BG97041A - Проби на база протеин-нуклеинова киселина и метод за използването им при имуноизследване - Google Patents

Abstract

1. Молекулярна проба за използване като усилвател на сигнали при имуноизследвания, включваща първи домен (А), който е полипептид и функционира като антитяло специфично за познат антиген, втори домен (В), който е двуверижен полинуклеотид, способен да функционира като промотор на ензим с активност на ДНК зависима РНК полимераза и трети домен (С), който е или едно- или двуверижен и е съседен на втория домен и е способен да функционира като матрица за промоторната активност на втория домен.35 претенции, 11 фигури

Description

Това изобретение се отнася общо яо областта на имунологията и химията ва нуклеиновата киселина. Оо-спеацифичяо, то се отнася до използуването хибрилизиране на нуклеиновата киселина като средство за подсилване на откриваем сигнал при ищунсиз^слвпв^яия

На ТшЖЬиТа

Хибрилизираяе на нуклеиновата киселина са използува сега общо ври генетичните изслелваяия, биомелипияските проучвания и клиничната диагностика за откриване и количествено определяне на отделян нуклеотидни послелователкост·· които са налични в

-2хетерогенни на ДЖ, Ж й/жли други гатериалн. при хибрядизирапето на базичнп нуклеинови оселия се изследва при едаолевтовв яувлеянсва киселина (*ж? ,”НК клу 1Ш) директно шш индиректно ?сьм белязани нуклеиново race.® средство,и дуплекси съдържащи белете се определят количествено Използуват се радиоактивен ь нерадпсактижи средство*

Црг оспозното изслсгваж лнгсва чувствителност* Когато авалгтът 0%ГшЦ]у е налячен в *алък брей или в разредена концентрация, сигналът не «оге да бт.де различен от фоновия еда. разработени сг Ейргщии на основната схема за улесняване сепарирането на именните дуплекси от външепял штериал е/гди за подсилване на аналитните последователности с оглед улесняване па откриването, но тези вариации страдат обикновено помади кошлексни и изискващи голя® консужпия процедури, висок фон, слаба чувствителност и трулностг прп количественото огредс^яъе. За общо обоьоейе на тези вариации виж Иятернапйоналвтя патент Пуб. % зз/оззп.

Ийунпизслепвання се използуват също често пра гозотвш нро учвания, бисаешшипсо изследвания й при клинични диагностики за откриване и количествено определяне на отлежи антигеняи е питони, които са налични в хетерогенни смеси на кръвни пробни образци, клетъчни екстракти и в други дас основно ииуноизежелвани включва специфично свързване на антитяло, иди коноклонажо или полишюяадно, хш към ^шенея антиген г средства за откри* ване на реакцията, такива ярвдетва са включени в различим изследвания включително директни, индиректен и сандвичеви и уяоизслелваяиа.. Обаче чувствителността за откриване ва есешцщлаите взаимодействия автиген/аятитяло пре длага съжте проблеав като описаните по-горе за хибсипнзаот на нуклеинова киселина.

Напоследък се използуват различни методики като радиои^ноизследване, и^нопецоксилаза и Ηιφφπρπ имуиоизследванията.

Обаче и><ат недостатъка за изискване на спасих s неблагоприятни за околната среда реактнии и имунотроксалмй, а страж от слаб жегнал спреш сж^еажето sa % е двлеко от ycumse бй сигнала· braa от първите з&гд« яа ^cto-wtc дзосе-зтеаде s ж създам «ежжзо усижвайе на скгй^ж изпозевж яа одгота ас»· аджлеотвдш мзлекудг, иевто се алзвиг пелездм прЕизслзпЕзння за на нукжтноБа квеедива пртпзлзаае за ямуяовз· следван wu Т&зт уоожл-и сраства предлагат сижс репродуцшруеи евгиаме съоазетно подстдване, силно репродуцарует отношение сигнал към шум, са^л са определяй количествено и репродупйруеж и са пригодна ж са комбинират специфично в анат* антиген, наличе в ниска концентрация и да о.ория /универсален рецептор ацетва киселина за одашв нс стабшши кошшексн.

Ь Патент р 4,36^,105, кжлен sa 19 согтгшри i?ss голи», чикте взвод! са вклюфрр тук като лвтерегура, описва· едно изследване ^отвориш -аса х^иржаацдешея сцшшлч, в κοίτα нуклеинова клеелвна д^б^лздра ж ‘’белязано средство” в до ’захвамо средство·· КодШедат срелство-аяалгт а свързан чрез хморичизашш кьв твърда опора. Това позволява аяйлнтнилт олигснуклеодад за бъда отстраняван от разтвор като газа твърд кожлмс, като с това се кояцеятрира алалитът, уж овявало сеп^зраяето от др”гя реактйвй и ковяйаваякд госледБащото откришае.

Патентното описание пуакация г 0/ΐ3δ£7 Публикувана аа 15 ноември 1990 година претендира за линейни и разклонени дултимерна аолшуоеотяднд средства които имат две области, и методи за използуване не тези средства като усилватели на сггнада пря изследвания за хибридизация на нуклеинова киселина. Първато област е лолълнхте«нз към ешюлентова опртонуклеотшша послелсвателнист прелет&вдяьа^а ннт©рвс_е - втората област е съставава от «тесте© еднодонтоьм олигануклаотвднм полединад вой то са допъжителви към е ДМА ежолавтов ОелАзан а^гонуклса^Ки· άάινηΤϋοΐό о^сжие дубдшмшия $ Д)17ШВ91/0МЗ претендира за СрслСТЗа, КОНТО ИЖТ Три αάβάΟΪΚ, както а за използуване На тези с^лстш като усилватели на сигнал да и» следвай вя за хаорилизнраяа на н/клсянава хаса.ова» Урвата област е допълнителни към ежааантова олигонуоео®иша последователност, втората област в пригодна да ^нкнионира като промотер за елин бактеряалеи зависила от ДЖ ШС-волямеразаа ензимна

L активност и третита област е пригожа да функционира като тръявкрийцясяен шаблон за псдиаеразяата алтавяост··

Ьрстслк/ДМ хибраляи модели се взаодзуваг като средство при язсдспвааиА за хисрддиздране па нуклеинова киселина, легато вротевявата «олекула ^нкцианира като беднзая ладпоневт (ш^ж/9^·

Црст-гаи/ДшС х^брижи шд^куди се дзаолзуват съшо кат© средства при й^ноизс^лйиНйл· а co илксза едно радиоактивно белязано оредстьс, йрслстидняьащ© д^зтейн и коьалентно свързан радиоактивен олчгонуклестид. «шисактивната аоловина се използува дз показва наличността да протри новата полоьйна при ежо биологично изследване· в /4/ е вжлю^на и една дротенн/ЖС хибридна в конто яротопаната половина разпознава сшщЕфичяо ендн ашзенев претелв а подояината нумсицона киселина предлага реакция за белязаяе·

Шооздеяие да изобретението ална страна На изобретението е ислидептижо/п<шиц/клеот1щвохибридно ^злекулв© средство за тзпелзуване като усилвател eq откриваем сигнал при лжяогзследвания· При едно из^лнеяие полимеразнотз средство обхваща тгж области:

..............--4 (a) ежа първа област ( 0 kojito я и функцио- нира тато ·ι»φ»*σ.ηη специШчно познат anwren;

(¢) е*на втора обтаст fp) които е пта*?г поллдооксирибо^ чтаотип пгжгог?» та. ^наотов^ра като проттер за зави* сяна от МК ВД-пота^рчпта еш^та актавпегт; и (е) една трета област, чаято е да анно- или пвужнтева и е съседна на втората област, тя та че третата обтаст е в състояние да функционира капо жабппн «« прочотерч;^ активност та втор^^ област.

Второ в<лт₽*ане е е who полнпептид/пролияуклеотя^хиб^дне w молекулярно средство за прилагане като усилвател за открнвавм сигнал да и^ноизслежания* Това •йуптпмеряо средотпо* обхвата две области;

(а) една първа област която е яголипептип пригоден па функционида като антитяло, което се старина cnen^w к^л познат антиген; ф) една втора област обхтатада ’.шянствепост от * едно лентови плигонуклеотиж* nonaw^wnn, конта са пргтота^ 31 се свързват снепт^чно към етап лентови нос тепователяоетя яа нуклеинова a cejte^a; н х (е) срелствоза свъ^ваяе на първата и втората област·

Ши»?

друга страда яа изобретението е метод за попетлжаде на откр*ваем сигнал да ниунонз слепване чрез ярвзагане яа по та гадните средства, описан» по-горе. Този мето” обуват;

(а) и мобилизиране на антигенея аталит, директно иди индиректно върху твърд субстрат;

( ) директно пли индиректно свързване към анаотът първо молекулярно средство, збхва^ао:

(I) свързване на област U)$ (II) една втора област (В) която е двоено лентова МК последователност пригодна па функпж>нире като промотер за зависяца от ДНК НШ-полимеразва ензимна активност* и (III) една трета област (С)_а която е ияя едно- или да лентова и е ишша съседна на област д₉ така че третата област е ^встояиие да ^ шщюдира пате ьаблон за прааотеряата активност навтогата област* (е) отстраняване на несвързаното срепство* тран кри* пране па w,i«иглените килия на ГНК о ли го мери коитв са лежжптвлни наблагпата после лова телнсст с* на третата област С на срекството конструирано па пътя да завнеяда от Ж Ж^слпгтншяа активност* (е) количествено определяне на тржекрштитз.

Fpvra страна на изобретението е пр^ г<етоп *sa пожплване № откриваем сигнал при имуиотзе лепване чрез _Еа стямернтте соелетва описани по-тоое. Ттчч обуча··®_: (а) и^чзби^оярене по ^ректно илт 9«1Л|рекяго_в

BT-pXV WMW субстрат;

( ) оректно или ипитртк*но свързване кг/ аяалт ш тибряжо молекулярно оре устно, обхватно;

(I) еииа свъривяин област (а), която е по ли пести:п₉ приголед па Инкпионипа като антитяло, което се сггрзва спецриедо къ* интересиna^!wo ни антиген; и (II) елка втора област (И пбив^яла rRO.noстзггост от ®нолентови ЛИК олигоииклеотияни «rtt? с* cp^rom па се сеъозват cnenwf»nwo нкм епти белязана олттоиуллеотил* и (TTJ) вино спелстис за конгсям^пе и? г втоаСжт₉ (?) ТОТН,2 :-G. (С .,.Зц;-:Л‘С Cp220TLU|

d) Hi ;u лпил^тсзЕте з^гзнуклео- тпя^оито обхващат екна яуклеотеляа последователя ос т, която е по същество итямъеляа лотелпницзта послепавателност яц ¥ областта средство ^зг; гяя^ггте яа втората област;

(е ) отстранявене та превързания белязан олигонуклеотид;

(1) количествено определяне яа коли чествате па беляза- ния олигонуклеотил свърза як-ь» ср«гството.

Une пп-лдао приложение ни с елин зо пс^сулване на бЩКрвваем сигнал при конкуридае г^яоизоле^ьгше, коа»е обхваада;

(а) конструиране на хибридна жекула е която сижгсттта а е пели пепеп тил пригоден па Футренира като хаптен и тази област е кояхгиранв η^Η към В/С областта на пплг^рз^·.^ средство или към * областта на мул ти пернато средство;

(|) имобилизиране яа хибридната или индиректно върху твъря субстрат р? rmwiw ?.0№рзрад аналит;

(с) отстраняване на несвързаното сгелстно, « или

U) транскнибирнне на mw типляни гю ИШ шт.‘слря по пътя на зависяща от ЛИК |4Ж-®гол*мвгтна акт^пгррт ъ птертафицираве и количеенвено определяне на транскпнгтт'тс - тога и случай г че се използува полимеразно среяство} ил?

(е) хибрилизиране на жнолентсяи белялап^ зпигошюпотили къ· подел:

те на й областта, стстре>чя™*к.т белязано и опрелеляне количествено яя ΓΓ ν ^π·^ _това в случай че «флтимерното среяство с изпп-чч? ^.

Фигура 1А е схематиздо нрепетавяне яа п-τ' o^p.ctbg от мономерея пачи ме резен тип. J ’ ' · ·· 1^· Оу аюЮ 0.311аЧяи«Т вилаетите а малките букви .«яивчн^т г пдадерна буква означава по-ннет? нент? F з* дю / _и? илва яа цясяо)·

Областта А е едно антитяло, аосто разпознава жаенен епитоп^послелсватедност ф 3). 0б;лс1ТР ъ t .за Ш-п шзерма (послед* 17) № 3), (s-зс^. Ιί ^U:1C), (пзеле. Λ’Οι 11) (Γ>·^^.ύ, rj K). 'РСЛВГЗ-й VxXlOCfT с* с шиблоя зс

Ж-пож вазата. Средството es,4W- ,.® чотз егполентово. ааадада (аоелел. 1$ /У0:1) в крзя па обаастта С представлява рсйй-А свързва тел добавен ду появалява ачшотгаявано. л/Т зоната yew а β Р области се ^усоа по збор да ?wе ли Пълва яядерпост на антитяло.

ЖУра 1В е Ж поглелспатзлнсст на ня?о тзц^шенис на подсилващото средство от пояж^зяея тия. Гкг данната област В се състои ат одяла пв.дата прочете^ на бажтеpwtar ТУ (5^4АаШЖА(ЛШ^ ихте даълйнтедни остатъка 5* и^-м рг-гура 1С е схематично предете вяна -.-^0 ч-пт^рмо зт ποΛΗβиеразея тип прохеилгашо средство, р л-^то л ’унхцжжира вато антитяло и лветявлентонятн област h г пблесяисти п- самоотгрунапг се.

оигура 1¾ . е схема течно представяне ть ’ТТ‘Г»а^’ порсллващв сре^тва моито областта а ьуиктг-оянра къта датдтпло и М областта е сьставева от жожестезеност на Повочеж са ваято разклонени така и сл^афтте «* тч?'.·**·?·· олт»р-п-:_;т..

фигура 2А е схематично ч\. г^-о^зелло· вателске система, вонил р»л^^ил^л п·_С7 полг дера· зен тен. дналитниет протеин е ннд^реятне ^бттузреап тда. субс*р&1 чрез коиглекспраие е ндне тг-до _? ^h (завяно) 2 —яргх-во е< .^_чя ^цдствож

НОСЯ п ..·’— г'·;,;' ; · _й.щ|а з₽тттлло).

.^гчра ifc е ехежтйшо вреяставяяе яа сантвпчева светела за хяоряошрп^оаяо одноазсжешию· лжамапл» щлтевя е вшгдактяо и^юилмзиран както нз-rope. карото антитяло («ц^автв-авалят) с. жошдексмрияо с х^орлпяа ай^^ло/под/пуялеотялйа «олекула,» която про^ит^ш хжшааь като онтвмвкш аянтяло и водвауоеотмзата ашздшш а шгм ивтежа кж адвя а* кукяеот^· гея 7'астак &ь аздала-щото ор«дстзо (в т^зи случай елво фжпмер» ас e_risc!so)« й пзоаад изсж аь иието на Ж-яола«разии траяскрат като съо» ш^да ори и^нокзслалзане. Ue* iuto cam·· /’б^гиа&с, ^а:,тс аклгчаа сролстяо е ОфОризя, гТК*п^1Ш£.рг.аи се .< се ярадцщр^ *Ш*Т|жи триата (с) 10· . : .

^лио^/хис кж iu.a;.GimT2 (и loan и^следова· ;;· 7 J··.. е* с захва·

Ajv/Xlbu, L Слрху Т&ьрн C^uCTpafj ж αί, която

- с_гсдсм.м. Тс«ш и^чшвва пияярект· не - κυ^-Μ^^Ηά 'йз^сдваяа яа вкгвала .-асдс^Дчи. '*ж^? свнашва ивк&рв<ф»рам1№ беяаг легто X- с ««^лмЛувШайецедтен· ^ораецатя (-^стт л - Р) »'заидаую&й»«® up&ae^S» изПС’й^ар_: -i ...ύϋϊ аа шшоииа ва греося я/ш .^...ззхюццз; »:тйа^₄.г е -,и*'Ъ . ... w »' ..^-....--.4..

i :-.

*^тх_, \ . :. ;. ~,..4йл ·<**»* с<й>сваи«н аозазатая за всявата па 6aaxu4-cciii. .илсалс, iuwu « а^демкш авов·

Λ'-ϊ..-' 4·: е.’ .^;.-а *ib ·* а^йли&шИиЮ- яа СубвКТ

СГЛЛСИа yCfJZ..·. iaa отА^аааа иихнад нри ичунсизслев·

-1О •Зависяща от ДНК Ж-поли мвраза е еди» ензим, който улеснява поли Фризиран е то ва Ж до спевифичва последователност от допълнителен Ш шаблон.

«Област* в отделен участък върху биохимическата молекула, характеризирана по своята пункция.

Епитоп* е тази част от една ии^ногенна молекула, която се разпознае сн чно от и се комплексира със своето с ответяо антитяло ври едва имунологична реакция.

ша нуклеотид/пептидна хифилна· молекула обхваща както остатъци на нуклеинова киселина така и остатъци на а ми но киселини, всяка в отдat на фув кпионажа област на молекулата.

Имуноген е субстанция, която реагира по специгичев начин с « но антитяло.

Имунологиада реакция· е спец жичното разпознаване и свързване ва антитяло кж епитопа на един ицуноген.*Имуноизследване е елин метод за определяне наличността ва епитоп чрез комбиниране ва имунобиологична реакция със средство за откриване и количествено определяне ва реакпията.

•Цолилеоксирибонуклеотил· е една полимерна ЖС молекула· Полинуклеотил е ежа полимерна ЛНК таи РНК молекула.

•Промотер* е страната ва елин полилеоксирибонуклеотил, към който Ж-полимеразен ензим са свързва препаратор но за започване на траяскршцйя. а

Зависят! от Ж Ж-полиФраза!· е елин ензим, който улеснява поли.Фризацията на РНК със специфична последователност от елив допълнителен шаблон.

_ж ^с

Транскрипция· е процес, посредтввван от един ензим, , чрез ко*то Ж сеЬфорня от елин допълнителен полияуклеотилен шаблон.

^А ва

Горната лента· муЯвойно лентова ЖС молекула е лентата, чийто ^’-кра» е|от ляво като пое леловатежост Считано от ляво № дясно. Последователността на тази лента е представена винаги вал последователността за нежната допълнително долна лента, която се отбий * з* до 5* от ляво ва дясно·

Начита м изводуваяе м мобретевием 1-Цолси»аив срелсда

А - Додшврмд свмема

Язва страна на това изобретение е Ж понсш ващо средство (отбелязвано като «полимеразяо средство), съдържащо три фувкционаляЩ области· Това средство се използува за повишаване на елин откриваем сигнал при иму неизследвания·

Първата област -А - фигура и* е елин подипептин, който функционира като антитяло със специфичност за избрания антиген· амино киселини или от нуклеияож киселини, т.е· елин разделяй участък, който по същество не взаимодействгва с активността на антитялото. Активността на антитялото може да е сяециФлчж за ел» епитоп ва самия а нали т; обаче при едно арелпочитаяо изпълнение антитялото е насочено към елин антигенен детерминант със специален имунсмвбин използуван при описаното по—поду изсдя (например анти-зайчи и^иог^булин 6 - вих фигура 2А). Както се придава анали тът контактува с едно специфично антитяло, излияека антитяло се отстранява подсилващите средство се оставя тогава да реагира със свързаното антитяло.

За предпочитане, аналигьт първо се и мобилизира върху твьрл субстрат за уресняване на последващите процедури на промиване. Това имобилизираве може да е директно (например биолога«яи препарати съдържащи аналите може да бъдат св^зани към нитроцелулозен рилтър! или индиректно (например едно специ^вно антитяло може” да бъде имобилизирано върху твърд субстрат и аналитът впоследствие да бъде свързан към имобилизираяо антитяло).

Втората област (В - Фигура 1л)обикновено ю ле 40 базови

-12двойки в дължина, за предпочитане 20 до 35 базови двойки, оше повече за препоръчване 30 до 35 базови двойки, е двоено лентова и функционира дато насочваш от Ж Ж(полинеравен проотер. Този промотер произхода обикновено от промотерната последователност на елин бактериален w, за предпочитане някои от гагите ТЗ, Т7 или за предпочитане от бактериофаг 17.. Този клас Ж(волимерава е слабо промотерно специфичен. Tf промотерът е характеризиран може би най-добре (фигура 1В). Ж последователностите от 17 17 промотера са познати и е изведена обща телност: (послелов. ^0t2) (виж /4/ и /5/). последователности з* към проютера върху допълнителната лента (с* сржмента, чийто з* край е съседе на 5* края на сегмента) служат като шаблон за транскрипция и транскрипция» на много мишенни последователности варирания може па бъде пригодена (фигура 1Ь) Само самия промотерея участък трнрябва да бъда нвойнолентов (виж /6/).

Удължавания на 5* края на помотера има слаб ефект върху транскрипцията. Жриивр, кри едно предпочитано изп^лненое в участъка се състои от обща последователност на 17 промотера плюс допълнителна ишхшшщш! фази дам общата поселедователност на 17 плазмили (могат да се получат от (М биохимидаля!) ло XX ограничително място (фигура 1В). Тези потаелователности ио?е да са или да не са въннни.

Третата област (С - фигура 14) е директно 3* към втората област и с* лентата на тази област служи като шаблон за областта В пром отера. Областта С е обикновено с дължина 30 до 80 нуклеотила, за предпочитане 35 до 50 нуклеотила и най-мнфв за предпочитане 4G до 45 нуклеотида. Тази област може да е или елини«во или двойно лентова, з* края на с* шаблонната лента (директно съседна към промотера) $ обикновено цитозинов остатък и следователно 5* края на горната лента е обикновено гваявзинов остатък.

транскрипционният предмт (е) на С областта функционира нато съобщителна молекула за наличността и водачеството на ашЛя <Wi& 3). ицдсидвайе на сигнала се явява защото всеки шаблон аролуцира ю¹ до ю⁴ траяскрипти. Послевователнастта та тазн област е означена със случайна последователност чрез комтерея1 анализ на кръстосана реакция с други средство в системна·

Последователността на областта с е предназначена за специфична схема за откриване и няколко такива схеш жж_е да бъдат използувани за кавичестзеяо определяне на трая скриптите. Например, транскриоционняят продукт (е) на С областта моке да бъде подразделен на две подобласти ( с^и с₂ (фигура 3). Подобластта β_χ е допълнитлна към трааакриптно захващащо средство, което е имобилизирано върху твърд субстрат. Подобластта с₂ е допълнителна към ещ0 белязана средство. Свел кирилизиране количеството на задържания белег е линейно пропорционален на количеството на аналит наличен в изходния пробен образец.

При едно друго изп&лнение трааскрипта на С областта нае само една е* подобласт. С областта е транскрибирана в присъствието на белязан^ рибонукдеотилни трифосфати и белязаният транскрипт е впоследствие свързан към имобилизирано транскриптно захмдащо срежело чрез своята с^ подобласт и количествено шуе делено»

При още по-друго изпълнение транскрипта на С обжет има само едва с₂ подобласт. С областта е транкрибярана в присъствието на биотинилирани рибощклеази и транскриптите са захваната в авидинови легла. Тогава траяскриптьт се отгрява де белязано среисио чрез своята допълизтелва с₂ подайте и се определя моличествено.

Възможни оа няколко други методи за белязане и откриване

-14на транкрипти на аоли—iwm срелетва_#|ключително едновременно използуване яа белязани рибонуклеот 7 да авидин/бустово свързване и те се яви» за епециалвстатс s тази област·

Ь в С лблюстоте да под? мразят средства маге, до Ъш? поау^ чени яре» опни^яе, езджтгчно свързване, хиочесо методи за кръстосано съе.пиняване, директен химическа синтез или номинация от тези. Котето се подуша чрез клониране, нуклеиновата кисела последователност, която кодира пялата област или фрагменти от нея може да бъде едно- или двулентова и да бъде офортна чрез обикновените процедури зе клспиране

В областта е дво*яо лентова , а С областта шше па е иди елнолеитова или дну лентова, Двоено лентови области могат да бъдат получавани при два начина: лентите могат да бъдат клояирани отделно и впоследствие да бъдат хибридизирани гж жителят ленти $ иди алтернативно, средството може да бъда клонирано като елини «и лентово и самоотгряти иоонукдеото (жшртжр с*» ^с ί % *°^зи случай се добавят че^ри де десет допълнителни нуклеотида, за предпочитане 5 по 7 нуклеотипа се добавят км една последовател» нает като раздалечител между с ι е’ за да се позволи правилно контуриране на двулентовата зона когато тя се самоотгрява. Ваздалечителят е обикновено поли-А, но може да бъде моди(Шпи|Вн до свеждане до мимицум хибрипизационна кръстосана реактивност между различни средства при изследването.

а областта може да бъде кон «тира на дам В/С областта чрез междинно поставени свързващи средства като нуклеинова киселина., амво киселина, карбохипрат иди полиодни мостове или чрез кръсмооюв свързващи елементи. Е/С областта може да бъде синтетизирава е 5* остатък от нуклеинова киселина която е била подучена като произволно да има една функционална група която предлага свързващо място за а областта или остатъкът може да бъде производно след като олигсжукле отидат е бил сиятетизнрая да създаван е па такова място. Ьлна предпочитана процедура за химическо кръстосано свързване е да се включи един ή(⁴ мо^^цираЗпитозин база към 5*края на позинуклеотиж, както е стлано в Е.Р.А. тб акация 89 0225807.

При едно ода по-предаочитаяо изпълнение конлгирадато ш ус областта в ЖС rsm А областта антитяло мода та бъде извършено по надаш аналогичен е ензимното кояжравв· ЖС областта се синтетизира да сълърка алкиламиясва половина. Алкиламинът реагира с един хетеробНуякционалене свързващ елемент като сукпиимиллл 4-^леимило^тил далсжексе^ ( Зад). След колонно n₽^4Hcy®aHe_t ЛИК да 4кж реагира специфично със сулрхидрилйи функционалност», ада антитяло може да съдържа реактив® су^Шлрид (както в жяиупирая af‘ )₂ или може да бъде июдвфциран m съдържа влия еулрхидрил както когато е моли^яцирая с ^^^кцинпшцт з-пнрилилда тио)пропионат (Зй^) и тогава редуциран) · гъзискпо • директно ксйшгираяе ЛНК-аиия ктм ж тиюо-ашш с ^мобифуяквиов· реактиви, н® е типично по-трулнд за,контролиране.

Друга приложена на изобретението е едно Ж подсилва®) средство (отбелязано като wawmpBo средство*) сьл«1ж&шс две функционалвж области. А, която е същата като област А на поомеразнето средство, описано по-г* ре и ем?а втора (й - фигура 1¾ )_t която съдържа н.шсяко пзвт-ряж; водедиавда. Това средство, по дебне яа пелимеразното средство сбисаво по-горе, се също изплува за подсилване на сигнала при имуноизследзания.

Полияуклеотидът ва ίΑ областта мазе ж е даиеен или разклонен полимер от съшаяа повтаряща олигодуклеотидна подадпница или различна еднолеятова адигонуклеотидяа поданиница. Тези полелиници са пригодни да хибрижзнрат спецадчяо и стаблияо по ^днолеятеш нуклеотид предешвкявац ж «рре, тини«о елин белязан

-toили друг мудтямер. Тези ежеща нормално 15 до 5^ за прелочктвяе 15 дс so ^влоогйж в .ж.джува т глт €С съд&^нйз в обесвате от 40 πο во Ос^глт бре:' иуклеотидни едхндцп в цултимера са обикновено в сб?вата от з до 50, но обикновено 10 до ас. Сйигануклеоч^жпте едйитщг на иултимвра моно да са съвтавснн от М, ЖфИожфагтрамд нукдеажш уж ст во«бинанжи от тях.

Олггспукдсстйднитс петшпщв па цултииера моке да бъдат ксважнтяо свързани директно помежду си чрез фоо*одаестернк връзки или чрез ждяинно поставени свързват елемент* като нуклеинова киселина, а^яо киселина, карбохидрат иди пелиолнн шетове или чрез други кръстосано свързвали елементи, които са гютодни за к|ГстосаЕО свързване на нуклеиново кисели или молифвдираяи нукеиново κι сели ленти. Мястото (местата) на свързване ио.е да се в кранта да поледи вица и пр^ тля вержава з’ - 5’ сриентация или към едо или повече вуклествди в лутате.

При линейните отделните поделянипи са свързали край къ« край за оформяне на лаяеен полияер· При елин тип разклонен н^дтй^р три или повече очигонуклеотидни егтювд^издират от едва точка яа произход за вмйр*>.я$ на разклонена етЯ’^турй· Точката яа произход може да е друга олигедклеотидаа поделиаяда или една функционална молекула жъз която мале да са ковадентво свързан? иай-5ажото три еоници. При елия друг тип, има елин нуклеотилен гръбнак на подвижницата е една ол посече лопьлнитекнн олигонукдеотпляв полелиявд. Тези т^п ^лтижри са «подобни на вил жа, «подобни да гребен» по структура, ропъ.жи те дните единици ⁰³ нормално зависяши от един моо>даиран яукдеотил или друга органична пжовйва имаща подходящи ;унационални групи към които одигонукдеотилите могат ла бъдат коя «тира ни или приказни по друг на чия -век г игура 1^·

Мулт^мерът може да бъде изцяло линеен, изцяло разклон® или ла е комбинация от линейна и разклонена част· За предпочитане иж на^-малкото две точки на разклонение в и^дтииера, повече за предпочитане най-малкото 15 и за прещочитане 15 до 50. ^лтимерьт може да включва ели или повече сегменти на двойнолеятови последователности.

Област М може да бъде приготвена чрез клонираяе (ако е лниеЗна), ензиетично свързване, химическо кръстосано свързване,директен хи № че ски синтез или комбинация от тези. Тези методи на синтез са кипяло включени в Интернационална патент пуб. й? 89/03891, 5 май, 1989 г дина. Ь случая с линейни мулт^мери, приготвени чрез клониране, последователностите на нуклеинови киселини които кодират пелия ^лтимер ми Фрагмента от него може да бъде орорменфз единично или двойно лентова форма чрез обикновените процедури на клониране. Когато са изработва в двойно навита :орш, мултимерите/ фрагмент» еса крайно ленатурирани за да лалат епнолантови мултаме^ж/фрагменти. мултимерв могат ла бъдат клонирани в ® нолентова фо. при използуване на обикновени еднодеятови фагови вектори като M3, фрагменти могат да бъдат свързани шзиштично или химически ла орормят областта в нултимер. Когато се свързват ензиматачно отделните единици се лигарат с ежаж лигава, като ДНК или иж лигаза, какъвто ажше ла е случая. Когато се получават чрез хи^чески кръстосано сврзвоне, отделните елинипи може да бъдат син тетижирани с ежа или повече нуклеинови киселини, които са били изведени па имат :унационални групи, които предлагат свързващи места или па са изведени след като олигонуклеотильт е синтетизиран да лале такива шета. Up® почитана процедура за кръстосано свързване е па се включи Л^⁴-жшифтирана цитозинова база в нуклеотяж, както е описано в к,р,а· ^25,807, изводите от койте са включени тук.

-18Кожато се приготвя чрез директен химически синтез, ол^гонукле отиди те съставящи изведени нуклеинови киселини ити еквивалентни жагоруякционални молекули, чии то функционални групи са блокирани, може да бъдат получавани чрез обикновени методики за синтез на шшгонуое отиди» Функционалните групи са отблбкирани и олигонуклео— тилните единици за синтезирани от отблокиран» места·

Една генерична структура за иолекудите, използувани за получаване на точки на разклоняване в ^/лтдагер^те е както средва:

(1) У където ίζ е една органична половина, за прецпсчг тане н» клепиовд киселина, Д¹ е хидроксилна защитна група, които /ложе да бъде отстранена при условия, които не отстраняват синтетичната нуклеинова киселина от твъпдата фаза и не отстраняват екзсш^ичния азот или фосфатните защитни групи, X е една съдържа ф_3сда жрупа, която улеснява синтезатя на нуклеинова киселина като защитна фосфорамилитна, Фосфатна или росронатна група, У е радикал произ“W от една пуклеофилна група като а,дао, хидроксил, сулфхидрид заситен фосфат и В? ⁸ ^или една блокираща иди защитна група, която може да бъде отстранена и наместена е азот без засягане на р¹ · В молекулите, използувани за получавене па разклонени или подобни на вилица клонове, ^и β² са еднакви; додаде в молекули използувани за получаване на подобно на гребен»» разклоняване е блокираща група, която е сеабилна при наличност на fj деблокиращ режт®. Фигура 4 илюстрира схештично дзполвувжте процедури за интетизиране на цултимери и^щ подобно на грабел раз-» клонения, подобни на вилица р® клонения иди ко^инатдш от тях·

Маст А от фигура 4 представя обикновената схема за ояигонуклеотяден синтез за получаване на линеен ол^генудлеотвд, к.то авто«тизиран фосфорамшпигеи (та /7/. Ьжияг йдок представя твърда опора. представя един вуклеатид и р·^^ (Κ_χ а еквивалектеи на t¹ пс-лояу), «^^биквовелс нукяеотвдне произвожо, ишко подходящи защитна хрупи.

«©т В показва прсцадураяа за п-лу^вяве на подобен ва гребен

4/дти^р. Съединението ο -ty- 0^ ί ϋ I «2 представлява тщжирана база на хорала (2) ко-дслу. дина оли.’•у-зрна чгнняда е желана големина и последователност се епитетазвра и остава върху опората. Вина вля повече ^-мошНжирани питезинев» баня с вклю*®8т тогава в веригата чрез споменачмта автештична процедура. За предпочитане^ ждифипираната база има Формулата s Н

което е нуклео ил иато -0-, - р*_а ^о₄· и

U

I ·

ОС · , te е блокиращ или защитна група като двметокситрятл или ттеил, който е обикновено базово стабилен и чувствителеяп на киселина, е водород ^?ли метял, е блокираща илз защитна rpvna, която нохв да бъде отстранена и заместена с водород без да се засяга като —20—

е росфоралогят или ψνοψορβο производао кието позволява досй»ш«*0 в* H>iUiOTW <ьм 5* ттяцпята на ежа олигояукреотюяа ьерйХч» ос вр&ж.

Г X 3 ТТсадзатбЛ ца дцмичвссил сгнтаз, шпртжр е ига ^осфолиестер, етнл, вопорсг, брои, *ог нлт ятор

т.л.

я обувате t ж 8 вклг^теляо· Кога то е вклюяьяа швече от ежа ;ш»«мр*ра!1а ада те оа за npeimowrane разлал®чс_;р^ трез йетгжнпс· бзз* рън ворвгата, яа^-жого за прежочитене ежч ТТелиаер» лажжлтедп? ои^гстглтлеот:!^!: чехе аа бпж? вкя.ючип в грьбнаац, иоадшхшо от датьж1_;-’телн иоли^яЦЙ^НИ ОаЗУ й ?.а

ЦуиДйО ^иШаТа Г^уШ ТОГсЛа CO ЛЙШВи ОТ ЗЙЦИШ (8 OTCTpS

-nнено) и се създават олигонуклее.тщшй единици чрез автоматизира* рата процедура. Остатъчните сруш- в края на веригата се отстраняват в разклонил холобен яа гребен* отлепва от старата» лет С от }*гура 4 представя облата процедура за получаване на ’’’подобни яа вилица* мултенори· Отново, едва олигомеряа единица с желана големина и последователност се евдтетмзйра чрез обикнвожяите методики и се оставя върху опората. Една бдолиоана, бтиункпионална сълъркана Фосtop групв преде» сена като Хг в част С, както и елек блокиран фосфорамндит се включва тогава ьъв веригата чрез автоматизираната процедура. Uperпортали бг ункциона на съдържаща фосфор групи са блокирани Фосфора^вати с fоракула к - 0 - (¾

Н С - j - Г t\ - 0 и ω·<

Кепето 1< е спсмената» то^окстлнц зоажш група, Р е мзопропил и Ηί’ е метил ичк бета-пшн^еТЕл. Посечи'за препоръчване е J й R¹ е ;*лтернзтп?ЕС, ц^тззиноьа база, калето # » (mnr~^p J ЕТ) п,_ъ.-с -а с:;:о изиша^^ано.

Явете зьтитпя vpynr стст^’^ат и иилучават лопълндтолнг ο·ΐΓΓΰΗ7&.”δθτί**Ήκ> е фгющц от тях автожгвзвравата преп^дура. Остятъ^Едте се отстраняват и вили шият нулти** мф се отлепва от спорта.

'Дстп 7} ^г Ь‘ ί^-ьоставят ирецигура, при които два или повече двезтляч»? vv лтдйзра, ·υαΑύθΗπ аа |1ρόό*Η” «ултимера иди комбина* пит от тгх си спетенч засляс е,ил.·,лтично или хишчески» Обикновено ДЗУ ВИЛИ ЧНП Н/И-иЯ *’П0Д0б2’1 П« 7>«υ«Η· ЦУЛУкМерИ С8 долу шмд у И^КТО по-гзр? п Ct· οτοτ^ιαπ^ατ от апарата. Тогава те се комбинират в йзгхолзушики ензи шкшли иди химически процедури на свързване, е описано гз-гсре.

’аст ₽ показва проце.зд^ за сиятетизярсне на жожествея «жодобгя и* гребен йулт”мер, Ш?. процеп ра е зариац^ от процедура® посочена а част В и вклк.-кза вграждано ва моди^пиряш! бази в за· едездата странжчна верига к генерздае аа вторична оотонувлео· тзда странични верига от тях.

Подходящи свързващи молекули мс^ да бъдат вградени в мултимери но предварително определени места за цедите на анализиране на структурата на цултилвра тж като средство sa освобождаване на предварително определени сегмент* (като частите от ^лтжмвра, жжХж който свързва към белязаните олигоиуглеотют)· След мулти^ряа® синтеза и пречистване тези свързватзлт може да бътат разцеоеяи следи Ьичяо без допълнително разрушаване за нуклеотетна® структура за мултимера. Предпочитан тип на свързваща излекува се определя Ди съдържа една 2-молна група (която жже та бьце отцепена селективно чрез периодати) както и една защитена хидроксилна и произхождаща от рооаюра^дит хидроксилна група зо позволяваж свьрззателят да бъде вграден във всеки ЛШС фрагмент чрез стаидартнг фосфарвммлижи химически обработки, ирелпечятаяо изграждане аа такъв свързвател е съединението: -v .

^с·^ Р ~^с^

—23— кълето^мТ и са както е посочено по-горе. Слел включвана в Ж фрагмент и цялостно премахване на защитата, съдържалият свь, звател фрагмент ама средата структ^: © ° )¾ 'Lc⁸’^^ соен “ ®^с0 ° ^{0 M} кьлето a 1¾ представляват подьрагменти ж ито може да ©а еднакви или раз ли «и. 1^вакцията на този фрагмент е натриев Тежат разцепва този фрагмент на следващите подфрагменти»

СН₃ 0 ⁰ /¾ 'βΗ,ΟΡ · * ^И/^С®” $ % 0 алтернативно, 1,2-диодам група може да бъла заместена със свързваща група която сълъри елин чувствителш на аламин свързвател, ежн чувствителен сулфон свързвател иди елин чувствителен към дисулфид свързвател· Такива свързващи групя могат да произхождат от обикновени кръстосано свързващи вещества, вой то се използуват като конктанти протеини за други съставки. Подобно, могат да се използуват защитни групи различни от

Функционалните страни на полимеразното средство може да бъдат комбинирани с мултимерна стржтура на средството чрез интетизиране на мултимерно средство, което има й област с полелиници обхващащи множество от промотер/ваблон (ί/С) области на полимеразното средство. Подобно н^цултимеките средства мултимедиите полелинипи могат па бъдат или свързваща насока или разклонени молекули.

Подобно на поли неравните средства д областта на му лти мерните средства мо- е да бъдат конггирани в М областта чрез междини свързващи елементи като нуклеинова киселина, амино киселина, карбохидрат или полиоляи мостове или чрез други кръстосано свързващи елементи· М областта мо>е да бъде синтетизираяа е елин 5*-иукиеивово кисел остатък ко*то е произволно което да има функционална група, създаваща свързващо място за А областта или остатъкът може да е като произволно след като олигонуклеотилът е бил синтетизирав за получаване на такова много· Предпочитана процедура за химическо кръстосано свързване е включено в X ⁴-модефинирана цитозинова база в 5*-края на полинуклеотиж, както е описано ь.КА. публикация р 0225807 и в точка А по-горе·

XI - Ииуноизслелванжя

Хруга страна на изобретението използува подсилващо средство при имуноизслелвания за откриване и количествено определяне' на валижостта и концентрацията № имунологичен аналит. Тези подсилващи средства са от два класа: хибрижи средства включени в точка I по-горе (или полимеразни средства иди цултимеряи средства)> или полинуклеотидиите средства включени в /8/. Тези средства са еднакви с хибридните средства, но с А област съдържаща едва полинуклеотилна последователност а не елин полипетял· Анажтът може да е всеки известен и^ногея представляващ интерес. Анадитът може да е наличен в ниска концентрация в елин приготвен пробен образец или може да е по-шък вид в хетерогенна структура на биологически материал· лнадитьт може ж е наличен в различни източници, например биологически течности или тъкани, Хранителни материали, материали от околната среда и τ·η·, или може да бъде синтетизиран ин витро.

При елин пръв ход, пробният образец съдържащ анадитът се приготвя чрез всеки от различните методи, познати ва специалистите в тази област·

Подсилващи средства могат да бъдат използувани за откриване на анадат при голям бре! начини на и^нтмедване^ извършени ми в разтвор дда имобидизирани върху твърда Шза»^Е5ноизслелваяето се извърмва в разтвор, пробният образец съдържащ аналите е ида свързан към подсилващото средство директно, индиректно чрез едно ида повече антитела специфидаи за аналита ида ако се използува полияуклеотжпно средство във връзка с хибридна свързваща иолекула (разгледано в то «а и) ао-дслу). Подсилващи средства мшгат да бъдат използувани пс този начин при повечето начини за имужизслежше в разтвор» Ьиж например /9/.

При имунеизследване използуващо твърда ^аза, аналитът, ко«то може да е иди антиген ида антитяло, е или имобилизирам директно върху твърда фаза, индиректно чрез свързване на аналите към едно върха антитяло, което е първо било свързано към твърда фаза или чрез сандвичево изследване (фигура 2д) при което едно второ антитяло разрознава аналита и обратно се разпознава чрез първото антитяло свързано към твърдата фаза» ако аналитът трябва да бъда директно св-рзж к-м твърда ^за пробниат образец съдържаш аналите се поставя в хоятакт с нитроцелулозен филтър или с подобно средство на неселективно свързващ протеин, ако аналитът трябва да бъде директно и селективно свързан към една твърда фаза, едно първо антитяло, насочено към епитоп на аналита или към второ антитяло, се конюгира към твърдата фаза и в последствие се използува за свързване на аналита ида едно второ антитяло свързано към аналита* йшо допълнително антитяло, насочено към един втори епитоп на анали» може тогава да бъде използувано като свързвател между аналита и подсилващото средство» Подсилващото средство, или подамеразно средство или му лти мерно средство, чия» а област е насочена

-2Смм второ антитяло, може тогава да бъда кон^гираяо дам свързващо антитяло, офоржщо ивица състояла се от първото антитяло свързано дам твърда ’фаза, второ антитяло, аналита, едно свързващо антитяло, и дележ ващо то средство (тгда 2а)·

При едно друго приложение, подсилващото средство използувало тук е едно от поояуклеотадните ^лтвшрни средства разгледани в /ю/.

Тези средства се различават от сеьтид/нуклеотид хибридните ^лтпмерни средства при брзотс прилагане в тази област А по ол^гонуклеотидната последователност а не по функшти я като антитяло понипептж. Следователно един аятитяло/полипептил хибриден сиьрзвател трябва да бъде използуван за индиректно прикачване на ана кита дам подсилващата средство (фигура 2В). Тозе хибриден свързва тел има една първа обааст, която е подипептил, който функционира като антитяло специфично за епитоп на аналите или епитоп на антиляло, което разпознава аналите и едва втора област додалнвтелна дам нуклсотажата последователност аа А областта на подсилващото средство.

Подобно, при едно друго приложение, едно от полинуоеотидните политераз ни средства, посочено в /11/ може съдо да бъде използувано. Тези средства се различават от хибридните полимеразяи средства при бързото прилагане по това, че област А е палгнуклеатилна последователност, а не функционираш като антитяло полипептид. Тези средства също изискват използуването на хибриден свързвател, иакто е описано по-долу.

^з използуване на подиауклсотидаи подсилващи средства и хибриден свързва тел а не хифидно подсилващо средство описано в точка I по-горе, подсилващото средство може яа бъде универсален* реактив, използуваем както за х^бридизационни изследвания на бридни мултииервл средства, , *2?· нуклеинова киселина и за ит’иопзслсгваггя.

Црд едно предпочитано приложение, аналтт е индиректно имцбплпзиран върху твърда Феза, яапришр плочка от пеливинил хлорид е 16 кла венчета. При сачдвпчевсто изследване посочено на Фигура 2а, 50 михролитра от първото антитяло антиза^чо в концентрация ст 20 текрогсаш1/о в 0,3 тала натриев бик^боиат се поставят еър кладен че. <лап« чето се покрива и се иякубира 2 часа при стайна температура в влвява атмосфера. Тогава раствсрът се изсуква от кла вея чето. Кладеоето се прожва тогава два пъта с блокиращ буфер съдърка® з пропейте говежди серум в бл^лериран с фосфат зоологически разтвор съдържат о,2 процента натриев а зил. След том клаяввчето се иикубира е блокиран буфер за зо минути пр» ст^на температура във влажна атяосфере ттогава се продава два ггти още с блокирал буфер, микролитра от второто антитяло (за^чи-анта аналит, следователно при концентрация от 20 мякраграма/милюттър се добавят към кла ден чето и се повтаря процедурата, слисана по-Г‘ре· Приготвя се следваща серия от разреждания в блокиращ буцер на аналита. 50 «крапитра от всяко разреждане се добавят към едно кладевче. Плочката се покрива и се инкубира за 2 часа при стегна тежература във влажна атмосфера. След това инкубиране кладенчетата ct продават четарк пъти с блокиращ dy iep. Третото антитяло (дапиантааналит) се добавя след това по същия начин, последвано от добавянето на хибридна подсилвало средство.Тъй като случайни тъканнт препарати може да съдържат анти-Ш антитела, използуваният буфер за прожването, ко*то следва добавянето на средството също съдържа 20 ^!.дц?рог;_?ама/милилитър ЛЕК от сперш яа пъстърва.

когато се използуват нуклестадни подсилвам средства или хиедна стъпка на хибрипизиране на я- пуядеипова киселина слсппз слсп. к степен рая е то яа аяалита v антителата. Обикновено, условията яа хдбрпдпзпраие се състоят от водна среда, йт^плално буферлрана водна среда, която включва различни добавяй. Тези добавят» даже да шс^чва^подлнуаде^ конто не бъдат хпбржпзпрапп, соли, например натриев цитра^ 0,017 до 0,17 мола плй яатр^ез хлорид о,17 до 1,7 шла, яе-^оянп wpгентн жото i>40 или Хритан >100 (0,1 до ι,ο пропента), конто не вза-’аде*етвуват с ко^дакса ачтпгбя/антитяло и поседя нуклеинови кпсолпнп. Сместа се инкубнрв 15 Д 75 МИНУТИ при 25 до 35°В.

ако използуваните деловия за х^дрижд пране на белязания олиго* нуклеотил до м^лтжчврни подеяипжи причинява нестабилност яа комплекепте аятиген/вятетяло, ходът на хпбрзднзираяе меже да г^де препхжхпав от трвтяраде па комплекса е протеинов напречен свързва* тел яете глутар алдехид или подобен метод за стабилизиране на кодекса. След като ведяаж портеиновият кошлекс е стебилизиран, условията за хифидизпраае на нуклеинова киселина може да бъдат променени да вотяват ncfi прсщент|[, неведни разтворители

А като .пиметилформа^ш, жгаяисудфокстд и форжмид и тежературя до 70°С.

Взжяо е да се наи&ят условията за хибриди вира яе да нуклепвввн кисел^н· за подържане стабилността на кожлексите йптигея/г-ятитяле· Наприжр, хзбридизжранетс на по-къся пътеки от телят последователности ^оже та се извърши при по-ниски тежеротури. При едно предпочитано изпълнение, допълнителните едиолентеви уча· стъпи се 12 по so бази, ррт едно врежочнтеяо изпълнение ttaneрат^рата яа хибрипязиране е 35 до 45°С. Освен това, тъ» като <^мо еднолен_ТоВЙ с-дигенукл*отиди налични при този хоп са допълнителен ленти, жже де бъде толерирана пс-виссж стргзст и слегсвателно по-ниска концентрация на сол (с,з мола натрил).

- адлтимерно средство ако се използува мултимерно средство се лобавябелязан олигонуоеотил ко^о е по светва дап?л1Ййи№ повтарящия се нуклеотпт яаЬ областта при условия конто позволяват топ яа хибридвзира до допълнителни одетонуклеотявня еди.яяци на л^лтийера.ревултиращия* ПЪрда фаза комплекс белязана нуклеинова киселина се сепарира тогава от из лишена комплекс белязана нуклеинова киселина чрез промиване за отстраняване на несвързания белязан олигонуклеотид и се отчита.

Подсилването може да бъде повишено чрез изподаувнето на повече от един вил мултимвр (както се определя чрез мхххиюцшжш полеливината последователност) при изследването· В такива случаи се предвижва втори цултимер за свързване ва повторната последователност на първия мултимер и коаслексът се бележи след това с един одагонуклеотил, кг* то е по същество допълнителен към повторната последователност на втория цултимср. Всякакъв брон мити мери мо^е да бъда свързан в серия по този начин за постигане на носило подсилване.

- йодимеразво средство

Ако се използува пъди изразно средство се продупира Ж полимераза специфична за промотерния участък (област В) на подсилващото средство като се лобавя при подходящи условия на транскрипция и му видени копия (с) на С областта шаблон (е*)· Количеството на транскрипт е пропорционално на количеството на аналите в изходаия препарат.

Условията за транскрипция се състоят във волна орела зя предпочитане буферирава всява среда с подходящи соли включващи обикновено магнезиева сол £аТР_# |СТг· елин ИЖ поли изразен ензим и включед обикновено различни лен-ту пирати елементи, пратуинни и сители и ивхибитори на рибонуклеаза. Инк^бирането е обикновено за 15 ло 90 минути, обикновено 60 минути и при

-30теижратура, моята t оптжйшш за избрания ензим, обикновено 5 ДО 42°С, ОООКН ЯКЙО 37°С.

хйсмедбзат&лностш на С областта е проектирана оа спвпмШм за откривана и а^алке такива сх^мп жже па бъдат използуиаяи за количествено определяй© за транскрЕПтате. Например, транскридвиопчият пркюо (с) на С областта мсде ш бъде подразтеле« на две подобласти - с^ и % (фигура 2В). Подобластта с^ ф допълнителна към едно тдаскриптно захващаш© средство, което е и мобилизирано върху твърд субстрат. Подобласт с_п е допълнителна към е*яо белязано средство. СЛад хибридизирже количеството на * задържан белег е линейно пропорционално на количеството на аналит наличен в изходния пробен образец.

При едно друго изпълнение траискриптът на С областта има само една с, подобласт. С областта е транскрибирана при наличност не белязани рибснудлеотидии три; ©арати и белязаният ^аскрипт е впоследствие свързан към едно белязано траяскриптяо захващащо средство чрез своята допълнителна ο_χ подобласт и е определено количествено.

При ояе до-друго изпълнение транкриптът на С областта има case с^ подобласт. Областта С е траяскрибирада при наличността ♦е» не биотминирани ребшуклеииови трифос.ати и транкриптите са обхванати в анилинови легла. Тогава траяскриптът се отгрява до белязано средство чрез неговата допълнителна подобласт е_о и се определя количествено.

Възможни са няколко други методи за белязане и откртеане на траяскмоти на подсялвагю средство, шд^гтелЕО едновременното използув-ие яа белязани рибовуклеотиди и купжиране авилин/биотин и те са явно позкати на сгеп^алпетите в тези област.

Твърдата Шза, която се използува при изследването може дй/ взиш участие да бъда гъ· рда повърхнина върху е се яд от различните контейнери, наприкер Цснтрп;ужни епруветки, колони, хлаленна Ь!ИАрйТЕТ>адС2НК ПЛС'ЯГ, '^П7^₉ Трдб* Т T.H. $8 ПрвДПОwiuae се използуват с големя»» в обхвата от около 0,4 ле 200 окрона, по-сбичл“пй от 0,3 ло 4,с жреяа. петиците могат га бъдат всеИи обикн-ве?^ материал, например л^текс или стъкло· Първото антитяло специфично за аналите или за еж второ антитяло г..ето е спвпвФичяо за авалита, <же па бъде стабилно прикрепено твърват® повърхнина чрез мнкппоналнй групи по известните пропейтри.

Беледеотте средства, ако се използуват пслвжразнг средства включват последователности допълнителни към с„ «пхклхшжхжхмх •W ж тр««скриптите на подсзджжото сродство exwdeskhx се използуват мултимерни средства., вМйчвато белязани средства с последовател* * ст? допълнителна към повтаряните се ежнхда вд В областта.

Белсеното средство ще включва сжь яли повече молекули (’белези*), * и то директно ? ли индиректно създава» откриваем сигнал· Белегът може та е свързан към отделни членове на допълнителната посяедозателност »« тяе да се налижи като терминален член или тврмик^ляв опашка, имаща голям брой белези, в литературана са съобщени различни средства за създаване на белези свързани към последователността. Например виж , риж /ц/, /12/, /13/, /14/, /15/, /16/ л /17/. Белезите могат да бъдат свързани или ковадертно или пх ге-когалентно към доим »ит® ната последователност. Белези, които могат да бъдат използувани включват рапионуклили, .луореспенти, жиодумзниспептж, багрила, еязими, субстрати, еняижо ло актор, ензимни чнхибиторн, ензижи подединипи, метали «опи У Други подобни. Илюстративно, спеии^чни белези включват ллуоре· (жеия, родени», Текс^ско чернено, шковрвтряи, умбеляферон, лумнал /( фш, галактозилаза. конска епична рероксияаза и т.н· 1яж /12/ за сравняване на методите за радиоизатолио белязано.

I —32—

Ьележещите средства могат да бьжт ковалентяо приготвени чрез хию!чески синтез, жито този описан в /16/.

^з снабдяване с терминална група, която има благоприятна у|ркпионалност, различни белези могат да бъдат обединени по функционалност. Така може да се създаде карбокси, тиол, амин, хидрати или друга Функционалност, към които различните белези могат да бъдат свързани без разрушително влияещи дуадекси. Както вече беше посочено, може да ида молекула с едожественост белези свързани к^ една последоватекнбст, допълнителна към бележещата последователност. От друга страна може да ида еган лиганл свързан към бележещата последователност и използуване на белязан рецептор за свързване към лиганла за получаване на белязан аналитея комплекс.

Ь зависимост от естеството на бея era могат да бъдат изоазувани различни методики за откриване наличността на белега· ба флуоресцентни штериали са на разположение голям брой .луоросценатори. С ензими може да бъде създаден и определен или флуоресцентен или оцветен продукт чрез иуорометрия, спектрохотометрия или визуално· газлидайте белези, които се използуват при и муноиз следвания и метод яките използуваеда за и да мои зслепвания може да бъдат използувани при изследване на обекта· Процедурата, използуване при холовете за сепариране при изследването варира в зависимост от естеството на твърдее раза, за частици се изподвива пентрифугиране иди филтриране за сепариране на частиците, отстраняване на валстаящата течност или изолирането и. когато ct изследват ч частиците те се промиват основно от ежн до пет пъти с подходящ^ Сусреж съгърЕааа шнтрФкер йр с

Нога то срдатвоги з« сепариране е стича илг опора, нидстоужта течност може да оъдс лзежрели ели атстрапева s стени та да бъде прежда до иьцпл aumeh, както i ДОСОЧСЙб зи частиците.

йжорялните имшв&Ф средства от акстолжто в a cope тенис може съда да сс йздсдззват като средство за белязано на активен яи едво конкуриращ^ изуноазсдедане· Дра типзчдо озследване, излишен антитяло, за предпочитане пежшгонално менооонално, което се свързва сдециги-рш към аналгин, се яиобилизира върху твъро' раза, οΠ^κηογ^έο в ямчха с голял бро* аладенчете. Едва с^нгартна конгентра^я от белязан антиген се смесва със сервНнн р.;зрежжгля ча ггосбиия образец н кж з·^ ко*то сь ярема та съдържа количество _ «известно здожга от apsoL Отделните пезреипани® се излагат тогава па имебилизиоапете антитяло и 0¾ вмесва количеството № свързалия белег, пригодността на набелязания авалит та конкурира с белязания аяалит се използува за изчисляване количеството ва аяалчт в пробния образец.

Цр^ едно изполяенис епно Ь/С областна пплеяуклеотиич^ половина на полн^рззйото средство се коягг-ра към етан квйкирираз? и^уноген· Т&зи хибрида молекула се пзползуВз тогава Kite белязан антиген както е оп«®£о пояторе. Слей конкурярвтатео свъсзвапе, се добавя педимереза жг.?^.те зл пргмотера яа областта и трзпокриппнонннят продукт

При се изследва, както е «’.писано в ^.ч^. х(л) по-горе.

едно друго пзполнея^жа V.

област полтиикл^отетаа активяост®е подогпкз на ^зтт^орното средство с*. кснптра «π.** конкурираш ^ноген. 1Ъзи хибридна текила ос използува тогава κετο белязан антиген, с^саи по-гор?. След конкурентното свързване м областта се бе вели и се апоопехи количествено, както е описено пз-горе·

За имуноген, свързан към ЖЧ, χρίουν/’/нкпиоиалв” резктнвн като .«яза субстрат ), втален хлякол бмс(сукпин-им| (Ь4>5) ;:ля Жйизотпсцдинат Gxlc) са може би пмчгс-1-Зпй шл-одл зи свързвано, ошидото олисанате точка 1(a)

ПО-Гир£

Комплекти за извършване на подсилени иму неизследвания според изобретението съдържат в сбита комбинация слепващите реактиви: една триа фаза, кш*о е или пригодна да свързва антиген авалит или, от друга мра® има едно първо свървващо антитяло свързано® нея ако форма® ва изследване е такава при която авалтт е индиректно свързан към триата Фаза «фез свьрзане на първото антитяло или чрез второ антитяло, по избор свързвател второ и трето антияяло които са специ;и«и за аналите и едно хибридно свързващо средство, ако юрма® на изследване е такава, рри която подинуклеотилното подсилващо средство се използува или се използува подходяда насочвана от Ж Ж-подимераза и транскрипционни захвадащи средства, ако пслиивразното подсилващо средство бъде използувано и едно подходащо белязано средство. ^^{631 ί>eaκτивl,} са типично в о лелии контейнери в комплекта. Комплектът може също да включва хибрилизоционни буферн, разтвори за промиване, отрицателни и положителни контроли и писмени инструкции за извършване на изследването.

Следващите при Mt ри ва представени като илюстрации, ф като ограничения зс ноствящето изобретение. Лруги приложения в духа и обхвата на изобретението се подсказват от само себе си за специалистите в тази област.

Това изследване е проектирано за изпитеане директно за наличност на О-too антиген на вируса яа хепатит С. Общото провеждане яа това ицуноизследване е както е описано по-горе. Шкротитрациояяи плочки се приготвят при използуване на анти-ьишо като първо антитяло. Това антитяло се имобнитра в клажевчетача яа микротитрапионна плочка с 96 кладеячета. Второто антижяло е мило пояоклояално антитяло специфично за епитопа ва НСу^юо. Двоени разреждания серум от индивиди които трябва да бъдат изследвани

I

-35за HCv се приготвят в блокиращ буфер и се иякубират в микротитрациовиите кладен чета заедно с подходящи не-инфектирани контроли. Третото антитяло е коибияедия от поликлонални зайчиъантитала, които разпознават всеки от HCv антигените. Крайното антитяло е един хибрид 17 полимеразяо подсилващо средство. Полипептилната половина на обиаст а функционира като коньо-антазайчо антитяло и завършва нмуноизслелването сандвич.

След бодавяне на подимъразното средство, транскрипцията на област С се извършва чрез инку&ране яа комплекс» в 20 микролитра разтвор съдържащ 40 милимола тряс солна киселина, pH 8, 20 мили мола магнезиев лвухлорид, i милимол спермилин, ю жлимааа датиотретиол, о,15 мг/мл говежди серум албум, 1,25 милимела всеки otiaTP. tCTP, Y^TP, Z UJP. 1600 единади/милилитър Мкжки ГНКазин и 9000 елинщимйлилитър Т7 РНК пожимвраза. Тази смес се инкубира при ЗТ°С за 1 час. Транскрипцията е завършека чрез добавянето на 20 микролитра от елин разтвор съльрмиа В1 . 9 процента и цялата смес е пренесена в нови кладенчета съдържащи имобилизирано захващащо средство със с/ последователя оста. Захванатото от област С транскриптате (риг. 3) става чрез инкубиране при 55°С за 1 час последвано от две промивания с ο,ι Х^С ,ο,ι процент

Тогава транскриптате област С се бележат чрез добавяне на 50^^f белязано с ензим средство (средство с₂*) в 40 микролитра 4 χ 100 микрограма поли а за 15 минута при 55°С. Най-после комплексът се промива два пъта с о,1 Х^ЗС , о,1 процентови последвано от две промивания с ο,ι X

За откриване яа АР, се използува задействуваната с ензим диоксетаяова реакция (виж /19/ и /20/. Процедурата за откриване е както следва: за хода за белязане се добавя към всяко клаленче 20 микролитра Hi буфер с аР средството и кладенчетата се иякубират

-36при 55°С за is ®вути. Надстоящата течност се отстранява и кладенл * четата се прошват два ньли е 38 микролитра ο,ι X и i процент ЗЬS четата се промиват тогава два пъти с зво тсроллтра от ο,ι х за отстраняване на ве ка остатъчно Д& $. Лобавя се 20 микродитра з,з х ю⁴ 1к диоксетан в СШ буфер към всяко кладен че. Кладенчетата се разбъркват слабо така че реактивът ла палне на дъното и се разбърква слабо за разпределяне на реактива равномерно по дъното. Кладенчетата се покриват с капачето на мвкротитрашюнвата плочка и се инкубират при 37^SC за 1 час. Тогава кладенчетата се отчитат с лумияометър и се определят количествено по отношение на ежа стандартна крива, получена с познати количества на антиген.

4а НСУ £ Ui чиаш тротитрационните пло«и Са покриват най-напрел е HCv-ioo антиген от ви^са на хепатит С. Точно приля добавянето се приготвя разтвц р съдържащ покриващ буфер (50 мялимола натриев борат, pH 9»®), 31 ма за пложац в А (25 микрограма/кд, HCv-ioo (2,50 шкрохрама/ма). След размесване за пет минути се добавя 0,2 мд/кладеачеот разтвора към плочките, та сепокриват и се жкубират за два часа при 37°С, след кае то разтворът се отстранява чрез изсмукване. Кладеячетата се промиват два пъти с 0,4 мл промшвен буфер (ιοο ми ли кола натриев фосфат, рй 7.4, 14 мидимола натриев хлорид, ο,ι процента казиея, 1 пропенто (тегдо/обем) тритон X ιοο, ο,ι процента (тегло/зб®) хибитвн. След отстраняване на промивния разтвор се добавя 200 жкролитра/кладен че от Мосткот разтвор (ю миля мода натриев фоефат, рй 7,2, 150 мидимола натриев хлорид, ο,ι процента (тагло/обем)|азеин, троцент захароза и 2 милимола феяилметилеудфояил фдуорид (Р^₽), вложите се покриват хлабаво за предотвратяване на изпаряване и се оставят ти сти^т при (жгва температура α. i®®te. Тогава йлале «ти® си изсмукват за отстраняване на разтвора и се льснилизират за ежа нощ Osa разклаааве на за извършване ва и^яоизслевваяето ко «кралитра от талиите рорежтания ва серумни пробни образци или контроли се добавят към клапеячетата, съдържали Ли дакролитра от разредител за проб· вия образец Сюо иилвмала натри® ос:ат, pH 7,4, хсю мятала натри® хлорид, ι дали чел Л, -,1 процент (тегло/обем) натопя, ν,οι ерлцеат (та-ло/збем) хиоитьн, i пртввт (тегло/обии) тритон Χ·100, 100 да ipOA-aWMs ^rpQ «в екстракт· Шаяк»те са залепват и се иякубграт при 37°С на з часа след к^те разтворът се отстра· »<1» чрхз изсмукване и аладенче®® се продаат три пътя с лос лгкралвтра от пра-жля бу .ир (съжр&ш ΐ£ Ту вя 20)·

Слея добавянето па серумни про&и образни кд жячеш® се третират както в пример 1 шмгоре, с езкмгченпе ва това, че за^чнят*дат®нш1веш№1 серум се заше^ва е тр^то антитяло (зей да· аяти-ч1№йт).·

Иа>_;^<г $ · йаиа^р шЦ» At ur>.

.........Ж„.,

К в два® πρ/йера по-горе ^л^даршто срететоо «ме та бь.яе заместено е паг^разйЗ! средство· велчкнте ходове са същи® във вееш пример до побажяето яа подсилваш© средство· освен разб^ж се, че едно ттомерно средство се изяо^зтвй вп®сто полимеразяо средство. Сжя -^рзв^не то на подсилващото сроство <к добавя л и©'н затвор с SP{is_n от бш^за? олггокуОсвтия е с&жествена xoso i лжясете Урвата подепиянда на област® Това белязано с еязям средство се добавя в ои дакролитра 4 X · ΐϋ ммро· града)далилилр пиля к жъга np? 35^еС. №*после к-м· ®яект»т се np'wea два пътя с ),1 X „ ja откриване ва Af, с-.. използува з^ждотз-ваяа от ензим лиокеетяяова реакция (всж /27/ и /28/) получавана от ^мигеи Инк. Процедурата за откриване е както следва: За хода на белязано се долавя 20 мякролитра НМ буфер към аР средството към всж о кладен че и кладепчетета се нкубират при 55°С ва is «нутв. Надстаящятя Т; чясст се отстранява и кладенчетата се промиват два пъти с 80 шкролитра ο,ί I и о,1 процевта · Тогава кладенчетата с® промиват два пъти е 580 микролитра o,i хД^ по отстраняване яа всеки остатък · 20 микрони^» от 3,3 х ю⁴ мода янокеетан СМ буФер се добавя към всяко кла венче. Кл^ленчвт-та св почукват лека така че реактивът да падне на дъното и се разбива нежно за разпределяне на реактива равномерно по жноото. Кладенчовата се покриват е микротитрдаояната влоша луко и се инкубира при 37^вС ва един час. Тогава краденчетата св отчитат с дужноифър и се определят колчественс по отношение не стандартна крива получена с познати количества антиген.

Mtejp 4 - >^Ц^жад> iU

Във всеки от примерите 1 или 2 по-горе, полинуклеотияните полимвразни средства могат да бъдат за местене с хибридни полимеразяи средства. Ьсичкнте ходове са същите във всеки пример чак до добавянето на третото антитяло, което е комбинация от пеликлонални затш антитела които разпознават всеки от Ηϋν антигените. Това се последва от лобявьнето на 50 м^кролитра свързваща молекула в к нцентрация от 20 микрограма/милилитър в 2 мода натриев бикарбонат. Това внкубиране се извършва спорел същите правила както при преднините енк беряне н^^тетъло. Хибридната свързваща молекула има една първа област, която функционира като анти-ва^чо антитяло и свързва всички по-раяо свързан з^^« грети ит’’тула. Вториа област на хебридния свъпзвател е ол таяукцеотяд с 15 остатъка где луд вателности η ко^то са допълнителни къл област а на пйлнвуклеотидната полимеразяо средство. След инкбираяе и пропише се добавя ^олинеразяо средство в 50 иикряитра хибрв* лизационес 6$ лр зо^йвола яатри^в хлорид, о,1 прафнед, /jflMo в се иякубзра за so ш^тв при 50°С. Сжед лнкубир_;8е излишното средство се тстранява и комплаксЖт су прямевя тре п*те е хебри* дизациоиев буфер» Областта Ь ое транскрибира е транскрипцията се к личествен о* кикто е описано в премуо 1.

ППИ О|СВММЬяШТи He HCV

Tom ззедепвава е япелт^чяс с описалото в пример 4 до лоба*

BWB0 на полтуклеотижото средство. След тава хбрижзирането ва белега към пождияипите на област И е с^ото ваете в пряжр 3.

Подобен ва гребен полинуклеотид, имаш 15 занисчии странични вериги, всяка съдържаща три места (о<Ш 45 места) допълнителен към белязано средство и ежа тф миналва биотинова молекула, при* качена към грьйнака, се приготвя както е описано во-горе.

Чсшекли и^воз^обулия € при различни кошеятрацж се имобилизда върху твърда опора· Имобилизираният януваг^обулни 6 се мку« бира е биотинилиран адавтетяо пречистен кози аяти-човешки и^во* глобулин 8 (концентрация на 6bgt*h 40 яаяограма) и изди) явят аятисерум се отмива от опората· Тогава опората се инкубира с 200 наиограма авидвя-^ и тогава с ιοο-j^ или soof Hz от половия на гребен разклонен полинуклеотип, при подходящо проми* ВйНе. Тог^а опората се яякубира с пуроксипаза от конска рапица белязано нуклеотилно средство, допълнително към свързващите места (

на белязаното средство върху полияуклеотида. Отчитанията на оптическата врътност се извъраша при 492/520 нжометре.

за целите на сравняване се извършват лзелолвантл както по-горе при използуване на полинуклеотяг със само едно свързващо ьжето на белязаното средство.

·4υ·*

Мдишта по-долу представя резултатите от тези изпитвания:

коки, яа чсвешни		Штнческа	ПЛЪЗНОСТ
(нанограж/	45 ИИСТС	1	мист?-	45 място	1 жсто
мл)	П ' l-ί й.	по	ίΰ/η	ПО 100	по 104¾
100	1.116		0,С05	2,505	—...............—г................. ' 1 ......... , и 02
50	1, м89		0,002	0,564	0,02
25	0,452		0,001	0,295	G, 001
12,5	с,зсз		0, Cui	0,451	с

^:Штз е съобщено 45 място полияуклеотаг пражага много повясок сигнал отколкото единично ^сто пол^яуклеотид.

Fnyrn верираиня и приложния на различни падсижаз'яи средства, описани в това изобретение са явни за спепшалястите в тази област и са предвидени за са в обхвата на предложеното изобретение.

(1) иш (l) Цремагм, , g (II) ο^Χλχ;/£ Βά iMUbr^AjiiKblV: iU haaa Ba мтиТО^ШРи:^ B/UwaAHa й Й ШгИ &№.

Ha UluVl^* till) iru/ Ha ДО^аишШшидаТб: 12 (iv) <B) /диш: 545 ^acl ДйК^{7 200} (С)Грал: г^шю Парк (Л) Щат; Калифорния (ц) Страда: СаД <» -И?

(v)Orwaaa с <омиютер Форма:

(a) CTAiUH Will *лиШ ДШл |Ь) шмШГ&Г: IBM iC съгласувал (С) ГдЬеШ ШШт:

|Л)Софтуер1 Патент ί| 1.1, Beраня 1,25 (fl) ЦйГдшНЙ ДлНаИ dA итИлШШЙН:

iBW ЙЛ ВтИжВаО: ПС1/ 81/02925 (3) ДЛ Нл ПШЪлВаВН: 06 - mt - 1991 (С) K/uCMiUHiH:

(VII)) iteBRGMOW/areHT ж юрмапия:

(А) Име: .

(Е) ?егястрапво«ен номер: 21013 (С) Литература/ по^р яа списъка: 2300-0047.51 (IX) Ищоравдия за Телеком авкастя:

(д) Телегов: 415*327^250 (В) В^лефасз: 415-327-2952 (С) Телекс: 706141 (а) Характера стика яа после лователност:

(а) Дължина $ 7 базова двешжв (В) Ъш; яумежоза киселина (С) Кавитост: единична (Л Шология: линейна (I) С^усание ие последователност: Послелов· аАААА (?) о разпия за по елек»· ift /^0:2 (I) Жрактеристика на послоловетеляост (а) Дг»ЖЖ; 17 базови ДВОЙКИ (В) Т>П: нуклеинова киселвяа (С) Нам тост: ежяична (?) Топология: лжнепва (И) (Мисанке на пвследователлост: Послелов. I (2) Ияюршятк» за послейов. ή ^0:3:

(I) Характеристика -на иаслевователвост:

(А) Млжийа; 17 базови двойки (В) 1ИД: Нуклеинова кисалиж (С) Навитост» единична (Д) Тсигология: 4ияе*ва (XI) СМисалзе на п-сдбйовптежос$: поеделов. ‘jbUVX CCXiTIk (2) Инрор^щия за послеппв. ^014?

(I) Характеристика на последователност:

(а) Вляиаа: 32 базек: двопки (Ь) ΊΜ: нуклеинова крселина (С) Вдатаст; едшяява (?) ‘РШОЛОТЯЯ: ЛГНСйпй (XI) (ЖсаяЕе на последователност: нослелов· 4s λΙ^ΟΙΑΪΟ АаАНАаЖ ОШОШЖ В

И) & Сршоя 32 послелов» Q ^0s5s (1) Характер® стдаа на последователност:

(А) МЛОЯА: 32 базови

Ί^Π: Куоетаова киселя® (В) (С) Навитост: е 2тн пяна (Л) Топология: .Шейна (П) йжсднуе да поодада&атслва т_г ПоодблоБ. 4A):5s жжть^т стшш юяшш; а^ (2) Ил pop мания за погледа, Г/ //0:6:

(1) $а последователност:

(а) Дължина: 43 базови двапая (В) Тип: Нуклеинова киселина (С) Навитост: единична (П) Топология: линейка (HI Списание на аосльдов-телност: Ласледов: I 0:6 СТЖЬС ТЖ^Шими' nuiwica^t 1W (2) Инфоршция за послел. 1^ ^⁰ⁱⁱ⁵ⁱ (1) ^рактерист?ка н& последователност!

(а) йьжжш: 43 базови двойки (В) ’Ito.· цуК^бИлОВа АИсеЛИНВ (0) НагатОСГ; удинжчва (X) ItжЛОГИК: <&не*ш (XL) tSTF&tfm на ПОСЛС-лВ^аТелЯОСТ; Зоидсдов I 0:7:

Gfe-kGIWnC A^bTTlWC Жа^ЖС^С aAiXaCaTCT СОС (2) _3ί, noe/.t’® 5$ Λ 0:8:

(I) Характеристика яа последователността:

(и) Нъжяж: 10 бадода (£) Τ^Πί Нуклеинова киселина (С) Напитоет: «тениедв <ϋ) Топология: линейна (XI) Описание на последователност: Послелов. ^0:3:

аааааааА (2) Информация за послелов. X/ ^0:9 (1) Характеристика на последвателност:

(л) Дължина: 41 базови двойки (х>) Т?Ш Нуклеинова киселина (С) Тавитост: единична (Д) Топология: линейна (XI) Опгшнпе ва поете «w тели ос Т: После нов. ΐΛ гттгтттс 1ШЖхТ($ αλαϊ^αΪκΟ ШОТииШ Л )2) Информация за последователност >^0:1ϋ:

(I) Характериегида на постедояатеякост (Л) В»ЖНЯВ: 41 6:30 ВИ П0ОП_Лр (3)^0: Нуклеинова киселина (С) Навитот:

(Л) Топология: дпяе*на

-XI) Описание на после юватш яост: После лов. ^0:10:

СЖТьТШТТ ТСШтаа1сс кШааааала а

Н) ИнФоркнря за Послелов. I^J ifOilli (I) характеристика яа последователност:

(А) Лължива: 43 базови двойки (1)Тип: Нуклеинова киселина (С)навйтост: единиада (Д) Топология: линейна ϊύΒ^Ι' КЬЮ ΧΜϊώ V ^игура i: 1. разклонен мити^р; 2. Греженен мултимер дистда 2.1. -шротатраиизияо блтц з. «штн-азалит;

4. лптя-за^чи-впито -еяитоп-опал^т; лят* жуп-чолеидлзахо средство

6. лчти-мио свързва тел аягуда 3. 1. ан^тялс; 2. Простор, 3- колонна ле ята;

4. РНК политераза; S. Т^НСКРИПППЯ; 6. РНК трш СКрИПТИ;

7* тротиррациовяо блюдо; 8. захванат срежстзо;

9. Бележещо средство.

*%гура 4а. 1. йнейна синтетична Ж€; 2. В. Разклонена Ш(,

Гребенова структура.

Фигура 4г{. . 1. ^ожестж.®?. Л’'' ЛЖ^ λ (среа обвил разтвор)

2. сиързвател «зяолзу.аан за химическо яигираяе яа Т₄ яигааа лиш 4 е. Е. Вглична гребенова структура;

2. ^ядпяе свързва тел използуван за сьърззано на лигаза.

е cw г^ческс свързвана.

1. Czichos, J. et al. fcttvl.AciG Res. (1989) 17:1563

2. US Pataat λ 4,8'0»187

3. VO Oatbut X 4,737,454

4. S.P.A. K 154,884

5· Cdenaa and Oakla>, Proc. Mat· Aend. Sei. (1977), 74:4266

6. Milligan at *1. Xue. Acid· Pee. (1987) 15? 8783

8, US Serial M 403,022

9.US latent N 4,778,742

10· lutein,tload Рш*11и»11оа ” 89/13891

11. US Application M 463,022

12. Urdea at al. Hud· Axids Res. (1986) 16: 4937

13. Leary et «A., Prer. Met! Acad. Sei. (1983) 80:4045

14· Renz. and Kara, Kud. Acids Мез. (1984) 12:3435

15· Richardson and Gunport, Mud. Acids. Res. (1983) 1⁵ ? 51^

16. Snith et al., Nncl. Acids Res. I1985) 13:2339

17· Meinkoth and Wahl, Abai. Biochen. (1984) 138:207 ^8. E.F.A. Pub. 225907 ly. Schap et si. (1987), Lett 28:1159-1102

20. OS Patent 4,857,652

21. Scharp ·* «1·· (1987) Tet.Iett. 28:1159-1162

22« US Patnt 4,847,552

Claims (2)

1. /о лек ударно средство за използуване като усилвател на сигнала при ижу неизследвания, обхващаш:

(а) една първа област (л), която е полипептил и фуркциоцяра яате антитяло спацярично за познат аятиген| (I) една втора област (В), която е двулентов полияуклеип пригоден да функционира като промотер за зависяща от ЛЙК ЙЖ полимвразна ензимна активност; и (е) една трета област (С), която е или едно- или гвулентова навита и е съседна на втората област, така че третата област е в състояние ла функционира като шаблон за про модерна активност на втората област·

2. Средството от претенция 1, в което зависядата от ДНК ЙЖ-пол ме разна активност произхожда от бактериофага Т?· з Средството от претенция 1 или Скауте ртрората Област В е с дължина заД-юлкото ю и не повече от 40 яуклеотиж.

4· Средството от претенция 5 в което третата област С е наН(*мажкото зо и не повече от 70 нуклеотиж льлга.

5· Средството от претенция 2, характерна рашо се с това, че полимвразяата активност произхожда от бактериоига Т? и последователността за втората област В обхваща последователността:

5*-TU М €йС ТСаСЖВ-3* (опсрелов. I J /0:2)

3*-аТТ аТ8 СТС аСТ 6а Т аГ—5 х^ослелов. ά У 0:3)

е. Средството от претенция 2, характеризирало се с това че полимвразяата активност произхожда от бьктериофаж Т7 в който нуклеотиляата последователност на втората област В в:

s’-CW £СТ >Т (Ж АдТ ЪХ ШС 1U СЬ В-З* (последов.

> N^)· з’- «а£ €Ж АТ^ «СТ ТТа дТТ аТ6 СТ8 АвТ ваТ а>5* (последов· i/) /|/th5h

Средството от претенция 1, 2, 3, 4, 5, или 6 при

7.

коетс s* сстлгш-Т от лента че чуклеотвдвата последователност ни третата област С с съставна от яторета област В и е гвангзйь оь остатък,

8. СрСДОТВмТО от 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 в коек н^лсдоютвтяостта на третата област s:

5*<-ws лш да да да да ^ст ш im ш *ст «тс са

СТС аз’ После лов· 1^ ^01Р) /’-ССС да АСА ССА АСа <А Ш АГС «СТ ΤΪΑ Ш Са€ «СТ

Сй« 05» (после лов. ХЬ Л/0:7).

9, Средството от претенция а в моето з* щрая на горната леете ча ЛЖ нуклеодадаата последователност на втората област В е прикачена ssmJ* края на горната лента яа нукяеотпдаата последователност на областта С.

ю. Средството от претенция 1 в което транскриптът яа третата област С ит две псдобластт:

(а) ежа първа подобласт С_х, която е пригодна да хибрилиедра до едм я.ялеоталеи захващащ свързва тел, като захващащия свързвател е пригоден ^а хибрилизира де елин пелинуклеотид, гмобилпадая върху <върл субстрат; и (() едаа втора подобласт (¾. доят© е пригодна за се свързва щъ« вдай нуалеотиден белязан свързва тел, като белязаният свързвател е пригоден за се свързва към коочесзЕено определимо средство.

11. Средството от претенция 1 в моето една (упзиисяаляа еликида обхващата втората и третата области, В и С, са налични в мултишем реалтивяж. ежшш.

12. 7етод за подсилване яа едив откриващ сигнал при ицуноизследгаяето, която обхваща:

(а) директно или индиректно свързване к и елин аналит (_ащК{) биохимическо молекулярно средство, обхващащо една свърз- веща (·»/. овоаст (*0, която е лбоино лентова

ЛНК свод-ч довате^ост нрюгшша дц ^нкциоякра като прожтер за завт?71 ат .ns гЕ^пслимеразна еязижа активизет, н опна трета вота (С), както е И4Г с.снс- или двулентова % е съседна яа ο*Μ«?τ ) т§«а ю тотата област е пригсдяа да фснкппояйра като, в^дов за προν сирната активност яд втората ооласт;

(ζ) стстроняваче на несвързаното средство;

(с) транскчибоане Па цудтишшни копия на влагомери, к лтс са юпълйктеднй към шаблонната последователност, с\ яа третата област С на конструкцията на средството по пътя на рЖ-подимеразвате активност зависяща от ФЖ;

¢£) определяне количествено на HiK тра«скриптите;

13. ^стодьтс според претенция 12 при поето анадитът се имобилвзира най-напред директно вди индиректно върху твърд· субстрат.

14. жтежът според претенция 12 или 13 пр® което областта А е полвиептид пригоден да рункшюиира като аятитада и средството е свързано директно еди кнлириктяо кш авалитът чрез областта А.

15 жодът спсред претенция 12 или 13 в MOTTOS (а) областта А па средството е ежолентово навит одйгокуклеотад| к

ф) айаднтът е ннлйректно свързан към молекулярното средство по оътя яа пратеадпадинукдеотид0| хибриден свързвател с две области бозаели (X) една първа област която е еднолентова полинуклеотидаа послеловатедяост допялнзтедйа към последователността па областа д на средството;

(XI) едва втора област която фуякциовира като антитяло, слепи/ ично за ааалята или за един епятоп на антитяло, което е специфично за аналите.

if η «4 _йли |5 _ffDr КОЙТО вторзтя област f q* or ήΗΚ Ж-псли««рвза за бактеpar*ага Т?.

17. ^τοτ^τ според п^тенпдя хл, 13, 14, is или 18, прз XC^TG:

(а) третата област ύ на ерелотвото е транскрибирана при цалвччзот на белязанг рибануклеотмии трифосфагази} транскриптите яа третата област имат една първа подобласт С_±, пс^л ни челна ядно олигонукл е стилно захласа що средство, което е имобялизиранс към твъ^д субстрат} и (е) сп мвнаттте траяскрвптя се иайзбйдизпрет и определят количествено.

18· £тожт според претенция 12, 13, 14, 15 ИЛИ 16 в КСЙТО:

(а) третата област С г; първете средство е тра искри ли рана при вшлтФост па биотадияяранг рибенуклеотило 1осфа13зИ| (f) трннспринтът яа яретата облазт ишг едва пъ^ва подобласт е която е дог лнителна към ежа бехязаао олиговуклеотипно средства;

(с) транскриптате са имобоизкраяи върху авилияйлврая ТВЪРД субстрат; и |/) траяскрттттте са определят кодичестввйо·

19. Стопът спорел лретешия 12, is, 14, is или 16 при • КОЙТО?

(а) третата област С яа средството е тратзкрибираяа при яали«зстта както забелязана така и на биотижиирава нуклеотиша зештаза;

(έ) транскриптите се ииобилизират върху авидинидиран твърд субстрат; т (с) транскриптите с$ определят количествено.

20. Методът спорел претенция 12, 13, 14, 15 ида хе при който* (а) транскриптьт на третата област С на средството има две подобласти» (I) една първа подобласт <4 която е лопъляитеоахъм едно одигонуклеотждно захващащо средство, като захващащото средство е имобидизирано върху твърд субстрат; и (II) една вт ора подобласт с2, която е допълнителна към едно белязано нуклеотилно средство;

(^) транскриптьт е дабрилизиран към захващащото средство;

(с) белязаното средство е хибрилизирано към споменатата ,₽анс„_и (i) бедазаяото средство се определя количествено.

21. Методът спорел претенция 12 при които единицата съставяш втората и третата област( В и С, на първото средство са наличнив цултипдено повтарящи се t/C единици.

22. Модедалярно средство за използуване като усилвател на сиввад при ицуиоизслелваве, обхващащо:

(а) една първа област (А) обхващаща елин полипептил припада за фунжциаяираяр като антитяло, което се свързва спуцафично към известен анаягт; и (/) една sTjspa област W обхващаща «ожест^еност на елнодентови одагонуклеотилии аопелиници, които са пригодни да се свързват специфично към ежолентов^ашно кисела последователност, прелстн&^яваща интерес.

23. Средството от претенция 22, в което всяка олигонукреотипна единица на втората област, обхваща около 15 до зо бази и има С съдържание в обхвата от около 40 процента по около 50 процента.

24. Средството според претенцияШ42 в което молекулата има линейна структура.

25. средството според претенция 22 в което молекулата има разклонена структура.

26. Средството от претенция 82 коетовмв най-малкото една част от олиронуклеотндннте подединици на втората област са свързани по пътя на една многофункционална половина, произхождящя от съединение с рорцулата:

- U- К- X (1) при което <е органична половина, за предпочитане нуклеинова киселина, е хидроксилна защитна група която може да бъде отстранена при условия, които не отстраняват синтетична нуклеинова киселина от твърда фаза и не отстраняват екзоцикличея азот или тна защитна група, X е една съдържаща фосфор група, която упоява с нтезата на нуклеинова кисеят, У е радикал произхождаш от едва нуклео^лна група, и 0? е Pt или блокираща или защитна група, която може да бъде отстранена и заместена с водород без застане на

2?· Средството от претеяцяя 22, характеризиращо се с найдано^) една част на одигонуоеотидните подединици, свърза ни по пътя на една многофункционална половина от едно съединение с горилата: ^виж на следващата страница) вря което у е нуклеофил, е еж защитна група, която е обикновено газово стабилна и чувствителна към киселина, Р? е водород иди цетия, е защитна група, която може са бъде остранена и заместена с водород без засягане на Р⁵ е фосфорно произвожо което позволява добавянето на нуклеотили към 5* позицията на олигонуклеотелната верига по време на химическия синтез, е е метил, водород, йод, бром или флуор и X е показател от

1 до 8 включително.

28. Средството спорел претенция 22 вря което най-малкото едва част от обигонуклеоталии« единици са свързани во ньтя на една многофункционална половина, произхождаща от съединение с Форинт*

К-о-са, Н -С - 0 К- о - (¾ при което Р_хе споменатата хидроксилна задигна група.

е изонропил и 4 е метил или бета-цианоетил.

29. ълин метод за подсилване на откривяем сигнал, използу ва за откриване и за количес твсно оиредедже на антиген при ^ноизслелване, който обхваща» (а) директно или индиректно свързване към един аналит на биохимично молекулярно средство, обхващащо една свързваща оМаст (А) и ежа втора област (М), която обхваща множественост яа едаолентови ЛНК олигомерни подел пригодни за хибрилизиране към ежолентови белязани олигонуклеотипи?

) отстраняване на несвързано средство?

(е) хибрилизиране на ежолентови белязани нуклеотили, които обхващат една нуклеотипва последователност която е допъл нителна към попелияината послепователност на областта Μ средството, към подепиници на втората област?

(еЬ Зстраняване на небелязаните олитояуклестилй; и (е) количествено определяне количеството яа белязания олигонуклеотил свързан към средството* зо. Атолът според претенция 29 при който аналитът е първо имобилязиран, директно или индиректно, върху твърд субстрат»

31. атолът спорел претенция зо при който областта А е едия полипептил пригеден да функционира като антитяло и средството е свързано директно или индиректно към аналитът от областта а.

32. Атолът спорел претенция 31, при кз^то палипептилът на областта а се свързва специфично към елин епитоп на антижяло, което се свързва специфично юм аяалита.

33. Методът спорен претенция 29 при който» (а)областта а на средството е елнолентов полинуклеотид? и (^) аналвть? е индиректно свързан към молекулярното средство но пътя на еж протеин/подинуклеотилен хибриден свърз

-10- e <

вател е две обаасти:

(I) първа област, която е еляолентова полияуклеотидиа последователност но същество дшълнителна към последователността на областта А на средството;

(II) втора област която функционира като антитяло, специфично за анадита.

34· летол за подсилване на откриваем сигнал при конкуриращо ицуноизследване, който обхваща:

(а) конструиране ва молекулярно средство, обхващащо:

(I) първа област (а) която е пригодна да функционира като ищуноген;

(II) втора област В, която е двойяодентов полпяуклеотил пригоден да функционира като прошт^р >а от ДНИ ИЖпмлииеразна ензимна активност;

(III) трета област (С), кзято е иди елнолентова или двулантова и е съседна до втората област, така че третата област е пригодна да функционира като шаблон за промотерната активност на втората област;

(t) и мобилизиране на средството, директно или индиректно, върху твърд субстрат при наличност на един коякураращ аналит;

(е) отстраняване но несвързаното средство;

Я) транскрибиране на множествени копия на МЖ слигомери, които са допълнителни към шаблонната псследсватзлност с’ На третата област, С, на средството по пътя на Ж-полимеразна активност;

(с) количествено определяне на транскриптите.

35. ^_ТОл за подсилване на откриваем сигнал при конкуриращо имуноизслелваяе, което обхваща:

(а) конструиране на молекулярно средство, обхващащо:

(I) ежа първа област М която е пригодна да Функционира като антиген* и (II) множестреност наежолентови оллгжу оеотяи нож паници които са в състояние да се свързват специфиздо към еднолентова нуклеиново кисела последователност представляваща интерес* (^) имобилиз^^е яа средството директно или индиректно, върху твърд субстрат при наличност на коякураращ аналит* (с) отстояване на несвързаното средство* ^1) Хибриозпране на елиолеятовите белязани олигонуклеотиж, които обхващат една нуклеотилна посрелователност, която е оо съшство ддажзтояа към поделиницата последователност яа област средството, към пожжвист as втората област* (е) отстраняване на несвързания белязан оллгонуклеотид* и ) ксличествинс определяне па количеството «а беляза· явя олигонуклеотид свързан към сродството.