RO114793B1 - Peptida derivata de lipaza umana stimulata de sarea biliara si secventa de adn ce o codifica - Google Patents
Peptida derivata de lipaza umana stimulata de sarea biliara si secventa de adn ce o codifica Download PDFInfo
- Publication number
- RO114793B1 RO114793B1 RO92-01490A RO9201490A RO114793B1 RO 114793 B1 RO114793 B1 RO 114793B1 RO 9201490 A RO9201490 A RO 9201490A RO 114793 B1 RO114793 B1 RO 114793B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- amino acid
- protein
- peptide
- bssl
- lipase
- Prior art date
Links
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims description 39
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims description 38
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims description 38
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 60
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 7
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 7
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 claims description 6
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 claims description 6
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- 201000007089 exocrine pancreatic insufficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 38
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 abstract description 5
- 101000715643 Homo sapiens Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000052905 human CEL Human genes 0.000 abstract description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 108010087173 bile salt-stimulated lipase Proteins 0.000 description 64
- 102100035687 Bile salt-activated lipase Human genes 0.000 description 62
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 36
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 32
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 17
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 17
- 102100030817 Liver carboxylesterase 1 Human genes 0.000 description 16
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 15
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 15
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 14
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 13
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 8
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 8
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 8
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 6
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 6
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 5
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 5
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 5
- 102000005311 colipase Human genes 0.000 description 5
- 108020002632 colipase Proteins 0.000 description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 5
- 102100033639 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 4
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- AGNTUZCMJBTHOG-UHFFFAOYSA-N 3-[3-(2,3-dihydroxypropoxy)-2-hydroxypropoxy]propane-1,2-diol Chemical compound OCC(O)COCC(O)COCC(O)CO AGNTUZCMJBTHOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101000929928 Homo sapiens Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 3
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100033504 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 3
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 3
- -1 vitamin esters Chemical class 0.000 description 3
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000003914 Cholinesterases Human genes 0.000 description 2
- 108090000322 Cholinesterases Proteins 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031415 Hepatic triacylglycerol lipase Human genes 0.000 description 2
- 108020002496 Lysophospholipase Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101000715641 Rattus norvegicus Bile salt-activated lipase Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 229940048961 cholinesterase Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 150000002314 glycerols Chemical class 0.000 description 2
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LHOLVWOLWSNGKW-DMTCNVIQSA-N (2r,3r)-3,4-bis(sulfanyl)butane-1,2-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](S)CS LHOLVWOLWSNGKW-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- RSOOXPFMVKSKNN-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxyethyl acetate;amino acetate Chemical compound CC(=O)ON.CC(=O)ON.CC(=O)OCCOC(C)=O RSOOXPFMVKSKNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 241001156002 Anthonomus pomorum Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100036806 Carboxylesterase 5A Human genes 0.000 description 1
- 102000004308 Carboxylic Ester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000863 Carboxylic Ester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100036045 Colipase Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108700012227 Drosophila ase Proteins 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000876022 Homo sapiens Colipase Proteins 0.000 description 1
- 101000800133 Homo sapiens Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 101710128782 Liver carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000006447 Phospholipases A2 Human genes 0.000 description 1
- 108010058864 Phospholipases A2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101100235661 Rattus norvegicus Lpl gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108010055297 Sterol Esterase Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L fluoridophosphate Chemical compound [O-]P([O-])(F)=O DWYMPOCYEZONEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 239000002628 heparin derivative Substances 0.000 description 1
- 102000047688 human TG Human genes 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 235000021125 infant nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000001630 jejunum Anatomy 0.000 description 1
- 108010021666 lipase II Proteins 0.000 description 1
- 230000020958 lipid digestion Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N nifedipine Chemical compound COC(=O)C1=C(C)NC(C)=C(C(=O)OC)C1C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O HYIMSNHJOBLJNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004203 pancreatic function Effects 0.000 description 1
- 210000001819 pancreatic juice Anatomy 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 210000004417 patella Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 125000000946 retinyl group Chemical group [H]C([*])([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])=C([H])/C([H])=C(C([H])([H])[H])/C([H])=C([H])/C1=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N tristearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC DCXXMTOCNZCJGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
- A61K8/36—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
- A61K8/361—Carboxylic acids having more than seven carbon atoms in an unbroken chain; Salts or anhydrides thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
- A61K8/37—Esters of carboxylic acids
- A61K8/375—Esters of carboxylic acids the alcohol moiety containing more than one hydroxy group
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/42—Amides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/40—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing nitrogen
- A61K8/44—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof
- A61K8/442—Aminocarboxylic acids or derivatives thereof, e.g. aminocarboxylic acids containing sulfur; Salts; Esters or N-acylated derivatives thereof substituted by amido group(s)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/49—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds
- A61K8/494—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing heterocyclic compounds with more than one nitrogen as the only hetero atom
- A61K8/4946—Imidazoles or their condensed derivatives, e.g. benzimidazoles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/92—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof
- A61K8/922—Oils, fats or waxes; Derivatives thereof, e.g. hydrogenation products thereof of vegetable origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
- A61K2800/59—Mixtures
- A61K2800/596—Mixtures of surface active compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Birds (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Prezenta invenție se referă la o peptidă derivată de lipază umană stimulată de ’ sarea biliară și o secvență ADN, care o codifică, utilizată pentru suplimentarea, substituirea sau terapia lipazelor stimulate de sarea biliară sau a proteinelor cu funcțiuni esențiale a lipazelor stimulate de sarea biliară.
Este cunoscut faptul că, glanda mamară umană în lactație sintetizează și secretă împreună cu laptele o lipază stimulată de sarea biliară (BSSL) (Blackberg, L., Ăngguist, K. A, & Hermell., O. (1987) FEBS Lett. 217, 37...41), astfel încât după activarea specifică prin sărurile primare (Hermell, O. (1987) Eur. J.CIin. Invest, J.CIin. Invest 5, 267...272; Hermell O, & T.Oliv. Crona, 1974, Humanmilk lipase II. Bile salt Stimulated lipase. Biochem. Biophys. Acta 309·. 234...244; Hermell, O., L. Blăckber & T.Olivecrona, 1981. Human milk lipases - în Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor Paven Press, New York. 347...354.) contribuie la capacitatea endogenă a sugarilor de a digera intestinal grăsimea. Helmell, O., Blackberg, L. & Bern Back, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B. S., ed) Bristol-Myers Nutrition Symposia voi. 6, 66. 259...272, Academic Press, New York; Hernell, O. L. Blackberg, B. Fredriczon, and Olivercrona, 1981 - Bile salt-stimulated lipase in human milk and digestion in the neonatal period în Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor. Raven Press, New York
465.. .471; Berback, S., Blackberg, 1. & Hernell, O. (1990) J.CIin. Invest, J.CIin. Invest221 ...225 (1990). Această enzimă, care constituie aproximativ 1 % din totalul proteinei din lapte (Blackberg,L. & Hernell, O. (1981) Eur. J.Biochim, 116,
221.. .225) este o lipază nespecifică. In vitro, ea hidrolizează nu numai tri-, di-, și monoacilgliceroli, ci de asemenea, colesteril- și rectinil esteri, și lizofosfatidilgliceroli (Hermell, □. & Blackberg, L. (1982) Pediatr. D.Guy, □. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288; Fredrikzon, B., Helmell, O., Blackberg,L. & Olivercrona, T. (1987) Pediatr. Res. 12, 1048... 1052; Wang, C.S., Hartsuck, J.A. & Downs, D. (1988), Biochemistry 27, 4834...4840). Mai mult, activitatea sa nu se reduce la substrate emulsionate, ci și substratele solubile și micelare sunt hidrolizate în aceleași proporții (Blackberg,L. & Hermell, O. (1983) FEBS Lett. 157, 337...341).
BSSL nu este degradată în timpul trecerii cu laptele prin stomac, iar în interiorul duodenului, ea este protejată, prin sărurile biliare, de inactivarea prin proteazele pancreatice, cum ar fi tripsina și chimiotripsina (Hermell, □. (1975) Eur. J.CIin. Invest, J.CIin. Invest 5, 267...272; Blackberg, L. & Hermell, □. (1983) FEBS Lett. 157,
337.. .341). Ea este totuși inactivată când laptele este pasteurizat, când laptele este încălzit la 62,5°C, timp de 30 min (Bjorksten, B., Burman, L.G., de Chateau, P., Fredrikzon, B., Gothefore, L. & Serger, H. M.Brown, G-A., Ablitt, L. lyangkaran, n. & Wharton B.A. (1978) Gut 19, 95...98.). Modelul exprimental in vitro sugerează că produsele finale ale digestiei triacilglicerolului sunt diferite în prezența BSSL (Berbaberg, L. & Hermell, O. (1981) Eur. J.Biochem, 116, 221...225; Hermell, O. & Blackberg,L. (1982) Pediatr. Res. 16, 882...885). Datorită concentrațiilor mai scăzute de săruri biliare în interiorul lumenului intestinal, în timpul perioadei de nou născut (Brueton, M. J., Berger, Η. M., Brown, G-A., Ablitt, L. Uyangkaran, N. & Whaton B. A. (1978) Gut 19, 85...98: Murphy, G.M. 8. Signer, E. (1975) Gut 15,
151.. .165), acestea pot fi favorabile pentru a produce absorbția (Helmell, O., Straggers, J.E. & Carey, M.C. Biochemistry (1990) 29:2041...2055).
Ester hidrolaza carboxilică (CEH) din sucul pancreatic uman (Helmell, O., Blackberg, L. (1982) Pediatr. Res. 16, 881...885) pare, din punct de vedere funcțional, a fi cel puțin foarte asemănătoare cu BSSL (Blackberg,L. Lombardo, D., Helmell, D. Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288. De
RO 114793 Bl asemenea, ei au porțiuni epitopice comune (Blackberg.L. Lombardo, D., Helmell, 50
D. Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288: Abgouaskil, N., Rogalska, E., Biocel, J. & Lombardo, S. (1988) Biochim. Biophys. Acta 961
299.. .308), au secvențe de aminoacizi N-terminali identice, (Abgouaskil, N., Rogalska,
E. , Biocel, J. & Lombardo, S. (1988) Biochim. Biophys. Acta 961, 299...308); și sunt inhibați de către inhibitorii serinesterazelor, de exemplu, serină și diizopropil- 55 fluorofosfat (Blackberg.L. & Hermell O (1981) Eur. J. Biochim, 116, 221...225; Blăckberg, L. Lombardo, D., Hermell, O.Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288; Lombardo, D., Guy D. & Figarella, C. (1978) Biochim.Biophys. Acta 527, 142...149. S-a presupus că cele două enzime sunt produse ale aceleiași gene (Hernall, □., Blăckberg, L. & Londberg. T. (1988) în Textbook of gastroenterology and 60 nutrition in infancy, (Lebenthal, E., ed) p. 209...217, Raven Press, New York; Wang, C.S. (1988) Biochem. Biophys. Res. Corn. 155, 950...955). Diferența de mărime moleculară observată (Blăckberg, L. Lombardo, D., Helmell, O.Guy, O. & Olivercrona, T. (1981) FEBS Lett. 136, 284...288: Wang, C.S. (1988) Biochem. Biophys. Res.
Corn. 155, 950...955) poate fi explicată prin două căi diferite de glicozilare, cum s-a 65 sugerat de curând (Abouskil, N., Rogalska, t., Biocel, J. & Lombardo. L. (1988) Biochem. Biophys. Acta 961, 299...308.
Lipidele din regimul alimentar sunt o importantă sursă de energie. Triglicerolii bogați în energie constituie mai mult de 95 % din aceste lipide. Unele dintre lipide, de exemplu, anumiți acizi grași și vitaminele liposolubile sunt constituenți esențiali ai regi- 70 mului alimentar. înaintea absorbției gastrointestinale, triglicerolii ca și componentele minore, de exemplu, vitaminele liposolubile esterificate și colesterolul, și diacilfosfatidilglicerolii, necesită hidroliza legăturii esterice pentru a obține produse absorbabile cu hidrofobicitate scăzută. Aceste reacții sunt catalizate de către un grup specific de enzime, numite lipaze. 75
La omul adult, lipazele esențiale sunt considerate a fi lipazele gastrice, lipaze colipaz-dependente pancreatice (tri și di- acilglicerolhidrolaze), fosfolipaze pancreatice A2 (diacilfosfatidilgliceroli) și esterhidrolaze carboxilice (colesteril și esteri de vitamine liposolubile). La copilul nou născut, lipaza stimulată de sarea biliară joacă un rol deosebit în hidroliza câtorva lipide menționate mai jos. împreună cu sărurile biliare, 80 produsele digestiei lipidelor formează micele mixte de la care are loc digestia ( (Helmell, O., Blackberg.L. & Bern Back, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B.
5., ed.) Bristol-Myers Nutrition Symposia voi. 6, 66, 259...272, Academic Press, New York; Hernell, □. L. Blăckberg, B. Fredriczon, and Olivercrona, 1981. Bile saltstimulated lipase in uman milk and digestion in the neonatal period. în Textbook of 85 gastroenterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor Raven Press, New York
465.. .471; Berback, S., Blăckberg, 1. & Hernell, □. (1990) J.CIin. Invest, J.CIin. Invest 221...225 (1990).
Cauzele comune ale absorbției lipidelor, și de aici ale malnutriției, sunt reducerea nivelelor de colindependente și/sau sărurilor biliare. Exemple tipice de astfel de 90 deficiențe lipazice sunt pacienții care suferă de fibroze chistice- o dereglare genetică obișnuită, care rezultă dintr-o deficiență de lungă durată la aproape 80% dintre pacienți, și pancreatită cronică.
Funcțiile pancreatice și hepatice nu sunt pe deplin dezvoltate, mai ales la copiii născuți înainte de termen. Malabsorbția grăsimilor, din motive fiziologice, este o 95 trăsătură comună și se apreciază că rezultă din concentrațiile scăzute, în lumenul intestinal, ale lipazei pancreatice colipaz-dependente și sării biliare (Helmell, O., Blackberg.L. &Bern Back, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B. S., ed.) BristolRO 114793 Bl
Myers Nutrition Symposia voi. 6, 66, 259...272, Academic Press, New York; Hernell, □.L. Blackberg, B.Fredriczon, and Olivercrona, 1981. Bile salt stimulated lipase in uman milk and digestion in the neonatal period - în Textbook of gastroeneterology and nutrition in infancy, E. Lebenthal, Editor Raven Press, New York 465...471; Brueton, M. J., Berger, Η. M., Brown, G-A., Ablitt, L. lyangkaran, N. & Whaton B. A. (1978) Got 19, 95...98; Murphy, G.M. &Signer, E. (1975) Gut 15, 151 ...165; Hernell, O., Staggera, J. E. & Carey, M.C. Biochemistry (1990) 29:2041...2056). Cu toate acestea, datorită BSSL, astfel de malabsorbții sunt mult mai puțin frecvente la copiii sugari decât la copiii hrăniți cu lapte uman pasteurizat, din preparate pentru copii (Helmell. P., Blackberg,L. & Bern Băck, S (1988) în Perinatal nutrition (Lindblad, B.S., ed. Bristol-Myers Nutrition Symposia, voi. 6, 66, 259...272, Academic Press, New York; Hernell, □. L. Blackberg, B. Fredriczon, and Olivercrona, 1981. Bile saltstimulated lipase in uman milk and digestion in the neonatal period în Textbook of gastroenterology and nutrution in infancy, E. Lebenthal, Editor Raven Press, New York
465...471; Berbăck, S., Blackberg, 1. & Hernell, O. (1990) J. Clin. Invest. J. Clin. Invest. 221...225 (1990); Bjorksten, B., Burman, L.G., de Chateau, P., Fredrikyone, B., Gothefors, L. & Hernell, D. (1980) Br.Med. J. 201,267...272; Atkinson, S. A. Μ. H. Bryan & G. H. Anderson. 1981. Human milk feeding in premature infants:protein, fat and carbohydrate balance in the first 2 weeks of life. J. Pediatr. 99: 617...634; Chappel, J.C.M.T. Clandinin, c. Kearney-Volpe, s. Keichemen and P.W. Swyer. 1985, Fatty acid balance studies of calcium supplementation, D. Pediatr. 108: 438...447; Willimson, S.E. Finucane, H. Ellis, and H, R, Damsu. 1978. Effect of heat treatment of human milk on absorption of nitrogen, fat, sodium, calcium and phosphorus by preterminfants. Arch. Dis. Childhood, 555...563). Acesta este unul din motivele pentru care s-a susținut că noii născuți, în special prematurii, care nu pot fi hrăniți cu lapte de la propriile lor mame, să poată fi hrăniți cu lapte nepasteurizat de la alte mame (Bjoeksten, B., Burman, L.G., deChateau, P., Fredrikyone, B., Gothefors, L. & Hernell, D. (1980) Br.Med. J. 201, 267...272).
Tratamentul actual al pacienților, care suferă de o deficiență a lipazei pancreatice brute, constă în administrarea orală a unor doze foarte mari de preparate brute de enzime pancreatice porcine. Lipaza pancreatică colipaz-dependentă este inactivată la pH mic. Astfel de condiții sunt predominante în stomac și au ca rezultat inactivarea completă a lipazei pancreatice administrată oral din stomac către intestin. De aceea, acest efect nu poate fi complet depășit prin utilizarea unor doze mari de enzime. Dozele mari de administrare sunt inadecvate pentru majoritatea pacienților și preparatele sunt impure și nedigerabile. Au fost formulate anumite tablete care trec prin regiunile acide ale stomacului și eliberează enzima numai în mediul relativ alcalin al jejunului. Totuși, cei mai mulți pacienți care suferă de afecțiuni pancreatice au o aciditate normală în jejun, și astfel de tablete nu reușesc să elibereze enzima, putând fi, de aceea, ineficiente. Mai mult decât atât, întrucât preparatele prezente pe piață nu sunt din sursă umană, există riscul de imunoreacție care poate cauza efecte dăunătoare pacienților, sau au ca urmare reducerea eficienței terapeutice. Un alt dezavantaj legat de preparatele prezentate este acela că ele au alte activități lipolitice decât lipaza colipaz-dependentă și nu sunt stabile. De fapt cele mai multe dintre acestea au nivele foarte scăzute de activitate CEH/BSSL. Acesta poate fi unul din motivele pentru care mulți dintre pacienții care suferă de fibroză chistică, în ciuda suplimentării terapiei, suferă de deficiențe ale vitaminelor liposolubile și acizilor grași esențiali.
Astfel, este o mare nevoie de produse cu proprietăți și structuri derivate de la lipazele umane și cu o specificitate completă a substratului, produse care trebuie să
RO 114793 Bl fie administrate oral pacienților care suferă de o lipsă a uneia sau câtorva enzime pancreatice lipolitice.
Din punct de vedere istoric, preparatele pentru copii s-au dezvoltat și îmbunătățit, de la conceptul asemănării compozițiilor cu cel al laptelui uman, atât cât poate fi posibil. Este de dorit ca astfel de preparate să fie completate.
Utilizarea pentru suplimentare, substituire sau terapie a lipazelor stimulate de sarea biliară (BSSL), sau a proteinelor cu funcțiuni esențiale ale BSSL, necesită totuși acces la cantități de produs la scară industrială. La nivel industrial, aceasta nu este posibil pe bază de surse naturale, cum ar fi laptele ca materie primă. Pe lângă problema menționată mai sus, de inactivare a BSSLîn timpul pasteurizării, există, în plus, riscul contaminării materialului din surse naturale cu agenți infecțioși, de exemplu, este nevoie de produse având proprietăți BSSL produse pe scară largă.
Prezenta invenție se referă la o peptidă derivată de lipaza umană stimulată de sarea biliară și secvența ADN ce codifică peptida derivată de lipază umană stimulată de sarea biliară.
Peptida derivată de lipaza umană stimulată de sarea biliară, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că are lanțul de aminoacizi indicat în fig.7 de la 1 la 722.
Secvență ADN care codifică peptida derivată de lipaza umană stimulată de sarea biliară, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că lanțul de nucleotide este dat în fig.2, de la 151 la 2316.
Produsele prezentei invenții, înlătură dezavantajele prezentate mai sus, singure sau în combinație cu alte lipaze, sau în combinație cu preparate care conțin alte lipaze. Mai mult decât atât, pentru unii copii, există o nevoie evidentă de a îmbunătăți utilizarea grăsimii din preparatele convenționale pentru copii sau laptele uman pasteurizat din așa-numitele bănci de lapte.
BSSL a avut câteva proprietăți unice ce o fac ideală pentru substituirea și suplimentarea terapiei:
- este destinată pentru administrare orală; astfel, ea rezistă trecerii prin stomac și este activată în interiorul intestinului subțire. Mecanismul său specific de activare va preveni lipazele întâmplătoare provenite din alimente sau pe cele ale țesuturilor lipidice în timpul păstrării sau trecerii lor prin locul său de substrat, are potențialul său propriu de a media digestia completă a majorității lipidelor alimentare, incluzând esterii vitaminelor liposolubile. BSSL poate fi superioară lipazei pancreatice colipaz-dependente de a hidroliza legăturile esterice care conțin lanțuri lungi de acizi grași polinesaturați.
In prezența lipazei gastrice și în absența sau la nivele scăzute de lipază colipazdependentă, BSSL poate stabili o digestie completă a triglicerolului, in vitro, chiar dacă nivelele sării biliare sunt scăzute, așa cum sunt la noii născuți. In prezență de BSSL, produsele finale ale digestiei triglicerolului devin acizi grași liberi și gliceroli liberi, de preferat în locul acizilor grași liberi și monoacilglicerolului generat de alte două lipaze. Aceasta poate favoriza provocarea absorbției, în special când nivelurile de sare biliară sunt scăzute în lumenul intestinal.
Prezenta invenție se bazează pe donarea cADN-ului care codifică BSSL derivată din glanda mamară umană. S-a izolat, de asemenea, din pancreasul uman un cADN parțial care codifică CEH. Secvențele de aminoacizi deduse de la cADN-utile umane și combaterea cu CEH de la alte specii, susțin interpretarea că BSSL și CEH sunt identice.
Așa cum va fi detaliat mai jos, s-a găsit că structura proteinei, așa cum s-a
150
155
160
165
170
175
180
185
190
195
RO 114793 Bl dedus din secvența cADN, este complet diferită de structura altor lipaze. Structura neașteptată s-a dovedit a fi mai asemănătoare structurii esterazelor tipice, ca, de exemplu, colinesteraza.
Invenția cuprinde, de asemenea, un vector, cum ar fi construcții de plasmide care cuprind astfel de secvențe ADN, capabile să exprime enzima dorită. Invenția mai cuprinde și organisme gazdă transfectate cu astfel de construcții, ca de exemplu, bacterii, drojdii, invenția include și procedee pentru prepararea noilor produse ale invenției. Noile peptide ale invenției sunt în legătură cu o enzimă cunoscută ca lipază umană stimulată de sare biliară.
Produsele invenției sunt:
a) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-722 în fig. 7;
b) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-535 în fig.7;
c) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-278 în fig.7;
d) o proteină cum este definită prn secvența de aminoacizi 1-341 în fig.7;
e) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-409 în fig.7;
f) o proteină cum este definită prin secvența de aminoacizi 1-474 în fig.7;
g) combinațiile de proteine definite de la b) - f) de exemplu, definite prin secvențele de aminoacizi în pozițiile 1-278, 27-9341, 279-409, 279-474, 342-474 și 536-722;
h) combinațiile de proteine definite de la b) -f) în combinație cu una sau mai multe din repetițiile corespunzătoare fig.5;
I) o proteină cum a fost definită de la a)-h) care posedă în plus ca aminoacid Nterminal, metionina, și variantele funcționale echivalente și mutantele proteinelor definite în a) -I) de mai sus;
Este de notat că proteinele de la a), b), c), d], e), f), h) și I] de mai sus nu vor fi identice cu BSSL întâlnită natural, dar ele vor prezenta una sau mai multe dintre funcțiunile critice ale BSSL întâlnite natural.
j) o secvență ADN care codifică proteinele definite în a), b), c), d), e), f), h) și I) de mai sus.
k) o secvență conform fig.2, definită prin următoarele secvențe de nucleotide în fig.2:
- o secvență AND 151-2316, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-722 în fig.7;
- o secvență AND 151-1755, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-585 în fig.7;
- o secvență AND 151-985, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-278 în fig.7;
- o secvență AND 151-1172, conform fig.2 care codifică proteina prin secvența de aminoacizi 1-341 în fig.7;
- o secvență AND 151-1376, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-409 în fig.7;
- o secvență AND 151-1574, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 1-474 în fig.7;
- o secvență AND 151-1172, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 279-341 în fig.7;
- o secvență AND 986-1376, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 279-409 în fig.7;
- o secvență AND 986-1594, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 279-474 în fig.7;
RO 114793 Bl
250
- o secvență AND 1173-1376, conform fig.2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 342-409 în fig.7;
- o secvență AND 1173-1574, conform fig. 2 care codifică proteina definită prin secvența de aminoacizi 342-474722 în fig.7;
Proteinele invenției au următoarele funcții semnificative:
a) sunt adecvate pentru administrare orală;
b) sunt activate prin săruri biliare specifice;
c) acționează ca lipaze specifice în interiorul intestinului subțire, deci sunt capabile să hidrolizeze lipide relativ independent de structura lor chimică și de starea lor fizică (emulsionate.micelare, solubile);
d) capacitatea de a hidroliza trigliceroli cu acizi grași având lungimi ale catenelor diferite și grad diferit de nesaturare;
e) capacitatea de hidroliză, de asemenea, a glicerolilor, monoglicerolilor, ester colesterolilor lizofosfatildiacilglicerolilor, retinil și alți esteri de vitamine liposolubile;
f) capacitatea de hidroliză nu numai a legăturilor ester sn-1 (3) într-un triglicerol, ci de asemenea, legătura sn-2;
g) capacitatea de a interacționa nu numai cu săruri biliare primare ci și cu cele secundare;
h) dependența de săruri biliare pentru activitatea optimă;
i) stabilitatea, în așa fel încât, conținutul gastric nu va afecta eficiența catalitică într-o măsură substanțială;
j) stabilitatea împotriva inactivării prin proteaze pancreatice, de exemplu tripsină, asigurată prin prezența sărurilor biliare;
k) capacitatea de a se lega la heparină și derivați de heparină, de exemplu, heparinsulfat;
l) capacitatea de a se lega la interfaze lipide-apă;
m) stabilitatea, care permite liofilizarea;
n) stabilitatea când sunt alimentați cu constituenți alimentari,cum ar fi laptele uman sau în preparate de lapte.
Funcțiile critice pentru suplimentare, înlocuire sau terapie,sunt cele conform cu a), c), d), e), f), i], j) și i). Pentru alte scopuri, nici o altă funcțiune critică nu trebuie să fie necesară.
Pentru expresiile proteinelor indicate mai sus,secvențele ADN indicate vor fi inserate într-un vector adecvat, care apoi se introduce într-un organism gazdă potrivit. Numitul vector, de asemenea, va cuprinde un semnal necesar și alte secvențe care permit organismului să exprime proteina dorită.
Organismele potrivite pentru expresie. Cu tehnicile ADN recombinant este posibil să se doneze și să se exprime o proteină de interes într-o varietate de organisme gazdă procariote și eucariote. Organisme posibile pentru expresie sunt: bacterii, eucariote simple (drojdii), culturi de celule animale, culturi de celule de insecte, culturi de celule de plante, plante și animale transgenice. Fiecare sistem individual are avantajele și dezavantajele sale specifice. Simpla concluzie este că pentru a fi exprimată fiecare genă este o problemă unică și nu există o soluție standard, accesibilă.
Sistemele bacteriene utilizate în mod curent sunt E.coli, Bacillus subtilis, Streptomyces. Drojdiile folosite de regulă sunt Saccharomyces și Pichia Pastoris. Celulele de animale folosite, de regulă sunt celulele CHO și celulele COS. Culturile de celule de insecte uzuale sunt celulele derivate de la Drosophila.
Planta folosită în mod obișnuit este tutunul. Animalele transgenice posibile sunt capra și vaca.
255
260
265
270
275
280
285
290
RO 114793 Bl
Vectorii bacterieni posibili sunt pUC și vectorii proteinei A.
Vector posibil la drojdii este pUC.
Vectorii posibili la insecte sunt derivați de la Baculo-virus.
Vectorii posibili de la celule animale sunt derivați de la SV/4O.
Vectorii posibili la plante sunt derivați de la plasmida-Ti.
In oricare sistem, pot fi folosiți promotori și terminatori atât naturali cât și sintetici.
Se înțelege că în funcție de alegerea sistemului de expresie, proteina exprimată poate să conțină un aminoacid N-terminal suplimentar (metionina), să conțină câțiva extraaminoacizi, sau să fuzioneze la o proteină heterologă (exemplu proteina A], sau să difere de proteina întâlnită în mod natural în glicozilări. Mai mult decât atât, vectorii trebuie să conțină, de asemenea, secvențe semnal în vederea eliminării proteinei spre periplasmă sau spre mediul de cultură.
Astfel, ulterioarele aspecte ale invenției sunt:
a) un vector care cuprinde o secvență ADN care codifică o proteină cum este specificat mai sus;
b) un organism gazdă care cuprinde o secvență ADN cum s-a specificat mai sus
c) un procedeu pentru obținerea unei proteine cum s-a specificat mai sus, prin creșterea unui organism gazdă care conține un vector cum s-a specificat la a] de mai sus și izolarea proteinei.
Metodele pentru purificare se bazează pe sistemul de expresie (de exemplu, proteina A/lgG) și/sau pe metodele folosite la purificarea enzimelor naturale așa cum este descris în Blackberg, L. & Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221 ...225
Aspectele suplimentare ale invenției sunt:
- o compoziție farmaceutică care cuprinde peptida derivată a lipazei umane stimulată de sarea biliară, cum s-a specificat mai sus;
- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru obținerea unui medicament pentru tratamentul unei stări patologice legată de insuficiența pancreatică exocrină;
- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru producerea unui medicament pentru tratamentul fibrozei chistice;
- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, ca supliment pentru un preparat alimentar de uz pediatric;
- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru obținerea unui medicament pentru tratamentul pancreatitei cronice;
- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul malabsorbției vitaminelor liposolubile;
- utilizarea unei peptide, descrisă mai sus, pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul malabsorbției grăsimilor datorat unor cauze fiziologice, de exemplu, la copii nou născuți.
Secvența ADN din fig.2 de la poziția 151 până la, inclusiv poziția 2316, este secvența care codifică întreaga proteină. Secvența de la poziția 2317 până la, inclusiv, 2415, nu este translatată în proteină, dar este inclusă în exonul de identificat în tabelul 2 de mai jos.
Intr-o realizare a invenției, peptida, cum este definită în paragrafele a)-l) de mai sus este asigurată în formă izolată și/sau în formă substanțial pură.
Secvențele ADN, așa cum au fost definite în paragraful a]-k) de mai sus, sunt într-o formă de realizare a invenției, obținute sub formă izolată și/sau sub formă substanțial pură.
RO 114793 Bl
In prezenta descriere, s-au folosit următoarele abrevieri:
- aa = aminoacid;
bp = baze pereche;
BSSL = lipază stimulată de sarea biliară:
c-AMP =adenozin monofosfat ciclic;
CEH = ester hidrolaza carboxilică;
Da = dalton;
c-7-GPT = 7-deaza-2-deoxiguanozin-5-trifosfat;
EDTA = etilen-diamino-tetraacetat kb = kilobaze;
MOPS = acid 6-N-morfolinpropansulfonic;
nt = nucleotide:
PAGE = electroforeză în gel de poliacrilamidă;
SDS = dodecil sulfat de sodiu;
SSC = NaCI citrat;
xGal = 5-bromo-4-cloro-6-indolil-p-D-galactopiranozidă.
In continuare, se prezintă exemplele de realizare a invenției în legătură cu fig. 1...7, care reprezintă:
-fig.1, separarea digestului triptic al BSSL prin HPLC.
BSSL purificat s-a tratat cu tripsină și s-a cromatografiat prin HPLC, așa cum s-a descris în Materiale și metode. Vârfurile indicate s-au colectat și s-au purificat în continuare printr-o recromatografie și s-a determinat secvența lor de aminoacizi.
-fig.2, secvența nucleotidică cDNA și secvența de aminoacizi dedusă pentru lipaza umană stimulată de sarea biliară.
cDNA-ul are o lungime de 2428 baze. Secvența de 23 codoni N-terminală (nt 82-150) care începe cu un ATG, se interpretează ca o peptidă lider, în timp ce secvența de aminoacizi N-terminală a proteinei mature începe la codonul 24 (nt 151, Ala). Peptida lider este subliniată. Semnul * indică punctul de start al unui axon. Semnul ** indică punctul de start al părții de repetiție.
- fig.3, secvența de nucleotidă a repetițiilor C-terminale bogată GC în lipază stimulată de sare biliară.
Substituțiile sunt indicate prin următorul semn *
-fig.4, hibridizarea petei Northern.
Analiza Northern a ARN-ului total izolat din glanda mamară umană în lactație, pancreas, țesut adipos și o linie celulară a hepatomului uman (HepG2). ARN-ul total (10 pg) din glanda mamară în lactație (bandaA), pancreas (bandaB), țesutul adipos (bandaC) și HepG2 (bandaD) au fost supuse electroforezei în gel de agaroză1% tampon MOPS 40mM la pH=7,0, după denaturarea ARN-ului în glioxal 1M, dimetilsulfoxid 50% și MOPS 40mM. ARN-ul glioxilat a fost apoi transferat pe hârtie de nitroceluloză pentru hibridizare cu BSSL cDNA (ABSSL) marcat cu (32P).
-fig.5, compararea secvenței deduse de aminoacizi din BSSL din lapte uman, lizofosfolipaza pancreatică de la șobolan (Ratlpl) (40) și colesterolesteraza pancreatică bovină (Bovceh) (41).
Resturile de serină implicate în situl activ sunt indicate prin * și * * și indică singurul semnal posibil de N-glicozilare al proteinei. Repetițiile directe ale secvențelor de aminoacizi sunt încadrate. Secvențele ajustate sunt marcate cu litere mari. Secvențele ajustate dintre două enzime sunt marcate cu litere mici și discordanțele cu un punct.
- fig.6, compararea structurii primare cu alte esteraze, tiroglobulina și un cAMP dependent de enzimă de la Dictyostelium discoideum.
345
350
355
360
365
370
375
380
385
390
RO 114793 Bl
BSSL: lipază stimulată de sarea biliară de la om, Cheshum: acetilcolinesterază de la Torpedo marmorată (51), Torpace Cheshum: colinesterază din țesut fetal uman (5), Drosceh: hidrolază carboxilică de la Drosophila melanogaster (52), Ratlivce: carboxilesteraza din ficat de șobolan (53), Drosace: acetilcolinesteraza din Drodophila melanogaster (54), Thyrhum: tiroglobulina de la om (49) și Dict.Di: c.AMP dependent de enzima de la Dictyostelium discoideum (469). Există 7 domenii diferite care arată asemănările dintre enzime. Căsuțele includ resturile care sunt identice și literele mici în secvență consens indică resturile identice în toate enzimele, cu excepția uneia. Punctele indică neconcordanțe. Restul de serină cuprins în situl activ este indicat cu *. Figura din colțul din dreapta arată cum sunt orientate domeniile.
- fig.7 și 7’, indică secvența de aminoacizi de la 1 la 722 pentru întreaga proteină (un cod literal) și indică exonii a, b, c și d. Semnul ** indică punctul de plecare al părții care se repetă.
Exemplul 1.
Enzime folosite:
- lipaza stimulată de sarea biliară EC 3.1.1.3;
- ester hidrolaza carboxilică EC 3.1.1.1.
Materiale și metode:
A) Enzima și prepararea anticorpului.
BSSL este purificat din laptele uman așa cum s-a descris mai sus (Blackberg, L. & Hernell, O. (1981), Eur. J. Biochem, 116, 221...225). Când s-a folosit pentru producerea anticorpului, enzima a fost purificată, ulterior prin SDS-PAGE. Banda de proteină care corespunde lipazei este, după colorare cu Coomassie Brilliant Blue, electroeluată din gel. 25 pg de enzimă purificată, împreună cu un volum egal de adjuvant Freud complet și s-a folosit pentru o primă injecție i.c. și aceeași cantitate de enzimă cu adjuvant incomplet pentru injecțiile ulterioare lunare de susținere. Se recoltează sânge de la iepurii injectați la aproximativ 2 săptămâni. După fiecare serie de tratament, serul preparat s-a păstrat la -20°C.
A) Prepararea fragmentelor triptice și analiza secvenței de aminoacizi.
mg de BSSL purificată și dizolvată într-un ml de tampon tris-HCI 0,1 M, pH=8,5, care conține 6 M clorhidrat de guanidină și 2 mM EDTA. Se adaugă ditioeritriol până la 5 mM. După incubare la 37°C timp de 2 h, se adaugă 300 pg iodoacetat 50 mM. După incubare 90 min, la 25°C, la întuneric, enzima redusă și carboximetilată este desalinizată pe o coloană de Sephadex C-25, echilibrată cu bicarbonat de amoniu 0,5M. 30 pg de tosil-L-fenilalanin-clormetan se tratează cu tripsină bovină (Worthington Diagnostic System Inc., Freehold, NJ, USA), se adaugă înainte de liofilizare. Proteina liofilizată se dizolvă în 4 ml bicarbonat de amoniu □, 1 M și se adaugă un plus de 90 pg tripsină. Digeratul triptic se dizolvă în acid trifluoracetic 0,1 % (2 mg/ml). 300 pg de BSSL tripsinată este cromatografiată prin HPLC folosind o coloană C-18 în fază inversă și este eluată cu un gradient de acetonitril O... 50 % prin înregistrarea continuă a absorbției la 215 nm. Peptidele de secvențiat sunt apoi purificate prin cromatografiere în aceeași coloană având gradienți ajustați.
Probele de fragmente de peptide de secvențiat sunt uscate sub azot pentru a îndepărta acetonitrilul și sunt puse la un aparat de secvențiere. Pentru analiza secvenței N-terminale,BSSL naturală se dizolvă în acid acetic 0,1 %. Analizele secvenței se realizează pe un aparat de secvențiere cu pulsație în fază lichidă Applied Biosystems Inc. 477A și în direct cu un analizator PTH 180A cu programe de reglare ciclică și reactivi de la fabricant. Randamentele inițial și repetitiv calculate pe proteină standard, secvențiată, β-lactoglobulină, au fost 47 și respectiv 97 %.
RO 114793 Bl
445
C) Izolarea ARN-ului.
Probele de adipoză pancreatică umană și țesut din glandă mamară în lactație sunt obținute chirurgical și sunt puse imediat în tiocianat de guanidină (1...5 g în 50 ml). ARN-ul total este extras așa cum este descris de către Chirgwin, J.. M. Przybyla, A. E. MacDonald R. J. & Rutter, W. J. (1979). Poli(A)-ARN-ul se prepară prin cromatografie pe o coloană oligo-dezoxitimidilat-(oligo(dT)(-celuloză (Aviv, H. & Leder, P. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 5201...5205).
D) Construcția și cercetarea depozitelor de cADN.
Aproximativ 15 pg de ARN poliadenilat din pacreasul uman s-a denaturat cu hidroxid metil mercuric(Bailey, J.M. & Davidson, N. (1976), Anal. Biochem, 70,
75...85), s-a inițiat cu oligo inițiatori (dT)12.16 (Pharmacia, Upssala, Sweden], și s-a transcris invers folosind procedee standard (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambook J. (1982): Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Sinteza catenei secundare s-a realizat conform lui Gubler și Hoffman (Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983), Gene 25, 263...269), cu excepția faptului că And-ligaza și β-NAD au fost omise și temperatura reacției s-a menținut la 15°C. Excesul de ARN a fost digerat cu ARN-aza A, și cADN-ul dublu catenar s-a tratat cu EcoRI metilaza (Maniatis t., Haldison, R., Lacy, E., Lauer, J. O'Conell, C. & □von, D. (1978), Cell 15, 687...701). Capetele au fost teșite cu enzima Klenow. După ligarea la linkerii EcoRI și clivarea cu EcoRI, cADN-ul s-a fracționat pe o coloană de Sepharoze 48-C1. Fracția de volum eliminat a fost precipitată cu etanol și cADN-ul a fost ligatîn situl EcoRI a unui vector gtll tratat cu o fosfatază (Young, R. A. & Davids, R. W (1983), Science 222, 778...782). In vitro, se obțin mai mult de 7 x 105 recombinați.
Un stoc de cADN din glanda mamară derivat dintr-un țesut obținut de la o femeie în luna a Vlll-a de graviditate, s-a procurat de la Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; USA.
Fagii de la depozitele cADN se plasează la 5 x 104 pe plăci care formează unități pe discuri de 120 mm. Antiserul se diluează la un raport de 1:3200 și se realizează selecția conform lui Zoung și Davis (Young, R. A. & Davids, R. W (1983), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 80, 1194. ..1198). Ca anticorpi secundari, s-au folosit anticorpii capră-anti-iepure conjugați cu alcalinfosfataza., (Bio-Rad, Richmond, CA USA). Pentru a izola clone care corespund capătului 5 al mARN-ului, acidul nucleic hibridizat a fost definit în condiții standard (Maniatis, t., Frirsch, E. F. & Sambrook, J. (1982): Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), folosind un fragment subclonat de la una din clonele imunopozitive ca o sondă.
E) Analiza ARN.
Electroforezele se realizează într-un gel de la 1 % agaroză în tampon MOPS 40mM, pH=7,0 după denaturare cu glioxal și dimetilsulfoxid (McMaster, G.K., & Charmichael, G.S. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci.,USA 74 48 353...48 358), ARN-ul total glioxilat se trasferă apoi pe filtre din nitroceluloză. Petele se probează cu subclone de BSSL și CEH recombinat care s-au caracterizat prin tehnica oligo-cloning (Feinberg, A. P. &Vogelstein, B. (1983), Analyt. Biochem. 132, 6...13. Prehibridizările și hibridizările se realizează cu formamidă 50 % la 45°C (Maniatis, t., Fritsch, E. F. & Sambrook, J. (1982): Molecular Cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York),. Spălările posthibridizare se realizează cu strictețe (0,1 % SDS și 0,1 x SSC la 60°C). (1 x SSC, 0,15 M NaCI, 0,0015 M Na3 citrat, pH=7,6).
450
455
460
465
470
475
480
485
490
RO 114793 Bl
495
500
505
510
515
52Q
525
530
Secvența de nucleotide.
Inserții de cADN din recombinantii de BSSL si CEH s-au donat fie direct în I ’ '
M3mp18 după sonicare și fracționare de mărime, fie unii din ei s-au subclonat, în continuare, în pTZ19R, după digestii cu Pstl, BstXI, Nari, Smal și Ahall. Secvența nucleotidică s-a determinat prin metoda dideoxi a lanțului terminal (Sânger, F., Nicklen, S. SCoulson, a.R. (1977), Proc. Natl. Aca. Sci., USA 74, 5463...5467. Repetițiile GCbogate sunt, de asemenea, secvențate cu polimeraza Taql și 7GTP. Ambele catene sunt secvențate. Informația din secvență a fost recuperată din autoradiograme prin folosirea de software MS-EdSeq cum a descris Sjoberg și alții.
Secvențe anticipate de aminoacizi și omologi.
Pentru a anticipa secvențele de aminoacizi corespunzătoare inserțiilor de cADN, codonul uzual al diferitelor cadre citite se compară conform lui Staden și dă un cadru deschis pentru citire (Staden, R, 1984, Nuci. Acids Res, 12, 551...567). Omologii sunt cercetați cu programele din pachetul software UWGCG (Devereux, J., Haeberli.P., Smithies, O., 19B4), Nuci. Acids Res, 12, 387...395.
Rezultate și discuții.
A) Secvențele fragmentelor triptice și N-terminal ale BSSL.
Digestia cu tripsină a BSSL purificată dă aproximativ 50 de fragmente care sunt apreciate prin numărul de vârfuri obținute în timpul cromatografiei HPLC (fig. 1). Se colectează vârfurile și cele indicate care au putut fi izolate în stare foarte pură și sunt secvențiate cantități rezonabile.
Secvențele rezultate sunt prezentate în tabelul 1. In plus, sunt secvențate majoritatea dintre cele 30 de resturi N-terminale (fig.2) și ele confirmă secvența raporată anterior de Abouakil și alții (30 de resturi) (Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J., Lombardo.S., 1988, Biochim. Biophys. Acta 961,299...308).
Secvența lungă de 22 de resturi N-terminale raportate de Wang.c.S. și Johnson.K., Anal.Biochem.{'} 983, 133, 457...461), în lucrarea noastră, este o glicină și o lizină în cea a lui Wang și Johnson.
B) Secvența nucleotidică a BSSL.
Pentru construcția stocului de cDNA Ăgtll se folosește ARN poliadenilat din pacreas uman. Inițial se izolează patru clone imunopozitive și apoi acest stoc de expresii pancreatice cDNA este selectat cu antiser împotriva BSSL. Analiza secvenței nucleotidice a celor 4 clone arată că ele sunt într-un perfect acord și corespund terminației 3' a ARNm. Toate încep cu un capăt poli A și diferă ca lungime; cel mai lung insert, denumit ACEH, cuprinde 996 bp.
Un depozit cDNA din glanda mamară umană este selectat cu antiser și clona ACEH de pancreas ca sondă. Clonele pozitive se izolează din ambele selecții, toate care au originea în capătul 3'.
Cea mai lungă clonă din glanda mamară, denumită ABSSL, poate să atingă mai mult de 2100 bp. Ea conține din fragmentele triptice secvențate (fig.2), dar nu include secvența aminoacidului N-terminal. Pentru extinderea secvenței dincolo de începutul translării, depozitul cDNA din glanda mamară este reselectat cu o sondă de 118 baze lungime derivată de la majoritatea părții 5' aproximativ a ABSSL. Se izolează o clonă care conține un plus de mai mult de 328 nucleotide. Secvența de aminoacizi N-terminală se ajustează și conține ceea ce a mai rămas din fragmentul triptic. Așa cum arată fig.2, cDNA-ul are lungimea de 2428 nucleotide și conține 81 de baze mai sus de primul codon ATG. Semnalul de poliadenilare, AATAAA, este localizat la 13 nucleotide mai sus de terminația poli A și codonul de terminație TAG se găsește la nucleotida 2317 urmată de o regiune 3' netranslată de 112 bp.
535
RO 114793 Bl
Se găsește o regiune GC bogată care constă în 16 repetiții a 33 de baze în terminația 3' a secvenței dintre baza 1756 și 2283. Secvența de nucleotide a repetiției, prezentată în fig.3, constă în 5 repetiții identice înconjurate de către 10 repetiții cu număr diferit de substituții care probabil se întâlnesc după câteva duplicări.
Numărul scăzut de substituții sugerează că aceste repetiții au apărut târziu în cursul evoluției.
C) Distribuția țesutului de expresie.
ARN-ul din glanda mamară umană în lactație, pancreas, țesut adipos și dintr-o linie celulară de hepatom (HepG2) se analizează prin pete Northern. Mărimea mesagerului este determinată a fi aproximativ 2,5 kb atât în glanda mamară în lactație, cât și în pancreas. Nu se poate detecta nici un semnal în benzile cu ARN extras din HepG2 sau țesutul adipos (fig.4).
Chiar dacă ARN-ul folosit pentru depozitul de glandă mamară se obține de la o femeie în luna Vlll-a de graviditate, este evident că transcripția și, probabil, translația genei BSSL este dirijată înainte de naștere în concordanță cu găsirea de secreție BSSL înainte de naștere (vezi fig.4), Hamosh. (1986) în Human Milk Infant Nutrition and Health, (Howell, R.R., Morriss, F.H. 8. Pickering.L.K. eds), 66...97, Charles, C. Thomas, Springfield.
D) Secvența de aminoacizi a BSSL.
Masa moleculară evaluată prin SDS-PAGE este 107-125 kDa (8,36) și prin ultracentrifugare analitică 105 kDa (Wang.C.S. & Lee, D.M., 1985, J.Lipid Res, 26,
824.. .402). Enzima, așa cum s-a dedus din cDNA, constă din 722 resturi aminoacide (fig.2) care dau o masă moleculară de 76271 Da indicând că enzima conține cel puțin
15.. . 20 % carbohidrați. Secvența lider este lungă de 23 de resturi. La serina 217 (fig.5) este localizat experimental un rest de serină într-o poziție activă. Secvența din jurul acestei serine este în concordanță cu consensul poziției active a secvenței serin hidrolazelor (Brenner.S., 1988, Nature, 334, 528...530). Recent, s-a presupus că resturile bazice găsite în interiorul sitului activ al serinei ar putea fi implicate în clivarea legăturilor ester din acilgliceroli de către lipaze (Yang.C.Y., Gu.Z.W., Yang.H.H., Rihde.M.F., Gotto, Jr., A.H. & Pownall.J.H., 1989, J.Biol.Chem., 265,
16822.. .16827). Este interesant de notat că astfel de resturi nu sunt prezente în BSSL. Singura încercare de sit de N-glicozilare este localizată numai în 7 resturi de la serină. Gradul de glicozilare sugerează că enzima conține un carbohidrat legat (Blackberg.L. & Mernell, □., 1981, Eur.J.Biochem., 116, 221...225; Lombardo, □., Guy.B. & Figarelle.C., 1978, Biochim. Biophys. Acta, 527, 142...149). Aici sunt numeroase situri unde pot fi întâlnite astfel de glicozilări. Compoziția de aminoacizi bazată pe enzima purificată a arătat un conținut ridicat de resturi de prolină (Blackberg.L. & mernell, O., 1981, Eur. J. Biochem., 116, 221...225). Secvența de aminoacizi obținută de la cADN confirmă aceasta. Mai mult, cele mai multe resturi de prolină sunt localizate în 16 repetiții a 11 resturi fiecare, constituind principala parte a jumătății C-terminale a enzimei.
Interpretarea rezultatelor obținute.
Compararea enzimelor din glanda mamară (BSSL) și pancreas (CEH) BSSL din lapte uman și CEH din pancreas uman s-au prezentat mai sus a fi similare, dacă nu identice. Date recente sprijină puternic ideea că cele două enzime sunt produse de aceeași genă. Secvența nucleotidică a clonelor cADN arată că clona pancreatică ACEH este identică cu clona glandei mamare ABSSL de la capătul poli A și 996 baze spre capătul 5' incluzând secvența care codifică pentru repetările bogate în prolină. Pata Northern dă o singură bandă de 2,5 kb în ARN-ul din pancreas și glanda mamară în
540
545
550
555
560
565
570
575
580
585
RO 114793 Bl
590
595
600
605
610
615
620
625
630 lactație. Petele Southern genomice susțin în continuare ideea că pentru BSSL și CEH codifică doar o singură genă. Diferența în mobilitate pe SDS-PAGE dintre BSSL și CEH poate fi explicată ca o consecință a glicozilării diferită sau a îmbinării diferențiale.
Similaritatea enzimelor BSSL la șobolani și bovine (vezi în continuare) și rezultatele de la petele genomice susțin posibilitatea ca îmbinarea diferențială să nu poată fi luată în considerare pentru diferențe de mobilitate. Din moment ce secvența C-terminală nu a fost confirmată pe nivelul de proteină există aici o probabilitate mai mică pentru posibilitatea ca CEH să poată fi produsă printr-un clivaj proteolitic în capătul Cterminal.
In măsura în care cunoaștem enzime pancreatice, acestea evident corespund cu CEH având numele adeseori după felul și specificul substratelor folosite pentru a determina respectivele lor activități: lizofosfolipază, colesterilesterază, sterolesterhidrolază, lipază nespecifică, estercarboxillipază și estercolesterilhidrolază. Datele accesibile sunt compatibile cu faptul că toate aceste activități au fost descrise inițial într-una și aceeași entitate funcțională (Blackberg.L., 1981, Fat digestion in newborn infant, Urnea University Medical Dissertations New Series No.71; Rudd, E.A. & Brockman.H.L., 1984, Lipases, Bergstrim.B. Brockman.H.L. eds., 184...204, Elsevier, Amsterdam). Aceasta ilustrează gama de specificitate de substrat și relevă destinația lor ca lipaze nespecifice. Când secvența BSSL/CEH se compară cu secvența de lizofosfolipază din pancreas de șobolan (Han.J.H., Stratowa.C. & Rutter.W.J., 1987, Biochemistry 26, 1617...1625) și colesterolesteraza din pancreas bovin (Kyger.S., Wiegand.R. & Lange.L., 1989, Biochim. Biophys. Res. Corn, 164, 1302...1309), se găsesc asemănări extensive care se întind la aproximativ 530 de resturi de la N-terminal (fig.5); dar ele diferă în partea moleculei unde se întâlnesc repetițiile. Enzima de la șobolan a avut numai 4 repetiții și enzima bovină 3. Deci, enzima umană este o peptidă considerabil mai lungă.
Mai mult, s-au găsit asemănări izbitoare între BSSL și un număr de esteraze tipice, de exemplu, acetilcolinesterazele de la câteva specii, inclusiv om și Drosophila și carboxilesteraze (fig.6). Aceste asemănări sunt restrânse la 300 resturi N-terminale ale BSSL care includ restul de serină în situl activ experimental. O asemănare cu acetilcolinesteraza a fost presupusă de faptul că BSSL este inhibat de către inhibitori tipici ai colinesterazei ((Blackberg.L. & Mernell, O., 1981, Eur.J.Biochem., 116,
221.. .225; Blackberg, L., Lombardo. D., Hernell, O., Guy, O. & Olivercrona.T., 1981, FESS Lett. 136, 284...288; Lombardo,O., Guy,B. & Figarelle, C., 1978, Biochim. Biophys. Acta”, 527,142...149). Cu posibila excepție a carboxilesterazei din ficatul de șobolan (Cammuli, E.D., Like.M.J., Brockman, H.L. & Hui.O.Y., 1989, Biochim. Biophz. Acta”, 1005, 177...182), niciuna dintre aceste enzime similare nu au apărut a avea aceeași dependență de sarea biliară ca BSSL; aceasta sugerează că baza structurală pentru această proprietate constă în partea C-terminală a proteinei. Mai mult, BSSL poata ataca eficient substrate emulsionate, ceea ce nu este cunoscut a fi caracteristic esterazelor similare. Pentru această activitate, sarea biliară este o condiție obligatorie.
Secvența propusă pentru BSSL uman s-a comparat cu alte lipaze bine caracterizate de la mamifere. Lăsând la o parte consensul secvenței din jurul sitului activ al serinei (G-X-S-X-G), nu s-au găsit similarități evidente (Mickel.S., Weidenbach.F., Swarowsky.S., LaForge.S. & Scheele.G., 1989, J. Biol. Chem.”, 264,
12895.. .12901).
In plus, la asemănările cu alte enzime, există, de asemenea, asemănări cu un cAMP dependent de proteina de la Dictyostelium discoideum (Mann.S.K. & Firtel.R.A.,
635
RO 114793 Bl
640
1987, Mol.Cell Biol., 7, 458...469) ca și tiroglobulina de la câteva specii (fig.6) (Mercken.L., Simons.M.J., Swîllens.S., Masser.M. & Vassaet.G., 1985, Nature, 316, 647...651; lauro.R., Obici.S., Condliffe.D., Ursini.V.M., Musti,A., Moscatelli.C. & Awedimento.V.E. (1985), Eur.J.Biochem, 148, 7...11; Malthiery.Y, Lissitzky.S., 1987, Eur. J. Biochem.”, 165, 491...498). Asemănările între BSSL și tiroglobulină care cuprinde regiunea sitului activ, dar nu situl activ în sine, arată că aceste strânse legături ale aminoacizilor sunt de o importanță generală mai mare decât simpla susținere a activității enzimatice a esterazelor.
In concluzie, BSSL din laptele uman este constituită din 722 resturi de aminoacizi. Datele accesibile indică evident faptul că, lanțul său peptidic este identic cu cel al CEH pancreatice și sunt codificate de aceeași genă. Cel mai evident este faptul că secvențele lor terminale 3' și secvențele lor aminoacidice N-terminale sunt identice. Omologia găsită la lizofosfolipaza pancreatică de la șobolan și colesterolesteraza pancreatică bovină susține ipoteza că aceste enzime sunt, de asemenea, funcțional identice. Totuși, așa cum s-a sugerat, mărimile moleculare diferite care s-au găsit la diferite specii, nu sunt datorate doar diferențelor de glicozilare; mai degrabă, ele reflectă un număr variabil de repetări ale aminoacidului unsprezece. Asemănarea secvenței de la situl activ între aceste esteraze sugerează că aceste proteine derivă de la o genă comună ancestrală.
Tabelul 1 Secvențe de aminoacizi ale peptidelor BSSL
Datorită interferării vârfurilor non-pozitive, identificarea de resturi în ciclurile 1 și 2 ale secvenței poate fi făcută în peptida 26. Numerele peptidelor se referă la vârfurile din fig. 1.
645
650
655
660
Fragmente triptice
TP16: LysValThrGIuGluAspPheTyrLys
TP19:GlylleProPheAlaAlaProThrLys
TP 20: LeuValSerGIuPheThrIleThrLys
TP24: ThrT yr AlaT yrLeuPheSerHisProSerArg
TP26:
PheAspValTyrGIuSerTrpAlaGInAspProSerGInGluAsnLys
665
670
Tabelul 2
Identificarea exonilor a, b, c și d, numerotați ca în fig. 2 și 7.
| Exon | Localizare | |
| între nucleotidele nr. | între aminoacizii nr. | |
| a | 986-1172 | 279-341 |
| b | 1173-1376 | 342-409 |
| c | 1377-1574 | 410474 |
| d | 1575-2415 | 475-722 |
| întreaga proteină | 151 -2316 | 1 - 722 |
| întreaga proteină | ||
| excluzând repetițiile | 151 - 2316 | 1 - 535 |
675
Claims (9)
- Revendicări1. Peptidă derivată de lipază umană stimulată de sarea biliară, caracterizată prin aceea că, peptidă are lanțul de aminoacizi indicat în fig. 7, de la aminoacidul 1 la aminoacidul 722.
- 2. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că prezintă metionina ca aminoacid N-terminal suplimentar.
- 3. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că prezintă una sau mai multe dintre funcțiile critice ale lipazei umane naturale stimulată de sarea biliară.
- 4. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează în combinație cu lipaza sau lipaze, sau în combinație cu preparate care conțin lipaza sau lipaze, pentru tratamentul unei stări patologice privind insuficiența pancreatică exocrină, pentru tratamentul fibrozei chistice, al pancreatitei cronice, al malabsorbției lipidelor, al malabsorbției vitaminelor liposolubile sau al malabsorbției lipidelor datorate unor motive fiziologice.
- 5. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează ca stimulent în hrana copiilor.
- 6. Peptidă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează sub forma unei compoziții farmaceutice împreună cu un agent purtător acceptabil farmaceutic pentru administrarea orală.
- 7. Secvență ADN ce codifică peptidă derivată a lipazei umane stimulată de sarea biliară definită la revendicarea 1, caracterizată prin aceea că are secvența de nucleotide indicată în fig.2, de la poziția 151 la poziția 2316.
- 8. Secvență ADN, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că cuprinde un lanț de nucleotide capabil de hibridizare, în condiții de hibridizare strictă, într-un lanț de nucleotide conform cu revendicarea 7 și care codifică proteina din fig.7 sau o formă modificată a acesteia, echivalentă din punct de vedere funcțional.
- 9. Secvență ADN, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că cuprinde un lanț de nucleotide care este degenerat, ca rezultat al codului genetic, într-un lanț de nucleotide conform revendicării 7 și care codifică proteina din fig.7 sau o formă modificată a acesteia, echivalentă din punct de vedere funcțional.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9001985A SE9001985D0 (sv) | 1990-06-01 | 1990-06-01 | New chemical products |
| PCT/SE1991/000381 WO1991018923A1 (en) | 1990-06-01 | 1991-05-30 | Derivatives of human bile-salt stimulated lipase, and pharmaceutical compositions containing them |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO114793B1 true RO114793B1 (ro) | 1999-07-30 |
Family
ID=20379662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO92-01490A RO114793B1 (ro) | 1990-06-01 | 1991-05-30 | Peptida derivata de lipaza umana stimulata de sarea biliara si secventa de adn ce o codifica |
Country Status (44)
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HRP930935A2 (en) * | 1992-06-11 | 1994-12-31 | Astra Ab | New dna sequences |
| IS4130A (is) * | 1993-03-01 | 1994-09-02 | Ab Astra | Ný fjölpeptíð |
| SE9300686D0 (sv) | 1993-03-01 | 1993-03-01 | Astra Ab | Novel polypeptides |
| FR2754827B1 (fr) * | 1996-10-17 | 1998-12-24 | Biocem | Lipases pancreatiques et/ou colipases recombinantes et polypeptides dervies produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
| JP2000026311A (ja) | 1998-07-02 | 2000-01-25 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 胃排出能亢進剤組成物 |
| EP1963524A2 (en) * | 2005-12-01 | 2008-09-03 | University of Bergen | Diagnosis and treatment of exocrine pancreatic dysfunction and diabetes using human cel gene |
| PT2561069T (pt) * | 2010-04-23 | 2017-05-22 | Alexion Pharma Inc | Enzima de doença de armazenamento lisossomal |
| CA2810999C (en) | 2010-09-09 | 2023-10-03 | Anthony Quinn | Use of lysosomal acid lipase for treating lysosomal acid lipase deficiency in patients |
| WO2012052060A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) | Method to increase the growth velocity of human infants |
| RU2013123056A (ru) | 2010-10-21 | 2014-11-27 | Сведиш Орфан Биовитрум Аб (Пабл) | Способ повышения всасывания ненасыщенных жирных кислот у грудных детей |
| KR20200018781A (ko) * | 2017-06-19 | 2020-02-20 | 스위디쉬 오르펀 바이오비트럼 에이비 (피유비엘) | 반감기 연장 폴리펩티드를 갖는 융합 단백질 |
| EP4501403A3 (en) | 2019-08-30 | 2025-05-14 | Société des Produits Nestlé S.A. | Engineered lipase variants |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60501758A (ja) * | 1983-07-01 | 1985-10-17 | セルテク リミテツド | タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ベクタ−宿主生物及びそれらの生産方法 |
-
1990
- 1990-06-01 SE SE9001985A patent/SE9001985D0/xx unknown
-
1991
- 1991-05-17 ZA ZA913778A patent/ZA913778B/xx unknown
- 1991-05-18 TW TW080103838A patent/TW221712B/zh not_active IP Right Cessation
- 1991-05-20 DZ DZ910064A patent/DZ1503A1/fr active
- 1991-05-22 NZ NZ238223A patent/NZ238223A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-05-23 MY MYPI91000877A patent/MY111245A/en unknown
- 1991-05-27 IL IL9827391A patent/IL98273A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-05-29 EG EG33391A patent/EG19937A/xx active
- 1991-05-29 MA MA22438A patent/MA22166A1/fr unknown
- 1991-05-29 YU YU95191A patent/YU49138B/sh unknown
- 1991-05-30 AT AT91911030T patent/ATE151077T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-30 AU AU79645/91A patent/AU651979B2/en not_active Expired
- 1991-05-30 JP JP91510382A patent/JPH05507201A/ja active Pending
- 1991-05-30 IE IE184491A patent/IE911844A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-05-30 RU RU92016526/13A patent/RU2140983C1/ru active
- 1991-05-30 ES ES91911030T patent/ES2099159T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 HU HU9203774A patent/HU215258B/hu unknown
- 1991-05-30 PL PL91296937A patent/PL166534B1/pl unknown
- 1991-05-30 RO RO92-01490A patent/RO114793B1/ro unknown
- 1991-05-30 UA UA93003780A patent/UA39165C2/uk unknown
- 1991-05-30 SG SG1996006887A patent/SG48078A1/en unknown
- 1991-05-30 DK DK91911030.4T patent/DK0535048T3/da active
- 1991-05-30 CA CA002083396A patent/CA2083396C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 EP EP91911030A patent/EP0535048B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 DE DE69125489T patent/DE69125489T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-30 WO PCT/SE1991/000381 patent/WO1991018923A1/en not_active Ceased
- 1991-05-31 PT PT97836A patent/PT97836B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-05-31 TN TNTNSN91041A patent/TNSN91041A1/fr unknown
- 1991-05-31 SK SK1644-91A patent/SK281089B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1991-05-31 CZ CS19911644A patent/CZ287470B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-05-31 IS IS3710A patent/IS1751B/is unknown
- 1991-06-01 CN CN91104368A patent/CN1075113C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-01 JO JO19911694A patent/JO1694B1/en active
- 1991-06-01 AP APAP/P/1991/000270A patent/AP207A/en active
- 1991-10-11 PH PH43285A patent/PH30761A/en unknown
-
1992
- 1992-10-01 HR HRP-951/91A patent/HRP920771B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-11-24 NO NO19924528A patent/NO322962B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-11-26 BG BG97123A patent/BG61165B1/bg unknown
- 1992-11-30 FI FI925453A patent/FI114639B/fi active IP Right Grant
- 1992-11-30 KR KR1019920703049A patent/KR100212411B1/ko not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-07-30 LV LVP-93-1005A patent/LV10292B/en unknown
- 1993-12-30 LT LTIP1736A patent/LT4020B/lt not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-08 HK HK62497A patent/HK62497A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-05-30 GR GR970401262T patent/GR3023618T3/el unknown
-
2000
- 2000-11-20 CN CN00130975A patent/CN1326782A/zh active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Morimoto et al. | Saposin A: second cerebrosidase activator protein. | |
| EP0503939B1 (en) | Antimicrobial peptide and antimicrobial agent | |
| US6607743B1 (en) | Bone resorption suppressing agent | |
| RO114793B1 (ro) | Peptida derivata de lipaza umana stimulata de sarea biliara si secventa de adn ce o codifica | |
| ES2215940T5 (es) | Traccion proteica basica derivada de la leche como agente para reducir la hipertension. | |
| KR960011522B1 (ko) | 리파아제 및 리파아제 추출물, 그들의 제조방법 및 이를 함유한 지방물질 흡수기능장애 치료용 약제 | |
| JP2764264B2 (ja) | 線溶活性増強剤 | |
| CN102458478A (zh) | 白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途 | |
| JPH01501282A (ja) | 肺胞疎水性界面活性物質関連タンパク質 | |
| KR101856598B1 (ko) | Cpne4 단백질을 포함하는 상아질-치수질환 또는 치주질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| Erickson et al. | Rat intestinal angiotensin-converting enzyme: purification, properties, expression, and function | |
| JP2004331566A (ja) | 皮膚コラーゲン産生促進剤 | |
| WO2023192711A1 (en) | Compositions and methods for delivering bioactive agents | |
| EP1080111B1 (en) | The induction of antiobiotic peptides by lait (scd14) protein | |
| JPS60501758A (ja) | タンパク質、医薬構成物、遺伝子、ベクタ−宿主生物及びそれらの生産方法 | |
| JP3726875B2 (ja) | 歯周病細菌内毒素中和剤、歯周病原因菌付着抑制剤及び口腔用組成物 | |
| KR20230123419A (ko) | 혈전용해 및 항혈전 활성을 나타내는 재조합된 신규 AnthroMedi-DM21 재조합 단백질 | |
| Rattazzi et al. | Toward Enzyme Therapy in Gm2 Gangliosidosis: β-Miexosaminidase Infusion in Normal Cats | |
| Timmermans | Purification, mofecular cloning and expression of the cDNA of bovine pregastric esterase | |
| WO2002061066A1 (en) | Method for producing an enzyme from a novel source | |
| WO2001089553A1 (en) | Enhanced triglyceride digestion in a deficiency of bile salts | |
| JP2004097212A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼに対する抗体酵素、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらを利用したヘリコバクター・ピロリ菌感染患者の治療薬と感染予防剤 | |
| JPH023699A (ja) | 細胞増殖促進性タンパク質、用途並びに単離方法 | |
| JPH0859697A (ja) | ペプチド並びにそれを含有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤、機能性食品及び動物用飼料 |