LT3365B

LT3365B - Vaccine for human immunodeficiency virus

Info

Publication number: LT3365B
Application number: LTIP335A
Authority: LT
Inventors: Gale E Smith; Franklin Volvovitz
Original assignee: Microgenesys Inc
Priority date: 1991-06-11
Filing date: 1993-02-11
Publication date: 1995-07-25
Also published as: SK18993A3; FI930577A7; MX9202781A; HU9300686D0; IL102092A0; AU4028895A; EE9400183A; HUT68355A; LTIP335A; AU2193192A; PL297849A1; BG97519A; JPH06501851A; IL102092A; ZA924150B; PT100584A; FI930577A0; IE921875A1; CA2087732A1; FI930577L

Description

Ši paraiška yra paraiškos JAV patentui, serija Nr. 151,976, užpildytos 1988 m. vasario 3 d., tęsinys. Paraiška Nr. 151,976 yra paraiškos JAV patentui, serija Nr. 920,197, užpildytos 1986 m. spalio 3 d. (dabar serijos Nr. 585,266), tęsinys. Šios paraiškos ir cituojami darbai yra įtraukti į šį patentą nors jie tik cituojami.

tipo žmogaus imunodeficito virusas (ŽIV-1) yra retrovirusas, sukeliantis patalogiją imuninėje sistemoje. Žmogaus imunodeficito virusas yra įgyto žmogaus imunodeficito sindromo (AIDS) sukėlėjas. BarreSinoussi, et ai., Science, 220: 868-871 (1983); Popovic et ai., Science, 224: 497-500 (1984); Klinikiniai ŽIV1 izolatai be to buvo priskiriami asocijuotam su limfadenopatij a virusui (Feorino, et ai., Science, 225: 69-72 (1984) ir AIDS giminingam virusui (Levy et ai., Science 225: 840-842 (1984)).

AIDS įgavo pandeminį pobūdį, todėl vakcinos prieš AIDS sukūrimas tapo viena iš pagrindinių sveikatos apsaugos užduočių. Didelis procentas žmonių, užsikrėtusių ŽIV-1, sparčiai praranda imuninę funkciją dėl T4 limfocitų sumažėjimo. Šios T4 ląstelės, taip pat kaip ir tam tikros nervinės ląstelės, savo paviršiuje turi molekulę, vadinamą CD4. ŽIV-1 atpažįsta CD4 molekulę dėka receptoriaus, esančio ant virusinių dalelių apvalkalo, patenka į ląstelę, replikuojasi ir galiausiai ją nužudo. Manoma, kad efektyvi vakcina prieš AIDS turėtų sukelti antikūnų prisirišimą prie ŽIV-1 viruso apvalkalo, tuo būdu apsaugodama T4 limfocitus bei kitas jautrias ląsteles nuo ŽIV-1.

Paprastai vakcinomis, kaip imunoprofilaktikai skirtomis priemonėmis, skiepijami sveiki asmenys, dar nesirgę nurodyta liga. Tačiau visiškai priimtina efektyvią vakciną prieš AIDS vartoti po užsikrėtimo, kaip imunoterapinę priemonę. Salk, J., Nature, 327: 473476 (1987).

Šiuo metu plačiai paplitusi nuomonė, kad tinkamiausias kandidatas vakcinos prieš AIDS sukūrimui yra ŽIV1 apvalkalas (env). Francis and Petricciani. New Eng. J. Med., 1586-1559 (1985); Vogt and Hirsh, Rewiews of Infectious Disease, 8: 991-1000 (1986); Fauci, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83: 9278-9283. Iš pradžių ŽIV1 apvalkalo baltymas yra susintetinamas kaip 160000 molekulinio svorio glikoproteinas (gpl60). Tada gpl60 pirmtakas suskaidomas į 120000 molekulinio svorio išorinį glikoproteiną (gpl20) ir 41000 molekulinio svorio transmembraninį glikoproteiną (gp41). Šitie apvalkalo baltymai yra svarbiausi antikūnų taikiniaiantigenai ligonių, sergančių AIDS, organizme. Barin, et ai., Science, 228: 1094-1096 (1985). Buvo parodyta, kad natyvus ŽIV-1 gpl20 yra imunogeniškas ir sugeba indukuoti neutralizuojančius antikūnus graužikuose, ožkose, rezus beždžionėse ir šimpanzėse. Robey, et ai., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83: 7023-7027 (1986).

Dėl labai žemo natyvaus ŽIV-1 apvalkalo baltymo lygio užkrėstose ląstelėse ir pavojaus, susijusio su AIDS vakcinos paruošimu iš ŽIV-1 užkrėstų ląstelių, ŽIV1 apvalkalo antigenų, skirtų vakcinos prieš AIDS gamybai, buvo pradėta naudoti rekombinantinės DNR metodus. Pasirodo, kad rekombinantinės DNR technika suteikia geriausias galimybes vakcinos prieš AIDS viruso subvienetų gamybai, nes įgalina saugiai ir pigiai gaminti imunogenus dideliais kiekiais. ŽIV1 apvalkalo baltymo genas buvo ekspresuotas genetiškai pakeistuose rekombinantiniuose vakcinijos virusuose. Chakrabarti, et ai., Nature, 320: 535-537 (1986); Hu, et ai., Nature, 320: 537-540 (1986); Kieny, et ai.,

Biotechnology, 4: 790-795 (1986). Be to, apvalkalo baltymo genai buvo ekspresuojami bakterijų ląstelėse (Putney, et ai., Science, 234: 1392-1395 (1986)), žinduolių ląstelėse (Lasky, et ai., Science, 23: 209-12 (1986)) bei vabzdžių ląstelėse. Sintetiniai peptidai, atitinkantys ŽIV-1 gp41 amino rūgščių seką, irgi buvo laikomi tinkamais vakcinų prieš AIDS gamybai. Kennedy, et ai. (1986). Deja, naudojant tokius metodus bei medžiagas nepavyko sukurti efektyvios vakcinos prieš AIDS.

Vienas iš išradimo aspektų yra bakuloviruso - vabzdžių ląstelės vektorinės sistemos naudojimas rekombinantinio ŽIV-1 apvalkalo baltymo gamybai, aprašytas kartu paduotoje ir pasirašytoje paraiškoje JAV patentui gauti, serijos Nr. 920,197, užpildytoje 1986 m. spalio 16 d., (dabar serijos Nr. 585, 266) aspektų. Taip pat žr. serijos Nr. 151,976.

Buvo parodyta, kad bakuloviruso sistema, apskritai, yra naudinga gaminant ŽIV-1 bei kitus baltymus. Pavyzdžiui, bakulovirusas - Autographa californica branduolinės polihedrozės virusas (AcNPV) buvo panaudotas, kaip vektorius viso ilgio gpl60 ir atskirų ŽIV-1 apvalkalo geno dalių ekspresijai užkrėstose Spodoptera frugiperda ląstelėse (Sf9 ląstelės). Be to, ankstesnėse paraiškose patentui yra aprašytas sutrumpintas gpl60 genas (rekombinanto numeris Ac3046); baltymas, pagamintas rekombinantiniame Ac3046, ir Ac3046 geno produkto gryninimo būdai, kuriuose naudojama lęšių lėktino afininė chromatografija bei geifiltracinė chromatografija. Buvo nustatyta, kad šiuo būdu išgrynintas ir agreguotas į daleles gpl60 baltymas yra labai imunogeniškas graužikams ir primatų rūšims.

Ideali vakcina prieš AIDS turėtų būti ne tik biologiškai gryna bei apirogeniška, bet viena ar kelios jos injekcijos turėtų visam gyvenimui apsaugoti nuo ŽIV-1 infekcijos. Tai yra būdinga gyvoms susilpnintoms vakcinoms. Kai vakcinų gamybai yra naudojamos užmuštos bakterijos ar virusai, arba iš jų išskirtos medžiagos, pvz.: toksoidai, baltymai, dažniausiai sukeliamas silpnas imuninis atsakas ir įgyjamas tik trumpalaikis imunitetas. Siekiant įveikti arba sumažinti šiuos vakcinų trūkumus, paprastai į vakciną įdedama papildoma medžiaga, vadinama adjuvantu. Adjuvantai - tai medžiagos, kurios padeda sukelti imuninį atsaką. Apskritai vakcinose, skirtose žmonėms, naudojami adjuvantai yra aliuminio druskų geliai (aliuminio fosfatas arba aliuminio hidroksidas) , paprastai vadinami alumo adjuvantais. Bomford, et ai., Adjuvants, Animal Cell Biotech. Vol. 2: 235-250, Academic Press Inc. (London: 1985) .

Šis išradimas - tai vakcina prieš žmogaus imunodeficito virusą (ŽIV). Tinkamiausioje schemoje apvalkalo baltymas agreguojamas ir sumaišomas su adjuvantu (pvz., alumu) vakcinos paruošimo yra gryninamas,

Šio išradimo detalės ir nuorodos į pridedamus brėžinius yra pateiktos žemiau:

Fig. 1 iliustruoja klonavimo strategiją, panaudotą ŽIV-1 apvalkalo geno (env) išskyrimui iš E, coli plazmidės pNA2. Užtušuotos dalys rodo ŽIV1 seką, neužtušuotos - klonavimo vektoriaus DNR seką. Tamsus plazmidės pl774 regionas yra sukonstruotas iš sintetinių oligonukleotidų ir įstatytas į plazmidės 01614 Smal-KpnI saitus kaip Smal-KpnI fragmentas. Parodyta šio sintetinio oligonukleotido seka.

Fig. 2 iliustruoja rekombinantinės plazmidės vektoriaus (p3046) konstravimo strategiją, šis vektorius savo ruožtu buvo panaudotas bakuloviruso ekspresijos vektoriaus Ac3046 konstravimui.

vektoriaus

Plazmidė pMGS3 turi bakuloviruso AcNPV sekas (užbrūkšniuotos skersai) kiekvienoje klonavimo saitų pusėje, pozicijoje 4.00. Šis regionas turi unikalius restrikcijos endonukleazių SmaI, KpnI ir BglII saitus. AcNPV polihedrino promotorius yra 5’ galo kryptimi nuo 4.00 pozicijos. Seka 5’-TAATTAATTAA-3' yra 3’kryptimi ir turi transliacijos terminacijos kodoną visuose trijuose skaitymo rėmeliuose. Plazmidė pl774 ir sintetinio oligonukleotido regiono seka yra parodyti Fig. 1. Plazmidė p3046 turi visą pMGS3, išskyrus sekas tarp SmaI ir BglII saitų, kur yra įterptas pl774 ŽIV1 apvalkalo genas.

Fig. 3 parodytos DNR, supančios Ac3046 gpl60 koduojančias sekas, nukleotidų sekos.

Fig. 4 yra	parodyta 3046	env	DNR seka tarp +1 ir +2267.
Fig.	4a-4t	rodo	Ac3046	ŽIV	env geno segmento pirminę
	DNR	seką	kartu	su	sintetinio oligonukleotido

seka, esančia prie 5’ env geno galo (tarp +1 ir +2267). Restrikcijos endonukleazių saitai yra surašyti virš DNR sekos, o numatoma amino rūgščių seka - po DNR seka. Bazės sunumeruotos kairėje ir dešinėje.

Fig. 5a-5h yra lyginamos Ac3046 env geno ir publikuota LAV-1 env geno DNR sekos. LAV-1 seka yra viršuje, o Ac3046 - apačioje. Linija (1) po LAV-1 seka rodo, kad šioje pozicijoje Ac3046 seka yra ta pati. DNR sekos sunumeruotos tuo pačiu būdu, kaip LAV-1 Wain-Hobson et ai., Cell, 40: 9-17 (1985).

Fig. 6 rodo antikūnų prieš ŽIV-1 titrą, nustatytą imunofermentine analize (IFA), teigiamuose žmonių serumuose (viršutinis grafikas) ir rezus beždžionių, imunizuotų gpl60 (IJ55, KL55) ar gpl20 (AB55, CD55, GH55), serumuose (apatinis grafikas). Serumų titras prieš gerai išgrynintus baltymus gpl20 ir gpl60 buvo išmatuotas IFA. Specifiškai prisijungę antikūnai buvo išryškinti, naudojant ožkos antikū.ius prieš žmogaus IgG, konjuguotus su peroksidaze iš krienų. Šiame teste titru laikomas didžiausias serumo praskiedimas, kuriam esant gaunamas teigiamas atsakas.

Fig. 7 pateikta lentelė, apibendrinanti imuninius atsakus, sukeltus gpl60 vakcinos, pacientams su teigiamais serumais.

Fig. 8 (A ir B) rodo vakcinos sukeltus imuninius atsakus į specifinius ŽIV-1 apvalkalo epitopus.

Fig. 9 rodo vakcinos sukelta T ląstelių proliferacini atsaką i, gpl60 paskiepytuose pacientuose su teigiamais serumais.

Fig. 10 rodo limfocitų skaičiaus didėjimą po skiepijimo vakcina gpl60.

Fig. 11 yra grafikas, rodantis CD4 ląstelių skaičiaus pokytį procentais laike vakcinai jautriuose ir nejautriuose individuose.

Buvo atrasta, kad rekombinantinio ŽIV-1 gpl60 apvalkalo baltymas (rgpl60), ypač adsorbuotas ant tokio adjuvanto, kaip alumas (pvz., aliuminio fosfatas), yra labai tinkamas vakcinai prieš AIDS.

Vienas šio išradimo aspektų yra AcNPV ekspresijos vektorius, turintis ŽIV-1 apvalkalo geno koduojančios sekos dalį, kuri yra ekvivalentinė rekombinantinio klono Nr. 3046 1-757 Wain-Hobsono (ibid) sekai ir atitinka 1-752 amino rūgštis.

Antras išradimo aspektas yra šio rekombinantinio ŽIV1 apvalkalo baltymo (ir paties baltymo) gaminamas vabzdžių ląstelėse, ypač baltymo rgpl60, koduojamo amino rūgščių 1-757 Wain-Hobson sekos (t.y. 03046, turinčio 752 amino rūgščių liekanas).

Kiti šio išradimo aspektai - apvalkalo baltymo gryninimas ir dalelių formavimas iš rekombinantinio bakuloviruso, gaminančio 3046 baltymą, geno produkto bei to produkto dalelių adsorbcija ant aliuminio fosfato agregatų.

Išradimas taip pat apima vakcinas ir priemones AIDS ir ŽIV infekcijų profilaktikai ir/arba terapijai.

Tolesni pavyzdžiai iliustruoja išradimą, neribodami jo pritaikymo sferos.

Rekombinantinis bakulovirusas Autographa californica branduolinės polihedrozės virusas (AcNPV), turintis sutrumpintą ŽIV-1 gpl60 geną, koduojantį ŽIV-apvalkalo baltymo 1-757 amino rūgštis, yra aprašytas užregistruotoje paraiškoje JAV patentui, serijos Nr. 920,197 (dabar serijos Nr. 585,260). Klonavimo pakopos, naudojamos konstruojant rekombinantinį bakulovirusą, turintį ŽIV-1 genus ar ŽIV-1 genų dalis, irgi yra aprašytos šiame patente ir yra šio patento dalis.

Toliau pateiktas detalus geno inžinerinių stadijų, panaudotų konstruojant Ac3046 ekspresijos vektorių, aprašymas. Naudotos medžiagos, tarp jų fermentai ir imunologiniai reagentai, buvo gauti iš komercinių šaltinių. Pridedami pavyzdžiai parodo, kaip atlikti ir taikyti išradimą.

Turimi omenyje taip pat ir kiti rekombinantiniai apvalkalo baltymai, kurie visi priskiriami rgpl60, čia įeina ir rekombinantiniai gpl20 ir gp41 baltymai. Ac3046 kaip tik yra tokio ekspresijos vektoriaus ir rekombinantinio apvalkalo baltymo pavyzdys pagal išradimą.

PAVYZDYS

Rekombinantinio bakuloviruso Ac3046, turinčio ŽIV1 koduojančios sekos dalį, atitinkančią 1-757 amino rūgštis, konstravimas

Svetimus baltymus koduojančių sekų klonavimui ir ekspresijai bakuloviruso vektoriuje reikia, kad koduojanti seka su polihedrino promotoriumi ir prieš ją esančios sekos būtų išrikiuotos vienoje pusėje, o bakuloviruso koduojančios sekos - kitoje pusėje. Esant tokiam išsidėstymui, homologinės rekombinacijos su bakuloviruso genomu metu svetimos koduojančios sekos yra perkeliamos kartu su polihedrino promotoriumi ir neaktyviu polihedrino genu.

Todėl ŽIV apvalkalo geno konstravimui buvo sukurti įvairūs insercijos vektoriai. Insercijos vektorius MGS3, aprašytas žemiau, buvo sukonstruotas tam, kad tiektų ATG transliacijos iniciacijos kodoną. Svetimų sekų įterpimas į šį vektorių turėtų būti toks, kad transliacijos rėmelis, prasidedantis iniciacijos kodonu, tiksliai tiktų svetimoms sekoms.

Insercijos vektorius MGS3 buvo sukonstruotas iš Eco RII restrikcijos fragmento klono, kurio DNR buvo išskirta iš išgryninto AcMNPV izoliato (WT-1). MGS3 buvo sukonstruotas taip, kad turėtų šias struktūrines savybes: (a) 4000 b.p. seką, esančią prieš polihedrino promotoriaus iniciacijos kodoną ATG; (b) polilinkerį, įterptą sait-specifinės mutagenezės būdu, kuris turi iniciacijos kodoną ATG pozicijoje, atitinkančioje kodono poziciją, ir KpnI, BglII, o taip pat polihedrino restrikcij os iniciacijos saitus SmaI, universalų stop kodono segmentą; (c) 1700 b.p. seką, nusitęsusią nuo Kpn restrikcijos saito (kuris yra polihedrino gene) iki terminalinio EcoRI-I klono EcoRI restrikcijos saito. Žr. pvz.: fig. 2.

PAVYZDYS

Bakuloviruso rekombinantų, turinčių LAV env koduojančias sekas, konstravimas

Rekombinantinė plazmidė, pažymėta NA2 (fig. 1), susideda iš viso ŽIV-1 proviruso 21.8 k.b. segmento, įterpto į pUC18. Buvo duomenų, kad šis klonas yra infekcinis, kadangi gali gaminti virusą, sugebantį užkrėsti tam tikras žmogaus ląsteles. Adachi, et ai., J.Virol. 59: 284-291 (1986) . Visos apvalkalo geno sekos, esančios NA2, yra kilusios iš ŽIV LAV štamo. Barre-Sinoussi (1983).

ŽIV-1 apvalkalo genas buvo išskirtas atliekamos genoinžinerinės procedūros aprašyta žemiau ir parodyta pav.l. Pi NA2 buvo išskirtas 3846 b.p. EcoRI/SacI fragmentas, turintis apvalkalo geną ir EcoRI//SacI restrikcijos saitą pUCl9. plazmidė pavadinta p708.

ir su juo taip, kaip rmiausiai iš restrikcijos klonuotas į Sukonstruota

Apvalkalo genas buvo pakartotinai išskirtas, kaip 2800 b.p. KpnI restrikcijos fragmentas ir klonuotas į pUC18 KpnI restrikcijos saitą. Sukonstruota plazmidė pavadinta pi 614.

KpnI restrikcijos fragmentas, esantis pl614, turėjo nežymiai sutrumpintą ŽIV apvalkalo geną, kuriame trūko 121 b.p. ilgio N-galą atitinkančios sekos. Ši trūkstama geno dalis, koduojanti signalines peptidų sekas, buvo pakeista, įterpiant dvigrandį sintetinį oligomerą. Įterptas oligomeras buvo susintetintas iš LAV amino rūgščių sekos, naudojant polihedrino genui būdingus kodonus. Siekiant palengvinti tolesnes manipuliacijas, vietoj ATG iniciacijos kodono buvo įterpta nauja Smal restrikcijos seka. ATG iniciacijos kodonas gaunamas iš bakuloviruso insercijos vektoriaus. Sukonstruota plazmidė pavadinta pl774.

Remiantis fig. 2., restrikcijos fragmentai iš pl774, turintys įvairių ŽIV apvalkalo domenų koduojančias sekas, buvo klonuoti į MGS insercijos vektorių (pvz., MGS3) taip, kad insercijos vektoriaus iniciacijos kodonas ATG būtų skaitymo rėmelyje kartu su apvalkalo geno kodonais. Sukonstruota p3046 susideda iš Smal/BglII restrikcijos fragmento, išskirto iš pl774, įterpto į plazmidės vektoriaus pMGS3 Smal/BamHI saitą. Šis klonas turi sekas, koduojančias baltymo gpl60 1 757 amino rūgštis ir MGS3 vektoriaus terminacijos kodoną.

PAVYZDYS

Rekombinantinio bakuloviruso paruošimas ir selekcija

ŽIV env geno rekombinantinė plazmidė p3046 buvo išsodinta kalcio fosfatu su AcMNPV DNR (WT-1) ir įdėta į neužkrėstas Spodoptera fruglperda ląsteles. Tada chimerinis genas homologinės rekombinacijos būdu buvo įterptas į AcMNP genomą. Rekombinantiniai virusai buvo indenfikuojami morfologiškai, pagal neigiamą plokštelių okliuziją. Tokiose plokštelėse pastebimas citopatinis efektas, bet be branduolio okliuzijos. Siekiant gauti gryną rekombinantinį papildomos, viena po gryninimo procedūros.

virusą, buvo atliktos dvi kitos sekančios, plokštelių Lyginant restrikcijos ir hibridizacijos charakteristikas su atitinkamom laukinio tipo virusinės DNR charakteristikom, buvo išanalizuota, ar rekombinantinėje virusinėje DNR įvyko ŽIV env sekų ”sait-specifinė insercija.

PAVYZDYS

ŽIV env iš rekombinantinio bakuloviruso ekspresija užkrėstose vabzdžių ląstelėse

ŽIV env sekų iš rekombinantinių virusų ekspresija vabzdžių ląstelėse turėtų baigtis pirminio transliacijos produkto sinteze. Šis pirminis produktas bus sudarytas iš amino rūgščių, transliuojamų nuo rekombinantinio vektoriaus kodonų. Tokiu būdu, gaunamas baltymas, kuris turi visas amino rūgštis, koduojamas regione nuo ekspresijos vektoriaus iniciacijos kodono ATG, esančio už polihedrino promotoriaus, iki transliacijos terminacijos signalo, esančio ekspresijos vektoriuje (pvz.: rgpl60). Pirminis Ac3046 transliacijos produktas turėtų skaityti Met-Pro-Gly-Arg-Val, kur Arg, esantis pozicijoje 4, originaliame LAV klone turėtų būti pozicijoje 2. Met-Pro-Gly kodonai klonavimo strategijos pasekmė.

PAVYZDYS gp!60 intarpo ir supanti DNR nukleotidu seka gpl60 intarpo ir šoninės DNR nukleotidu seka buvo nustatyta pagal restrikacijos fragmentą, išskirtą iš virusinio ekspresijos vektoriaus Ac3046 DNR. Sekos buvo nustatomos tokia tvarka: 3.9 kb EcoRV-BamHI fragmentas buvo išgrynintas, restrikacijos endonukleazėmis suskaidžius Ac3046 virusinę DNR. Ac3046 virusinė DNR buvo paruošta iš ekstraląstelinio viruso, esančio ląstelių, naudotų vakcinos serijos gamybai, terpėje.

Kaip parodyta fig. 2, 3.9 kb EcoRV-BamHI fragmentas susideda iš viso gpl60 geno ir 100 b.p. DNR, esančios prieš geną ir 1000 b.p. DNR, esančios už geno.

Taigi, sekų nustatymo rezultatai parodė, kad gauta chimerinė konstrukcija, kurią nulėmė klonavimo strategija. gpl60 seka iš esmės buvo tokia pati, kaip nurodė Wain-Hobson, et ai. (1985). 2256 bazių porų seka tarp tariamų transliacijos iniciacijos ir terminacijos kodonų lemia 752 amino rūgščių kodoną ir 28 potencialus N-glikozilinimo saitus. Šio rgpl60 molekulinis svoris (kartu su angliavandenių liekanomis) apytiksliai yra 145000.

Kaip matyti Fig. 3,4 ir 5, 200 bazių, priklausančių supančiai DNR, sekų analizė parodė tikslią inserciją.

PAVYZDYS gp!60 amino rūgščių seka

Naudojant standartinę automatizuotą Edmano degradaciją ir HPLC buvo nustatyta, kad pirmų 15-kos gpl60 liekanų N-galinė seka yra identiška pagal DNR numatytai sekai. gpl60 baltymas neturi N-galinio metionino. Tai atitinka stebėjimus, kad AcNPV polihedrino baltymas taip pat yra sintetinamas be N-galinio metionino. Analizuojant AcNPV 3046 DNR ir išgrynintą gpl60, nustatyta, kad pirminės gpl60 DNR ir N-galo baltymo sekos tokios (1 lentelė):

LENTELĖ

LAV env AcNPV 3046 ekspresijos vektoriuje

Liekana

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Pro Gly Arg Vai Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly

ATG CCC GGG CGT GTG AAG GAG AAG TAC CAA CAC CTG TGG CGT TGG GGC

Šie rezultatai lyginami su originaliu LAV-1 klonu (2 lentelė):

LENTELĖ

LAV env genas AcNPV originaliame LAV-1 klone

Liekana

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

Mat

Arg

Vai

Lys

Glu

Lys

Tyr

Gln

His

Leu

Trp

Arg

Trp

Gly

ATG

AGA

GTG

AAG

GAG

AAG

TAT

CAG

CAC

TTG

TGG

AGA

TGG

GGG

PAVYZDYS

Rekombinantinio gp!60 gryninimas

Vienas šio išradimo aspektų yra procedūra, naudojama rekombinantinio HIV-1 apvalkalo baltymo, koduoto Ac3046 ekspresijos vektoriuje, ekstrakcijai ir išskyrimui. Rekombinantinis HIV-1 apvalkalo baltymas gpl60 yra sintetinamas S. frugiperda ląstelėse 45 dienas po užkrėtimo Ac3046. Šio rgpl60 baltymo gryninimas vyksta sekančiom pakopom:

1. Ląstelių plovimas

2. Ląstelių suardymas

3. Gelfiltracinė chromatografija

4. Lęšių lėktino afininė chromatografija

5. Dializė

Šiame pavyzdyje aprašytas rekombinantinio gpl60 gryni£ nimas iš maždaug 2x10 ląstelių, užkrėstų Ac3046.

1. Ląstelių plovimas. Užkrėstos ląstelės plaunamos buferyje, turinčiame 50mM Tris'o buferio (pH 7.5), 1 mM EDTA ir 1 % Triton'o Χ-100. Šiame buferyje ląstelės resuspenduojamos, homogenizuojamos standartiniais metodais ir centrifuguojamos 20 minučių, esant 5000 aps/min. Šis procesas pakartojamas 3 kartus.

2. Ląstelių suardymas. Nuplautos ląstelės suardomos ultragarsu 50mM Tris’o buferio (pH 8.0-8.5), 4 % dezoksicholato ir 1 % beta-merkaptoetanolio mišinyje. Ardymas ultragarsu atliekamas naudojant standartinius metodus. Po ardymo ultragarsu lieka nesuirusios tik branduolio membranos dalelės, kurios pašalinamos centrifuguojant 30 minučių, esant 5000 aps/min. Stebėjimai per šviesini, mikroskopą rodo, kad supernatante, turinčiame ekstrahuotą gpl60, nėra nesuirusių ląstelių.

3. Gelfiltracija. Gelfiltracija atliekama stiklinėse 5.0x50 cm kolonose (Pharmacia), užpildytose Sefakrilu (Pharmacia). Bendras sorbento tūris yra apytiksliai 1750 ml. Kolona ir žarnelių jungtys depirogenizuojami bei dezinfekuojami leidžiant per koloną 24 valandas mažiausiai 6 litrus 0.1 N NaOH. Eliuatas, ištekantis iš kolonos, eina per UV-kiuvetę, sujungtą su monitoriumi ir savirašiu (Pharmacia), kolona nulygsvarinama 4 litrais gelfiltracinio buferio. Nevalytas gpl60 yra pakraunamas ant kolonos ir per ją leidžiamas gelfiltracinis buferis.

Kolonoje nevalytas mišinys susiskirsto i tris dideles UV absorbuojančias frakcijas. Pirmasis pikas nubrėžiamas tarp apytiksliai 500 ir 700 ml, antrasis tarp 700 ir 1400 ml ir trečiasis tarp 1400 ir 1900 ml buferio. Toks pat eliucijos profilis stebimas nedidelėse analitinėse kolonose, pagal kurias buvo nustatyta, kad pirmą piką duoda medžiaga, kurios molekulinis svoris >2 000 000.

Šio piko frakcija silpnai absorbuojama, nes joje yra didelio molekulinio svorio lipidų bei lipidų kompleksų. Be to, šio piko frakcijoje yra nuo 10 % iki 20 % gpl60, ekstrahuoto iš užkrėstų ląstelių. Neabejotinai, ši gpl60 frakcija sudaro kompleksus pati su savimi ir su kitais ląstelių komponentais, suformuodama didelio molekulinio svorio agregatus.

Antrojo, plataus, piko frakcijoje, yra didžioji dalis gpl60 ir baltymų, kurių molekulinis svoris apytiksliai yra 18 000 - 200 000.

Trečiojo piko frakcijoje yra mažai baltymų, ir didžia dalimi UV absorbcija sąlygojama beta-merkaptoetanolio, esančio pavyzdyje.

Kai tik antrasis pikas užregistruojamas UV detektoriumi, eliuatas, ištekantis iš kolonos, nukreipiamas tiesiai į koloną su lęšių lėktinu. Kai antrasis pikas išeina iš kolonos, eliuatas atjungiamas nuo kolonos su lęšių lėktinu ir nukreipiamas lauk.

4. Lęšių lėktinas. Didelis kiekis lęšių lėktino afininės gelio terpės (Lentil Lectin Sepharose 4B) buvo įsigytas firmoje Pharmacia. Lęšių lėktinas buvo išgrynintas iki 98 % švarumo afininės chromatografijos būdu ant Sefadekso ir tada imobilizuotas ant Sefarozės 4B, naudojant bromcianą. Ligando kiekis matricoje yra maždaug 2 mg/ml gelio. Lęšių lėktino kolona - tai 5.0x30 cm stiklinės kolona (Pharmacia) kurioje yra 125 ml lęšių lėktino Sefarozės 4B gelio. Rūpestingai praplovus ir pagal gamintojo rekomendacijas regeneravus, afininę matricą galima naudoti pakartotinai. Nenaudojant gelis yra saugojamas kolonoje, pripildytoje tirpalo, kurį sudaro 0.9 % NaCI, 1 mM MnCI₂, lmM CaCI₂ ir 0.01 % mertiolato. Prieš kiekvieną naudojimą kolona yra plaunama ir nulygsvarinama 250 ml anksčiau aprašyto lęšių lėktino buferio.

Nevalytas gpl60 yra leidžiamas tiesiai per koloną, nes nuo gelfiltracinės kolonos jis eliuuojamas anksčiau aprašytu būdu. Kai neišgrynintas gpl60 prisijungia prie lęšių lėktino buferio,

Esant šioms sąlygoms, kolonos. Prisijungusių kolonos, jis plaunamas 800 ml turinčio 0.1 % dezoksicholato. visas gpl60 prisijungia prie glikoproteinų, nustatomų UV detektoriumi, esant 280 nm bangos ilgiui, eliucijai naudojamas lęšių lėktino buferis su 0.3 M alfa-metil-manozidu.

5. Dializė. Angliavandeniai ir dezoksicholatas pašalinami įprastos dializės būdu.

Baltymo gpl60 išgryninimo iš 1 litro užkrėstų ląstelių procedūrą galima reziumuoti sekančioje lentelėje (lentelė 3) . Kitu atveju, vietoj gelfiltracijos galima atlikti įprastinę jonų mainų chromatografiją (anijonų ir katijonų). Darbo eiga irgi neturi lemiamos Įtakos: pavyzdžiui, gelfiltracinė ar jonų mainų chromatografija gali būti atliekama po lęšių lektininės chromatografijos. Pagal išradimą, galima naudoti ir kitus reagentus. Pavyzdžiui, vietoje dezoksicholato rekombinantinio baltymo gryninimui galima naudoti kitus detergentus, t. y. nejoninius detergentus tokius, kaip Tween 20 (polisorbatas 20), Tween 80, Lubrol ir Triton Χ-100.

LENTELĖ - gryninimo reziumė

Gryninimo	Bendras	gpl60 balty-	Bendras	Pašalintos
stadija	baltymas	mas (mg)¹	gpl60 (mg)	priemaišos %
Ląstelių nuosėdos	1-2000	20	1-2	Augimo terpė
1,2,3-ias	250	15	6	Serumo albuminas,
plovimas				dauguma nukleino rūgščių, tirpūs ląstelių baltymai
Gelfiltra-	120	12	12	Lipidai, nukleino
cija				rūgštys, didelio mol. svorio agregatai
Lęšių	14	10	70	Neglikozilinti

lėktino baltymai afininė chromatografija ¹ Bendras baltymo kiekis buvo nustatytas pagal absorbciją, esant 280 nm bangos ilgiui.

PAVYZDYS

A. gp!60 dalelių surinkimas.

Vienas šio išradimo aspektų buvo tai, kad gryninimo metu antigenas gpl60 gali būti surinktas į >2000000 molekulinio svorio daleles. Iš ląstelių ekstrahuojamas gpl60 baltymų mišinys, turintis 80-90 % monomerų (160.000 molekulinio svorio) ir 10-20 % polimerų (dalelių forma). Gelfiltracijos pakopoje pašalinamos agreguotos gpl60 formos. Nepavykę bandymai membranos frakcijoje, išskirti gpl60 iš šios frakcijos (pirmasis pikas po gelfiltracijos) perša išvadą, kad jis sudaro kompleksus su kitais ląstelės baltymais ir, galbūt, net su fragmentais. Tačiau gpl60 antigenas duodančioje antrą piką po gelfiltracijos, yra apytiksliai 160000-300000 molekulinio svorio. Tai rodo, kad dominuoja monomerinės bei dimerinės formos.

Baltymo gpl60 agregatai ar polimerai susidaro kolonoje su lęšių lėktinu. Buvo nustatyta, kad antigenas sudaro agregatus tiek eliuuojant 0.5 % dezoksicholatą nuo kolonos su lęšių lėktinu, kai kritinė micelių koncentracija (KMC) dezoksicholato atžvilgiu yra apytiksliai 0.2 %, tiek ir eliuuojant gpl60 nuo kolonos 0.1 % dezoksicholatu.

Agregatų dydis yra matuojamas didelę skiriamąją galią turinčioje FPLC Superozės 12 kolonoje (Pharmacija). Tipiškų išgryninto gpl60 serijų pavyzdžiai dažniausiai yra 20000000 ar didesnio molekulinio svorio, lyginant su Dekstran Blue standartu.

Schwaller, et ai. (1989) darbuose parodyta, kad vabzdžių ląstelėse susintetintas gpl60, - tai tetramerinės dalelės, sudarytos iš identiškų subvienetų. Be to, šie tyrimai rodo, kad ŽIV užkrėstose ląstelėse ir virusinėse dalelėse gpl60 yra tetramerinis. Taigi, rekombinantinio gpl60 dalelės gali turėti tretinę ir ketvirtinę struktūras, panašias į natyvaus HIV gpl60.

Tinkama trimatinė struktūra gali būti svarbi epitopų, reikalaujančių tikslaus gpl60 erdvinio išsidėstymo, formavimui. Kadangi neglikozilinti baltymai atskiriami nuo gpl60 antigeno lęšių lėktino chromatografijos metu, panašu, kad hidrofobinės gpl60 porcijos pradeda formuoti tarpmolekulinius asocijatus. Dezoksicholatas, matyt, neprisijungia prie gpl60, kadangi galima palaikyti didesnę nei KMC jo koncentraciją, o antigenas toliau formuoja kompleksus. Pasirodo, kad toks antigeno agregavimasis yra būdinga šio baltymo savybė, jei jis gryninamas pagal šį išradimą. Gali būti, kad būtent ta hidrofobine N-galinė seka, kuri yra gpl60 baltyme, prisideda prie natūralaus šio baltymo sugebėjimo formuoti daleles. Po gryninimo galima gpl60 kompleksus steriliai filtruoti per 0.2 mikronų skersmens celiuliozės acetato filtrą, tokios procedūros metu neprarandama daug baltymo.

B. Dalelių susidarymo analizė.

Išgryninto gpl60 dalelių analizė elektroninės mikroskopijos būdu parodė, kad tai yra panašios į baltymus, sferinės 30-100 nM dalelės.

Norint įsitikinti, jog dalelės susidarė, išgrynintas gpl60 papildomai analizuojamas gelfiltracijos būdu.

Apytiksliai 100 mikrogramų gpl60 buvo praleista per FPLC gelfiltracijos HR 10/30 Superozės koloną (Pharmacia, Ine.). Prieš tai kolona buvo kalibruojama, naudojant molekulinio svorio baltyminius standartus. Šioje kolonoje baltymų eliucijos profilis labai gerai atsikartoja; eliucijos tūris yra atvirkščiai proporcingas baltymų standartų molekuliniam svoriui. Kolonoje monomerinis gpl60 atskiriamas nuo polimerinių formų ir pašalinami globuliniai baltymai, kurių molekulinis svoris > 2xl0⁶. Dirbant su šia kolona visas baltymas gpl60 išteka su tuščiu tūriu, taigi molekulinis svoris yra >2xl0⁶ (2000000).

PAVYZDYS

A. gp!60 adsorbcija ant alumo.

Netirpių aliuminio junginių, kaip imunologinių adjuvantų, efektyvumas priklauso nuo antigenų adsorbcijos ant kietos fazės. Viena šio išradimo dalis tai atradimas, jog galima padaryti tokius alumo junginius, kurie efektyviai adsorbuotų gpl60. Šiuo atveju, pH turėtų būti toks, kad nesumažėtų gpl60-alumo komplekso imunogeninis aktyvumas. Šio alumo (aliuminio fosfato gelio) junginio susidarymo metu kontroliuojami tokie faktoriai:

1. Optimalus antigenų adsorbcijos ant alumo pH yra apytiksliai 5.0. Tačiau buvo atrasta, kad gpl60, esant pH 6.5. praranda imunogeniškurną labiau nei, esant pH 7.5. Todėl alumas buvo pagamintas, esant pH 7.l±0.1. Buvo atrasta, kad esant šiam pH, visi 100% gpl60 dar adsorbuojąsi prie alumo.

2. Joninė jėga, sąlygojama NaCl, yra santykinai maža ir yra mažesnė nei 0.15 M.

3. Naudojamas moliarinis aliuminio chlorido perteklius, lyginant su natrio fosfatu, užtikrinantis, kad supernatante nėra laisvų fosfato jonų.

4. Baltymas gpl60 įdedamas į šviežiai pagamintą alumą, kad sustotų kristalų augimas ir sumažėtų dalelių dydis.

200 ml alumo ruošiami ir išgrynintas gpl60 adsorbuojamas prie alumo taip, kad galutinė antigeno koncentracija būtų 40 ųg/ml, kaip nurodyta žemiau.

B. Reagentų paruošimas (serijos po 200 ml).

Toliau nurodytus tirpalus ruoškite 100 ml talpos steriliuose depirogenizuotuose buteliuose ar stiklinėse. Sumaišykite druskas, skirtas tirpalo 1 ir tirpalo 2 paruošimui, su natrio hidroksidu ir filtruokite per 0.2 mikronų skersmens celiuliozės acetato filtrus į 100 ml talpos sterilius depirogenizuotus butelius.

Tirpalas 1 A1C1₃.6H/)

NaHAc.3HįO

Ištirpinti 40 ml vandens injekcijoms (VI), filtruoti per 0.2 mikronų filtrą

Tirpalas 2 Na₃PO₄ 12H/)

Ištirtpinti 40 ml VI, filtruoti per 0.2 mikronų filtrą

Tirpalas 3 NaOH

0.895 g 0.136 g

1.234 g

2.0 g

Ištirpinti 100 ml VI, filtruoti per 0.2 mikronų filtrą

Tirpalas 4 Tris 1.25 g

Ištirpinti 100 ml VI, įpilti 1 ml į 90 ml VI, pH koreguoti iki 7.5 su 0.5N HC1 ir pripilti VI iki 100 ml

Tirpalus autoklavuoti 30 min; lėtai išleisti garą. Atšaldyti iki kambario temperatūros.

C. Alumo paruošimas

1. Supilkite 1 tirpalą (aliuminio chloridas-natrio acetatas) į paruošimo indą, naudodami 25 ml sterilias vienkartines pipetes. Pasižymėkite 1 tirpalo tūrį ir pradėkite maišyti tirpalą.

2. Į indą įpilkite 2 tirpalą (natrio fosfatas), naudodami 25 ml sterilias vienkartines pipetes ir toliau maišykite krentant nuosėdoms. Pasižymėkite tirpalo 2 tūrį.

3. Įpilkite 3 ml 3 tirpalo (natrio hidroksidas) ir maišykite dar 5 min. Paimkite 0.5 ml pavyzdi ir pamatuokite pH. Jei pH mažesnis nei 7.0, papildomai įpilkite 0.5 ml natrio hidroksido, maišykite dar 5 min ir vėl pamatuokite pH. Tęskite, kol pH nusistovės tarp 7.0 ir 7.2.

4. Nustatykite bendrą tūri, Įpiltą į paruošimo indą (tirpalas 1 + tirpalas 2 + tirpalas 3), tada įpilkite sterilaus VI iki 100 ml.

5. Skubiai Įdėkite 8,000 mikrogramus išgryninto gpl60 100 ml 1 mM Tris pH 7.5 tiesiai į paruošimo indą.

6. Plakite dar bent 20 minučių, tada paruoštą vakciną išpilstykite į sterilius mėgintuvėlius.

PAVYZDYS

Alumo, adsorbuoto ant gp!60, imunogeniškumas (specifinis Ab atsakas)

Tinkamas metodas antigeninio preparato (vakcinos) imunogeniškumo nustatymui yra specifinio imuninio atsako matavimas pelių, paskiepytų vienkartine antigeno doze, grupėse. Baigiantis 4 savaitei pelės yra nukraujinamos ir antikūnų prieš nurodytus antigenus (paprastai prieš tuos antigenus, kuriais gyvūnai buvo imunizuoti) lygis serume yra matuojamas standartiniu testu, t.y. IFA (imunofermentinė analizė).

Išgryninto gpl60 be adjuvanto, esant pH 6.0 ir 7.5, adsorbuoto prie alumo (kaip aprašyta pavyzdyje 9 ) arba sumaišyto su pilnu Freund’o adjuvantu imunogeniškumas pelėms yra susumuotas žemiau (4 lentelė).

LENTELĖ

Grupė	gp 160 IFA vidurkis	Serokonversij a
gpl60	Adjuvantas	Serija	OT²	%	(P/N)³
1 mkg	Nėra, pH 7,5	8702	0.140	57	4/6
	Nėra, pH 6.0	8702	0.110	26	2/7
	Alumas	8702	1.000	90	9/10
	Alumas	8705	2.285	100	6/6
	Freund’o	8604	1.108	83	5/6
	Freund’o	8702	1.396	100	7/7
	Freund’o	8604	0.434	67	4/6
0.1 mkg	Freund’o	8604	0.434	67	4/6
	Alumas	8705	1.003	67	4/6
2	Praėjus 28 dienoms po imunizacijos pelės buvo nukraujintos ir serumai, praskiedus 1:10; testuojami IFA būdu, prieš gelfiltracijos metodu išgrynintą gpl60. Panašūs rezultatai buvo gauti, naudojant komercinę IFA (Genetic System Ine.; EIA™ ELISA) prieš natyvius HIV1 baltymus, serumo praskiedimui esant 1:400.

Serokonvertuotų pelių skaičiaus (P) santykis su bendru testuotų pelių skaičium (N).

Pelėse, imunizuotose vienakartine 1.0 mikrogramine gpl60 antigeno doze jokio adjuvanto, kyla imuninis atsakas į gpl60 (žr. lentelę žemiau). Žymiai stipresnis imuninis atsakas stebimas pelėse, imunizuotose vienkartine 1.0 mikrogramine gpl60, adsorbuoto ant alumo adjuvanto, doze. Vienkartinė, mažesnė nei 0.1 mikrogramas gpl60, sumaišyto su pilnu Freund'o adjuvantu arba adsorbuoto alumu, dozė sukels serokonversiją >50% imunizuotų pelių. Nors ir nestipriai, antigenas gpl60 be adjuvanto buvo imunogeniškas pelėms, esant pH 7.5 ir pH 6.0. Esant žemesniam pH imunogeniškumas prarandamas.

PAVYZDYS

Ant alumo adsorbuoto gp!60 imunogeniškumas (serūmo tyrimas IFA metodais)

Vakcinos sugebėjimas sukelti imuninį atsaką yra labai svarbi biologinė savybė. Siekiant patvirtinti, kad gpl60 vakcina, paruošta su alumu, yra imunogeniška gyvūnams, o alumo adjuvantas didina šį imunogeniškurną, buvo atlikti tokie eksperimentai:

Nulinę dieną pelėms (10 individų grupėje) buvo suleista vienakartinė dozė (0.5 mikrogramo, 1.0 mikrogramas ir 5.0 mikrogramai) vieno gpl60, gpl60 adsorbuoto ant alumo ar gpl60 su pilnu Freund’o adjuvantu (PFA). 28-tą dieną pelės buvo nukraujintos ir IFA (praskiedimas 1:10) būdu patikrinti serumai, ar yra antikūnų prieš gpl60.

Rezultatai, lentelėje, gauti po pateiktoje grupėse daugiau nei dienų, yra susumuoti (lentelė 5) pelių buvo skaičius ir

Visose stebima vidutinė

28-nių žemiau 50% serokonversij a. Serokonversijų serumo absorbcija (OT₄₅₀ nm, esant praskiedimui 1:10, IFA) buvo didesni, suleidus bet kurią gpl60, adsorbuoto ant alumo, dozę, nei imunizavus atitinkama vieno gpl60 doze.

Šie rezultatai rodo, kad alumo adjuvantas žymiai padidina gpl60 antigeno imunogeniškumą.

LENTELĖ - 28 dienos po suleidimo

0.5 ųg dozė	1.0 ųg dozė	5.0 ųg dozė
Vidurkis	Vidurkis	Vidurkis
P/N⁴ OT⁵	P/N OT	P/N OT
gpl60 9/10 0.407	7/10 0.699	7/10 0.430
gpl60 (alumas) 9/10 0.547	8/10 0.797	10/10 0.347
gpl60 (CFA) 10/10 1.130	10/10 1.967	10/10 1.317

Serokonvertavusių pelių skaičius (P) , lyginant 5 su bendru tirtų pelių skaičiumi (N), praėjus dienoms po imunizacijos 0.5 mikrogramais, 1 mikrogramu ir 5 mikrogramais ŽIV-1 VaxSyn™.

⁵ Vidutinė serokonvertavusių pelių serumų absorbcija (OT₄₅₀) , išmatuota IFA prieš gpl60, serumo praskiedimui esant 1:10.

PAVYZDYS

Neutralizacijos duomenys

ŽIV neutralizacijos analizė yra pripažintas metodas norint nustatyti ar antikūnų preparatas inhibuoja ŽIV1 virusą ir apsaugo nuo užkrėtimo jautrias žmogaus limfocitų kultūrų ląsteles. Gyvūnėlių, imunizuotų gpl60, antiserumai buvo tikrinami ŽIV-1 neutralizacijos analizės būdu; rezultatai susumuoti lentelėje, pateiktoje žemiau (6 lentelė).

LENTELĖ

Gyvūnas	Identifi- kacija	Imunogenas/A Mikrogramai⁶djuvantas	Neutralizuoj antis titras⁷
Rezus	G55	gpl20/Alumas 16/8/8	1:80-1:160
Rezus	H55	gpl20/Alumas 16/8/8	1:80-1:16
Rezus	L55	gpl60/Alumas 16/8/8	£1:80
Pelės
1:40-1:80	Mišinys 3	gpl20/Freund’o .25/.25/.25
Pelės	Mišinys 8	gpl60/Freund'o .1/.1/.1	1:40-1:80
J.kiau-	Išgry-
lytės	nintas IgG gpl60/Freund’o 10/10/10	1:320

⁶ gpl60 ar gpl20 kiekis mikrogramais pirmos/ antros/trečios imunizacijos metu.

⁷ Didžiausias antiserumo praskiedimas, kuris 50% stabdo užkrėtimą, lyginant su ŽIV-1 užkrėstomis ląstelėmis, kurios buvo laikomos neimunizuotų gyvūnų serume.

Jūrų kiaulytės, triušiai ir rezus beždžionės irgi buvo imunizuoti gpl 60 (su alumu arba Freund'o adjuvanto). Apskritai, šiuos gyvūnus imunizavus, buvo stebimas geras imuninis atsakas į ŽIV-1 apvalkalo baltymus.

PAVYZDYS

Imunogeniškumas šimpanzėse

Genetiškai šimpanzės yra artimiausi žmogaus giminaičiai. Šiuo metu tai vienintelis gyvūno modelis, tinkamas ŽIV-1 infekcijos tyrimams. Toksiškumo/imunogeniškumo bandymai buvo atliekami su trimis beždžionėmis; dvi buvo imunizuotos 40 mikrogramų arba mikrogramų gpl60 su alumu paruošta vakcina. Po 4 savaičių kiekviena jų buvo papildomai imunizuota, atitinkamai 40 mikrogramų arba 80 mikrogramų gpl60. Kontroliniam gyvūnui tuo pat metu buvo suleistas 1 ml druskos tirpalo. Kiekvieną savaitę buvo imami visų trijų šimpanzių kraujo pavyzdžiai ir tikrinama, ar yra antikūnų prieš gpl60 ir ŽIV-1 virusinius antigenus. Tam buvo atliktos trys imunologinės analizės: IFA, naudojant išgrynintą gpl60, sukurtą MicroGeneSys, Ine., Western Blot analizė ir komercinė ZIV-1 IFA analizė. Šių analizių duomenys yra pateikti žemiau.

A. IFA (MGSearch HIV 160)

IFA analizė MGSearch HIV 160 (MGSearch yra MicroGeneSys, Inc. of Meriden, Connecticut, U.S.A. prekybinis ženklas imunosorbentinei analizei prieš gpl60) yra aprašyta kartu paduotoje ir pasirašytoje paraiškoje JAV patentui, serijos Nr. 920,197 (dabar Nr. 585, 266) .

Serumo pavyzdžiai paimti prieš imunizaciją ir 11 savaičių po pirminės imunizacijos buvo praskiesti nuo 1:10 iki 1:100 000 ir inkubuoti su nitroceliuliozės juostomis, turinčiomis 100 ųg išgryninto gpl60 kiekviename taške. Galutinis titras - tai didžiausias antikūnų prieš gpl60 praskiedimas, kuriame testas davė teigiamus rezultatus, naudojant ožkos antikūnus prieš žmogaus IgG konjuguotus su šarmine fosfataze.

Serumo pavyzdžiai, paiimti iš kontrolinių bei bandomųjų gyvūnų prieš imunizaciją buvo neigiami. Šimpanzės, kuriai buvo suleista 80 mikrogramų dozė, serumas buvo teigiamas, praskiedus 1:100, antrą savaitę, o šimpanzės, kuriai buvo suleista 40 mikrogramų dozė, serumas buvo teigiamas, praskiedus 1:10, ketvirtą savaitę. Antikūnų prieš gpl60 titras didėjo iki 5-tos savaitės, kai galutinis titras atitinkamai buvo 1:100000 ir 1:2000000. Antikūnų titrai abiejuose gyvūnuose per 6-11 savaites nukrito labai nežymiai.

Toks atsako tipas yra ir kokybiškai ir kiekybiškai panašus į imuninį atsaką, stebimą šimpanzėse, paskiepytose vakcina prieš žmogaus hepatitą B.

B. Komercinis IFA testas θ

Iš šimpanzių, imunizuotų VaxSyn , serumų analizės MGSearch ŽIV 160 ELISA ir Western blot’o metodais, aišku, kad jose vyko serokonversij a ir buvo antikūnų prieš rekombinantinį gpl60. Siekiant ištirti, ar jose gaminami ir anti-ŽIV antikūnai, atpažįstantys natyviųs virusinio apvalkalo baltymus, serumai prieš imunizacija ir serumai paimti 1-11 savaitę buvo tikrinami licenzijuotame komerciniame IFA testų rinkinyje. (LAV EIA™ tęst kit of Genetic System Corparation, Seattle, Washigton). Gyvūno, imunizuoto 80 mikrogramų gpl60, serumas buvo teigiamas, praskiedus 1:100, 2-rą savaitę; antikūnų lygis jame ir toliau augo visas 6 savaites. Gyvūno, imunizuoto 40 mikrogramų gpl60, serumas, praskiedus 1:100, buvo teigiamas 6-tą savaitę.

PAVYZDYS

Antikūnų prieš gp!20 ir gp41 pasiskirstymas

Svarbu nustatyti, ar imuninis atsakas į gpl60 paskiepytame gyvūne nukreiptas prieš gp41, gpl20 ar prieš abu. Antikūnų prieš įvairius ŽIV-1

VaxSyn yra čia aprašytos MicroGeneSys, Ins. vakcinos prieš AIDS prekybinis ženklas.

apvalkalo baltymo regionus nustatymui ir jų lygio išmatavimui buvo naudojami įvairūs imunologiniai metodai, tarp jų radioimunoprecipitacij a (RIP), imunof luorescenci j a (IF), VJestern blot analizė (WB) ir kiekybinė IFA prieš tris skirtingus rekombinantinius apvalkalo antigenus.

fig. susumuoti trijų skirtingų rekombinantinių antigenų imuniniai reaktyvumai: [ART] [ TAB] (1) gpl20 — delta (sutrumpintas ŽIV-1 gpl20, kurio molekulės C-gale trūksta maždaug 40 amino rūgščių) ; [ ART] [ TAB] (2) gpl20 (pilno ilgio rekombinantinis ŽIV-1 gpl20) ir [ART] [TAB] (3) gpl60.

žmonių, turinčių antikūnus prieš ŽIV-1, serumai ir 3 sumaišyti žmonių serumai gerai reagavo į gpl60, vidutiniškai - į gpl20 ir silpnai arba visai nereagavo į sutrumpintą gpl20. Panašu, kad sutrumpintas gpl20, kuris sudaro daugiau nei 90% išorinio ŽIV1 glikoproteino, turi apsauginių determinančių. Tai, kad AIDS teigiami žmogaus serumai turi mažai antikūnų prieš šį apvalkalo regioną, atitinka faktą, jog imuninis atsakas nevisiškai apsaugo nuo virusinių infekcijų, o teigiami žmonių serumai paprastai rodo žemą neutralizuojančio aktyvumo lygį in vitro.

Priešingai, rezus beždžionių, imunizuotų arba imunogenu gpl60, arba sutrumpintu gpl20, serumuose yra antikūnų, reaguojančių tik su ŽIV-1 apvalkalo sutrumpinta gpl20 dalimi. Gali būti, kad tokie antikūnų atpažinimo saitų pasiskirstymo viruso apvalkale skirtumai ir aukštesni titrai, stebėti beždžionėse, yra aukštų neutralizuojančių titrų beždžionių serumuose priežastis.

Kiekybinis šių trijų rekombinantinių apvalkalo antigenų imuninio reaktyvumo žmogaus ir imunizuotų rezus beždžionių serumas įvertinamas yra parodytas 7 fig. Visi testuoti beždžionių serumai, tarp jų ir gyvūnų, imunizuotų gpl60, turėjo aukštą antikūnų prieš sutrumpintą gpl20 titrą (gpl20-delta).

Šie rezultatai rodo, kad rekombinantinis gpl60 sukelia imuninį atsaką rezus beždžionėse. Šis atsakas skiriasi nuo to, kuris paprastai atsiranda natūralių infekcijų metu. Baltymo gpl60 regione gpl20-delta yra epitopai, kurie efektyviai atpažįstami imunizuotose beždžionėse ir kurie nebuvo pastebėti žmogaus imuninėje sistemoje infekcijos metu. Šie nauji epitopai gali būti reikalingi apsisaugojimui nuo ŽIV-1 ir turėtų būti svarbi rekombinantinio gpl60 savybė, tinkama ŽIV-1 infekcijos profilaktikai bei gydymui.

PAVYZDYS

Vakcinos taikymas gydimui

Skiepijimo klonuotu ŽIV gpl60 (susintetintu bakuloviruso sistemoje pagal aukščiau aprašytą schemą) poveikis ŽIV užkrėstiems asmenims, buvo studijuojamas klinikinių bandymų su 30 pacientų, turinčių teigiamus ŽIV serumus, metu.

Skiepijimas rekombinantiniu gpl60 sukėlė gpl60 ŽIVspecifinio humoralinio ir ląstelinio imuninio atsako sustiprėjimą 19-oje iš 30 (63%) ŽIV-1 savanorių, kurių serumai buvo teigiami ŽIV. Keturiolikai iš 15 (93%) savanorių, kuriems buvo suleistos 6 vakcinos dozės, padidėjo bendras antikūnų prieš gpl60 kiekis. Todėl rekombinantiniai ŽIV baltymai (t.y. rgp41, rgpl20, rgpl60 ir jų priedai) gali būti sėkmingai naudojami pacientų, užkrėstų ŽIV, gydymui.

Efektyvius ŽIV-1 baltymo kiekius, taikytus šioje išradimo schemoje, galima nustatyti tradiciniais metodais, aprašytais žemiau. Apskritai, šie efektyvūs kiekiai gali kisti tarp apytiksliai 1 mikrogramo ir apytiksliai 100 mikrogramų vienam paciento svorio kilogramui. Vartojimo dažnumą irgi galima nustatyti tradicinėmis priemonėmis. Labiausiai tinkamas vartojimo būdas - parenteralus, t.y. leidžiama į veną, pilvaplėvę, raumenis, po oda ir t.t., kas gerai žinoma turintiems patirtį šioje srityje.

A. Savanorių atranka

Buvo atrinkta trisdešimt savanorių, užkrėstų ŽIV. Registruojami buvo tik tie asmenys, kurių serumas buvo teigiamas ir diagnozuota ankstyva ŽIV infekcijos stadija, vadinama Walter Reed Stage 1 arba 2 (daugiau nei 3 mėnesius CD4 ląstelių kiekis ne mažesnis nei 400: su arba be limfadenopati j os) . (Redfield, et ai., New Eng. J. Med. 314: 131-132 (1986). Pagal papildomus kriterijus buvo atrinkti 18-50 metų amžiaus suaugę savanoriai, turintys normalią kraujo formulę, be akivaizdžių pagrindinių organų ligų, nepiknaudžiavę alkoholiu bei narkotikais pastaruosius 12 mėnesių ir nevartoję antiretrovirusinių bei imunomoduliuoj ančių vaistų. Prieš atsitiktiniu būdu paskirstant į gydomąsias grupes, visų pacientų būklė buvo vertinama mėnesius. Bandymo metu nei vienas savanoris negavo jokių antiretrovirusinių ar imunomoduliuoj ančių vaistų.

Iš 30 savanorių dvidešimt šeši buvo vyrai, 4 - moterys. Tarp jų buvo keturiolika kaukaziečių, 13 juodaodžių ir ispanų rasės atstovai. Vidutinis amžius 29 metai (intervalas 18-24). Registracijos pradžioje savanoriams buvo diagnozuota Walter Reed Stage 1 ir 22 - Walter Reed Stage 2. Pradinis vidutinis CD4 kiekis buvo 668 (intervalas 388-1639). Vidutinis laiko tarpas tarp pradinės diagnozės ir studijų pradžios buvo 24 mėnesiai (intervalas - nuo 3 iki 49 mėnesių).

B. Vakcina ir imunizavimo schema

Šiame dokumente aprašytą, bandomąją vakciną sudaro neinfekcinis subvienetinis glikoproteinas, kilęs iš gpl60 - bakuloviruse ekspresuojamo rekombinantinio baltymo. Imunogeninis baltymas buvo susintetintas Lepidoptera vabzdžių ląstelėse, išgrynintas biocheminiais būdais ir adsorbuotas prie aliuminio fosfato. Taip buvo gauta galutinė vakcinos forma.

Buvo naudotos trys gpl60 dozės: 40 mikrogramų mililitrui, 160 mikrogramų mililitrui ir 320 mikrogramų mililitrui. Injekcijos tūris buvo 1 ml tiek 40 ųg, tiek 160 ųg dozėms; (320 ųg/mililitrui) 640 ųg dozės injekcijoms buvo naudojamos 2 ml tūris.

Trisdešimt savanoriu buvo suskirstyti į šešias grupes po penkis savanorius kiekvienoje grupėje. Imunizacijos buvo atliekamos pagal tokias schemas: schema A, kur skiepijimą 0, 30 ir 120 dienomis; ir schema B, kur skiepijama 0, 30, 60, 120, 150 ir 180 dienomis.

Skiepijant pagal abi imunizacijos schemas (A ar B), buvo sudarytos trys grupės, kuriose pacientai gaudavo skirtingas vakcinos dozes (7 lentelė). Skiepijama buvo į trikampius raumenis. Tyrimai truko 10 mėnesių:

mėnesius - pradinis įvertinimas ir 8 mėnesius stebėjimai po pirminio paskiepijimo.

LENTELĖ - imunizacijos schema

Suleisto gpl60	kiekis	(hg)
Diena	0	30	60	120	150	180
Schema A
Grupė 1	40	40		40
Grupė 3	160	160		160
Grupė 5	640	640		640
Schema B
Grupė 2	40	40	40	160	160	160
Grupė 4	160	160	160	640	640	640
Grupė 6	640	640	640	640	640	640

C. Saugumo ir toksiškumo įvertinimas

Visi savanoriai buvo apklausti ir ištirti 0, 1, 2, 3, ir 30 dienomis po kiekvienos injekcijos. Savanorių buvo teiraujamasi dėl karščiavimo, peršalimo, šleikštulio, pykinimo, artralgijos (sąnarių skausmų), mialgijos (raumenų skausmų), negalavimų, dilgėlinės, dusulio, galvos svaigulio ar galvos skausmo. Vietinės reakcijos vaistų suleidimo vietoje buvo vertinamos pagal eritemą, patinimą, niežulį, skausmą ir padidintą jautrumą, odos spalvos pakitimą, odos sutrūkimą, regioninės limfadenopatijos pakitimus, galūnės, i kurią buvo injekuota, funkcijos pakitimus, poodinių mazgelinių sustorėjimų atsiradimą injekcijos vietoje.

Be to, kas mėnesį buvo vertinama pilna kraujo formulė, serumo cheminiai parametrai, kraujo krešėjimo greitis, atliekama šlapimo analizė.

Ląstelių imuninė funkcija in vitro buvo įvertinta, fenotipuojant T-ląsteles (bendrus limfocitus, CD4 ir CD8 ląstelių fenotipus) pagal Rickman, et ai., Clinical Iitununo. 52: 85-95, 1989; Birx, et ai., J. Acguir. Immune Defic. Syndr. 4:188-196, (1991). T-ląstelių dauginimasis, sukeltas mitogenų (amerikietiškoji fitolaka ir Con A) bei kontrolinių antigenų (Candida albicans ir stabligės), irgi buvo įvertinatas. Birx et ai., supra. Ląstelių imuninė funkcija in vivo buvo įvertinta sulėtinto hipersensityvumo odos testais prieš kontrolinius antigenus (t.y. kiaulytės virusas, stabligės toksoidas, Candida albicans ir trichofitonas).

Periferinio kraujo vienbranduolės ląstelės (PKVL) ir plazmos virusinės kultūros buvo kiekybiškai įvertintos pagal Burke, et ai., J. Acguir. Immune Defic. Syndr. 3: 1159-1167, 1991. DNR polimerazinė grandininė reakcija (Wages, et ai., J. Med. Virol. 33: 58-63, 1991) ir p24 antigeno lygis serume buvo nustatyti tam, kad būtų galima įvertinti ŽIV viruso kiekį in vivo.

Nebuvo pastebėta ryškaus sistemos toksiškumo, bet vietinės reakcijos buvo konstatuotos 87 procentams pacientų (13 kiekvienoje skiepytoje grupėje). Vietinės reakcijos apėmė sukietėjimus, padidintą jautrumą, ir laikinų poodinių mazgelių atsiradimą injekcijos vietoje; regioninės adenopatijos sustiprėjimas buvo retas. Nei vienas asmuo neatsisakė nuo pakartotinų injekcijų. Vietinių reakcijų dažnumas nepriklausė nuo pirminės imunizacijos, papildomų injekcijų ir dozavimo.

Aiškių pašalinių poveikių imuninei sistemai nebuvo konstatuota, nei in vitro matuojant mitogeno ir antigeno specifinius proliferacinius atsakus, nei - in vivo sulėtinto hiperjautrumo odos reakcijoje ar pagreitėjusiame CD4 tipo ląstelių pašalinime. Pirminis vidutinis CD4 ląstelių kiekis buvo 716 ir 605, atitinkamai. CD4 ląstelių kiekio vidurkis jautriuose ir nejautriuose vakcinai asmenyse paskaičiuotas 180240 dienomis buvo 714 ir 561, atitinkamai. Per 240-ies dienų eksperimentą grynas CD4 ląstelių kiekio vidurkio pokytis buvo minus 0.2 procentai vakcinai jautriuose pacientuose, tuo tarpu nejautriuose CD4 ląstelių kiekio vidurkis sumažėjo 7.3 procentais (11 fig.). Viso bandymo kurso metu nei viename atskirame atvejyje vakcinos sukeltas imunogeniškumas prieš ŽIV nepriklausė nuo pagreitėjusio CD4 tipo ląstelių pašalinimo. ŽIV viruso replikacijos ir viruso susikaupimo galimybės vertinimui po paskiepijimo buvo išmatuotas virusinis aktyvumas, kiekybiškai įvertinus plazmą ir PKLV virusines kultūras, PKLV DNR amplifikavimą polimerazinės grandininės reakcijos būdu ir p24 antigeno lygį serume. Kiekybinė kultūrų ir DNR amplifikacijos polimerazės grandininės reakcijos analizė neparodė jokių pakitimų viso bandymo metu. Antigenas p24 nebuvo surastas šių asmenų serume.

D. Imunogeniškumo įvertinimas

Antikūnai prieš bendrus ŽIV baltymus buvo išmatuoti naudojant ir rekombinantiniu būdu pagamintus viruso geno produktus gpl60, p66, p24 ir bendrą prototipinio

ŽIV štamo MN virusinį lizatą. Dot blot'as ir Western blot'as buvo atliekami pagal Toubin, et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354 (1979). Be to, buvo išmatuoti imuniniai atsakai į specifinius apvalkalo epitopus (žr. fig. 7).

Fig. 7 buvo atrinkti epitopai 88 (amino rūgštys 8889 baltyme gpl20) ir 448C (amino rūgštys 448514 baltyme gpl20), kadangi yra duomenų, jog antikūnai prieš šiuos gpl20 regionus turi savitarpio ryšį su ankstyvąja ŽIV infekcijos stadija.

Epitopai 106 (aminorūgštys 106-121 baltyme gpl20), 241 (aminorūgštys 241-272), 254 (aminorūgštys 254-272), 300 (aminorūgštys 300-340), 308 (aminorūgštys 308-322), 422 (aminorūgštys 422-454) ir 735 (aminorūgštys 735752) buvo atrinkti dėl jų spėjamos funkcinės svarbos. Epitopai 106 ir 422 dalyvavo CD4 prijungime; epitopai 241, 254 ir 735 dalyvavo grupių specifinėje neutralizacijoje, o epitopai 300 ir 308 dalyvavo tipų specifinėje neutralizacijoje.

Epitopas 582 (aminorūgštys 582-602) buvo pasirinktas kontroliniu, kadangi jis atstovauja imunodominuojantį apvalkalo domeną natūralioje ŽIV infekcijoje. Papildomai buvo ištirti 49 (aminorūgštys 49-128) ir 342 (aminorūgštys 342-405) epitopai.

Fig. 7a taškuoti kvadratėliai rodo imuninio atsako, nukreipto į ŽIV apvalkalą, dokumentais patvirtintą pokytį. Kvadratėliai su (-) žymi pirminį humoralinį atsaką; taškuotas kvadratėlis su (+) žymi antrinį humoralinį atsaką; (-) žymi antikūnus, nesąveikaujančius su specifiniais epitopais nei prieš, nei po imunizacijos; (+) žymi antikūnus sąveikaujančius su specifiniais epitopais prieš imunizaciją ir po jos, bet be kiekybinių pakitimų. Taškuose stulpelis su (.) žymi naują T-ląstelių proliferacinį atsaką į imunizaciją gpl60. Vienas (.) žymi imuninio atsako į gpl60 nebuvimą tuo tarpu hb žymi high background (neįmanoma interpretuoti); nd žymi not done (nepadaryta).

Neutralizacijos aktyvumas buvo matuojamas prieš tris prototipinius izoliatus (ŽIV-IIIB, RF ir MN) , analizuojant sincitijų inhibiciją pagal Nara, Nature, 333: 469-470 (1988). ŽIV specifinis ląstelinis atsakas buvo išmatuotas įprasta limfocitų proliferacinės analizės technika, naudojant gp!60, p24 ir bakuloviruso ekspresinės sistemos kontrolinius baltymus (Birx, supra).

E. Vakcinai jautrus ir nejautrus individai

Individai buvo laikomi jautriais vakcinai tik tuomet, jei atsikartojantis selektyvus ląstelinio bei humoralinio imuninio atsako į ŽIV apvalkalo specifinius epitopus sustiprėjimas priklausė nuo skiepijimo serijų (7 fig.). Vakcinos sukeltas humoralinis imunitetas buvo apibrėžtas kaip serokonversij a prieš specifinius epitopus ir/ar antrinis imuninis atsakas prieš specifinius apvalkalo epitopus. Vakcinos sukeltas ląstelinis imunitetas buvo apibrėžtas kaip naujo, atsikartojančio, vakcinos sukelto proliferacinio atsako į gpl60, atsiradimas^{* 9} nejautriais asmenimis buvo laikomi tie kuriuose neatsirado nei humoralinio, nei ląstelinio proliferacinio atsako, arba išsivystė vien tik humoralinis ar vien tik ląstelinis proliferacinis atsakas i gpl60 epitopus ar ŽIV apvalkalą.

ŽIV apvalkalo pastiprinantis

Vakcinai asmenys,

F. Vakcinos sukeltas humoralinis atsakas

Remiantis fig. 7, 19 iš 30 asmenų (63 procentai) buvo stebimas vakcinos sukeltas specifinio humoralinio bei ląstelinio imuninio atsako į gpl60 ŽIV sustiprėjimas. Šie 19 individų buvo laikomi jautriais vakcinai. Keturiems iš 11 vakcinai nejautrių asmenų atsirado vien tik humoralinis arba vien tik ląstelinis imuninis atsakas. Visi 7 asmenys, kuriuose nepavyko aptikti jokių vakcinos sukeltų atsakų, buvo gavę tik 3 dozes ⁹ Toks vakcinai jautraus individo apibrėžimas yra labai ribotas šio bandymo mokslinių tikslų šviesoje: pvz., Įvertinti imunizacijos po užkrėtimo pagristumą.

(Schema A) . Nebuvo rasta pokyčių antikūnams jungiantis prie ŽIV polimerazės (p66), nei struktūriniuose (p24) genų produktuose ar ne-ŽIV kontroliniame stabligės antigene. Nei vieno individo organizme antikūnų prieš bakuloviruso-Lepidoptera baltymus.

nesusidarė sistemos

Apvalkalo baltymų (gpl60) kiekio padidėjimas buvo rastas 13 individų Western blot'o analizės metodu,

ŽIV-MN. Pakitimai

Trys iš 15 individų schemą A, o 10 iš naudojant bendrą viruso lizatą priklausė nuo imunizacijos schemos.

(20 procentų) buvo skiepyti pagal individų (67 procentai) - pagal schemą B. Skiepijant pagal schemą B, išaugo antikūnų prieš apvalkalo baltymus kiekis (P=0.025 pagal tikslų Fišerio testą, dviejų sigmų taisyklė). Visi 13 individų irgi serokonvertavo prieš specifinius apvalkalo epitopus.

Priešingai, iš 10 asmenų, kuriems nepavyko serokonvertuoti nei prieš vieną specifinį apvalkalo epitopą, nė viename nebuvo pastebėtas padidėjęs apvalkalo baltymų kiekis, analizuojant Western blot'u. Kiti 7 individai, kurie serokonvertavo prieš specifinius apvalkalo epitopus, neparodė pakitimų bendruose antikūnuose prieš viruso apvalkalą, analizuojant Western blot'u. Antikūnai, nukreipti prieš neapvalkalinius ŽIV baltymus, nebuvo pakitę nei vieno individo organizme.

Keturiolikai iš 15 individų (93 procentai), skiepytų pagal schemą B (6 dozės), padidėjo bendras antikūnų prieš gpl60 kiekis. Tuo tarpu grupėje, gydytoje pagal schemą A (3 dozės) tokie buvo tik 7 iš 15 asmenų (47 procentai) (P=0.01 pagal Fišerio testą, dviejų sigmų taisyklė) (7 fig.).

Iš 8 fig. matyti, kad laiko tarpe nuo prieš imunizacijos iki po paskiepijimo kiekvieno gpl60 specifinio epitopo pasiskirstymas buvo toks: epitopas 49 (27 - 70 procentų), epitopas 88 (28 52 procentai), epitopas 106 (50 - 87 procentai), epitopas 214 (0 - 14 procentų) , epitopas 254 (0 13 procentų), epitopas 300 (47 - 77 procentai), epitopas 308 (42 - 69 procentai), epitopas 342 (0 27 procentai), epitopas 422 (3 - 10 procentų), epitopas 448C (73 - 87 procentai) ir epitopas 735 (17 30 procentų). Vakcinos sukelta serokonversija buvo nukreipta prieš visus specifinius epitopus, išskyrus epitopą 582 (7 fig.). Antikūnai (serekonversija) nukreipti prieš epitopus 241, 254 ar 342, buvo aptikti tik po kito skiepijimo.

Antrinis imuninis atsakas buvo nukreiptas prieš tokius epitopus: 88, 106, 300, 448C ir 582. Prieš skiepijimą antikūnų prieš epitopą 582 paplitimas buvo 100 procentų ir tik vienam individui (3 procentai) buvo stebimas antrinis imuninis atsakas.

Vakcinos indukuotų antikūnų prieš ŽIV apvalkalo epitopus skalė įvairavo (fig. 7) . Pirminis imuninis atsakas (serokonversij a) bent prieš vieną epitopą atsirado 20 individų; 14 iš 15 gydytų pagal schemą B ir 6 iš 15, kuriems atsitiktiniu būdu buvo parinkta schema A (P=0.005 Fišerio testas, 2-jų sigmų taisyklė). Individai, gydyti pagal schemą A, serokonvertavo tik prieš 15 iš 110 (14 procentų) galimų epitopų, prieš kuriuos jie neturėjo priešimunizacinių antikūnų. Individai, gydyti pagal schemą B, serokonvertavo prieš 60 iš 129 (47 procentai) (p<0.0001 Fišerio testas, 2-jų sigmų taisyklė) epitopų. Serokonversij a prieš tris ar daugiau apvalkalo epitopų Įvyko 9 individams (60 procentų), gydytiems pagal schemą B ir tik 2 asmenims (13 procentų), gydytiems pagal schemą A (p=0.02 Fišerio 2-jų sigmų taisyklė).

Serumo neutralizuojantis aktyvumas prieš tris skirtingus štamus (ŽIV-IIIB, MN ir RF) buvo konstatuotas 7 asmenyse 0, 90 ir 195 dienomis. Keturiems iš vakcinai jautrių individų didėjo neutralizuojantis aktyvumas prieš vieną ar daugiau izoliatų. Be to, vakcinai jautrūs individai geriau inhibavo sincitijų formavimąsi,, nei vakcinai nejautrūs individai.

G. Vakcinos sukeltas ląstelinis atsakas

Pakitimai ląsteliniame imuniniame atsake buvo nustatomi, lyginant vidutinį limfocitų stimuliacijos indeksą (LSI) prieš skiepijimą (pradinis) ir po skiepijimo Wilcoxon'o eilės sumavimo metodu.

Dvidešimt vienam iš 30 individų (70 procentų) atsirado naujas T ląstelių proliferacinis atsakas į gpl60 postimunizaciją (7 fig.).

Fig. 9 iliustruoja proliferacinius atsakus į gpl60, p24 ir bakuloviruso kontrolės baltymą keturiems tipiškiems vakcinai jautriems individams, bėgant laikui. Visiems individams gpl60 sukelta proliferacija išaugo nuo pradinio vidutinio LSI lygaus 3 iki LSI lygaus 10 (paskaičiuota pagal vidurkį, gautą iš 4 reikšmių po paskutinės imunizacijos) . Priešingai, nebuvo pastebėta proliferacinių atsakų, nukreiptų į ŽIV p24 baltymą ar į kontrolinį bakuloviruso baltymą.

Fig. 10. rodo vakcinos sukeltus vidutinių LSI reikšmių pakitimus visiems individams, bei individams, sugrupuotiems pagal jautrumą vakcinai ir pagal imunizacijos schemą.

Vakcinai jautrių ir nejautrių individų proliferacinio atsako į gpl60 pakitimai aiškiai skyrėsi (<0.001, Wilcoxon, vienos sigmos taisyklė). Proliferacinis individų, gydytų pagal schemą B (6 dozės), atsakas į gpl60, buvo stipresnis nei individų, gydytų pagal schemą A (3 dozės) (P<0.10, Wilcoxon, vienos sigmos taisyklė).

Devyniolikai iš 21 individo, kuriuose atsirado proliferacinis atsakas į gpl60, pastebėtas ir humoralinis atsakas (vakcinai jautrūs individai). Visų vakcinai jautrių individų maksimalus vidutinis limfocitų stimuliacijos indeksas (LST) i gpl60 buvo 50.1. Vis dėl to visi vakcinai jautrių individų atsakai buvo variabilūs (LSI reikšmės kito intervale nuo 3 iki 171) (fig. 7) . Taip pat variabilūs yra laikinas santykis tarp ląstelinio atsako į gpl60 dydžio bei trukmės (fig. 9) ir vakcinavimo.

H. Rezultatų aptarimas

Nepaisant ribotos šio bandymo apimties, buvo parodyta, kad keliolika faktorių siejasi su vakcinos imunogeniškumu. Šeši iš 15 (40 procentų) individų, gydytų pagal schemą A, lyginant su 13 iš 15, gydytų pagal schemą B, buvo jautrūs vakcinai (P=0.02 Fisher'io testas, 2-jų sigmų taisyklė) (pav. 7). 13 iš 16 individų (procentais), kuriuose vidutinis pradinis CD4 kiekis buvo didesnis nei 600 viename mililitre, buvo jautrūs vakcinai, tuo tarpu 6 iš 14 (43 procentai) individų, kuriems vidutinis pradinis CD4 kiekis buvo mažesnis nei 600/mililitrui (p=0.07 Fisher'io. dvi sigmos) buvo nejautrūs vakcinai. Lentelėje 8 reziumuojama, kad daugkartinės imunizacijos pagerino imunogeniškurną net tiems pacientams, kurių vidutinis pradinis CD4 kiekis buvo mažesnis nei 600/mililitrui. Pavyzdžiui, 5 iš 6 individų, imunizuotų pagal schemą B (6 injekcijos) buvo jautrūs vakcinai, lyginant su 1 iš 8, gydytų pagal trijų injekcijų režimą (schema A) (p=0.03 Fisher'io, dviejų sigmų taisyklė) (8 lentelė).

LENTELĖ

Imuninis atsakas į	qp!60 vakciną pagal pradinį CD4 kiekį ir
imunizacijos	schemą
CD4 kiekis	N	Jautrių individų	Nejautrių individų
		skaičius, %	skaičius, %
SCHEMA A
>600	7	5 (71%)	2 (29%)
500-600	5	1 (20%)	4 (80%)
<500	3	0 (0%)	3 (100%)
Viso	15	6 (40%)	9 (60%)
SCHEMA B
600	9	8 (89%)	1 (11%)
500-600	2	2 (100%)	0 (0%)
<500	4	3 (75%)	1 (25%)
Viso	15	13 (87%)	2 (13%)
IŠ VISO	30	19 (63%)	11 (37%)
Gydymui vakcinas	19-tame amžiuje	pradėjo naudoti
Pasteras.	Jis	taikė vakciną	ūmios pasiutligės

infekcijos gydymui. Tačiau vakcinų tinkamumas kitų infekcijų gydymui nebuvo plačiai tyrinėjimas. Nors yra virusinio specifinio imuniteto postinfekcinės modifikacijos pavyzdžių (po Hepatito A ir B), deja, nėra atliktų ir tinkamai dokumentais patvirtintų tyrimų, kurie parodytų, kad tikslinga vakcinas taikyti žmogaus ūmių ar lėtinių virusinių infekcijų gydymui.

Aktyviai imunizuojant po užsikrėtimo pagal šį išradimą imuninė modifikacija. Iš gpl60 vakcina sustiprino humoralinį ir ląstelini atsiranda virusinė-specifinė ŽIV apvalkalo geno kilusi žmogaus virusinį specifinį atsakus 19 iš 30 asmenų, kuriems diagnozuota ankstyva ŽIV stadija.

Šiame darbe buvo kokybiškai lyginami skirtingi imuniniai atsakai į specifinius ŽIV epitopus natūralioje infekcijoje ir imunizavus po užsikrėtimo. Tuo būdu, tiksliai nustačius vakcinos sukeltą humoralinį imunogeniškurną jau užkrėstuose individuose, buvo dokumentais patvirtinta, kad jis atsirado 70 procentų individų. Pavyzdžiui, dvidešimt individų (19 jautrių vakcinai ir 1 nejautrus) serokonvertavo prieš specifinius apvalkalo epitopus. Serokonversij a, priklausanti tik nuo skiepijimo (epitopai 241, 254 ir 342), buvo patebėta 10 individų.

Be to, humoralinio atsako į šią vakciną variacijos, nustatytos identifikuojant pektyvas tolimesnei eigai imuninio atsako analizei prielaidas nesukeliamų zavimui.

galimų imunoreguliatorinių natūralios infekcijos metu, epitopus, atvers persir efektyviai specifinio bei sudarys unikalias mechanizmų, charakteriNors serumo neutralizuojančio aktyvumo svarba in vivo kol kas nežinoma, 4 iš 5 vakcinai jautrių individų pastebėtas padidėjęs neutralizuojantis aktyvumas prieš skirtingus ŽIV štamus (IIIB, RF, MN) pasiūlė prielaidą, kad poinfekcinė imunizacija sukėlė pakitimus funkciniuose antikūnuose. Bandomoji vakcina sukėlė serumo neutralizuojančio pajėgumo prieš skirtingus ŽIV štamus padidėjimą ir, matyt, padės nustatyti grupinius specifinius neutralizuojančius epitopus.

Proliferacinis atsakas į ŽIV apvalkalo baltymus natūralios ŽIV infekcijos atveju kyla retai. Tačiau po imunizacijos gpl60, specifinis T-ląstelių proliferacinis atsakas buvo užregistruotas 21 (70 procentų) individų. Tokio skirtumo priežastis nėra aiški. Viena galima priežastis yra tai, kad naujas proliferacinis atsakas gali būti nukreiptas prieš apvalkalo epitopą (us), kurie yra unikalūs šiai vakcinai (vakcinos gamybos metodologijos ar alternatyvaus antigeno procesingo in vivo rezultatas). Priešingai, baltymas, naudotas proliferacijos analizėje, negali stimuliuoti pirminio T-ląstelių proliferacinio atsako į homologinius natūralaus viruso laukinio tipo apvalkalus. Tačiau buvo gauti papildomi įrodymai, kad vakcina sustiprina ląstelinį imuninį atsaką: atrinktuose vakcinai jautriuose individuose kilo tipų specifiniai citoksiniai T-ląstelių atsakai į ŽIV-IIIB po stiprinančios imunizacijos.

Faktoriai, lemiantys imuninį jautrumą vakcinai ŽIV užkrėstuose individuose, ir toliau turi būti tiriami. Net ankstyvoje ŽIV infekcijos stadijoje individai prasčiau reaguoja į įvairias vakcinas, lyginant su kontrole. Toks žemas jautrumas siejamas su ankstyvu B ląstelių išsigimimu ir T ląstelių funkciniais sutrikimais. Čia jautrumas vakcinai buvo susietas su pradiniu CD4 ląstelių kiekiu, kuris atitinka hipotezę, kad imunologinė šeimininko būklė yra svarbi determinantė, sąlygojanti jautrumą vakcinai. Tačiau imunizacijos schema (pagal specifinį T ląstelių kiekio intervalą) irgi turėjo įtakos jautrumui vakcinai:

(6 injekcijos) buvo pranašesnė. Iš tiesų, jautrumas vakcinai, stebėtas mažesnį CD4 ląstelių kiekį, sustiprintas, padidinus skiepijimų skaičių. Iš to galima padaryti prielaidą, kad toliau keičiant dozavimą, režimą, adjuvantus ar vaistinę formą galima schema B sumažėjęs turintiems individams, gali būti tikėtis imuninio jautrumo sustiprėjimo. Nors ir buvo susirūpinta, ar saugu ŽIV specifiniais vakcinos produktais aktyviai imunizuoti asmenis, užkrėstus ŽIV, imuninis specifinis toksiškumas nebuvo įrodytas. Kiekybinė kultūros, grandininės polimerazinės DNR reakcijos ir serumo antigeno analizė parodė padidėjusį ŽIV kiekį in vivo. Puikus ŽIV replikacijos in vivo markeris, CD4 ląstelių mažėjimo rodiklis, tinkamai pakito pacientų organizme, ypač tų, kurie laikomi jautriais vakcinai. Vidutinis CD4 ląstelių kiekio pakitimas buvo -0.2 procentai vakcinai jautriems individams ir -7.3 procentai - nejautriems. Duomenys parodė, kad imuninis jautrumas po užsikrėtimo nebuvo susijęs su padidėjusia CD4 ląstelių destrukcija. Buvo padaryta prielaida, kad tai siejasi su padidėjusia HIV replikacija in vivo.

Šiose stadijose skiepijimo rezultatai taip pat buvo lyginami su pradiniais duomenimis, gautais iš dešimties užsikrėtusių ir negydytų asmenų, sugrupuotų pagal amžių, etninę grupę ir pradinį CD4 ląstelių skaičių. Vidutinis CD4 ląstelių kiekis šioje tyrimų grupėje sumažėjo 8.7 procentais, individuose, gydytuose pagal schemą A sumažėjo 7.2 procentais ir individuose, gydytuose pagal schemą B išaugo 0.6 procentais. Šie rezultatai rodo, kad skiepijimas rekombinantiniu ŽIV apvalkalo po užsikrėtimo yra galimas. Gauti rezultatai teikia vilčių, kad tokias vakcinas galima naudoti profilaktikoje.

sistemoje.

išgryninti, aliuminio

Vakcina prieš įgytą imunodeficito sindromą (AIDS), turinti 1 tipo žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV-1) apvalkalo baltymus yra kilusi iš ŽIV-1 apvalkalo geno, klonuoto bakuloviruso-vabzdžių ląstelės vektorinėje Rekombinantiniai ŽIV baltymai yra surinkti į daleles ir adsorbuoti ant fosfato adjuvanto. Gauta adsorbuoto rekombinantinio ŽIV-1 viruso apvalkalo baltymo forma (vakcina prieš AIDS) yra labai imunogeniška gyvūnams ir skatina antikūnų, prisijungiančių prie ŽIV-1 viruso apvalkalo, gamybą, o taip pat neutralizuoja užkrėtimą virusu testuose in vitro. Aukščiau aprašyta vakcina prieš AIDS sukelia naujus humoralinius ir ląstelinius imuninius atsakus ŽIV-užkrėstuose pacientuose ir yra naudinga, kaip gydomoji vakcina, skirta imuninės sistemos irimui išvengti arba jį sulėtinti.

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

Claims

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. Kompozicija, tinkama taikyti farmacijoje individų, užkrėstų žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) gydymui, besiskirianti tuo, kad į jos sudėti, įeina:

rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas, kurio kiekis pakankamas ŽIV-specifinio ląstelinio ar imuninio humoralinio atsako padidinimui.
2. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas yra gaminamas bakuloviruso-vabzdžių ląstelės ekspresinėje sistemoje.
3. Kombinacija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas yra apytiksliai 145000 molekulinio svorio.
4. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad ŽIV apvalkalo baltymas yra bent vienas iš gpl60, gpl20 ir gp41.
5. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas yra ekspresuojamas bakuloviruso vabzdžių ląstelės vektoriumi Ac3046.
6. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas yra aglomeruojamas į daleles, kurių molekulinis svoris mažiausiai apytiksliai 2000000.
7. Kompozicija pagal 1 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas jungiamas prie adjuvanto.
8. Kompozicija, tinkama užkrėstų žmogaus imunodeficito virusu (ŽIV) gydymui, besiskirianti tuo, kad į jos sudėtį įeina rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas ir alumo adjuvantas, kai rekombinantinis baltymas sudaro daleles, kurių molekulinis svoris mažiausiai yra apytiksliai 2000000.
9. Kompozicija pagal 8 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas yra gaminamas bakuloviruso-vabzdžių ląstelės ekspresinėje sistemoje.
10. Kompozicija pagal 8 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas yra atrenkamas iš grupės, susidedančios iš rekombinantinio gpl60, rekombinantinio gpl20, rekombinantinio gp41, rekombinantinio ŽIV apvalkalo baltymo, kurio molekulinis svoris apytiksliai 145000 ir rekombinantinio baltymo, ekspresuoto vektoriuje Ac3046.
11. Kompozicija pagal 8 punktą, besiskiriant i tuo, kad rekombinantinis baltymas sudarytas iš apytiksliai 757 gpl60 viena po kitos einančių aminorūgščių ir kuriame visiškai pašalinta apytiksliai 40 viena po kitos einančių galinių aminorūgščių.
12. Terapinė vakcinos prieš ŽIV kompozicija, besiskirianti tuo, kad į jos sudėtį įeina rekombinantinis ŽIV apvalkalo baltymas ir alumo adjuvantas, kai rekombinantinis baltymas yra aglomeruojamas į daleles, kurių molekulinis svoris mažiausiai apytiksliai 2000000.
13. Kompozicija pagal 12 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinio ŽIV apvalkalo baltymo kiekis yra apytiksliai nuo 10 ųg iki 4000 ųg dozėje.
14. Kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas yra gaminamas bakuloviruso-vabzdžių ląstelės ekspresinėje sistemoje.
15. Kompozicija pagal 13 punktą, besiskirianti tuo, kad rekombinantinis baltymas sudarytas iš apytiksliai 757 gpl60 viena po kitos einančių aminorūgščių, gpl60 baltymas nutrauktas apytiksliai 757 pozicijoje, ir jame visiškai nėra bent 40 gpl60 galinių aminorūgščių.