BG98720A - Метод и състав за определяне на имунната активност на биологично активни вещества - Google Patents

Abstract

Имунната активност на някои биологично активни субстанции се определя чрез третиране на култури от човешки периферни кръвни левкоцити (рвl) или суспензия от ваlв с миши перитонеални клетки гостоприемници (rрс) с разтвор от субстанцията, подлежаща натестуване, с цел да се индуктира продуцирането нацитокини, които след това се определят съгласно стандартни идентификационни методи. Резултатите могат да се подобрят чрез прибавяне към тестувания разтвор на нестероидно противовъзпалително средство,за предпочитане индометацин. Методът е приложим също за определяне на имунната реакция на хора спрямо терапия с цитокиноиндуктираща субстанция.

Description

МЕТОД И СЪСТАВ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ИМУННАТА АКТИВНОСТ НА

БИОЛОГИЧНО АКТИВНИ СУБСТАНЦИИ се отнася до метод и състав за тестване на някои биологично активни субстанции и определяне

Н е:

т я х нат а активност по отношение на способността

г. а индуктират продуцирането на ци т ок и н и . Цит ок.ините, кат о инт ерферони (IFN) уморонекрогизпращи фактори (TNF) са ормонОПО ДОб ни роля в почти всички имунни реакции, както и в регулаторните процеси.

отговорни за поддържане на хомеостазата.Продуцирането на такива цитокини може да бъде индуктирано от определени субстанции, които благодарение на тяхната биологична и имунологична активност, са приложими за терапия на имунна недостатъчност и свързани с нея заболявания.

Има сериозна необходимост от методи за точно и лесно тестване на имунната активност на биологично активни субстанции.Предмет на изобретението е създаването на един такъв метод.

Методът съгласно изобретението позволява да се определи дали изпитваната субстанция е в състояние да индуктира продуцирането на различни цитокини, както и бързата и ефективна проверка на свойствата на дадените субстанции, а именно имунната им активност на всеки етап от тяхното продуциране, разделяне, пречистване и формиране на окончателния състав. Настоящото изобретение осигурява също състав и китове за осъществянате на посочения метод.

Използваните до сега тестове за определяне на имунната активност са многобройни₅ че трудни за осъществяване. Когато се изпитва клинично нов терапевтичен състав с имунологичен ефект, неговата ефективност се оценява чрез установяване на множество добре известни и аналитично определими свойства на имунните системи чрез прилагане на стандартни методи. След като вече активността на състава е доказана, се налага провеждането на индивидуални тестове за бърза проверка на състоянието на пациента по отношение на неговата /или нейната/ имунна реакция.

В клиничните изследвания, оценяването на нивата на IFN серума може да се окаже трудно, неточно и заблуждаващо. Интерфероните често се произвеждат локално в различни тъкани, живеят кратко, тяхното действие се ограничава в непосредствена близост и те са здраво свързани със клетъчните рецептори и протеините-носители.

От друга страна, технологичните процеси за производство, пречистване и/или отделяне на имунологично активни субстанции, като например торфени екстракти, са обикновено многостепеини процеси, при които винаги има нужда от създаване на надежден и бърз тест контрол на често имат комплексно естество, както е в случая с торфените важно е да има подобни тестове за определяне на имунната активност на отделните фракции на т ак и в а субстанции

Също е необходимо да се намери микроскопски метод за тестване, тъй като анализираните продукти са много ск ъпи позволяват да се решат поставните проблеми 5

1.Някои имуноактивни торфени екстракти продуцирането на цитокини като интерферони и туморонекрстизиращи фактори в in vitro култури от периферни кръвни левкоцити (PBL), като индукцията зависи от дозата.

2.Бета-интерферона /и алфа-туморонекротизиращия фактор/ се продуцират в значително по-големи количества от BALB/c миши перитонеални клетки-гостоприемници (RPC), когато са третирани с имуноактивни торфени екстракти в сравнение със спонтанното отделяне на тези цитокини при нетретирани проби.

3.Някои торфени екстракти при тестване in vitro показват синергичен ефект в комбинация с известни имуномодулатори, като селено-органични съединения, рх ηop фенил ами д на

3-мети л-5-бензоламино-изоти азол-4карбоксилна киселина индометацин

Това позволява използването на много по-малки количества от имунологично активните субстанции за показване на тяхната активност

4. РЕЯ... от здрави доброволци, третирани с ТТР Ζμ3βθοτεη торфен дериват/, вземан през устата в дневна доза от Змг, тествани за индукция на цитокините алфа-интерферон , гамаинтерферон алфа-туморонек роти зи р ащ фак т ор, губят способността да реагират на ТТР разтвора с предуциране на цитокини след продължително непрекъснато приемане на ТТР през устата си възвръщат т ази способност след приблизително две седмици прекъсване

Методът съгласно изобретението включва третиране на периферни кръвни левкоцити /PBL.Z или суспензия от

ZRPCZ с разтвор от подлежащата на тестване субстанция с цел. да се индуктира продуцирането на цитокини.

след което тези стандартни идентификационни методи

PBL културата, използвана съгласно първия вариант на метода, е с малка трайност, приготвена е от пресни левкоцити на здрави хора е хранителна среда, подходяща за тъканни култури.Предпочитаната гъстота на готовата за употреба култура е около 8 х 10^ левкоцити/мл

Предпочитаната концентрация на изпитвания разтвор е от

В частност, методът е подходящ за

0,1 до 200^д/м1 тестване на торфени екстракти

М и к р о с. к оп с к от о определяне възможно, ког ат о изпитваният разтвор, например торфен екстракт или негова фракция, се смеси с имуномодулиращ агент като нест ероиден противовъзпалит елен медикамент, за предпочитане субстанция подбрана от групата, вкпюнваща селено-органични съединения, като ebselen, определени производни на изотиазопа като рхлорфениламид на

3-мети п—З-бензоламино-изоти азол-4карбоксилна киселина, инцометацин, както и аналози, и метаболити на такива субстанции.

хомолози

Примери на селено-органични съединения,които могат да се използват за тази цел са дадени с формулите от 1 до 3. Предпочитан вариант е съединението с формула 2 /ebselen/s

ί 1) Bi. s-Г.2- (N-фенилкарбоксиами до) ]-фенилдиселенид

(2) 2~фенил-1,2-бензизоселенавол-З(2Н)-он (Ebselen PZ 51)

(3) Bi s-C2-(Ν-(2-пиридип)карбоксиамидо)]-хенилдиселенид.

Примери за производни на изотиазола, които могат да се използват за горепосочените цели са съединения с обща формула I ^R3 сн-----сн

II II

N С—NHCOR

CONHR (I) където Ry фенил и R^ Халогеннният е халофенип, за е нискомолекулен предпочитане хлорфенил, алкил, за предпочитане атом в хапофенилната група, хпорфенилна е за предпочитане да бъде в р-позицията ^r2 ^ε метил група Ry на фенилния пръстен.

Предпочитаното съединение с горната формула I е рхлорфенипамид на 3-метип-5-бензоламино-изотиазол-4карбоксилна киселина, т.е, съединение с формула I, където Ry е р-хпорфенил, Rj> е фенил и R^ & метил. По нататък за удобство това съединение ще се означава като съединение

ITCL”

L.IN &

Съществуват регистрирана търговска марка VRATIZOза това съединение в Полша

Неговият синтез и свойства сз описани в Arch. Immunol et Ther. Exp

1973, 21,

Всички имуномодулаторни аг енти, за които се споменава по-горе като приложими за микроскопско определяне,

С5 индометацина имат противовъзпалителни съединения общот о , производните на свойство, че са средства, които потискат изотиазола и нестероидни по мет ода за микроопределяне. Усилването на резултатите е от порядъка на 5--20 пъти.

От всички разновидности на нестероидните противовъзпалителни съединения, приложими за цепите на усилване, селено-органичните съединения (1,2 и 3) и съединението ITCL, и специално индометацинът, са найподходящи

В настоящото изобретение се използват различни антисеруми цит окини за разпознаване на отделните индуктирани

Тези серуми са известни и се използват за определяне и стандартизация на различни цитокини

Идентификацията на индуктираните цитокини трябва да се извърши в момента на завършване на тяхното формиране и преди протеолизата им

Някои от различните индуитирани цитокини се формират бавно и са устойчиви в разтвор, к ат о например гама-интерферона, докато други се формират бързо и са лесно податливи на протеопиза, като например т уморон ек р от и з и р ашите факт ори

Гореописаният метод може да се използва и за определяне на имунната реакция на различни индивиди спрямо дадена имуноактивна субстанция, като се осигури тази реакция да не бъде стимулирана от други фактори, като например вирусна или бактериална инфекция. Методът може да бъде използван и за определяне на реакцията спрямо лекарствените препарати на отделни пациенти за определяне на оптималната доза на терапевтичен индуктор на цитокини като ТТР, както и за определяне на ефективна схема за приемане на лекарството

Методът се базира върху оценката на и π ор е а и т и вн от о състояние спрямо индуктирането на интерферони

Методът съгласно изобретението е също и метод за определяне на имунната реакция на различни индивиди спрямо терапия, в която се използват имуномодулаторни субстанции при индуктирането на цитокини

Този метод се характеризира

PBL култура от човешки индивид се третира през определени интервали от време с разтвор на имуномодупаторна субстакция.

приемана с. цел да индуктира цитокини, след което цитокините се определят по стандартни методи (включително и н а цит ок ини) за да се установи момента на развиване на хипореакция към продължителното й приемане и момента субстанцията след на възвръщане на реактивната способност към една допълнителна доза след известен период на прекъсване. Препоръчителните интервали от време са от 7-14 дни.

Предпочитан вариант на метода съгласно изобретението е прилагането му за терапия чрез торфен екстрат като имуномодупаторна субстанция, индуктираща продуцирането на цит ок и н и .

Съгласно най-предпочитания вариант на изобретението методът се прилага за терапия чрез ТТР като имуномодупаторна субстанция, индуктираща продуцирането на цитокини. ТТР е обект на изобретение, заявено с международна заявка Ng.РСТ/ЕР92/00491, където подробно са описани неговите характеристики и начина на производство. С оглед на това.

настоящото изобретение изпитван или определян е свързано с ТТР, когато е използван, по метода от настоящото изобретение

Съг пасно втория вариант на изобретението, подходящ за бърз контрол при технологичен процес за производство , пречистване, отделяне и други необходими операции за получаване на имуноактивни субстанции. Например, когато суспензия от RPC се третира с разтвора, подлежащ на тестване, се индуктира туморонекротизиращ фактор миши бета-интерферон, както

И двата могат да бъдат открити качествено определени по стандартните идентификационни методи. Съгласно този вариант на метода се използва суспензия от пресни миши RPC, съдържаща приблизително 1x10 клетки/мл.

Разтворът, подлежащ на изпитване, се приготвя в хранителна среда Eagle или RPMI-1640 с добавка от 107« телешки ембрионален серум. Получените резултати се сравняват с калибрована крива, получена за еталонна субстанция. Като еталонна субстанция може да се използва проба от подлежащата на изпитване имуноактивна субстанция, тествана по традиционен начин.

Както беше отбелязано, методът изключително подходящ за т орфени ек ст р ак ти и т ех ни фр ак и,и и .

-- g

Настоящият метод е много прост и ефикасен в сравнение с други известни методи, защото се основава на директна индукция на бета-интерферон, вместо както много от конвенционалните тестове - на вторичния ефект от образуването на антитела. Досега не беше възможно да се намери подобен метод поради факта, че имунната система на мишката значително се различава от човешката имунна система и тестовете за разпознаване на имунната реакция при хора като например наличието на интерферони в тъкани от далак или лимфни възли “ не са приложими за най-добрите лабораторни животни, т.е. мишките от типа BALB/c.

установено че може да се получи чисто и мун н а реакция на BALB/c мишките, когато се изберат перитонеални клетки гостоприемници (RPC) като биологичен суспензия от тези клетки необходимо се жертват само по три се получават за няколко часа биологичният материал би могъл да се създаде съответстваща пиния от макрофаги

При метода изобретението се използва биологичен материал, а именно култури от периферни кръвни левкоцити (RBL) или суспензия от перитонеални клетки гоктоприемници (RFC) от

3ALB/с лабораторни ми шки. Напи ч ието и концентрацията на всеки цитокин се определя по методи за тестване и стандартизация на интерферони, известни от “Methods in Enzymology,1986, vol,119, part CsInterteron , издание на Sidney F'estka.

Чрез определянето на пълния спектър от индуктирани цитокини се определя имунния статус на пациента.

За точната оценка на резултатите и при двата варианта на метода е важно биологичният материал да бъде подбран от подходящи донори, В случая с използването на човешки левкоцити, проби взети от индивиди с хипореактивност /редки случаи/, т.е. ниско ниво на имунна реакция трябва да бъдат изключени. В случая с използването на миша RPC суспензия трябва ра бъдат изключени проби допълнително стимулирани животни /например инфектирани/. Пробите не трябва да се вземат от твърде млади или твърде стари животни, тъй като тези животни имат възрастово зависима недостатъчност при продуциране на цитокини

Трябва да се подбират 5-8 седмични з др аеи животни, Пр оби, показващи много високо спонтанно предуциране на цитокини особено при тестване на имунорегупаторни субстанции, защото никакво усилване на индуктирането на цитокини, а понякога даже и спадане не може да бъде наблюдавано.

Вариантът на метода съгласно изобретението. в който усилването на резултатите се постига чрез смесване с нестероиден противовъзпалителен медикамент / една от субстанциите описани по-горе, като съединението ITCL. ипи селено-органичните съединения 1,2 ипи 3, но за предпочитане индометацин/ на субстанцията, подлежаща на изпитване с. микротест, особено подходящ за определяне на активността на интерферон и туморонекротизиращ фактор. Този тест е икономичен, бърз, приложим за тестване на голям брой проби едн ов ременно, подходящ за стандартизиране и частично за ае томатизирайе.

Двата варианта на метода съгласно изобретението са описани подробно с помощта на примери както следва!

Приготвяне на разтвор от с у бс. т ан ци ята, подлежаща на изследване!

Субстанцията, подлежаща на изследване, например торфен ек с т р ак т , се разтваря в двойно дистилирана вода в мд/м!.Пробата се стерилизира чрез филтриране fft) та··; Millipore концентрация 10 през 0.45 това се правят разтвори в пълноценна RPMI

600 kPa ан т и 6 ак т ери ци дн и филтри. След

1640 среда, съдържаща топлинно дезактивиран ембрионален волски серум (FBS).

н) Вариант с PBLs

Съсиреци от здрав кръводарител могат да се вземат от регионалния център по кръвопреливане. Друга възможност за осигуряване на периферни кръвни певкоци*и е тяхното изолиране от хепариниз>чрана венозна кръв от здрави

СЯ) fA) доброволци чрез Fi cal 1 -Hypaque (или Histopaque ¹ ) центруфугиране с градиент на интензитета g = 1.077 с последващо двойно измиване на клетките. Еритроцитите се разтварят /лизират/ чрез третиране с NH CL no CanteLL и др. (Cantell, К., Hirvonen, S., Kauppiпеп, H.L.s Production and partial purification of Human Immune Interferon. Meth. Enzymol. 119, 54, 1988). Използвани са левкоцитите от един донор, съдържащи приблизително 8x10 левкоцит и/м! в RPMI1640 среда с добавка от 107.

ембрионален волски серум (FBS),

L- глутамин и антибиотици

Всички количества от FBS се тестват повторно

За PBL нултурите се използва само немитогенен hBS.

Индукторите на цитокини се добавят към

2001000 мои. обема от културите. В случая, въведеният индуктор на цитокини е фи т ох емог л ут ами н

PHA (Pharmaci a Fine

Chemicals, Sweden или Sigma, USA). Индуктираните култури от

PBL се инкубират в атмосфера с 57. съдържание на С0 при 37°

С за 20 часа и се центрофугират, филтратът се съхранява при

С и се тества за интерферон в рамките на една седмица, филтратът за определяне на туморонекротизиращ фактор трябва о да се съхранява при -90 С или течен азот, за да се предотврати дезактивирането му вследствие на протеолиза.

Тест за интерферон

В микротарелки се приготвят сляти монослоеве от А549 клетки в Dulbecco модифицирана Minimum Essential Medium (DMEM) с

107. FBS, L-гпутамин и антибиотици (пеницилин

100 ед./мл и стрептомицин

100 g /м1 .

се добавят

Разредените тарелките към клетъчните интерферонови проби се инкубират при 37°С за 20 часа във въздух с моноспоеве и

57. съдържание на След това клетките се измиват и се възбуждат с енцефаломиокардитен вирус (EMCV). Титърът на IFN се определя след 48 часа инкубация, ефект на вируса е намален с 507.

Използва се МТТ тиазол-2-ил1-2,5-дифенилтетразс-лиумбромид) метода ( Hansen,

М„ В. , Nielsen, S. Е and Berg, К. : Re-examination and

Further Development of a Precise and Rapid Dye Method -for

Measuring Cell Growth/Cell Kill. J.Immunol.

за измерване на убитите клетки

Meth. 1989, 119, в EL ISА ск енер„

Лабораторните стандарти за интерферон

IFN трябва да бъдат включени във всички тестове, например рекомбинантен човешки р гама-интерферон (специфична активност 2x10 units/mg-., естествени човешки певкоцитни алфа-интерферон (3x10^ IU/ml) ζ и гама-интерферон (2x10 IU/ml),

Тест за туморонекротизиращ фактор TNF

Цитотоксичната активност на TFN в L--929 клетките по Flick и Git-ford (Flick, D.A., Gifford, G,Е.!Comperison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor, J. Immunol . Meth. 68, 1667, 1984). Разтвор от пробите и ак тиномицетин D (5 y|tg/ml> се добавят към монослойните клетъчни култури. След инкубация при 37 С за 20 часа цитотоксичният ефект на TMF се определя или чрез микроскапска експертиза на културите или чрез МТТ метода. Количеството, предизвикващо 507. деструкция на клетъчните култури се определя ката една единица активност на TNF. Сравнението с препарат от алфа-TNF (Genetech Inc.,USA) показва, че една единица в тестовете е равна на 100-200 pg/ml TNF.

Тест за неутрализация на цитокини

Цитокините, процуцирани от PEL, третирани с изпитваните

препарати, могат	да се идентифицират чрез тест за
неутрализация със	специфични антитела (Inglot et al..
Grgancselenides as	potential immunostimulants and inducers

- 12 -от inter-feron gama and other cytokines in human peripheral blood leukocytes, Ex peri ent. i a 1990, 46, 308-311). Също така могат да се използват различни ELISA китове за определяне на имунната активност на даден цитокин .

Комент ар

Във филтратите, получени от култивирани лимфатични клетки, могат да се открият и идентифицират чрез други стандартни методи различни от TNF или IFN цитокини, например интерлеекини (IL-1-10), GM--CSF, TGF - бета и др.

Б) RPC вариант за индуктиране на цитокини

Миши перитонеални клетки-гсстоприемници се получават от около шест седмични BALB/c мишки, умъртвени с етер, чрез инжектиране на 5мл пилноцечна RPMI-1640 среда при стайна температура. Промивната среда, съдържаща RFC се поставя е ледено студени 50 милилитрови центротрофужни тръби. RPC не са изплакнати нито центрофугирани. Клетките се изброяват в

Buerker хемоиитометър и се

1-1.5x10 кпетки/мп. Тази суспензират до плътност от плътност се изисква за всички тестове, измерващи ефекта от различните концентрации на п pen аратите (от 0.1 положит елен контрол

500 уьс g / m 1) .

включени във

Отрицателният и

От рицателният контрол измерва спонтанното отделяне на

TNF или IFN от

RFC, инкубирани с пълноценна

RF'MI -1640 среда без индуктори, докато позитивният контрол сзт стандартен (LPC -from Е coll.

0o5s85, Sigma 1-lOyvug/ml). Всички култури се инкубират о

С за 20 часа, След това културите се центрофугират при

1000 оборота за 10 мин. и филтратът се отделя. С помощта на автоматична пипета филтратите се разреждат от 1:2 до 1:256.

13Биотест за цитокини

За да се определи активността на ΤΝΓ във филтрати от миши перитонеапни клетки-гостоприемници RFC се използват 20 часови L-929 монослойни клетъчни култури.

Мишите фибробластоподобни L-929 клетки, 2x10 клетки на гнездо в 1.00 мсзларни обема пълноценна среда, се поставят в 96-гнездови плоскодънни тарелки и се инкубират за 20 часа __ о при 37 0 за да се получи моноспой.

Преместването на филтрата трябва да се извърши мног о внимателно продължение

Инкубирането на L.-929 часа при :..7 С в култ урит е се провежда на атмосфера с

5% съдържание на 002

Оцен к и

1) Отчитане на цитотоксичния ефект под обърнат ми к р ос к оп

2) МТТ- тест (3-С4.5-диметиптиазол-2~илЗ-2,5~ ди фен и л т ет р азол и ум бромид, сигма)

За измерване на убитите клетки в L-929 всяка микротарелка се добавят по 25 моларни обема от МТТ оцветяващ разтвор в концентрация от 5мд/м1

После тарепките се инкубират за 2 часа при температура _ о .57 С е агмосфера с

57. съдържание на С0_А .

След това във всяка тарелка се добавят 100 моларни обема разтворител, съдържащ 45 мл диметилформамид, 13.5 д. SDS (sodium dodecil suphate) и 55 м1 дестилирана вода.

Извършва се инкубиране в продължение на 12 часа при 37* С е COинкубатор.Резултатът от цветния МТТ тест се отчита в

Multi skan 340/CC разчитащо устройство (лабораторна система), използващо 570 нанометров филтър. Трябва да се използва съответният рекомбинантен алфа ~ туморснекротизиращ фактор TNF-cZ.

Биотест за интерферон

Интерферонът се тества чрез потискане на цитопатичния ефект, причинен от миши ениефапомиокардитен вирус (EMCV in snouse L-929 cells, re-ference Mu IFN алфа/бета, standard from National Institute of Health Bethesda, MD, USA), Цит олатичният ефек·- се наблюдава през обърнат микроскоп и също се измерва чрез метода МТТ, както е описано по-долу;

МТТ метод съгласно Serg и др,

Berg.K., Hansen М. В. и Nielsen S. Е, (1990)5 Нов чувствителен биотест за точно количествено определяне активността на интерферон чрез измерване на митохондрийната деми дрогеназа клетките (МТТ метод).ARMIS, 98,

156-16

МТТ <3/4,

5ди мет и л-т и аз ол-2-и л /2,5-ди фен и л т етразолиум бромид,

Сигма) се разтваря в

PBS в концентрация от 5мд/м1

За да се измерят убитите клетки е L-929 културите се добавят молар ни обема от МТТ оцветяве ц разтвор кон центр ация от 5мд/м1 към контролна проба тарелките се инкубират за (еталон) TNF или IFN. След това часа при темпелатура :-7 С в атмосфера със 5’4 съдържание въглероден двуокис. После във всяка тарелка се добавят по

100 моларни обема разтвор.

съдържащ 45 м!

диметилформамид, 13,5 g SDS (содиум додецил при температура дестилирана вода. Спец една

37^8 се измерва оптическата нощ инкубиране плътност при 570 нанометра с помощта на разчитаща устройство за микропластини

Start ta

Awareness Technology Inc, ?100, ползваше буферна екстракция като контролна /празна/ проба.

Алфа-туморонекротизиращият фактор, бета-интерферонът и други циюкини могат да бъдат тествани също и с помощта на китовете ELISA.

Сьставьт за провеждане на метода съгласно изобретението се характеризира основно с това, че съдържа двойно обработена водна тьканна култура, среда и серум за обогатяване на средата , както и човешки периферни крт^вни левкоцити или миши перитонеални клетки—гостоприемници.

Диагностичният кит (цитокино-индуктиращ кит) тг използване във варианта с периферни кръвни левкоцити (PBL) на настоящия метод (за 10-20 мануални теста) може да съдържа следните съставкиϊ

1) Двойно обработена водна тъканна култура, 100 м1

2) Hi st.opaque (R) ипи Fi col 1 -Hypaque <R) - 1077, (среда за градиент на плътността), 100 м1

3' RFMI- 1А40 - греда, 2x100 м1 (със сода бикарбонат и Lглутамин, филтрирана стерилно и тествана за ендотоксини)

4) Волски ембрионален серум (FBS), 20 м1- с ниско съдържание на ендотоксини и хемоглобин

5) Лекомн от Phaseolus vulgaris 0.5 mg (фитохемогпутинин ΡΉΑ—Η >

t>) Тубуси c обло дъно c капачки от стерилен пропилен за тъканни култури 17x100 мм с вместимост 14 м1, 25 в опаковка 7) Тарелни за тъканни култури с похлупаци, 2 тарелки, 96 гнезда, плоскодънни, стерилни..

Реагентите могат да се осигурят от Sigma Chemical Co.,St. Louis, Mo., USA или други фирми.

Такъв PBL кит може да се използва като т.н. втора фаза скринингова система за потвърждаване на резултатите, получени с PBL клетките ипи понякога като директна скринингова система за няколко субстанции, които могат да бъда? неактивни като имуномодупатори при гризачи, т.е. селено-органични съединения.

Диагностичният кит (цитокино-индуктиращ кит) за използване във варианта с миши перитонеални кпеткигостоприемници (RFC) на настоящия метод (за 10--20 мануални теста) може да съдържа следните съставки:

1)Двойно обработена водна тъкачна култура, 100 м1

0) RPMI-1640 ~ среда, 2x100 м1 (със сода бикарбонат и Lглутамин, филтрирана стерилно и тествана за ендотоксини)

3) Волски ембрионален серум (FBS), 20 м1, с ниско съдържание на ендотоксини и хемоглобин

4>Липополизахарид (LPS) 0.5 мд, от Е. coli 0127:08

6) Тубуси с обло дъно с капачки от стерилен пропилен за тъканни култури 12x75 мм с вместимост 6 м1, 25 в опаковка

7> Тарелии за тъкачни култури с похлупаци, 5 тарелки, 96 гнезда, плоскодънни, стерилни.

Реагентите могат

Co., St. Loui s, Mo =, USA от или други фирми

Един осъществяване на метода съгласно изобретението, въвеждащ усилване на к ой т о е това, че съдържа суспензия, от микротестове, се от една страна друг а страна характеризира

PBL култура нестероиден, главно с или RPC пр от и е ствъзпалителен медикамент, за предпочитане субстанция индсмет ацин

ITCL съединение.

деривати, ан алози,

ОМОЛО5И ИЛИ метаболити на тези съединения.

като найпредпочитан е индометацинът.

Настоящето изобретение се илюстрира със следните примерни изпълнения, като те не ограничават πο-никакъв начин обхвата на изобретението:

Пример 1:

Индивидуални разтвори от миши перитонеални клетки умъртвени с етер женски BALB/c мишки чрез инжектиране в ηеритонеалната кухина на 5м1

Eagle’s minimum essential medium (EMEM)/среда за тьканни култури/, допълнен с 10Х топлинно дезактивиран телешки серум. Утайката,получена чрез g промиване от една мишк съдържа 1-2 х 10 клетки/мл.

Суспензиите от клетки от всяка мишка се разделят на две проби, разпределени в два тубуса. Едната проба се третира с 100 у(А.д ТТР/м! , а другата служи за негативен контрол, показващ спонтанното отделяне на цитокини.

Всички култури се инкубират при 26 С за 20 часа и след това се центруфугират при 1000 оборота за 10 мин. филтратите се събират и тестват за бета-интерферонова активност чрез биотест, използващ микрометод за потискане на цитопатичния ефект, причинен от EMCV (енцефаломиокардитен вирус) в миши

L-929 клетки

Във всеки тест е включен вътрешно-лабораторен еталон , който е капиброван според международния еталонен препарат от

Mu

IFN, G002-904-511 , NIH, Bethesda,

USA

Цит апатичният ефект се измерва чрез МТТ метода съгласно Вег «*·»

Т' и др., ARMIS

98, 156-162

Получените резултати са к ак т о следва:за контролните проби нивото на бета-IFN е

1-8 U/M1 усреднено , за пробите , третирани с ТТР нивото на бета IFN е 4-127 U/м!

. усреднено

U/mI. Резултатите са дадени графично на фиг.1 (Сравнение на предуцирането на бета-IFN от

RPC третирани и нетретирани с ТТР

1- граница на откриване,

2..... медиана. Съгласно теста Medians р=0,0000

IS показва нивото на интерферона в RPC, изолиран от всяка отделна мишка),

Пример 2

Процедурата, описана в Пример 1 се повтаря с група от 7 мишки, само че суспензията получена от RFC на една мишка се дели не на две проби , а на четири. Пробите се разпределят в 4 тубуса (по 1 м1 всеки). Едната от пробите е негативен контрол, а останалите три се третират съответно със 100, 10 и ly<g TTF/wl , .за да се определи зависимостта на интерферона от дозата. След о

температура 26 С, часа при събрания филтрат отделяне на όη и сан о в

Пример фи γ(Зависимост инкубиране на културите за тубусите се центрофугират бета-интерферона се определя както

Получените резултати са представени на на продуцирането на IFN от концентрацията на ТТР). Всяка крива показва резултатите , наблюдавани при суспензията на RFC ,получени от една мишка.

Пример 3

Извършва се процедурата, описана в Пример определя апфа-туморонекротмвиращият фактор само че се вместо бетаинтерферонът.

филтратите от RFC културите, третирани и нетретирани със 100 ТТР/м! се тества за определяне на TNF чрез биотест. Миши фибробпастоподобни L-929 клетки (4x10^ в 100 моларни обема пълноценна ЕМЕМ) се поставят във 96 - гнездови плоскодънни тарелки (Falcon, Linbro, Flow) и се инкубират за 4 часа при температура 37^вС в атмосфера с 57. съдържание на С0^ .Пробите се разтварят в ЕМЕМ с актиномицин D (крайна концентрация 2,4 у(4.д/м1 ) в спомагателна тарелка, След това средата на културата над моноспоя от L.-929 клетки се отстранява и приготвеният разтвор се премества към тази култура часа с помощта на многоканална пипета. След инкубиране за 0 при температура 37 С, културите се тестват за убити клетки по метода МТТ, както е описано по-горе. Получените резултати са както следва: за негативния контрол на алфаTNF нивото έ 1-256 U/m1 , усреднено 8 U/m1, а за пробите, третирани с

ТТР нивото е също 2-256, но средното равнище е

U/ м1

Получените резултати са показани на фиг.З <Сравнение на продуцирането на алфа

TNF от RPC третирани и нетретирани с ТТР. Ιграница откриването, 2-медиана

Съгласно тестът Mediana

Р=0,0030

Всяка точка показва нивото на TNF в

RFC, изолирани от една ми шк а.

Пример 4

Следва се процедурата, к ак т о е описана

Пример 2, с изключение на това че не се определя бета-IFN, а апфа-TNF, по същество както е описано по-горе в

Пример 3

Получените резултат и са показани на фиг .4 (Зависимост на продуцирането на TNF от концентрацията на

ТТР)

Пример 5

А. Биологичен материал. За теста са използвани над

15 съсиреци от отделни здрави кръводарители, осигурени от

Регионалния център по кръвоп рели ване във

Вроцлав.

Характеристиките на донорите са дадени в 1аблица 1, долу донорите но кръв.

използвана като източник на PBL

Таблица 1: Характеристики на

Възраст (г оди ни )	Брой	Мъже	Жени	Даряване Многократно Еднократно
21 -30	24	22		24	—
31-40	45	44	1	45	-
41-59	46	44		40	6
06 що	115	110	5	109	6
7.	100	96	4	95	5

- 20 Болшинството от донорите са млади мъже, които са давали кръв мнотократно. Наблюдавани са значителни различия в реакцията на PBL от отделните донори, което е отбелязано в Таблица 2 по-долу.

Както се вижда от Таблица 2, 10-307. от PBL. могат да не реагират на дозата 100уК.д/м1 ТТР, докато само 77. не могат да бъдат стимулирани от 10у«.д/м1 доза РНА и 507. не реагират на същата доза LPC при продуциране на TNF. Тези данни са съществени за правилния подбор на биологичен материал. Нереагиращите PEL култури са открити чрез оценка на негативния (непредизвикано, спонтанно отделяне на цитокини) и позитивен (третиране на културите със стандартен индуктор като РНА или LPC) тестове.

Таблица 25 IFN и TNF реакция на PBL.. от индивидуални донори след стимулиране с различни дози ТТР или стандартни ин дук т ори

Индуктор	Доза (yfcg/м!	Брой на тестваните PBL	IFN	Брой реагирали :
(7.)	TFN	(7.)
ТТР	010391	100	19	13	(68)	13	(68)
		30	13	6	(46)	9	(69)
		10	15	14	(93)	13	(87)
ТТР	020391	100	14	10	(71)	11	(79)
		30	12	8	(67)	8	(67)
		10	10	5	(50 (	5	(50)
ТТР	101091	100	26	21	(81)	20	(77)
		30	*РГ)	9	(45)	8	(40)
		10	24	14	(58)	15	(63)
ТТР	010991	100	tr(	5	(100)	4	(80)
		30	4		(50)	0	(0)

Таблица 2 - продължение

Индуктор Доза Брой на Брой реагирали ;

		(yUg/ м1	тестваните PBL	IFN	(7.)	TFN	(7)
		10	Е;	*-*	(40)		(60)
ТТР	021091	100	5	4	(80)	4	(80)
		30	4	3	(75)	4	(100)
		10	5	3	(60)	3	(60)
ТТР	111191	100	5	-3	(60)	4	(80)
		30	4	'у	(50)		(75)
		10	5	4	(80)	2	(40)
ТТР	(8х )	100	29	19	(66)	10	(34)
		30	24	14	(58)	11	(46)
		10	21	16	(76)	р	(10)
РНА		10	69	64	(93)	54	(78)
LPS		10	41	33	(80)	21	(51)
			69	36	(52)	20	(29)

Таблица 3-5

TNF под въздействието на различни партиди 100 /мл торфен екстракт в международни единици за активност /Units/

IFN

un

TNF

Сериен Брой на Обхват Неди- Брой на Време на тестване;

24часа Меди- бдни МедиNo. пробите ана пробите Обхват ана Обхват ана

Конт- 333 <10-- 10 41 9-750 27 9-80 9 ролка проба без ин дукт ор

100

Таблица 3 - продължение

IFN / unite/ml TNF / Linit.s/ml

Сериен Брой на Обхват Меди- Брой на Време на тестване! 24ч ас а Меди- бдни МедиNo. пробите ана пробите Обхват ана Обхват ана

31090	·.>	5-	30	3	ND	ND	9-80	80
		30
291290	21	10- 3000	100	14	ND	ND	9-750	40
010391	J,.- ·„>	10- 2000	60	17	ND	ND	9-160	9
020391	19	10-	30	32	9-750	200	9-250	27

1000

Кондиционираният екстракт се съхранява при 4 С преди изпитанията.

Използвани са периферни кръвни левкоцити от здрави донори (8х10$ клетки/мл).

Б. Проведени експерименти

Проби от торфен екстракт от различни производствени партиди, изброени както е показано в Таблица 3, се изпитват с помощта на PBL., както е описано по-горе. В експериментите, интерфе-ронът (IFN) и туморонекротизиращият фактор (TNF) са определени качествено съгласно гореописаната ст андартна процедура, международни единици за активност.

Експериментите са повторени многократно, както

Получените обхвати и медиани също са дадени.

посочено в Таблица

За илюстрация, подобен тест е направен и със стандартизиран торфен препарат. При концентрация 30 Л д/м1 , активността на интерферона е с обхват 30-300 международни единици за активност, докато при концентрация 100^<д/м1, тя е 300-1000 международни единици за активност.

Междинни концентрации показват линейна зависимост между дозировката и реакцията.

Имуноактивните торфени екстракти, тествани в горния пример, са продуктите, описани в международната заявка 1Чо. РСТ/ЕР92/С0491.

Ст посочените в Таблица 3 данни става ясно, че при PBL културите, негативният и позитивен контрол са от съществено значение при оценяване на резултатите.

Освен това, експериментите показват, че когато една нереагираща PBL култура не се вземе под внимание и се прави статистическа оценка на голям брой експерименти, ефективността на тестовете, съгласно изобретението, не може да бъде изследвана.

за повече от две години са индуктиращата активност на определени цитокинопартиди ТТР, включително и 10 стандартни търговски портиди от него чрез биологичен тест, 2) партиди, отхвърлени от производитея поради неадекватна биологична активност при мишки, по-ниска ст установения стандарт и 3) препарати от лабораторни торфени екстракти в малки количества. Получените резултати са представени в Таблица 4 по-долу под формата средни нива на индуктираните IFN и TNF (с калкулиране на стандартните отклонения - SD и статистическата значимост).

Таблица 4 s Въздействие на различните партиди ТТР върху продуцирането на IFN и INF в човешки PBL

Ин дукт ор

Доза

TNF (^д/м1 ) Log 10 units/ml ( + SD)

ТТР	010391	100	1.41	&	1.07b	1.26 ±	0.91c
		30	0.96	zb	1.07	1.25 ±	0.88b
		10	1.81	zb	0.58c	1.45 ±	0. 63c
ТРР	020391	100	1=23	zb	0.81a	1.35 *	0.75c
		30	1.12	db	0.90	1. 14 *	0.83b
		10	0.75	cfc	0 = 76	0.86 +	0.90
ТТР	101091	100	1.70	zb	0.91c	1.38 ±	0.81c
		30	0.99	±:	1. 12	0.62 ±	0.80
		10	1.22	db	1.07 a	0.94 +	0. 76b
ТТР	010991	100	2.24	i	0.30c	1.35 ±	0.73b
		30	1.00	db	1.00	0.0
		10	0.56	+	0.68	0.88	0.73
ТТР	021091	100	1.72	dk	0.87 b	1.49 *=	0. 84b
		30	1.39	zb	0.81	1.79 t	0.20c
		10	1.11	sfc	0.91	1.01 ±=	0.84
ТТР	111191	100	1.36	db	1. 12	1. 18 ±	0.62b
		30	1.00	db	1.00	1.21 ±	0.71a
		10	1.56	±	0.86a	0.54 +	0.66
ТТР	(8Х)	100	1.04	db	0.82a	0.63	0.91
		30	0.88	dz	0.81	0.75 *	0. 84
		10	1.10	zk	0.70b	0.13 *	0.40a
РНА		10	2«08	dd	0.79c	1.67 ±	0.99c
L..PS		10	1.36	zb	0.80c	0.97 ±	1.01b
			0.64	zb	0.63	0.42 ±	0.67

Средните стойности са изчислени като са взети предвид, всички резултати от титруването на IFN или TNF. Нереагиращите проби са взети като 0.

а-с Различно от при а (спонтанно продуциране на цитокини) b - р<0.01 или при с - р'0.001.

Стойностите Mediana , съответстващи на резултатите от

Таблица 4, са дадени в следващата Таблица 5, а подбрани данни са представени в графичен вид на фиг.5 и 6, илюстриращи въздействието на различните партиди ТТР съответно върху продуцирането на IFN и TNF.

Таблица 5: Въздействие на различните партиди ТТР върху продуцирането на IFN и TNF от човешки PBL

Ин дук т ор

Доза (JAq /ml )

IFN A

Units/ml

TNF

TTP	010391	100 30 10	30 <10 100	27 27 27
TTP	020391	100	30	50
		30	30	34
		10	<10	<9
TTP	101091	100	100	34
		30	< 10	<9
		10	45	IS
TTP	910991	100	300	27
		30	<10	<9
		10	< 10	18
TTP	021091	100	100	27
		30	60	80
		10	60	27
TTP	111101	1 00	100	18
		30	<10	40
		10	100	<9

- 26 Таблица 5 -- продължение

Индук тор	Доза yu g / m 1 )	IFN	4 Uni ts/ml	TNF
ТТР (8х)	100	20		<9
	30	10		<9
	10	20		<9
РНА	10	200		80
LPS	10	30		27
	—	10		<9

Стойностите Medians са изчислени като са взети предвид всички резултати от титруването на IFN или TNF.

Идентификацията на индуктираните цитокини е извършена чрез неутрализация на IFN и TNF, индуктирани чрез ТТР.

Горните резултати от експериментите са пояснени съответно с фигури 5 и 6.

Въздей с.т ви ет о различните партиди

ТТР върху продуцирането на IFN от човешки PBL е показано на фиг

ТТР

Всяка точка от графиката съответства на PBL от отделен здрав донор нктивността на

INF съответства на антивирусни единици.

Потъмнената зона показва границата на несъществените данни

Хоризонталните линии показват средните ст ойности

Индуктирането на

IFN от и 100^g/ml ТТР е значимо (при р

Въздействието на различните партиди

ТТР върху продуцирането на TNF от човешки PBL е показано на фиг.6.

- 27 Активността на TNF е изразена в цитотоксични единици за миши L-929 клетки. Реакцията спрямо въздействието на 30, 100 и 200ix,g/ml TTP е значителна ( при р < 0.05).

В експериментите са използвани силни поликлонални антисеруми, а именно! анти- естествен алфа-интерферон, антилимфобластоиден (Namalwa) алфа-интерферон и анти- естествен гама-интерферон за неутрализиране на антивирусната активност във филтрата от FOL културите, третирани по 20 часа с три различни дозировки ТТР. Резултатите, представени на фиг. 7 (Резултати от неутрализацията на интерфероните чрез поликлонални анти-интерферонови серуми), показват, че порциите интерферон тип алфа- и гама-, продуцирани от PBL от различни кръводарители, варират значително. Предполага се, че отделянето на интерферон при всеки донор има отделна и н ди в и д у а лн а ар ак т ер и с т и к а.

Неутрали зационните тестове, проведени със силен попиклонален заешки анти -апфа-туморонекротизиращ фактор серум (Genzyme Inc.),показват, че индуктираният с ТТР туморонекротизиращ фактор е главно от типа алфа-. Беше потвърдено чрез резултатите от подобни неутрализационни тестово със заешки поликпонапен анти—бета-туморонекротизиращ фактор серум (Genzyme Inc,), който не неутрализира активността на индуктирания с ТТР туморонекротизиращ фактор, фигура 7 показва резултатите от неутрализацията на интерферсните посредством поликлонални анти-интерферонови серуми, филтратите, съдържащи интерферона от PEL културите, инкубирани с ТТР ( използвани са три различни дозировки ТТР и седем различни PEL ) се третират с посочените антиинтерферонови серуми. 1 - не третирани препарати? 2 третирани с анти-алфа-HuIFN! 3 - третирани с анти-HuIFN-Ly; 4 - третирани с анти-HuIFN-Y .

Пример 6 : Процедурата, описана в Пример 5 се извършва с цел да се покаже усилващия ефект от присъствието на усилвател, например индометацин, съгласно изобретението. Всяка PBL- култура се разделя на няколко проби. Едната от тях служи за негативен контрол, показващ спонтанното отделяне на цитокини, другата служи за позитивен контрол и се третира със стандартен мощен индуктор на цитокини от посоченото по-долу естество, а останалите проби се третират с от 1 до 100 yU-g/ml TTP, партиден No 010391 или 020391,, както и с ТТР I и TTP II, което е посочено съответно в таблици 6Ь и 6с. и 5 ytz-g/ml индометацин + ТТР от същите партиди ( Таблица 6а ) или 10 g/rnl съединение ITCL + ТТР от същите партиди ( Таблица 6Ь) ипи още 10 или 20ytzg/ml селеноорганинни съединения ¢1),(2) ипи (3) , както са изяснени погоре + ТТР от същите партиди. Така са определени IFN и TNP във филтратите от инкубираните култури. Получените резултати са посочени в Таблици 6а, b и с по-долу.

Таблица 6а! Ефект на усилване индукцията на цитокини в присъствие на индометацин

Експериментален Индс- Концен-- Цитокини (units/ml) индуктор метацин трация IFN TNF yUzg/ml

1.а)ТТР 010391

LFS

—	100	300	750
-	10	30	250
-	1	20	SO
+	100+5	1000	2200
+	10+5	200	750
+	1+5	<10	250
-	10	200	500
-	-	<10	9
+	5	20	27

Таблица 6а - продължение

Експеримент ален Индо-ин дук. тор метацин

КонценЦитоки ни

IFN (uni ts/ml) TNF

2.Ь)ТТР	020391	100	600	50
Н	...	40	20	9
..... 1! ___	--	20	10	9
.... J1 .	-	10	<10	<9
_ Н	+	100+5	600	80
... !8 _	+	40+5	100	27
— »	+	20+5	100	9
... ·!	+	10+5	30	9
РНА		5	600	50
РНА		5+5	2000	80
	-	-	60	<9
-	+	5	10	<9
---------—	------------...--------.........	----...-----....---------		—
a) PBL с	а приготвени	от свежа хепаринизирана	кръв по 1
Hypaque	разделителна	техника. PBL	културите	съдържа

Ficol1 7x10 ⁶ / ml ₃

b) PBL.

пригот вени

Регионалния център по кръвопреливане. Клетките са обработени съгласно метода на Cantel1 и др. ( Meth. Епгуто1. 1981, 78, 29-38).

PBL културите съдържат 8x10 клетки/ml.

Таблица 6b:

Ефект на усилване индукцията на цитокини в присъствие на

ITCL съединение

Експериментален Съединение	Концен-	Цитокини	(units/ml)
и н дук. тор T.TCL.	трация	IFN	TNF

1. ТТР	010391	—	100	100	13
ТТР	010391	-	30	100	9
ТТР	010391	+	100+10	3000	30
ТТР	010391	+	30+10	300	80
РМА		-	10	3000	250
-		-		10	<9
		+	10	<10	<9

2. ТТР I

ТТР I

ТТР I +

ТТР I +

РНА

100	3000	27
30	30	<9
100+10	3000	250
30+10	300	9
10	100	13
-	10	<9
10	10	<9

Таблица 6с ϊ

Ефект на усилване индукцията на цитокини в присъствие на селено-органинни съединения.

ь.к сп еримен т ален индуктор

Селено-	Концен-	Цит ок и ни	(uni ts/ml )
орг ан и ч ни съединения	трация /ml	TEN	ΤΝΕ

1. TTPs		...	10	100	<9
TTPs		-	5	10	<9
TTPs	Comp .	(1)	10+20	300
TTPs	Comp „	(1)	5+20	100	27
TTPs	Comp .	(2)	10+20	300	50
TTPs	Comp .	(2)	5+20	100	9
PHA		-	10	100	<9
-	Comp .	(1)	20	200	9
-	Comp ,	(2)	20	100	27
-		...	--	10	<9
2.TTP II		-	50	10	<9
TTP II			5	10	<9
TTP II	Comp .	(3)	50+10	30	27
TTP II	Comp .	(3)	10+10	30	27
PHA		-		30	<9
-	Comp .	(3)	10	10	<9
...		_	—	10	<9

θ

PBL културите съдържат 8x10° клетки/ml. ТТР е торфен препарат, произведен в малки количества. Отнасително слабата TNF реакция вероятно се дължи на факта, че кръвните съсиреци о се съхраняват в продължение на 20 часа при температура 4 С преди приготвянето на културите. Селено-органичните съединения са индуктори на цитокини както и ТТР.

Пример 7: Провежда се диагностичен тест, отразяващ ефекта от оралната администрация на ТТР в дневни дози от 5 mg , приет под формата на достъпни чрез търговската мрежа таблети, върху реакцията на PBL култури in vitro към една допълнителна доза индукция на цитокини чрез ТТР, както е дадено по-долу:

Тестът е проведен с четири здрави доброволци от женски пол на възраст от 43-58 години, които дават 20 ml венозна кръв, вземана от вена ulnaris седмично преди, по време и след вземането на ТТР в дневна доза от 5 mg на таблетки. Спазвани са два различни режима на приемане. Две от доброволките (по нататък съответно В.К. и J.Z.J.) са подложени на третиране с ТТР в продължение на 3 седемдневни цикъла; дрогата се приема през устата, една таблетка от 5 mg на ден в продължение на една седмица следвана от една седмица почивка. Пълната доза е 21 таблетки. Останалите две доброволки продължение на три седмици

I. и W.F.) се третират с по една дневно, вземани през устата в непрекъснато. Пъпната доза е 21 таблетки. След две седмици милиграмовите таблет ки са стандартен търговски продукт на фармацевтичната фабрика TORF CORPORATION във

Вроцлав,

Полша лактоза и 2 mg MYVATEX. За да се индуктират ци т и к и н и в PBL

ТТР, като чистата субстанция е приготвена под формата на основен разтвор, съдържащ редестилирана вода, mg TTP/ml в освободена „о „ съхраняван при температура 4 С.

от сяра

Кръвните проби, взети от доброволците са хепаринизирани с разтвор от Heparin POLFA без консерванти в крайна концентрация от 10 units/ml, се третират, както е описано по-горе, за да се получат PEfL култури in vitro, които след това се третират с индуктори на цитокини PHA, LPS и ТТР по начина, описан в предишните примери. За всяко третиране са използвани 200 yU g култури. филтратите се съхраняват и тестват за IFN при температура 4° С в продължение на една седмица , а се съхраняват и тестват за TNF при -20°С, за да се предотврати дезактивацията им в резултат на спонтанна протеолиза.

IFN и TNF се тестват по същия начин, както е описано по-горе. Получените резултати са представени графично на фигури от 8 до 13 (реакция на PBL култури от различни пациенти спрямо индуктори на IFN и TNF , по време на орална администрация на ТТР) .

Както може да се види от данните, представени на фигури 8 и 9, показващи IFN реакцията на първата група доброволци по време на приемане на ТТР, реакцията намалява и приема началните си стойности след двуседмична почивка. Обратно, TNF реакцията, показана на фигури 10 и 1.1, се повишава по време на приемането на ТТР и се връща към нормалното си ниво след две седмици почивка.

Данните, представени на фигури 13 и 14, отразяващи реакцията спрямо индукцията на цитокини при другия начин на приемане на ТТР от доброволката A.D.I., показват, че хипореактивната състояние спрямо индукцията на цитокини се достига след 3 седмици непрекъснато приемане на ТТР през

- 34 устата. Хипореактивното състояние, изразено като загуба на възможност от страна на F'BL да реагират спрямо индукцията на IFN чрез ТТР, изчезва след две седмици почивка. Обратно, по време на непрекъснатото триседмично приемане на ТТР, хипореактивност спрямо индукцията на TNF не се развива (фи r . 12) .

Горните резултати показват, че оптималната доза имуномодулатор, индук.тор на цитокини, може да бъде установена индивидуално за всеки пациент, като бъде подложен на прост PBL тест съгласно настоящото изобретение.

Claims (17)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1.Метод за определяне на иммунната активност на биоактивни, цитокино-индуктиращи имуномодупаторни субстанции, характеризиращ се с това, че култура от човешки периферни кръвни левкоцити (PBL) или суспензия от BALB/c миши леритонеални клетки-гостоприемници (RPC) се третират с разтвор от субстанцията, подлежаща на тестване с цел да се индуктира продуциране на цитокини, които след това се определят по стандартни идентификационни методи.
2. 2.Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се изпозва PBL. култура, в която се индуктира продуцирането на различни видове цитокини след което всеки от цитокините се определя качествено и набор от различни, за предпочитане известни серуми к ои т с припознават отделните цитокини.
3. 3. Метод, съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че човешката PBL култура се приготвя с. хранителна среда, подходяща за тък.анни култури и гъстотата на готовата за $

   употреба PEL. култура е приблизително 8 х 10 левкоцити/ml.
4. 4. Метод, съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че разтворът, подлежащ на тестване е в концентрация от 0,1--200 yUg/ml.
5. 5. Метод, съгласно претенции от 1 до 4, характеризиращ се с това,че всеки цитокин се идентифицира достатъчно бързо, за да бъде предотвратена протеолизата на цитокините.
6. 6.Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че се използва PBL. култура или RPC суспензия и биоактивна субстанция индуктира продуцирането на интерферони и туморонекротизиращи фактори.
7. 7. Метод, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че

   RPC суспензията съдържа около 1-2 х 10 клетки/ml.
8. 8. Метод, съгласно претенции 6 и 7, характеризидащ се с това.

   че разтворът, подлежащ на тестване, са приготвя в хранителна среда Eagle или RPMI-1640 . добавка от 10Х телешки ембрионален серуг-.
9. 9.Метод, см л но която и да е от предходните претенции.

   характеризиращ се с това че получените резултати се оценяват спрямо еталонна крива.
10. 10. Метод, съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това, че? се тестват торфени екстракти, такива като ТТР.
11. 11. Метод, съгласно която и да е претенция от 1-6, 8, 9 и 10, характеризиращ се с това, «а във варианта с PBL, усилването на резултатите се постига чрез прибавяне към разтвора, подлежащ на тестване на нестероидно противовъзпалително средство, като ITCL съединение и селено-органични съединения, а най-добре индометацин.
12. 12.Метод за определяне на имунната реакция на човешки индивид спрямо терапия с цитокино-индуктираща имуномодулаторна субстанция, характеризиращ се с това, че култура от човешки периферни кръвни левкоцити (PBL) от отделен индивид, третирана с имуномодулаторна субстанция, се третира на определени интервали от време с разтвор от приемана субстанция с цел да индуктира продуцирането на цитокини, които цитокини след това се определят съгласно стандартни методи за да се определи моментът на развиване на хипсреактивност спрямо субстанцията спед продължителното й приемане и моментът на възтановяване на реактивоспособността спрямо допълнителна доза след период на почивка.
13. 13. Метод, съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че интервалите от време са от 7 до 14 дни.
14. 14. Метод, съгласно претенции 12 или 13, характеризиращ се с това, че по време на терапията се прилага торфен екстракт като цитокино-индуктираща имуномодулаторна субстанция.
15. 15. Метод, съгласно претенции 12, 13 или 14, характеризиращ се с това, че по време на терапията се прилага ТТР като цитокино-индуктираща имуномодулаторна субстанция.
16. 16. ТТР, когато се използва, изпитва или определя по метода, съгласно претенции от 1 до 15.
17. 17.Съединение за осъществяване на метода, съгласно която и да е претенция от 1 до 15, характеризиращо се с това , че съдържа от една страна PBL култура или RPC субстанция, а от друга страна нестероидно противовъзпалително средство, за предпочитане индометацин.

    /Изменени претенции в съответствие с препоръките, отразени в доклада от международната предварителна експертиза/

    1. Метод за определяне на имунната активност на биоактивни, цитокино-индуктиращи имуномодулаторни субстанции, характеризиращ се с това, че култура от неактивирани човешки периферни кръвни левкоцити (PBL), за предпочитане приготвени с хранителна среда ,подходяща за тъканни култури, при което гъстотата на готовата за употреба култура е приблизително 8 х 10 левкоцити/ml или суспензия от неактивирани BALB/c миши перитонеални клетки-гостоприемници (RFC) се третират с разтвор от субстанцията, подлежаща на тестване с цел да се индуктира по време на определен инкубационен период продуцирането на цитокини, които след това се определят по стандартни идентификационни методи.

    2. Метод за определяне на имунната активност на биоактивни, цит ок и н о-ин дук тир ащи и мун омодулат орни субстанции, характеризиращ се с това, че култура от неактивирани човешки периферни кръвни левкоцити (PBL) или суспензия от BALB/c миши перитонеални клетки-гостоприемници (RPC) се третират с разтвор от субстанцията, подлежаща на тестване с цел да се индуктира по време на определен инкубационен период продуцирането на цитокини, които след това се определят по стандартни идентификационни методи, при условие,че за варианта с човешка PBL култура, последната е приготвена с подходяща за тъканни култури хранителна среда , като гъстотата на готовата за употреба култура е приблизително £

    8 х 10 левкоцити/ml.

    3.Метод, съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че разтворът, подлежащ на тестване е в концентрация от 0,1-200 ug/ml.

    4.Метод, съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с това,че всеки цитокин и по специално туморо-некротизиращият фактор CTNF), се идентифицира достатъчно бързо, за предпочитане веднага след инкубацията, с цел да бъде предотвратена протеолиза.

    съгласно която и да е от предходните се с суспензията съдържа около 1-2 клетки/ml

    6. Метод, съгласно претенция 5, х ар ак т ер и з иращ се с това, че разтворът, подлежащ на тестване, хран ит елна среда Eagle или

    RPMI-1640 добавка от

    107:

    телешки която и да от предходните претенции, с това, получените резултати се оценяват спрямо еталонна крива, за предпочитане позитивен и негативен контрол

    а.Метод съгласно която и да от предходните п р ет ен ци и , характеризиращ се с това че се тестват торфени екстракти,

    9. Метод съгласно която и да е от предходните претенции, характеризиращ се с. това, че усилването на резултатите се постига чрез прибавяне към разтвора, подлежащ на тестване на нестероидно противовъзпалително средство, като ITCL съединение и сепено-органични съединения (1-3),а най-добре индсметацин .

    10. Метод за определяне на имунната реакция на човешки индивид спрямо терапия с цитокино-индуктираща имуномодулаторна субстанция, характеризиращ се с това, че култура от човешки периферни кръвни левкоцити (PBL) от от делен индивид, третирана с такава имуномодупаторна субстанция, определени интервали от за предпочитане от / до дни третира с разтвор от приемана субстанция г цел да индуктира продуцирането на цит ок ини, ► сито след това се определят съгласно стандартни методи за да се определи моментът на развиване на хи п ореак тивност спрямо субстанцията след продължителното й приемане и моментът на възтановяване спрямо допълнителна доза след период на реактивоспособността на почивка

    11.Метод съгласна претенция 10, характеризиращ се с това, че по време на терапията се прилага торфен екстракт, поспециално ТТР, като цитокино-индуктираща имуномодупаторна субстанция.

    12.Използване на ТТР в метода, съгласно която и да е от предходните претенции.

    13.Съединение за осъществяване на метода съгласно която и да е претенция от 1 до 11, характеризиращо се с това , че съдържа от една страна PBL култура или RPC субстанция, а от црута страна нестероидно противовъзпапитепно средство, ва предпочитане индометацин.

    За верността на превода!