JPH06501851A - ヒト免疫不全症候ヴィールスに対する痘苗（ワクチン）および治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト免疫不全症候ヴイールスに対する痘苗（ワクチン）および治療方法本発明は 、１９８８年２月３日出願の米国特許出願第１５１，９７６号の一部継続出願で ある（現在では特許出願第５８５．２６６号）。そして、米国特許出願第１５１ ，９７６号は、１９８６年１０月１６日出願の米国特許出願第９２０゜１９７号 の一部継続出願でもある。

発明の背景 １型ヒト免疫不全症候ヴイールス（ＨＩＶ−１）は、遡及性（レトロ）ヴイール スで、免疫系に激しい病状でもって感染を引き起こし、後天的免疫不全症候群（ エイズ）の病原体である（バージ　シノーシ等（Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ 　ｅｔ　ａｌ、　）　、サイエンス誌　２２０：８６８−８７１　（１９８３） ；　ポポヴイック等（Ｐｏｐｏｖｉｃｅｔａｌ、）、サイエンス誌　２２４　： ４７９−５００　（１９８４）参照）。臨床的なＨＩＶ−１の分離は、リンパ節 炎関連ヴイールス（フェオリーノ等（Ｆｅｏｒｉｎｏ　ｅｔａｌ、）、サイエン ス誌　２２５　：　６９−７２　（１９８４）’）やエイズ関連ヴイールス（レ ヴイー等（Ｌｅｖｙ　ｅｔ　ａｌ、　）、　サイエンス誌　２２５　：　８４０ −８４２（１９８４）。

エイズは疫病となっており、痘苗（ワクチン）の開発か世界保健上の見地から優 先的問題となっている。エイズ感染者のかなりの多くは、Ｔ−リンパ球の欠乏に より免疫機能が徐々に失われている。一定の神経細胞と同様に、Ｔ−リンパ球は 表面にＣＤ４と称される分子を有している。ＨＩＶ−１は、ヴイールス粒子の表 面膜に位置する受容器を介してＣＤ４を認識し、細胞の内部に進入して増殖し、 結果として細胞を死滅させる。有効なエイズ痘苗（ワクチン）は、ＨＩ’Ｖ−１ の表面膜にくっつく抗体を誘い出してリンパ球や他の敏感な細胞に対する感染を 防止する。

痘苗（ワクチン）は、免疫予防手段として健康な人が病原菌に感染する前に、投 与されるのが一般的である。しかしながら、病気に対する免疫療法として感染後 に有効なエイズワクチンを用いることを考慮するのも一部あることである（サー ク、Ｊ、（ＳａｌＫ、　Ｊ、）、ネイチャー誌、３２７　：　４７３−４７６　 （１９８７））。

痘苗（ワクチン）の開発にあたっては、ＨＩＶ−１の包被（“ｅｎｖ”）が最有 力候補であると一般に考えられている（フランシス、ベトリッチア一二（Ｆｒａ ｎｃｉｓ、　Ｐｅｔｒｉｃｃｉａｎｉ）、　ニューイングランド　ジャーナルメ ディスン、１５８６−１５５９　（１９８５）；　ヴオグトおよびヒルシュ（ｖ ｏｇｔ、　Ｈｉｒｓｈ）　、感染病レビュー誌、８：９９１−１０００　（１９ ８６）；　ファウチ（Ｆａｕｃｉ）　、ナショナルアカデミ−科学紀要ＵＳＡ、 ８３　：　９２７８−９２８３）、ＨＩＶ−１の包被蛋白は、分子量１６０，０ ００のグリコ蛋白（ｇｐ１６０）として最初に合成された。この初期のグリコ蛋 白（ｇｐ１６０）は、分子量１２０．０００の外被性グリコ蛋白（ｇｐ１２０） と分子量４１．０００の膜通過性グリコ蛋白（ｇｐ４１）とに分離された。これ らの包被蛋白は、エイズ患者の抗体に対する主要な目的抗原である（バリン等（ Ｂａｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）　、サイエンス誌　２２８　：１０９４−１０９ ６（１９８５））。ＨＩＶ−１ｇｐ１２０自体は、免疫性を示し、げっ歯頚、羊 やリーサス猿やチンパンジーに対しては中性化させる抗体を誘導する能力を備え ていた（ロベイ等（Ｒｏｂｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　）　ナショナルアカデミ−科学 紀要ＵＳＡ、８３　：　７０２３−７０２７　（１９８６））。

感染細胞でのＨＩＶ−１ｇｐ１２０自体の包被蛋白レベルが低いことや、ＨＩＶ −１感染細胞からエイズ痘苗（ワクチン）を抽出するに伴う危険性があるため、 組換えＤＮＡ方法が適用され、エイズ痘苗（ワクチン）として使用するＩ（ＩＶ −１包被抗原が生成されてきた。組換えＤＮＡ方法の技術は、エイズ　サブユニ ット　ワクチンを生産するには最も優れた手法である。これは、安全て経済的に 免疫原を生産する能力を備えているからである。ＨＩＶ−１包被蛋白は、遺伝子 を換えられたヴ７クシニア　ヴイールスの組換えにより行われる（チャクラバー チ等（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ、　）、ネイチャー誌、３２０：５ ３５−５３７　（１９８６）；ツー等（Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ、　）　、ネイチャー 誌、３２０：５３７−５４０　（１９８６）；キー二等（Ｋｆｅｎｙ　ｅｔ　ａ ｌ、　）、バイオテクノロジー、４　：　７９０−７９５　（１９８６））。こ の包被蛋白は、バクテリア細胞内で生成され（プツトニー等（Ｐｕｔｎｅｙ　ｅ ｔ　ａｌ。

）、サイエンス誌　２３４　：１３９２−１３９５　（１９８６））　、哺乳顕 細胞（ラスキー等（Ｌａｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、　）、サイエンス誌、２３　：　 ２０９−１２　（１９８６））や昆虫細胞内で生成される。ＨＩＶ−１ｇｐ４１ 内のアミノ酸配列から誘導された合成ペプチドは、エイズワクチンの有力候補に 挙げられてきている（ケネディ等、（Ｋｅｎｎｅｄｙ　ｅｔ　ａｔ、）　（１９ ８６）　）　ｏしかしながら、この方法や物質からは有効なエイズワクチンは製 造できなかった。

桿状ヴイールスー昆虫細胞ベクトル系を用いて組換えＨＩＶ−１包被蛋白を製造 することは、この発明の一側面であり、本出願とともに出願中であり、譲渡者を 共同とする１９８６年１０月１６日出願の米国特許出願第９２０．１９７号（現 在では米国特許出願第５８５，２６６号となっている）に開示されている（米国 特許出願第１５１，９７６号も参照）。

桿状ヴイールス系を用いると、ＨＩＶ−１蛋白や他の蛋白を製造する上で有用で あることが判明した。例えば、桿状ヴイ〜ルスであるオートグラーファ　カリフ すルニ力（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉｃａ）の核多面体状ヴイ ールス（ＡｃＮＰＶ）をベクトルとして用いて、ｇｐ１６０の全長体や、感染し たスポドプテラ　フルギペルダの細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅ ｒｄａ粟夜盗虫）内に種々の蛋白質を生成した（Ｓｆ９細胞）。なお、出願係属 中の特許出願には、さい頭形のｇｐ１６０の遺伝子（組換え番号　Ａｃ５Ｏ−４ ６）、組換え番号　Ａｃ３０４６から製造された蛋白や、Ａｃ３０４６遺伝子製 造のための精製技術が開示されている。この精製技術には、レンチル−レクチン （レンズ豆抽出形細胞凝集住物）　（ｌｅｎｔｉｌ　１ｅｃｔｉｎ）親和性のク ロマトグラフィやゲル浸透性クロマトグラフィが含まれている。

このようにして精製され１こｇｐ１６０蛋白のうち、凝集させて泣子化したもの は、げっ歯頚や霊長類に対して有効な免疫原となることが判明した。

理想的なエイズワクチンは、生物学的に純粋であることや非発熱性であることに 加えて、数回投与した後に感染に対して永久的保護が可能でなければならない。

この要件は、活性を弱めたワクチンに対しても当てはまる。死滅した細菌やヴイ ールスその他のものが、分離されると、毒物や蛋白質といったものがワクチンと して用いられるが、これらのものは、抗体反応は弱く、短期間の免疫効果しか有 さないことが多い。この欠点を補うには、補助剤と称される追加成分が必要であ る。この補助剤は、免疫反応を刺激する働きを有する。人間のワクチンに用いら れる補助剤に共通するものは、アルミニウム塩ゲル（リン酸アルミニウム、水酸 化アルミニウム）であり、普通にはアルミ補助剤と称せられる（ポンフォード等 （Ｂｏｍｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　）、“補助剤”、動物細胞バイオチック　第 ２巻：２３５−２５０、アカデミツク　プレス社　ロンドン：１９８５）。

本発明は、ヒト免疫不全症候ヴイールス（ＨＩＶ）に対する痘苗（ワクチン）お よび治療方法を提供することが目的であり、感染者および感染可能者に対して組 換えＨＩＶ包被蛋白を投与することとを構成要件としている。好ましい実施例と しては、包被蛋白は精製され、集められて、ワクチンとして使用するために補助 剤（例としてはアルミ）により処理されている。

図面の簡単な説明 本発明の詳細は、添付の図面と共に以下に説明する。

第１図は、Ｅ、ｃｏｌｉ　プラスミドｐＮＡ２からＨＩＶ−１包被遺伝子（ｅｎ ｖ）を分離するに用いるクロニング方法を示す。斜線部分は、ＨＩＶ−ＩＤＮＡ 配列で、空白部分はクロニングベクトルからの部分を示す。プラスミドｐ１７７ ４における黒色部分は合成されたオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ ｔｉｄｅ）から構成され、プラスミドｐ１６１４のＳｍａ　Ｔの位置にＳｍａ　 Ｉ・曲・ＫｐｎＩ片として導入されたものである。この合成オリゴヌクレオチド の配列が示されている。

第２図は、組換えプラスミド　ベクトル（ｐ　３０４６）を構成するために用い る手法を示し、これは桿状ヴイールス生成ベクトル（Ａｃ３０４６）を構成する ために用いられる。プラスミド　ｐ　ＭＧ　Ｓ　３は、４．００で表されるクロ ニング位置のいずれかに桿状ヴイールスＡｃＮＰＶから生成された配列（斜線部 分）を含む。この位置は、Ｓｍａ　ＩやＫｐｎＩやＢｇｌｌｌに対して特有の内 ヌクレアーゼの制限酵素を有する。Ａ　ｃ　Ｎ　Ｐ　Ｖ多面形プロモータは、４ ．００の位置から５′の方向にある。この配列５″−ＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡ− ３＝は、３′の方向にあり、全ての三つの読取り系に転写終了コドン（特定のア ミノ酸を作り出す遺伝情報を形成するヌクレオチド３個の連続）を有する。プラ スミドｐ１７７４および合成オリゴヌクレオチド部分の配列は、第１図に示しで ある。プラスミドｐ３０４６は、ｐ１７７４のＨＩＶ−１包被遺伝子の挿入され たＳｍａ　ｒとＢｇＩ１１位置との間の配列を除いてはｐＭＧＳ３の全てを含ん でいる。

第３図は、Ａｃ３０４６　ｇｐ１６０のコード配列の両側に存するＤＮＡのヌク レオチド配列を示す。＋１と＋２２６４との間の３０４６　ｅｎｖ　ＤＮＡ配列 は、第４図に示す。

第４３図ないし第４に図は、Ａｃ３０４６　（＋１と＋２２６４との間）のｅｎ Ｖ遺伝子の５′端部における合成オリゴヌクレオチドとともに示すＨＩＶ−１ｅ ｎｖの実際のＤＮＡ配列である。内ヌクレアーゼの制限酵素の位置は、ＤＮＡ配 列の上に示され、前述のアミノ酸配列はＤＮＡ配列の下に示されている。各基に は左右に番号が付されている。

第５ａｅないし第５ｄ図は、Ａｃ３０４６からのｅｎｖ遺伝子の配列を既知のＬ ＡＶ−１からｅｎｖ遺伝子の配列と比較する図である。ＬＡＶ−１配列は、上方 に示され、Ａｃ３０４６は下方に示されている。ＬＡＶ−１配列の下方の線（１ ）は、ＡＣ３０４６の配列はこの位置では同一であることを示している。ＤＮＡ 配列の番号は、ワインーポプリン等αａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　） かＩ、ＡＶ−１に対して記載したのと同一のものを用いている（細胞、４０　： 　９−１７　（１９８５）’）第６図は、ヒトＨＩＶ−１抗体陽性血清（上のグ ラフ）および、ｇｐ１６０（ＩＪ５５、ＫＬ５５）あるいはｇｐ１２０　（ＡＢ ５５、ＣＤ５５、ＧＨ５５）により免疫化された動物からのリーサス猿の血清（ 下のグラフ）についてのＥＬＩＳＡ終点稀釈滴定を示す。このＥＬＩ　ＳＡ終点 稀釈滴定は、高度に精製されたｇｐ１２０やｇｐ１６０蛋白に対して測定される 。特別に結合させた抗体は、羊−反ヒトＩｇＧ　ＨＲＰ対に対して測定された。

本テストにより陽性反応を与える血清の最大稀釈は、滴定である。

第７図は、ワクチン化した血清陽性患者についてのｇｐ１６０ワクチンが誘導す る免疫反応を要約した表である。

第８図（ＡおよびＢ）は、特殊なＨＩＶ包被エピトープに対して直接行われるワ クチン誘導免疫反応を示す。

第９図は、ワクチン化した血清陽性患者についてｇｐ１６０に対するワクチン誘 導化子細胞増殖反応を示す。

第１０図（Ａ−Ｃ）は、ワクチン化に伴うリンパ球増殖反応を示す。

第１１図は、反応者および非反応者におけるＣＤ４細胞の経時的変化を示す。

発明の概要 組換えＨＩＶ−１ｇｐ１６０包被蛋白（’ｒｇｐ１６０”　）　、とりわけ、燐 酸アルミニウムなどが補助剤に吸着されたときには、エイズワクチンとしては特 に有効であることが判明している。この発明の一側面では、組換えクローン３０ ４６番に見出されたアミノ酸１−７５７に関するＨＩＶ−１包被遺伝子の蛋白に 対するコード配列を有するＡｃＮＰＶ発現ベクトルを扱う。また他の側面では、 昆虫細胞内の組換えＨＩＶ−１包被蛋白（および蛋白質自体）の製造に関する。

とりわけ、アミノ酸配列１−７５７　（すなわち０３０４６）によりコード化さ れたｒｇｌ）１６０蛋白を取り扱う。

本発明の他の側面では、３０４６蛋白および、燐酸アルミニウムを集めるために ３０４６粒子の吸着する組換え桿状ヴイールスの遺伝子複製物から組換え包被蛋 白の精製および純粋化することを含んでいる。

本発明は、エイズおよびＨＩＶ感染に対する予防、治療用ワクチンおよび、エイ ズおよびＨＩＶ感染に対する予防および治療方法をも含んでいる。

発明の詳細な説明 次の例は、発明を限定するものではない。

組換え桿状オートグラーファ　カリフォルニカ核多面状ヴイールス（ＡｃＮＰＶ ）は、ＨＩＶ包被蛋白（組換えＡｃ３０４６）のさい頭形のＨＩＶ−１ｇｐ１６ ０コードを含んでおり、このことは出願係属中の特許出願束９２０．１９７号（ 現在では特許出願束５８５，２６０号）。組換え桿状ヴイールス含有遺伝子を構 成するために用いられるクローニングの手順は、先の出願に開示されているし、 ここにも文献として組み込まれている。

下記は、Ａｃ３０４６発現ベクトルを構成するために用いられる遺伝子技術の手 順を詳細に記載したものである。ここに使用される物質は、酵素や免疫反応物を 含み、市販されているものである。本発明の製法および応用例も記載されている 。

集合的には、ｒｇｐ１６ｏとして参照される他の組換え包被蛋白は、考慮され、 組換えｇｐ１２０およびｇ　ｐ　、４１蛋白が含まれている。ＡＣ３０４６は、 本発明による発現ベクトルの一例であり、組換え包被蛋白でもある。

例１ アミノ酸１−７５７に対するＨＩＶ−１コ一ド配列を有する桿状ヴイールス組換 えＡ　ｃ　３０　＝４６の生成 桿状ヴイールスベクトルにおける異蛋白発現コード配列は、一方ではポリヒドリ ン蛋白促進子（Ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）および上流の配列と 同列になっており、他方では桿状ヴイールスのコード配列と揃って並んでいる。

この配列においては、桿状ヴイールスの遺伝子とに対応する組換えは、ポリヒド リン蛋白促進子および不活注形遺伝子と並んでいる異物コード゛配列の転写を起 こす。

したがって、ＨＩＶ包被遺伝子の製造のために、多様な挿入ベクトルが創生され ている。挿入ベクトルであるＮｆＧＳ３は、下記に述べるように、ＡＴＧ転写開 始コドンを供給するためのものである。このベクトルに異物配列を挿入するに際 しては、転写開始コドンにより生じた転写系か異物配列を全体的に正しく維持さ れる状態で行われる。挿入ベクトルＮｌＧ５３は、悪疾（ｐｌａｑｕｅ）を精製 したＡｃＭＮＰＶ分離体から得られ７′：ＤＮＡのＥｃｏＲＩ−Ｉ制限片クロー ンから構成されたものである（ＷＴ　−１，）。二〇＼１Ｇｓ３は、下記の構造 的特徴を有している。

（ａ、　）多面的遺伝子のＡ　Ｔ　Ｇ開始コドンから上流側に４００Ｃ１ｂｌ） の配列がある。

（ｂ）位置指力形の変種生成に誘導された高度連鎖子を有し、多面体コドンに対 応する位置に存するＡ　Ｔ　Ｇ開始コドン、制限付ＩＳｍａ　Ｌ　Ｋｐｎ　Ｌ　 Ｂｇｌ　１■および汎用停止コドン断片から成っている。

（Ｃ）多面体遺伝子の内側でゐるＫｐｎｌ制限位置からＥｃｏＲＩ−ｒクローン の末端ＥｃｏＲＩ制限位１に延びる１７００ｂｌ）の配列がある（第２図参照） 。

例２ アミノ酸１−７５７に対するＬＡＶ　ｅｎｖコード配列を有する桿状ヴイールス 紐換えの生成 第１図にＮＡ２として示す組換えプラスミドは、ｐＵｃ１８に挿入された全体の ＨＩＶ−１親和性ヴイールスの２１．ｓｋｂ切片からなる。ヒトの所定の細胞に 感染してからヴイールスとなることから、このクローンは、感染性とされている （アダチ等（Ａｄａｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、雑誌ヴイールス学、５９　： 　２８４−２９１　（１９８６））。ＮＡ２に含まれる完全な包被遺伝子配列は 、ＨＩＶのＬＡＶ種から誘導されたものである（バージ　シノーシ（Ｂａｒｒｅ −３ｉｎｏｕｓｓｉ）、１９８３）。

ＨＩＶ−１の包被遺伝子は、分離され、下記のように処理される（第１図参照） 。この包被遺伝子は、ＮＡ２から３８４６ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／５ａｃＩ制限断片 として最初は分離され、ＥｃｏＲＩ／５ａｃｌ制限位置ｐＵｃ１９にり。−ユン グされる。この結果生じたプラスミドは、ｐ７０８として特定される。

包被遺伝子は、その後に２８００ｂｐ　ＫｐｎＩ制限断片として再度分離されて 、ｐＵＣ１８のＫｐｎＩ制限位置にクローニングされる。この結果生じたクロー ンは、ｐ１６１４として特定される。

このｐ１６１４におけるＫｐｎＩ制限断片は、ＨＩＶ包被遺伝子の僅かにさい頭 形部分を含んでいるから、Ｎ一端部の１２１ｂｐに対応する配列は失われている 。この失われた部分の遺伝子は、誘導形ペプチド配列を含み、二重螺旋の単量体 （ｏｌｉｇｏｍｅｒ）の挿入により置き換えられている。挿入された単量体は、 適宜の多面体遺伝子コドンを用いてＬＡＶアミノ酸配列配列創生される。この遺 伝子組換え操作を促進するために、ＡＴＧ開始コドンの代わりに新たなＳｍａ　 Ｉ制限配列か同時に導入される。ＡＴＧ開始コドンは、桿状ヴイールス挿入ベク トルにより供給される。この結果生じたプラスミドは、ｐ１７７４として特定さ れる。

第２図において、ＨＴＶ−１包被の様々な領域にコード配列を含むｐ１７７４か らの制限断片は、クローニングされてＮｉＧ５挿入ベクトル（例：ＭＧＳ３）と なるから、挿入ベクトルのＡＴＧ開始コドンは、包被遺伝子のコドンとともに組 み込まれている。ｐ１７７４の構造は、プラスミドベクトルｐＭＧＳ３のＳｍａ Ｉ／ＢｇｌＩＩの位置に挿入されたｐ１７７４から分離されたＳｍａＩ／Ｂａｍ ＨＩ制限断片から成っている。このクローンは、ｇｌ）１６０のアミノ酸１〜７ ５７に対する配列コードを有し、５ｆＧＳ３ベクトルにより供給された終端コー ドを利用している。

例３　組換え桿状ヴイールスの創成および選択ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子絹換えプ ラズミドｐ３０４６は、Ａ　ｃ　ｋｉ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　（ＷＴ−１）とともに沈澱 させた憐酸カルシウムであり、非感染状態のスボドプテラフルギベルダ（Ｓｐｏ ｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ粟夜盗虫）の細胞に加えられる。ついで 、仮想上の遺伝子は、相同組換えによりＡｃＭＮＰＶ配偶子に挿入される。組換 えヴイールスは、閉塞性陰性悪疾形態学（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ　ｎｅｇａｔｉｖ ｅ　ｐｌａｑｕｅ　ｍｏｒｐｈｏｌＯｇいにより同定される。このような悪疾は 、細胞破壊効果を示すが、核の閉塞は起こさない。二回の追加的な悪疾精製が続 いて行われて、純粋な組換えヴイールスを得る。組換えヴイールスＤＮＡは、こ れらの制限、混成特性を野生のヴイールス形ＤＮＡと比較することによりＨＩＶ 　ｅｎｖ配列への挿入位置特定のために分析される。

例４ 組換えからのＨＩ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖの発現感染した１虫細胞内の桿状ヴイールス 昆虫細胞内の組換えヴイールスからのＨＩＶ　ｅｎｖ配列の発現により、結果的 には第１次転写物質が合成される。この第１次転写物質は、組換えベクトルから 供給されたコドンから転写されたアミノ酸からなる。この結果、ポリヒドリン蛋 白促進子から発現ベクトル（例：ｒｇｌ）１６０）上の転写末端誘導部への下流 に存する発現ベクトルのＡＧＴＩ始コドンに対する全てのアミノ酸を含む蛋白質 が生成される。第１次転写物質であるＡＣ３０４６は、Ａｒｇ　（位置４）が元 のＬＡＶクローンでは位置２のＡ　ｒ　ｇであるところの終端位置にてはＭｅｔ −Ｐｒｏ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　ｒ　ｇ　−Ｖａ　１と読める。Ｍｅ　ｔ−Ｐｒｏ− Ｇｌｙ：＋トンはクローニング技術の結果により供給される。

例５ ｇｐ１６０挿入子およびＤ　Ｎ　Ａ両側のヌクレオチド配列ＤＮＡ両側およびｇ ｐ１６０挿入子のヌクレオチド配列は、ヴイールス形発現ベクトルＡｃ３０４６ ＤＮＡから分離された制限断片により決定される。かかる配列技術は下記の手順 による。３．９ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ断片は、Ａｃ３０４６ヴイールス 形ＤＮＡの制限的取り込みにより精製される。このＡｃ３０４６ヴイールス形Ｄ ＮＡは、ワクチン製造のために用いられた媒介細胞に存在する細胞外ヴイールス から創成されたものである。

第２図に示すように、３．９ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩ断片は、全部のｇｐ １６０遺伝子、上流の１００ｂｐおよび両側ＤＮＡの下流の約１０００ｂｐから なる。このうち、全部のｇｐ１６０のヌクレオチド遺伝子配列は、上流の１００ ｂｐおよび両側ＤＮＡの下流の１０００ｂｐを含めて決定されている。

要するに、配列決定の結果、クローニング技術で予想したように仮想上の構造が 現れた。ｇｐ１６０の配列は、ワインーポプリン等（１９８５年）が報告した通 りであった。転写開始と思われる位１と終端コドンとの間に存する２２５３基の 配列により、７５１アミノ酸コドンおよび２８潜在形Ｎ一連鎖型の糖形成化位置 が予測される。このｒｇｐ１６０算定分子量は、残存する糖分を含めて凡そ１４ ５．０００である。ｐＮＡ両側の２００基の連続的分析により、第３図、第４図 および第５図に示すように、正しい挿入を示していることが分かる。

例６ ｇｐ１６０のアミノ酸配列 自動化されたエドマン減化■ｄｍａｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）およびＨＰＬ Ｃ法を用いて、ｇｐ１６０の最初の１５残留部分のＮ一端末部分がＤＮＡ配列か ら予測されたそれと同一と決定された。Ｎ一端末部分のメチオニンは、ｇｐ１６ ｏの蛋白質には存在していない。このことは、ＡｃＮＰＶ多面体蛋白質がＮ一端 末部分のメチオニン無しで生成されることの知見と理論的に整合する。結局、実 際のｇｌ）１６０ＤＮＡおよびＮ一端末蛋白の配列は、ＡｃＮＰＶ　３０４６　 ＤＮＡおよび精製されたｇｐ１６０の分析により決められたように、下記に示さ れる（表１）。

表１ ＡｃＮＰＶ　３０４６発現ベクトルにおけるＬＡＶ　ｅｎｖ遺伝子残存物 ２　３　４　５　６　７　Ｆ３　９　１０　１１　１２　１３　１．４Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　 Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ１ｙ ＡＴＧ　ＣＣＣＧＧＧ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　へＡＧ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＴＡＣＣＡ へ　ＣＡＣＣＴＧ　ＴＧＧ　ＣＧＴ　ＴＧＧＧＧに れらの結果を元のＬＡＶ−１のクローンと比較すると表２が得られる。

表２ 元のＬＡＶ−１のクローンにおけるＬＡＶ　ｅｎｖ遺伝子残存物 １、２　３　４　５　６　７　８　９　１０　１１　１２　１３　１４Ｍｅｔ　 ＡｒｇＶａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔ ｒｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ、へＴＧ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　〜ＡＧ　ＧＡＧ　へ ＡＧ　ＴＡＴ　ＣへＧ　ＣＡＣＴＴＧ　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＧＧ例７ 組換えｇｐ１６０の精製 本発明の一側面においては、Ａ　Ｃ３０４６発現ベクトルにコード化された祖換 えＨＩＶ−１包被蛋白を抽出して精製する製法が用いられている。組換えＨｒＶ −１包被蛋白ｇｐ１６０は、Ａｃ１６０注人後４〜５巳間でＳ、フルギペルダ（ Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の細胞内に生成される。ｒｇｌ）１６０の精製は 、下記の手、順で行なわれる。

１、細胞の洗浄　２．細胞溶解　３．ゲル浸透クロマトグラフィ　４．レンチル −レクチン（Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ　；レンズ豆から得られるレクチン） 親和性クロマトグラフィ　５．透析 本例は、２Ｘ１０’個のＡｃ　３０４６の感染細胞から得られた組換えｇｐ１６ ０を精製する方法を記載している。

１、細胞の洗浄 感染細胞は、５０ｍＭのトリス緩衝液（Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７，５） 　、１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび１％のトリトンＸ−１００を含む緩衝液によ り洗浄される。この緩衝液内で細胞か懸濁さｎ通常の手法により均一化され、５ ０００ｒｐｍにより２０分間遠心分離される。この手順を３回繰り返す。

２、細胞溶解 感染細胞は、５ＱｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８，０〜８．５）、４％デオキシコ レ−ｔ−（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）および１％ベーターメルカプトエタノー ル内で衝撃音波法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）により溶解される。この衝撃音波法 は、通常の技術により行われる。衝撃音波法を行った後には、核膜の残存物のみ が無傷状態で残り、これらは５０００ｒｐｍにより３０分間遠心分離により取り 除かれる。抽出されたｇｐ１６０を含む表面浮遊物は、無傷状態の細胞で、光学 顕微鏡による観察で確認される。

３、ゲル浸透 ゲル浸透の操作は、セファクリル樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）により充填さ れたファーマシアの５．ＯＸ５０ｃｍガラスカラム内で行われる。全層体積は、 おおよそ１７５０ｍ１である。このガラス柱および接合部分を非発熱性にして浄 化するために、少なくとも６リツターで０．１規定の水酸化ナトリウムをガラス 柱に２４時間流す。このガラスカラムからの流出物は、ＵＶ−流量セル、モニタ ーおよびチャート記録器（ｐｈａｒｚａｃｉａ社）に接続され、４リツターのゲ ル浸透緩衝液により平衡化される。未処理のｇｌ）１６０は、ガラス柱に詰めら れてゲル浸透緩衝液により処理される。このガラスカラムにより、この未処理の 混合物か三相の大きなＵＶ吸着成分に分離される。最初のピークは、緩衝液て略 ５００ｍ１と７００ｍ１の間で現われる。ついで、第２のピークは、略７００ｍ １と１４００ｍ１の間で、第３のピークは略１４００ｍ１と１９００ｍ１の間で 現われる。これと同じ現象は、最初のピークが本質的で分子量２，０００，００ ０以上を示すことを決定する小形の分析カラムによっても観察される。

このピークは、高分子量の脂質および脂質：混合物の析出により半透明状態であ る。このピークには、感染細胞から抽出されたｇｐ１６０の１０％から２０％が 含まれている。明らかに、ｇｐ１６０のこの部分は、自己と複合化さｎｌあるい は他の成分と複合されて高分子量の析巴物となっている。

第２の幅広なピークは、ｇｐ１６０の大半が含まね、分子量が略１８，０００と ２００，０００との開蓋白質を含んでいる。

第３のピークには、資料中のベーターメルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐ ｔｏｅｔｈａｎａｌ）のため、少量の蛋白が含まれている他は、大半がＵＶ吸着 である。

ＵＶ吸着を追跡の結果、第２のピークを最初に検出したときには、ガラスカラム からの流出物は、レンチル−レクチンカラム（ｌｅｎｔｉｌ　］ｅｃｔｉｎ　ｃ ｏｌｕｍｎ）に直接与えられる。第２のピークがガラスカラムから消えたときに は、流出物は、レンチル−レクチン（ｌｅｎｔｉｌ　Ｉｅｅｔｉｎ）カラムから 外し、そのまま捨てる。

４、レンチル−レクチン（Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉ、ｎ）　（レンズ豆から得 た細胞凝集性物質）レンチル−レクチン親和性ゲル媒体（Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃ ｔｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）は、薬局から大量に購入される。レンチル −レクチンは、セファデックス（クロマトグラフィ用球状粒子）　（Ｓｅｐｈａ ｄｅｘ）で親和性クロマトグラフィにより純度９８％以上に分離される。ついで 、シアン化硼素を用いてセファローズ　４　Ｂ　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）に 結合させることにより固定される。この母液は、ゲル１ｍｌに対して略２ｍｇの レンチル−レクチン（ｌｉｇａｎｄとして）を含んでいる。レンチル−レクチン カラムは、５．０ｃｍＸ３０ｃｍのガラスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で、 １２５ｍ１のレンチル−レクチン　セファローズ　４　Ｂ　（Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌ ｅｃｔｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ）ゲル（高い分子量を有する物質を低分 子化するための濾過媒体）を含んでいる。

この母液は、完全に洗浄後に再び利用され、仕入れ先から指示された手法により 再生産される。使用しない場合には、ゲルは、０．　９％ＮａＣ１，１ｍＭ　Ｍ ｎＣｌ２．１ｍＭ　ＣａＣ１□および０．０１％のチメロサール（ｔｈｉｍｅｒ ｏｓａｌ）の溶液を含んだガラスカラム内に貯蔵される。このガラスカラムは、 既述したように使用毎に洗浄されて２５０ｍ１のレンチル−レクチン緩衝液によ り平衡化される。

未処理のｇｐ１６０は、既述のようにゲル浸透柱から流出しているときに亘接ガ ラスカラムに移される。未処理のｇｐ１６０が、このガラスカラムに接続される と、０．１％デオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）を含む８００ｍ１ のレンチル−レクチン緩衝液により洗浄される。このような状況下で、全てのｇ ｐ１６０は、ガラスカラムに付着される。０．３Ｍのα−メチル−マノサイドを 含むレンチル−レクチン緩衝液を用いることにより、付着されたグリコ蛋白を溶 離させる。これは、２８０ｎｍの波長域でＵＶモニターを介して観察される。

５、透析 通常の透析手法により、糖およびデオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ ｓ　）か取り除かれる。１リツトルの感染細胞から得られたｇｐ１６０の精製は 、下記の表３のように要約される。

本発明の池の実施例では、ゲル浸透法に代わって、通常のイオン交換クロマトグ ラフィ（陰イオン性および陽イオン性）が用いられる。また、手順の順序はあま り重要ではない。例えば、ゲル浸透法あるいはイオン交換クロマトグラフィがレ ンチル−レクチン浄化手順の後に続いてもよい。本発明によれば、他の反応試薬 が用いられてもよい。例えば、組換え蛋白純化に当たっては、デオキシコレート （ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）の代わりに、他の洗浄剤が利用されてもよい。こ れらには、Ｔｗｅｅｎ　２０（ポリツルベイトＰｏ１ｙｓｏｒｂａｔｅ　２０　 ）　、Ｔｗｅ　ｅ　ｎ　８０．ルブロール（Ｌｕｂｒｏｌ）およびトリトン　Ｘ −１００（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）といった非イオン性の洗浄剤が含まれる 。

表　３　純化手順の要約 例８ Ａ０ｇｐ１６０粒子の構成成分 本発明の一面においては、純化工程の間にｇｐ１６０の抗原は、分子量２．Ｏｏ ｏ、ｏｏｏ以上の粒子から成っていることか判明した。このｇｐ１６０の蛋白は 、８０〜９０％の単量体（分子量１６０．０００）と８０〜９０％の多量体（粒 子状）の混合物として細胞から抽出された蛋白である。ゲル浸透工程により、ｇ ｐ１６０の集合体を取り除く。ｇｐ１６０の純化工程により（ゲル浸透ガラスカ ラム（。。ｌｕ工ｎ）における第１のピーク）、ｇｐ１６０は他の細胞と複合化 、あるいは膜片と複合化している可能性を示唆している。しかしながら、ゲル浸 透ガラスカラムにおける第２のピークでｇｐ１６０の抗原では、略１６０．００ ０〜３００．０００の分子量を有しているから、単量体もしくは二量体になって いることは支配的である。

ｇｐ１６０の集合物や多量体は、レンチル−レクチン処理の工程で、形成される 。デオキシコレートに対して０．２％臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）であるところの ０．５９６のデオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）中のレクチンカラ ムから溶離したか、あるいは０．１％のデオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌ ａｔｅ）中のガラスカラムから溶離したかによって、抗原が凝集形態をとること が決められる。

凝集物の大きさは、高解像度ＦＰＬＣスパローズ１２　（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　１ ２　）カラム（Ｐｈａｎｎａｃｉａ社）により計測される。純化されたｇｐ１６ ０の代表的試料は、プループキシトラン標準薬の分子量２，０００，０００にほ ぼ等しいか、あるいは若干大となる大きさを持っている。シュバラ−等（Ｓｃｈ ｗａｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、１９８９年）による交鎖の研究によれば、昆虫細胞 内で生じたｇｌ）１６０は、同類中の３量体であることか判明している。この研 究により、ＨＩＶ感染細胞およびヴイールス粒子内のｇｐ１６０は、３量体であ ることも分かっている。こうして、未処理のＨＩＶ　ｇｐ１５０に見られるのと 同様に、組換えｇｐ１６０の粒子も、第３元および第４元構造を呈しているはず である。

適宜の第３元の構造は、ｇｐ１６０を正しく包み込むに必要なエピトープの形成 にとって重要である。非糖化蛋白は、結着、洗浄工程においてのｇｐ１６０抗原 への付着から取り除かれてレンチル−レクチンカラムに移行するから、ｇｐ１６ ０の非親水性の蛋白は、分子内結合を形成し始める。濃度が、ＣＭＣ以上であり 、抗原か複合体を形成していることから、デオキシコレート（ｄｅｏｘｙｃｈｏ ｌａｔｅ）は、ｇｐ１６０には結合しないであろう。本発明によって精製したこ とから、この抗原の成分が集合物になることは、この蛋白自体の固有の性質であ ろう。ｇｐ１６０蛋白の極めて非親水性のＮ−終端配列部分があることにより、 粒子形成上、本蛋白の中性化に寄与し得ると考えられる。精製した後には、ｇｐ １６０？Ｊ（合体は、蛋白質を実質的に失うこと無＜０．２ミクロンのセルロー スアセテートフィルタにより滅菌状態に濾過される。

Ｂ０粒子形成の分析 精製されたｇＴ）１６０粒子の電子顕微鏡による分析結果では、３０〜１１００ ｎの蛋白質状態の球形粒子であることか判明している。

この粒子の存在について追加的な実験によれば、精製されたｇｐ１６０はゲル浸 透法により分析されたものである。略１００ミクログラムのｇｐ１６０がスパロ ーズ１２、ＦＰＬＣゲル浸透ＨＲＩＯ／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｅｉａ社）に 加えられる。このカラムは、最初は蛋白分子量基準液により較正されている。こ のカラム（ｃｏｌｕｍｎ）からの蛋白形成体は、高度に再現性があり、吸着体積 は、蛋白基準液の分子量に反比例する。このカラムにより単量体のｇｐ１６０が 多量体形成物から分離され、２×１０６以上の分子量の球形蛋白を取り除く。こ のカラムにより処理されると、精製されたほとんど全てのｇｐ１６０は溶離して 容量的には無くなる。このため、分子量は２Ｘ１０６　（２，０００，０００） 以上となる。

例９ Ａ、ｇｐ１６０のアルミへの吸着 免疫的補助剤としての不溶解性複合物の効果は、抗原の固体相への吸着の完全性 に依存している。本発明の一部においては、アルミの複合体は、ｇｐ１６０アル ミ複合体が免疫原としての可能性を減少させないｐＨであって、ｇｐ１６０を効 果的に吸着するようになっていることが判明している。このアルミ複合体（濃酸 アルミニウム）の形成工程で制御対象となる要素は以下の通りである。

１、抗原のアルミに対する吸着の最適ｐＨは凡そ５．０である。しかしながら、 ｇｐ１６０は、ｐＨ７，５に対してｐＨ６，５で免疫性を喪失することが分かつ ているため、アルミは７．１±０．１のｐＨ範囲で形成される。このｐＨ範囲で もほぼ１００％のｇｐ１６０がアルミに吸着されることか判明している。

２、ＮａＣ１から発生したイオン力は、比較的低く０．１５Ｍ足らずである。

３、燐酸ナトリウムに比較して塩化アルミニウムのモル過剰は、表面浮溝物には 燐酸イオンが含まれていないことを示すものである。

４、ｇｐ１６０は、新たに形成されたアルミに加えられて結晶成長を阻止し、粒 子の大きさを最小限にする。

以上の手順にて２００ｍ１のアルミを調整して精製されたｇｐ１６０に吸着させ るので、抗原の最終濃度は下記の通り４０μｇ／ｍｌとなる。

Ｂ１反応試薬の調整（２００ｍｌ全基準化液）下記の溶液を滅菌済みで非発熱性 の１００ｍ１ボトルないしはビーカーを用意する。ついで、塩を溶液１、溶液２ および水酸化ナトリウムに混合し、０．２ミクロンのセルロースアセテートフィ ルターにより濾過して後に、滅菌済みで非発Ｃ，アルミの形成 １、溶液１（アルミニウムーナトリウム−アセテート）を２５ｍ１の滅菌済みて 使い捨てピペットを用いて基準液用の容器に加える。この際、溶液１の容量に留 意しながら、溶液１を攪拌する。

２、溶液２（燐酸ナトリウム）を２５ｍ１の滅菌済みで使い捨てピペットを用い て基準液用の容器に加える。攪拌を続けながら、析出させる。なお、この際、溶 液１の容量に留意する。

３．３ｍｌの溶液３（水酸化ナトリウム）を加え、５分間攪拌を続ける。０゜５ ｍｌの試料を採取してｐＨを測定する。ｐＨが７．０以下であれば、さらに０゜ ５ｍｌの水酸化ナトリウムを加えて、さらに５分間攪拌を続け、再び試料のｐＨ を測定する。この操作をｐＨが７．０と７，２の間になるまで継続する。

４、基準液用の容器（溶液１＋溶液２＋溶液３）に加えられるべき全容量を決定 し、滅菌済みのＷＦＩを足して１００ｍ１にする。

５．１ｍＭトリスｐＨ７，５の１００ｍ１内の純粋化ｇｐ１６０を８．０００マ イクログラムを直接基準液用の容器に加える。

６．２０分間攪拌を続け、ついで基準ワクチンを滅菌済み薬瓶内に配合する。

例１０ アルミ吸着ｇｐ１６０の免疫能力（特殊Ａｂ反応）創生された抗原（ワクチン） の免疫性を決定する一般的方法は、一定量の抗原を単投与された一群のネズミに 対する特殊な抗体反応を測定することである。投与から４週間後に、ネズミから の放血により、特定の抗原に対する血清の抗体レベルを例えばＥＬＩＳＡといっ た標準試験により測定する。ここに特定の抗原とは、通常の動物を免疫化させる のに用いる抗原をいう。また、ＥＬＩＳＡは、Ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　ｉ ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ　（酵素結合形免疫吸着試料）の略であ る。

純粋化されたｇｐ１６０のネズミに対する免疫性については、補助剤無しでｐＨ ６，０およびｐＨ７，５の場合、例９に記載のようにアルミ吸着の場合ならびに フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全補助剤を混合させた場合に分け、下記（図４ ）のように要約される。

表４ １μｇ　無し、ｐＨ７，５８７０２０，１４０５７％　４７６無し、ｐＨ６，０ ８７０２０，１１０２６％　２７′７アルミ　８７０２　１．０００　９０％　 ９／１０アルミ　８７０５　２．２８５　１００％　６／′６フロイント　８６ ０４　１．１０８８３％　５７６フロイント　８７０２　１．３９６　１００％ 　７／７０．１μｇ　フロイント　８６０４　０．４３４　６７％　４７′６ア ルミ　８７０５　１．００３　６７％　４／６２、ネズミは、免疫化後２８日で 採血され、ゲル純粋化され、ｇｐ１６０に対してＥＬＩＳＡ試薬内で１＝１０の 稀釈により血清が試験される。市販のＥＬＩＳＡ試薬（ジエンチック社のＥＩＡ 　ＥＬＩＳＡ）を用いても、未処理のＨＩＶ−１蛋白に対して１　：　４００の 稀釈の血清については、同様の結果が得られた。

３、全試験数（Ｎ）に対する血清転換したネズミの数（Ｐ）に対する比である。

１、　０マイクログラムの単投与のｇｐ１６０により免疫化されたネズミは、補 助剤がなくても表１に示すように、ｇｐ１６０に対する抗体反応を誘発する。し かしながら、もっと有力な抗体反応は、アルミの補助剤を吸着したｇｐ１６０の １、Ｏマイクログラム投与の場合である。フロイントの完全補助剤混合あるいは アルミにより調整された場合で、ｇｐ１６０の１．０マイクログラム以下の単投 与では、免疫処理したネズミのうち血清転換率が５０％以上となることが分かる 。

ｇｐ１６０の抗原は、ｐＨ７，５ないしｐＨ６，０での非調製の抗原はどはネズ ミにおける免疫力はないが、低いｐＨ領域では免疫能力が失われる。

例１１ アルミ吸着ｇｐ１６０の免疫能力（ＥＬＩＳＡ　血清研究）候補ワクチンか免疫 反応を誘発する能力を有することは、極めて重要な生物学上の特性である。アル ミにより調整したｇｐ１６０ワクチンが、動物に対して免疫力を付与し、このア ルミｌ助剤が免疫力を増強することを確認するために下記の実験か行われた。

先ず当日である零日（０日）には、１０匹からなるネズミ群には、０．５μｇ１ １．０μｇあるいは５．０μｇのｇｐ１６０のみの単投与、アルミ吸着ｇｐ１６ ０の単投与ならびに、フロイントの完全補助（ＣＦ　Ａ）処理ｇｐ１６０の単投 与がされた。２８日経過後には、ネズミは放血により血清がＥＬＩＳＡ（稀釈： １：１０）を用いてｇｐ１６０に対する抗体の存在か検査された。

２８日目に検査された血清からの結果は以下に示す表５に要約されている。全て のネズミにおいて、５０％以上の血清転換率が見られた。すべての投与において 、血清転換率の数および平均血清吸着（ＥＬＩＳＡ試薬で１＝１０稀釈でのＯこ の結果は、アルミ補助剤が大幅ｇｐ１６０抗原の免疫能力を向上させることを示 している。

表　５　注入後２８日経過 投与量０．５μｇ　投与量１．０μｇ　投与量５．０μｇ平均値　平均値　平均 値 Ｐ／Ｎ’　ＯＤ５　Ｐ／Ｎ　ＯＤ　Ｐ／Ｎ　ＯＤｇｐ１６０　９／１０　．４０ ７　７／１０　．６９９　７／１０　．４３０ｇｐ１６０（ａｌｕｍ）　９／１ ０　．５４７　８／１０　．７９７　１０／１０　１．３４７ｇｐ１６０（ＣＦ Ａ）　１０／１０　１．１３０　１０／１０　１．９６７　１０／１０　１．３ １７’：　ＶａｘＳｙｎ″ｍ０ＨＩＶ−１ノ０．５　μｇ　、１．０μｇ、５． ０μｇの投与量で免疫化２８日経過時点での全数（Ｎ）に対する転換ネズミ数（ Ｐ）の比５・１・１０の血清稀釈てのｇｐ１６０に対するスポンサーのＥＬＩＳ Ａ試薬により測定して、血清転換されたネズミの平均吸着（ＯＤ４５ｏ）例１２ 中性化資料 ＨＩＶ−１中性化試薬は、創成した抗体が、培養したヒトのリンパ球細胞にＨｒ ｖ−１ヴイールスが感染するのを阻止するかどうかを決定するのに用いる一般的 な手法である。ｇｐ１６０で免疫化した動物からの反血清がＨＩＶ−１中性化試 薬中で試験され、その結果が下記の表６に要約されている。

のマイクログラム量を示す。

７：非免疫化動物の血清に晒されたＨＩＶ−１感染細胞に比べて５０％だけ感染 阻止する反血清の最大稀釈を示す。

モルモット（ｇｕｉｎｅａ　ｐｉｇｓ）　、兎やリーサス猿も、アルミあるいは フロイント（ｆｒｅｕｎｄ　”　ｓ）補助剤を用いてｇｌ）１６０により免疫化 された。一般にこれらの動物に対する免疫化は、ＨｒＶ−１包被蛋白に対して良 好な抗体反応を示した。

例１３ チンパンジーに対する免疫性 遺伝子的に見て、チンパンジーは人間に最も似ている近縁であり、今のところで はＨＩＶ−１感染の唯一の動物例である。

３匹のチンパンジーにおける安全性／免疫性の実験では、二匹のチンパンジーが アルミ調整ワクチンのｇｐ１６０の４０μｇおよび８０μｇにより免疫化された 。これらは、４週間用には、ｇｐ１６０の４０μｇおよび８０μｇか増強免疫と して投与された。残りの対照用チンパンジーには、１ｍｌの食塩水を投与した。

血清試料は、週毎に各チンパンジーから分析し、ｇｐ１６０およびＨＩＶ−１ヴ イールス抗原に対する抗体を調へた。この際には、三つの免疫試料、すなわち純 粋化ｇｌ）１６０１．：対しテマイクロンエネシス社（ＭｉｃｒｏＧｅｎｅＳｙ ｓ、　Ｉｎｃ、）により開発されたＥＬＩＳＡ試薬、ウェスターンプロット分析 試薬（Ｊｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ）および市販のＨＩＶ−Ｉ 　ＥＬＩＳＡ試薬をそれぞれ用いた。これらの分析結果を下記に示す。

Ａ、ＥＬＩＳＡ　（７グサーチ　ＨＩ　Ｖ　１６０　（ＭＧＳｅａｒｃｈ　）Ｉ ｌｆｆ　１６０）　）ＥＬＩＳＡ試薬は、ＥＬＩＳＡ試薬およびマグサーチ　Ｈ ＩＶ　１６０は、ｇｐ１６０に対する免疫吸着剤で、これについては、本出願と ともに出願係属中であり、同−譲渡人とする特許出願第９２０．１９７号に記載 されている（現在では特許出願第５８５．２６６号）。なお、マグサーチは、米 国、コネチカット州、メリデンに所在するマイクロジエネシス社の商標名である 。

免疫化する前で、最初の免疫種痘の１１週後に採取された血清試料は、１：１０ から１：１００．０００に稀釈され、ついで点滴（スポット）あたり１００μｇ の純粋化ｇｌ）１６０を含むニトロセルロース片により培養した。この場合の終 端点稀釈滴定は、山羊の反ヒトＴｇＧアルカリーフォスファターゼ複合物で検出 されたように、反ｇｐ１６０抗体に対して陽性と示されたところの最も高い稀釈 率であった。

対照用動物であるチンパンジー、および免疫種痘された免疫前のチンパンジーの 血清試料は、陰性であった。８０μｇを投与されたチンパンジーは、２週間用の １　：　１００の稀釈で陽性であり、４０μｇを投与されたチンパンジーは、４ 週間用の１：１０の稀釈で陽性であった。ｇｐ１６０に対する抗体の点滴は、４ 過用まで続けられ、この時点での終末点稀釈滴定は、それぞれ略１：１００，０ ００および１：２．０００，０００になった。双方のチンパンジーにおける抗体 滴定は、６〜１１週目に過用て僅かに減少した。

この種の反応は、人間のＢ型肝炎ヴイールスに対してワクチン種痘したチンパン ジーに共通して所見される抗体反応と量的にも質的にも類似している。

Ｂ、市販のＥＬＩＳＡ試験 ヴアクシン（ｖａｘＳｙｎ）により免疫化されたチンパンジーの血清からのウェ スターン　プロット分析、ならびにマグサーチ　ＨＩＶ　１６０　ＥＬＩＳＡ（ ＭＧＳｅａｒｃｈ　ＨＩＶ　１６０　ＥＬＩＳＡ）から明らかなように、チンパ ンジーは血清転換され、組換えｇｐ１６０に対して抗体を有するようになってい た。なお、ヴアクシン（ｖａｘＳｙｎ）とは、ここに記載するエイズワクチンに 対するマイクロシエネシス社の商標名で加し続けた。４０μｇのｇｐ１６０を投 与されたチンパンジーは、６週間用で１：１００の稀釈て陽性てあった。

例１４ ｇｐ１２０とｇｐ４１との間の抗体の分布ワクチン種痘動物のｇｐ１６０に対す る抗体反応が、ｇｐ１２０あるいはｇｐ４】若しくはこれら双方にも示されるか どうかを確認することは意義深いことでた。この免疫的手法としては、放射性免 疫析出法（ＲＩ　Ｐ）　、免疫蛍光法（ＩＦ）、ウェスターン　プロット分析（ ＷＢ）および量的ＥＬＩＳＡ法などを用いている。

第６図は、異なる三種の祖換え抗原に対する免疫活性を要約するものである。

異なる三種の組換え抗原とは、　ＣＡＲＴ］　［ＴＡＢ］　（１）　ｇｐ１２０ 〜デルタ（分子のＣ−末端部からほぼ４０個のアミノ酸が欠落している、さい頭 形組換えＨＩＶ−１ｇｐ１２０）；　ｆ：ＡＲＴ］　［ＴＡＢ］　（２）（組換 えＨＩＶ−１ｇｐ１２０の全側鎖長に亘る’）；　［ＡＲＴ］　［ＴＡＢ］　Ｃ ３）ｇｐ１６０をいう。

ＨＩＶ−１抗体陽性の５０名のヒトの血清、ならびにプールされた３名のヒトの 血清は、ｇｐ１６０に対しては高度に活発であり、ｇｌ）１２０に対しては穏や かであり、さい頭形ｇｐ１２０に対しては抗体がほとんどないか、あるいは皆無 であった。さい頭形ｇｐ１２０は、ＨＩＶ−１の外被糖蛋白の９０％以上を占め 、保護に対する決定因子を含んでいそうである。ヒトのエイズ陽性血清がこの包 被蛋白領域に対してほとんど抗体を持っていないという所見は、ヴイールス感染 に対する免疫反応が十分保護されないことや、通常の実験では、ヒトの陽性血清 が低い中性化活性しか示さないことと符合している。

これに対して、ｇｐ１６０あるいは、さい頭形ｇｐ１２０により免疫化したリー サス猿ては、さい頭形ｇｐ１２０のＨＩＶ−１包被蛋白に強く反応する抗体を有 する。ヴイールス包被に沿う抗体認識位置の分布の相違、ならびに猿に見られる 比較的高い力価は、猿の血清が高い中性化力価を有していることを説明している 。

ヒトの血清および免疫リーサス猿血清におけるこれら三種の組換え包被抗原の免 疫活性の量的評価は、第７図に示されている。ｇｐ１６０により免疫化した動物 の血清を含み、試験した全ての猿の血清は、さい頭形ｇｌ）１２０抗原（ｇｐ１ ２０−デルタ）に対して高い滴定抗体を有していた。

この結果により、組換えｇｐ１６０は、リーサス猿では自然感染中に生ずること の多い抗原反応とは異なる抗体反応を誘発することか判明した。これらは、免疫 化した猿に多く認識され、ｇｐ−１６０のｇｐ１２０−デルタ領域にあるエピト ープであり、これらは感染中にはヒトの免疫系には見られないものである。これ らの新たなエピトープは、ＨＩＶ−１に対する防護にとって重要であり、ＨＩＶ 感染に対する予防および処置上、組換えｇｐ１６０の重要な特性となろう。

例１５ 療法的なワクチン投与 ３０名の）（ＩＶ血清陽性患者に対する臨床試験が行われ、ＨＩＶ感染者個々に 対してクローニングしたＨＩＶｇｐ１６０　（既述したように、桿状ヴイールス 系により生成された）のワクチンの効果が決定された。

組換えｇｐ１６ｃｌによるワクチン化により、３０名のＨＩＶ血清陽性志願者の うちで１９名の者（６３％）が、ｇｐ１６０ＨＩＶ特異的体液、細胞的反応にお いて増加の傾向にあった。６回分のワクチン投与を受けた１５名の志願者のうち １４名（９３％）が、全ｇｐ１６０抗体において増加を示した。したがって、組 換えＨｒＶ蛋白（すなわち、ｒｇｐ４１、ｒｇｐ１２０、ｒｇｐ１６０およびこ れらの混合物）は、ＨＩＶ、ｌｌ染患者を治療する方策上で、効果的に投与され たといえよう。

本発明の実施例上、ＨＩ　Ｖ蛋白の有効量は、下記に示す既知の技術に基づいて 定められる。一般的に、このような有効量は、感染患者の体重（Ｋｇ）あたり１ μｇから１００μｇの範囲内にある。服用のための投与回数についても、既知の 方法で決定されよう。好ましくは、本発明の分野における通常の知識を有する者 にとってはよく知られているように、非経口的投与、すなわち静脈投与、腹膜内 投与、筋肉投与あるいは皮下投与などにより行われる。

Ａ、志願者の選択 ＨＩＶ感染患者のうち３０名の志願者は募集によるものだった。ＨＩＶ感染初期 の段階での血清陽性志願者は、ウォルターリード（ｆａｌｔｅｒ　Ｒｅｅｄ）段 階１あるいは段階２と定義されるが、これらの者は、登録のための有資格者であ った。ウォルターリード（ｆａｌｔｅｒ　Ｒｅｅｄ）段階１あるいは段階２とは 、リンパ腫（１ｙｍｐｂａｄｅｒ＋。

ｐａｔｈいが生じても生じなくても、ＣＤ４細胞の数が３ケ月経過以上で４００ を下回らないものをいう（レッドフィールド等（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ 、）　、ニューイングランド　ジャーナルメディスン、３１４：１３１−１３２ 　（１９８６））。追加的な志願者基準は、１８歳から５０歳までの成人に限り 、正常な到達血球数測定、末端器官の疾患なし、試験前１２ケ月間にわたってア ルコールおよび薬物常習者でないことであった。全患者は、任意抽出法により治 療群に組み入れる前に、２ケ月の基本的評価を受けた。試験中に対遡及性ヴイー ルス（ａｎｔｉ−ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）薬剤あるいは免疫遅効性の薬剤投与を 受けた者はいなかった。

３０名の志願者のうち２６名は男子で、４名が女子であった。このうち１４名が 白人（コーカシアン）、１３名が黒人で３名がスペイン系であった。平均年齢は 、２９歳であった（１８歳から４９歳の年齢範囲）。登録資格者のうち８名は、 ウォルターリード（ｆａｌｔｅｒ　Ｒｅｅｄ）段階１であり、他の２２名はウォ ルターリード段階２にあった。ＣＤ４数の基本的平均値は、６６８であった（３ ８８がら１６３９の範囲）。最初診断から研究対象となるまでにかかった平均期 間は、２４ケ月であった（３ケ月から４９ケ月の範囲）。

Ｂ、ワクチンの製造および免疫化計画 既に説明したように、試験用ワクチンは、桿状ヴイールス発現組換え蛋白として ｇｐ１６０から得た非感染サブユニット糖蛋白からなっている。免疫性蛋白は、 鱗し類昆虫細胞から製造され、生物学的に純粋化され、最終的なワクチン処方の ため燐酸アルミニウムに吸着された。

ｇｐ１６０の三つの投与処方が用いられた。すなわち、ミリリットルあたり４０ μｇであり、ミリリットルあたり１６０μｇであり、ミリリットルあたり３２０ μｇであった。注入容積は、４０μｇおよび１６０μｇの双方では１ｍｌであり 、６４０μｇの投与ではミリリットルあたり３２０μｇの２ｍｌが用いられた。

３０名の志願者５人づつ６群に分かれた。計画Ａと計画Ｂとの二つの免疫化計画 が企画された。計画Ａでは、ワクチン投与量が０１３０および１２０日に分かれ た。計画Ｂでは、ワクチン投与量が０．３０．６０．１２０．１５０および１８ ０日に分かれた。各免疫化計画（ＡあるいはＢ）内に、下記の表７に示すように 、異なる回数のワクチン投与されたのは三つの群であった。全てのワクチンは、 筋肉注入により三角筋に投与された。実験継続期間は１０ケ月であった。最初の ２ケ月は、基本評価であり、次の８ケ月は最初の投与からの補足的評価である。

表　７　免疫化計画 ｇｐｉｅｏの投与量（μｇ） 投与量　０　３０　６０　１２０　１５０　１８０計画Ａ 第１群　４０　４０　４０ 第３群　１６０　１６０　１６０ 第５群　６４０　６４０　６４０ 計画Ｂ 第２群　４０　４０　４０　１６０　１６０　１６０第４群　１６０　１６０　 １６０　６４０　６４０　６４０第６群　６４０　６４０　６４０　６４０　６ ４０　６４０Ｃ８安全性および毒性についての評価 各志願者には投与後の第０日、第１日、第２日、第３日、第１５日および第３０ 日にそれぞれ面会して診察した。これらの各志願者に対しては、発熱の有無、寒 気、む力りき、吐き気、関節痛（関節の痛み）、筋肉痛（筋肉の膚み）、不快感 、じんましん（皮膚の一過性症状）、咳き込み、眩量あるいは頭痛について問診 した。ワクチン注入による投与量！について局部的反応を評価する試験は、紅斑 、腫れ、かゆみ、痛み、過敏症、皮膚褪色、皮膚荒れ、リンパ腫の局部変化、注 入端部の機能変化および注入位Ｉの皮下層形成について行われた。月毎の到達血 球数測定、血清の化学変化、凝結面および尿分析についても評価が行われた。

体外での細胞免疫機能が、Ｔ細胞−表現型（全リンパ球、ＣＤ４、およびＣＤ８ の表現型）により評価された（リックマン等（Ｒｉｃｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　 ）、臨床免疫学５２　：　８５−９５．１９８９　；ビルクス等（Ｂｉｒｘ　ｅ ｔ　ａｌ、）　、後天的免疫不全症候群誌　４　：１８８−１９６、１９９１） 。有糸分裂原（アメリカヤマゴボウおよびコンカナバリンＡ　（Ｃｏｎｃａｎａ 〜ａｌｉＸ１Ａ）　（タチナタ豆から生成された有糸分裂性レクチン））および 対照抗原（カンジーダ　アルビカンス園および破傷風医）に対するＴ細胞の増殖 的反応も評価された（上述のビルクス等）。対照抗原（風疹菌、破傷風トキソイ ド、力ンジーダ　アルビカンス菌およびトリコフィトン（ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔ ｏｎ））に対する遅延性皮膚過敏テストにより、人体内の細胞免疫機能か評価さ れた。

末梢血球単核細胞（ＰＢＭＣ）および血しょうに関する量的なヴイールス培養に ついては、プルケ等（Ｂｕｒｋｅ　ｅｔ　ａｌ、　）か後天的免疫不全症候群誌 の３　：１１５９−１１６７．１９９１て記載された方法で評価された。ＤＮＡ ポリメラーゼ連鎖反応（ワーゲス等（Ｗａｇｅｓ　ｅｔ　ａｌ、　）、医学的ヴ イールス学誌、３３：５８−６３．１９９１）および血清ｐ２４抗原レベルは、 体内のＨＩＶヴイールス負荷の観察により評価された。

系統だった毒性の根拠は見られなかったが、局所的な反応活性は被実験対象者の ８７％に見られた（ワクチン投与群の１３名）。局所的な反応活性は、組織硬結 、反応過敏、注入位置での一過性皮下層形成があり、局所的な分泌障害の悪化は ほとんど知見されなかった。被験者のうち増強的投与を拒んだ者はいなかった。

局所的反応の頻度については、最初の免疫時、増強的投与、あるいは投与回数で 差異は生じなかった。

体外での有糸分裂原および抗原特異増殖反応、ならびに人体での遅延形皮膚過敏 テスト反応、もしくは量的Ｃ４細胞の減少促進による計測では、免疫系の悪影響 の根拠については、知見されなかった。基本平均ＣＤ４細胞数は、ワクチン反応 者では７１６個でワクチン無反応者では６０５個であった。平均ＣＤ４細胞数は 、実験日から１８０日、２４０日では、ワクチン反応者およびワクチン無反応者 で、それぞれ７１４個、５６１個であった。２４０日の実験中には、平均ＣＤ４ 細胞数の実質的変化は、ワクチン反応者ではマイナス０．　２％であり、ワクチ ン無反応者では７．３％の減少を見た（第１１図参照）。ワクチンにより誘発さ れるＨＩＶ免疫性は、実験の全工程において被験者にＣＤ４細胞の加速的な減少 が見られる現象とは関係していなかった。

ワクチン接種の結果、被験者中のＨＩＶヴイールス増殖およびヴイールス負荷の 増加を評価するにあたっては、体内のヴイールス活性は、血しょうの定量化、Ｐ ＢＭＣヴイールス培養、ＰＢＭＣ−ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応およびｐ２４抗 原の血清レベルを測定することにより行われた。このヴイールス培養およびＤＮ Ａポリメラーゼ連鎖反応実験では、実験中変化は観察されなかった。血清ｐ２４ 抗原は被験者から検出されなかった。

Ｄ、免疫性の評価 組換えによる製造ヴイールス遺伝子ｇｐ１６０、ｐ６６、ｐ２４ならびにＨＩＶ 原型の変種ＭＮの全溶解ヴイールスの双方を用いて、全ＨＩＶ蛋白に対する抗体 を測定した。トウビン等（Ｔｏｕｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　）によりナショナルア カデミ−サイエンス紀要ＵＳＡ　７６：４３５０−４３５４（１９７９）に記載 されているように、ドツト　プロット（ｄｏｔ　ｂｌｏｔ）およびウェスターン 　プロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ）を利用した。特異的包被エピトープ 抗体反応も測定された（第７図参照）。

第７図には、エピトープ８８　（ｇｐ１２０中のアミノ酸８８−９８）および４ ４８Ｃ（ｇｐ１２０中のアミノ酸４４８−５１４）が選び出された。これは、ｇ ｐ１２０の当該領域に対する抗体が初期のＨＩＶ惑染と相関があると報告されて いるためである。

エピトープ１０６　（ｇｐ１２０中のアミノ酸１０６−１２１）　、２４１　Ｃ ｇｐ１２０中のアミノ酸２４１−２７２）　、２５４　（ｇｐ１２０中のアミノ 酸２５４−２７２）　、３００　（ｇｐ１２０中のアミノ酸３００−３４０）　 、３０８　（ｇｐ１２０中のアミノ酸３０８−３２２）　、４２２　（ｇｐ１２ ０中のアミノ酸４２２−４５４）および７３５　（ｇｐ１２０中のアミノ酸７３ ５−７５２）が選び出された。これは、推定上の機能的重要性から選ばれたもの である。エピトープ１０６および４２２は、ＣＤ４結合に関与している。エピト ープ２４１．２５４およびは７３５は、群−特異的中性化に関与し、エピトープ ３００およびは３０８は、型−特異的中性化に関与している。

エピトープ５８２（アミノ酸５８２−６０２）は、対照用として選択された。

これは、ＨＩＶの自然感染において免疫支配領域に関しているからである。研究 対象の追加的エピトープには、４９（アミノ酸４９−１２８）および３４２（ア ミノ酸３４２−４０５）を含んでいる。

第７図に示すのは、陰影を付した箱印は、ＨＩＶ包被指向免疫反応における変化 を記録したものである。（＝）を付した陰影箱印は、第１の体液反応であり、（ ＋）を付した陰影箱印は、第２の体液反応である。また、（−）の符号印は、免 疫化前後の特異エピトープに対する抗体陰性を示すものであり、（＋）の符号印 は、免疫化前後の特異エピトープに対する抗体陽性を示すものである。この場合 、量的変化は伴わないものとする。（、）付きの陰影箱印は、免疫に伴うｇｐ１ ６０に対する新Ｔ細胞増殖反応を示す。一方、（１）のみの印は、ｇｐ１６０に 対する細胞無反応を示し、ｈｂは［高い背景度（ｈｉｇｈ　ｂａｃｋｇｒｏｕｎ ｄ）　Ｊ　（解釈不能）を示し、ｎｄは［不発生（ｎｏｔ　ｄｏｎｅ）Ｊを意味 する。

中性化活動は、ナラ（奈良）によりネイチャー誌（３３３：　４６９−４７０゜ １９８８）に記載のように、多核買活住抑制試料において三種の原形質分離物（ ＨＩＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ、ＲＦおよびＭＮ）に対して測定された。ＨＩＶ特異細胞 反応は、ｇｐ１６０、ｐ２４および桿状ヴイールス発現系対照蛋白（上述のビル クス等による方法）を用いて既知のリンパ球増殖試料により測定した。

Ｅ、ワクチン反応者とワクチン無反応者ＨＩＶ包被特異エピトープに対する細胞 および体液免疫反応の双方の再生選択的増加が一連のワクチン接種と関連がある ときには、被験者はワクチン反応者のみに分類された（第７図参照）。ワクチン により誘導された体液免疫化は、ＨＩＶ包被特異エピトープに対する血清転換、 あるいは包被特異エピトープに対する第２の強化免疫反応として定義される。ワ クチンにより誘導された細胞免疫化は、ｇｐ１６０に対する、新たな再生的、ワ クチン接種関連増殖的反応の進展として定義される。ワクチン反応者に対するこ の定義は、本実験（例：感染後免疫化の有用性に関する評価）の科学的目的の見 地から、極めて制限的である。体液的反応も細胞増殖的反応も示さない被験者、 あるいは体液的反応のみ、細胞増殖的反応のみしか示さない被験者はワクチン無 反応者として分類される。

Ｆ、ワクチンにより誘導された体液反応者第７図に示すように、被験者３０名の うち１９名（６３％）は、ｇｐ１６０特異性反応および細胞免疫反応の双方を示 した。これらの被験者１９名は、ワクチン反応者として分類された。１１名のワ クチン無反応者のうち４名は、体液的反応のみか細胞増殖的反応のみしか示さな かった。ワクチン誘導される反応を検出されなかった７名の全員については、３ 回のみの接種投与しか受けなかった者であった（計画Ａ参照）。ＨＩＶポリメラ ーゼ（ｐ６６）、構造的（ｐ　２４）遺伝子物質、あるいは非ＨＩＶ対照抗原の 破傷風菌に対する抗体結合性に関する変化は検出されなかった。いずれの被験者 にも、桿状ヴイールス鱗し類細胞対照蛋白に対する抗体の発生は見られなかった 。

包被抗体（ｇｐ１６０）の増加は、ヴイールス全溶解のＨｒＶ−ＭＮを用いたウ ェスターン　プロット法により被験者の１３名に検出された。この変化は、免疫 化計画に関連を持っており、計画Ａでは、１５名中の３名の被験者（２０％）、 他では１５名中の１０名の被験者（６７％）であった。計画Ｂでは、包被蛋白に 対する抗体の増加をもたらした（Ｐ　＝　０．０２５．　フィッシャーの二尾端 法精密テストによる）。１３名全員は、特異包被エピトープに対して血清転換を 示した。

翻って、被験者のうち１０名は、いかなる特異包被エピトープに対しても血清変 換も生ぜず、ウェスターン　プロット法によっても包被抗体に対する抗体増加を 示さなかった。特異包被エピトープに対して血清変換を生じた残る７名の被験者 は、ウェスターン　プロット法ではヴイールス包被抗体全体の変化は生じなかっ た。どの被験者にも、非包被ＨＩＶ蛋白に対する抗体の変化は見られなかった。

計画Ｂの６回投与の場合のように、１５名の被験者のうち１４名（９３％）にお いては、ｇｐ１６０に対する抗体増加を示した。これに対して、計画Ａの３回投 与の場合では、１５名の被験者のうち７名（４７％）だけが、ｇｐ１６０に対す る抗体増加を示した（Ｐ　＝　０．０１．　フィッシャーの二尾端法テストによ る）（第７図参照）。

第８図に示すように、ワクチン接種前に対するワクチン接種後のｇｐ１６０特異 エピトープの発生率は、下記の通りである。エピトープ４９ては２７〜７０パー セント、エピトープ８８では２８〜５２パーセント、エピトープ１０６では５０ 〜８７パーセント、エピトープ２１４では０〜１４パーセント、エピトープ２５ ４てはＯ〜１３パーセント、エピトープ３００では４７〜７７パーセント、エピ トープ３０８ては４２〜６９パーセント、エピトープ３４２ては０〜２７パーセ ント、エピトープ４２２では３〜１０パーセント、エピトープ４４８Ｃでは７３ 〜８７パーセント、エピトープ７３５ては１７〜３３パーセントであった。ワク チンにより誘導された血清転換は、５８２（第７図）を除く全ての特異エピトー プに見られた。エピトープ２４１．２５４あるいは３４２に対する抗体（血清転 換）は下記の場合たげに検出された。

二次的な免疫反応は、次のエピトープについて検出された。すなわち、８８．１ ０６．３００．４４８Ｃおよび５８２である。エピトープ５８２に対する抗体発 生率は、ワクチン接種前では１００％であったが、被験者１名（３％）のみが二 次的免疫反応を示した。

包被エピトープに対するワクチン誘導形ＨＩＶ抗体の態様は、第７図に示すよう に多様である。少なくとも一つのエピトープに対する最初の抗体反応（血清転換 ）は、２０名の被験者に生じた。この内訳については、計画Ａでは１５名のうち １４名であり、計画Ｂでは１５名のうち６名であった（Ｐ　＝　０．００５フイ ツシヤーの二尾端法テストによる）。計画Ａでの被験者においては、血清転換を 生じた者は、免疫前にはエピトープに対する抗体を持っていなかった１１０名の うち１５名（１４％）だけであった。計画Ａての被験者においては、血清転換を 生じた者は１２９名のうち６０名（４７％）だけであった（　Ｐ　＜　０．００ ０１フイツシヤーの二尾端法テストによる）。３ないしそれ以上の包被エピトー プに対する血清転換は、計画Ｂに組み入れた９名（６０％）に生じたが、計画Ａ ては２名（１３％）に生じたのみであった（Ｐ　＝　０．０２、フィッシャーの 二尾端法テストによる）。

三種の異なる種類（ＨＩＶ−Ｉ　Ｉ　ＩＢ、ＭＮおよびＲＦ）に対する血清中性 化活性は、ワクチン接種後Ｏ日、９０日および１９５日目の７名の被験者に基づ いて決定される。５名のワクチン反応者のうち４名は、工ないしそれ以上の分離 物に対して強い中性化活性を示した。このワクチン反応者は、ワクチン無反応者 に比べて多核質形成を強く抑制する能力があることが知見された。

Ｇ、ワクチンにより誘導された細胞反応細胞免疫反応における変化は、ウィルコ クソン階層積算試験＋Ｊｉｌｃｏｘｏｎ　ｒａｎｋｓｕｍ　ｔｅｓｔ）を用いて 平均ワクチン播種前リンパ球刺激指数（基本値ＬＳりと平均ワクチン接種後リン パ球刺激係数（ＬＳＩ）との比較に基づいている。

被験者３０名のうち２１名（７０％）は、ｇｐ１６０免疫化後免疫化工新たなＴ 細胞増殖反応を起こしていた（第７図参照）。

第９図は、典型的ワクチン反応者におけるｇｐ１６０、ｐ２４および桿状ヴイー ルス対照蛋白に対する増殖的反応を示す。被験者全員において、ｇｐ１６０によ る増殖は促進され、平均ワクチン播種前リンパ球刺激指数（基本値ＬＳＩ）の３ からＬＳＩの１０にまで引上げられていた（下記の最終免疫化に続いて４値の平 均を算出）。これに対して、ＨＩＶｐ２４あるいは対照桿状ヴイールス蛋白に対 する増殖的反応について変化は見られなかった。

被験者全員、ワクチン反応により副群に分類された被験者、ならびに免疫化計画 により群分類された被験者において、ワクチンに誘導される平均ＬＳＩ値の変化 は、それぞれ第１０図に示されている。

ｇｐ１６０に対する増殖的反応は、ワクチン反応者とワクチン無反応者とでは有 意の差があった（＜０．００１．　ウィルコクラン法、二尾端法テスト）。計画 Ｂ　（６回投与）において誘導されるｇｐ１６０に対する増殖的反応は、計画Ａ （３回投与）において誘導されるｇｐ１６０に対する増殖的反応よりも大きかっ た（＜０．１０、　ウィルコクラン法、二尾端法テスト）。

２１名の被験者のうち１９名は、ｇｐ１６０に対して増殖的反応を生じ、さらに 体液的反応をも示した（ワクチン反応者）。ｇｐ１６０に対する最大平均リンパ 球指数（ＬＳＩ）は、被験者全員において見られ、５０．１を記録した。しかし ながら、各ワクチン反応者の反応については、第７図に示すようにＬＳＩの頂上 値が３から１７１の範囲に亘っている如く様々であり、ｇｐ１６０に対する細胞 反応のワクチンによる大きさや持続が一過性の関係にある如くである（第９図参 照）。

Ｈ１結果についての議論 本実験では、試料の大きさに限りがあったにも拘らず、数個の要素はワクチンの 免疫能力に関係があった。計画Ａでは被験者の１５名中６名（４０％）に対して 計画Ｂでは被験者の１５名中１３名（８７％）がワクチン反応者であった（Ｐ＝ ０、０２　フィッシャー法、二尾端法テスト）（第７図参照）。リッターあたり ６゜Ｏよりも多い平均基本値のＣＤ４数を有する被験者１６名のうち１３名（８ １％）は、ワクチン反応者であった。これに対して、リッターあたり６００以下 の平均値のＣＤ４数を有する被験者１４名では、そのうち６名（４３％）がワク チン反応者であった（Ｐ＝０．０７　フィッシャー法、二尾端法テスト）。表８ に要約したように、リッターあたり６００以下の平均値のＣＤＪ数を有する被験 者であっても、多面的な免疫化法により免疫能力が改善することが分かる。例え ば、計画Ｂにおいては被験者６名のうち５名（６回投与）がワクチン反応者であ るのに対して、計画Ａにおいては３回投与では被験者８名のうち１名だけがワク チン反応者にすぎなかった（Ｐ＝０．０３　フィッシャー法、二尾端法テスト） （表８参照）。

表８ 基本値ＣＤ４に基づ＜　ＧＰ１６０ワクチン免疫反応性および免疫化計画表ＣＤ ４数　Ｎ　＃反応者（％）　＃無反応者（％）計画Ａ ＞６００　７　５（７１％＞　２（２９％）５００−６００　５　１　（２ＯＮ ）　４　（８ＯＮ）＜５００　３　０　（ＯＸ）　３　（１００％）合計　１５ 　６　（４０％＞　９　（６０％）計画Ｂ ＞６００　９　８（８９％）１（１１％）５００−６００　２　２　（１００％ ）０（０％）＜５００　４　３（７５％）　１　（２５％）合計　１５　１３　 （８７％）２（１３％）全合計　３０　１９　（６３％）　１１（３７％）ワク チンの療法的利用は、急性狂犬病感染に対する治療法として１９世紀にパスツー ルによって紹介された。しかしながら、他の感染に対する処置については、この ような方法での研究は広範にはなされていなかった。Ａ型およびＢ型肝炎感染に 対する処置のように、ヴイールス特異的免疫の事後的感染緩和についての処置例 は種々あるものの、確定もしくは慢性ヴイールス感染に対しては、免疫法の有効 利用により人間に対する系統だった研究は無かった。

本発明では、感染後に積極免疫化によりヴイールス特異的免疫付与療法を提供す る。とりわけ、ＨＩＶ遺伝子包被から誘導されたｇｐ１６０に対するワクチンに より、ＨＩＶ感染初期患者の３０名中１９名が、ヒトに対するヴイールス特異的 体液反応および細胞反応を増加させた。

本研究により、自然感染と感染後免疫化における特異的ＨＩＶエピトープに対す る抗体反応の差異が質的および量的の双方から測定できた。このようにして、感 染者のワクチン誘導形体液免疫性についての正確な判定が、被験者の７０％につ いて系統的に記録された。例えば、２０名の被験者（１９名はワクチン反応者、 １名はワクチン無反応者）特異的包被エピトープに対して血清転換された。ワク チンのみに関与する血清転換（エピトープ２４１．２５４および３４２）は、１ ０名の被験者に発生した。

さらには、このワクチンに対する体液反応の変化は、エピトープ地図により特徴 づけられているように、特異的抗体反応の因果関係について見込みのある展望を 提供し、自然感染からでは導出されない免疫制御機構を特徴とする特別な機会を 与えるであろう。

血清中性化活動についての体内発生率は現在では未知であるが、５名のワクチン 反応者の４名について、個々のエピトープ種（Ｉ　Ｉ　ＩＢＳＲＦ、ＭＮ）に対 する強い中性化活動を観察すれば、感染後の免疫化が抗体の機能変化を誘導する ことを示唆するだろう。試験上のワクチンは、個々のエピトープ種に対して血清 中性化能力を増加させ、群分類に特異的な中性化エピトープを明確にする上で役 立つ可能性がある。

ＨＩＶ包被蛋白に対する増殖的反応は、自然のＨＩＶ感染ではほとんど起こらな い。しかしながら、ｇｐｌｓｏにより免疫化した後には、特異的Ｔ−細胞増殖反 応が起こることが、２１名の被験者（７０パーセント）において記録された。

このような相違か生ずることの理由については明らかではない。一つの可能性と しては、ワクチンに特有の包被エピトープに対して新たな増殖的反応が起こるこ とが指摘できる（ワクチン製造方法、あるいは体内抗原処理の代替の結果として ）。もしくは、増殖試薬で用いられた蛋白が、自然ヴイールスの相同「野生型」 包被エピトープに対して初期のＴ−細胞増殖反応を刺激しないことが考えられる 。

しかしながら、補足的な根拠ではあるが、ワクチン化がヒトの細胞免疫反応を促 進することが判明している。選ばれたワクチン反応者によれば、免疫強化の後に ＨＩＶ−ＩＩＴＢ形特異的細胞毒素Ｔ−細胞反応を示した。

ＨＩ　Ｖ感染者におけるワクチン反応性を支配する要因については、これから明 らかにすべきことである。初期段階のＨＩＶ感染者であっても、相当の対照手段 に比較して種々のワクチンには適度に反応する。この高い反応性は、初期のＢ細 胞に抑制不全とＴ−細胞の機能不全とに関係している。ワクチン免疫反応性は、 基本ＣＤ４細胞数に関与しており、このことはヒトの免疫状態はワクチン反応の 重要な決定因子であるとの仮説と符合している。しかしながら、特異的Ｔ−細胞 数の変化範囲内での免疫化計画は、ワクチン反応に影響を及ぼした。計画Ｂ（６ 回投与）の場合は、優秀であった。ＣＤ４細胞数が少ない場合には被験者に免疫 反応性が低下するが、この低下はワクチン投与回数を上げることにより改善の可 能性があった。このことは、さらにワクチン投与回数、養生法、補助剤あるいは 処方の改良如何によりヒトの免疫性が改善されることを示唆している。

ＨＩＶ感染者に積極的に免疫化する際のＨＩＶ特異性ワクチン製品に対する安全 性について憂慮があるものの、免疫に特異的な毒性を証する根拠はなかった。

量的培養、ＤＮＡポリメラーゼ連鎖反応試料、ならびに血清抗体試料によれば、 体内でのＨＩＶ負荷の増加を見た。優れたＨ■Ｖ再生の体内標識やＣＤ４細胞の 減少率により、とりわけワクチン反応者として分類された被験者の間では有効に 影響されて有意の差を見た。ワクチン反応者に対する平均ＣＤ４細胞数の変化は 、−０，２％で、ワクチン無反応者では−７，３％であった。これら資料は、感 染後免疫化の反応性はＣＤ４細胞数の減少には関与せず、体内のＨＩＶ再生低下 に関係していることを示唆している。

本研究でのワクチン接穫の結果は、相応する年齢、人種群および基本ＣＤ４細胞 数における１０人の感染、不処置のヒトのデータベースに比較された。この比較 群において平均ＣＤ４細胞数が８．７％減少することとは、計画Ａに組み入れら れた被験者では７．２％の減少に相当し、計画Ｂに組み入れられた被験者では０ ．６％の減少に相当する。これらの結果からは、組換えＨＩＶ包被蛋白による感 染後ワクチンは実用的であり、ざらには当該ワクチンの感染予防的使用に関して は有望であることを示していることが分かる。

図面 ＴＧＣＴＧＡＴＡ丁ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＡ　ＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴ　ＡＡＣＣ ＡＴＣＴＣＧ　ＣＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴ Ａ　ＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴ　ＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡ　ＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡ、Ｔ 　−−−−−／　′ｉＦ　−−−−−、Ｔ″ｌ、Ｔ、ＴＡ　ＴＴ、　、　ＧＴ　 ＡＣＣＧＡＣＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＡＡ　ＧＡＧＧＡＧ　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＣＴＣ ＣＴＴ　ＧＡ、Ｉ　ＧＴＴ　丁ＣＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＴＡ　Ａ ＡＧ　ＧＡＧ中２２８７ ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＧＣＡ　ＣＣＴ　ＣＴＣＴＴＣＡＣ丁　ＧＧ丁 　ＣＣＧ　ＧＣＧ　ＴＡＴ　ＴＡＡ◆２３３２　◆２３７４ 図３ Ｖ輩１　′“゛：藝卦言 °°′　１占 トくり ＜トコ−〇〇〇〇 （Ｊ（ｊ　１ｊＦＩ １乏５：　ＣＪローさ 畦立　４．．９゜−百Ｆ、５８ ｐｇＩ″ｃ′Ｏ，：：函；＝８８８ ｉ糟！”　Ｌｌｌｌｖ’−ＣＪｌｊＱ＋番よ　斃゛口胚＝韮ぎ　已じ。

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Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．組換えＨＩＶ包被蛋白を感染者に投与することを特徴とするヒト後天的免疫 不全ヴィールス感染者の治療方法。
2. ２．前記組換えＨＩＶ包被蛋白は、体重１Ｋｇ当たり略１マイクログラムから１ ００マイクログラムを１回の服用として投与されることを特徴とする特許請求の 範囲第１項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
3. ３．前記組換えＨＩＶ包被蛋白は、略１０μｇから略４０００μｇを１回の服用 として投与されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヒト後天的免 疫不全ヴィールス（ＨＩＶ）感染者の治療方法。
4. ４．前記組換えＨＩＶ包被蛋白は、略４０μｇから略１２８０μｇを１回の服用 として投与されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヒト後天的免 疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
5. ５．少なくとも３回の服用を投与されることを特徴とする特許請求の範囲第３項 に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
6. ６．少なくとも６回の服用を投与されることを特徴とする特許請求の範囲第４項 に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
7. ７．少なくとも各回の服用は３０日から６０日までの日数を隔てて投与されるこ とを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感 染者の治療方法。
8. ８．少なくとも各回の服用は３０日から６０日までの日数を隔てて投与されるこ とを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載のヒト後天的免疫不全症候群感染者 の治療方法。
9. ９．ＨＩＶに特異的細胞反応、あるいは体液免疫反応の増加を誘引するに十分な 置だけＨＩＶ包被蛋白を感染者に投与することを備えたことを特徴とするヒト後 天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
10. １０．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞発現系から生産されることを 特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者 の治療方法。
11. １１．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞発現系から生産されることを 特徴とする特許請求の範囲第３項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者 の治療方法。
12. １２．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞発現系から生産されることを 特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者 の治療方法。
13. １３．前記組換え蛋白は、略１４５，０００の分子量を有していることを特徴と する特許請求の範囲第１項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療 方法。
14. １４．前記組換え蛋白は、略１４５，０００の分子量を有していることを特徴と する特許請求の範囲第３項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療 方法。
15. １５．前記組換え蛋白は、略１４５，０００の分子量を有していることを特徴と する特許請求の範囲第５項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療 方法。
16. １６．前記ＨＩＶ包被蛋白は、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のうちの 少なくとも一つであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヒト後天 的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
17. １７．前記ＨＩＶ包被蛋白は、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のうちの 少なくとも一つであることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載のヒト後天 的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
18. １８．前記ＨＩＶ包被蛋白は、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０およびｇｐ４１のうちの 少なくとも一つであることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のヒト後天 的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
19. １９．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞ベクトルＡｃ３０４６により 発現されるようになっていることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヒ ト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
20. ２０．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞ベクトルＡｃ３０４６により 発現されるようになっていることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載のヒ ト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
21. ２１．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞ベクトルＡｃ３０４６により 発現されるようになっていることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のヒ ト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
22. ２２．前記組換え蛋白は、少なくとも略２，０００，０００の分子量を有する粒 子に凝集していることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のヒト後天的免 疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
23. ２３．前記組換え蛋白は、少なくとも略２，０００，０００の分子量を有する粒 子に凝集していることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載のヒト後天的免 疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
24. ２４．前記組換え蛋白は、少なくとも略２，０００，０００の分子量を有する粒 子に凝集していることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載のヒト後天的免 疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
25. ２５．前記組換え蛋白は、補助剤と組み合わされていることを特徴とする特許請 求の範囲第１項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
26. ２６．前記組換え蛋白は、補助剤と組み合わされていることを特徴とする特許請 求の範囲第３項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
27. ２７．前記組換え蛋白は、補助剤と組み合わされていることを特徴とする特許請 求の範囲第５項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
28. ２８．少なくとも略２，０００，０００の分子量を有する粒子に形成された組換 えＨＩＶ包被蛋白およびアルミ補助剤を含む組成物を感染者に投与することを備 えていることを特徴とするヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
29. ２９．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞発現系から生産されることを 特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染 者の治療方法。
30. ３０．前記組換え蛋白は、組換えｇｐ１６０、組換えｇｐ１２０および組換えｇ ｐ４１から選択され、組換えＨＩＶ包被蛋白は略１４５，０００の分子量を有し 、組換え蛋白は棒状ヴィールス昆虫細胞ベクトルＡｃ３０４６により発現される ようになっていることを特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載のヒト後天的 免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
31. ３１．前記組換え蛋白は、ｇｐ１６０の略７５７個の連鎖アミノ酸を備え、ｇｐ １６０の略４０個の末端連鎖アミノ酸を実質的に除くことを特徴とする特許請求 の範囲第２８項に記載のヒト後天的免疫不全ヴィールス感染者の治療方法。
32. ３２．前記組換え蛋白は、略１０μｇから略４０００μｇを１回の服用として投 与されることを特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載のヒト後天的免疫不全 ヴィールス（ＨＩＶ）感染者の治療方法。
33. ３３．組換えＨＩＶ包被蛋白およびアルミ補助剤を具備し、該組換え蛋白は少な くとも略２，０００，０００の分子量を有する粒子に形成されたことを特徴とす る療法的ＨＩＶワクチン組成物。
34. ３４．前記組換えＨＩＶ包被蛋白は、一回の服用当たり略１０μｇから４０００ μｇの量を調整することを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載の療法的Ｈ ＩＶワクチン組成物。
35. ３５．前記組換え蛋白は、桿状ヴィールス昆虫細胞発現系により生産されること を特徴とする特許請求の範囲第３４項に記載の療法的ＨＩＶワクチン組成物。
36. ３６．前記組換え蛋白は、ｇｐ１６０の略７５７個の連鎖アミノ酸を備え、ｇｐ １６０の略４０個の末端アミノ酸を実質的に除くことを特徴とする特許請求の範 囲第３４項に記載の療法的ＨＩＶワクチン組成物。