 2003-02-04
DK0633028T3 (da) 2000-04-10
US5178859A (en) 1993-01-12
US5686267A (en) 1997-11-11
DK0633313T3 (da) 2000-07-24
NO904062D0 (no) 1990-09-18
IE903377A1 (en) 1991-04-10
CZ284616B6 (cs) 1999-01-13
DE4015911A1 (de) 1991-03-28
JP3418171B2 (ja) 2003-06-16
DE59010888D1 (de) 1999-12-23
EP0861664A3 (de) 1999-02-24
SI9011773B (en) 2001-12-31
ATE175576T1 (de) 1999-01-15
YU49370B (sh) 2005-09-19
ATE191499T1 (de) 2000-04-15
HRP940545A2 (en) 1997-04-30
FI904597A0 (fi) 1990-09-18
ES2141182T3 (es) 2000-03-16
NZ235260A (en) 1993-04-28
HK1013620A1 (en) 1999-09-03
EP0633313A1 (de) 1995-01-11
EP0643974B1 (de) 1999-01-13
DE59010903D1 (de) 2000-05-11
EP0633028A1 (de) 1995-01-11
SK456090A3 (en) 1999-11-08
US5434077A (en) 1995-07-18
KR910005889A (ko) 1991-04-27
EP0861664A2 (de) 1998-09-02
YU9097A (sh) 1999-06-15
US5856447A (en) 1999-01-05
SI9011773A (sl) 1998-04-30
IE990173A1 (en) 2000-11-01
EP0633313B1 (de) 2000-04-05
SK151198A3 (en) 1999-04-13
JP2001069969A (ja) 2001-03-21
DK0643974T3 (da) 1999-09-06
HU211228A9 (en) 1995-11-28
AU6244490A (en) 1991-03-28
HRP940545B1 (en) 2000-06-30
NO20014624L (no) 1991-03-20
ES2082812T3 (es) 1996-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ456090A3 (cs) Očkovací látka proti boreliose, způsob její výroby a monoklonální protilátky
US5747294A (en) Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease
Simon et al. Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibodies protective against spirochetal infection in mice
HK1002405B (en) Vaccine against lymie borreliosis disease
IE83320B1 (en) Vaccine against lyme disease
US5656451A (en) OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi
DE69835682T2 (de) Oberflächenantigene und proteine für zusammensetzungen zu diagnose und vorbeugung der lyme-kkrankheit
CA2244147A1 (en) Decorin binding protein compositions and methods of use
US6716591B1 (en) B. burgdorferi polypeptides
US20030103977A1 (en) Antibodies to polysaccharide of C. neoformans
JP2000510339A (ja) インビボで発現されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉポリペプチド
AU673912B2 (en) Vaccine against lyme disease
HK1013620B (en) Vaccine against lyme disease

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20050919