BG98695A - Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза - Google Patents

Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза Download PDF

Info

Publication number
BG98695A
BG98695A BG98695A BG9869594A BG98695A BG 98695 A BG98695 A BG 98695A BG 98695 A BG98695 A BG 98695A BG 9869594 A BG9869594 A BG 9869594A BG 98695 A BG98695 A BG 98695A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
nucleic acid
desaturase
isolated nucleic
acid
gla
Prior art date
Application number
BG98695A
Other languages
English (en)
Other versions
BG61791B1 (bg
Inventor
Terry Thomas
Avutu Reddy
Michael Nuccio
Georges Freyssinet
Original Assignee
Rhone-Poulenc Agrochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Agrochimie filed Critical Rhone-Poulenc Agrochimie
Publication of BG98695A publication Critical patent/BG98695A/bg
Publication of BG61791B1 publication Critical patent/BG61791B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6436—Fatty acid esters
    • C12P7/6445—Glycerides
    • C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19003—Linoleoyl-CoA desaturase (1.14.19.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Fats And Perfumes (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до получаване на -линоленова киселина (glа) чрез ензима 6-дезатураза, катонуклеиновите киселини и рекомбинантните конструкции се използват за получаване на glа в трансгенниорганизми. 6-дезатуразата е ензим от около 359 аминокиселини, има мембранно свързана част и активномясто за дезаториране на мастни киселини. С него се осигурява възможност за получаването на големиколичества glа, използвана в диетологията за предотвратяване на хиперхолестеролемия, атеросклероза и др. Коронарни заболявания. Осигуряват се също клетки и организми, съдържащи насочващите вектори съгласно изобретението и потомци на такива организми. Насочващите вектори се състоят от 6-дезатуразен промотор, кодираща област и ограничаваща област. Изолираната нуклеинова киселина се съдържа в трансгенен организъм, който може да е бактерия, гъба, растителна клетка или животно. Изобретението се отнася и до метод за получаване на растения с увеличеносъдържание на -линоленова киселина, например слънчоглед, соя, царевиц а, тютюн, фъстък или маслодайна рапица, който се състои в трансформиране на растителна клетка с изолирана нуклеинова киселина съгласно изобретението и регенериране на растения сувеличено съдържание на glа от посочената растителнаклетка. Изобретението се отнася и до метод за придаване на студоустойчивост на културните растения.

Description

ИолучаВанс иа гама лимолейова киселина чрез А6-дезатураза
Линолова киселина (18:2) (LA) се трансформира в гама линоленова киселина (18:3) (GLA) чрез ензима Д6-дезатураза. Когато този ензим, или нуклеиновата киселина, която го кодира, сс прехвърли в LA-произвеждащи клетки, се получава GLA. Настоящето изобретение осигурява нуклеинова киселииа, съдържаща Л6-дезатуразния ген. По-специално, нуклеиновата киселина се състои от промотор, кодираща област и ограничаващи области на Δό-дезатуразния ген. Настоящето изобретение е още насочено към рекомбинантни конструкции на Д6-дсзатуразна кодираща област във функционална комбинация с хетероложни регулиращи последователности. Нуклеиновите киселини и рекомбинантните конструкции от настоящето изобретение се използват за получаване на GLA в транегенни организми.
Ненаситеии мастни киселини, такива като линолова (С]8Д9,12) и α-линоленова (Cj8A9,12,18) киселини, са важни диетични съставни части, които не могат да бъдат синтезирани от гръбначни животни, тъй като гръбначните клетки могат да Ш»· вкарват двойни връзки в позицията на мастни киселини, но не могат да вкарват допълнителни двойни връзки между А9 двойната връзка и метиловия край па мастната киселинна верига. Тъй като те са предшественици на други продукти, линоловата и α,-линоленовата киселини са важни мастни киселини и обикновено се получават от растителни източници. Линоловата киселина може да бъде превърната в γ-линоленова (GLA, CjgA6>9,12) киселина от бозайници, която от своя страна може да бъде превърната в арахидонова киселина (20:4), крайно важна мастна киселина, тъй като тя е важна основа за повечето прост агландини.
Диетичното осигуряване на линолова киселина, благодарение на нейното превръщане в GLA и арахидонова киселина, задоволява диетичната нужда от GLA и арахидонова киселина. Все пак, показано е, чс има връзка между консумацията на наситени .мазнини и болестни състояния, такива като хиперхолестеролемиа, атеросклероза и други химични нарушения, свързани с податливост към коронарни заболявания, докато консумацията на ненаситени мазнини се свързва с намаляване на концентрацията на холесшерол в кръвта и намаляване риска от атеросклероза. Терапевтичната полза от диетичната GLA е, че тя е предшественик на арахидоновата киселина и така спомага за простагланднновия синтез. Съответно, консумацията на попе наситената GLA, вместо линоловата киселина, има потенциални здравни предимства. Обаче, GLA не присъства в буквално пито едно от търговско отглежданите културни растения.
Линоловата киселина се превръща в GLA, чрез ензима Абдезатураза. Аб-дезатураза, ензим от около 359 амино киселини, има мембранно-свързана част и активно място за дезатуриране на мастни киселини. Когато този ензим премине в клетки, ендогенно произвеждащи линолова киселина, но не GLA, се получава GLA. Чрез осигуряване на аен-кодираща Аб-дезатураза, настоящето изобретение позволява получавието на трапсгепни организми, които съдържат функционална Аб-дезатураза и които произвеждат GLA. Освен че позволява получаването на големи количества GLA, настоящето изобретение осигурява нови диетични източници на GLA.
л
Настоящето изобретение е насочено към изолиран Δ6дезатуразен ген. По-специално, изолирания ген се състои от А6дезатуразен промотор, кодираща област и ограничаваща област.
Настоящето изобретение още описва насочващи вектори, състоящи се от Аб-дезатуразен промотор, кодираща област и ограничаваща област.
Настоящето изобретение също описва насочващи Вектори, състоящи се от А6-дезатуразна кодираща област В функционална комбинация с хетероложни регулиращи области, т.е. елементи не произтичащи от Аб-дезатуразния ген.
Настоящето изобретение също осигурява клетки и организми, съдържащи векторите от настоящето изобретение и потомци на такива организми.
Настоящето изобретение също осигурява изолирана бактериална А6-дезатураза и освен това е насочено към изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална Л6дезатураза.
По-нататък, настоящето изобретение осигурява метод за получаване на растения с увеличено съдържание на гама линоленова киселина (GLA), които се състои в трансформиране на растителна клетка с изолирана нуклеинова киселина от настоящето изобретение и регенериране на растение с увеличено съдържание на GLA от споменатата растителна клетка.
Настоящето изобретение също осигурява метод за получаване на студоустойчиви растения.
фиг .1 описва хидропатиините профили на извлечените амино-киселинни последователности на Synechocystis Δ6дезатураза /част А) и А12-дезатураза (част В). Предполагаемите мембранно-въртящи се области са обозначени чрез плътни линии. Хидрофобния индекс е изчислен за отрязък от яминокиселинни утайки [Kyte, и др. (1982) J. Molec. Biol. 157]
Фиг.2 описВа газ-течни хроматографски профили на дива (част А) и трансгенна (част В) Anabaena.
Фиг.З е диаграма от карти на козмидите cSy75, cSyl3 и cSy7 със застъпващи сс области и клонинги. Произхидът на клонингите на cSy75, cSy75-3.5 и cSy7 са обозначени чрез наклонени диагонални линии. Дезактивираните ограничителни места са в скоби.
фиг 4 описва газ-течни хроматографски профили на див (част А) и транегенен (част В) тютюн.
Настоящето изобретение осигурява изолирана нуклеинова киселина, кодираща Л6-дезатураза. За да се идентифицира нуклеиновата киселина, кодираща Δό-дсзатураза, сс изолира DNA от организъм, които произвежда GLA. Споменатия организъм може да бъде например животинска клетка, някои гъби (например Mortierella). някои бактерии (като Synechocystis) или определени растения (пореч, Oenothera, френско грозде). Изолирането на геномната DNA може да бъде осъществено чрез множество методи, добре известни за средния специалист в областта, онагледени с примери от Sambrook и др. (1989) в Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY. Изолираната DNA cc разделя на части чрез физични методи или ензимно разлагане и се клонира до подходящ вектор, като бактериофага или козмиден вектор, чрез които и да е от множество добре известни от литературата методи, например от Sambrook и др. (1989). Поспециално разглеждани тук, са насочващи вектори, съдържащи DNA от настоящето изобретение. DNA кодиращата Δ6дезатураза може да бъде идентифицирана чрез функционален анализ. Векторът, съдържащ разделената на части DNA, се прехвърля, например посредством инфекция, трансконюгация и трансфекция, в гостоприемен организъм, които произвежда линолова киселина, но не GLA. Използваният тук термин трансформация означава най-общо вграждане на чужда DNA в гостоприемна клетка. Методи за вкарване на рекомбинантна DNA в гостоприемен организъм са известни на средния специалист В областта и са изложени, например, в Sambrook и др_. (1989). Произвеждането на GLA от тези организми (те. придобиване на функция) се изследва, например, чрез газова хроматография или други методи, известни на средния специалист в областта. Организмите накарани да произвеждат GLA, т е. придобили функция, чрез Вкарването на Вектора, се идентифицират, като се извлича DNA кодиращата Δ6дезатураза, а споменатата DNA се възстановява от организмите. Възстановената DNA може отново да се раздели на части, да сс клонира с насочВащи Вектори и да се оцени функционално по горните процедури, за да се определи с по-голяма точност DNA кодиращата Д6-дезатураза.
Като пример от настоящето изобретение се изолира произволна DNA от цианобактерията Synechocystis Pasteur Culture Collection (PCC) 6803, American Type Culture Collection (ATCC) 27184, клонира се в козмиден вектор и се вкарва чрез трансконюгация в цианобактерийния щам Anabaena РСС 7120, АТСС 27893, който е с недостиг на GLA. Получаването на GLA от съдържаща Anabaena линолова киселина се следи чрез газова хроматография и се изолира съответния DNA фрагмент.
Изолираната DNA се структурира чрез методи добре известни на средния специалист в областта, като например в Sambrook и др. (1989).
В съответствие с настоящето изобретение се изолира DNA съдържаща Д6-дезатуразен ген. По-специално, от цианобактерията Synechocystis се изолират 3.588 килобаза (kb) DNA. съдържаща А6-дезатуразен ген. Определя се нуклеотидната последователност на 3.588 kb DNA, която е показана в SEQ ID N0:1. Отворени отчитащи контури, определящи потенциални кодиращи области, присъстват в нуклеотиди от 317 до 1507 и в нуклеотиди от 2002 до 3081. За да се определят нуклеотидите кодиращи А6-дезатураза, 3.588 kb фрагмента, който причиняВа Лб-дезатуразна активност се разцепва на два подфрагмента, всеки от които съдържа само един отворен отчитащ контур. Фрагментът ORF1 съдържа нуклеотиди от 1 до 1704, докато фрагмента ORF2 съдържа нуклеотиди от 1705 до 3588. Всеки фрагмент се субклонира в двете права и обратна ориентации до копюгиращ насочващ вектор (АМ542, Wolk и др. [1984] Proc. Natl. Acad. Sei, USA 81, 1561), който съдържа цианобактериален карбоксилазен промотор. Получените структури [т.е. ORF1(F), ORF1(R), ORF2(F) и ORF2(R)] се конюгират до див тип Anabaena РСС 7120 посредством стандартни методи (виж, например, Wolk и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 1561). Конюгираните клетки от Anabaena се идентифицират, като NeoR зелени колонии върху кафява основа от умиращи неконюгирани клетки, след двуседмичен растеж върху селективна среда (стандартна минерална среда BG11N + съдържаща 30 цгр/мл неомицин, съгласно Rippka и др., (1979) J. Gen Microbiol. Ill, 1). Подбират се зелените колонии и израстват в селективна течна среда (BG11N + с 15 нгр/мл неомицин). Чрез стандартни методи се екстрахират липиди (например, Dahmer и др., (1989) Journal of American Oil Chemical Society 66, 543) от получените трансконюгати, съдържащи право и обратно ориентираните ORF1 и ORF2 конструкции. За сравнение, липидите също се екстрахират от диви типове култури Anabaena и Synechocystis. Метиловите естери на мастни киселини се анализират чрез газ-течна хроматография (GLC), например с Тгасог-560 газ-течен хроматограф, снабден с йонизиращ детектор с водороден пламък и капилярна колона. Резултатите от GLC анализа са показани в таблица 1.
Таблица 1: Разпространение на С18 мастни киселини във диВ тип цианобактерия и трансгенна цианобактерия
Източник 18:0 18:1 18:2 γ18:3 ο 18:3 18:4
Anabaena(див тип) 4- + + - 4- -
Anabaena 4- ORF1(F) + + + - + -
Anabaena + ORF1(R) + 4- - + -
ΐ Anabaena + ORF2(F) + + + + 4· 4-
1 Anabaena + ORF2(R) 4- 4- + - 4- -
1 Synechocystis (див тип) + + + + • -
Както показва GLC анализът, Anabaena с недостиг на GLA придобива свойството (функцията) да произвежда GLA, когато се вкарва чрез трансконюгация, конструкцията съдържаща ORF2 в права ориентация. Транконюгати, съдържащи конструкции с ORF2 в обратна ориентация спрямо карбоксилазния промотор или ORF1 в която и да е ориентация, не произвеждат GLA. Този анализ показва, че единичния отворен отчитащ контур (ORF2) в 1884-ия Ьр фрагмент кодира Л6-дезатураза. 1884-ия Ьр фрагмент е SEQ ID N0:3. Това се потвърждава от цялата прилика на хидропатийните профили между Аб-дезатураза и А12-дезатураза [Waga и др. (1990) Nalure 347], както е показано на Фиг.1, като (А) и (В), съответно.
Изолираните нуклеинови киселини, кодиращи Аб-дезатураза, могат да бъдат различени от другите организми, които произвеждат GLA, чрез описания по-горе анализ за придобито свойство или чрез хибридизационни методи с нуклеинова киселица, използващи изолираната нуклеинова киселина, която кодира Anabaena Аб-дезатураза, като хибридизационна проба. И двата геномен и cDNA клониращ метод са известни на специалистите и са изложени в настоящето изобретение. Хибридизационната проба може да съдържа цялата DNA последователност, описана като SEQ. ID N0:1 или ограничаващ фрагмент или друг съответен DNA фрагмент, включващ олигонуклеотидна проба. Методите за клониране на хомоложни гени чрез кръстосана хибридизация са известни на средния специалист в областта и са описани, например, в Sambrook (1989) и Beltz и др. (1983) Methods in Enzymology 100. 266.
Трансгенните организми, които са придобили функцията да произвеждат GLA, чрез вкарване на DNA кодираща А-дезатураза, също така придобиват свойството да произвеждат октадекатетраеонна киселина (18:4дбА12,15) f Октадекатетраеонна киселина присъства обикновено в рибни масла и в някои растителни видове от рода Boraginaceае (Craid и др_. [1964] J. Amer, Oil Chem. Soc. 41. 209-211; Gross и qp. [1976] Can. J. Plant Sei. 56, 659-664). В трансгенните организми от настоящето изобретение октадекатетраеноената киселина се получава от по-нататъито дезатуриране на а-линоленова киселина чрез Аб-дезатураза или дезатуриране на GLA посредством А15-дезатураза.
359-те аминокиселини кодирани от ORF2, т.е. отворения отчитащ контур кодиращ Аб-дезатураза, са показани като SEQ.
ID N0:2. Настоящето изобретение също описва други нуклеотидни последователности, които кодират аминокиселините от SEQ ID N0:2. В компетенцията на средния специалист е да идентифицира такива последователности, които се получаВат, например, от дегенерирането на генетичния код. ОсВен тоВа, средния специалист В областта може да определи, посредством описания по-горе анализ за придобито свойство, по-малки подфрагменти на 1884-ия Ьр фрагмент, съдържащ ORF2, които кодира Аб-дезатураза.
Настоящето изобретение изследва който и да е полипептиден фрагмент на Аб-дезатураза и съответните нуклеинови киселини, който запазва активност за превръщане на LA в GLA.
В друг аспект на настоящето изобретение, вектор съдържащ 1884-ия Ьр фрагмент или по-малък фрагмент съдържащ промотор, кодираща последователност и ограничаваща област па Аб-дезатуразен ген се прехвърля в организъм, например цианобактерия, в която Аб-дезатуразния промотор и ограничаващите области са функционални. Съответно, това изобретение осигурява организми произвеждащи рекомбинантна Аб-дезатураза. Още един аспект на настоящето изобретение е осигуряването на изолирана Аб-дезатураза, която може да бъде пречистена от рекомбинантните организми, чрез стандартни методи за протеиново пречистване. (Виж, например, Ausubel и др. [1987] Current Protocols in Molecular Bioloev. Green Publishing Associates, New York).
Настоящето изобретение също осигурява вектори съдържащи DNA кодираща Аб-дезатураза. За средния специалист в областта е очевидно, че могат да бъдат конструирани подходящи вектори, които да насочват преминаването на Δ6дезатуразната кодираща последователност в множество организми. По-специално се предпочиташ възпроизвеждащи се насочващи вектори. Описаните тук възпроизвеждащи се насочващи вектори са DNA или RNA молекули, конструирани за контролирано насочване на желания ген, т.е. Аб-дезатуразния ген. За предпочитане векторите са плазмиди, бактериофаги, козмиди или Вируси. Совалкови вектори, като описаните от Wolk и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1561-1565 u Bustos и дд. (1991) J, Bacteriol. 174, 7525-7533, се изследват в настоящето изобретение. Sambrook и др. (1989), Goeddel, ed. (1990) Methods in Enzymology 185 Academic Press u Perba.1 (1988) A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons, Inc., дават подробен преглед на вектори в които може да бъде вкарана и насочена нуклеинова киселина кодираща наличната Аб-дезатураза. Такива вектори също съдържат нуклеинови киселинни последователности, които могат да влияят на насочването на нуклеиновите киселини, кодиращи Аб-дезатураза. Последователности, способни да Влияят на насочВането на генен продукт, са промотори, усилващи елементи, възходящо активиращи последователности, транскрипционни ограничаващи сигнали и полиаденилиращи f места. Разглеждат се и двата съставен и тъканно-специфичен промотори. По-специално интересни за трансформиране на растителни клетки са 35S промотора на цветнозелевия мозаечен Вирус (CaMV) и промотори, които се регулират по време на узряването на растителните семена. Всички тези промотори и транскрипционни регулаторни елементи, самостоятелно или в комбинация, се разглеждат за използване в настоящите възпроизвеждащи се насочващи вектори и са известни на средния специалист в областта. CaMV 355 промотора е описан, например, от Restrepo и др. (1990) Plant Cell 2, 987. Също се изследват генетично конструирани и мутирали регулаторни последователности. Средния специалист в областта може да определи подходящите вектори и регулаторни елементи за носител в конкретна гостоприемна клетка. Например, вектор съдържащ промотора от гена, кодиращ карбоксилазата на Anabaena. оперативно свързан с кодиращата област на Δ6дезатураза и също оперативно свързан с ограничаващ сигнал от Synechocystis, е подходящ за носител на Лб-дезатураза в цианобактерия. Оперативно свързан, в този контекст, означава, че промотора и ограничаващите последователности действат ефективно за регулиране на транскрипцията. Примерно, вектор, подходящ за носител на Δό-дезатураза в трансгенни растения, може да включва семенно-специфична промоторна последователност, получена от хелиантинин, напин или глицин, оперативно свързана с Лб-дезатуразната кодираща област и също оперативно свързана със семенен ограничаващ сигнал или с нопалиновия синтазен ограничаващ сигнал.
По-специално, хелиантининовите регулаторни елементи, описани в нерешена U.S. заявка No. 682 354, заявена на осми април 1991 и цитирана тук за справка, са описани като промоторни елементи, насочващи пренасянето на А6-дезатуразата от настоящето изобретение.
Модификациите на описаните тук нуклеотидни последователности или регулаторни елементи, които притежават дадените тук функции са в обхвата на това изобретение. Такива модификации са прибавки, заместители и заличите ли и специфични заместители, които отразяват разрушаването на генетичния код.
Стандартните методи за конструиране на такива хибридни вектори са добре известни на средните специалисти в областта и са описани в публикации, такива като Sambrook и др. (1989) или който и да е от миогобройните, широко разпространени лабораторни наръчници за рекомбинантна DNA технология. Познати са множество подходи за лигазиране на фрагментите на DNA, изборът на които зависи от естеството на края на DNA фрагментите. По-нататък се описва Включването в хибридните вектори на други елементи с нуклеотидни последователности, които улесняват клонирането, насочването или обработката, например последователности, кодиращи сигнални пептиди, последователност, кодираща KDEL, която е необходима за задържане на протеините в ендоплазмичния ретикулум или последователности, кодиращи транзитни пептиди, които насочват Дб-дезатуразата към хлоропласта. Такива последователности са известни на средния специалист в областта. Оптимизиран транзитен пептид е описан, например, в Van den Broeck и др. (1985) Nature 313. 358. Прокариотни и еукариотни сигнални последователности са описани, например, от Michaelis и др. (1982) Ann. Rev. Microbiol. 36, 425.
Друг аспект от настоящето изобретение осигурява организми различни от цианобактерията, които съдържат DNA, кодираща Дб-дезатуразата от това изобретение. Трансгенните организми, съответно описани в настоящето изобретение, са бактерии, циано бактерии, гъби и растения и животни. Изолираната DNA от настоящето изобретение може да бъде вкарана в гостоприемника по методи известни от нивото на техниката, например, инфекция, трансфекция, трансформиране или трансконюгация. Методите за трансфер на DNA от настоящето изобретение в такива организми са добре известни и са описани в публикациии, такива като Sambrook и др. (1989).
Известни са множество методи за трансформиране на растения. А6-дезатуразния ген може да бъде вкаран в растенията през листото, чрез трансформационно-регерациоина процедура, описана от Horsch и др_. (1985) Science 227, 1229. Други методи за трансформация, такива като протопластиа култура (Horsch и др. (1984) Science 223. 496; DeBlock и др. (1984) ЕМВО J. 2. 2143; Barton и др. (1983) Cell 32, 1033), могат също да бъдат използвани и са в обхвата на това изобретение. За предпочитане е растенията да се трансформират с Agrobacterium- получени вектори. Все пак, известни са и други методи за вкарване на Δ6дезатуразния ген от настоящето изобретение в растителни клетки. Такива алтернативни методи са бнолистни подходи (Klein и др. (1987) Nature 327. 70), електроиорация, химическииндуцирано DNA поемане или използване на вируси или цветен прашец, като вектори.
Когато е необходимо за метода на трансформация, Δ6дезатуразния ген от настоящето изобретение може да бъде вкаран в растителен трансформационен Вектор, като двойния вектор, описан от Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12. 8111. Растителни трансформационни вектори могат да бъдат получени чрез модифициране на естествената генна система за трансфер на Agrobacterium tumefaciens. Естествената система включва големг Ti (тумор-предизвикващи)-плазмиди, съдържащи голям сегмент, известен като Т-DNA, който е прехвърлен на трансформираните растения. Друг сегмент от Ti плазмида, vir областта, е необходим за Т-DNA трансфер. Т-DNA областта граничи с крайни повтарящи се елементи. В модифицираните двойни вектори тумор-предизвикващите гени са премахнати и функциите на vir областта се използват да прехвърлят чуждата DNA, граничеща с Т-DNA граничните последователности. Тобластта съдържа, също, селективен маркер за антибиотична устойчивост и многократно клониращо място за вкарване на последователности за трансфер. Такива конструирани щамове са известни като обезвредени A. tumefaciens щамове и позволяват ефикасна трансформация иа последователности, граничещи с Тобластта в ядрените геноми на растенията.
Повърхностно-стерилизирани листа се заразяват с обезвредения A. tumefaciens. съдържащ чужда DNA, култивират се за два дни и след това се прехвърлят в среда, съдържаща антибиотик. След внедряването в среда, съдържаща подходящ антибиотик се избират трансформирани части от тъкан, прехвърлят се в пръст и регенерират.
Като друг аспект от това изобретение се осигуряват трансгенни растения или прогени на тези растения, съдържащи изолирана DNA от това изобретение. Изследват се както едносемеделни, така и двусемеделни растения. Растителни клетки се трансформират с изолираната DNA кодираща Δ6дезатураза по който и да е от методите за трансформиране на растения, описани по-горе. Трансформираната растителна клетка, обикновено намираща се в новообразувание на кората или в листото, регенерира до завършено трансгенно растение по методи добре известни на средния специалист от областта (nanp. Borsch и gp, (1985) Science 227. 1129). За предпочитане, трансгсниото растение е слънчоглед, маслодайна рапица, царевица, тютюн, фъстък или соя. Тъй като прогените на трансформираните растения наследяват DNA кодираща Δ6дезатураза, семена или отрязъци от трансформираните растения се използват, за да поддържат трансгенната растителна линия.
Настоящето изобретение съгцо осигурява метод за получаване на трансгенни растения с увеличено съдържание на GLA. Този метод включва вкарване на DNA кодираща Δ6 дезатураза В растителни клетки, които нямат GLA или са с ниски ниВа на GLA, но съдържат LA, и регенериране на растения с увеличено съдържание на GLA от трансгенните клетки. Поспециално, като трансгенен организъм се използВат търговско отглеждани културни растения, като слънчоглед, соя, маслодайна рапица, царевица, фъстък и тютюн, без те да се считат за ограничаващи.
Настоящето изобретение, също осигурява метод за получаване на трансгенни организми, които съдържат GLA. Този метод Включва вкарване на DNA кодираща Аб-дезатураза В организъм, който няма GLA или е с ниски ниВа на GLA, но съдържа LA. В друг случай, Включва вкарване на един или повече насочващи вектори, които съдържат DNA кодираща А12дезатураза и Аб-дезатураза в организми, които са с недостатъчно GLA и LA. Съответно, организми с недостатъчно GLA и LA се предизвикват да произвеждат LA чрез вкарването на А12-дезатураза, а след това генерират GLA, вследствие на Вкарването Аб-дезатураза. Насочващи вектори, съдържащи DNA кодираща А 12-дезатураза или А12-дезатураза и Аб-дезатураза, могат да бъдат конструирани по методите на рекомбинантната технология, известни на средния специалист от областта (Sambrook и др., 1989) и публикуваната последователност на А 12дезатураза (Wada и др [1990] Nature (London) 347. 200-203). Също така е намерено, в съответствие с настоящето изобретение, че иуклеотиди 2002-3081 от SEO. ID N0:1 кодират цианобактериалната А 12-дезатураза. Съответно, тази последователност може да се използва за конструиране на споменатите насочващи вектори. По-специално, като шраисгенен организъм се използват търговско отглеждани културни растения, като слънчоглед, соя, маслодайна рапица, царевица, фъстък и тютюн, без те да се считат за ограничаващи.
Настоящето изобретение съгцо е насочено към метод за предизвикване на студоустойчивост в растения. Чувствителността към студ може да се дължи на фазово преминаване на липиди в клетъчни мембрани. Температурата на фазово преминаване зависи от степента на ненаситеност на мастни киселини В липидните мембрани и по-този начин увеличавайки степента на ненаситеност, например чрез Вкарване на Лб-дезатураза, която да преобразува LA в GLA, може да се предизвика или подобри студоустойчивостта. Съответно, настоящият метод включва вкарването на DNA кодираща Δ6с^езатураза в растителна клетка и регенериране на растение с подобрена студоустойчивост от споменатата трансформирана растителна клетка. За предпочитане растението е слънчоглед, соя, маслодайна рапица, царевица, фъстък или тютюн.
СледВащите примери илюстрират настоящето изобретение.
Пример 1
Щамове и условия за култивиране
Synechocyslis (РСС 6803, АТСС 27184), Anabaena (РСС 7120, АТСС 27893) и Synechococcus (РСС 7942, АТСС 33912) се отглеждат фотоаВтотропно при 30° С В BG11N + среда (Rippka и др. [1979] J, Gen. Microbiol. 111. 1-61) при осветяване от лампи с мажежаема жички (60 itE.m-Z.S-1). Избират се козмиди и плазмиди и се размножават в Escherichia coli щам DH5a върху LB среда с прибаВеии антибиотици при стандартни концентрации, както е описано om Maniatis u cip. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York.
Пример 2
Конструиране на Synechocystis козмидна геномна съвкупност
Общата геномна DNA от Synechocystis (РСС 6803) се разрежда частично с Sau3A и се фракционира при захарозеи градиент (Ausubel и др. [1987] Current Protocols in Molecular Bjplogy, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Избират се фракциите, съдържащи 30 до 40 kb DNA фрагменти и се лигазират в дефосфорилираното Bam.HI място на козмидпия вектор, pDUCA7 (Buikema и др. [1991] J. Bacteriol. 173. 1879-1885). Аигазираната DNA се опакова in vitro както е описано от Ausubel и др. (1987) и опакованата фага се размножава В Е. coli DH5a, съдържаща Aval и Есо4711 метилазен помощен плазмид, pRL528, както е описан от Buikema и др., .1991. Общо 1152 колонии се изолират в произволен ред и се отглеждат индивидуално в дванадесет 96-гнездни микротитърни плочи.
Пример 3
Придобиване на функция след вкарване на GLA в Anabaena
Anabaena (РСС 7120), пръчковидна цианобактерия, е с недостиг иа GLA, но съдържа значителни количества линолова киселина, която е предшественик на GLA (фигура 2, таблица 2). Svnechocvstis козмидната съвкупност, описана в пример 2, се конюгира в Anabaena (РСС 7120), за да се идентифицират трансконюгатите, които произвеждат GLA. Клетките Anabaena се отглеждат до средна фаза в BG11N+ течна среда и се pecycnengupam В същата среда до получаване на крайна концентрация от приблизително 2х108 клетки на мл. Културата от средната фаза, Е. coli RP4 (Burkardt и др. [1979] J. Gen. Microbiol. 114. 341-348), отгледана в LB, съдържаща ампицилин, се промива и ресуспендира в свежа LB среда. След това Anabaena и RP4 се смесват и се разполагат равномерно върху BG11N 4- плочи, съдържащи 5% LB. Козмидната геномна съвкупност отново се разполага върху LB плочи, съдържащи 50 цгр/мл канамицин и 17.5 цгр/мл хлорамфеникол и последователно се поставя на BG11N + плочи, съдържащи Anabaena и RP4. След 24 часов престой в инкубатор при 30° С, се подслоява 30 цгр/мл неомицин и престоя в инкубатор, при 30° С, продължава докато се появят т р а нсконю гат и.
След конюгация се изолират индивидуални трансконюгати и се отглеждат в 2 мл. BG11N + течна среда с 15 цгр/мл неомицин. Получават се метилови естери на мастна киселина от див тип култури и култури съдържащи множества от по десет трансконюгати, както следва. След центрофугиране се получават див тип и трансгенни цианобактериални култури, които се промиват двукратно с дестилирана вода. От тези култури се екстрахират метилови естери на мастна киселина, както е описано от Dahmer и др. (1989) J.Amer. Oil. Chem. Soc. 66, 543-548, и се анализират чрез газ-течна хроматография (GLC), като се използва Tracer-560, снабден с водородно-пламъчен йонизационен детектор и капилярна колона (30 м х 0.25 мм свързана с FSOT Superox И, Alltech Associates Inc., IL). За идентифициране на мастни киселини се използват времената на задържане и кохроматография на стандартни проби (получени от Sigma Chemical Co.). Средната мастно-кисела композиция се определя като съотношение на пиковата стойност (област) на всяка CI8 мастна киселина към нейната стандартна стойност.
Представителни GLC профили са показани на фиг. 2. Показани са метилови естери на С18 мастна киселина. Пиковете се идентифицират, чрез сравняване на времената за елюиране с известните стандартни стойности за метилови естери на мастна киселина и след това се потвърждават чрез газхроматографска масс спектрометрия. Част А представлява GLC анализ на мастни киселини от див тип Anabaena. Стрелката показва миграционното време на GI.A. Част В представлява G1.C профил на мастни киселини на трансконюгати от Anabaena с pAM54'2 + 1.8F. За две GLA произвеждащи множества (от 25 множества с общо 250 трансконюгати) се доказва, че произвеждат GL.A. Индивидуални трансконюгати от всяко от тези множества се анализира за това дали произвежда GLA; два независими трансконюгата, AS13 и AS75, по един от Всяко множество, се идентифицират, че имат значителни ниВа GLA и че съдържат козмиди, съответно, cSyl3 и сВу75 (фигура 3). Козмидите се застъпват в област с дължина приблизително 7.5 * kb. 3.5 kb Nhel фрагмент от cSy75 се реклонира във вектор pDUCA7 и се прехвърля в Anabaena, която придобива функция да отделя GLA (таблица 2).
Два Nhel/Hind III подфрагмента (1.8 и 1.7 kb) па 3.5 kb Nhe I фрагмента на cSy75-3.5 се субклонират в pBLUESCRIPT (Stratagene) (фигура 3) за получаване на последователност. Прилагат се стандартни молекулярни биологични методи, както е описано от Maniatis и др. (1982) и Ausubel и др. (1987). Осъществява се получаване на дидеокси последователност (Sanger и др. [1977] Proc. Natl. Acad, Sei, USA 74, 5463, 5467) на pBSl.8 c SEQUENASE (United States Biochemical) на двете вериги, чрез използване на специфични олигонуклеотидни първични слоеве, синтезирани от Advanced DNA Technology Laboratory (Biology Department, Texas A & M University). Осъществява се анализ на DNA последователността с GCG ( Madison, WI) софтуер, както е описано от Devereux и др. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395.
Двата подфрагмента Nhel/Hindlll се прехВърлят в конюгиращ насочващ Вектор АМ542, както В праВа, така и В обратна ориентация спрямо цианобактериалния карбоксилазен промотор и се вкарват в Anabaena чрез конюгацпя. Траискоиюгатите, съдържащи 1.8 kb фрагмента в права ориентация (AM542-1.8F) произвеждат значителни количества GLA и октадекатетраеноена киселина (фигура 2; таблица 2). Траиконюгати, съдържащи други конструкции, обратно ориентиран 1.8 kb фрагмент или праВо и обратно ориентиран 1.7 kb фрагмент, не произвеждат Видими ниВа GLA (таблица 2).
Във фигура 2 се сравняват С18 мастно-киселинен профил на екстракт от диВ тип Anabaena (фигура 2А) с този на траисгенна Anabaena. съдържаща 1.8 kb фрагмента на cSy75-3.5 В праВата си ориентация (фигура 2В). GLC анализът на метилови естери на мастна киселина от AM542-1.8F показва пик с Време на задържане, идентично с тоВа на автентичната стандартна GLA. Анализът на този пик чрез газ-хроматографска масс спектрометрия (GC-MS) показва, че той има същото масс фрагментиране, като GLA проба. Трансгенни Anabaena с променени нива на полиненаситени мастни киселини са подобни на дивия тип по темп на растеж и морфология.
Таблица 2 ( 'ucmaB ма (18 мастни киселини В диВ тип и В трансаениа цианобактерия
Щам Мастна киселина (%) |
18:0 1 18:1 18:2 18:3 (α) 18:3 (у) 18:4 1
Див тип 1
Synechocystis (sp.PCC6803) 13.6 4.5 54.5 - 27.3 •
An abac п a (sp.PCC'7120) 2.9 24.8 37.1 35.2 -
Synecliococcus ! (Sp.PCC7942) 20.6 79.4 - - -
Anabaena трансконк ______ щати _
cSy'75 3 8 24.4 22.3 9.1 27.9 12.5
c Sy 75-3.5 4.3 27.6 18.1 3.2 40.4 6.4
p/kM542- 1.8F 4.2 13.9 12.1 .19.1 25.4 25.4
pAM542-1.8R 7.7 23.1 38.4 30.8 - -
pAM542-1.7F 2.8 27.8 36.1 -*> «-V - -
pAM542-1.7R 2.8 25.4 42.3 29.6 - 1
Synecliococcus трансформанти
р AM 854 27.8 72.2 - - - -
ρΛΜ854-Δ12 4.0 43.2 46.0 - - -
ρΛΜ854-Δ6 18.2 81.8 - - - -
ρΛΜ854-Δ6 & Δ12 42.7 25.3 19.5 - 16.5 • 1
18:0, стеаринова киселина; 18:1, олеинова киселина; 18:2, линолова киселина; 18:3(а), α-линолеиова киселина; 18:3(у), у-линолепова киселина; 18:4, октадекатстраеноена киселина
Пример 4
Трансформиране на Svnechococcus с Аб и Δ12 дезатуразни гени
Трета козмид, cSy'7, който съдържа А12-дезатуразен ген, се изолира чрез отделяне от Synechocystis геномната съвкупност на олигонуклеотид, синтезиран от публикуваната Synechocystis дезатуразиа генна последователност (Wada и др. [1990] Nature (London) 347, 200-203). 1.7 kb Aval фрагмент от този козмид, съдържащ Л12-дезатуразния геи, се идентифицира и служи като пример, за да демонстрира, не cSy!3 съдържа не само Лбдезатуразеи ген, но също и Д12-дезатуразен ген (фигура 3). ’w Геиомния Southern Blot анализ показва, че и двата Δ6 и Δ12дезатуразни гена са уникални за Synechocystis геном, така че двата функционални гена, включени в С18 мастно-киселинното дсзатуриранс, са тясно свързани в Synechocystis генома.
Едноклетъчната цианобактерия Synechocystis (РСС 7942) е с недостатъчно съдържание, както па линолоВа киселина, така и на GLA(3). А12 и Δ6 дезатуразните гени се клонират индивидуално и заедно в рАМ854 (Bustos и др. [1991] J. Bacteriol. 174. 7525-7533), совалков вектор, който съдържа последователности, необходими за интегриране на чуждата DNA в генома Synecliococcus (Golden и др. [1987] Methods in Enzymol. 153. 215-231). Synecliococcus се трансформира с тези гении конструкции и се избират колонии. Метиловите естери на мастна киселина се екстрахират от транегенна Synechococcus и се анализират чрез GLC.
Таблица 2 показва, че основните мастни киселини на дивия тип Svnechococcus са стеаринова киселина (18:0) и олеинова киселина (18:1). Synechococcus трансформиран с ρΑΜ854-Δ12 отделя линолова киселина (18:2), освен основните мастни киселини. Трансформантите с ρΑΜ854-Δ6 и Δ12 произвеждат, както линолеат, така u GLA (таблица 1). Тези резултати показват, че Synechococcus. съдържащ и двата Л12- и Лбдезатуразни гена, придобива способността да вкара втора двойна връзка в Δ 12 позиция и трета двойна връзка в Δ6 позиция на С18 мастни киселини. Все пак, не се забелязват промени в мастнокиселинния състав на трансформанта, съдържащ рАМ854-лб, което показва, че при отсъствието па субстрат синтезиран от л !2-дезатураза, лб-дезатуразата не е активна. Освен тоВа този експеримент показва, че 1.8 kb Nhel/Hindlll фрагмента (фигура 3) съдържа, както кодираща, така и промоторна област на Svnecliocvstis Аб-дезатуразния ген. Трансгенните Synechococcus с променени нива на полиненаситени мастни киселини са подобни на дивия тип по темп иа растеж и морфология.
Пример 5
Нуклеотидна последователност на Дб-дезатураза
Определя се нуклеотидната последователност на 1.8 кв фрагмента на cSv75-3.5, Включващ функционалния Аб-дезатуразен ген. Идентифицира се отворен отчитащ контур, кодиращ полипептид от 359 амино киселини (фигура 4). Kyte-Doolittle хидропатисн анализ (Kytc и др. [1982] J. Mol. Biol. 157. 105-132) показВа две области на хидрофобни амино киселини, които могат да представляват трансмембранни домени (фигура 1А); освен това, хидропатийпия профил на лб-дезатуразата е подобен на този на А12-дезатуразния ген (фигура IB; Wada и др.) и на Δ9дезатуразите (Thiede и др. [1986] J. Biol. Chem. 261, 13230-13235). Подобието на последователностите между Synechocystis Δ6- и Δ12- дезатурази е по-малко от 40% при нуклеотидното пиво и е приблизително 18% при амино-киселинното ниво.
Пример 6
Трансфер на цианобактериална А6-дезатураза в тютюн
Цианобактериалния Д6-дезатуразен ген се вкарва в растителен насочващ вектор и се прехвърля в тютюн, като се използва гении методи за трансфер, посредством Agrobacterium среда За да сс осигури, че прехвърлената дезатураза е подходящо внедрена в листа и развиващи се семена и че дезатуразния генеи продукт е насочен към ендоплазмения ретикулум или към хлоропласта, се коиструират разнообразни насочващи касети с Syncchocystis А-дезатуразен отворен отчитащ контур (ORF). Компонентите на тези касети са : (1) 35S промотор или семенноспецифичен промотор, извлечен от слънчогледовия хелиаптишшоВ геи, за насочване па А6-дезатуразното генио отделяне ВъВ Всички растителни тъкани или съответно само в развиващите се семена, (Н) предполагаем сигнален пептид от морковен екстенсинов ген или от слънчогледов хелиантининов геи, които да насочи ново-синтезираната Аб-дезатураза в ER, (iii) ER лумен ограничаваща сигнална последователност (KDEL) в СООН-края иа А6-дезатуразш1я ORl·' и (iv) оптимизиран транзитен пептид, за насочване на Аб-дезатуразата в хлоропласта. 35S промотора е производно на pRTL2, описано от Restrepo и др. (1990). Оптимизираната транзитна пептидна последователност ,е описана от Van de Broeck и др. (1985). Морковният екстенсинов сигнален пептид е описан от Chen и др (1985) ЕМВО J. 9, 2145.
Получават се транегенни тютюневи растения, съдържащи химеричен цианобактериален дезатуразен ген, състоящ се от Synechocystis А6-дезатуразния ген свързан с ендоплазмена ретикулумна ограничаваща последователност (KDEL) и екстснсинов сигнален пептид, движен от CaMV 35S промотор. PCR увеличения на трансгенната тютюнева ге помпа DNA показват, че Аб-дезатуразния ген е вграден в тютюневия геном. Метилови естери на мастна киселина от листата на тези трансгенни тютюневи растения се екстрахират и анализират чрез газ-течна хроматография (GLC). Този трапсгепен тютюн акумулира значителни количества GLA (фигура 4). фигура 4 показва метилови естери на мастна киселина, както са определени, чрез GLC. Пиковете се определят, чрез сравняване на времето за елюиране с известните стандарти за метилов естер на мастна киселина. Съответно, цианобактериални гени, включени в мастно-киселинния метаболизъм, могат да бъдат използвани за да генерират трансгенни растения с променен мастно-кисел състав.
Списък на последователности (1) Обща информация :
(i) Заявител : Thomas, Terry L.
Reddy, Avutu S. Nuccio, Michael Freyssinet, Georges L.
Hi) Заглавие на изобретението : Получаване па гама линоленова киселина чрез делта 6-дезатураза (iii) Брои последователности : 3 (iv) Адрес за кореспонденция :
(A) Адресант : Scully, Scott, Murphy & Presser (B) Улица : 400 Garden City Plaza (C) i’pag : Garden City (D) Щат : New York (E) Държава : САЩ (F) ZIP kog : 11530 (v) Компютърно оборудване (А) Носител : Флопи диск (Ί3) Компютър : IBM PC съвместим (C) Операционна система : PC-DOS/MS-DOS (D) Софтуер : Patentin Release #1.0, Version #1.25 (vi) Налични данни за описанието (A) Номер на описанието :
(B) Дата на подаване : 08 януари 1992 (C) Класификация :
(vii) Информация за пълномощника :
(A) Име : McNulty, William Е.
(B) Регистрационен номер : 22606 (C) Списъчен номер : 8383Z (ix) Телекомуникационна информация (A) Телефон : (516) 742-4343 (B) Телефакс : (516) 742-4366 (C) Телекс : 230 901 SANS UR (2) Информация за SEQ (последователност) ID N0:1 :
(i) Характеристики на последователността (A) Дължина : 3588 базови двойки (B) Тип : нуклеинова киселина (C) Вид на веригата : и двата вида (D) Топология : линейна (и) Тип молекула : DNA (гепомна) (ix) Особености :
(A) Име/код : CDS (B) Местонахождение : 2002...3081 (xi) Описание на последователността : SEQ ID N0:1 :
GCTAGCCACC AGT GACGAT G CCTTGAATTT GGCCATTCTG ACCCAGGCCC GTATTCTGAA 60
TCCCCGCATT CGCATTGTTZi ATCCtTTTGTT C A AC C AT GC C CTGGGTAAAC GT T TAG AC AC 120
CACCTTGCCA GACCACGTTA GTT-TGAGTGT TTCCGCCCTG GCGGCCCCGA TTTTTTCCTT 180
TGCGGCTTTG GGCAATCAGG CCrATCGGGCA ATTGCGTTTG TTTGACCAGA CTTGGCCCAT 240
TCAGGAAATT GT CAT TO ACC AAGACCATCC CTGGCTCAAT TTACCCCTGG CGGATTTATG 300
GGATGATCCG AGCCGAATGT TGATCT ATTA CCT ACCGGCC C AC AGT GA A A CGGATTT AGT 360
AGGCGCAGTG GT G A AT A AT T TAACGTTGCA ATCTGGGGAC CATTTAATAG TGGGACAAAA 420
ACCCCAACCC A AG ACC A A AC GGCGATCGCC TTGGCGCAAA TTTTCCAAAC TGATTACCAA 480
C C T GC GGG AG TA'fCAGCGGT ATGTCCAACA GGTGATATGG GTGGTGTTGT TTTTATTGTT 540
GATGATTTTT C T GGC C AC C T TCATCTACGT TTCCATTGAT CAACATATTG CCCCAGTGGA 600
CGCGTTGTAT TTTTCCGTGG GC AT GATT AC CGGGGCCGGT GGCAAGGAAG AGGTGGCCGA 660
AAAGTCCCCC GAT AT CATC A AACrT ATTCAC AGTGGTGATG ATGATCGCCG GGGCGGGGGT 720
Q AT T GGT AT T TGTT ATGC.CC TACT GA AT GA TTTCATCCTT GGCAGTCGCT TTAGTCAGTT 780
TTTGGATGCG GCC A AGT T AC CCGATCGCCA TCACATCATC ATTTGTGGGC TGGGGGGAGT 840
GAGCATGGCC ATTATTGAAG AGTTAATTCA CCAGGGCCAT GAAATTGTGG TAATCGAAAA 900
GGATACAGAT AATCGTTTCT TGCATACGGC CCGCTCCCTG GGGGTGCCCG TAATTGTGGA 960
CCIATGCCCGC CT AGAAAGAA CGTTGGCCTG CGCCAATATC AACCGAGCCG AAGCCATTGT 102i
Crf JT<O. a'ACC AGCGACGAC/\ CCGTTAACTT GGAAATTGGC CTAACTGCCA AGGCGATCGC IDS'
C ·.'']' Ai ni. ”T Ct CCAGTGGTGT TGCGTTGCCA GGATGCCCAG TTTAGCCTGT CCCTGCAGGA 11Γ
ACTATITGAA TTTGAAACGG TGCTTTGTCC GGCGGAATTG GCCACCTATT CCTTTGCGGC T.’T
GGCGCtCCCTG GGGGGCAAAA TTTTGGGCAA CCiGCATGACC GATGATTTGC TGTGGGTAGC 126'
CCTAGCCACC TTAATCACTC CTAACCATCC CTTTGCCGAC CAATTGGTTA AAATTGCAGC 132'
CCAAAAGTCT GATTTCGTTC CCCTCTATCT AGAACGGGGT GGCAAAACCA TCCATAGCTG 13S
•GGAATTATTG GGTACCCATC TCGACTCTGG AG AC GT GT TG ТАТТТАЛССА TGCCCGCCAC 1-U
Ti ’CCCT /V r/\G CAACTTTGGC GATCGCCCCG TGCCACTGCT GATCCTCTGG ACTCTTTTTT 150
ίΉ’TTT AGC AT GGGGGGAT GG AACTCTTGAC TCGGCCCAAT GGTGATCAAG AAAGAACCiCT 156
TI GT CT AT GT ttagtatttt TAAGTTAACC AAC AGC AG AG GATAACTTCC AAAAGAAATT 162J
A AGC T ί. A f\ Λ f\ AGTAGCAAAA TAAGTTTAAT TCATAACTGA GTTTTACTGC TAAACAGCGG 16R‘
Tf. jC /k A A A A AG TCAGATAAAA TAAAAGCTTC ACTTCGGTTT TATATTGTGA CCATGGTTCC 17Λι
CACTK’ATCTG CTCT AGGGAG TTTTTCCGCT GCCTTTAGAG AGTATTTTCT CCAAGTCGGC ISO'
ТЛАСТССССС ATTTTTAGGC AAAATCATAT ACAGACTATC CCAATATTGC CAGAGCTTTG lS6i
ATGACTCACT GTAGAAGGCA GACTAAAATT CTAGCAATGG ACTCCCAGTT GGAAT A A ATT 1921
TTTAGTCTCC CCCGGCGCTG GAGTTTTTTT GTAGTTAATG GCGGTATAAT GTGAAAGTTT 192.1
TTTATCTATT ΤΑΑΛΤΤΤΑΤΑ A ATG CTA AC A GCG CAA Met I.eu Thr Ale G1U 1 5 AGA ATT AAA Arg lie L y s TTT ACC Phe Thr 10 20-
CAG AAA CGG Q 1 v. L у г A r j GGG TTT CGT CGG GTA CTA AAC CAA Gly Plic Arg Arg Vai Leu Asn Gin 15 2 0 CGG GTG GAT Arg Vai Asp GCC TAC Ala T y r 2 5 207'.
TTT GCC GAG FiiC A 1 ύ U ι U CAT GGC CI 1113 Gly Le ? 0 G ACC CAA AGG GAT AAT u Thr Gin Arg A s p Asn 3 5 CCC TCC ATG Tro Ser Met 10 TAT CTG T y r Leu 212
Г
AAA Lys ACC Thr CTG Leu 1 5 ATT lie ATT lie GTG Vai CTC Leu TGG Trp 50 TTG Leu TTT Phe TCC Ser GCT Ala TGG T r p 55 GCC A1 a TTT Phe GTG Va 1 2175
GIT TTT GCT CCA GTT ATT TTT CCG GTG CGC CT A CTG GGT TGT ATG GTT 2223
x. e u The A 1 tl Γΐυ Vai lie The Pro Vi 1 Arg Leu Leu Gly C y s Met Va 1
6 0 6 5 70
TTG GCG ATC GCC TTG GCG GCC TTT TCC TTC AAT GTC GGC CAC GAT GCC 2271
Leu A1 a lie Ala Leu Ala Ala Phe Ser Phe As n Va 1 Gly His Asp A1 a
7 5 SO 85 90
AAC C.AC AAT GCC TAT TCC TCC AAT CCC CAC ATC AAC CGG GTT CTG GGC 2319
'λ s n H i s Ain A 1 a Tyr Ser Ser A s n Pro His lie A 8 n Arg Va 1 Leu Gly
9 5 1 00 105
ATG ACC TAC GAT TTT GTC GGG TTA TCT AGT TTT CTT TGG CGC TAT CGC 2367
M e 1 Th r T y r Asp Phe Va 1 G1 y Leu Ser Ser Phe Leu T r p Arg Tyr Arg
1 1 0 1 1 5 1 2 0
C AC A AC T AT TTG CAC CAC ACC T AC ACC AAT ATT CTT GGC CAT GAC GTG 2415
Ilia A a u Tyr Leu Hie His Thr Tyr Thr A s n He Leu Gly His Asp Va 1
1 2 5 130 135
GA A ATC CAT GGA GAT GGC GCA GT A CGT ATG AGT CCT GAA CAA GAA CAT 2463
G i u lie II 18 G 1 y Asp Gly Al a Va 1 Arg Met Ser Pro Glu Gin Glu H18
14 0 145 150
GTT GGT ATT TAT CGT TTC CAG CAA TTT T.AT ATT TGG GGT TTA TAT CTT 2511
Vn 1 G 1 y He Ty r Arg Phe Gin G I n Phe Tyr lie Trp Gly Leu Tyr Leu
1 55 160 165 170
TTC ATT CCC TTT TAT TGG TTT CTC TAC GAT GTC TAC CT A GTG CTT AAT 2559
Phe lie Pro Phe Tyr Trp Phe Leu Tyr Asp Vai Tyr Leu Vai Leu A s n
1 7 5 180 185
AAA GGC AAA TAT CAC GAC CAT AAA ATT CCT CCT TTC CAG CCC CTA GAA 2607
L j г G 1 y I. y 8 ’Τ' i y 1' II is Asp His L y s lie Pro Pro Phe Gin Pro Leu Glu
1 9 0 19 5 200
TTA GGT AGT TTG CT A GGG ATT AAG CT A TTA TGG CTC GGC TAC GTT TTC 2655
Leu A i a Ser Leu Leu Gly 11 e Lys Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Vai Phe
205 210 215
GGC TTA CCT CTG GCT CTG GGC TTT TTC ATT CCT GAA GT A TTA ATT GGT 2703
Gly Leu Pro Leu AI a Leu Gly Phe Ser lie Pro Glu Vai Leu lie Gly
2 2.0 2 2 5 23 0
GCT A1 a 2 3 5 TCG Ser GT A Va 1 ACC Thr TAT Tyr ATG Met 240 ACC Thr TAT Tyr GGC Gly ATC lie GTG Vai 245 GTT Vai TGC Cy s ACC Thr ATC lie TTT Phe 250 2751
AT G CTG GCC CAT GTG TTG GAA TCA ACT GAA TTT CTC ACC CCC GAT GGT 2799
ΐνί e t Leu A 1 u His Va 1 Leu Glu 5 e i Thr Glu Phe Leu Thr Tro Asp Gly
255 260 26 5
GAA TCG GGT GCC ATT GAT GAC GAG TGG GCT ATT TGC CAA ATT CGT ACC 2847
Glu Ser Gly Ala lie Asp Asp Glu Trp Ala lie Cy 8 Gin lie Arg Thr
270 275 280
ACG GCC AAT TTT GCC ACC AAT AAT CCC TTT TGG AAC TGG TTT TGT GGC 2895
Thr A 1 я A s n Phe Ala Thr A s n As n Pro Phe Trp Ain Trp Phe Cys Gly
2 8 5 290 295
GGT TTA AAT CAC CAA GTT ACC CAC CAT CTT TTC CCC AAT ATT TGT CAT 2943
Gly Leu A s n His Gin Va 1 Thr His His Leu Phe Pro As n lie Cys His
3 00 305 3 1 0
ATT CAC TAT CCC CAA TTG GAA AAT ATT ATT AAG GAT GTT TGC CAA GAG 2991
lie II is Tyr Γ i o G1 n L e u Glu As n lie lie L y s Asp Vai Cys Gin Glu
J 1 5 3 20 3 2 5 330
TTT GGT GTG GAA TAT AAA GTT TAT CCC ACC TTC AAA GCG GCG ATC GCC 3039
Phe G 1 y V« 1 GI u Tyr L y s Va 1 Tyr Pro Thr Phe Lys A1 a Ala lie A1 a
335 340 34 5
TOT AAC TAT CGC TGG CT A GAG GCC ATG GGC AAA GCA TCG TGACATTGCC 3088
Ser A s n Tyr Arg Trp Leu Glu Ala Met Gly Lys A1 a Ser
350 355 360
TTGGGATIG A AGCAAAATGG CAAAATCCCT CGTAAATCTA TGATCGAAGC CTTTCTGTTG 3148
CCCGCCGACC AAATCCCCGA TGCTGACCAA AGGTTGATGT TGGCATTGCT CCAAACCCAC 3208
TTTGAGGGGG TTCATTGGCC GCAGTTTCAA GCTGACCTAG GAGGCAAAGA TTGGGTGATT 3268
TTGCTCAAAT CCGCTGGGAT ATTGAAAGGC TTCACCACCT TTGGTTTCTA CCCTGCTCAA 3328
TGGGAAGGAC aaaccgtcAg AATTGTTTAT TCTGGTGACA CCATCACCGA CCCATCCATG 3388
TGGTCTΛACC CAGCCCTGGC CAAGGCTTGG ACCAAGGCCA TGCAAATTCT CCACGAGGCT 3448
AC-GCCAGAAA AATTATATTG GCTCCTGATT TCTTCCGGCT ATCGCACCTA CCGATTTTTG 3508.
AGCATTTTTG CCAAGGAATT CTATCCCCAC TATCTCCATC CCACTCCCCC GCCTGTACAA 3568.
AATTTTATCC ATCAGCTAGC (2) Информация за SEQ ID N0:2 :
(i) Характеристики на последователността (A) Дължина : 359 амино киселини (B) Тип : амино киселина (D) Топология: линейна (ii) Тип молекула : протеин (xi) Описание на последователността : SEQ ID N0:2 :
3588
М е t 1 L е u Thr A 1 a GJ u 5 Arg lie
A r g V a 1 Leu Aan 20 Gin Arg Va 1
Thr Gin Arg 3 5 Asp As n Pro Ser
Leu Trp 50 Leu Phe Scr A1 a Trp 55
Phe 65 Pro Ve 1 Arg Leu Leu 70 Gly
A1 a Fhe Ser Fhe As n 85 V,a I Gly
Ser A s n Pro Hi» 1 00 lie А» n Arg
Gly Leu Scr 115 Ser Phe Leu Trp
T h r Tyr 130 Thr Aan He Leu GLy 135
A 1 a 145 Vai A r g M e t Ser Pro 150 Crlu
G 1 n Gin Phe Tyr lie 165 Trp Gly
L y s Phe Thr 10 QI n. L y s Arg Gly Phe 15 Arg
Asp Ala 25 Tyr Phe Ala Glu His 30 Gly L е u
Met 40 Tyr Leu Lys Thr Leu 45 lie He Ve 1
A1 a Phe Vai L е u Phe 60 Ala Pro Va 1 He
Cys Met Vai Leu 75 Ala lie Ala Leu Al a 80
His Asp Alt 90 Aan. Hit As n Ala Tyr 95 Ser
Vai L e U 105 Qly Met Thr Tyr Asp 110 Phe Vai
Arg 120 Tyr Arg Hit Aan Tyr 125 Leu His Ilis
His Asp Vai Glu lie 140 H i s Gly Asp Gly
Gin Glu His Vai 155 Qly lie Tyr Arg Phe 160
Leu Tyr Leu 170 Phe lie Pro Phe Tyr 175 Trp
Г It с L c u Tyr A s P 1 3 0 V β 1 Tyr T л ,. 4-> v U Ve 1 Leu 185 A з n L y з Gly L y a Tyr 190 His A 3 p
Η. 1 5 1. y a 1 Ic i 9 5 P r o Pro Phe G1 n Pro 2 00 L е u G1 u Le U A I a Ser 205 L. е u Lc u G i y
I ! г Г V ? :> 1 n I.r n L. е u T .· p L е. и G 1 -j 2 1 5 T y .· V η 1 Fhe Gly L е u 2 2 0 P r o Leu /У. I a Le и
G 1 у The Ser He Pro G1 u 2 3 0 Vai Leu lie Gly Al a 23 5 Ser Va 1 Thr Tyr Met 24 0
Т ь ,· T У r 01 lie Vs! 2 4 5 Vs 1 C у? T h r lie The 2 5 0 Met L е u Ale His Vai 2 5 5 Leu
G ΐ и Ser T h r ί.τ 1 U 2 6 0 F h e L е u T h r r r o A s p 265 G1 y G1 u Ser GI y A1 a 270 lie /4 3 p
Λ П р ('hl T r P 2 7 5 /\ 1 n He C v G 1 n Ur 2 8 0 Are T h r Thr Ala Л я n 28 5 Phe Ala Thr
А л i t A 2. 11 ? ’? i'- F . ... Fl.e Tip A a n TrP ο ς The C У 5 G1 y Gly Leu 3 0 0 As n I-Iie Gin Va 1
Т Ιί r _< ύ 5 Hi?. H i s Leu Phe Pro 3 1 0 А я n He C у я Hi? . He 3 15 His. Tyr Pro Gin L. е u 3 20
G 1 11 A s n I! r He Ln 32 5 Asp Va 1 C y s Gin G 1 u 3 3 0 Phe Gly Va 1 Glu Tyr 3 3 5 Lys
V ο 1 Г y r Pro T h 1 .? Д Phe I. y λ A 1 a A 1 й lie 3 45 Ala Ser А я n T y r A r R 3 50 T r p Le и
d I ., Λ ] c M 1 G 1 y L V s A1 h Ser
5 5 (2) Информация за SEQ ID N0:3 :
Ci) Характеристики на последователността (A) Дължина : 1884 базови двойки (B) Тип ; нуклеинова киселина (C) Вид на веригата : и двата вида (D) Топология : линейна (И) Тип молекула : DNA (геномна) (xi) Описание на последователността : SEQ ID N0:3 :
'Ν
AGCTTCACTT CGGTTTTATA TTGTGACCAT GGTTCCCAGG CATCTGCTCT AGGGAGTTTT ©
TCCGCTGCCT TTAGAGAGTA TTTTCTCCAA GTCGGCTAAC TCCCCCATTT TTAGGCAAAA 133
TC.AT AT AC AC' ACTATCCCAA T ATTGCCAGA GCTTTGATGA CTCACTGT AG AAGGCAGACT 183
AAAATTCTAG CAATGGACTC CCAGTTGGAA TAAATTTTTA GTCTCCCCCG GCGCTGGAGT 240
TTTTTTGTAG TTAATGGCGG TATAATGTGA AAGTTTTTTA TCTATTTAAA TTTATAAATG Tn
CTAACAGCGG AAAGAATTAA ATTTACCCAG AAACGGGGGT TTCGTCGGGT ACTAAACCAA 333
CCG'IT GGA.T G CCT ACTTTGC cgagcatggc CTGACCCAAA GGGATAATCC CT CC AT GT AT 430
< 3 T13 A. .A A. AC C C T GATT ATT GT OCT CT GGT T G TTTTCCGCTT GGGCCTTTGT GCTTTTTGCT 430
ГГ Д(ТГТ ДТТТ TTCCGGTGCG CCT ACTGGGT TGTATGGTTT TGGCGATCGC CTTGGCGGCC 540
TTTTCCTTCA ATGTCGGCCA CGATGCCAAC CACAATGCCT ATTCCTCCAA TCCCCACATC ©0
AAC C GGGTT C TGGGCATGAC CTACGATTTT GTCGGGTTAT CTAGTTTTCT TTGGCGCTAT 6©
CGCC AC AACT ATT TGC ACC A CACCTACACC AATATTCTTG GCCATGACGT GGAAATCCAT 720
GGAGATGGCG CAGTACGTAT GAGTCCTGAA C A AG A AC AT G TTGGTATTTA TCGTTTCCAG 700
CAATTTTATA TTTGGGGTTT ATATCTTTTC ATTCCCTTTT ATTGGTTTCT CTACGATGTC &Ю
T ACCTA.QTGC TT AATAAAGG CAAATATCAC GACCATAAAA TTCCTCCTTT CCAGCCCCTA SOO
G.AA.TT ACCT A GTTTGCTAGG GATTAAGCTA TTATGGCTCG GCTACGTTTT CGGCTTACCT s©
CTGGCTCTGG QCTTTTCCAT TCCTGAAGTA TTAATTGGTG CTTCGGTAAC CT AT AT G ACC 1CG0
T ATGGCATCG TGGTTTGC AC CATCTTTATG CTGGCCCATG TGTTGGAATC AACT GA ATTT 1C0O
CTC ACCCCCC· AT GGT G A AT C CGGTGCCATT GATGACGAGT GGGCTATTTG CCAAATTCGT 1140'
ACCACGGCCA ATTTTGCCAC CAATAATCCC TTTTGGAACT GGTTTTGTGG CGGTTTAAAT 1203
C ACC .AACT T A CCCACCATCT TTTCCCCAAT ATTTGTCATA TTCACTATCC CCAATTGGAA 1333
A AT AT T ATT A AGC-ATGTTTG CCAAGAGTTT GGTGTGGAAT ATAAAGTTTA TCCCACCTTC 1333
AAAGCGGCGA TCGCCTCTAA CTATCGCTGG CTAGAGGCCA TGGGCAAAGC ATCGTGACAT 1200
TCCCTTGGGA TTGAAGCAAA ATGGCAAAAT CCCTCGTAAA TCTATGATCG AAGCCTTTCT 1440
GTTGCCCGCC GACCAAATCC CCGATGCTGA CCAAAGGTTG ATGTTGGCAT TGCTCCAAAC 13DL
CCACTTTGAG GGGGTTCATT GGCCGCAGTT TCAAGCTGAC CTAGGAGGCA AAGATTGGGT 159
( тЛ 1111 CK- 1 G AAATCCGCTG (.K.iAl All GA A AGGCTTCACC ACCTTTGOTT TCTACCCTGC 1®
TC Λ/XT GGGAA GGACAAACCG TCAGAA'l’TGT TTATTCTGGT GACACCATCA CCGACCCATC 1®
C ATGT GGTCT AACCCAGCCC TGGCCAAGGC TTGGACCAAG GCCATGCAAA TTCTCCACGA 17«
GGC T AGGC C /X GAAAAATTAT ATTGGCTCCT GATTTCTTCC GGCTATCTCA CCTACCGATT 1ЯГ
TTTGAGCATT TTTGCCAAGG ЛАТТСТАТСС CCACTATCTT САТСССЛСТС CCCCGCCTGT 139
АСЛАЛАТТТТ ATCCATCAGC T AGC

Claims (22)

  1. Патентни претенции :
    1. Изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална Абдезатураза.
  2. 2. Нуклеиновата киселина от претенция 1, съдържаща нуклеотидите от SEQ. ID N0:3.
  3. 3. Изолирана нуклеинова киселина, която кодира ами но киселинната последователност кодирана от нуклеиновата киселина от претенция 1.
  4. 4. Изолираната нуклеинова киселина, съгласно която и да е претенция 1-3, където споменатата нуклеинова киселина се съдържа във вектор.
  5. 5. Изолираната нуклеинова киселина от претенция 4, функционално свързана с промотор и/или ограничаващ сигнал, способен да осъществи насочването на генния продукт на споменатата изолирана нуклеинова киселина.
  6. 6. Изолираната нуклеинова киселина от претенция 5, където споменатия промотор е Аб-дезатуразен промотор, Anabaena карбоксилазен промотор, хелиантининов промотор, глицинов промотор, напинов промотор или хелиантининов тъканноспецифичен промотор.
  7. 7. Изолираната нуклеинова киселина от претенция 5, където споменатия ограничаващ сигнал е Synechocystis ограничаващ сигнал, иопалимов синтазен ограничаващ сигнал или семенен ограничаващ сигнал.
  8. 8. Изолираната нуклеинова киселина, съгласно която и да е от претенции 1-7, където споменатата изолирана нуклеинова киселина се съдържа в транегенем организъм.
  9. 9. Изолиранат нуклеинова киселина, съгласно претенция 8, където споменатия транегенен организъм е бактерия, гъба, растителна клетка или животно.
  10. 10. Растение или потомство на тоВа растение, което е регенерирано от трансгенната растителна клетка от претенция
    9.
    I I Растението, съгласно претенция 10, което е слънчоглед, соя, царевица, тютюн, фъстък или маслодайна рапица.
  11. 12. Метод за получаване на растение с увеличено съдържание на гама липоленоВа киселина (GLA), който Включва:
    (а) трансформиране на растителна клетка с изолираната пуклеиноВа киселина, съгласно която и да е от претенции 1-7; и (в) регенериране на растение с увеличено съдържание на GLA от споменатата растителна клетка.
  12. 13. Метод съгласно претенция 12, където споменатото растение е слънчоглед, соя, царевица, тютюн, фъстък или мас л ода й н а р а п и ц а.
  13. 14. Метод за предизВикВаие получаването на гама липолеиоВа киселина (GLA) В организъм с недостатъчна или липсваща GLA, които Включва трансформиране на споменатия организъм с изолираната нуклеинова киселина от която и да е от претенции 1-7.
  14. 15. Метод за предизвикване получаването на гама линоленова киселииа (GLA) В организъм с недостатъчна или липсВаща GLA и линолова киселина (LA), който Включва трансформиране на споменатия организъм с изолирана нуклеинова киселина, кодираща бактериална Аб-дезатураза и изолирана нуклеиноВа киселина, кодираща л12-дезатураза.
  15. 16. Метод за предизвикване получаването на гама линоленова киселина (GLA) В организъм с недостатъчна или липсваща GLA и линолова киселина (LA), който Включва трансформиране на споменатия организъм с най-малко един насочващ Вектор, включващ изолирана нуклеиноВа киселина, кодираща бактериална лб-дсзатураза υ изолирана нуклеинова киселина, кодираща Δ12деза тураза.
  16. 17 Метод, съгласно която и да е ош претенции 15 или 16, където споменатата изолирана нуклеинова киселина, кодираща Дб-дезатураза, включва нуклеотиди 317 до 1507 от SEQ. ID N0:1.
  17. 18 Метод за предизвикване получаването на октадекатетраеонна киселина в организъм с недостатъчна или липсваща гама лииоленова киселина, койпю се състои в трансформиране на споменатия организъм с изолирана нуклеинова
    w. киселина, съгласно която и да е от претенции I до 7.
  18. 19. Метод, съгласно претенция 18, където споменатия организъм е бактерия, гъба, растение или животно.
  19. 20 Метод за използване на изолираната нуклеинова киселина, съгласно която и да е от претенции 1 до 7, за получаване на растение с подобрена студоустойчивост, който включва :
    а) трансформиране на растителна клетка с изолираната нуклеинова киселина от която и да е от претенции 1 до 7; и
    в) регенериране на споменатото растение с подобрена студоустойчивост от споменатата трансформирана растителна клетка.
  20. 21 Метод, съгласно претенция 20, където споменатото растение е слънчоглед, соя, царевица, тютюн, фъстък или маслодайна рапица.
  21. 22. Изолирана бактериална Лб-дезатураза.
  22. 23. Изолираната . бактериална Дб-дезатураза, съгласно претенция 22, притежаваща амиио-киселинна последователност от SEQ ID N0:2.
BG98695A 1991-10-10 1994-04-05 Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза BG61791B1 (bg)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77447591A 1991-10-10 1991-10-10
US81791992A 1992-01-08 1992-01-08
PCT/US1992/008746 WO1993006712A1 (en) 1991-10-10 1992-10-13 Production of gamma linolenic acid by a δ6-desaturase

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG98695A true BG98695A (bg) 1995-05-31
BG61791B1 BG61791B1 (bg) 1998-06-30

Family

ID=27118889

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG98695A BG61791B1 (bg) 1991-10-10 1994-04-05 Получаване на гама-линоленова киселина чрез делта6-дезатураза

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5552306A (bg)
EP (1) EP0666918B1 (bg)
JP (1) JP3537434B2 (bg)
KR (1) KR100316068B1 (bg)
CN (2) CN1053469C (bg)
AT (1) ATE284961T1 (bg)
AU (1) AU667848B2 (bg)
BG (1) BG61791B1 (bg)
BR (1) BR9206613A (bg)
CA (1) CA2120629C (bg)
CZ (1) CZ285471B6 (bg)
DE (1) DE69233459T2 (bg)
DK (1) DK0666918T3 (bg)
ES (1) ES2231767T3 (bg)
HU (1) HU217328B (bg)
IL (1) IL103407A (bg)
MX (1) MX9205820A (bg)
NZ (1) NZ244685A (bg)
PH (1) PH31293A (bg)
RO (1) RO113256B1 (bg)
RU (1) RU2152996C2 (bg)
UA (1) UA43314C2 (bg)
WO (1) WO1993006712A1 (bg)

Families Citing this family (121)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070130654A1 (en) * 1991-10-10 2007-06-07 Thomas Terry L Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US5614393A (en) * 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
WO1994018337A1 (en) * 1993-02-05 1994-08-18 Monsanto Company Altered linolenic and linoleic acid content in plants
US5639645A (en) * 1993-09-22 1997-06-17 Mitsubishi Corporation Recombinant Δ9 desaturase and a gene encoding the same
US6310194B1 (en) * 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5965793A (en) 1995-09-20 1999-10-12 Monsanto Company, Inc. Strong early seed-specific gene regulatory region
US5959175A (en) * 1997-04-09 1999-09-28 Thomas; Terry L. Sunflower albumin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US5972664A (en) * 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6075183A (en) * 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
EP1598422B1 (en) * 1997-04-11 2013-01-02 Calgene LLC Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6051754A (en) * 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6080911A (en) * 1997-04-15 2000-06-27 Ohio University Mice models of growth hormone insensitivity
KR100711074B1 (ko) * 1997-04-15 2007-04-26 커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 식물의 지방산 에폭시게나제 유전자 및 이의 용도
US6100450A (en) * 1997-10-22 2000-08-08 Rhone-Poulenc Agrochimie Seed specific promoters based on arabidopsis genes
GB9724783D0 (en) * 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
CA2329159A1 (en) * 1998-05-29 1999-12-02 Bruce Kelder Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products
DE69937050T2 (de) 1998-06-12 2008-05-29 Calgene Llc, Davis Polyungesättigte fettsäuren in pflanzen
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US20030163845A1 (en) * 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
RU2268939C2 (ru) * 1999-06-07 2006-01-27 Басф Плант Сайенс Гмбх ДЕЛЬТА 6-АЦЕТИЛЕНАЗА/ДЕЛЬТА-6-ДЕСАТУРАЗА И ДЕЛЬТА-6-ДЕСАТУРАЗА ИЗ Ceratodon purpureus
AU776447B2 (en) 1999-06-07 2004-09-09 Basf Plant Science Gmbh Delta6-acetylenase and delta6-desaturase from ceratodon purpureus
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
GB9929897D0 (en) * 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
FR2803592A1 (fr) 2000-01-06 2001-07-13 Aventis Cropscience Sa Nouveaux derives de l'acide 3-hydroxypicolinique, leur procede de preparation et compositions fongicides les contenant.
RU2311457C2 (ru) * 2000-02-09 2007-11-27 Басф Акциенгезельшафт Новый ген элонгазы и способ получения полиненасыщенных кислот жирного ряда
FR2810994B1 (fr) * 2000-06-30 2004-03-12 Biogemma Fr Acides nucleiques codant pour une phosphatase vegetale de type mipp a activite phytasique et applications
EP1197550A3 (en) * 2000-08-25 2002-11-20 Pfizer Products Inc. Methods and compositions for diagnosing and treating disorders involving angiogenesis
DK1911837T3 (da) 2000-09-28 2011-08-29 Bioriginal Food & Science Corp FAD5-2 fedtsyredesaturasefamiliemedlem og anvendelser deraf
FR2815969B1 (fr) 2000-10-30 2004-12-10 Aventis Cropscience Sa Plantes tolerantes aux herbicides par contournement de voie metabolique
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
AU2002309482B2 (en) * 2001-01-25 2007-08-30 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
US7045683B2 (en) * 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
EP1392278A4 (en) * 2001-05-14 2005-05-04 Martek Biosciences Corp PREPARATION AND USE OF A POLAR LIPIDREICH FRACTION WITH STEARIDONIC ACID AND GAMMA LINOLIC ACID FROM PLANT SEEDS AND MICROBES
EP1392623A4 (en) * 2001-05-14 2005-05-04 Martek Biosciences Corp PREPARATION AND USE OF A POLAR LIPID RICH FRACTION CONTAINING HIGHLY UNSATURATED OMEGA-3 AND / OR OMEGA-6 FATTY ACIDS FROM MICROBES, SEEDS OF GENETICALLY MODIFIED PLANTS AND MARINE ORGANISMS
US7211656B2 (en) * 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
EP1472357B1 (de) 2002-01-30 2009-12-16 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren mittels eines neuen elongase-gens
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
WO2005024017A1 (en) * 2002-03-15 2005-03-17 Monsanto Technology Llc Nucleic acid molecules associated with oil in plants
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
FR2848064B1 (fr) * 2002-12-06 2006-01-13 Bayer Cropscience Sa Plantes legumineuses transplastomiques fertiles
FR2848570B1 (fr) 2002-12-12 2005-04-01 Bayer Cropscience Sa Cassette d'expression codant pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps) et plantes tolerantes aux herbicides la contenant
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
EP1576166B1 (en) 2002-12-19 2014-10-15 University Of Bristol Novel method for the production of polyunsaturated fatty acids
BRPI0407138A (pt) 2003-02-27 2006-01-10 Basf Plant Science Gmbh Sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácido, construção de gene, vetor, organismo transgênico não humano, processo para produzir ácidos graxos poliinsaturados, óleo, lipìdeo, ou um ácido graxo poliinsaturado ou uma fração dos mesmos, composições de óleo, de lipìdeos, ou de ácido graxo, e, uso do óleo, lipìdeos ou ácidos graxos ou de composições de óleo, de lipìdeos ou de ácido graxo
AU2004225483B2 (en) 2003-03-28 2009-07-23 Monsanto Technology, Llc Novel plant promoters for use in early seed development
AU2004225838B2 (en) 2003-03-31 2009-11-05 University Of Bristol Novel plant acyltransferases specific for long-chained, multiply unsaturated fatty acids
EP1613744B1 (de) 2003-04-08 2015-09-09 BASF Plant Science GmbH Delta-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
NO347177B1 (no) 2003-08-01 2023-06-19 Basf Plant Science Gmbh Fremgangsmåte for fremstilling av flerumettede fettsyrer i transgene organismer
CA2881252C (en) 2003-08-21 2017-02-28 Monsanto Technology Llc Soybean oil having 5 to 50% sda and less than 10% gla
CA2450000A1 (en) 2003-12-18 2005-06-18 Alberta Research Council Inc. Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil
CA2558726C (en) 2004-02-27 2017-11-07 Basf Plant Science Gmbh Method for producing unsaturated .omega.-3-fatty acids in transgenic organisms
JP4567047B2 (ja) 2004-02-27 2010-10-20 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法
US20050220901A1 (en) * 2004-03-22 2005-10-06 Huttenbauer Samuel Jr Methods of pharmaceutical separation from plants
EP1734947B1 (en) 2004-04-16 2015-04-15 Monsanto Technology, LLC Expression of fatty acid desaturases in corn
CA3056110C (en) 2004-04-22 2020-07-14 Surinder Pal Singh Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
ES2529572T3 (es) 2004-04-22 2015-02-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Síntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga por células recombinantes
US7138391B2 (en) * 2004-08-09 2006-11-21 Silverbrook Research Pty Ltd Hydrophilizable and hydrophilic cyanine dyes
US7456270B2 (en) * 2004-09-01 2008-11-25 Abbott Laboratories Δ6-desaturase genes and uses thereof
AU2006217847B2 (en) 2005-02-26 2011-04-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
ATE552343T1 (de) 2005-04-19 2012-04-15 Basf Plant Science Gmbh Endosperm-spezifische expression und/oder expression in keimenden embryos monokotyledoner pflanzen
US7902423B2 (en) 2005-04-20 2011-03-08 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression that utilize the promoter from a flax tonoplast intrinsic protein gene
AU2006245701B2 (en) 2005-05-10 2011-04-28 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
NZ563676A (en) 2005-05-23 2011-01-28 Arcadia Biosciences Inc Safflower with elevated gamma-linolenic acid
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
EP1806398A1 (en) * 2006-01-04 2007-07-11 Monsanto S.A.S. Fad-2 mutants and high oleic plants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
BRPI0714390B1 (pt) 2006-07-19 2018-05-15 Monsanto Technology Llc Polinucleotídeo, construção de dna, célula hospedeira fúngica ou bacteriana, processo para produção de alimento ou de produto alimentício e composição para alimento ou produto alimentício
CA2659993C (en) 2006-08-24 2016-01-05 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
RU2009111266A (ru) 2006-08-29 2010-10-10 Коммонвелт Сайентифик энд Индастриал Рисерч Организейшн (AU) Синтез жирных кислот
ES2531391T3 (es) 2006-10-06 2015-03-13 Basf Plant Science Gmbh Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos
KR20090119910A (ko) 2007-02-16 2009-11-20 바스프 플랜트 사이언스 게엠베하 외떡잎 식물에서 배-특이적 발현의 조절을 위한 핵산 서열
EP3546588A3 (en) 2007-06-01 2019-12-18 Corbion Biotech, Inc. Recombinant microalgal cell and method of producing lipids using said cell
EP2176416B1 (de) 2007-07-31 2016-03-16 BASF Plant Science GmbH Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
US20130323801A1 (en) * 2007-11-01 2013-12-05 Wake Forest University School Of Medicine Compositions, Methods, and Kits for Polyunsaturated Fatty Acids from Microalgae
AU2008337600A1 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
CN102066564B (zh) 2008-04-30 2015-02-11 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 去饱和酶和在转基因生物中产生多不饱和脂肪酸的方法
CA2729496C (en) 2008-07-01 2018-02-13 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
EP2331695B1 (en) 2008-08-26 2014-07-23 BASF Plant Science GmbH Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
DK2358882T3 (da) 2008-11-18 2017-11-06 Commw Scient Ind Res Org Enzymer og fremgangsmåder til fremstilling af omega-3 fedtsyrer
EP2370555B1 (en) 2008-11-28 2016-04-20 Solazyme, Inc. Production of tailored oils in heterotrophic microorganisms
AU2009326129B2 (en) 2008-12-12 2016-05-12 Basf Plant Science Gmbh Desaturases and process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
AR074941A1 (es) 2009-01-07 2011-02-23 Bayer Cropscience Sa Plantas transplastomicas exentas de marcador de seleccion
US20120036593A1 (en) 2009-04-17 2012-02-09 Basf Plant Science Company Gmbh Plant Promoter Operable in Endosperm and Uses Thereof
CA3020943A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Basf Plant Science Company Gmbh Whole seed specific promoter
CA2760326A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
CN102471777B (zh) 2009-07-10 2014-09-24 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚乳-特异性表达的表达盒
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
DE112010005958T5 (de) 2009-12-03 2013-08-14 Basf Plant Science Company Gmbh Expressionskassetten für die Embryo-spezifische Expression in Pflanzen
WO2011095460A1 (en) 2010-02-02 2011-08-11 Bayer Cropscience Ag Soybean transformation using hppd inhibitors as selection agents
SG185780A1 (en) 2010-05-28 2013-01-30 Solazyme Inc Tailored oils produced from recombinant heterotrophic microorganisms
EP2585603B1 (en) 2010-06-25 2017-12-20 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses therof in fatty acid production
AU2011323288B2 (en) 2010-11-03 2016-05-26 Corbion Biotech, Inc. Microbial oils with lowered pour points, dielectric fluids produced therefrom, and related methods
CA2825691C (en) 2011-02-02 2020-08-25 Solazyme, Inc. Tailored oils produced from recombinant oleaginous microorganisms
AU2013246661B2 (en) 2012-04-12 2018-12-20 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
SG10201702442RA (en) 2012-04-18 2017-05-30 Terravia Holdings Inc Tailored oils
US9719114B2 (en) 2012-04-18 2017-08-01 Terravia Holdings, Inc. Tailored oils
US8946460B2 (en) 2012-06-15 2015-02-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Process for producing polyunsaturated fatty acids in an esterified form
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
US9249252B2 (en) * 2013-04-26 2016-02-02 Solazyme, Inc. Low polyunsaturated fatty acid oils and uses thereof
JP6517196B2 (ja) 2013-10-04 2019-05-22 テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド 調整油
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
KR102386838B1 (ko) 2013-12-18 2022-04-15 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
BR112017000414A2 (pt) 2014-07-10 2017-11-07 Terravia Holdings Inc genes cetoacil-acp sintase e utilizações dos mesmos
KR102054762B1 (ko) 2018-03-06 2020-01-22 대한민국(관리청: 특허청장, 승계청: 농촌진흥청장) 갈고리 흰오징어 유래의 지방산 사슬연장효소 유전자 및 이의 용도

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4736866B1 (en) * 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
NZ221259A (en) * 1986-07-31 1990-05-28 Calgene Inc Seed specific transcriptional regulation
CA1333397C (en) * 1987-11-04 1994-12-06 Jean Bernard Ducep Fluorinated arachidonic acid derivatives
EP1103616A3 (en) * 1989-02-24 2001-06-27 Monsanto Company Synthetic plant genes and method for preparation
WO1991013972A1 (en) * 1990-03-16 1991-09-19 Calgene, Inc. Plant desaturases - compositions and uses

Also Published As

Publication number Publication date
BG61791B1 (bg) 1998-06-30
HU9401007D0 (en) 1994-08-29
EP0666918B1 (en) 2004-12-15
IL103407A (en) 1999-09-22
DK0666918T3 (da) 2005-03-14
JP3537434B2 (ja) 2004-06-14
CN1053469C (zh) 2000-06-14
CN1121499C (zh) 2003-09-17
CN1174236A (zh) 1998-02-25
HUT69781A (en) 1995-09-28
CZ285471B6 (cs) 1999-08-11
CA2120629C (en) 2009-02-17
NZ244685A (en) 1994-06-27
CA2120629A1 (en) 1993-04-15
JPH07503605A (ja) 1995-04-20
ES2231767T3 (es) 2005-05-16
DE69233459D1 (de) 2005-01-20
EP0666918A4 (en) 1995-03-17
AU667848B2 (en) 1996-04-18
ATE284961T1 (de) 2005-01-15
MX9205820A (es) 1993-04-01
US5552306A (en) 1996-09-03
US5663068A (en) 1997-09-02
PH31293A (en) 1998-07-06
IL103407A0 (en) 1993-03-15
US5689050A (en) 1997-11-18
CN1072722A (zh) 1993-06-02
AU2881292A (en) 1993-05-03
WO1993006712A1 (en) 1993-04-15
RU2152996C2 (ru) 2000-07-20
UA43314C2 (uk) 2001-12-17
KR100316068B1 (ko) 2002-11-13
DE69233459T2 (de) 2005-12-15
HU217328B (hu) 1999-12-28
EP0666918A1 (en) 1995-08-16
BR9206613A (pt) 1995-04-11
RO113256B1 (ro) 1998-05-29
CZ81794A3 (en) 1995-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU667848B2 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
AU707061B2 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US6355861B1 (en) Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
US10174297B2 (en) Fatty acid desaturases from primula
US6683232B1 (en) Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
US20070130654A1 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase
US20090077692A1 (en) Production of gamma linolenic acid by a delta6-desaturase