BG97519A - Метод за получаване на ваксина срещу вируса на човешка имунна недостатъчност - Google Patents
Метод за получаване на ваксина срещу вируса на човешка имунна недостатъчност Download PDFInfo
- Publication number
- BG97519A BG97519A BG97519A BG9751993A BG97519A BG 97519 A BG97519 A BG 97519A BG 97519 A BG97519 A BG 97519A BG 9751993 A BG9751993 A BG 9751993A BG 97519 A BG97519 A BG 97519A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- vaccine
- hiv
- protein
- recombinant
- patients
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 27
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 36
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 claims abstract 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 claims description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 21
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 20
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 20
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 9
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 5
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 claims 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 claims 1
- 229940070376 protein Drugs 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 abstract description 32
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 14
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 12
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 abstract description 6
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract description 6
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 abstract description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 abstract description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 abstract 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 abstract 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 35
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 28
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 28
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 27
- 230000004044 response Effects 0.000 description 24
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 18
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 16
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 16
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 16
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 11
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 11
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 10
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 7
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 7
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 7
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 7
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 6
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 229940124718 AIDS vaccine Drugs 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 3
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 2
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 2
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 229940124622 immune-modulator drug Drugs 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 208000018555 lymphatic system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- PFFIDZXUXFLSSR-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-N-[2-(4-methylpentan-2-yl)-3-thienyl]-3-(trifluoromethyl)pyrazole-4-carboxamide Chemical compound S1C=CC(NC(=O)C=2C(=NN(C)C=2)C(F)(F)F)=C1C(C)CC(C)C PFFIDZXUXFLSSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036962 5'-3' exoribonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000208140 Acer Species 0.000 description 1
- 241001143500 Aceraceae Species 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000132028 Bellis Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100021984 C-C motif chemokine 4-like Human genes 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000008374 Capirona Species 0.000 description 1
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 101710187001 DNA terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010013654 Drug abuse Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 101000804879 Homo sapiens 5'-3' exoribonuclease 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000777471 Homo sapiens C-C motif chemokine 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000737602 Homo sapiens Ceramide synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- DTRYYPKLEYYJTH-UHFFFAOYSA-N I.OP(O)(O)=O Chemical compound I.OP(O)(O)=O DTRYYPKLEYYJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000692870 Inachis io Species 0.000 description 1
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- -1 Pentyl lactin Chemical compound 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000037656 Respiratory Sounds Diseases 0.000 description 1
- 101100397220 Rhodococcus sp. (strain AD45) isoH gene Proteins 0.000 description 1
- 101150071661 SLC25A20 gene Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 206010039740 Screaming Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 241000863032 Trieres Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 206010047924 Wheezing Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 206010001584 alcohol abuse Diseases 0.000 description 1
- 208000025746 alcohol use disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 101150102633 cact gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 210000001061 forehead Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005858 glycosidation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical group CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004969 ion scattering spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 235000021190 leftovers Nutrition 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000009527 percussion Methods 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000002516 postimmunization Effects 0.000 description 1
- 238000009021 pre-vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000004986 primary T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003156 radioimmunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 101150076141 rn gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- JAEKEOGDGMUJNX-UHFFFAOYSA-J sodium trichloroalumane acetate Chemical compound C(C)(=O)[O-].[Na+].[Al](Cl)(Cl)Cl JAEKEOGDGMUJNX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000002562 urinalysis Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000036642 wellbeing Effects 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Ваксината на синдрома на придобита имунна недостатъчност (спин) съдържа човешки имунодефицитен вирус, тип-1 (нiv-1) повърхностни протеини, продуциранслед клониране на нiv-1 повърхностни гени от векторна система на заразени с бакуловирус клетки на насекоми. Рекомбинантните нiv-1 протеини се пречистват, обединяват се в частици и след това се адсорбират върху алуминиево-фосфатен аджувант. Получената форма на адсорбиран рекомбинантен нiv-1 вирусенповърхностен протеин (ваксина срещу спин) е силноимуногенна при животни и отделя антитела, които се свързват към нiv-1 вирусната обвивка и неутрализират инфекциозността на вируса при тестовете ин витро. Посочената ваксина срещу спин предизвиква новхуморален и клетъчен имунен отговор у нiv инфектирани пациенти и е полезна под форма на ваксинотерапия за забавяне или предпазване от разрушаване на имунната система. 1 претенция
Description
МЕТОД ЗА ПОЙУЧАВАНЕНА СЪСТАВ HA HIV ВАКСИНА
Това приложение се явява отчасти продължение на САЩ патент серия ₽ 151,976, регистриран през февруари, 3,1988, серия IP 920,197 регистрирай 16. 10. 1986 /сега серия » 585,266/.Тези регистрации и цитираните тук резюмета са· включени в резюмета изцяла.
ДАННИ ЗА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Човешкият имунодефйцитен вирус Тип-1 /HIV-1/ е ретровирус, който причинява инфекция на целия организъм с главна патология в имунната система и е етиологичен агент отговорен за Синдрома на придобита имунна недостатъчност /ΑΙΏ57. OfaZZC-SiHOUSti и сътр., Зй/е/ИС е 220:868-871 /1983/; РорОЧс И сътр.,SCiFMCC 224: 497-500 /1984/. Клинично изолирания HIV-1 се отнася към свързания с Лимфаденопатиите вирус /Τε,ΟΖΙήΟ и сътр., Je/€WC 225 : 69-72 /1984/ и AIDS? -свързания вирус и сътр.,
J6/£>W225: 840-842 /1984/.
AIDS’ /СГЧГI/ стана пандемична болест и разработването на вакС/иа придоби главен приоритет за здравето на хората от цял свят. Рисок-процент ст хората заразели с ЧР-1, показва прогресираща загуба'на имунната функция, дължаща се на изчерпване на лимфсцитите. Тези клетки, също както определени нервни клетки, имат молекула на повърхността наречена СР 4. H1V-1 разпознава молекулата СР 4 чрез рецептор валиращ се върху обвивката на ви-
| русните частички, прониква в тези клетки / | накрая /евентуално/ | ||
| ги рекликира | > убива. | ||
| Очаква се | обективната | ΓΠΓ'-'.Ι Т j. kJCxiiIjjlcl ί- | ле/,извиква образуване fc “ · Lt/ |
| ка антитела, | сито да се | свържат е обвивката яа д!.·—1 *·. да ире- | |
| дстзратят | ектирането | Ια ΤΔ лид*оцитите | или <ια други податливи |
| клетки. | |||
| Обикновено | , Всжси тите | се дават на, з,.црави хора преди да се |
- η. · .»-rτ1 х · .. ч V. ? '8 ' Ά-Αη· ’ . 1’4 л .Λ.*-·, , 1
WW.W*' k * · · · · Г. •••‘-'it ί
*. : .ν : : .·?$’$’ · >
•;·· · *♦.!-'· ·' · ' ··· · ' · · «... · · · · .: ί'· ··»’··'. ·· ·· · · ··
приложат на болни, като имунна пр офилактика. Обаче, логично е да се обсъди използването на ефективна СПИН ваксина след подлагане на имунизация като имунотерапия срещу заболяването. S/M; у, (/акасзгл: 473-476 /1987/ .
'Пироко е разпространено схващането, че обвивката на ΗΓΖ-1 е най-обещаващата съставка при създаването на СПИН ваксина.
fac-d /Ucot.f 1566-1559 /1985/;
Vogt * yb'tsh .Rinws У Jnf, Мщь·. 991-1000 №&oijautit : 9276-9283. HIV-1 обвиващият протеин е първоначално синтезиран като гликопротеин с молекулно тегло 160,000 /гп 160/. Перкусорът гп 160 се разцепва на външен гликопротеин
- с молекулно тегло 120,000 /гп 120/ и трансмембранен гликопротеин с молекулно тегло 41,000 /гп 41/. Тези обвиващи протеини са основните антигени за антитела при болни от СПИН. и сътр.,Sg.iCWCG' ,228: 1094-1096 /1985/. Доказано е, че нативния HIV-1 гп 120 е имуногенен и е способен да предизвика неутрализиране на антителата при гризачи, кози, маймуните резус и шимпанзета. ν /1986/.
сътр., tteact 06/. Ute 63:7^23-7927
Поради лного ниските нива на нативния НГ;-1 обвиващ протеин п инфектираните клетки и рисковете свързани с приготвянето иа CI7’” ваксина ст ПГ’-1 заразени клетки, използват се рексмбинантни Г НА :-зтси.и за производство ли 7ΙΥ-1 обвивали антигени при получаването на СЕПл ваксини. Пекомбияантната D НА технология зводствоти ria СПИН ваксина поуал.и ъ~. з .л ъ* io ст та з< пслучсшаие аз. гол е.'ли количества сигурни
у.ногеш. н1т.:“ 1 исьпващилт протеин сс изявява ::/10 генетично изменящ се рекомбинантен вирус на шарката по кравите? Chdtkzc^^^ сътр. ,/¼ ЗнО: 535— 537 /1986/;
·· ···· //U, ч сътр., fatuZO , 320: 533-530 /1966/; , и оътр, й/790-795 /1966/. Обвиващият протеин присъства и
влечени от аминокиселинна поредица в HIV*1 гп41 също се смятай γΒ| до сега не е произведена успешно СПИН ваксина , използвайки те· зи материали и методи. · \Αό’·>ί ’зползването на бакуловирус с носител насекомна клетка ι4κ 1.31зс>дство на рекомбинантни HIV-1 обвиващ протеин е единия аспект на изобретението открито в САЩ патент серия № 920,197 регистриран 16.10. 1966 /сега серия № 585,266/. Вижте също се-
C. нт е,/..та бакуловирус показва, че е най-полезна в производ- ч ството на HIV-1 протеин и други протеини. Например, бакулови-
ползван като носител за изразяване цялата дължина гп 160 и различни количества HIV-1 обвиващ ген в заразени клетки на
pkzQ. 9 клетки/. В приложенията иа предшестващия патент се разкриват също стволовия гея гп 160 /рекомбинант 1₽ Ас 3046/, протеин произведен ое рекомбинант Ас 3046,и пречиствала техника за АсЗО46 генен продукт, която включва лещовидна лек-
тинафинитетна хроматография и гел филтрираща хроматография. По този начин протеина гп160 се пречиства и агрегира под формата на частички, които са по-имуногенни при гризачи и примати.
Идеалната СПИН ваксина, в допълнение към.изискванията, за субстациалко биологически чиста и непирогенна, осигурява продължи А тсл.к протекция срещу инфекцияс HIV-1 след една или няколко инжекции. Това е обичайно за случаите с атенюирана ваксина. Когато
• ·· ·· ···· ·· ···· ······ · · · · • · · · · · · · · · · · ··· · · · · ··· , ··· ·· ·· ·· ·· ··
- 4 ;,с. ги ииктсрии или вируси, или изолирали от тях материали, кат© ‘1 ·· .·κόπни или протеини, се използвате за производство на ваксина, f’ccuo резултатът е лош антитяло отговор и само краткотраен имунитет. се избегнат -или намалят тези недостатъци на вакси*· зеле , ..оже да се добави една допълнителна съставка, наречена дцкъалт. Адютантите са материали,които помагат за стимулираме на мунния отговор. Адюьантиха при обичайно използване в чо;.ени-..г ваксини са гелеве на алуминиени соли /алуминиевфосфат или
-7'· 1иез хи ‘рсксид/, обикновено като адювант се използва стипца, а сттр., ^al^1(/. Aiokik. том2: 235250, /kc<ckr>ve pUSS Pfrc /Лондон: 1905/.
'Тастояцсто изобретение предвижда ваксина и методи за лечение чогешеия и нулодедаитен вирус /НГ7, включващи приложението па ^околбинаатея НЮ обвиващ протеин върху заразени или подат ливи индивиди. Г предпочитаните включвания, обвиващият протеин ..оже ,,j,a бъде пречистен, агрегираа и комбиниран с адювант /напр. стипца/ за ваксинна употреба.
ΙΤΛΊΗ0 ОГ'ЛСАН'ЛЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ
Детайлите на това изобретение са представени с резюме към замиращите се по-долу чертежи.
тура. 1 илюстрира клониращата стратегия използвана за изоjH.ya.ie на ЧГт-1 обвиващ ген /осв/ ст Е. colt плазмид plMAg. ЗаIIрихоос'штс- области са HIV-1 D МА поредица и отворените области са ст кло мранитс носители, перната област в·плазмид р1774 е създадена от синтетични олигонуклеотиди и е въведена като $Уис&· Kpvl /рагмелт в $w(XI--Kp»l \ecL’a в плазмид р1614. Показана е поредицата от този сиштетичен нуигонуклеотид.
'.пура 2 илюстрира стратегията използвана за получаването на рекембинантен плазмен носител /р304о/, който поред се използва
• ·· · з<': създаване на рекомбинантният бакуловирус изразяващ носителя ·
АоУ46. Плазмидът ρΜθΓ3 съдържа поредица /полетата с пресечени' ,.^ιχπ/ ст бакуловирус AcMPV от двете страни на клонирането мяс- '<,· | то на. позиция ч.ОО. Това мяста е единственото ограничително ен- -1-.-/-- I донуклеарно място 3aSwOl, ΚρπΙ и Belli. Активаторът AcMPV полихедрин е на 5*направление от 4.00 позиция. Поредицатац гР и- ΑΑΊΤΑΑΊΊΆΑ-3 е на 3 направление и има терминално препредаване '
... *<.V.... .· ч и и трите прочетени структури. ГУлазмидът р!Ш4 и поредицата ©тсинтетичен олигонуклеотид е описана във Фиг. 1. Плазмидът рЗО46 съдържа всички от pM@S3, с изключение на поредицата между/жН] v, Ffyl II, където се вмъква HIV-1 обвиващият ген на р1774.J ;
'. г.\уа 3 показва нуклеотидната последователност на t) МА ,;
(граничаващь Ас3046 гп160 в кодова последователност. На фиг.4 с показана 3046 сбв. DMA последователност между +1 и +2264., *игурите 4а-4к показват актуалната I ПА последователност -.' -л I .на 'IIV-1 совлвац гонен сегмент по-нататък съе синтетичната оли- 1 ' гонуклеотидна поредица на б’на обвиващия ген в Ас3046 /между 2 ‘ - I + 1 и +2264/. Локализацията на ограничителните ендонуклеарни<
.-сола се регистрират по-горе от I) МА поредицата и предполага-;
; i спата а .инокиселинна поредица .е регистрирана над DMA поредицата. Позите са номерирани от ляво и от дясно. · -j|jp3
Фигурите 5a-6oL сравнява DMA поредицата но обвиващия ген на1 ’ „ j αο3Ύ6 с публккуванаяа последователност на обвиващия ген от IAV-1.;.
.· -'-Сг I LA-1 последователността е от горе а Ас3046 е от долу. Линия /1/ -.·... ,.3 под 1AV-1 поредицата показва, че последователността в АсЗО46 е същата в тази позиция. Номерирането яа IIIA поредицата е същото, .лХ.| ьакто описаното от Wcdti ЛЬ&ЗОЪ и сътр., ,40:9-17 за LAV-1.
ъгура 6 показва крайната точка на титрите разтворимостприЕш.; метод на човешки HIV-1 антитяло позитивен серум /Иф^ГЙа гр&фикй ·· ···· ·· ···· ·· *··· • · · · · « ··· · • ···· · · · ·· ·· ·· ·· k ccp.v,; на резус маймуни /долната графика/ от животни имунизирани с гп 160 ХЕ/55, KL 55/ или гп120 /АВ 55,00 55,бН55/. Ш$Л титрите са. измерени срещу високо пречистени гп120 и гп160 Специфично свързаното антитяло е измерено с кози анти-човешки ма, която дава позитивен отговор в теста.
Фигура 7 е таблица обобщаваща ваксината ГП160- предизвикала имунен отговор у ваксинираните серопозитивни пациенти.
Фигура Р /А и В/ показва ваксина предизвикала антитяло отговор насочен срещу специфични HIV обвиващи епитопи.
Тигура 9 показва ваксина предизвикваща Т-клетъчен пролиферативен отговор на гп160 у ваксинирани серопозитивни пациенти. - у
Фигура 10 /А-С/ показва лимфоцитен пролиферативен отговор - *' 1 • . . . ·, * свързан с ваксинацията.
Фигура 11 е графика показваща процентната промяна на CD 4 клетките реагиращи или че реагиращи извънредно. „ f’ Ί
Открито е,че рекомбинантнияя HIV-1 гп160 обвиващ протеин /”ргп 160”/, особено когато е адсорбиран върху адювант такъв като стипца /т.е. алуминиев фосфат/ е особено полезен като спин ваксина. 3 ин аспект от това изобретение е Ac&PV носител, имащ кодовата последователност за част от HIV-1 обвиващия ген, кой
то обгражда аминокиселините 1-757 намерени в рекомбинамтния< клон 3046. Друг аспект на изобретението е производството на
този рекомбинантен HIV-1 обвиващ иротекн /и самия протеин/ в клетки на насекоми- особено ргп 160 кодиран от аминокиселини®. <*· та поредица 1-757 / 03046/. :
Други аспекти на това изобретение включват пречистване и ф р ;.рсне· иа рекомбинантни обвиващи протеинни' частици ст геи/ц,. продукт иа рекомбинантния бакулонирус, който произвежда •·· ·· ·· • ·· • ·· • · ·· · ·· ···· ·· ···· • · · · · · • · · · ··· · • · · · · · · ·· ·· ·· ··
445 протеин и адСорбция на 3046 частици да агрегира на алумиЗИСх 1 Я ., СХ<ДГ.
Изобретението включва също профилактични и/или терапевтични ваксини за υΓίΙΙ и ли HIV инфекции и методи за предпазване или лечение ла СГГЖ1 или HIV инфекция.
πς’Τ'ΈΗΟ ОПИСАНИЕ НА И30ПРЕГШИЕГ0
Следните примери илюстрират изобретението без да ограничават неговия обхват.
Рекомбинантният бакуловирус полихи,.резен вирус /Асяпв/, който евдържа стволов HIV-1 гп 160 ген κο,,ρραίΐ за аминокиселини 1-757 на HIV обвиващия протеин /ре1,с .бинантен Ас304&/ е описан U.S приложение №е.рия №920,197 /сега сериен № 585,260/. Клонираните етапи използвани за конструиране на рекомбинантния бакуловирус-евдържащ гения или части ст гени с® HIV-1 са също показани тук и включени в резюмето,
Следва пълно описание на гениите инженерни етапи използвакоито са
Hz .за създаване яа Ас3046 иосител. Материалите използвани включ ф/ ίν VC
ватсчзими и имунологични реагенти, получени от комерсиални ресурси. Също така има примери показващи как да се направи и използва изобретението.
Други рекомбинантни обвиващи протеини, отнасящи се к но като ргп 160, са също предвидени и включват рекомбинантни ‘ гп 120 гп 41. Ас 46 е само е,цин пр имер на носител и рекомби- •тантса обвиващ протеин според изобревението.
Гоаструкция па бакульирус рекомбинант Ас 3046 носещ кодираната НГ.-1 последователност за аминокиселини 1-757
4ic лира пето и изразяването «а чужда протеинова кодирана пое • , основателност о Сакулвирус носител изисква изравняване на ко-I •ripr-tiai а последователност е аолихидрин активатора и нагоре в редицата ст еАна страна и с бакуловирус кодирана- последоваюллсст от ..ovra стоаяа.
7Изравняването е такова, че хомоложната рекомбинация с бакуловирусния геном довежда до прехвърляне на чух^ца кодирана поредица изравнена с полихидрияният активатор и неактивен полихидрин ген.
Създадени са множество вмъкнати носители за употреба bHIV обвиващи ген конструкции. Вмъкнатият носител MS$3 описан по-долу е създаден да подържа ATG препредаване иа началната информация. Вмъкването на чужда поредица в този носител трябва да бъде поетроена така, че препредадената да информация се структура установена от .началната
Ехлъкнатият ррагмент
КЛО.Н жз подържа правилно носител MG$3 е конструиран от Eco^I-Ι ограничаващ на DNA изолиран от пречистен ι-золвран Ac’/.NPV ixv.a следните структурални черти: а/ 4000βρ от почрез чуждата поредица.
в горната част на редицата рин? б/ полилинкер вмъкнат
ATG инициален ..одон на генът полихедчрез отстрани дирижирана мутагенеза, който сс състои от ATG инициален кодон на позиция на съответ, и ограничителни места Ι,ΚρπΙ, стопксдон сегмент; в/ 1700 Ьр от поредицата ограничително място /което е вътрешно на пскрайяия EcoRI ограничително наето /a.ScoRIСТВЙБ.ИЯ ПОЛИХС^И! кодон Fvt II и универсален лзостиращ се от ΚρηΙ лххедрвн
Ixxxkh
I клон.
генът/
т. .
*ίΣ* · · през
Създаване ча бакуловнрусяи рекембинанти iOCCU-’x Ък\т обвивни кодира.т?х поредици
Рекомбинантен плазмид обозначен МА2 сегмент на цял ’-1IV-1 провирус вмъкнат в
о.
стане заразителен когато произведе вирус следва!., иа гякои /определени/ човешки клетки.
59: 254-291 /1986/. ''ялата гея ебвиваед поредица NA2 пропохзжда от LA’r вйД на з;
съдържа'
Ί7. baiU-SiУММi/1/З/.
| q | . -. ·-.' -·,···<. ' | .. ..· ..·· - ·· · · ·· '··< · · · ·-· • · « · ♦ · . . • · · · · · · · | ♦ -4 · ·· ···? :. Ο *··.' | οΐ» ·\ 1 1 ’ - -» | |
| ...... | ··· ·· ·· ·· | ·· · · |
от лиран ккхв NA2 като 3846 bp EcoPI/^acI ограничаващ фрагмент и клониран в 03oRI/^acI ограничаващата страна |Л1С19. Полученият плазмид е означен р7О8.·
Впоследствие обвиващият ген е изолиран отново като 2800 6р ΚρπΙ ограничаващ фрагмент и клониран в ΚρπΙ ограничаващата страна на pUCIS. Полученият клон е означен ρ1614.
ΚρπΙ ограничаващият фрагмент в р1614 съдържа лека стволова частица ка ИГ; обвиващия геи, така че 121Ьр от М-терминалната съответстваща последователност липсва. Тази липсваща частица в гена, която включва сигналната^, пептидна поредица е заместена чрез в/ъкване на двойно усукан синтетичен олигомер. Вмъкнатият олигомер е създаден от IAV аминокиселинна поредица използвайки предпочитана гюлихе^ин ген кодон практика.За да се улесни пснататъшната манипулация, нова SmAl ограничаваща поредица се вмъква сднсвремеяо вместо ATG първоначалния ксдоя. ATG инициалния ’лОдСя g залестеа от бакулввррусния носител. Полученият плазмид е сзначел като р!774.
Според Фигура 2, ограничават,и ъраг-ленти от р1774 съдържащи кс..ирана последователност от различни области
са ;лспирани з /СЗ&ЖШИ /ЖЗ/ така че ATG nCp-jC.i К.& LнцЪК 1се'ГИА ЛОСмПбЛ Cl’pj ivl^pciTc·. С КСд^С ict ЛН ОЗБИБсЛ/.^ИЯ i'C ι. уΊ’ρυβ.ij/ijiT ό ’jbC’luH li SH L-T'jci 1*-Л-:.<иВсхЦ ·Ί€-’ iT изолирал от ^1774 в ^TKx.ai в Srnal/kKxxKi ΕψΊΙ страната на з..<.аз'.'идният носител p/GSd, Тсзе клен съдържа ι.орсдица кс.._,прана за ί*'. ю киселили 1-70/ ла гп13С· и използва терминален кедол το ί от 'G53 loo/ι сля.
г· й''
HIV обвиващият гел река юияантен’ ι и с з м ид р 3/4 6 с ал о, и е б плещил /тиран с
.обавен към нсо. желания! х‘б ι
χ· , ν' “t > ' *' Π ee вмъква в АсММРТ геномачрез хомоложнар ©комбинация. Рекомбинамтни вируси са идентифицирани чрез негативна еклузия ма мор '·’· ' 1 *< '· ' ’’· * 1 * фологичма плака. Такива плаки проявяват идентификационен цитопатичен ефект, но не и ядрени оклузии. Осъществяват се две до- пълчителни пречиствания на последователни плаки, за да се по лучи чист рекомбинантен вирус. Рекомбинантен вирусен. DNA е анализиран за странично специфично вмъкваме на HIV обвиващата последователност чрез сравняване на техните ограничаващи и хибридизиращй характеристики/ с широкия тип вирусен ЖА.
• ПРЖЕР 4
Изразяване на HIV обвивка от рекомбинантни бакуловируси в заразени клетки не насекоми.
Изразяването на HIV обвиваща последователност от рекомбинантни вируси в клетки ма насекоми би дало резултат в синтеза- . та на първичен трачсладионен пр одукт. Този първоначален про дукт се състои от аминокиселини транслирани от кодоните заместени от рекомбкнантния носител. Резултатът е протеин съдържащ всички аминскисели кодирани ст ΑΤΘ ичициалния кодон на експре| сивния вектор в долната част на определящия сигнал върху експресивния вектор /носител/ -Хйргх! ргп 160. Първичният1 трачслационен продукт на Ас3046 трябва да разчете Mei- Pt,o-$iy- -тта£ на терминала където Ах^. /позиция4/ s Atg, на позиция 2 е оргиналния IAV клон. Met- Ρνο-β/у кодоните са заместени в резултат на клсниращата стратегия.
ПРИМЕР 5
Нуклеотидна последователност на гликопротеина /гп/ 160 ъмъкf чат и фланкиращ ДМА.
Иуклеотидната последователност на гп160 вмъкнат и флаякиращ ЖА е определена от ограничаващи ррагченти изолирани от вирусен експресивен носител Ас3046 ЩА. Последователната стратегия включва следните етапи. 3.9 кс EccKV-БатпHI фрагмента е пречистен
чрез ограничаващо разтваряне на АсЗО46 вирусен DNA. АсЗО4б вирусният DNA е пр иготвем от екстрацелуларен вирус намиращ се в медията на клетки използвани за производство на група ваксини.
Както е показан© на Фигура 2, 3.9 ко EcoPV-Ba HI фрагмента се състои ст целия гп160 ген и 100 ор от горната част и; около 1000 ор от долната на фланкирацата. ШД:' Така е определена нуклеот тидната последователност на цнлия гп ген включвайки ΙΟΟορ от горната част и 10Q δρ от долната на фланкиращата ЖА.
Ср Накратко, резултатите от последователността показват желана конструкция, както предполагаемите от клсниращата стратегия. Последователността на гп160 е важна , както е съобщено ат fyhov и сьтр., /1985/. Последователността на 2253 бази между предполагаемата инициална транслация и. определящите кодони , предвижда- 751 аминокиселинни кодони и 28 потенциални N-свързани въглехидратни страни. Изчисленото молекулно тегло на този prnlSO, включващо захарните остатъциу е приблизително 145,000.
Последователни анализи яа 200 бази от фланкирааща ON А показват пр авклно вмъкване, както е показано на фигури 3,4,5. ПРИНЕР 6
Аминокиселинна последователност на гп!60
| Използвайки стан; | цартна автоматична EcUan деградация r.'-’PIC |
процедури е определена N- терминалната последователност
| първите 15 остатъка | и тя е същата като предвидената ст JNA |
| последователността. | N-терминалният метиожн не присъства в |
| гп 160. Наблюдавано | е, че AeNPV полихед^ин протеин е ст^о про- |
изведен без N-терминален метисжн. Обобщение на действителния гп150 DNA и N-терминалиа протеинна последователност са опре-
| делени чрез анализ!: | на AcNPV 3046 J)NA и пречистения гп!60 |
/Табл.1/
ТАБЛИЦА 1
ТМ’Г г-бру.РГШ ггя р ίπΛΤΡΓ twn ->рг»авиип раотпг: /-тпп.^фрп/
- 12 ρ в
? 1 таблица 1
V
АсЮТ3046 експресивния вектор /носител/
7 8 9 10 11 12 13 <J
LAV обвиващ ген
Остатък
3 4 „Хе т,р /¾ t&’ бьб огтсте AAGefiG fifiG ж сал- && сте Тс& ьбб Тези резултати са сравнени с оргиналния ЛАУ41 клан какт® следва /таблица 2/.
IAV обвиващ ген
Остатък
Таблица 2 оргиналния I/AV-l клон
2 3 4 № VaC &S &/и Xj Ίνίζί/Η His Τζϋ Ьа j>p £&
ffn$ fiSA- SVG ftfiC QAC M&iXTCfiQ С-АСТГ6 T&S fi$-T<S6 &&G
7 8 9 10 11 12: 18
ПРИМЕР 7
Пречистване на рекомбинант гп1бО
Един аспект от настоящото изобретение е процедурата за извличане и пр ечистване на рекомбинантa HIV-1 обвиващ протеин кодиран за АсЗС46 експресивен вектор /носител/. Рекомбинантният HIV-1 обвиващ протеин гп150 е произведен вSклетки за 4-5 дни след заразяване с Ас304б. Пречистването на този ρππΙβΟ включва
1·Промиване
Клетъчен следните етапи:
на клетките
9_ *7 ·
ЛиЗИС
Гел филтрираща хроматография
Пентил лсктин а фннит сти ка хроматография
о. Анализ а
1ози пример описва пречистването на рекомбинантния гп16С ст около 2 х 1С~ Ас304б ;нж.слтирани клетки.
1. Промиване на клетките. Инфектираните клевки се проми, в буф,ер съдържащ 5С < Трие бу*ер /рК 7.5/, 1 мМ ЩЩ. ΐ· 15 1рвтен Х-100. Клетките са ^есуспендирани в този буфер, хемегениз?
ат са
рани използвайки стандартни методи и центрофугиране при. 5QQO за 20 мин. Този-процес се повтаря три пъти.
2. Клетъчен лизис. Промитите клетки се лизират чрез соникация в .50 мМ Трие буфер /pH 8.0-8.5/ 4% деоксихолат и бета меркаптоетанол. Ссникацията се извършва използвайки стандартни ме-: тоди. След соникация само остатъци на ядрената мемрама оатават незасегнати и се премахват чрез цетрофугиране при за
минути. Супернатантът съдържащ извлечения гп160 няма'цели клетки кайте е определено чрез наблюденията със светлинна микроскопия.
3. Гел филтрация. Гел филтрацията се извършва в 5.0 х50 см стъклена колона обвита с ^bhGC'tyi J fyez/htCiCftl /
Общият основен обем е около 1750 мл. За да, се депирогенизира и самира колоната и свързващите тръби за период от 24 часа през колоната преминава 0.1 М КЕаОН. Потокът от колоната е свързан с UV поток клетки и монитор и записващо устройство /PhQZfytGCd&J и след това е еквилибриран с 4 литра гел филтриращ буфер. Непречистеният ГП160 е добавен в колоната и обраротен с гел филтриращ буфер.
Колоната разделя непречистената смес на три главни 1(7 абсорбиращи фракции. Първият пик излиза между около 500-и 700 мл вторият - между 700 и 1400 мл и третият- между 1400 и 1900 мл буфер. Същият· този пр офиле наблюдаван при малки аналитични колени от които е определено, че първият пик е материал с молекулно . тегло по- голямо или равно на 2,000,000.
Този пик е полупрозрачен вследствие концентрация на високо молекулно тегле на лидиди и липидни комплекси. Този пик също съдържа от 10 дС 206 гп160 извлечен от заразените клетки. Нее съмнено тази фракция на гп 160 е комплексна за себе си или други клетъчни компоненти, за да формира високо молекулно тегло на агрегатите.
Вторият голям пик се състои от преобладаваме на гп1 теини с молекулно тегло между ©кол© 18,(XX) и 200,000.
Третият пик съдържа малко протеин и преобладаващата ^/ V.абсорбция се дължи на бета меркапт©етанол в пробата. *
Когато вторият пик се забелязва пръв от трасирането на V абсорбцията потокът от колоната се прилага директно върху лентил лектим колоната. Веднъж вторият пик излезъл от колоната, ^отокът се разрушава от лентил лектин колоната и се изхвърля като отпадък. ‘
4. Лентил лектин . Лентил летимният афинитетен гел медия
4В/ е получен в голям обем от P/ialmfiCfiZ Лентил лектинът е изолиран чрез афинитетна хроматография върхудо повече от 98% чистота и след това е имобилизиран чрез съединяване съсЗе//<^?^/@В използвайки цианов бромид. ^атриксът съдържа около 2мг лиганд за 1мл гел. Лентил лектинната колона е 5оО х 30 см стъклена колона ! Р^бсрЖС/Ь/ съдържаща 125 мл лентил лектин-?^1<4В гел. Афижтетната матрица се използва отново след като е била старателно изми-
та и възстановена чрез процедура препоръчана от заместителя.
Когато голът не се използва той се съхранява в разтвор от 0.9% ШС1, 1мМ MnCl2fK CaCl2, и 0.01% тимерсзал. Колоната се измива и екьилибрира с 250 мл лентил лектин буфер, описан по-гс-ре преди всяка употреба.
Непречистеният гп160 се прилага къл колоната налраво кактое пречистен от гел филтриращата колона, описано по-гсре. Веднъж непречистеният гп 160,се свързва с кг лоната, промива се с 800 мл лентил лектин бу^ер съдържащ С.1% деоксихолат. При тези обстояна дълги вълни 280>/м телства целият* гп16С се свързва с колоната. Лентил лектин буфер плюс 0.3 И алфа- метил манозид се използва за пречистване яа свързалите гликопротеши, които са мониторирааи чрез монитор
5. Т^ализд, Завари, и дезоксихолати се премахват чрез конвенционална диалйз а.
Пречистването ма гп1б0 от 1 л инфектирани клетки може да бъде обяснено в следната таблица / Таблица 3/.
При друг© приложение конвенционалната йонобменма хроматография / анйонна или катйонна/ може да се използва вместо гел филтрацията. Редът на етапите не е строго ©пределен: например, гелфилтрацията или йонобменната хроматография може да бъдат след лентил лектин пречистващия етап. Според изобретението могат да бъдат използвани и други реагенти. Например, могат да бъдат използвани други детергенти за пречистване на рекомбинантния протеин вместо деоксихолат. Те включват нейонни детергенти като /и 50? 20/полисорбат 20/,75^^77 80,^/z^^ и 7х/'т£>77 Х-100.
ТАБЛИЦА 3- ОБОБЩЕНИЕ НА ПРЕЧИСТВАНЕТО
| Пречистващ етат | Общ протеин | гп160 /мг/ | $гп160 общ | Отстранени конта- минанти | |
| Кръгла клетка/ДМ/ . | 1-2000 / | 20 | 1-2 | Средна култура | |
| 1 П Q-TO промиване | 250 | 15 | 6 | Серум Албумин,много нуклеинови к-ни, разтворими клетъчни протеин | |
| Гел филтра- ' ция | 120 | 12 | 12 | липиди,нуклеинови к-ни и агрегати с високо молекулно тегло | |
| Лентил Лектин | 14 | 1 1 1 1 1 ο 1 1 т-Н 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 70 | негликозилирани протеини |
: то
Диализа захар, деоксихолат, излишък на Трие буфер
ПРИМЕР 8
А. Събиране на частици от гп160
Според един от аспектите на настоящото изобретение е открито, чи ГП160 антигена може да бъде събран на частици с молекулно тегло по-голямо ил равно на 2,000,000 пс време на пр ечистването. Гликопротеинът -гп160 е извлечен от клетката като смес от 80-90% монамерен /160,000 мол. тегло/ и 10-20% полимерен /часчици/. Етапът гел филтрация махкк1Ж премахва съединените форми на гп160. Опити за пречистване на гп160 от тази фракция /първият· пик излиза от гел филтриращата колона/ предполагат, че е комплексен с други клеттчни протеини, дори е възможна с мемранни фрагменти. Обаче, гп160 антигена във втория пик при излизането от гел филтриращата колона има молекулна маса от около 160,000-300.000 и ето защо е в преобладаваща моиомерна или димерна форма.
формирането на агрегати или,полимери на гп160 настъпва по време на създаването на лентил лектин колоната. Определено е, че а.гсигенните форми агрегират било чрез отделяне от лектин колоната е С,5% деоксихолат, който е около 0,2% от критичната ми челна концентрация /КЖ/ за деоксихолат или гп160 е от де лен ст колената в 0,1Ф деоксихолат.
Раз /ера на агрегатите- е измерен на ?<<Д12 колена /(/t.p у у, с z с /. Проби от представени групи от пречистен гп16С шат размер, който е преломи·жращо еднакъв или пс-голям ст 2,Р?С,С0С‘ олекулно тегло на стад.дртьи-.я размер син декстран.
Учението за кръстосаните връзки не Λ’/'ц. д ? и сътр., /1969/ показва, че ги1о2 произведен клетките на насекоми е тетзамер ст идентично нсе ставяне. То съцо показва, че гг:16С в заразените сНГ.’ клетки Лвирусиите частици е тетраперен.
Така рекомбинантните гп!60 частици могад да имат третични и кватернерни структури, които са подобни на тези намерени в нативния HIV гп160.
Подходяща триизмерна структура може да бъде важна за формирането на епитопи, които изискват правилно нагъване на гп!6О. Вероятно е че както негликозираниее протеини се отстраняват от свързааае с гп160 антигена по време на свързването и промиването към лентил лектин колоната, хидрофобните части на гп1б0 започват· да формират интермолекулярни съединения. Деоксихолата вероятно не е свързан с гп160 като концентрацията може да бъде запазена над КМК и антигена все още да формира комплекси. Съединяването на тези антиген в агрегати се явява вътрешно свойство на протеина веднъж пречистен според изобретението. Възможно е много хидрофобната К- терминална последователност представена върху гп160 да допринася за естествената възможност на. този протеин да рермира частици. След пречистването , гп160 комплексите могат да бъдат стерилно филтрирани през 0,2 микрона целулозен адетатеи филтър без сипификантна загуба на протеин.
* 5. Анализ на образуването на частици
Анализ на пречистени ггДбО частици чрез електронна микроскопия показва, че те са протеиноподебни сферични частици ст ЗО-ЮОп./.
гатс дС11Т.л;Л'1‘елен iccx наличието ча частици иречис-юния
П1160 е анализиран чрез гел филтрация. Около 10 микрограма пЛб^
'.I '14. . л>
“s*/.· ’ 4 (
ПрСЮИ.· IIJ
протеини с молекулна
г.рспорпд·сналеп ia мслскулнсю тегло на протеинлите стандарти. Го£ лоната разделя меномерния протеин гп160 ст пелпмерните форми и
Ъ<Са I1C“ГСЛЯчс·. iiJly рс.Ь
X
тени гп160 се отделят в свободен обем и тяхното молекулно тегло е по-голямо или равно на 2 х 10^/2,000,000/.
ПРИМЕР 9
А. Адсорбция на гп1бО да стипца
Ефективността на неразтворимите алуминиеви съединения като имунологични адюванти зависи от пълнотата на адсс&цията на антигените върху твърда фаза. Като част от настоящото изобретение е открито, че съединенията на стипцата могат ефективно да адсорбират гп1бО, но при pH, което няма да редуцира способност ц';: w та на гп1б0-стипца комплекс като имуноген. Факторите контролиращи образуването на тази стипца /алуминев фосфатен гел/ са :
1. Оптималното pH за адсорбция на антигена от стипцата е к около 5.0. Установено е обаче, че гп 160 губи своята имуногенност при pH 6,2 в сранвение с ра 7,5 , така че стипцата е направена при pH 7,1 - 0.1. Установено е, че при това pH 100/ от гп16С се абсорбират от стипца!а.
2. Йонната здравина на ЩаС1 е представена релативно ниска и хиххлхка е по-малка от С.15
ύ. Налице е .сларен излишък ia «луминиев хлорид о.ързан с натриев ..сс^ат, за да бъде осигурена липсата на свободни фосфатни йож.
Mi.px.Lci.. j а.1'11 Ги -ттт t ,.-.,οτγηοη към iipjiCiio образувана стипца, за да спре растежа м кристалите и да сведе до мини,,-уи размера ia частиците.
/роцедурата за получаване ла сОО .чл стлце и абсорбиран© пре—
Ч/.стс . 131167 Ох огипцх.та е хилиис, чс к^спнатс. концентрация ла антигена е 4^^-.. /'ччЦ , итс с схсчатт чнс из .αθ жено- но—^олу ·
Г-/
Е. Приготвяме ма реагенти /200 нл общо формулирана група/
Приготвяне на следните разтвори в 100 мл стерилни, апирсгеи<W>yn V .MWTP ~
ни пмпета или ,<· стъкленици. Смесване на солите за РазтввйИШ'
Разтвор 2 и. натриевия хидроксид и Титриране през 0.2 й^^зна^ацетадшифаитри в 100_мл_стерилнж, апирогеина шишета. Разтвор! ‘ А&&. 6Η2θ 0.895 грама
..—82^51322-______________—__— 0.136 грама . _
Разтваряне в 40 мл вода за инжектиране /ВЗЙ/, 0,2 микрона филтър
Разтвор 2 J^a^POa^HgO 1.2М грама ’ филтър __
Разтвор 3 ЛаОН 2.0 грама .
Разтваряме в 100 мл ЕЗЙ, 0.2 микрона филтър
Разтвор 4 Трие 1.25 грама
Разтваряне в 100 мл ВЗИ, добавяне на 1мл към 90 мл ВЗК, жустиране pH на 7.5 с 0.5 М HCI и вземане 109 мл с ЕЖ
Лзюклавиране на разтворите за 30 минути; бавно изпускане. Охлаждане на стайна температура.
В. Образ у в ад ie на ствпе.а
1. Добавяне Разтвор 1 /алуминиев хлорид-натриев ацетат/ към определения съд, използвайки 25 мл стерилни пипети. Отбелязва
| се обема на. Разтвор 1 и се разбърква. |
| 2. Добавяне на Разтвор 2 Латриеь ^сс^ат/ ньм. съда, пзпел- |
| зьаики 25 ..Ήι еιернлни пилени; п^лидт-лжава разоъркванетс като се |
| образува- утайка и се шдсляз-.<.· о^ема на Разтвор 2. |
| ύ. добавяне на 3 ст Резтъср о /натриев хидроксид / и про- |
| дължава разбъркването 5 минути. Езема се 0.5 ;лл пребе и се из- |
| мерва pH. Акс рИ е пс-малкс· от 7.0, ,_сб&вят се 0.5 лл натриев |
ί хидроксид, разбърква се още 5 минути, и отново се определя pH. Това се повтаря докато pH стане между 7т0 и 7.2.
.
'4. Определяне общия об.ем добавен към определения съд /Разтвор 1 % Разтвор 2 -F Разтвор 3/, след това се добавя стерилна ВЗЙ до получаване 100 мл обем.
5. Веднага се добавят 8,000 микрограма от пречистен гп!бО в
100 мл от 1мМ Трие pH 7.5 направ© в определения съд.
6. Продължава разбъркването за. минимум 20 минутищ след това, създадената ваксина се разпределя в стерилни ампула.
. пример ίο
Имуногенност на абсорбирания от стипца гп 160 /Специфичен АЬ отговор/
Приет метод за определяне имуногенността на антиген препарата /ваксина/ е измерването на специфичен антитяло отговор у групи мишки , яа които са дадени единични дози от антигена.В края на 4“ϊα седмица от мишките се взема кръв и серумното антитяло ,ϊζεο към определен антиген /обикновено антигенът използван за имунизиране на животното/ се измерва чрез стандартен антитяло тест, напр. SLLfA.
’муяогеността при мишките на пречистен гп160 без адювант при pH 6.0 и pH 7,5 адсорбира® със стипца /както е описано в Пример 9/ или смесен с пълен адювант са отбелязани по-дслу /табл.4/.
| Таблица 4 | Сероконверсия | |||
| Група гп160 Адювант | гп160 | |||
| E1ISA rpjne | ||||
| 8 | / P/K/3 | |||
| IjU^, няла,рИ 7,5 | £702 | 0.140 | Ο | 4/6 |
| няма, рНб.С | 8702 | 0.11С | 26< | 2/7 |
| Стипца | 8702 | 1.000 | qrw | 9/10 |
| Стипца | £705 | с per; | 100/ | 6/6 |
| 8604 | 1.108 | (3/ | 5/6 |
I
Мишките имунизирани с единична доза 1 микрограм гп1бО антиген без добавяне на някакъв адювамт, предизвикват антитяло отговор срещу гп160 /вижте таблицата по-гора/. Инего по-силен амтитяло отговор се наблюдава при групи мишки имунизирани с 1 микрограм гп160 адсорбиран на стипца адавант. Единична доза по-мал· ка от 0.1 микрограма Д1160 смесена с пълем7м</ж/или образувана със стипца е сероконвертираща по-вече или равно на 50% при Йонизираните мишки.ГП160 аитигенъте имуногенен при мишки като неопределен антиген при pH 7.5 и при pH 6.0, но има заг уба на имуногенност при по-ниско pH*
На мишките се взема кръв на 20 ден след имунизацията и серумът се тестува при разреждане 1:10 в EII А опит срещу гел пречистения гп160. Подобни резултати са п олучени използвайки търговски ELISA ί опит срегу н&тивните HIV-1 протеини при серумно разреждане 1:400.
Проят на серокснвертните мишки /Р/ към общия тестуван £ брой /М/.
ПРЖЕ? 11 [Алулогелнсст следване/
Гтз нежността на стипца абсорбирала гп160 /ЕЦ^А серумно из място важно бк ла пробна ваксина да предизвика *-му нея чгговор слогично свойство. За да се потвърди, че стипцата харазукаха фер;лулирала гп16С ваксина е илуногенна при шивстни и се потвърди, че стипца адюБанта псьишаьа тази имунсгеннсст, са извършени следните експерименти.
Г деня 0, мишките /групи х 10/ се инжектират с единична доза
/ 0.5 микрограма, 1 микрограм или 5 микрограма/ сам© гп160, гп 160 адсорбиран от стипца или гп1бО в ггьлен 4ι4·ι ' с/ адювант /ПФЯ/. На 28 ден от мишките се взема кръв и серума се проверява от ELPA / 1: 10 разреждане/ за наличието на антитела към гп160.
Резултатите от серума извлечен на 28 ден са отбелязани в таблицата по-долу /Таблица 5/.. Във всички/групи. повече ©т 50% от мишките показват сероконверсия. При всички дози броят на > сероконверсиите и средната се^мна абсорбция /ОР при разреждане 1:10 в ELISA опита/ ек по-високж. як с гп1бО абсорбиран ©т стипца, отколкото този- получен при мишки имунизирани само с гп1бО.
Тези резултати показват, че стипца адюванта значително повишава имуногенностт а на гп 160 антигена.
Таблица 5- 28 дни след инжектирането___
О.б^доза 1.0^доза б.О^^доза средно среда© средно
| р/и4 | 0D 5 | р/лм | оъ | P/N | ор | |
| гп160 | 9/10 | .407 | 7/10 | .699 | 7/10 | .430 |
| гп160/стипца/ 9/10 | .547 | 8/10 | .797 | 10/1п | 1.347 | |
| ГП160/П5Л/ | 10/10 | 1.130 | 10/10 | 1.967 | 10/10 | 1.317 |
| rPT6fEP 12 |
са приет определяне дали за метод
Неутрализиращи данни
HIV-1 неутрализиращи опити инфектирането с антитяло препарат забави HIV-1 вируси на податливи човешки лкмфсцитеклетъчни култури. Яйтисерума ет жвстни имунизирани с гп16С е тестуван в HIV-1 неутрализиращ опит и резултатите са сбсбщени в долната таблица /Таблица 6/.
Ероят на мишките, които са серсконвертни /Р/ сравнен с общия брой на тестуважте /N/ на 26 ден след имунизация с 0.5
Ч’ г, микрограма, 1.0 мякрограм или 5 микрограма от Vaxjyn HIV-1.
Средната абсорбция /OD^q/ на мишките, които са серокомвертни, както е измерена от EII А метод срещу гп160 при разреждане на серума 1:10.
Таблица 6
| Животно | Идентификация | Имуноген/ адювант | Микрогр.6 Неутрализиращ титър | |
| Резус | С55' | гп120^стипца 16/8/8 | 1:80-1:160 | |
| Резус | Н55 | гп120$стипца | 16/8/8 | 1:80-1:160 |
| Резус | I 55 | гп160/стипца | 16/8/8 | «= 1:80 |
| Мишки | Пул 3 | гп120/ | .25/.25/.25 | 1:40-1:80 |
| Мишки | Пул 8 | гп160/ | .1/.1/.1 | 1:40-1:80 |
| Θ.Ρ | Пречистен | гп!бО$ | 10/10/10 | 1:320 |
/Л ч S (juiWW /гвинейски прасета/, зайци и Резус маймуни също са имунизирани с rnloC /използвайки стипца иликатс адсвант/. Имунизирането на. тези животни произведе добър антитяло отговор срешу HIV-1 обвиващите протеини.
ПРИМЕР 13
Шунсгенност при шимпанзетата
Генетично шимнанзетс е най-близко до ственстс животно модел за инжектиране с човека
HIV-1 тях са сигурен и^унеге/\Г\ логичен опит при трн хМс/панзста, дзе ст микрограма или 80 микрограма rnlcO ккххдеххххх рана ваксина. Рсяко от животните получава реимунизация /бустер имунизерия/ на 4-та седмица с 40 микрограма и 80 микрограма гп160 съответно. Контролно животно е ваксинирано в същото време с 1 мл физиологичен разтвор. Седмичните серумни проби на всяко шимпанзе унизирани с ъ стипца фсрмули^Ιί№···ΒΗΗΐ¥ ό1 ','Fi τ^πr^j.» »-.1 «л !. v'y Я 1 лМ . Г »·' 11 ·' .’'
Ш! · ' ’24 са анализ й^^ми за антитела към гп160 и към HIV-1 вирусните антигена изпелзвайки три имунологични опита ,. ЕША шп® срещу пречистен ГП160 развит от л и търговски BIV-1 ЕК')А опит. Резултатите от тези ямялизи са ©писани. по-долу.
А. ЕША /М6спроучване HTV 160/
ЕЦ.5А метод, KG.S^?<?^HIV 160, запазена марка на в Мериден, Кънектикът, САЩ е имуносорбентен метод срещу ГП160 описан в патентно приложение сериаикк IP920197 /се· © ra IP 585,266/.
Серумните проби взети преди имунизацията и през единайсетте °седмици следващи първоначалната имунизация са разредени в съотношение от 1:10 до 1:100,000 и след това са инкубирани с нитроцелулозни лентички на места съдържащи 100 пречистен гп160. Крайната точка на разреждане на титъра е най-високото разреждане, при което теста е положителен за анти-гп1б0 антитяло, както е определено с конюгата кози анти-човешки^^- алкална фосрат аз а,
Серумните проби на контролното животно и ст преимунния серум на имунизираното животно са негативни. Шимпакзето, което е получило 80 микрограма доза е позитивно пои разреждане 1:100 до втората седмица, а шимпанзетс, което е получила доза от 40 микрограма е положително до четвъртата седмица при разреждане 1:10. Аатоитяло титрите към гп!60 продължават да нарастват дс петата седмица, по което време крайната точка на разреждане на титрите е приблизително 1:100,000 и 1:2,000,000. Антитяло титърът в двете животни спада малко през б -11-та седмици.
Този вид отговор е еднакъв качествено и количествено с антитяло отговорите съвместно наблюдавани при шимпанзета, ваксини-
рами c човешка хепатит В вирусна ваксина.
Е. Търговски тест . Ясно е отЖ>44б/г НП16О,Ш5Аи акализи ’ на серума на имунизирани с ь/Ъу / шимпанзета, че те са сероконвертни и имат антитела срещу рекомбинантния гп1бО. За да се ©предели дали те също произвеждат анти-HIV антитяло.което разпознава нативните вирусни обвиваващи протеини/, преимунният
, Сиатьл, Вашингтон. Жив©тнат© ваксерум и серумът от първата до единадесетата седмца са тесшував узаконен търговски ELI5A тест, кит, LAV EIA™ тест кит на d'C. и &
синиран© с 80 микрограма гп160 е позитивно до втората седмица при разреждане 1:100 и продължава да показва повишаване нивото на антителата през шестата седмица. Животното имунизирано с 40 микрограма е позитивно при разреждане 1:100 до шестата седмица.
ПРИМЕР 14
Разпределение на антителата ^ежду гп160 и гп41
Важно е да се установи дали антитяло отговорите срещу гп160 у ваксинирано животно са насочени срещу’ гп41, гп120 или и към двата. Множество имунологични методи радиоимунопреципитация /НТ1/, имунофлуоресценция /ИФ/, Wl(,-/c27t ί&ά анализи /К/В/ и количествена EI1SA срещу три различни рекомбинантни обвиващи антигена се използват за да определят и измерят разпределянето на антитела срещу различни области на 7IIV-1 обвиващите протеини.
Фигура 6 обобщава имунната реактивност на три различни рекомбинантни гена: /АРТ/ /ТАВ/ /1/ гп120-делта / стволов рокомбин нантен HIV-1 гп120 с около 40 аминокиселини липсващи от С-терминала на молекулата/; /АРТ/ /ТАВ/ /2/ гп12С / с цяла дължина^ рекомбинантен HIV-1 гп120; и /АРТ/ /ТАВ/ /3/ гп160.
Човешкият серум от 50 пациенти с Позитивни HIV-1 антитела и з извлечени човешки серуми са силно реактивни с гп1бО, средно реактивни с гп120 и малко или ареактивни съ&ит стволевия гп
120. Вероятно, стволовият гп120, който представлява повече от 90^ от HIV-1 външния гп, съдържа протективни детерминанти. Наблюдението, в което човешкиХ позитивен серум има няколко антитела към тази област на обвивката е съчетано с факта, че имунния т отговор на вирусната инфекция не е напълно протекти- ран и че човешки позитивен серум обикновен© показва ниско ниво на неутрализираща активност ин витро.
Обратно, резус маймуните имунизирани или с гп160 имуноген, илисъс стволовият гп120 имат антитела, коит© реагират бурно със стволовата §^§9яй1ст на' HIV—1 обвивката. Тази разлика в разпределяне на^азпознаващите страни по вирусната обвивка и по-бис оките тигри наблюдавани при маймуните може да обясни факта, че серума на маймуната има висок неутрализиращ титър.
Количествена оценка на имунореактивността иа тези три рексмбинантни обвиващи антигени с човешки и имунен резус серум е представел на фигура 7. Тестуваният серум на всички маймуни ииа висок титър антитела срещу стволсвия /трункиран/ гл!20 антиген /гп120-делта/ включително и тези от животни имунизирани с гп160.
Тези резултати показват, че рекомбинантният гп160 предизвиква а шитяло отговор у резус маймуни, който е различен от този появяващ се често по време на естествена инфекция. Ч/.а епитопи в гп120-делта област на гп160, конта са разпознати е имунизирани маймуни, но ле са виждани от човешката имунна система по
160 за предпазване и лечение на HIV - инфекция.
за предпазване от HIV-1 и важно свойство ла рекомбинантният гп
Терапевтично прилагане на ваксина' ; Г
Извършен е клиничен опит с 3OHIV- серопозитивни пациенти за определяне ефектите от ваксинираното с клониран Н1У гп160 /произведен в бакул©вирусната системакакто е описана по-горе/ върху Нациемтите.
Ваксинирането с рекомбинантния гп1б0 води до увеличаване в гп160 HIV-специфични хуморални и клетъчни имунни отговори при 19 от 30 /63%/ НП-серопозитивни/доброволци. 14 от 15 /93%/ доброволци получили 6 дози от ваксината показват нарастване на.общия гп160 антитяло, ©го защо, рекойбимантни HIV протеини /ргп41, ргп120, ргп1бО и прибавените към тях смеси/ могат благоприятно да бъдат прилагани в метод за лечение ма пациенти заразени с HIV.
Ефективните количества HIV протеин използвани в прилагането на изобретението, могат да бъдат определени според добре известни в областта техники, такива като тези представени по-долу. По принцип такива ефективни количества могат да варират между около 1 микрограм и около 100 микрограма за кг човешко гегло. Честотата на прилагане също може да бъде определена чрез известни средства. Предпочитано прилагане е парентерално инжектиране, т.е интравенозне, интраперитонеално, иитрамускулно, интрадермално и т.н.
А. Селекция на доброволците
Набрани са 3?· доброволци с HIV инфекция. Само серопозитивните с ранен етап на HI — ;.нАекцИ.я са определени като
Етап 1 г’ли 2 /изброените 0¾ клетки не са пс-малкс ст 400 за повече от з месеца, с ;.ли без лимфаденспатия/са с -необходимите качества за изследването. , и сътр.XM&d· 314:
131-132 /1985/. Допълнителен критерий ограничаващ доброзолцит ' е възраст между 1с и 5-в години, с icJiTJiiio .-термална кръвна кад·
IIpjpT/ 7 жВ^употр^ба • ·..* /У ’IvU ма органите;, -«од . ’ ί I л '-- 1 ' тима, без следи за заболявалия с алкохол и. наркотици през последните 12 месеца д такива, които не са вземали амти-ретровирусни. или имуномодулиращимедикаменти. Всички пациемти са подложени два месеца на основно изследване пр^пеб^ащ© рандомизирамот© в лечебни; групи. Доброволците не получават никакви анти-ретровирусни или имуномодулиращи лекарства п© време на този процес.
Двадесет и шест от +0-те доброволци са мъже; 4 са жени. 14 са бели, 13-черми. и 3 мулатих. Средната възраст е 29 /между 18Ш 49/. При приеманет© 8 доброволци са Етап ί и 22 са в Етап /стадий/ 2. Изходния среден брой CI клетки е668 / между 388 и 1639/. Средният интервали, между първоначалната дк диагноза и проучването е 24 месеца / между 3 и 49 месеца/.
Б.Ваксинен продукт и имунизационна таблица • Както е описан® тук, тест-ваксината включва меинфектираиа субединица гликопротеин извлечен от гп160 като бакуловирусен експресивен рекомбинантен протеин. Жуногенкият протеин е произведен в zG-Ъ насекомни
клетки, биологично пречистен за крайно формулираната вакси/ос/ат
Пзпслзат се тридози от микрограма за милилитър и гп160:
микрограма на милилитър, 160 320 микрограма/мл. Инжекционният обем и за двете дози от 40 и 160 микрограма е 1 мл; 2 мл ст 320 микрсграма за 1 мл са използвани за получаване на 640 микрограма ияжекциснна доза.
Тридесетте доброволци са разпределени в шест групи с по пет Списъквъв всяка. Проучени са две имуяизационни таблици; Таблица А,
0, 30 и 120 дс;ι; и табл. F, където ваксинацията 120, 150, и 180 ден. Във всяка ст имунизацион. или 57 има три групи, всяка от които получава различни дози ст ваксината /табл. 7/. Всички ваксинации са напс ваксинация на е на 0, 30, 60, ните таблици /А павйни. иятаам^скмлно р пелъсл пни. я .·,νηκν.π. Пзопълхителкостта на
' V» , \ ·.
месеца ·„ . V ·’ опита е 10 месеца; два месеца основно изследване и ‘ ' л‘* оценяване след първоначалната ваксинация. >
—Таб£иЦ&_7г_Ш?низациеюпг< списък
Количества иа приложения гп160 / /
| Ден | 0 . | 30 | 60 | 120 | 150 | 180 |
| Списък_А_ | ||||||
| Група 1 | 40 | 40 | 40 | |||
| Група 3 | 160 | 160. | 160 | |||
| Група 5 | 640 | 640 | 640 | |||
| Списък Б | ||||||
| Група 2 | 40 | 40 | 40 | 160 | 160 | 160 |
| Група 4 | 160 | 16Q | 160 | 640 | 640 | 640 |
| Група б | 640 | 640 | 640 | 640 | 640 | 640 |
| В. Оценка на безопасността | и токсичността | |||||
| Всеки доброволец | е интервюиран и | прегледан | на 0, 1, 2, 3, | 15 | ||
| и 30 ден след всяка | инжекция. | Доброволците са | разпитвани за | трес- |
ка, простуда, гадене, повръщане, артралгия /болки по ставите/, '-•иалгия /болки по мускулите/, неразположение, уртикария /обриви/, затруднено дишане, виене на сеел или главоболие. Оценява се и местната реакция при инжектиране от рода на еритема, оток, сърбеж, б?.лка, потъмнявано no к.мата, премяна в регионалните лимф ни бъзли, промяна във фуиндията на инжектирания крайник, подкожни възловидни образувания ст страна та инжекцията. Правят се също ежемесечно изследване ни кръвната картина, химически анализ на серума, коагулаД/iGiicix нре^^! уринен анализ.
тлт витро клетъчната имунна функция е оценена чрез Ί-клетъчен фе.хстип / общи лимфедит-и, CP z и СРр клетъчни /енстипи/, както е описана в Ridcmccft и сътр., С&гиСйС ЛптиИ0.Ъ2-.
к сътр. JnmiLLhc
85-95,1983; B'Z.X
4: 188-196, 1991/. Т-клетъчния пролиферативек отговор иа мит·t
ция се оценява чрез определяне хиперсензитивността на кажат© тестуване за контрол иа антигени / паротит, тетаничен токсин,
Вирусните култури от моннуклеарни клетки от периферна кръв ЛКПК/ и плазма са количествено определени както е описан© в 1159-1167,1991. ДОА полимерна верижна реакция / Wc^&S и сътр. Д foci, 33: 58-63,1991/ и нивото на серумния р24 антиген кй определят мина, монитор ин виво HIV вирусен товар.
Не е наблюдавана системна токсичност, но е отбелязана локална реактивност при 87% от пациентите /13 във всяка ваксинирана група/. Локалната реякция включва индурация, болезненост, транзиторни възловидни подкожни образувания на инжекционното място; рядко се отбелязва увеличение на регионалните лимфни възли. Никой пациент не е отказал бустерна инжекция. Не е наблюдавана разлика в честотата на локалната реакция·при първата инжекция или при бустерната /реимунизация/, както и при дозировката.
Няма и следа ст неблагоприятни ефекти върху имунната система както е измерено ин витрс чрез митоген и антиген специфични пролифератняни отговори, ил виво чрез определяне хиперсензитивнсстта на кожните тест отговори, или чрез акцелерация яа количественото CD 4 клетъчно изчерпване. Основният брой 0¾ клетки е 716 и 605 съответно за ваксинотгсваряв^те и ваксиннеотгова-. рящите. Средният брой на CD 4 клетки по време на дните за изследване 180-240 е 714 и 561, съответно за ваксиотгсварящите и ваксиннеотговарящи. По. време аа изследването на 240 дневен опит
окончателната премяна в среднато количество ка клетките за ваксинотговарящите е минус 0.2%, докато' при ваксинвотговарящите средаотб количество на CD 4 клетките клони към 7.3%/Фиг. 11/. Ваксииндуцираща HIV имумогенмост ме е свързана с данните «ги за акцелерация на CD 4 наклона у някои пациенти п© време ма целия опит.
За оценяване възможността за увеличаване на HIV репликация та и вирусния товар у пациенти като резултат ет ваксинацията, им вив© вирусната-активност се измерва чрез количество плазма и МКПК BIWSKft КУЛТУРА ШКПК ВДА полимераз на верижка реакция и серумни нива на р24 антиген. Количествата култури и DHA по
лимеразна верижна реакция не показват промени по време на ©пита. Серумния р24 антиген е незабележим при пациентите. ‘
В. Определяне на имуногенмостта
Антитела насичени срещу всички HIV протеини са измерени‘чрез използване и на рекомбинантно произведени вирусни гении продукти гп16С, роб, р24 и на цял вирусен лизат от прототип HIV спънат л’Х. Технически за използвани &М , както е описано οι а сътр., Рьос fteed. Sc<'. VSQ
76: 4350-4354 /1979/ . Измерени са също антитяло отговорите на специфични обвиващи епитопи /вижте Фиг. 7/.
Иа жигура 7 са подбрани епителите 66 /аминокиселини 86-96 в . nil 20/ и 4460 / агнило киселини 446-514 в гп12(>/, защото се стсб щава, че антитела насечени срещу тези области са свързани с ранния стадий на НГ.Т инфекцията.
Епителите 106 /аминокиселини 106-121 в гп120/, 241 /аминокиселини 241-272/, 254 / аминокиселини 254-272/, 300 /аминокиселини 3ПО-34О/, 308 /аминокиселини 308-322/, 422 /аминокиселини 422тяхната
454/ и 735 /аминокиселини 735-752/ са подбрани, заради преднолагаеча функционална важност. гцштстп-те 1и6 и 4ж< са 1>кль
чени задължително в CD 4 ; епитопи 241, 254, 735 са включени в група специфична неутрализация; и епитопи 300 и 308 са включели в типово-специфична неутрализация.
Епитоп 582 /аминокиселини 582-602/ е подбран като контролен, защото представлява имунодоминантната обвиваща области в естес твенияа HIV инфекция. Проучват се допълнителни епитопи, включително 49 / аминокиселини 49-128/'; и 342 /аминокиселини 342405/.
Еъв Фигура 7, защрихованата част означава документирана промяна в HIV обвивка- директен имунен отговор. Защрихованото с /=/ означава първичен хуморален отговор. Защрихованото с /+/ означава вторичен хуморален отговор; /-/ означава негативни, антитела ажиЕШф. на специфичния епитоп пре и постимунизация; и с /*/ се означава позитивни антитела на специфичен епитоп пре ипостимунизация, но без количествени промяна. Защриховането с /./ озна чава нов Т-клетъчен пролиферативен отговор на гп1бО следващ имунизацията. Само /./ липса на клетъчен отговор към гп160;/|$ означава »А^А чава » Ήΰί dcvCc
Т-ОРрсР /не се интерпретира/; ищ/ озна-не се извършва.»
Неутрализационна активност се измерва срущу три прототипа, изолирани /HIV-IIIE, КР и ?Ш/ в синцитиум инхибиращ сценката какте е описало в fl'fa 1Ccf t-Cy 333:469-470 /1988/ _ЧГТ специфични клетъчни отговори се измерват чрез позната лимфоцитна пролиферация определяна технически чрез използване на гп160, р24 и бакуловирусна експресивна система за контрол на протеина / β'Ζ Υ, /.
Д. Раксинстгсварящи и не- отговарящи епитопи се съчетава с ваксинациснните серии /Фиг,7/.
Пациентите са определени като ваксинотговарящи само ако репродуктивното .селективно увеличение както на клетъчния, така и *ен отговор срещу HIV обвиващи специфични
ι ?.*
Ваксина идуцираща хуморален имунитет.се дефинира като серокон версия към HIV обвиващиспецифични епитопи и / или вторичен бустер имунен отговор към'обвиващи специфични епитапи. Ваксина ин дуцираща клетъчен имунитет се дефинира като развитието на нов, репродук гп160.
тивен, свързан с ваксината, пролиферативеи отговор на Пациенти, които не развиват нит© хуморален, нито клетъчен пролифуративен отговор или, които развиват само хуморален или само клетъчен прслиферативен отговор към гп160 епитопи или HIV обвивка са класифицирани като не-оговарящи.
Е. Ваксина иидуцираща хуморален отговор
Според миг.7, 19 от 30 падиенти /63%/ показват ваксининдуциращо повишаване и яа тп160 IIIV специфичен хуморален и на клетъчен имунен отговори. Тези 19 пациенти са класифицирани като «ваксин отговарящи»». Четирима от 11-те »»ле- отговарящи»» развиват сало ху:. орален гли клетъчен имунен отговор. Всички 7 пациенти, хситс не успяват ^а демонстрират някакъв доловим ваксини одиращ с-тгсвср получават само 3 дози /Списък А/. Не са д :ι алтшЕвлштасоЪрзани към E.IY полимераза /рос/,
| г,ли струпт^р | [ .. . . ........ .. г ... Тт Т*ТГ ~ сАЛЛИ /рОЬ./ lip СДуКТИ, /ЛИ ЛЯИСо. Че- .QlV ЧС л— |
| тролеи δ.ίΐΒΓ | 011 Ί U Т СД 1 j/ С · У 'IJxiiOl·- lied i.lfjOi’lTI'j j . л/iilCc- лС. .Ш Cv. .»1 i'xJ |
| пулсвирусен | dCpt клетъчен ксягрслен претопи разбива |
| с 11ИТЯЛС . |
ixi тела /B1J.SC/ сс ^лавя у 13
А-Л ί -•ν'ΙόιΡΟίχ'ίΙνΙ': ...Ί0 Jll'i J . Ϊ Д?.ЛрУ C Cl 1 Л1 *
Псдиояти дез
Обратно, от 10 пациенти,· които са загубили сероконвврсията към всеки'обвиващ специфичен епител, никой не проявява повишане на обвиващото антитяло чрез Weskitt Md. Останалите седем пациента, коит® са сероконвертни към специфични обвиващи 1епитопи не показват промяна в цялото вирусно обвиващо антитяло чрез Не са наблюдавани пр ©мени в антиталато насочено срещу необвиващия HIV протеин при никои пациенти.
ст 15 пациенти /93// от списък Б иккахзат /6 дози/ показват повишаване в общото гп160 антитяло, срещу само 7 от 15 папациенти /47// от списък А /3 дози/ /Р= 0.01 T/SkzZ / /Фигура 7/.
Както е показано на Фиг. 8, преимунизационното към првнютрхщЕЕ® постваксинационното превалиране на всеки гп160 специфичен епитоп е респективно, кактс следва: Епитоп49 /27кдя 70//, Епитоп 88 /28 до 52//, Епитоп 106 /50 до 87//, Епител 214 /0 до i 14//, Епитоп 254 / 0 до 13//, Епитоп 300 /47 до 77//, Епитоп 308 /42 до 69//, Епитоп 342 /0 до 27//, Епитоп 422 / 3 дс10//, Епитоп 448С /73 до 87// и Епитоп 735 /17 до 33//. Отбелязано е, че ваксината предизвиква серокояверсия срещу всички специфични епитопи с изключение яа 582 /Фиг.7/. Антитела /сероконверсия/ насочени срещу Епитопи 241, 254 или 342 са само· долее вени след ваксинация.
Етерични имунни отговори са доловени към следните епито пи: 88, 106, 300, 4480 и 582. Преобладаването на антитяло насочено срещу епитоп 582 е 100/ преваксилациснно и само 1 пациент /34/ показва вторичен имунен стгсрср. Структурата is. ваксината предизвикала. НГГ антитяло ктм обвиващите епитопи е променлива /Фиг. 7/
Гтрвиччп антитяло отговори /сереконверсия/ поне към един спи-
са рандемизиражи ет Списък А /Р=О тите от Списък А.са серекенвертни сам© &5м 15 от 110/14?С/п·-.
* < ί .5 ' 1 ί ·, * . · ' , ,'tj»·; c тенциалми епитепи, към които те нямат преимумизакм· антитела. Пациентите от списък Б са сероконвертки към 60 ет 129 /47%/ /Р<0.0001$Х^& Λ Сероконверсия към три или четири епитопа се появява у 9 пациенти /60%/ рандомизйраки ет .списък Е, но сам© 2 пациенти /13%/рандомизирани от списък А /Р=0.02
Серумнеутрализиращата активност срещу три отделни клона /HIV-IIIB, МП и РГ/ е определена на 0, 90 и 195 ден при 7 пациента. 4 ет 5 ваксинетговарящи показват повишаваме на неутрализиращата активност към един или повече ет изолираните. Ваксин отговарящите в сравнение с не-отговарящите, показват повишение на способността за инхибиране синцитиалната формация.
Л. Ваксина иадуцираща клетъчен отговор
Промените в клетъчния имунен отговор се основават на сравнение на главниж пре-ваксинациснан /базалаа/ и пост-ваксинацис-нва лимфоцимфоцитен стимулиращ индекс /ЛСИ/.
ст 30 пациенти /70/7 развивай лев Т-клеттчен пролифератиес ι отговор към гп1б0 , псст-имунизационно /Фиг.7/.
Фигура 9 илюстрира прелиферативни отговори към гп16С, ₽ 24 и бакулсвирусен контролен протеин в 4 типично ваксин отговарящи. За всички пациенти гп160 произвежда пролиферативно повишавах не на средното базалнс нива наЛСИ от 3 на 1G /измерено чрез използване на 4 стойности следващи последната имунизация/. Обратно, не са отбелязани промени пролиферативните отговори насечени срепу HIV р24 протеин или контролния бакуловирусен протеин.
Ваксина предизвикала предени в средните стойности ле ЛСИ за всички пациенти, за пациенти групирани в подгрупи според ваксияжя сттснор и за пациенти, групирани чрез инужзациснея спистк, коетс е илюстриране на Фиг. 10.
'As ί,
1.
Има значителна разлика /синификаятма/ в пр •Г‘ феращинвшг отговор ктм гпШХйоду ваксим-отго е и не-от- .
· / > . '9, ' * ’ говарящи./ О.ООЪШ^^ '/.’ζΓπΙβΟ пролиферативмизмв' отговори
Ч>-· ' ' . . · ‘ •'.-ν'?····'« · :.' . A.·.,. · ', .· · > ··» .· . · предизвикани в Списък В /6 дози/ са по-големи от теЗив СписъкА /3 двзи/. / «1-0,/.
ст 21 пациенти, които развиват пролиферативен отговор към гп160, развиват и хуморален отговор /ваксинотговарящи/. максималният среден ^имфоцитен стимулиращ индекс /ЛСИ/ към гп1бО се наблюдава за всички ваксим-отговарящи ие 50:1. Но всеки ваксинален отговор е вариабилен / пик на стойностите за ЛСИ е от 3 до 171/ като представлява временна връзка на ваксинацията с големината и продължителността на клетъчните отговори към гп160 /Фиг.9/.
3. Обсъждане на резултатите
Независимо от ограничения размер на пробите при този опит, няколко са факторите, които са свързани с ваксинната имунсгенност. 6 ст 15 /40%/ от пациентите от списък А, спрямо 13 от 15 /87%/ ст пациентите от Списък Б са ваксинотговарящи /Р=0.02 /7sJiib / /Фиг.7/. От 16-те пациенти със средно базисно нива на
CD 4 измеренс пс-голямо от 600 за милилитър, 13 /81$/ са ваксинстгсварящи, срещу 6 от 14 /43%/ пациенти, чиитс средно изходно ниво на CD 4 е по-малко ст 600 клетки ria милилитър /Р=0.07Т?shu /. Еактс е обобщено в таблица 8, многократните имунизации подобряват имуясгеннсстта , «цСри при пациенти с базисно арвдик ниво на CDпо-малко от 600 клетки на милилитър. Например ст б пациенти ст Списък ъ сравнение със само 1 сък А; Рм C.03Z;^£ _ d> 5 инжекции/ cs ваксин- отговаряща които получават 3 инжекции /Спи· /Табл.8/ r / o x- /
CT 6, /
ГП160 ваксинен имунен отговор чрез , базисно CD л w дл» ял ' х ' > I I I ’ 1 I A’ ниво и муницационек списък
CJ) 4 ниво II Отговаряща /%/ ( . Не-отг®варящи/%/
| Списък А 600 500-600 | 7 5 | 5/71%/ 1/20%/ | 2 /29%/ 4/80%/ | |
| • | 500 | 3 | 0 /0^/ | 3/100%/ |
| субто- | ||||
| тален | 15 | 6/40%/ | .9 /60%/ | |
| Списък Е | ||||
| 600 | 9 | 8 /89%/ | 1 /11%/ | |
| 500-600 | 2 | 2 /100%/ | 0 /0%/ | |
| 500 | 4 | 3 /75%/' | 1 /25%/ | |
| субтс- | ||||
| тален | 15 | 13 /87%/ | 2 /13%/ | |
| Т ! ' ·) | 30 | 19 /63%/ | 11 /37%/ | |
| • | Терапевтичната употреба | на ваксини е | въведена от Пастьср | |
| през XIX век за лечение на | бяс. Ползата | от този опит за ле- | ||
| че пиете ria | други инфекции ί | ie е всестранно изследвана. Рьпреш- | ||
| че има други примери на пост-инфекци©зни | модификации на ви- |
русния специфичен имунитет / такива като след преболедуване ст хепатит А илиЕЙ/, няма дсбре документирани изследвания за човек, който показва осъществяването на този опит за доказана или хронична вирусна инжекция.
Изобретението предвижда вирусна специфична имунна модификация чрез активна имунизация след инфекция. НГГ обвиващият ген, извлечен от гп160 ваксина увеличава вирусно специфичният хуморе me»-
н отговори при 19 от 30 о .HIV заразен^па· >·?4 * . ' ‘ ’-Ц'; ' '‘ .· . „·,,,/!. -, . yj , 4 1 ·
Това; изследваме количествено и качествено измерва отделните антитяло отговори към специфични HIV -епитопи при естествена j; ·ν>$4·/,·’ '' д - инфекция в сравнение с постинфекциозка ймуки.аация. По този на'*3 i гад' 1 .· · чин, едно точно определяне иа ваксината предизвикала хуморална имуногеност във вече заразени хора е отбелязано при 70% ат пациентите. Например, 20 пациенти /19 ваксин- отговарящи и 1 ваксик не-отговарящ/ са сероконвертни. към специфични * обвиващи епитопи. Сероконверсия свързана само с ваксинация /епитопи Ά 241, 254 и342 / се появява при 10 пациенти.
В допълнение, вариации в хуморалните отговори, към тази вак* ' сина, характеризирани с епитоп мейпинг, позволяват проспективно да се проследят причината и ефекта от анализите на специфични антитяло отговори и позволява единствено възможност за характеризиране яа потенциалните имунорегулаторни механизми, не извършени пс време на естествената инфекция. . ? ·
Въпреки,че ин виво серумната неутрализираща активност е в τ' момента неизвестна, наблюдаването повишаване на неутрализираща! та активност срещу различните HIV кленове /видове/- /ШЕ, ^F F*N/ при 4 ст 5 ваксин отговарящи , предполага, че пост-инфекциозната имунизация предизвиква промени във функционалните ант титела. Тест ваксината предизвиква повишаване на серумния неутрализиращ капацитет срещу отделни ПГ/ видове и спомага за определянето на група специфични неутрализиращи епитопи.
В естествената ЯК инфекция рядко се появява пролиферативен отговор на HJ7 обвиваните протеини. След имунизацията с гп1бО
Тса. отбелязани специфични клетъчни пролиферативни отговори при
ПУМ ст пациентите. Причината за тази разлика не е ясна.
да е насечем срещу об· у
i ..·
Възможно е новият прелиферативен отговор виващ епител /. епители/ еднакъв с ваксината /като резултат от производствена методология на ваксина или алтернативно производство на антиген ин виво/. Алтернативно, протеинът използван в пролиферативния опит може да не стимулира ни пролиферативии отговори срещу хомеложните първичните Т-клетъчnbd’vLcL обвивки на естествения вирус. Забелязано е, че ваксинацията усилва клетъчния имунен отговор на организма : избрани ваксинотговарящи показват HIV-IIIB тип цитотоксични специфични Т-к клетъчни отговори следващи бустерната имунизация.
Все още не са ясни факторите отговорни за ваксинния имунен отговор при HIV инфектирани лица. Дори при ранна HIV инфекция, пациентите отговарят субоптимално на различни ваксини в сравнение с контролите. Пониженият отговор се свързва с раннаВклетъчна дисрегулация и Т-клетъчна дисфункция. Ваксинният имунен стгевср е свързан с базалнотс CD^ клетъчно количество, на което вероятно се дължи имунологичния статус на организма и с важна дедерминанта за ваксинния отговор. И/унизациснният списък със специфични Т-клетъчля количествени интервали също влиаяе w на ваксинния отговор: Списък Е /б инжекции/ епредшестващ/ Понижаването на ваксинния слговср се наблюдава при пациенти с ниско CDz клетъчно количество и /сже ._а бъде подобрен с нарастване броя на ваксинациите, ксиги предполагат по-нататъщни модификации в дозирането, режима, адювантите или ^сруулите, коетс може да подобри имунния отговор. Няма доказателства за имунна специфична токсичност при лица заразени с HIV. Количествените култури, ΠΙΑ пелимеразната рерижна реакция и серумния анттгенен опит показват повишаване иа виза ла HIV-товара. Премяната в средното СХ^количествс за отговарящи е -0.2% и-7.3% за не-отговарящи. Данните наказват, че постил^екциозния ,.мунен отговор
не е свързан с увеличаваме на CD 4 деструкция и се подезира връзка с понижаване на НГ7 репликацията им виво.
Резултатите от ваксинацията същв са сравнени с ©сневмите данни на 10 заразени, нелекувани пациенти подбрани повъзраст, етническа група и базално 6D4 клетъчно количество. Средното CD 4 количество намалява до 8.7% в тази референтна група, намалява д©7.2% при пациенти ©прелени от списък А, и се повишава до 0.6% при пациенти ат СписъкБ. Тези резултати показват, че постинфекциозната ваксинация с рекембинантен HIV обвиващ протеин е възможна,и пс-нататък изследването се насърчава с оглед профилактичната употреба на такива ваксини.
Claims (8)
- ПАТЕНТНИ Π Ρ Е Τ Ε Η ЦИЙ1. Метод за получаване състав на HIV ваксина включва стипца адювант и рекомбинантни HIV обвиващи протеимни частици с молекулно тегло поне около 2,000,000. Споменатият метод включва след ните етапи:а/ обработване на клетки ст насекоми заразени, с рекомбинантен бакуловирус; споменатият рекомбинантен бакуловирус имащ кодиращ ген за HIV обвиващ протеин, за изразяване на рекомбинантен обвиващ протеин;б/ възстановяване на споменатия рекомбинантен HIV обвиващ протеин от споменатите обработени клетки на насекоми;в/изолиране и събиране на пречистени рекомбинантни HIV обвиващи протеинни частици чрез отделяне на споменатия рекомбинантен протеин ст афинитетен матрикс съдържай; лентил лектин имобилизиран в гел медия; и г/абсорбирано на споменатите пречистени рекомбинантни HIV обЧвй*· виващи протеинни частици върху споменатия стипца адювант.
- 2. /етодът, съгласно претенция 1, се характеризира с това, че рокомбинаитните прстсиляи частици включват сксло 757 последователни аминокиселини ст споменатия HIV обвиващ протеин и в същност отхвърля около 40 последователни терминални аминокиселини ст споменатия протеин.
- 3. Методът, съгласно претенция 1, се характеризира с това, ие протеинните частици са. сферични и имат диаметър от 30 до 100иш.
- 4. /стсдът, съгласно претенция 1, се характеризира с това, баьулс че jeксмстна .τ> 1ия.1 \вг;рус е вектор /носител/ Ас304о.
- 5. етсдтт, съгласно претсадил 1, се характеризира с това, че най-напред в етап г/ изолирания пречистен рекомопнантен про теин сс подлага на гдал».за.
- 6. Методът, съгласно претенция 1, се характеризира с това, че етап г/ се извършва при pH от ©коло 7.0 до 7.2.
- 7. Методът, съгласно претенция 1, се характеризира с това, че етап б/ включва:/и/ промиване и хомогенизиране на културите заразени клетки на насекоми;/ии/разкъсване на клетките; и /иии/ възстановяване на рекомбинантния протеин от разкъсаните- клетки..
- 8. Методът, съгласно претенция 1, се характеризира с това, ча етап в/ включва:/и/ прилагане на възстановения протеин към споменатия афинитетен матрикс;/ии/ промиване на матрикса с първия лент-ил лектин буфер; и /иии/ отделяне на протеина от матрикса с втория лентил лектин буфер.етодтт, съгласно претенция 8 се характеризира стова, че
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71415291A | 1991-06-11 | 1991-06-11 | |
| PCT/US1992/004980 WO1992022654A1 (en) | 1991-06-11 | 1992-06-10 | Vaccine and treatment method of human immunodeficiency virus infection |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG97519A true BG97519A (bg) | 1994-03-24 |
Family
ID=24868938
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG97519A BG97519A (bg) | 1991-06-11 | 1993-03-10 | Метод за получаване на ваксина срещу вируса на човешка имунна недостатъчност |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0542998A1 (bg) |
| JP (1) | JPH06501851A (bg) |
| CN (1) | CN1068266A (bg) |
| AU (2) | AU2193192A (bg) |
| BG (1) | BG97519A (bg) |
| CA (1) | CA2087732A1 (bg) |
| EE (1) | EE9400183A (bg) |
| FI (1) | FI930577L (bg) |
| HU (1) | HUT68355A (bg) |
| IE (1) | IE921875A1 (bg) |
| IL (1) | IL102092A (bg) |
| LT (1) | LT3365B (bg) |
| MX (1) | MX9202781A (bg) |
| PL (1) | PL297849A1 (bg) |
| PT (1) | PT100584A (bg) |
| SK (1) | SK18993A3 (bg) |
| WO (1) | WO1992022654A1 (bg) |
| ZA (1) | ZA924150B (bg) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| USRE40786E1 (en) * | 1984-03-16 | 2009-06-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Vaccines against intracellular pathogens using antigens encapsulated within biodegradable-biocompatible microspheres |
| US6017536A (en) * | 1993-06-07 | 2000-01-25 | Trimeris, Inc. | Simian immunodeficiency virus peptides with antifusogenic and antiviral activities |
| US5464933A (en) * | 1993-06-07 | 1995-11-07 | Duke University | Synthetic peptide inhibitors of HIV transmission |
| US6479055B1 (en) | 1993-06-07 | 2002-11-12 | Trimeris, Inc. | Methods for inhibition of membrane fusion-associated events, including respiratory syncytial virus transmission |
| WO1995017515A1 (en) * | 1993-12-23 | 1995-06-29 | University Technologies International Inc. | Methods of expressing proteins in insect cells and methods of killing insects |
| AU723537B2 (en) | 1995-06-07 | 2000-08-31 | Trimeris Inc. | The treatment of HIV and other viral infections using combinatorial therapy |
| US6395541B1 (en) | 1996-05-23 | 2002-05-28 | The Rockefeller University | Methods for the identification of compounds capable of inhibiting HIV-1 viral replication employing murine cell lines expressing human topoisomerase I |
| US6319504B1 (en) | 1996-06-24 | 2001-11-20 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Treatment and prevention of HIV infection by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin |
| US6077662A (en) * | 1996-11-27 | 2000-06-20 | Emory University | Virus-like particles, methods and immunogenic compositions |
| US6214540B1 (en) | 1997-03-26 | 2001-04-10 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Chemokines that inhibit immunodeficiency virus infection and methods based thereon |
| US6583109B1 (en) | 1997-06-24 | 2003-06-24 | Robert C. Gallo | Therapeutic polypeptides from β-hCG and derivatives |
| US6548631B1 (en) | 1997-09-16 | 2003-04-15 | BIOMéRIEUX, INC. | Macrophage derived chemokine (MDC) as an anti-viral agent for the treatment and prevention of lentivirus infection |
| US6750008B1 (en) | 1999-07-09 | 2004-06-15 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission |
| US7994278B1 (en) | 1999-08-06 | 2011-08-09 | Nobel Biosciences Llc | Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA) |
| US6623741B1 (en) | 2000-02-29 | 2003-09-23 | Trimeris, Inc. | Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events including RSV transmission |
| AUPS065002A0 (en) | 2002-02-20 | 2002-03-14 | Immunaid Pty Ltd | Strategy for retroviral immunotherapy |
| JP2006509039A (ja) * | 2002-12-03 | 2006-03-16 | ユニバーシティ オブ マサチューセッツ | 多価初代ｈｉｖ−１糖タンパク質ｄｎａワクチンおよびワクチン接種方法 |
| PL1692516T3 (pl) | 2003-10-24 | 2011-05-31 | Immunaid Pty Ltd | Sposób terapii |
| GT200800303A (es) | 2007-12-24 | 2009-09-18 | Combinacion anti-retroviral | |
| PT2435825E (pt) | 2009-05-27 | 2015-11-02 | Biotempus Ltd | Métodos para o tratamento de doenças |
| AU2012298125B2 (en) | 2011-08-19 | 2015-09-24 | Immortal Spirit Limited | Antibody and antibody-containing composition |
| CN102961760B (zh) * | 2011-09-01 | 2017-07-18 | 常州文松生物技术有限公司 | 重叠肽作为制备皮肤试验和检测特异性细胞免疫的试剂及其应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL89118A0 (en) * | 1988-02-03 | 1989-08-15 | Microgenesys Inc | Vaccine containing polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus type 1 |
-
1992
- 1992-06-03 IL IL10209292A patent/IL102092A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-06-08 ZA ZA924150A patent/ZA924150B/xx unknown
- 1992-06-10 HU HU9300686A patent/HUT68355A/hu unknown
- 1992-06-10 JP JP5501040A patent/JPH06501851A/ja active Pending
- 1992-06-10 WO PCT/US1992/004980 patent/WO1992022654A1/en not_active Ceased
- 1992-06-10 SK SK18993A patent/SK18993A3/sk unknown
- 1992-06-10 AU AU21931/92A patent/AU2193192A/en not_active Abandoned
- 1992-06-10 EP EP92913889A patent/EP0542998A1/en not_active Withdrawn
- 1992-06-10 MX MX9202781A patent/MX9202781A/es unknown
- 1992-06-10 CA CA002087732A patent/CA2087732A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-10 FI FI930577A patent/FI930577L/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-06-10 PL PL29784992A patent/PL297849A1/xx unknown
- 1992-06-11 CN CN92104517A patent/CN1068266A/zh active Pending
- 1992-06-11 PT PT100584A patent/PT100584A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-07-01 IE IE187592A patent/IE921875A1/en not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-02-11 LT LTIP335A patent/LT3365B/lt not_active IP Right Cessation
- 1993-03-10 BG BG97519A patent/BG97519A/bg unknown
-
1994
- 1994-09-21 EE EE9400183A patent/EE9400183A/xx unknown
-
1995
- 1995-12-07 AU AU40288/95A patent/AU4028895A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK18993A3 (en) | 1993-10-06 |
| FI930577A7 (fi) | 1993-03-24 |
| MX9202781A (es) | 1993-04-01 |
| HU9300686D0 (en) | 1993-06-28 |
| IL102092A0 (en) | 1993-01-14 |
| AU4028895A (en) | 1996-02-22 |
| EE9400183A (et) | 1995-12-15 |
| HUT68355A (en) | 1995-06-28 |
| LTIP335A (en) | 1995-01-31 |
| AU2193192A (en) | 1993-01-12 |
| LT3365B (en) | 1995-07-25 |
| PL297849A1 (en) | 1994-01-24 |
| JPH06501851A (ja) | 1994-03-03 |
| IL102092A (en) | 1996-11-14 |
| ZA924150B (en) | 1993-02-24 |
| PT100584A (pt) | 1993-07-30 |
| FI930577A0 (fi) | 1993-02-10 |
| IE921875A1 (en) | 1992-12-16 |
| CA2087732A1 (en) | 1992-12-12 |
| FI930577L (fi) | 1993-03-24 |
| WO1992022654A1 (en) | 1992-12-23 |
| EP0542998A1 (en) | 1993-05-26 |
| CN1068266A (zh) | 1993-01-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG97519A (bg) | Метод за получаване на ваксина срещу вируса на човешка имунна недостатъчност | |
| US12233124B2 (en) | Recombinant metapneumovirus f proteins and their use | |
| Gorse et al. | A dose-ranging study of a prototype synthetic HIV-1MN V3 branched peptide vaccine | |
| EP0939835A1 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| CN108912215A (zh) | 用于登革病毒表位的方法和组合物 | |
| JP2013523617A (ja) | Ｈｉｖワクチン | |
| CZ195793A3 (en) | Derivatives gp160 and vaccine based on gp160 or on a derivative of said substance, containing an auxiliary component | |
| KR100194079B1 (ko) | Hiv 감염 예방 또는 치료용 제약학적 조성물 및 이의 제조방법 | |
| US9486518B2 (en) | Membrane proximal region of HIV GP41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine | |
| EP0327180A2 (en) | Vaccine containing polypeptides derived from the envelope gene of human immunodeficiency virus type 1 | |
| AU733234B2 (en) | Conjugated peptides, immunological reagent containing same and use thereof for treatment of immunological disorders | |
| WO2025189435A1 (zh) | 针对猫fipv的多表位抗原构建rna疫苗的方法 | |
| DE69233271T2 (de) | Therapeutischer- und präventivimpfstoff gegen hiv | |
| EP0328390B1 (en) | Peptide treatment of refractory infectious diseases | |
| US20080267989A1 (en) | Hiv Gp-41-Membrane Proximal Region Arrayed On Hepatitis B Surface Antigen Particles as Novel Antigens | |
| US7588764B2 (en) | Compositions comprising human immunodeficiency virus Tat adsorbed to the surface of anionic nanoparticles | |
| US20210379182A1 (en) | Bivalent dengue/hepatitis b vaccines | |
| JP2001505763A (ja) | Ｈｉｖ ｐ―１７ペプチドフラグメント、それを含有する組成物並びにその製造及び使用方法 | |
| AU2006200454B2 (en) | Compositions and methods for treating viral infections | |
| WO2025090742A1 (en) | Coronavirus receptor binding domain (rbd) nanoparticle vaccines | |
| SI9200420A (sl) | Vakcina proti infekciji, ki jo povzroča človeški virus imunodeficience | |
| HU211505A9 (hu) | HIV-fertőzés kezelésére szolgáló vakcinakészítmény Az átmeneti oltalom az 1-15. igénypontokra vonatkozik. | |
| LV10492B (en) | Vaccine and treatment method for human immunodeficiency virus | |
| HK1128410A (en) | Multivalent hiv vaccines | |
| HRP921484A2 (en) | Vaccine and treatment method of human immunodeficiency virus infection |