BG97123A

BG97123A - Производни на човешка, стимулирана от жлъчните соли, липаза и фармацевтични състави на тяхна основа

Info

Publication number: BG97123A
Application number: BG097123A
Authority: BG
Inventors: Gunnar Bjursell; Lars Blaeckberg; Peter Carlsson; Sven Enerbaeck; Olle Hernell; Jeanette Nilsson; Thomas Olivecrona
Original assignee: Arexis Ab
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1992-11-26
Publication date: 1993-12-24
Also published as: IE911844A1; IL98273A; RU2140983C1; FI925453A0; HU9203774D0; ES2099159T3; SK164491A3; SE9001985D0; WO1991018923A1; IL98273A0; FI925453L; HRP920771A2; CZ287470B6; IS1751B; EP0535048A1; JO1694B1; AU651979B2; IS3710A7; SG48078A1; LV10292B

Abstract

1. Протеин, включващ следната аминокиселинна последователност от позиция 1 до 722: 37 претенции, 6 фигури

Description

ПГО'^тЗР0Ж1 НА ЧОВЕШКА, ОТ^1ШРАЧА ОТ ЖЛЪЧНИТЕ СОЛИ ЛИПАЗА И ФАР^ПЕВТИЧНИ СЪСТАВИ НА ТЯХНА ОСНОВА

Човешката ластираща млечна жлеза синтезира и секпетира с млякото стимулирана от жлъчните соли липаза /BSSL/ /у _{така Т1е}след специфично активиране от първичните жлъчни соли /2,57,58 /, обезпечава ендогенен капапитет за интестчнално усвояване. на мазнините у сукалчетата /3-5/.Този ензим,който представлява приблизително 1% от общия мл^сн ппотеин/б/, е неспецифична липа заJ ин витро тя хидролизира не само три-ди- и моноацилглицеролите,но също и холестерил- и петинпл естери и лизофосфатидилглицеролите/ 7—10/. Нещо повече,нейната активност не се ограничава до емулгира ? ; не на субстратите.но мимолетните и разтворими субстрати са хидоолизирани в еднаква степен /11/. I

BSSL не се разграждат при преминаването си с млякото през __ чрез стомаха и в дуоденалното_пространство се предпазва ^х жлъчните соли . от инактчвапдя с паниреетични протеази като трипсин и тсин /2.11/. Инактивпра се,обаче при пастьоризация на мля- 2 Ο κοτο,τ.е..при нагряване ЛО 62,5 С 2? 30'МИН /1,2/. ЪДвЛНИ Θ^Τ*ΚΟпеои^^ПтпувбЖт до пге”поло.-.“ението,че коаичите ^оду^ти от усвоЯВЯнеФр 112. ТРИаЦИЛГЛППеООЛЗ. CO ΌΗΟΤΠΓΓΙΠ’ ' 13 ^тисъствпе на В I /5,0 Елагодарение на ниското съ^гъожаяие не удачни соли в ичтоглуминял I , ното пространство по прено на неонаталното развитие /13,14/ това ' е мо™е би полезно за пготппене на абсопбцията/5,15/.

Кзрбоксплният естер на хидролизата;/СЕН/ от човешки понкгеятичен сок /16/ изглежда функционално и Оптичен, или най-^малтсото ¹ I / много близък до B^SVs/.Te също така показват общи епитопи /8,17/

T’roTxrr’u’-’x? М-т-юай«п амт^оючзелпнни’последователности /17/ и ...-----........ - ...

се инхпб-рат от инхибитопкте на серин естеразите , т.е. еоерин и пиизопоопвдалчософосмат /6,8,16/.Пре^долога се,'че двата ензима тт ί -.разлика в / са пмо^мпти на едан п същ ген /18,19/ .·τ46.ψ?.γ£βο^ ияалякяхн размер/8,19/ би могла да бъде-обяснена с различните начини на глпкозилацпя,кактосе предполага напоследък /1?/.

Хранителните лнпицн са вален източник на енергия.Ьогатите на енергия тоиацилглицероли обезпечават повече от 95^ от тези липиди.Някои от липидите,т.е. мастните тзюелини и частно разтворимите витамини са. ва.~ж хранителни съставки. Преди гастро-пнтестинална абсорбция на триащтлглкцеролите като най-малко компоненти нзпр. естеоийицир^ни мастно разтворими витамини и холестерол диащилфосфат:^ изискват хидролиза на естерните връзтги за па се даде възможност на по-малко хидрофобните,абсорбтивни ' продукти.Тези реакции се катализират от специфична група ензими, наричани липази.

Като есенпиални липази за възрастните хора се сечитет гастро липззите,колипаза-зависимата липаза /три-и диатщлглицерол хидролиза/,панкреатична фосфолипаза А2/ жацилфос1-атип'тлглицероли и карбоксил естери на хидролазите/холес^егил и мастно разтворими естери на витамините /.У новородените сукалчета ,сти?лулирената ΙΙΙΜΜίΐΜ^ от жлъчните соли липаза игрее Ба’”нз роля в хидролизата на някои от посочените по-горе липиji.Заетно с жлъчните соли,продуктите на лиии-но усвояване дормират снесен?: -'ицели от '-оито се ооъоствява ассорбция/З-5/. ‘

Обща поичина за лилирна малабсорбцкя,и слотроатолно едостатъчпо хоанене,са редуцираното ниво на панкреатична колипгзазависима липаза и/или жлъчни соли.Типични примери за такава липа? на недостатъчност са пациентите,страдаща от циститна риброза ,обίτο генетично тазстгойство в резултат от Цро-^\1<те.тчаснеурстатъч -юст на емна 30'^J от пациентите , или хоонични паядфеяъит^, често в оезултат от хтокпчен алкохолизъм. ;

панкреатичната и чеопопсобяи Зуглшпи са не папълчо гаоплти при раждането,з по—значителна стопо?! пои децата, ιό гени преди гео-, мина,‘-астната-малабсорбция,по физиологични причини ,е общо устано вена и е резултат от ниското съдържание :ja интралуиинглната панкреаткчна иолипаза-зависила липаза и концентрацията на жлъчките соли /-3,4,13-15 /.Ь-акто и да е, поради токова малабсорбцня. е иногс по-малко често срелана у сукалче^отколопото у бебета,из хранзани с пастьоризирано човешко мляко /з-5,12,59,60.61 /.'-ова е една от причинител поради която се ралцтавп тезата,че новородените, и по-специално тези родени преди термина,които не могат ра бъдат хранени от собствените км майки,следва да бъдат хранени j с ?:опастьоризирано мляко от други майки/]2/.

Настоящото третиране на пациеити,^падащи от недостатъчност на панкреатична липаза е орално въвеждане на много големи дози сурови свински панкреатични ензими.Колил:за-зависима панкреатична липаза е инактивирана чрез прилагане на ниско pH. Такива условил съществуват в стомаха и в резултат на оралното приложение панкреатичната липаза е фактически напълно инактивирана при преминаване това, напълно избягнат чоез пзпзлзсоие ма голо?.:и дози ензим, въведените големи дози са неподходящи за човечето пациенти и препаратите се подобряват .-акива таблетни са изготвени |с оглед да преминат през киселите области на сто . на и ^ααΒΟ^°^Λ3^&Β^^τθΗ3>·?ί& ca?O в релатипно алкална слода на тънкото черво .¾ мн^го пациенти,сткаращи от панкреатични разстройства притежават абнбрмено количество киселина в тънкото чеово и такива тнелетки може ,Д£. не освободят ензима и да са неефективни.Нецо повече,докато намиращите се понастоящем :

на пазара препарати са с не-чозешки произход,налице е риск от

руг недостатък на наличните препарати е, че съдържанието на други освен нолипаза-зависима липаза липолитични активности са непотвърдени.^актически,повечето от тях-съдържат много ниско ниво на CEH/BSSL -активност.Това може би е една от причините по ради която много пациенти,страцащи от цизтитна фиброза,независи мо от допълнителната терапия,страдат от недостатъчност на разтво рими витамини и есенциални мастни киселини.

Така,налице е голяма нужда цт продукти със свойства и струк тура, получена от човешки липази и с тясна субстратна специфичност, които да могат ^;:а бъдат въведени *у пациентите,страдащи от недостатъчност на един или няколко от панкреатичните липолитични ензими..

Продуктите на настоящето изобретение реализират тази нужда сами по себе си или в комбинация с други липази или в комбинация с ггро дукти,съдь1ь:ащи -'руги ли пази. Още повече/ за някои бебета /на сора/

I е оакълмлтелно де се по поори оползотворяването на г^знините от храната за бебета или от пастьоризирано човешко мляко от т.нар.

млечни банки.

ES$L ошава някои уникални скойс^ва,конто го гозвкт I идеално подео.пнщ за терапия : конструиран!е от природен източник за озално приложение,запазва се пои поег.сирвгне през стопяха п се ' : ' ’ * . Ф I V активира в съдържимото на тънките ’-ерва.^ози специшдеен аитизагию-е; механизъм слолва да'предпази от случайна липолиза на х пенете или тъканните лкпиди по време на съхранение и|преминаване до. момента . ; ' ^: на действие.благодарение на широката ху субстратна специфичност, притежава потенциалната възможност да медиира пълно усвояване на i повечето хранителни липиди,включително мабтно разтворимите естери не витамини.

Б8$Хможе превъзходно да хидролизира естерните връзки,съдържащи дълговеривап! полиненасктони мастни киселини у панкреатичната коί липаза-зависима липаза. В присъствието на|стомашна липаза и в отсъствието на,или при ниски нива на колипаза-зависим ^5К:доже па се установи ггьлио тркглицеролно усвояване ж нитра дори ако нивото I г* на жлъчните соли са ниски както при новородените бебета.* присъствието на BSSL крайните продукти от триглицеролното усвояване са ι свободни местни киселини и свободен глице^юл вместо свободни мастни киселини и моноацилглицелор,генериран от ,фуги две липази /б/.^ова може дд улесни абсорбцията на продукти1те,:ю-специално когато интралуминалното ниво на жлъчните соли е ниско ^3,15/. I

От историческа гледна точка формите предназначени за сукалчета

I са претърпели развитие и са подобрени,от юзлциите на -.онцепциято, че техните състави следва да. бъдат аналогични на roneL-i.-Oio ..ля^о. лзиолзгансто като добавка,заместител или за терапия са сти:.уаш:а.ии от жлъчните соли липази / BSSL / или на протеини с есенциална функция на BSSI^ изисква нарастване на продуктите в широк обхват .Невъзможно, е в промишлен мащаб да се разчита на природен ресурси като мляко като начален материал. 0_СБен посечените по-горе а пастьоризацията, на лих^ь^

S ^ОПЪЯНИТЗЛбН РИСГг

48, -'δ^ΉΌΙΤ^ЛГТТθ ОТ н^ИТО^О:-⁷ източник с инфектиращи агенти,като вируси на ΗΓΖ и СгЛ^т.Съобразно е iiihdok обхват ивожкти,пгите™?г^

B$$L свойства.Настоящето изобретение обезпечава такива продукти

I и мото ти 5S тяхното полупоранв« птп·'*

Настоящето изобретение се основава на клониряне на сДл-\ уо раща В SSL, получена от човешка членна жлеза.Изолирали сме съш^о⁰човешки панкреас, сДНК,иопирата С Hi.Изведените аминокиселинни последователности от човешка сЖК и сравняването им с СЕЕ _отпдл^и пост^о^-^ел^ос^и от тоути викове,долкоепят интегпоетапията, - — — - -V | υθ BbSL. и СЕН са идентични.

Както ше бъде обяснено по-подобно, изненадвало е установено че структурата на протеина, както е изведена от сЖ^?·· после лова телността е твърде различна от структурата на други липази.Структурата неочаквано доказва аналогия с тази на структурите па тчпи^нит естераци,такива като холинеетеразите^

Съобразно с Фигура II и Фигура VII\продуктите на изобретение то са ί а/ поотеин,както е определен от ампнониселинна последователност 1-722 на ФигЛ1 , в/ поотеин,както е определен от а^нокиселинна последователност 1-535 на Фиг. VII , с/ протеин,както е определен от анинокиселинна последователност 1-278 на Фиг. VII , d/ протеин,както е определен от амтптокиселинна последователност 1-341 на Фиг. VII , е/ протеин,както е определен от аминокиеелинна последователност 1-409 на Фиг. VII / протеин,както е определен от! аминокиселинна последователност / Е0?.'бИНаЦИИ ОТ ПратеиНИ, опне ОЛеНИ ПО Т; · в/ -j / , Т .0. ^ΌΚΤΌ ςρ опоедолепи от аминокиселинна последователност в позиции 1-278,279

341,279-409,279-474,342-404,342-474 и 536-722.

!ι / комбинации от протеини,определени по т. в/ - d/ в гомбинаттия е един или ^гговече от повторенията съгл. Фиг. V, / протеин,както е определен съгласно a/-V ,притежаваща допълните т е лНа,М-крайна амино киселина,наречена метионин и функционални еквиваленти и мутанти на протеини,определени в а/-1/ по-горе.

Следва. да се отбележат, че протеините по т. a,B,c,d,e,^,i и 1 по-горе не са идентични във всяко едно отношение с пригодния BSSL, но те показват една ш повече от критичните функции на ппчго^о срещания BSSL.Kритли^^е Дункпии са излопени по-долу.

у ДНК. последователност,ко^траща протеини,определени по т. а,в,с, d,е,fi и 1 по-горе. к/ ДНК последователност съгл. Фиг.И,определена съгласно нуилеотидните номера на Фиг. И. — i а/ ДНК последователност 151-2316 съгл. Фиг. II,ко.фраща протеин определен по аминокиселинна последователност 1-722 на ФигЛП, в/ ДНК последователност 151 -1755 съгл. Фиг. П,кодираща протеин, определен от аминокиселинна последователност 1-535 на Фиг. VI, _с/ ДНК послецователност 151-935 съгл. Фиг.II,кодираща протеин, определен от аминокиселинна, последователност 1-278 на Фиг, VII, df ДНК последователност 151-1172 съгл. Фиг. И,кодираща протеин определен от аминокиселинна последователност 1-341 на Фиг. VII, е/ /ΉΚ последователност 151-1376 съгл. Фиг.И,кодираща протеин, определен по а^лп-юкиселинна последователност 1-409 на Фиг.VII,

Ууппотеун по / ДНК последователност 151-1574 съгласно Фиг. П,кодираща^последователност 1-474 на Фиг. VII

ДЕК последователност 986-1172 съгласно Фиг.И , ко^тоат? протеин определен от аминокиселинна последователност 279-341 на Фкг VII. ’

V ДНК последователност 986 -1376 съгласно ФигД1, одираща протеин определен от аминокиселинна последователност 279-409 на $иг^ 1/ ДЕК последователност 986-1574 съгласно ®игД1, кодирала поотеин,определен от аминокиселинна последователност 279-474 на ®иг.

j/ ДНК последователност 1173 -1376 съгл. ®игД-Цкодираща поотеин,о пое делен от аминокиселина последователност 342-409 на ФягЛП к/ ДО последователност 1173-1574 съгласно ^г.П,о^^ теин.опоецелен от аминокиселиина последователност 342-474 ®Hr.^VI±

Особени функции на протеините съгласно изобретението са : а/ подходящи са за орална употреба в/ актпвиоанп са от спепипични жлъчни соли

С/ действат като неспецифична липаз? в съдържимото на тънките черва,които са способни е? хидролизира!? лгпидите,независимо от тйхната химична структура и физично състояние /емулгирано,разтворен? / d/ способност да хидролизират триацилглицеролите о ’«ини i киселина с различна дължина на веригата и различна степен на нефсителност.

е/ Способност да хидролизират сщо и диацилглицеролите,моноацилглицеролите,холестериловите естери,лизофосфатидилацилглицеролкте и ретинил или други мастно разтворими естери на витамините.

/ Способност да хидролизират не само &ц- 1/з/ естерните връз ки в триацилглицерола,но също и ^д-2 естедната връзка о? Способност па взаимодейства не сало с първични,но и с втоги^ ни жлъчни соли.

It/ Зависимост пт жлъчните соли зе оптималната активност.

{/ Стабилност така,че стомашното съдържимо няма да влияе върх^/ j I Стабилност сгещу кнактквация от панкреатични претегли като топпсин,обезпечен от жлъчните соли к/ Способност за свързване към хепарин и хепаринови произволи като но по. хепарин сулфат {/ Способност за свързване към липида-волни интерфази м/ Стабилност да позволи лиофилгзация п/ Стабилност при смесване с хранителни компоненти,такивл съдържащи се както в човешкото мляко,така и вмлечната формула

Критичните (рункции за добавяне, заместване или тераиил. са х' 0 ji · с<<^ c/,d/,e/,y/,i/,j/ и 1/. За |цруги цели могат да бъдат използвани не само тези критични функции.

За експресия на протеините,марниронИ по-горе,по входящите ДНК последователности,които също са отбелязани по-горе,следва не се инсертират в подходя::; ветор, която след това се въвежда в подхо-. дящ гостопшвмников организъм.ίοзя везстор следва също така да включва подходящ сигнал и други пбследователности,позволяващи па гостоприежика да експресира желалият протеин.

Подходящи експресионни организми ^:

С рекомбинантната ЛИК техника е възможно да се - лонира и

I експресира интересуващия ни протеин в различни прокариотични и еукариотични гостоприемникови организш.Възможни експресионни органи·?⁷^ са боктерии,прости еукариоти/дрожди/,А-.ивотинсь.и клетъчни •култури,клетъчни култури от инсекти,растителни клетъчни култури, растителни и трансгенни животни.Всяка индаидуална система притежава свои специфични преимущества и недостатъци. Простото заключение е, че за-експресиоане на всеки ген е необходею да бъде рошен отделен уникален проблем и няма стандартно решеше за това· ;

Общоприети бактериални системи са -ези на E.coU^ac.^i&s . SirepUvAices · Общоприети дрожди са сакхе.ромицес и Picftia Pasioris .

* г .Общоприети животински клетки са CHD клетти и COSклетки.Общоприети.

- 10 Общоприето растение е тютюна ,змо:”ни са козата и кравата.

Еъзмо^ни бактериални вектори са дадените като пример pUC и поо т е ин А-в е кт ор ит е. ;

Еъзмоопито йхкхприалия дроздеви вектори са представени от pvlA 91. i

Възможни инсентицидни вектори са Представени от В_аСи£о-вкрус Възиоп^ите животински клетъчни вектори са получени от 8^/40.

Възможните растителни вектори са Получени от Т1-плазмид.

Във всяка система,могат да бъдат използвани както природни, ! така и синтетични терминатори.

Разбра се, че в зависимост от избора на е кспкес конната система,ексдресиралият протеин можо да съдеха допълнителна Ν'-крайна .. аминокиселина /метионин/,съдаля някрлкс} допълнителни аминокиселиI ни или да бъде въведен в хетероложен!'протеин /като протеин А/,; или или да се различава от природно срещаният протеин по начина naj гликозилация. i

По-нататък,векторите могат също да съдържат сигнални последователности за експорт на протеина към периплазмата пли къл к,лтуралната среда.. ;

Така,други аспекти на изобретението са ί а/ вектор,включващ ДНК последователност , кодираща протеин както са специфизиогни по-горе, в/ гостоприемников организъм,включващ последователност лнкто е посочена по-горе. — с/ метод за получаване на протеин както е специфициран по-горе, посредством култивиране на гостоприемния,включващ вектор,както е посочено в а/ по-горе и изолиране на тротеина.

-егодпте за пречистване са основани на използваните експресионните системи / е.г. протеин А/I^C/ и/иМ на методите за пречистване^гзползвани за пречистване на природнф срещащия се ензим,както е описало в референс 6.

допълнителни аспекти на изобретението са *

- фармацевтичен състав,включващ протеин както е посо-ено по-горе, - използването на протеин както е посочено по-горе за производство на медикаменти за,лечение на патологичните състояния,свързани с екзокрянна панкреатична недостатъчност,

- използването на протеин както е посочено по-горе за получавано па медикаменти за лечение на циститна фиброза,

- използването ма протеин както е посоченр по-горе като допълнителен кс.дюнент в храната за сукалчета^

- използването на протеин ::акто е ; посочено по-горе за производство на медикаменти за на хронични панкреатити,

- използване на протеин,както е посочено по-горе за производство на медикаменти за лечение на маста· малабсорбция от различна етиология,

- използването на протеин както е посочено по-горе за получаване на медикаменти за лечение на малабсорбцияга на мастно разтворими витамини,

- използването на протеин както е посочено по-горе за производство на медикаменти за лечение на мастна малабзорбция благодарение на физиологични предпоставки ,напр. у новородени; бебета.

дНК последователността на ®игД1 от позиция 151. до края, включително позиция 2316 е последозгтолпозт,кодираща цялостния протеин .Последователността от позиция 2317 до края и включваща позиция 2415 не се транслира до протеин, но се вклочва в екзон d , идентифициран на Табл. 2 по-долу.

В един от вариантите на изобретението,Протеинът както е дефиниран в параграфи а/ -1/ по-горе се осигурява в изолирана форма и/или в чист вид. j

ДО последователностите,както са дефинирани в параграфи а/-к/

I по-горе,са в един от вариантите на изобретението осигурени в изолирана и/яли чиста форма.

Експериментална част.

Съкратения » _ ;

аа, аминокиселини $ вр,двойки бази j BSSL -стимулирана от жлъчните, соли липаза; С-А:.!?, цикло адвнозин монофоАфат !j СЕН, карбопсилен естер ка хи проказата j Да , далтон, с Ж⁵, '7-деазо-2-цезоксигуанозии 5 тоифосфат j ЖА , етилен диамин тетраацетат ; кв, кило бази, P-S, киселина ^пт, нуклеотид, PAGE ,иоллакриламид гел електрофореза, ,натриев додецил сулфат ;

натриев хлориден цитрат,х&аХ,5-бромо-4хло]Ю-3-индолил -З-Д-галактопиранозид.

ЕНЗИМИ

Симулирана от жлъчните соли липаза Карбоксилен естер на хидролазата

ВС 3.1.1.3 ас 3.1.1.1

Материал и методи.

А. Изготвяне на ензима и антитялото

BSSL се пречиства от човешкото мляко както е описано в б/

За получаване на антитялото,ензима по-нататък се пречиства чрез ^Д$^РАСЕ.Протеиновите връзки,кореепондиращи на лкпазата,се електроелуират от гела след престояване с Сока^ BriiflaHT в^е.Двауе·

личество от ензима с непълен адвувант за съответните месечни поддържащи инжекции. Плъховете се обезкръвяват около две седмици след всяка поддържаща инжекция и серума ,който се изготвя от него се съхранява

Б. Изготвяне на триптични фрагменти и анализ на аминокиселините последователности | ' ' . i

Три мг пречистен BSSL се разтваря в 1 мл 0,1 & Т_ркс-С1 буфер pH 8,5,съдържащ гуанидин хидрохлорид и 2 WA. Добавя се дртиоеритаитол до 5м--.След инкубация на 37 ^С за 2п,300м£ се добавя 300 м£ 50 мм йодрацетат.; След инкубация за 90 ж на 25 на тъмно,редуцираният и карбфпгтлетнлиран ензим се подлага на проце дура за отделяне на солите р Сефадекс С-25 колона, еквиж-. брира се с 0,5 М амониев бикарбонат*.Тридесерт от то зил- Д- фепилаланинов хлорометан -третиран говежди трипсин /WolILimj-Ux

A / се добавят преди лиофилизяциятя. Лиофилизираният протеин се разтваря в 4 ми 0,1 М амониев бикарбонат и се добавя допълнително количество от 90 мг трмпсин. След 5' п инкубация на 37°С ,протеина отново се подлага на лиофилизация. Триптичният фрагмент се разтваря в 0,1% трифлуороцетна киселина / 2мг/мл /. Триста мг трипсинизиран Bb$L_Ce подлага на хроматография върху HPIC,използвайки С-18 обратно фазова* колона и се елуирг с грздиент от 0-50% ацетонптркл в 0,1% трифлуороцетна киселина. Сбора от пептид се наблюдава чрез продьлт.1’телн^. регистрация на . абсорбцията при 215 нм. По-нататък пептитате се подлагат на рехтуматогваЛия с помощта : . на същата колона гри подходящи граженти.

Пооби от пептидните фрагменти се изсушават в присъствие на азот за отстраняване на ацетонитрила и;се подлагат на определяне

ΙΑ «₇ «- <- Τ' 4 1 «И»· »4 , f * - .--

- 14 ΑΛΛτ-ίονττηαπτ.’τπιτ, где .- 2 re в ‘долно сти, пшро.цн2 В SSL се разтвапя в 0,0 опетна киселпна.СекЕенционният анализ се провежда в AppBed BioVpk Inc 477А ^лсационен течио-фазен секвентор и он-лайн РТН 120 А анализатор с циклични прогрг Ή и »г'икали от про мит* е нос т та. На _Лзлната и следващата. проекции, тдхлкулот стандартен протеин р - лактоглобулин ,са 47 и 97 %,респективно.

С, Изолиране на ННК.

Плоби от човешка панкреатична адипоза и тъкани от лаЕТир^ра млечна жлеза се получавафо хирургичен пъщ и незабавно се поставят в гуаниик тиофосрат / 1-5 г а 50 мл/. ОйДо т-_ОЛипв_Стзо РНК се escspew* ® ««· °” ^{/2θΛ ое кзготвя} хртятогрп^и върху олиго-де«>!®июг.ад?Ж1т-/слиго/ДУ/· -ifMJW колона /21/.

Д. Конструиране и скпгаинг на сДНК библиотеки

Приблизително 15 j.ir поли-аденилирана РНК от човешки панкреас се денатурира с четил живачен хидроксид /22/ и се подлага, на възпей ствието на олиго/с£Г/ 12-18 праймери / P|iarMacia,Mppsa{a.^ ^:/, и се подлага на обратна транскрибция с помощта на стандартни процедури./23/.Синтезата на двойната верига се провежда съгласно busier и Hoeman /24/,с изключение на това, че ДНК лигазата и j-WAA се пропускат и реакционната температура се установява на 15°С.Излишъка от ЬНК се усвоява с РНКгзз А /50 мг/мл/ и двойноверижнета сДНК се третира с ЕсоД! котилаза /25/.Краищата се слепват с Кленов ензим.След лигатиране къ-¹ EcoRI линкери и раздробяване с EcoPl , сДНК се фракционира на Сефарозна 4|i-с£ колона. Пробата, не съдържаща сДНК фракция,се преципитира ci етанол и сДНК се лигатира въм ЕсоЩ сайта на третирания с фосфатаза вектор/ 26 /. Ид витро сДНК бпблчотека от ловешка млечна зле за, полудена от жена,, бременна. на осем месеца е закупена от с{оптес!х ^β.,Ιπο. ,?s/o а{_ГО,СА,И$А /.

Фаги от с/НК библиотеката се поставят на 5.10^ плаки,формирали единши за 120 мм чинии, Аптиоерумът се разрежда до съотношение от 1:3200 и се скпинира съгласно методиката на Уокп^, и 4?V1S /27/. Алкално-фосйатазните кокогати на' иози-онти-плъшите антитела се използват като вторично антитяло /Blo-#ad,$ic!iMond,OA И^А /, ор изолиоане на клонове, кохзеспон.-иращн на 5-края на мЖ,се проверце хибридизация с нуклеинова киселина при стандарт ни условия /23/ с помощта на. субклониран фрагмент от един от тгзунопоактивните клонове като пооба.

К. РЕК анализ i

Електрофорезата се проЬежцр върху 1% агарозеп гел в 40 мМ

MOPS буфер с pH 7,0 след денатурация с глиоксал и шшетилсулфоксид /28/. Глиоксилираното общо количество РНК след това се прехвърля върху нитроцелулозни филтри/29/ и се оставя да взаимодейства със субклонове на BSSL и CSH рекомбинанти, белязани с олиго-маркираща техника /30/. Прехибридизацията и хибридизацията се провеждат с 505^s формамид при 46°С /зЗ/.Постхибридизащшта се провежда пои строго специфични условия /0,1^ SiS и 0,l.^SC при 60°^./ 1х^Р, Ο,ΙδΜ Г^аС1,0,0015М цитрат,рН 7,6 /.

F. Нуклеотидна секвенция сДНК инсерти от В^^Ьи СБИ рекомбинантите или директно се клонират в М3мр18 и мр19 след въз,действие с ултразвук фракциони!ране по размер или някои от тях по-нащатък се субклонират в £Ш9К след разяждане с ΛτΙ,Β^Ι,ΚβτΙ,ίΙίβΙ и А?гаП. Нуклеотидата последователност се определя по

I дидезокси верижно-терминалния метод./31/.

GC- повторенията /вж. по-долу/ са също секвентирани с Та$ 1 полимераза и de ?GTP, Двете вериги са съгласувани.

Информацията за съгласуване се извежда от авторадиограмите с помощтта /55/.

на софтуер както е описано от Sjoserj и др.

• &. Предсказване на аминокиселинните последователности и хомолози I

I

За предсказване на кореспондиращата амийокиселинна последователност на еДНК инсеотите,колоните използвани за четене на разливни рамки се сравняват по таоеп и дават една отворена четяща рамка /32/. Хомологията се изследва е помощта на програми от HlfGCG* сойт уерен продукт. /33/. 1' '

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ :

А. Последователности на триптичните фрагменти и ^Ί-края на BSSIa

Трипсиновото разграждане на пречистена BSSL резултира в приблизително 50 фрагмента ,оценявани по броя на пиковете,получени по време на KPIC -хроматографията / $иг. I /. П_{иковете} се събират и посочените пикове,които биха могли да бъдат изолирани във високо пречистено състояние и в съответни количества,се подлагат на секвен тиране.Получените последователности са псказани на ТаблД.В до\30δ._ пълнениe\/4Y-крайните последователности се подлагат на секвонтиране за определяне на аминокиселинната последсвателност / Фиг.Н / и те формират докладваната по-рано последователност*Авоиак!^ erf af/p

-те остатъка от дългите «^-крайни последователности,док-

17Б. Нуклеотидна последователност на !

За конструиране на |<$т11 с.ч^К -библиотека, използвахгле полиаденилирана ΗίΚ от човешки панкреас. Като надало бяха изолирани четири имунопозитивьи клона и след това гази панкреатична експресионна сДНК библиотека бе скринирана с артисерум срещу ВЪЗЬ.Иуклеотидаят сенвенционен анализ показа,че съответстват на 3- края на мРНК. Всички те започват с поли А опашка и се различават ca'O по дължина.Най-дългият кнсерт,означен като АСЕН, е с размер на 996 вр сдНК библиотека от човешка млечна жлеза се скринира с янтисерум и панкреатичният клон АСЕН като п^оба.позитивните клонове от двете скоиниания бяха изолирани,ko^tq· всички произтичаха от З-края Най-,дългият клон от млечна жлеза,означе^ като Ab достига 2100 вр нагоре Дой съдържа четири от секвентир' нит е триптични фрагмент;. / Фиг.П /но не включва П-крайната аминокиселинна последователност ί

За да се разшири последователността извън транслационния старт,с.Ш библиотеката от млечна жлеза се рескринира със118 -базова проба j . „ _т' „ I от най-проксималния о-край на яььъдоеше изолиран един клон,който продължава нагоре в 323 нуклеотида.Той съответства на Н-крайната аминокиселинна последователност,но съдарха и оставащият триптичен фрагмент. Както е показано на ^иг.11,сЖ^ е дълга 2428 нуклеотида. и съдържа 81 бази нагоре от първия ATG- кздон. Полиаденилационният сигнал ААТААА е локализиран на 13 нуклеотида нагоре от поли А опашката и терминационния кодон TAG· е намерен като нуклеотид 2317,следвал от 3 - нетоанслиоана област от 112 вр.

i i

GC областта,състояща се от 16 повторения на 33 бази бе намерена на 3*- края от последователността изжду базите 1756 и 2283. Нуклеотидната последователност oij повторението,показана на $иг.Ш, се състои от шест идентични повторения, заобиколени от десет повторения с различен брой замествания,коитз вероятно са се появили

след няколко дупликации. -алкият брой от за?лествания предполагат, че тези повторения са се появили по-късно ро вре-’е на еволюцията.

ί

С. Разпределение на експресията в тъканта.

РЕЕ от човешка лактираща млечна жлеза,от панкреас,адипозна тъкан и от човешка хепатитна клетъчна линия /НерС2/ се подлагат на анализ чрез Norifiern βΙο.ΜΙπ^. ^размера на транспортната РНК бе определен като приблизително 2,о кв както в лактиращата тъксН,^ака и в панкреаса .Не бе възможно да се,определят сигнали в.линиите с РНК екстрахирани от Нер&2 или адипозна тъпан / Фиг.4 /.

Докато мИЖ,използвана за библиотек^ от млечна жлеза на жена с осеммесечна бременност,очевидное^че транс крйбцията. и вероятно транслацията на BSSL гена започва преди раждането,в съгласие с предишните намирания на секретирания · · преди раждането/

/.Виж ©иг. IV,

Д, Аминокиселинна последователност на BS^Li

Определена чрез $Д£-РАСЕ, молекулярната маса възлиза на 107125 кДа /8,36/ и чрез аналитично ултрацентрофугИрйМе- 105 кДа/37/. Ензима, както може да се заключи от сДНК,сз състои от 722 оминоI *' киселинни остатъка /Фиг«И/,което давайки молекулна маса от 76,271 Да,сочи че ензима съдържа най-малко 15-20$ въглехидратиДидерната •последователност е дълга 23 остатъка. Експериментално активния сайт серинов остатък е локализиран към серин -217 /$ИгЛ /.Последователността около този серин предоставя активно сайтова последовател · I ност за серинови хидролази/38/. ^акто .напоследък се предполага, > базичните последователности,намерени J блязост до активния серинов сайт,може да бъде вкличен в разграждането на естерните връзки_

ЗМгликозилационен сайт е локализиран само на седем остатъка от серина. Степента на гликозилация /б,1о/ предполагаме ензима съдържа 0-сгър зан карбохидрат. Налице са доста сайтове,кщдето·можо да се срещне подобна гликозилация.Аминокиселинният състав,основан на пречистения ензим е показал високо съдържание на пролинови остатъци /б/.^А':инокиселинна^последозателност,получена от сДО. потвърждава това. Нещо повече,повечето от пролиновите остатъци са 'локализираш в 11 остатъка всеки, определяйки основната част от С-*крайната половина, на.

I ензима.

Е. Сравнение на ензимите от млечна мле^а/BSSb/ и ОТ пигревс /СЕЧ ! ' ί

BSSL от човешко мляко- и от панкреас; СЕН побрано бяха поиа- . зани като аналогични,но не идентични .· Настоящите данни строго предполагат, че двата ензима'са продукт на един и същ ген.^клеоти^йта последователност на сДНК клоновете показва,че панкреатичният клон АСЕН е идентичен с клона от млечната жлеза ABSSLot поли А опашката и 996 бази спещу 5 -крея,включително последователността,кодираща пролиновите повторения.Изследването с .ίίοϋ дава е цинична, връз ка от 2,5 кв в НЖ от панкреас и лактиралюла жлеза /Фиг.4/. Геномните S. по-нататък потвърждават идеята,че само един ген кацира BS^Lh СЕН.Разликата в мобилността търху -PAGE между BSSLh СЕН може да бъде обяснено следствие от различно гликознлчооне или диференциално разграждане.

Аналогията от плъщи и телешки епзичи /гж.по-^лу/ и резултатите от гено^ите изследвания потвърждават вероятността циференциалното разграждане да не гкяе въ^г различията в мобилността.Докато С-крайната последователност не е потвърдена чя нивото на протеина,налице е по-малка вероятност да бъде получен през

- 20 Доколкото ни е известно,панкпеатичните’ ензими,които задължи··^ но кооеспондипат на СЕН често са именувани след вида и специалният I стбстоаг, използван за оггоеделяне на тяхната песпективна аефирност· лизофосфолипаза,холестерилестеоаза, стерол естерна хи/щолаза/теспец цифична липаза, капбоксил естерна липаза и холестерил естера ^и^рола за.Налените данни са активности произтичат от спагними с оглед па това,че всички описани τ' ЧСНо&ст . , една и същатоункционадаа /4:,43/.

Това илюстоиоа широката субстратна специфичност и зависимостта веради която са означени като.неспецифични липази.Ногато се сравняват последователностите на лизофосфолипазата αη панкреас /40/ и холестерол естеразата от телешки панкреас f~\l ^ст^новент са аналогии, възлизащи.на около 530 остатъка от N-ноая/ ^nr.V/ j но те се грзлпчг ват в частта на молекулата,където се появяват повторения.Плъшият Слепова^елчо ТТ ^{1 1}ензим притежава са тю четкои повторения, а горе-ждня — три. ?лхххй чо вешкият ензим е сравнително дълъг пептид.

Нещо повече, удивителни аналогии са ваме-ени BSSL % някои типични естера зи, на по. апетил холин €етерази от пазлични ви» дове, включително човек и'Дрозофила, и карбсксил естеразите/ ^кгЛ Тези аналогии са ограничени до N-крайннте 300 остатъка от който включва експериментално активният сайт серин-остатък.Аналогия с ацотил холин естераза е предсказана от фекта. че В SSL ,се инхибира от типични холин естеразни инхибитори /6,3,16/.0 .възможното .изклюпенйе на п-тапа черно .дробна сарбоксил естеразе /45/,никой от тези яналогични ензими не показват подобна * ‘-солвва зависимост като BSSL ; това предполага,че структурната основа за тези свойства се крие в тершшалната част на протеина.Нещо човече, ^SSL е^екти^но да атакува емулгирани субстрати,което е непозната характеристика на подобните ензичг/еетерази/.Зг мая аяижнос* жлъчните соли са особено необходими.

- 21 I

IHsгокззоната последователност за иорепката BSSL бе сравнена с други добое характеризирани липази от бозайници. Освен после поеателността около активния серинов сайт / &-X-S-X-G/, не бяха чямепенн задължителни аналогии/44/.

В допълнение към аналогиите с други рнзиж,налице са също забележителни етнаквости с един с-A'.T¹ зависим протеин от Д1сНоъ^е^и

Axsctfdeuyn /46/ с тироглобулин от различни видове / . VI/ 1^49/, Аналогиите между BSsL и тироглобулин,роито включват областта на активния сайт,но не и самия сайт ся?д по себе си,показват,че тези високо консервативно пространство от аминокиселини са от по-об*т? еча - ' “ I чимост от повечето подсилващи хктхвнхгх ензимната активност на естеразите.

• В заключение,от попешко мляко ср състои от 7°2 а-лпюккссг линни остатъка. Наличните данни строго показват,че нейната пептидна веоига е идентична на тази от панкреатичната СЕН и те са кодирани от съдия ген.Най-силното доказателство е, че нуклеотидните последователности от техните 3-крайнк и техните it-крайни аминокиселинни последователности са идентични.Удивителните хомологии,установени за плъша лизофосфолипаза и говежда панкреатична холестерол естераза подкрепят хипотезата,че само тези ензими са функционално идентшщн. Но както се предполага, различните молекулни размери,установени , измежду видовете не са благодарение на различията, в гли^озилапията у вместо това те рефлектират върху различен брой от единадесет аминокиселинни повторения.Аналогията в последователността на активния: сайт между тези естерази предполага,че тези протеини произхождат, от общ родоначален ген.

Но отношение на Фигури от 1 до VII са надени следните легенда:

7 ОтГРЛЯНе HO. ТГИПТИЧНИТР Дпгрмдтттрт θψ ΰ I ръруу HPIC

Пречистен BSS L се третира с тоипсин и се хроматоггатира върху HPIC както е описано в Материали и методи. Посочените пикове се събират и пречистват с рехроматограф и техната аминокиселинна пое, I ледователност се определя.

Фигура 11 : сДНК нуклеотиината последователност и изведената ..... киселинна последователност за стттулигане от жлъчните соли човешка..... липаза ^: ΐ

сДНК е пълга 2423 бази.£1 -крайната|23-кодойна, последователност -.1 / ni82 - 150 / започва с ATG и е интегрирана като лицерен пептид докато М-тер?л<налната аминокиселинна. последователност на природният протеин започна като кодон 24 /п! 1517Ala JДидерният пептид е подчертан.Знакът * посочва началната точка на екзона. юнакът Я посочва началната точка на повторената част, i

Фигура Ш : Нуклеотипн^та последователност на С-терцинелните SC-— ί повторения у стимулирана от жлъчните соли .шпаза| ί

_ ί* iI

Заместванията са означени с ♦:

Фигура IV ί ^ог^егп в/от хибгилиз.шша-N.sioT анализа на· общото количество ИЖ^изолирано от лартираща млечна жлеза,панкреас,адипозна тъкал и човешка хепатоцитна клетъчна линия / Н_ер &2/. Обжото количество TNA /lO j.xj / от лактираща млечна жлеза /линия А /,панкреас /линия В/^аднюзна тъкан /линия С/ и HepCS /линия Д / се подлага на електрофореза в 18/ гел в присъствие на 40'мМ буфер на при pH 7,0 след денгтурация на РНК в 1М глиоксал,5($ диметилсулфоксид и 10 мМ MOPS .Олед това

- 23 глиоксилирантата ΗίΚ се прехвърля върху нитроцелулозна хартия за хибридизация с ^~Р белязан BSS1 сДНК / /.

Фигура V · Сравняване на изведената а?лпю киселинна последователност • ' ' i_v/40m, //, и говежда панкреатична холестерол естеразл/41/.J—

Сериновите остатъци,внлючени в активния сайт са означени, с# ache означава единичния К-глинозилациОнен сигнал на протеина.

директните повторения на аж-юкиселкнни последователности са ограл.ени в каре.Съответните последователности са отбелязани с главни букви съответните последователности между два ензима са. означени с малки букви, а несъответствията - с точка.

Фигура. VI : С_теБнязане на първичната статут на Б&1 _g туугч. естеоази.тигоглобулин

ESSL : стимулирана от жлъчните соли: липаза от човек, С^еьбим : Холинестераза от фетална човешка тъпкан /50/, iorpa.ee · ацетилхолпнестераза от Torpedo магмо^ай /ol/,fepcfi ^: карбоксилен естер на хидролизата от Дрозофила меланогастер/52/, ЗатШсе :карбоксил естераза от плъши черен дроб/53/,ДЛиасе · ацетилхолинестераза от Дрозофила меланогастер /54/,Tforhu^ тироглобулин от човек /49/ и Дист.Д1· c-Ai*P зависим ензим от Диктиостеляум дискоидеум /4б/.-алир це са 7 различни области,които показват аналогии меж/у ензимите.каре са очертани остатъците,които с- идентични и малките букви в съответната последователност ин.щпшрат идентичните остатъци във всички ензими освен еданДочтате обозначават несъвпадения.Сериногият остатък,включен в активния сайт е означен със . Фигурата в десниг тите.

- 24 7Ц

Фигура дава аминокиселинна последователност 1-722 за_целия протеин /еднобуквен код / и обозначава хидинятн екзоните а,в,с и d. юнакът обозначава началната точка на повторяемата част.

ТАБЛИЦА 1 _______Аминокиселина после нователноот на BSSL пептили

Благодарение на взаимодействащите пикове не може да бъдат създадени позитивни идентификации: на остатъците в циклите 1 и 2 пои съгласуване пои лепти ден номер 26. Пепти дните номера съответ •χ· Т стват на пиковете от Фигура 1.

Триптични фаргменти

15	ТР16:LysValThrGluGluAspPheTyrLys
	ТР19: GlylleProPheAlaAla ProThrLys Тр2 0: LeuValSerGluPheThr I leThr Lys
20	TP24:ThrTyrAlaTyrLeuPheSerHisProSerArg TP26:PheAspValTyrThrGluSerTrpAlaGlnAsp
25	ProSerGlnGluAsnLys

ТA-culzEIh. 2 ·	Идентификация на екзоните а_гв.	с и о . номл-ппггни
на. ^иг. И	._т VII
екзон	Локализация 1'
	между нуклеоти,Ения	между амино киселинния
	номер	номер
а	986 - 1172	1 279-341
в	1173 - 1373	342-409
с	1377 - 1574	410-474
ol	1575 - 2415	475-722
целият	151 - 2316	1-722
протеин
целият протеин''151-1755	1-535

без повторения

ί I

WO 91/18923

PCT/SE91/00381

References

I. ;

1. Blackberg, L., Xngquist, K.k, & Hernell, 0. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.

2. Hernell, 0. (1975) Eur. J. Clin. Invest. 5, 267-272.

3. Hernell, 0., Blackberg, L. & Bernback, S. (1988) In

Perinatal nutrition (Lindblad, B.S., ed.) BristolMyers Nutrition symposia vol. 6, pp. 259272, Academic Press, New York.

4. Hernell, 0, L. Blackberg, B. Fredrikzon, and T. Olivecrona. 1981. Bile salt-stimulated lipase in human milk and lipid digestion In the neonatal period. In Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, editor. Raven Press, New York. 465-471. ΐ

5. Bernback, S., Blackberg, L. & Hernell, O. (1990) J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221-226 (1990)

6. Blackberg, L. & Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem 116, 221-225.

7. Hernell, 0. & Blackberg, L. (1982) Pediatr. Res. 16, 882-885. I

8. Blackberg, L. Lombardo, D., Hernell, 0., Guy, 0. £ Olivecrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284-288.

9. Fredrikzon, B., Hernell,* 0., Blackberg, L. & Olivecrona, T. (1978) Pediatr. ^les. 12, 1048-1052.

IC. Wang, C.-S., Hartsuck, J.A. & Downs, D. (1988) Biochemistry 27, 4834-4840.|

11. Blackberg, L. & Hernell, O. (1983) FEBS Lett. 157, 337-341.J

12. Bjorksten,B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikzon, B., Gothefors, L. & Hernell, 0. (1980) Br. Med. J. 201, 267-272.।

13. Brueton, M.J., Berger, H.M., Brown, G.A., Ablitt, L., lyangkaran, N. & Wharton B.A. (1978) Gut 19, 95-98.

14. Z4urphy, G.M. & Signer, E. (1975) Gut 15, 151-163.

15. Hernell, 0., Staggers, J.E. & Carey, M.C.

Biochemistry. (1990), 29:2041-2056.। wo 91/18923

PCT/SE91/00381

16. Lombardo, D., Guy, O. & Figarella, C. (1978) Biochim. Biophys. Acta 527, 142-149. ' I

I ;

17. Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. & Lombardo, D. (1938) Biochim. Biophys. Acta 961, 299-308.

18. Hernell, 0., Blickberg, L. & Lindberg, T. (1988) in Textbook of Gastroenterology and Nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed) pp. 209-217, Raven Press, New York. i

19. Wang, C.-S. (1988) Biochem. Biophys. Res. Com. 155, 10 950-955.

20. Chirgwin, J.M. Przybyla, A.E., MacDonald R.J. & Rutter, W.J. (1979) Biochemistry 18, 5294-5299.

21. Aviv, H. & Leder, P. (1979) Proc. Natl·. Acad. Sci. USA 69, 5201-5205.

22. Bailey, J.M. & Davidson, N. (1976) Anal. Biochem. 70, 75-85. ί . I

23. Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982): Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

24. Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1933) Gene 25, 263-269.

25. Maniatis T., Haldison, R.C., Lacy, E., Lauer, J., O'Conell, C. & Qvon, D. (1978) tell 15, 687-701.

26. Young, R.A. & Davis, R.W. (1983^ Science 222, 778782. I

27. Young, R.A. & Davis, R.W. (1983 Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80, 1194-1198.

28. McMaster, G.K. & Charmichael, G.G. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 48 353-48 358.

29. Thomas, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 30 5201-5205.

30. Feinberg, A.P. & Vogelstein, B. (1983) Analyt. Biochem. 132, 6-13. i i

31. Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74. 5463-5467.

32. Staden, R. (1984) Nucl, Acids Res. 12, 551-567.

33. Devereux, J., Haeberli, P. & Smithies, 0. (1984) Nucl. Acids Res. 12, 387-395. I

PCT/SE91/00381

WO 91/18923

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

Wang, C.-S. & Johnson, K. (1983) Anal. Biochem. 133, 457-461.

Hamosh, M. (1986) in Human Milk Infant Nutrition and Health (Howell, R.R. Morriss, F.H. i Pickering, L.K. eds) pp. 66-97, Charles, C. Thomas, Springfield.

Wang, C.-S. (1980) Anal. Biochem. 105, 398-402.

Wang, C.-S & Les, D.M. (1985) J. Lipid. Res. 26, 824830.

I

Brenner, S. (1988) Nature 334, 528-530.

Yang, C.-Y., Gu, Z.-W., Yang, hJ-Н., Rohde, M.F., Gotto, Jr., A.M. & Pownall, H.jJ (1989) J. Biol.

Chern. 265, 16822-16827.

Han, J.H., Stratowa, C., & Rutter, W.J. (1987) Biochemistry 26, 1617-1625.

Kyger, E., Wiegand, K., & Lange; L. (1989) Biochim.

Biophys. Res. Com 164, 1302-1309.

Blackberg, L. (1981) Fat digestion in newborn infant. UmeA University Medical Dissertations New Series No 71. I

Rudd, E.A. & Brockman, H.L. (198^4) in : (Borgstrom, B & Brockman, H.L. eds) pp

Lipases . 184-204

Elsevier, Amsterdam.

Mickel, S., Weidenbach, F., Swarjovsky, B., LaForge, S. & Scheele, G. (1989) J. Biol. Chem. 264, 1289512901. i

Cammulli, E.D., Linke, M.J.,·Brockman, H.L. & Hui, D.Y. (1989) Biochim. Biophys. Acta 1005, 177-182.

Mann, S.K.O. & Firtel, R.A. (1987) Mol. Cell Biol. 7, 458-469.

Mercken, Vassart, Lauro, R. Musti, A.

L., Simons, M.J., Swill,ens, S., Masser, M. & G. (1985) Nature 316, ^47-651.

, Obici, S. Conuliffe, |D., Ursini, V.M. , , Moscatelli, C. Λ Awedimento, V.E. (1985)

Eur. J. Biochem. 148, 7-11.

Malthiery, Y. & Lissitzky, S. (1987) Eur, J. Biochem.

165, 491-498.

Prody, C., Zevin-Sonkir.. L. , Gnaltt, A., Goldberg, 0., ' WO 91/18923

PCT/SE91/00381 & Soreq, Π. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3555-3559.

51. Sikorav, J-L., Krejci, E. & Massoulie’, J. (1987) 2MBO J. 6, 1865-1873.

52. Oakeshott, J.G. Collet, C., Phillis, R.W., Nielsen, K.M., Russel, R.J., Cambers, G.K., Ross, V. & Richmond, R.c. (1987) Proc. Natl'. Acad, Sci, USA 84, 3359-3363. s

53. Long, R. , Satho, H., Martin, B.,|Kimura, s.,

Gonzalez, F. & Pohl, L. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 156, 866-873.!

54. Hall, L.M.C. & Spierer, P. (1586) EMBO J. 5, 29492954.;

I

55. Sjoberg, S., Carlsson, P., Enerback, S., & Bjursell,

G. (1989) CABIOS 5, 41-46. i

56. EP-A-317355-i

57. Hernell, 0., and T. Olivecrona. 1974. Human milk lipases li, Bile salt-stimulated lipase. Biochim.

Biophys. Acta 369:234-244.!

58. Hernell, 0., L. Blackberg^ and T. Olivecrona. 1981. Human milk lipases, in Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy. E. Lebenthal, editor.

Raven Press, New York. 347-354.

59. Atkinson, S.A., M.H. Bryan, and G.H. Andersson. 1981. Human milk feeding in premature infants: protein, fat and carbohydrate balances in the first two weeks of life. J.Pediatr. 99:617-624.

60. Chappell, J.E., M.T. Clandinin, cl KearneyVolpe, B. P.eichman and P.W. SwyerJ 1986. Fatty acid balance studies in premature infants fed human milk or formula: effect of calcium supplementation. J. Pediatr. 108:-138-447.

WO 91/18923

PCT/SE91/00381

61. Williamson, S., E. Finucane, H. Ellis, and H.R. Gamsu. 1978. Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterm infants. Arch. 5 Dis. Childhood 53:555-563.

Claims

iiATahTHH 11Р1П1ЛцИИ

1. Протеин,както е означен на Фигура VII с т позиция 1 до 722
2. Протеин,както е означен на Фигура VII 0 т по зиция 1 до 535
3. Протеин,както е означен на Фигура VII 0 т ПОЗИЦИЯ' 1 до 278
4. Протеин както е означен на Фигура VII с т ПО зиция 1 до 341
5. Протеин както е означен на Фигура VII с т позиция 1 до 409
6. Протеин,както е означен на - игура VII с т позиция 1 до 474
7. Протеин ,както е означен на Фигура VII от позиция 1 до 278, позиция 279 до 341,позиция 279 до 409,позиция 279 до 474,позиция 342 до 409,позиция 342 до позиция 474 или позиция 535 до 722.
8. Протеин съгласно която и и,а е от претенции 1-7 в комбинация с ' . е,цип или повече повторения съгласно Фигур< V.
9. Протеин съгласно която и да е претенция στ 1 до 8, обладаваща метионин като допълнителна М-крайна аминокиселина.
10. Протеин съгласно която и да е бт претенции от 1 о 9,показващ един или повече от критичните функции на природно срещана стимулира, на от жлъчните соли липаза.

И, Функционално еквивалентни варианти или мутанти на протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 9.

12, ,ЦНК последователност кодираща протеин с аминокиселинна последователност съгласно претенция 1.
13. № последователност,копираща протеин с р^тнокиселит-тня последог телност'съгласно претенция 2.

14, да последователност,копираща протеин с ат^ножселпнна последователност съгласно коя и да е ат претенции 3,4,5,6,7,8,9,10 и 11.
15. ДНК последователност,дефинирана от сладните пуклеотидни номера

151-2316ί

151-1755 iI

151-985 Ij

151-1172

151-1376

151-1574

986-1172

986-1376

986-1574 1173-1376 1173-1574
16. Вектор,включващ ДНИ последователност,копираща протеин съгласно претенции от 1 до 11.ΐ
17. Βθκτοη,включващ ДНК последователност съгласно претенции от 12 до 15.
18. Гостопрнемнидав организъм, тпансфоршграп с вектор,съгласно πη^ ции ¢6 или 17.j
19. Метод за получаване на протеин съгласно претенции 1-11 ^рез култивиране на гостоприемния,включващ вектор съгласно претенттии j 16 или 17 и изолиране на протеина’
20. Фармацевтичен състав,включващ протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11.;
21. Фармацевтичен състав,включващ протеин съгласно която и да е рт претенции от 1 до 11 в комбинация с липаза или в комбинация с : препарати, съдържащи липаза.
22. Използване на протеин съгласно коя^о и па е от претенции от 1 до 11 за производство на медикаменти за лечение на патологии,отнасящи се до екзокринна панкреатична недостатъчност.
23. Използване на протеин съгласно която и да е от претенции от 1 до 11 за производство на препарат за лечение на циститен фиброзис

- 28 I
24. Използване на пгптеин съгласно коя и да е от претенции от 1 го 11 като допълнение в храната на сукалчета.|
25. Приложение но протеин съгласно коя и да е от поетенции от 1 го 11 за производство на препарат за лечение на хроничен панкреятитис.
26. Приложение на протеин съгласно която и да е от претенции от 1. до 11 за производство на препарат за лечение на мастна. ^алабсорбция
27. Приложение на. протеин съгласно коя и др е от претенции от 1 го Г за производство на преперат за лечение но малабсорбция от мастно . разтворими витатлпни.
28. Приложение-на протеин съгласно коя и л? е от -претенции от 1 го 11 за производство на препарат за лечение яз.мастна малябсорбция причинена от физиологични предпоставки.
29. Приложение,съгласно претенции 22-28 на протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 в комбинация з липаза. или липази или с препарати съдържащи липаза или лцпази.
30. Храна за счкалчета, попълнена с Протеин съгласно коя и да е от i претенции от 1до 11.
31. Протеин съгласно коя и да е от претенши от 1 до 11 в чист вид 32. Протеин съгласно коя и да е от претенции от 1 до 11 в изолиран вид.

33, ДНК последователност съгласно коя и да е от претенции от 12 го 15 в чиста форма.

34, ДНК последователност съгласно претенции от 12 до 15 в изолирана форма.;
35. Метод за получаване на фармацевтичен препарат съгласно претентпп^ 20 или 21 чрез въвеждане н? поотеин съглазно ^ретенции 1-11 ,31 или 32 във фармацевтично подходящ носител.' ^v -1 - _ -г . - *а£1а ъ.“ - ^f 'j ,,

- 29
36. ето,' съгласно претенция 35 за получаване на фармацевтите· състав за орално приложение
37. ’’ето за получаване на храна за сукалче* а съгласно плет. 30 чоез попълване на хваната за сукалчета с протеин съгласно претенции