BG98583A

BG98583A - Изостерни пептиди

Info

Publication number: BG98583A
Application number: BG98583A
Authority: BG
Inventors: Butrus Atrash; David Jones; Michael Szelke
Original assignee: Aktiebolaget Astra
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 1994-09-30
Also published as: AP313A; SK23394A3; TNSN92076A1; NZ243675A; SI9200193A; AP9200418A0; EP0605462B1; IS3906A; HUT66060A; FI940945A0; MA22632A1; EP0605462A1; MX9204767A; JPH06510059A; DE69232394T2; FI940945A7; ATE212643T1; FI940945L; TW221816B; DE69232394D1

Abstract

Изобретението се отнася до нови инхибитори на тромбин, до синтеза им, до фармацевтичните състави, съдържащи съединенията като активно вещество, и до приложението им като антикоагуланти при профилактиката и лечението на тромбоемболичните заболявания.Инхибиторите са с формула в която а означава -сн2-, -сн = сн-, -сн2 сн2 или -сн2 сн2 сн2, у означава о или s(о)р, където р е 0, 1 или 2, а значенията на r1, r2, r3, r4 и м са посочени в описанието. Те могат да се използват самостоятелно или под формата на физиологичноприемливи соли, включително и стереоизомери.

Description

Изобретението се отнася до нови комттн&ни инхибитори на тромбин, до синтеза им, до фармацевтични състави, съдържащи съединенията като активна съставка и до приложението на тези съединения като антикоагуланти за профилактика и лечение на тромбоемболичните заболявания като венозна тромбоза, белодробна емболия, артериална тромбоза, по-специално при инфаркт на миокарда, общи състояния на хиперкоагулация и местни хиперкоагулантни състояния, например след англиопластика и коронарни байпасни операции.

2. ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Коагулацията на кръвта е ключов процес, вземащ участие както при хемостазата (т.е. предпазване от загуба на кръв от повредени кръвоносни съдове), така и при тромбозата (т.е. патологично запушване на кръвоносен съд от кръвен съсирек). Коагулацията е в резултат на сложна серия от ензимни реакции, посочени в Схема 1, при които различните съсирващи фактори са означени с римски цифри.

Тромбинът играе централна роля в коагулацията, независимо дали процесът е предизвикан от вътрешни или външни причини: той активира тромбоцитите, превръща фибриногена във фибринови мономери, които полимеризират спонтанно в нишки и активира FXIII, който на свой ред създава напречни връзки в полимера до неразтворим фибрин. По-нататък фибринът активира FV и FVIII в реакция за положителна обратна връзка.

Ето защо се очаква, че инхибиторите на тромбина ще са активни антикоагуланти. Първите инхибитори на тромбин, на базата на електрофилни кетони са разработени, както е описано от М. Szelke and D.M.Jones in EP-A10,118,280, GB приоритетна дата 04.03.1983. Тези по-ранни съединения са получени от Р3 - Р2‘ пентапептидната последователност на веригата на фибриноген Аа, в която разцепващата се пептидна връзка Pi - Pf се замества с групата -CO-CHg-, образуваща кетоизостер на съответните пептиди.

Други известни примери на инхибитори на серин протеиназа, на базата на електрофилни кетони, са дадени по-долу:

(а) M.Kolb et al. (Merrel-Dow) EP-A2-),195,212 (приоритетна дата 04.02.86) описващ пептидни α-кетоестери и амиди, (б) В.Imperial! and R.H.Abeles, Biochemistry 1986. 25. 3760 (пептидил флуороалкил кетони), (в) Ueda et al., Biochem. J. 1990. 265.539 (пептидил флуороалкил кетони), (г) D.Shirlin et al. (Merrel Dow) EP-A1-0,362,002 (приоритетна дата 01.09.88) описващ флуороалкил амидни кетони,

-3Схема 1

Външна система

Протромбин Тромбин

FII

Фибриноген Фибрин

FI (разтворим)

F Па

F ХШа-.---F XIII

Фибрин (Неразтворим)

-4(д) Р. Bey et al. (Merrel Dow) EP-A2-0.364.344 (приоритетна дата 07.10.88) описващ α, β, δ-трикето съединения, (е) Ε.Ν. Shaw et al. (Research Corporation) US-4,318,904 (приоритетна дата 25.04.80) описващ пептидни хлоро-метил кетони, т.е. H-DPhe-Pro-Arg-CH₂CI.

Инхибитори на тромбина, на базата на пептидни алдехиди са докладвани от S.Bajusz et al. in J. Med. Chem. 1990.33.1729 и в (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar R T) EP-A2-0,185,390 (приоритетна дата 21.12.84). Инхибитори на тромбин, като пептиди, включващи в С-края борни производни на аргинина и техни изотиорониеви аналози, са докладвани от A.D. Kettner et al. (Du Pont) EP-A2-0,293,881 (приоритетна дата 05.06.87 и 06.04.88).

По-долу са дадени някои примери на аргининови производни - инхибитори на тромбина или техни аналози, несъдържащи електрофилни кетони, т.е.:

(а) S. Okamoto et al (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) EP-A1-0,008,746 (приоритетна дата 31.08.78), описващ арилсулфонил аргининови амиди, т.е. аргатробан, (б) J. Stuerzebecher et al., Pharmazie 1981. 36. 639 (арилсулфонил р-амидинофенилаланин амиди).

Цел на представеното изобретение е даде нови и мощни инхибитори на тромбин с компетивна инхибиторна активност спрямо техния ензим, т.е. предизвикващи реверсивно инхибиране. Друга цел на изобретението е да даде инхибитори, които са орално приемливи и селективни при инхибирането на тромбин спрямо други серин протеази. Стабилност, продължителност на действието и ниска токсичност при терапевтични дози са останалите цели на изобретението.

3. ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Установено е, че съединения с обща формула 1, като такива или под формата на физиологично приемливи соли, включително и стереоизомерите им, са мощни инхибитори на тромбина.

(СНЯзА)т

Във формула 1, както и по-нататък в текста, освен ако не е посочено изрично, важат следните означения:

А означава -СН₂-, -СН=СН-, -СН₂-СН₂- или -СН₂-СН₂-СН₂-;

R-Ι и R₂ са еднакви или различни и всеки един от тях означава Н или Χ-В-, където В е права или разклонена алкиленова група, притежаваща 1-3 въглеродни атома, a X е Н, метил, етил, циклоалкилова група притежаваща от 3-6 въглеродни атома или R'CO-, където R' е ОН, права или разклонена алкокси група с 1-4 въглеродни атома, NH₂ или NHR, където R е права или разклонена алкилова група, притежаваща от 1-4 въглеродни атома или X е мнемонична карбонова киселина, добре известна, подбрана от PO(OR')₂, -SO3H и 5-(1Н)-тетразолил, a R' е Н, метил или етил или В е -SO₂- a X е метил или етил;

m е 0,1 или 2, R3 означава циклохексилова група и Язд е Н; или гп е 1, a R3 означава циклохексилна или фенилна група, a R3A образува етиленов мост заедно с Яц

Y означава 0 или S(O)p, където р е 0,1 или 2;

Яд означава Н, прав или разклонен алкил или циклоалкил с 1 до 6 въглеродни атома, незаместен или заместен с един или повече флуорни атома и/или заместен с фенилна група; заместен или незаместен ароматен пръстен, подбран от фенил, 4-метокси-фенил, 4-трет-бутил-фенил, 4-метил-фенил, 2-, 3- или 4трифлуоро-метил-фенил, фенил, заместен с 1-5 флуорни атома или -CH₂(CF3)фенил.

Съединенията с формула 1 се отнасят до пептидната последователност на

Аа веригата на човешки фибриноген, представляваща изменени субсайт Р3 - Pf':

-6H-Ala-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly1 5 10

P3 P₂ Pi I Pf ₽2' Р3¹

-Gly-Gly-Val-Arg----------Gly-Pro-Arg-Val14 15 16 17 20

Тази последователност е идентична с Последователност No.1 в списъка в Приложението. (SEQ ID N0.1).

Съгласно предпочетено изпълнение, изобретението се отнася до съединения с формула 1, в която;

А означава -СН2-СН2- или -СН2-СН2-СН2-;

Rj е Н, a R₂ е НОСО(СН2)гг или СНзСН2ОСО(СН2)п- и η е 1 или 2;

YeO m е 1, R3 означава циклохексил и Нзд означава Н.

Особено сполучливи изпълнения на изобретението са представени от съединенията;

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3

HOOC-CH2-DCha-Pic-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3 HOOC-CH₂-DCha-Pic-D,LArg-CH₂-O-nBu

HOOC-CH₂-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-nBu HOOC-CH2-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-nBu.

Приложение в медицината и фармацията

В друг аспект, изобретението се отнася до лечение в човешки или животински организъм при условия, при които е необходимо инхибиране на тромбина. Очаква се съединенията на изобретението да бъдат полезни, поспециално при животни, но и при хора при лечение или профилактика на тромбоза и хиперкоагулация в кръв и тъкани. Болестните състояния, при които съединенията притежават възможно приложение при лечение и/или профилактика, включват венозна тромбоза и белодробна емболия, артериална тромбоза, както при инфаркт на миокарда, нестабилна ангина, припадъци на

- 7базата на тромбоза и периферна артериална тромбоза. Освен това, съединенията са с очаквани възможности в профилактиката на атеросклеротични заболявания, като коронарно артериално заболяване, церебрално артериално заболяване и периферно артериално заболяване. Понататък, съединенията се очаква да бъдат полезни, заедно с тромбоцитите при инфаркта на миокарда. Освен това, съединенията се очаква да бъдат полезни в профилактиката на повторно запушване след тромболиза, перкутанна транслуминална ангиопластика и операции за поставяне на коронарен байпас. По-нататък, се очаква съединенията да бъдат използувани за предпазване от ретромбоза след микрохирургически намеси. Очаква се съеди-ненията да бъдат полезни при антикоагулантно лечение във връзка с изкуствени органи и поставяне на сърдечни клапи. Очаква се да бъдат използувани като антикоагуланти при хемодиализа и разсейваща се вътрешносъдова коагулация. Обикновено дневната доза ще се движи в границите до 0,1 мг до 10 г активна съставка. Препоръчително е венозните разтвори да съдържат 0,1-100 мг/мл, докато единичната доза е препоръчително да съдържа 1-1000 мг, която да бъде разпределена за приемане от 1-4 пъти дневно.

Друга очаквана полезна употреба е при изплакването на катетри и механични прибори, използувани при пациенти in vivo и като антикоагуланти за консервиране на кръв, плазма и други кръвни продукти in vitro.

Друга цел на изобретението е метод за получаване на съединенията от изобретението. Ето защо изобретението по-нататък се отнася до метод за получаване на съединения, отговарящи на формула 1, като споменатият метод включва:

(Метод I) заместване с R4Y- (Y = О, S) на халогена в халогенметилкетона с формула

(Wg)HN

в която W-| е защитна в амино-края група, напр. третичен бутоксикарбонил, а W£ е защитна група, напр. бензилокси карбонил, (както е показано при

Процедури (A), (D) и (F)), редукция на кетона до алкохол, отстраняване на защитната в амино-края група, стандартно пептидно свързване, последвано от окисление на алкохола, даващо защитен трипептид кетон, отстраняване на защитната на амино-края група, последвано от N-алкилиране, (както е илюстрирано в Процедури (А), (В), (G) и (Н)) и отстраняване на защитната група или заместване на защитения дипептид в свързването, споменато по-горе и илюстрирано (напр. в Процедура (A) (III)), със защитен в амино-края Nалкилиран-М-трифлуороацил-защитен дипептид (Проце-дура К), последвано от окисление и отстраняване на защитната група или (Метод II) - алкилиране с Пд-халогенид на α-кетол с формула

в която Wi и W2 са дефинирани по-горе (както е илюстрирано в Процедура (Е)) и последвано от взаимодействия, както описаните в Метод (I); или

-9(Метод III) - чрез използуването на видоизменена реакция на Dakin-West, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 8 (1969) 981, като е приложена за трипептиди, J. Org. Chem., 50 (1985) 1112: взаимодействие на съединение c формула (или алтерна товно - директно използуване на защитен в амино-края М-алкилиран-Nтрифлуороацил-защитен трипептид):

^(W2)HN

където W-| и W£ са както дефинираните по-горе, с (Т-СН2СО)2О, където Т е халоген, R4O или R4S и 4-DMAP, а след това реакцията продължава, както е описана в Метод (I).

В тези случаи, когато в резултат на реакцията се получава смес от стереоизомери, те обикновено се разделят чрез стандартни хроматографски или прекристализационни техники и ако е желателно, се отделя единичен стереоизомер.

Даденото по-долу описание е илюстративно по отношение на изобретението.

СИНТЕЗ И ФАРМАЦИЯ

Използуваните химични процеси за получаване на инхибиторите, заявени в изобретението са показани на Схемите за синтез (Процедури от А до Н) и Процедури I и К. Необходимите алкокси- или фенокси-метил кетони на аргинина са получени главно чрез: (1) заместване с R4O на Вг в бромометилкетоните, като се използува или предварително получен NaOR4 (Процедура А) или чрез използуването на KF (Процедури D и F) или с (2) алкилиране на аргинин α-кетол, като се използува Ag2O/R4l (вижте Процедура Е).

- 10За въвеждането на DCha, Pro и техните аналози са използувани стандартните реакции за свързване на пептиди. Карбоксиалкиловата група на N-края се въвежда или чрез алкилиране, като се използуват бромоацетати или чрез притъкмяването на Michael към третичен бутилакрилат (Процедури А и В), или чрез използуването на предварително включване на карбоксиалкил в дипептидната част (Вижте Процедура К). След това всички защитни групи се отстраняват (Вижте процедурите по отстраняване на защитните групи а - с, дадени по-долу).

ОСНОВНИ ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ ПРОЦЕДУРИ

Стандартната работна процедура включва екстракции с етилацетат, нормално промиване с 0,3M KHSO4, 1М КНСО3, Н2О и солен разтвор, последвано от филтруване през фазоразделяща хартия Whatman и сушене чрез ацеотропно изпаряване с толуол. Тънкослойната хроматография се извършва върху търговски стъклени плаки със силикагел: Merck Silicagel 60F254. Визуализацията (проявяването) се извършва с комбинация от ултравиолетова светлина, нагряване, последвано от спрей с флуорескамин или нагряване, последвано от хлориране (CI2 съд) и напръскване с разтвор 1% скорбяла/К1. флеш-хроматографията се провежда върху силикагел Merck 60 (40-63 мкм) под налягане на азот. Анализът на аминокиселините се извършва чрез използуването на системата Бекман Голд. Пептидите се хидролизират (6N HCI + фенол при 110°С в продължение на 24 часа), след това се инжектират и се измерва пика на пролина. Течната хроматография при средно налягане (MPLC) се провежда в стъклени колони (Anachem), запълнени със силикагел Vydac С18 с размери 15-25 мкм, като се използуват градиенти на 1% трифлуороцетна киселина-MeCN в 1% трифлуороцетна киселина-НгО с наблю дение при 226 нм. фракциите се анализират с висококачествена течна хроматография (HPLC) и чистите се събират и лиофилизират. Висококачествената течна хроматография се провежда като се използува хроматографска установка Spectra-Physics 8700. Системата елюенти е както при хроматографията със средно налягане с детекция при 210 нм. Поток 1,5 мл/мин. Колона: Novapak С18, 4 мкм (8 х 100 мм касета, Waters).

- 11 Всички междинни съединения се охарактеризират с ЯМР (Hitachi-Perkin Elmer R24 60 MHz или Jeol 270 MHz прибори). Всички крайни пептиди се охарактеризират с техните FAB (бързо атомно бомбардиране)-масови спектри (М-Scan Ascot, Berks., U.K.).

Получаване на изходните материали

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂Br (I) Boc-D,LArg(Z2)OH (10 ммола) в сух тетрахидрофуран (50 мл) и Nметилморфолин (10 ммола) се охлажда до -10°С и се прибавя на капки изобутил хлороформиат (10 ммола), в продължение на 45 минути, като температурата се поддържа -10°С. След 10 минути при -10°С смесеният анхидрид се излива в смес от CH₂N₂-eTep (25 ммола в 150 мл). След 3 часа излишъкът от CH₂N₂ се разрушава с оцетна киселина и разтворът се промива трикратно с вода и солен разтвор. Сушенето и изпаряването дават диазокетона под формата на жълто масло. IR 2100 см¹ (COCHN2).

(II) Диазокетонът (10 ммола) в сух етилацетат (200 мл) се охлажда до -15°С и към него се прибавя на капки смес от 1М HBr/етилацетат (около 11 мл). Когато жълтият цвят изчезне, тънкослойната хроматография (етилацетат/хексан) показва пълно превръщане на диазокетона в бромометилкетон. Разтворът се прехвърля бързо в делителна фуния и се промива с 1М КНСО3, солен разтвор, суши се и се изпарява за отделяне на твърда фаза. Разтварянето й в горещ етилов алкохол и охлаждането дава бромометилкетон под формата на аморфен бял прах.

ЯМР (CDCI3): δ 1,3 (5, 9Н), 1,5-1,85 (m, 4Н), 3,75-3,95 (т + s, 4Н), 4,3 (т, 1Н), 5,05 (S, 2Н), 5,15 (s, 2Н), 5,65 (d, 2Н), 7,30 (т, 10Н), 9,2 (br, s, 1Н), 9,3 (br, s, 1Н). Точка на топене: омеква при 50°С, след това бавно се разлага > 70°С.

Boc-DCha-X-ONSu (X = Pro, Pic или Aze):

(I) Boc-DCha-OH (10 ммола) в СН₂С1₂/диметилформамид (1:5, 50 мл) се обработват с HONSu (N-хидроксисукцинимид) (11 ммола), охлаждат се до 0°С и се прибавя водоразтворим карбодиимид (13 ммола). След 30 минути реакционната смес се затопля до стайна температура. След 3 часа

- 12тънкослойната хроматограма показва изцяло образуване на Boc-DCha-ONSu. Прибавянето на Et2O (диетил-кетон) (200 мл) и трикратното промиване с вода, солен разтвор и сушене, дават естера под формата на безцветна пяна.

(II) N-хидроксисукцинимидоестер (10 ммола) в CH2CI2 (50 мл) се обработва с Н-Pro-OBzl.HCI или с Н-Pic-OBzl.HCL или с H-Aze-OBzl (11 ммола) и iPrgNEt (20 ммола). След разбъркване в продължение на 3 часа, стандартната обработка с етилацетат/0,3 М KHSO4 дава дипептиден естер, който е достатъчно чист, за да се използува в следващата фаза.

(III) Boc-DCha-X-OBzl в тетрахидрофуран се хидрира върху 5% Pd/C при стандартна температура и налягане в продължение на 4 часа, филтруването и изпаряването дават киселината под форма на твърдо тяло или пяна. Прекристализацията (из iP^O (изопропилкетон) или Е12О(диетилкетон)/хексан) дават чистите продукти.

Boc-DCha-Pro-OH (твърдо с т.т. 121°С-122°С): ЯМР (CDCI3) δ 0,8 - 2,05 (m, + s при 1,45, 28Н), 3,35 (m, 1 Η), 3,95 (m, 1Η), 4,6 - 4,9 (m, 1Н), 5q4 (m, 1H), 5,6 (m, 1H), 8,8 (br, s, 1H).

Boc-(Me)DCha-Pro-ONSu:

Boc-(Me)DChe-OH се хидрира върху 5% Rh/C в 90% воден разтвор на оцетна киселина при налягане 0,41 МРа в продължение на 3 дни, давайки количествен добив на Boc-(Me)DCha-OH. Boc-(Me)DCha-OH (10 ммола) и Nметилморфолин (10 ммола) в CH2CI2 (50 мл) се охлаждат до -15°С и се прибавя PI12PO-CI (10 ммола). След 20 минути се прибавят H-Pro-OBzl.HCI (11 ммола) и Nметилморфолин (20 ммола). След 1 час сместа се оставя да се темперира до стайна температура. След 2 часа стандартна обработка и флеш-хроматография (40% етилацетат/хексан) се получава чист Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl като безцветно масло (80%).

ЯМР (CDCI3): δ 0,5-2,2 (m + s при 1,4, 26Н), 2,65 (s, ЗН), 3,5 (m, 2Н), 4,3 - 5,0 (m,

2Н), 5,1 (S, 2Н), 7,30 (s, 5Н).

Този продукт се превръща в N-хидроксисукцинимидоестер, както е описано за

Boc-DCha-X-ONSu по-долу.

-13СХЕМИ НА СИНТЕЗ

Процедура А (|)

DMF

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂Br + OR₄------------·— Boc-D,LArg(Z2)-CH₂OR4

-20°С напр. R₄= CH₂CF₃, CH(Ph)CF₃.Ar (ID

NaBH₄МеОН, O°C

(III)

1) HCI-диоксан

OR₄ -*----------- Boc-N

2) Boc-DCha-X-ONSu A или [Boc-(Me)DCha-X-ONSu]

R*

OH

OR₄ (IV)

Дес-Мартин периодинан

Boc-DCha-X-D,LArg(Z₂)-CH₂OR₄ (V)

1) HCI-диоксан

2) RO₂CCH₂Br

---------a- Y'-DCha-X-D,LArg(Z₂)-CH₂OR₄ или [Boc-(Me)DCha-X-D,LArg(Z₂)-CH₂O₄] iPr₂NEt,MeCN,A или изпускане или Проц. G или Проц. Н

X = Pro, Pic, Aze

R*= (CH^-NZ-CiNHJ-NHZ

Y' = H, RO₂CCH₂(RO₂CCH2)₂(R=Bzl, tBu или Et)

Процедура B

1) HCI-диоксан

2) EtOAc/ 1M KHCO₃

Boc-DCha-X-D,LArg(Z₂)-CH₂OR₄ --------tBuO₂CCH₂CH₂-DCha-X-

3) tBu-акрилат -D,LArg(Z2)-CH₂OR₄

MeOH, Δ напр. R₄ = nBu, CH₂CF₃

- 14ПронедураС

Rh₂(OAc)₄

Boc-D,LArg(Z2)-CHN₂ + HOR₄ -------напр. R₄ = CH₂CF₃, CH(Ph)CF₃, CH(CF₃)₂

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂OR₄

След това продължава както в

Процедура (А) (II)

1) HCI-диоксан

2) Boc-DCha-X-ONSu

3) Zn-HOAc

Boc-DCha-X-D.LArg^-CHBr

Процедура D (I) CI₃CCH₂-OH CH₂CI₂

Boc-DCha-X-D.LArgiZ^-OH-----—

WSCID 4-DMAP (III)

1) NMM, iBC, THF

2) CH₂N₂-GTep

Boc-DCha-X-D.LArg^-OH ----------—

3) HBr-EtOAc,-10° (IV)

DMF

R₄YH

-------— Boc-DCha-X-D,LArg(Z₂)-CH₂YR₄KF, RT, 24 ч

Y = 0, s

R₄ = nBu, Aryl

За пример 1: R₄YH = HO₂CCOPh

Boc-D, LArg (Z^ -ОТ се

След това продължава както в Пр.

Процедура Е (I)

KF

Boc-D,l_Arg(Z2)-CH₂Br + HO₂CCOPh----*- Boc-D,LArg(Z2)-CH₂O₂CCOPh

DMF

Зч напр. R₄ = Me, Et, nPr, nBu (Ч) Ag₂O

1MKHC0₃ CH₂CI₂

-----— Boc-D, LArg(Z2)-CH₂OH-----* ч R₄I

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂OR₄

След това продължава както Пр. А.

-15Процедура F

KF

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂Br + R₄OH ------Boc-D₎LArg(Z₂)-CH2OR₄

DMF, 24 ч . След това продължава както в Пр. А.

напр. R₄ = CH2CF3, CHaiCF^CFs,

Ph(4-OMe)

Процедура G

1) HCI-диоксан

Boc-DCha-X-D,LArg(Z2)-CH₂OR₄-------— Me-S02-DCha-X-D,LArg(Z2)-CH₂OR₄

2) MeSO₂CI напр. R₄ = CH₂CF₃

Процедура H

1) HCI-диоксан

Boc-DCha-X-D,LArg(Z2)-CH₂OR₄ -------— ChCH2-DCha-X-D,LArg(Z2)-CH₂OR₄

2) ChCHO/NaCNBH₃ напр. R₄ = CH2CF3 w

-16ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Дадените по-долу препаративни процедури илюстрират посочените погоре методи от (I) до (III) в последователни етапи до получаване на крайните съединения.

ПРОЦЕДУРА (А) (I) Boc-D,LArg(Z2)-CH2Br (10 ммола) се прибавя под формата на твърда фаза към предварително получен разтвор на алкохолат или фенолат (алкохол или фенол 10 ммола и 80% NaH-масло, 10 ммола) в диметилформамид (40 мл) при 20°С под азот. След 30 минути разтворът се затопля до стайна температура. 2 часа по-късно се прибавя 0,3M KHSO4, за да неутрализира останалия алкохолат, а диметил-формамида се отстранява чрез изпарение под вакуум. Суровият продукт се разделя на части между етилацетат и вода, етилацетатният слой се промива със солен разтвор, суши се и се изпарява. Чистите алкоксикетони се получават с флеш хроматография или чрез прекристализация.

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂OPh (твърд): ЯМР (CDCI3): δ 1,35 (s, 10Н), 1,64-1,68 (m, ЗН), 3,92 (dd, 2Н), 4,5 (m, 1Н), 4,62 (q, 2Н), 5,1 (s, 2Н), 5,2 (s, 2Н), 5,5 (d, 1Н), 6,8 (d, 2Н), 6,95 (t, 1 Η), 7,2-7,45 (m, 12Η), 9,2 (br, s, 1H), 9,3 (br, s, 1H). Точка на топене: 115°C118°C.

Boc-D,LArg(Z2)-CH2OCH2CF3 (твърд): ЯМР (CDCI3): δ 1,35 (s, 10H), 1,55-1,75 (m, ЗН), 3,7 (q, 2H), 3,85 (m, 2H), 4,2 (q + m, 3H), 5,05, (S, 2H), 5,15 (s, 2H), 5,7 (d, 1H), 7,15-7,35 (m, 10H), 9,15 (br, s, 1H), 9,3 (br, s, 1H). Точка на топене: 87°C - 90°C.

(II) Алкоксиметил- или феноксиметилкетонът в смес MeOH/THF (тетрахидро-фуран) (1:1) при 0°С се обработва с ИаВИд (1 еквивалент). След 10 минути се прибавя 0,ЗМ KHSO4 до постигане на pH 7 и сместа се изпарява, за да се отстрани MeOH/THF. Прибавя се етилацетат и след стандартната обработка (етилацетат /0,ЗМ KHSO4), алкохолът се изолира като диастереоизомерна смес.

(III) Алкохолът се обработва с 4М HCI в диоксан в продължение на 15 минути при стайна температура и след това се изпарява. Остатъкът се смесва с CH2CI2 (1 ммол в 5 мл) и се обработва с Boc-DCha-X-ONSu (1 еквивалент) и с iP^NEt (до pH 9 върху мокра pH хартия). След три часа, стандартната обработка дава моди-фициран трипептид, който се пречиства чрез флеш-хроматография (смес етилацетат-хексан, съдържаща 1% оцетна киселина). Добив: 50-85%.

(IV) Трипептидалкохолът в CH2CI2 се обработва с периодинан на ДесМартин (3 еквивалента) (Dess, D.B. and Martin, J.C. J. Org. Chem., 1983, 48. 41554156). След два часа разбъркване при стайна температура, стандартната обработка (Et20/1 М КНСОз/МагвгОз) дава сурови трипептидкетони, които се пречистват чрез флеш-хроматография (етилацетат-хексан).

(V) Кетонът се обработва със смес от 4М HCI-диоксан в продължение на 15 минути при стайна температура и се изпарява. Остатъкът се улавя в сух MeCN (1 ммол в 5 мл) и се обработва с бензилбромацетат или третичен бутил-бромацетат (1,2 еквив.) и iPr2NEt (3 еквив.). След нагряване под обратен хладник в продължение на 2 часа, разтворът се изпарява и хроматографира в колона (етилацетатхексан), давайки бензилоксикарбонилметилни или третичен бутилоксикарбонилметилни пептиди под формата на масло (40-50%).

В Примери 30 и 31 се използувани 2,5 еквивалента бромоацетат за постигане на би-алкилирането.

ПРОЦЕДУРА (В)

Пептид-алкоксиметилкетонът се обработва с излишък от смес 4М HCIдиоксан в продължение на 15 минути при стайна температура. Изпаряването дава HCI-сол, която се разпределя между етилацетат и 1 М КНСО3. Етилацетатьт се отделя, суши и изпарява, давайки свободен амин, който се улавя в МеОН и се прибавя прясно дестилиран третичен бутилакрилат (1,5 еквив.). Нагряването под обратен хладник в продължение на 4 часа дава третичен бутоксикарбонилетилпептид, който се пречиства чрез флеш-хроматография с етилацетат/хексан.

- 18ПРОЦЕДУРА (С)

Boc-D,LArg(Z2)-CHN2 (1 ммол), разтворен в алкохола ЯдОН (5 мл), се обработва с Rh₂(OAc)4 (катализатор). След няколко часа при стайна температура, анализът с тънкослойна хроматография не показва наличие на свободен диазокетон. Алкохолът се отстранява под вакуум и продуктът се изолира хроматографски, като се използува смес етилацетат/хексан.

ПРОЦЕДУРА (D) (I) Boc-D,LArg(Z2)-OH (10 ммола) в сух СН₂С1₂ (50 мл) се обработва с 2,2,2трихлоретанол (11 ммола) и 4-DMAP (4-диметиламинопиридин) (1 ммол), охлажда се до 0°С и се прибавя водоразтворим карбодиимид (13 ммола). След 30 минути сместа се темперира до стайна температура и се разбърква в продължение на 24 часа. Изпаряването и разпределянето между етилацетат/0,3 М KHSO4, последвано от трикратно промиване с 0,3 М KHSO4, еднократно с вода и еднократно със солен разтвор, сушенето и изпаряването, дават Тсе(2,2,2трихлоретил)-естер, който се използува като такъв.

(II) Тсе-естерът (10 ммола) се обработва със смес 4 М HCI-диоксан (50 мл) в продължение на 20 минути при стайна температура и след това се изпарява. След сушене, остатъкът се улавя в СН₂С1₂ (50 мл) и се обработва последователно с Boc-DCha-X-ONSu (10 ммола) (X = Pro, Pic) и iPr₂NEt (до pH 9 върху влажна pH-хартия). След 3 часа, стандартната обработка (етилацетат/0,3 М KHSO4) дава трипептиден естер под формата на масло. Тсе-естерът (10 ммола) в 90% воден разтвор на оцетна киселина (50 мл) се обработва на интервали от 5 минути с малки порции прясно активиран цинк в продължение на 1 час. След още 1 час сместа се филтрува и разтворът се изпарява. Стандартната обработка (етилацетат/0,3 М KHSO4) дава трипептидна киселина, която се пречиства хроматографски върху силикагел (2% оцетна киселинаетилацетат), давайки трипептидна киселина под формата на безцветна пяна (80% за 3 етапа).

(III) Трипептидната киселина се превръща в бромометил-кетон, като се използува същата процедура, описана за Boc-D,LArg(Z2)-CH₂Br. Трипептид

- 19бромометил кетонът се получава хроматографски под формата на безцветно масло, като се използуват смеси етилацетат-хексан.

ЯМР (CDCI₃): δ 0,9 (m), 1,15 (m), 1,25 (m), 1,35 (s), 1,6 (m), 1,85 (m), 2,1 (m), [общо 30HJ, 3,3 (m, 1H), 3,7 (m, 1H), 3,95 (m, 2H), 4,15 (s, 2H), 4,25 (m, 1H), 4,4 (m, 1H), 4,5 (m, 1H), 5,0 (d, 1H), 5,1 (dd, 2H), 5,2 (s, 2H), 7,2-7,4 (s, m, 10H), 9,2-9,5 (2 br, s, 2H).

(IV) Трипептид бромометил кетонът (1 ммол) в сух DMF (диметилформамид) (5 мл) се обработва с флуориран алкохол, фенол или тиол (1,2 ммола) и безводен калиев флуорид (1,5 ммола) и се разбърква при стайна температура в продължение на 24 часа. Изпаряването, последвано от стандартната обработка и хроматография, дават трипептид кетоните, Boc-DCha-Pro-D,LArg(Z2)-CH₂O-Ph(4-Me): ЯМР (CDCI3): δ 0,9 (m), 1,15 (m), 1,25 (m), 1,35 (s), 1,6 (m), 1,85 (m), 2,1 (m), [общо 30H], 2,38 (s, 3H), 3,4 (m, 1H), 3,9 (m, 1H), 4,1 (br, s, 2H), 4,4 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,7 (m, 1H), 4,9 (q, 2H), 6,9 (d, 1H), 7,15 (d, 1H), 7,4-7,5 (m, 2H), 7,45 (s, 10H), 9,4 (br, s, 1H), 9,6 (br, s, 1H).

В Пример 37, защитеният сулфид е окислен до сулфон, като се използува m-хлоробензоена киселина в дихлорметан при стайна температура.

ПРОЦЕДУРА (Е) (I) Boc-D,LArg(Z2)-CH2Br (10 ммола) и бензоилмравчена киселина (12 ммола) в DMF (40 мл) се обработват с KF (14 ммола). След разбъркване в продължение на 3 часа, диметилформамида се изпарява и продуктът се разпределя между етилацетат/вода. Сушенето и изпаряването дават суров бензоилформиатен естер, който се пречиства чрез кристализация (из смес СН₂С1₂-хексан), давайки продукт под формата на бяло твърдо вещество с добив 86%.

ЯМР (CDCI3): δ 1,4 (s, 9Н), 1,65-1,9 (m, 4Н), 3,95 (т, 2Н), 4,3 (т, 1Н), 4,95 (q, 2Н), 5,15 (ABq, 2Н), 5,25 (s, 2Н), 5,9 (d,1H), 7,35 (т, 10Н), 7,5 (t, 2Н), 7,65 (t, 1Н), 8,15 (t,2H), 9,25 (br, s, 1 Η), 9,45 (br, s, 1Η). Точка на топене: 130°С - 132°С.

(II) Бензоилформиат естера (5 ммола) в THF (тетрахидро-фуран) (200 мл) и 1 М КНСО3 (200 мл) се разбърква енергично в продължение на 24 часа при стайна температура. THF се отделя и изпарява и водната фаза се екстрахира с

-20етилацетат, който се събира с материала от THF. Прекристализацията из смес СН2С12-хексан дава алфа-кетол под формата на твърдо бяло вещество (90%). ЯМР (CDCI3): δ 1,4 (s, 9Н), 1,7 (m, 4Н), 2,95 (t, 1Н), 3,95 (т, 2Н), 4,25 (т, 2Н), 5,15 (s, 2Н), 5,25 (s, 2Н), 5,6 (d, 1Н), 7,35 (т, 10Н), 9,25 (br, s, 1 Η), 9,4 (br, s, 1H). Точка на топене: 101 °C - 103°С.

(Ill) α-кетол (1 ммол) в сух CH2CI2 (5 мл) се обработва с алкил-йодид (5 до 10 ммола) и сребърен окис (2 ммола). Сместа се нагрява под обратен хладник на тъмно в продължение на 2 до 17 часа (напр. Mel, Etl, nPrl: 2 часа; nBul: 5 часа). Изпаряването, последвано от флеш-хроматография (етилацетат-хексан) дава алкоксиметил кетони под формата на безцветни масла (50-85%). Boc-D,LArg(Z2)-CH2OEt (масло): ЯМР (CDCI3): δ 0,9 (t, ЗН), 1,4 (s, 9Н), 1,5-1,8 (m, 4Н), 3,4 (q, 2Н), 3,95 (t, 2Н), 4,1 (q, 2Н), 4,45 (m, 1 Η), 5,15 (s, 2H), 5,25 (s, 2H), 5,4 (d, 1 Η), 7,35 (m, 10H), 9,25 (br, s, 1H), 9,4 (br, s, 1H).

Boc-D,LArg(Z2)-CH₂NBu (масло): ЯМР (CDCI3): δ 0,9 (t, ЗН), 1,25 -1,8 (m) + 1,4 (s) [ 17H], 3,3 (dd, 2H), 3,95 (t, 2H), 4,05 (q, 2H), 4,45 (m, 1H), 5,1 (s, 2H), 5,2 (s, 2H), 5,35 (d, 1H), 7,35 (m, 10H), 9,25 (br, s, 1H), 9,4 (br, s, 1H).

ПРОЦЕДУРА (F)

Boc-D,LArg(Z2)-CH2-Br се обработва c CF3CH2OH, CF3(CF2)2CH2OH или Ar-OH и KF в диметилформамид, като се използува процедурата, описана в Процедура (D) (IV).

ПРОЦЕДУРА (G)

Пептидите, защитени с Вос се обработват с 4 М HCI-диоксан в продължение на 15 минути при стайна температура и се изпаряват. Остатъкът в CH2CI2 се обработва с MeSO2CI (1,1 еквивалента) и с iP^NEt (2,5 еквивалента). След 1 час стандратна обработка и флеш-хроматография се получават метилсулфонилпеп-тиди, на които се снема защитата, както е описано в съответната Процедура (а).

ПРОЦЕДУРА (Н)

На пептидите се снема защитата с Вос, както по-горе и отмиване с HCI, като се използува разделяне с етилацетат/1 М КНСО3. Свободните амини в

-21 МеОН, охладен до 0°С се обработват с алдехид Ch-CHO (1,5 еквивалента) и ΝβΟΝΒΗβ (1 еквивалент). След 1 час изпаряването на студено и флеш хроматографията дават N-алкилиран пептид.

Отстраняването на защитните групи става като се използува процедурата за отстраняване на защитните групи (а).

ПРОЦЕДУРА (I)

Вос-(3-транс-фенил)-0,1лролин се получава по метода, описан от Chung et al. J. Org. Chem. 1990, 55, 270, и се свързва c H-Pro-OBzl, както е описано по-горе за Boc-(Me)DCha-Pro-OBzl. След това дипептида се превръща в неговия -ONSu естер, както е описано по-долу.

Вос-(3-транс-цеклохексил)-0,1_пролина се получава от фениловия аналог чрез хидриране върху 5% Rh-C в 90% НОАс-Н₂О при 0,41 МПа в продължение на 3 дни.

ПРОЦЕДУРА (К)

Синтез на междинното съединение N-(BzlO₂C-CH₂-),N-(CF3CO)-DCha-ProONSu (I) H₂-Pd/C (II) BzlO₂C-CHO,

NaCNBH₃

Z-DCha-Pro-OtBu ----------------► N-(BzlO₂C-CH₂-),N-(CF₃CO)DCha-Pro-ONSu (iii) (Cf₃co)₂o (IV) TFA (V) HONSu, WSCDI (водоразтв.карбодиимид) (I) Z-DCha-Pro-OtBu (получен съгласно стандартните реакции за свързване на пептиди) се хидрира в THF върху 5% Pd-C при стандартни температура и налягане в продължение на 24 часа, филтруването и изпаряването дават H-DChaPro-OtBu (масло, 100%).

(II) Продуктът, получен по-горе (2 ммола) и бензил глиоксилат (1 еквивалент) в бензол се подлагат на три изпарявания (всеки път се прибавя свеж бензол), за да се отстрани водата. Остатъчният имин (2 ммола) в 1% оцетна киселина/метанол (8 мл) се обработва с ΝβΟΝΒΗβ (2 ммола). След 1 час изпарението, последвано от флеш-хроматография върху силикагел (60% EtOAcхексан) дава BzlO₂C-CH₂-DCha-Pro-OtBu, 385 мг (41%).

(III) Полученият по-горе продукт (380 мг) в сух CH2CI2 (8 мл) се обработва с Et₃N (2 еквивалента) и (CF₃CO)2O (1,2 еквивалента). След 40 минути изпарението и флеш-хроматографията (силикагелр 30% EtOAc-хексан) дават N-(BzlO2C-), N(CF3CO)-DCha-Pro-OtBu като масло, 390 мг (86%).

¹Н ЯМР (CDCI3) - комплекс, дължащ се на наличието на 4 ротамера - напр. tBuгрупа при δ 1,4-1,5 е разцепен четирикратно в отношение 1 : 0,25 : 0,8 : 0,4 при 0,9 (т), 1,1 (т), 1,65 (т), 1,95 (т), 2,2 (т) [ 17Н]; 1,4-1,5[4xs, 9Н], 3,1 (т), 3,5 (т), 3,7 (т) [2Н]; 4,3-4,6[т, ЗН]; 5,05-5,4 (т, ЗН); 7,35[S, 5Н].

(IV) Полученият по-горе продукт (335 мг) се обработва с CH2CI2-TFA (1:1,8 мл) в продължение на 2,5 часа при стайна температура. Изпарението, последвано от три изпарения из толуол дават свободната киселина (100%).

(V) Получената по-горе киселина се превръща в нейния -ONSu естер (100%), като се използува HONSu, както е описано преди това за Boc-DCha-OH.

Междинното съединение може да се свърже с H-D,LArg(Z2)-CH2-Y-R4 като се използуват общите методи, вече описани.

Процедурата (а) за отстраняване на защитната група дава пептид, защитен с N-CF3-CO-. N-CF3-CO се отстранява чрез процедура d.

Процедури за отстраняване на защитните групи:

(a) Защитеният пептид в МеОН/НгО (3:1), съдържащ 1М HCI (2 еквивалента) се хидрира върху 5% Pd-C при стандартни температура и налягане в продължение на 40 минути, филтруването (0,2 мкм) и изпарението са последвани от лиофилизация от вода за получаването на пептидите под формата на мъхесто бяло вещество.

Пречистването, ако е наложително, се провежда чрез течна хроматография при средно налягане (вижте общите процедури).

(b) Защитеният пептид първоначално се обработва с TFA/CH2CI2 (1:1) в продължение на 1 час и се изпарява, след което се хидрира, както е описано в процедура (а), по-горе.

(c) Групата COCOPh първо се хидролизира, както е описано в (Е) (II), след това се хидрира върху H2-Pd/C, както е описано в (а).

(г) Отстраняване на N-CF3-CO (N-трифлуороацетил):

N-трифлуороацетил пептидът се разтваря в смес ΜΘΟΗ-Η2Ο-ΝΗ4ΟΗ (1:1:1) и се държи при стайна температура в продължение на 24 часа. Изпарението, последвано от пречистване, ако е необходимо, дава пептида.

ПРИМЕРИ

Дадените по-долу примери илюстрират в по-големи подробности принципите на изобретението.

Примери за съединенията на изобретението са изброени в Таблица 1. Таблица 2 показва използуваните процедури за тяхното получаване, описани в * главата Процедури за получаване, а в Таблица 3 са представени данните, характеризиращи съединенията, изброени в Таблица 1.

Пример No.

ТАБЛИЦА 1 Формула

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

H-DCha-Pro-D,LArg-CH2-OH

H-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Me

H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH₂-CF3

H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-CH(CF₃)2

H-DCha-Pro-Arg-CH2-O-C*H(Ph)-CF3

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3

Et-OOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3 HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF2-CF2-CF3 HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-Ph

HOOC-CH₂-DCha-Pro-DMrg-CH2-O-Ph(4-OMe)

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-tBu)

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-Me)

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-F)

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(3-F)

H00C-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph(2-F)

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(3-CF3)

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(4-CF3)

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Ph(2-CF₃)

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-C₆H5

HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Et

HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH₂-0-nPr

HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-nBu

HOOC-CH2-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-iBu

HOOC-CH₂-DCha-Aze-D,LArg-CH2-O-CH₂'CF3

HOOC-CH2-DCha-Pic-D,LArg-CH2-O-CH2-CF₃

HOOC-CH₂-DCha-Pic-Arg-CH2O-nBu

Me-DCha-Pro-D_tLArg-CH₂-O-CH₂-CF3

Me-SO2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂O-CH2-CF3

Ch-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH₂-CF₃(HOOC-CH2)2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH2-CF3 (HOOC-CH2)2-DCha-Pro-Arg-CH₂-O-iBu

HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-nBu

HOOC-CH₂-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-nBu

H-D,LPro(3-TpaHC-Ph)-Pro-D,LArg-CH2O-CH2-CF3

H-D,LPro(3-TpaHC-Ch)-Pro-D,LArg-CH2-0-CH₂-CF3

HOOC-CH₂-DCha-Pro-Arg-CH2-S-nBu

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-SO2-nBu * абсолютна конфигурация R или S.

-25ТАБЛИЦА 2

Пример No.	Процедура на получаване	Процедура за деблокиране
1.	D	с
2.	Е	b
3.	А или С	Ь
4.	А или С	b
5.	А или С	ь
6.	А	а
7.	А	а
8.	F	а
9.	А или D	а
10.	F	а
11.	D	а
12.	D	а
13.	D	а
14.	D	а
15.	D	а
16.	D	а
17.	D	а
18.	D	а
19.	D	а
20.	Е	а
21.	Е	а
22.	Е	а
23.	Е	а
24.	А	а
25.	А	а
26.	Е	а
27.	AnF	а
28.	AmG	а
29.	АиН	а
30.	А	а
31.	Е	а
32.	ЕиВ	b
33.	АиВ	ь
34.	1 и А	ь
35.	1 и А	ь
36.	D	а
37.	D	а

-26ТАБЛИЦА 3

Пример No.	Мол.тегло (М + 1)	FAB MS	ААА:Пептид Съдърж.(%)*	HPLC задържане** Време(мин)/система
1.	2.	3.	4.	5.
1.	438,57	439	56/Рго	10,3/E
2.	452,60	453	65/Рго	9,9/E
3.	520,6	521	59/Рго	8,6/A
4.	588,6	589	60/Рго	10,7/A
5.	596,7	597	61/Рго	12,2/A
6.	578,64	579	72/Рго	14,8/C
7.	606,69	607,7	65/Рго	22,0/B
8.	678,65	679,8	76/Рго	18,2/G
9.	572,71	573,3	73/Рго	19,9/B
10.	602,74	603,8	76/Рго	13,4/G
11.	628,82	629,5	77/Рго	22,0/G
12.	586,74	587,2	75/Рго	16,0/G
13.	590,70	591,4	76/Рго	15,2/G
14.	590,70	591,4	63/Рго	15,0/G
15.	590,70	591,4	54/Рго	14,0/G
16.	640,71	641,5	68/Рго	19,0/G
17.	640,71	641,6	70/Рго	20,0/G
18.	640,71	641,4	65/Рго	18,4/G
19.	662,66	663	49/Рго	21,0/G
20.	524,67	525,4	79/Рго	15,5/B
21.	538,69	539	67/Рго	9,2/F
22.	552,72	553	69/Рго	19,3/B
23.	552,72	553,4	56/Рго	9,2/F
24.	564,61	565	67/Aze	13,6/D
25.	592,66	593	90/Pic	8,4/D
26.	566,75	567,4	86/Pic	17,0/G
27.	534,63	535,6	70/Pro	18,8/B
28.	598,69	599	71/Pro	11,2/D
29.	616,77	617	64/Pro	14,5/C
30.	636,67	637,6	70/Pro	12,0/A
31.	610,76	611,2	67/Pro	10,0/F
32.	566,75	567,5	65/Pro	19,7/B
33.	592,66	593	46/Pro	10,6/F
34.	540,59	541	56/Pro	14,3/C
35.	546,64	547	49/Pro	15,9/C
36.	568,78	569,4	45/Pro	17,4/G
37.	600,78	601,3	62/Pro	14,6/G

* На базата на показаната аминокиселина ** Вижте основната експериментална процедура. Времената са дадени за епимери L-Arg. D-епимерите (по-малко), обикновено преминават 0,5 минута порано.

-27Система A: 20% повишение до 80% на 1% TFA-MeCN в 1% TFA-H2O за 25 минути (20-80%, 25 мин).

Система В: 10-60%, 30 мин

Система С: 10-90%, 30 мин

Система D: 30-100%, 30 мин

Система Е: 10-90%, 20 мин

Система F: 20-100%, 20 мин

Система G: 20-70%, 30 мин.

Пример 38

Разтвор за непрекъснато венозно приемане. Разтворът се получава от следните съставки:

Инхибитор на тромбин 50 мг

Натриев хлорид за инжекции 4,5 г Вода за инжекции до 500 мл

Активната съставка и натриевият хлорид се разтварят във вода, след което разтворът се филтрува и стерилизира в автоклав или чрез филтруване през 0,2 мкм стерилен филтър и се напълва асептично в стерилни инфузионни стъкленици. Пример 39

Разтвор за инжекции

Разтворът се получава от следните съставки:

Инхибитор на тромбин 5 г

Натриев хлорид за инжекции 9 г

Вода за инжекции до 1000 мл

Активната съставка и натриевият хлорид се разтварят във водата, след което разтворът се филтрува и стерилизира в автоклав или чрез филтруване през стерилен филтър 0,2 мкм и се напълва асептично в стерилни ампули (5 мл). Пример 40

Разтвор за назално приложение

Разтворът се получава от следнвите съставки:

	- 28-
Инхибитор на тромбин	10 г
Глицерол	200 г
Метил р-хидроксибензоат	1 г
Пропил-р-хидроксибензоат	0,2 г

Вода за инжекции до 1000 мл

Активната съставка и консервантите се разтварят в глицерол и в основната част вода. След това обемът се довежда до 1000 мл и разтворът се напълва в стерилни полиетиленови контейнери.

Пример 41

Таблети за орално приемане

1000 таблети се получават от следните съставки:

Инхибитор на тромбин	100 г
Лактоза	200 г
Поливинил пиролидон	ЗОг
Микрокристална целулоза	30 г
Магнезиев стеарат	6г

Активната съставка и лактозата се смесват с воден разтвор на поливинил пиролидон. Сместа се суши и смила за получаването на гранули. След това се към тях смесват микрокристалната целулоза и магнезиевия стеарат. Накрая сместа се пресова на таблетир-машина, давайки 1000 таблети, всяка от които съдържаща 100 мг активна съставка.

Пример 42

Желатинови капсули за орално приемане

Желатиновите капсули се запълват със смес, приготвена от следните съставки:

Инхибитор на тромбин	50 мг
Магнезиев стеарат	3 мг
Лактоза	100 мг

Биология

-29Определяне на времето за съсирване на тромбин и IC50TT:

Човешки тромбин (Т 6769, Sigma Chem. Co.) в буферен разтворр pH 7,4, 100 мкл и разтвор на инхибитор, 100 мкл се инкубират в продължение на една минута. След това се прибавят 100 мкл разлята нормална, цитрирана човешка плазма и времето на съсирване се измерва с автоматичен прибор (КС 10, Amelung).

Времета за съсирване в секунди се представя графично спрямо концентрацията на инхибитора и чрез интерполиране се определя ICsqTT.

IC50TT е концентрацията на инхибитора, която удвоява времето за съсирване на тромбин за човешка плазма. pICsqTT е отрицателния десетичен логаритъм от IC50TT в мол/л (-юдЮ). Резултатите са представени на Таблица 4.

ТАБЛИЦА 4

Пример No. PIC50TT

1.	7,71
2.	7,81
3.	7,92
4.	7,38
5.	7,77
6.	8,04
7.	7,70
8.	7,64
9.	8,45
10.	7,90
11.	7,86
12.	8,25
13.	8,22
14.	8,15
15.	8,12
16.	7,77
17.	8,68
18.	7,30
19.	8,27
20.	8,17
21.	8,14
22.	8,69
23.	7,64
24.	8,01
25.	8,00
26.	7,89
27.	7,52
28.	6,85
29.	6,47

30.	7,38
31.	6,88
32.	7,63
33.	7,78
34.	7,03
35.	7,25
36.	7,57
37.	7,72

СЪКРАЩЕНИЯ

4-DMAP	= 4-диметиламинопиридин
AAA	=	аминокиселинен анализ
Arg	=	L-аргинин
Arg(Z2)	=	М-дибензилоксикарбонил-1_-аргинин
Aze	=:	1_-азетидин-2-карбонова киселина
Boc	=	третичен бутоксикарбонил
Bu	=	бутил
Bzl	=	бензил
Ch	=	циклохексил
Cha	=	L-b-циклохексилаланин
DMF	=	диметилформамид
Et	=	етил
EtOAc	=	етилацетат
FAB	=	бърза атомна бомбардировка
Fl до FXIII	=	коагулационни фактори 1 до XIII
Flla до FXIIIa	⁼	активирана форма на коагулационни фактори от II до XIII
Gly	=	глицин
HMW-K	=	високомолекулен кининоген
HOAc	=	оцетна киселина
HONSu	=	N-хидроксисукцинимид
HPLC	=	висококачествена течна хроматография

iBC	=	изобутил хлорформиат
Kall	=	каликрейн
Me	=	метил
MPLC	=	течна хроматография средно налягане
NMM	=	N-метил морфолин
Nph	=	нафтил
Ph	=	фенил
Pic	=	L-пипеколинова киселина
PL	=	фосфолипиди
Pr	=	пропил
Prekail	=	прекаликрейн
Pro	=	L-пролин
STP	=	стандартна температура и налягане
Tee	=	2,2,2-трихлоретил
TFA	=	трифлуороцвтна киселина
THF	=	тетрахидрофуран
Vai	=	L-валин
WSCDI	=	водоразтворим карбодиимид
Z	=	бензилоксикарбонил

Представките n, i и t са с обичайните си значения: нормален, изо и третичен.

Списък на последователността

Брой последователности: 1 (1) Информация за SEQ ID N0.1:

(I) Характеристика:

(A) Дължина: 20 аминокиселини (Б) Тип: аминокиселинен (B) Топология: линейна (II) Молекулен тип: пептид (III) Хипотетичен: Не (VI) Оригинален източник:

(А) Организъм: Homo sapiens (IX) Характеристики:

(A) Име/Ключ: Пептид (Б) Място: 1...20 (B) Друга информация: /забележка: Пептидна последователност, съдържаща място, разцепващо тромбина в човешкия фибриноген А-алфа верига.

(IX) Характеристика:

(А) Име/ключ: Място на разцепване (Б) Местоположение: 16... 17 (XI) Описание на последователността: SEQ ID No.1:

Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly

5

Vai Arg Gly Pro Arg Vai

20

Claims

1. Съединение с обща формула:

А означава -СН2-, -СН=СН-, -СН2-СН2- или -СН2-СН2-СН2-;

Rf и R2 са еднакви или различни и всеки един от тях означава Н или Х-В-, където В е алкиленова група с права или разклонена верига, притежаваща 1 до 3 въглеродни атома, a X е Н, метил, етил, циклоалкил, притежаващ от 3 до 6 въглеродни атома или ROO-, където R¹ е ОН, алкоксигрупа с права или разклонена верига, притежаваща от 1 до 4 въглеродни атома, NH2 или NHR, където R е алкилова група с права или разклонена верига, притежаваща от 1 до 4 въглеродни атома, или X е известна мнемонична карбонова киселина, подбрана от следните: -PO(OR*)2> -SO3H и 5-(1Н)-тетразолил, a R' е Н, метил или етил; или В е -SO2-, a X е метил или етил;

m е 0,1 или 2, R3 означава циклохексилна група и R₃a означава Н или m е 1, и R₃ означава циклохексилна или фенилна група, a R₃a образува етиленов мост заедно с R-|;

Y означава 0 или S(O)p, където р е 0,1 или 2;

R4 означава Н; алкилова група с права или разклонена верига, притежаваща от 1 до 6 въглеродни атома, незаместени или заместени с един или повече флуорни атоми и/или заместени с фенилна група; заместен или незаместен ароматен пръстен, подбран от следните: фенил, 4-метоксифенил, 4-2третичен-бутилфенил, 4-метилфенил, 2-, 3- или 4-трифлуоро-метилфенил, фенил, замесетн с с 1 до 5 флуорни атома; или --СН(СРз)-фенил, като такова или под формата на физиологично приемлива сол, включително и стереоизомерите му.

2. Съединение, съгласно Претенция 1, в което:

А означава -СН2- или -СН₂-СН₂-СН₂-;

R( означава Н и R2 означава НОСО(СН2)п· или СНзСН2ОСО(СН2)гг> а η е 1 или 2;

YeO m е 1, R3 означава циклохексилна група и R3A означава Н.

3. Съединение, съгласно Претенция 1, подбрано от: H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-OH,

H-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Me, H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH₂-CF₃, H-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-CH(CF3)2,

H-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-(R или S)CH(Ph)-CF₃, ' H00C-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-0-CH₂-CF3, Et-OOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3, H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-CH₂-CF2-CF2-CF3, H00C-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph, HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-0-Ph(4-OMe), HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-tBu), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-Me), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-F), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(3-F), H00C-CH₂-DCha-Pro-D_ILArg-CH₂-0-Ph(2-F), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(3-CF3), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(4-CF3), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-Ph(2-CF3), HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH₂-O-C₆F5,

-3HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-Et,

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-nPr, H00C-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-0-nBu,

HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-iBu, HOOC-CH2-DCha-Aze-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3,

HOOC-CH₂-DCha-P^DMrg-CH2-O-CH2-CF3, HOOC-CH2-DCha-Pic-D,LArg-CH2-O-nBu,

Me-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH₂-CF3,

Me-SO2-DCha-PrQ-D,LArg-CH2O-CH2-CF3,

Ch-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3, (HOOC-CH2)2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3, (HOOC-CH2)2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-iBu,

H00C-CH₂-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-0-nBu, HOOC-CH2-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF₃₁H-D,LPro(3-TpaHC-Ph)-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3 ' H-D,LPro(3-TpaHC-Ch)-Pro-D,LArg-CH2-OCH2-CF3, HOOC-CH2-DCha-Pro-D,l_Arg-CH2-S-nBu и HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-SO2-nBu, така както са или под формата на физиологично приемливи соли, включително и ** стереоизомерите им.

4. Съединение, съгласно Претенция 1, подбрано от HOOC-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-CH2-CF3, HOOC-CH2-DCha-Pic-D,LArg-CH2-O-CH2-CF₃, HOOC*CH2-DCha-Pic-D,LArg-CH2-O-nBu, HOOC-CH₂-CH2-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-nBu, HOOC-CH₂-CH2-DCha-Pro-DMrg-CH2-O-CH2-CF3n HOOC-CH₂-DCha-Pro-D,LArg-CH2-O-nBu, като такива или под формата на физиологично приемлива сол, включително и стереоизомерите.

5. Съединение, съгласно някоя от претенциите от 1 до 4, с приложение в терапията.

6. Метод за получаване на съединение съгласно някоя от претенции от 1 до

4, характеризиращ се с това, че включва:

(I) заместване с R4Y· (Y = O.S) на халогена от халометилкетона с формула:

в която W-) е блокираща група на N-края, a W₂ е блокираща група; редукция на кетона до алкохол, отстраняване на блокиращата група от N-края, стандартно пептидно свързване, последвано от окисление на алкохола, даващо защитен трипептиден кетон, отстраняване на блокиращата N-края група, последвано от N-алкилиране и деблокиране или заместване на блокирания дипептид в свързването, описано по-горе с ^алкилиран-^трифлуорацил-блокиран дипептид в амино-края, последвано от окисление и деблокиране или (II) алкилиране с Яд-халогенид на алфа-кетол с формула:

-5в която W-| и W₂ са както дефинираните по-горе и след това извършване на реакцията, по способ, описан в (I) или (III) взаимодействие на съединение с формула в която W-] и W₂ са както дефинираните по-горе, с (Т-СН₂СО)₂О, където Т е халоген R4O или R4S и 4-DMAP, след което следва протичане на реакцията, съгласно (I) и, ако е желателно, образуването на физиологична приемлива сол, а в онези случаи, когато в резултат на реакцията се получава смес от стереоизомери, те, обикновено се разделят чрез стандартни хроматографски или прекристализационни техники, а ако е желателно, изолира се отделен стереоизомер.

7. фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва ефективно количество от някое от съединенията, заявени в претенции 1-4 и освен това включващ един или повече фармацевтични носители.

8. Използуване на съединенията от някоя от претенции 1 - 4 като активна съставка за изработването на фармацевтичен препарат за инхибиране на тромбина в човешки или животински организъм.

9. Използуване на съединение, съгласно някоя от претенции 1 - 4, като антикоагулиращ агент.

10. Метод за постигане инхибиране на тромбин в човешки или животински- 6 организъм, при нужда от такова инхибиране, характеризиращ се с това, че включва приемане от споменатия организъм на инхибиращо ефективно количество от някое от съединенията, заявени в някоя от претенции 1 - 4.

11. Метод за лечение или профилактика на тромбоза и хипергоагулация в кръв и тъкани в човешки или животински организъм, характеризиращ се с това, че включва приемането от индивида в нужда от такава профилактика или лечение, на ефективно количество от съединенията, заявени в една от претенции от 1 до 4.

12. Съединение, метод, фармацевтичен състав, приложение и метод, както заявените в някоя от претенции 1 -11 и по-същество, както описаните.