JPH07500905A

JPH07500905A - バイオ活性物質の免疫活性を測定するための方法と組成物

Info

Publication number: JPH07500905A
Application number: JP5507380A
Authority: JP
Inventors: イングロット、アンナ; ブラコルスゼフスカ、ゾフィア
Original assignee: Torf Establishment
Current assignee: Torf Establishment
Priority date: 1991-10-26
Filing date: 1992-09-28
Publication date: 1995-01-26
Also published as: RU94022481A; DE69220078D1; CZ100494A3; GR3024457T3; NO941444D0; FI941920A7; FI941920A0; DE69220078T2; EP0609255A1; PL170592B1; FI941920L; HU9401185D0; SK44094A3; BG98720A; HU216863B; BG61705B1; RO114837B1; LV12140A; ES2061424T1; HK1002610A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】バイオ活性物質の免疫活性を測定するための方法と組成物本発明はある種のバイオ活性物質を検定して、サイトカインの生産を誘導する活性に関するその免疫活性を測定するための方法と組成物に関する。サイトカイン、例えばインターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、ホルモン様のタンパク質で、全ての免疫反応に於いて、又恒常性（ホメオスタシス）の維持を司る調節プロセスに於いて実際に重要な役割を演ずる。このようなサイトカインの生産はある種の物質によって誘導することができ、そのような物質はそのバイオ活性及び免疫活性のために免疫不全症候群及び関連疾病の治療に有用である。

このようなバイオ活性物質の免疫活性を正しく簡単に検定する方法が勿論必要であり、本発明の目的はそのような方法を提供することにある。

本発明の方法は、被検物質が種々のサイトカインの生産を誘導する能力があるかどうかを決定し、且つある種の物質の特性、即ちその免疫特性を生産、分離、精製、及び最終組成物の調製の各段階に於いて有効に検査することができる。又本発明は前記の方法を実施するための組成物とキットを提供する。

従来免疫活性を測定するためには多くの方法があるが、いずれもその実施は簡単ではない。免疫効果を有する新しい治療用組成物を臨床的に試験する場合には、免疫システムのよく知られた数多くの分析可能の特性を標準の方法を用いてモニタすることによりその免疫効果を評価している。一旦その活性が実証されれば、次に患者の状態をその免疫応答に関して迅速に検査できる代表的単一試験方法が必要になる。

臨床的検討に於ける血清中のＩＦＮのレベルの評価は困難且つ不正確で誤解を招き易い。インターフェロンはしばしば種々の組織の中に局所的に生産され、その寿命は短く、その作用は傍分泌的で（直接の隣接細胞にのみ作用）、且つ細胞内受容体や担体タンパク質に強く結合している。

一方免疫活性物質、特に粗ビート（泥炭）から抽出物を生産、精製及び／又は分離するための工学的プロセスは普通多段階のプロセスであり、それには生産を完全に管理できる信頼性のある迅速な試験方法の確立が常に必要である。更にビート抽出物の場合のように対象物質が複合体である場合が多いので、そのような物質の個々の両分の活性を測定する同様な方法も重要である。更に分析すべき産物が非常に高価であるから、微量試験方法を案出する必要がある。

発明者は次の四つの基本的研究結果により前述の問題を解決することができた。

１、ある種の免疫活性ビート抽出物が、インターフェロンや腫瘍壊死因子のようなサイトカインの生産を、抹消血液の白血球の１ｎｖｉｔｒｏ培養の中で誘導し、誘導の程度は抽出物の用量に左右される。

２、　ＢＡＬＢ／ｃマウスの常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）を免疫活性ビート抽出物により処理すると、このＲＰＣによりインターフェロンβ（及びＴＮＦ−α）が、非処理のサンプルでのこれらのサイトカインの自発的放出に比べて非常に多（の置土産される。

３、ある種の免疫活性ビート抽出物は、上述のようにＩｎ　ｖｌｔｒｏで試験した場合、有機セレン化合物、３−メチル−５−ベンゾイルアミノイソチアゾール −４−カルボン酸のｐ−クロロフェニルアミド及びインドメタシンのような既知の免疫モジュレータ−と組み合わせれば相乗効果を示す。この方法により、ごく少量の免疫活性物質を使用してその免疫活性を示すことができる。

４、ある種のサイトカイン、即ちＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの誘導を試験するために、ＴＴＰ　（Ｔｏｒｆ−Ｉｌｉｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　Ｔｏｒｆ　Ｐｒｅｐａ−ｒａｔｔｏｎ、ビート由来の産物）　５　ｔａｇ１日の用量の経口投与を受けた健康な有志者の末梢血液白血球（ＰＢＬ）は、ＴＴＰの経口投与を長期継続１した後ではＴＴＰ溶液によるサイトカインの誘導に対して応答する能力を失うが、約２週間経口投与を中断した後ではこの能力を回復する。

本発明の方法は、ヒトの末梢血液白血球（ＰＢＬ）の培養液又はＢＡＬＢ／Ｃマウスの常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）の懸濁液を、サイトカインの生産を誘導するために試験しようとする物質の溶液で処理する段階と、次に前記サイトカインを標準の同定方法で測定する段階とを含む。

本発明の第一の方法又は実施例に於いて使用される末梢血液白血球（ＰＢＬ）の培養液は、組織培養に適した栄養培地を用いて健康なヒトの新鮮な白血球から調製した短期培養液で、直ちに使用可能の培養液の好ましい濃度は約８　Ｘ　１０ ”白血球／−である。試験しようとする溶液は０．１〜２００μｇ／ｍ／の濃度で使用するのが好ましい。この方法は特にビート抽出物の試験に適している。

試験すべき溶液、例えばビート抽出物またはその両分に、非ステロイド系抗炎症薬のような免疫調節物質、好ましくはエブセレン（ｅｂ３ｅｌｅｎ）のような有機セレン化合物、３−メチル−５−ベンゾイルアミノイソチアゾール−４−カルボン酸のｐ−クロロフェニルアミドのようなイソデアゾール誘導体及びインドメタシン並びにこれらの物質の類似体、同族体及び代謝物を含むグループから選定した物質を混合すれば微量測定が可能になる。

この目的に使用可能の有機セレン化合物の例としては次の構造式１〜３の化合物があり、構造式２の化合物エブセレンが特に好ましい。

（１）ビス−［２−（Ｎ−フェニルカルボキシアミド）］−二セレンジフェニル（２）　２−Ｐｈａｎｙｌ−１，２−ｂａｎｚｉａｏｓｅｌａｎａｚｏｌＪ（２Ｈ）−ｏｎ・（Ｘｂｓａｌｅｎ　ＰＺ　５１　）（２）２−フェニル−１，２− ベンズイソセレンアゾール−３（２＋１）−オン（エブセレンＰｚ５１）（３ン　ビス−［２−＜Ｎ−（２−ピリジルンカルボキシＩミド）］−二セレンジフェニル前記の目的に使用できるイソチアゾール誘導体の例としては次の一般式Ｉの化合物があり、この式でＲ１はハロフェニル基、好ましくはクロロフェニル基、ＲＭはフェニル基、Ｒ８は低級アルキル基、好ましくはメチル基である。

ハロフェニル基（特にクロロフェニル基＞　Ｒ１のハロゲン原子はフェニル環のパラの位置にあるのが好ましい。

上記の一般式Ｉの好ましい化合物としては３−メチル−５−ベンゾイルアミノイソチアゾール−４−カルボン酸のｐ−クロロフェニルアミドがあり、これは一般式ＩのＲ１がｐ−クロロフェニル基、Ｒ，がフェニル基、Ｒ３がメチル基の化合物である。簡単のためにこの化合物を以下「化合物ＩＴＣＵＪと称することにする。ボーランドにはこの化合物に対して商標ｒＶＲＡＴＩＺＯＬＩＮ　＠　Ｊが登録されている。この合成と特性に就いては＾ｒｃｈ、　Ｉａｍｕｎｏｌ、　ｅｔ　Ｔｈｅｒ、　ｌ１ｘｐ、　１９７３．２１．８９１に記載しである。

微量測定に有用な前述の免疫調節物質、即ち有機セレン化合物、イソチアゾール誘導体及びインドメタシンの共通点は、全て非ステロイド系抗炎症薬であり、プロスタグランジンの合成を阻害する点である。これらの物質は本発明の方法の結果を増幅するので、微量測定に特に有用である。結果の増幅率は５〜２０倍である。

種々の非ステロイド系抗炎症薬の中で増幅の目的には、有機セレン化合物（１，２，３）と化合物ＩＴＣＬ１特にインドメタシンが好ましい。

本発明には誘導された個々のサイトカインを認識するために種々の抗血清が用いられる。このような血清は種々のサイトカインの試験と標準化用として知られており又そのために使用される。誘導されたサイトカインの同定はサイトカイン形成が完了した時点でタンパク質分解の前に実施すべきである。誘導された種々のサイトカインの内で、例えばインターフェロンγなどは形成が緩やかで溶液中に安定に残るが、例えば腫瘍壊死因子などは速やかに形成され、タンパク質分解を受け易い。

ヒト個人のある種の免疫活性物質に対する免疫応答が他の因子、例えばウィルス又は細菌の感染により刺激されていなければ、そのような免疫応答を測定するのに前述の方法を用いることができ、従ってこれは個々の患者の薬品応答のモニタ、ＴＴＰのような治療用サイトカイン誘導物質の適正な用量の測定、更には薬剤投与の有効な計画の設定にも適用可能である。この方法はＴＦＮ誘導に対する低反応性状態の評価に基づいている。

即ち本発明の方法は又、サイトカインを誘導する免疫調節物質を用いた治療に対するヒト個人の免疫応答を測定する方法に関する。

本方法は、そのような免疫調節物質で処理したヒト個人の末梢血液白血球（ＰＢＬ）の培養液を定められた時間間隔を置いて、サイトカインの生産を誘導するために投与する物質の溶液によって処理し、次にこの誘導されたサイトカインを標準の方法（サイトカインのＥＬＩＳＡ法を含む）で測定し、前記物質の投与を継続した後の前記物質に対する低反応性の発生の時点とある期間投与を中断した後での前記物質の追加投与に対する応答活性の回復の時点とを測定するようにしたことを特徴とする。

その際の時間間隔は好ましくは約７〜１４日である。

好ましい実施例では、サイトカインを誘導する免疫調節物質としてゝピート抽出物を使用する治療の過程に前記の方法を適用する。

本発明の特に好ましい実施例では、サイトカインを誘導する免疫調節物質としてＴＴＰを使用する治療の過程にこの方法を適用する。

ＴＴＰは例えばＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９２１００４９１の対象であり、ここにＴＴＰ　、その特性及びその生産が詳細に記載しである。

上述の点を考慮すれば、本発明は又、本発明の方法により必ず使用され、試験され、測定されるＴＴＰに関する。

本発明は第二の方法として、免疫活性物質の生産、精製、分離などの工学的プロセスを迅速にモニタするために適した試験方法を提供する。例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウスの常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）の懸濁液を試験しようとする液体で処理すれば、マウスインターフェロンβ並びに腫瘍壊死因子が誘導される。この両者の検出と定量は標準の同定方法により可能である。この方法には約１×ｌＯ“細胞／−を含む、マウスの新鮮な常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）の懸濁液が用いられる。

試験しようとする溶液は１０％の子ウシ胎児血清を加えたイーグル栄養培地又はＲＰＭＩ−１６４０培地の中で調製される。得られた結果をモデル物質を使用して作成した検量線と比べて評価する。モデル物質としては、従来の方法で試験した同じ免疫活性物質のサンプルを使用してもよい。ここでもこの方法は、ビート抽出物を取得しその画分を分析するためのプロセスをモニタするのに特に適している。

本方法は　−多くの従来の試験方法の場合のような　−抗体形成の二次効果ではな（、インターフェロンβの直接誘導に基づいているので、他の公知の方法に比べて非常に簡単で有効である。従来は、マウスの免疫システムがヒトの免疫システムと大きく相違しており、ヒトの免疫応答の指標として認識される試験　−例えばひ臓又はリンパ節などの組織の中のインターフェロンの存在　−が最良の実験動物であるＢＡＬＢ／ｃ型のマウスの場合に効果がないという事実のために、本方法に類似の方法を見出すことが不可能であった。

ここで、試験用の生物学的材料としてＢＡＬＢ／ｃマウスの常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）を選び、そのような細胞の新鮮な懸濁液を使用すれば、ＢＡＬＢ／ｃマウスの明らかな免疫応答が得られることを見出した。各試験に対して３匹の動物を犠牲にすれば充分であり、結果は数時間以内に得られる。又この生物学的材料を培養し、マクロファージの相当する線を確定してもよい。

本発明の方法は、上述の知見により、生物学的材料、即ち末梢血液白血球（ＰＢＬ）の培養液又はＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）の懸濁液を使用する。各サイトカインの存在と濃度は、書籍５ｌｄｎｅｙＰｅｓｔｋａ編、ｒ酵素学の方法１１９８６．１１９巻、Ｃ部ｒインターフェ。

ンＪに記載のインターフェロンの試験と標準化の方法により測定される。誘導されたサイトカインの全スペクトルの測定により患者の免疫状態が確認される。

結果の正しい判定には、本発明の両方の方法を実施するための生物学的材料を適当な供与体から選択することが必要である。ヒトの白血球の場合には、低反応性、即ち低いレベルの免疫応答を示す個人（稀なケース）からのサンプルは評価から除外すべきである。

ＢＡＬＢ／ｃマウスのＲＰＣ懸濁液の場合には追加の刺激を受けた（例えば感染した）動物から採取したサンプルも評価から除外する必要がある。ＢＡＬＢ／ＣマウスのＲＰＣ懸濁液の場合、若すぎる又は年を取りすぎた動物では年齢によるサイトカイン生産の低下が見られるので、そのような動物からはサンプルを採取すべきではない。５〜８週齢の健康な動物を選定する。サイトカインの自発的生産の非常に高いサンプルの場合には、特に免疫調節物質の試験の際に、サイトカイン誘導の増強作用が見られず、場合によってはそのような誘導の減少さえ認められるので、このようなサンプルは除外すべきである。

非ステロイド系抗炎症薬（前述の物質のどれか、即ち化合物ＩＴＣＬ又は有機セレン化合物１．２及び３、好ましくはインドメタシン）を試験しようとする溶液に加えて結果の増幅を達成する、本発明の方法の実施例は、誘導されたＴＮＦ、　ＩＦＮ活性を測定するのに特に適した微量試験法である。本試験法は数多くのサンプルの同時検定に経済的に迅速に適用可能で、標準化と少なくとも部分的の自動化に適している。

次に本発明の両方の方法を実施例により更に詳細に説明する。

試験しようとする物質の溶液の調製。試験しようとする物質、例えばビート抽出物を無菌の２回蒸留した水に１０　＠ｇ／−の濃度に溶解する。このサンプルを孔径０．４５μｍで最大６００　ｋＰａの　ミリボア［Ｆ］抗菌フィルタを濾過して滅菌する。次に溶液を加熱により不活性化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む完全ＲＰＭＩ−１６４０培地に加える。

Ａ）　ＰＢＬ−法サイトカインの誘導健康な献血者からの軟層（バフィーコート）は地区の輸血センターから入手できる。或いは、ヘパリンを加えた健康な献血者の静脈の血液から、フィコール・ハイバック（Ｆｌｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ＠　）又はヒストバックく旧５ｔｏｐａｑｕｅ　＠　）密度勾配遠心分離＜ｇ　＝　１．０７７）により末梢血液白血球（ＰＢＬ）を分離し、続いて細胞を２回洗浄する。赤血球はカンチル等の塩化アンモニウム処理（Ｃａｎｃｅｌｌ、　Ｋ、、　Ｈｌｒｖｏｎｅｎ。

Ｓ、、　Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ、　Ｈ，１，：　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐａｒｔｉａｌ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＨｕｍａｎ　ＩＩＩＩａｕｎｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　（ヒト免疫インターフェロンの生産と部分的精製）、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　ｌｐ、　５４．１９８８）により溶解した。１人の献血者からの約８　Ｘ　１０＠個／ｒｎｌの濃度の白血球を、１０ｘのウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン、抗生物質を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地に加えて使用した。ＦＢＳの全てのロットは予め試験して、非マイトジェンＦＢＳのみをＰ肛培養に使用した。サイトカイン誘導物質を培養液の２００〜１０００μ！容積に加えた。対照標準のサイトカイン誘導物質は植物凝集素（ＰＨＡ）　（スエーデンのＰｈａｒｇ＋ａｃｌａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｓｌ−ｃａｌｓ社又は米国のＳ１ｇ＠ｉ社）であった。誘導したＰＢＬ培養液を５％のＣＯりを含む空気中で３７℃で２０時間インキュベートしてから遠心した。上清を４ ℃で保存し、１週間以内にＩＦＮ−活性を検定した。ＴＮＦ−活性測定用の上清は、タンパク質分解による不活性化を避けるため一９０℃又は液体窒素中で保存する必要がある。

インターフェロン検定Ａ３４９の集密的細胞単層をマイクロプレートの中の、１（１％　ＦＢｉＳ、　Ｌ−グルタミン及び抗生物質（ペニシリン１００単位／−とストレプトマイシン１００μｇ／Ｊ）を加えたダルベツコ変法最少必須培地（ＤＭＥ＆ｌ）の中で調製した。プレート中で希釈したＩＦＮを細胞単層に加えて５％のＣＯ３を含む空気中で３７℃で２０時間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、髄膜炎ウィルス（ＥＭＣＶ）を注入した。４８時間のインキュベート後にウィルスの細胞変性効果を５０％減少するＩＦＮの希釈度をＩＦＮの力価と定義した。ＥＬ　Ｉ　ＳＡスキャナ中の細胞死滅を測定するためのＭＭＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）法（Ｈａｎｓｅｎ、　Ｍ、Ｂ、’、　Ｎ１ｅｌｓｅｎ、　Ｓ、Ｅ、。

Ｂｅｒｇ、Ｋ、：　Ｒｅ−ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｆｕｒｔｈｅｒ　ＤｅｖｅｌｏｐｓｉｅｎＬ　ｏｆ　ａ　Ｐｒｅ−ｃｉｓｅ　ａｎｄ　Ｒａｐｉｄ　Ｄｙｅ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ／Ｃｅ１ｌＫｉｌ＋　（細胞生育／細胞死滅測定用の正確且つ迅速な染色法の再検討と開発）　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　１９８９．　Ｌｕ、　２０３−２１０）も使用した。

ＩＦＮの実験用標準物質としては全ての検定用例えば組換えヒトＩＦＮ−γ（比活性２Ｘ１０＠単位／ｍｇ）、ナチュラルヒト白血球ＩＦＮ−ａ　（３ｘ　１０＠１０／ｍ／）及びＩＦＮ−７（２ｘ　１０“ＩＵ／ｍりが含まれるべきである。

ＴＮＦ検定ＴＮＦの細胞障害活性をＦｌｉｃｋとＧｉｆｆｏｒｄ　（Ｆｌｉｃｋ、　Ｄ、Ａ、、　Ｇｌｆｆｏｒｄ。

Ｇ、Ｅ、　：　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｉｎ　ＶＩＬｒｏ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　Ａｓ５ａｙｓ　ｆｏｒ　ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＴＮＦ用ｉｎ　ｖｌｔｒｏ細胞障害検定法の比較）　Ｊ　Ｉｍ−ａｕｎｏｌ、　Ｍｅｓｈ、　６８．１６６７、１９８４）によりり０３．細胞中で測定した。

サンプルとアクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍ／）溶液を細胞の単層培養に加えた。３７°Ｃで２０時間インキュベート後、ＴＮＦの細胞障害効果を培養の顕微鏡観察又はＭＴＴ−法で測定した。細胞培養の約５０％の死滅を引き起こす量をＴＮＦ−活性の１単位と定義した。ＴＮＦ−αの標品（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、、　ＵＳＡ）と比較した結果本検定の１単位は１００〜２００ｐｇ／−のＴＮＦに相当することが判明した。

サイトカイン中和検定試験した標品で処理したＰＢＬが生産したサイトカインは特殊の抗体との中和検定により同定できる（Ｉｎｇｌｏｔ等、Ｏｒｇａｎｏｓｅｌｅｎｌｄｅｓ　ａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｉａ＋ｍｕｎｏｓｔｌａ＋ｕｌａｎｔｓ　ａｎｄ　１ｎｄｕｃｅｒｓ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｇａｍａ＋ａａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｃｙｔｏｋｌｎｅｓ　Ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｃｌ　Ｉｅｕｋｏｃｙｔｅｓ　（免疫刺激物質として又ヒト末梢血液白血球中でのインターフェロンアン化物）　、Ｅｘｐｅｒｌｅｎｔｌａ　１９９０．１４ｆ）− 、３０８−３１１）。更に同定されたサイトカインの免疫活性を測定するための種々のＥＬＩＳＡ−キットが利用できる。

注釈培養したリンパ系細胞から得られた上清の中にはＴＮＦ又はＩＦＮ以外のサイトカインも存在することがあり、これらは他の標準方法、例えばインターロイキン（ＩＬ−１−１０）、　ＧＭ−Ｃ８Ｆ、　ＴＧＦ−βなどで同定される。

Ｂ）　ＲＰＣ−法：サイトカインの誘導マウスの常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）は、約６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをエーテルで殺し、腹腔に常温で完全ＲＰＭＩ− １６４０培地５−を注入して採取する。ＲＰＣを含む洗浄水を水冷した５０〃ｌの遠心用試験管に集める。ＲＰＣの洗浄も遠心も行わない。細胞をＢｔｌｒｋｅｒの血球計数板で数えてから１〜１．５　ＸＩＯ’細胞／ｄの濃度に懸濁する。

この細胞濃度は標品の種々の濃度（０，１〜５００μｇ／＋ｄ）の効果を測定する全ての検定に必要である。全ての試験には正と負の対照試験が含まれる。負の対照試験は、誘導物質なしで完全ＲＰＭＩ−１６４０培地でインキュベートしたＲＰＣによるＴＮＦ又はＩＦＮの自発的放出を測定し、一方正の対照試験は標準リボ多糖誘導物質（大腸菌０５５　：８５からのＬＰＳ。

Ｓｉｇ＋ｓａ　１−１０μｇ／Ｊ）の効果を示す。全ての培養液を２６℃で２０時間インキュベートし、次に培養液を１００Ｏｒｐｍで１０分間遠心して上清を集める。自動ピペットを使用して上清をｌ：２乃至１：２５６に希釈する。

サイトカインのバイオアッセイＲＰＣ培養からの上清中のＴＮＦ活性の測定には、Ｌｓｔｓ細胞培養の２０時間経過した単層を用いる。

完全培地１００μ！中にウェル当たり２Ｘ１０’個のマウス繊維芽様細胞し９２．を、ウェル９６個の平底プレート中に植え付け、単層が得られるように３７℃ で２０時間インキュベートする。

上清の移送は極めて正確を要する。Ｌ、□培養を５ｘのＣ（ｂを含む空気中で３７℃で２４時間インキュベートする。

評価ｌ）倒立顕微鏡での細胞障害効果の観察２）　ＭＭＴ−試験（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、ＳＩｇｓ＋ａ）Ｌｕｌｌ細胞培養による細胞死滅の測定には、濃度５　ｍｇ／ｒｎｌの關Ｔ−染料溶液２５μｌをマイクロプレートの各ウェルに加える。

次にプレートを５％のＣＯ３を含む空気中で３７℃で２時間インキュベートする。

続いて、ジメチルホルムアミド４５　Ｊ、ＳＯ５（ドデシル硫酸ナトリウム）　１３．５　ｇ、蒸留水５５　ｍ／を含む溶剤溶液１００μｌを各ウェルに加える。

ＣＯ，インキュベーター中で３７℃で１２時間インキュベートしてからＭＭＴ− カラーテストの結果をＭｕｌｔｌｓｋａｎ　３４０／ＣＣ読取り器（Ｌｘｂｓｙ −ｓｔｅｍ）により５７０　ｒ＋＋ａフィルタを用いて読む。対照組換えＴＮＦ −αを使用する必要がある。

インターフェロンのバイオアッセイマウスの髄膜炎ウィルス（マウスＬ。、細胞中のＥＭｃｖ、　’ｌ準として米国メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈからの標準Ｍｕ　ＩＦＮα／βも含まれる）による細胞変性効果の阻害によりＩＦＮを検定する。細胞変性効果を倒立顕微鏡により観察し、又下記のようにＭＩＪＴ−法により測定する。

Ｂｅｒｇ等のＭＭＴ−法Ｂｅｒｇ、Ｋ、、Ｈａｎｓｅｎ、Ｍ、Ｂ、、Ｎ１ｅｉｓｅｎ、Ｓ、Ｅ、（１９９０）：　Ａ　ｎｃｖ　５ｅｎｓｌ−ｔｌｖｅ　ｂｉｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｐｒｅｃｉｓｅ　ｑｕａｎｔｌｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｃｔｌ−ｖｌｔｙ　ａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｖｌａ　ｔｈｅ　ｍ１ｔｏｃｈｏｎｄｒＬａｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｆｕｎｅ−ｔｌｏｎ　Ｉｎ　ｃｅｌｌｓ　（ＭＴＴ−ｍｅｔｈｏｄ）　（細胞中のミトコンドリア脱水素酵素を介して測定されたインターフェロン活性を正確に定量するための新しい敏感なバイオアッセイ、ＭＭＴ−法）　ＡＰＭＩＳ、　９８．１５６−１６２　。

ＭＭＴ　（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド、Ｓｉｇｍａ）をＰＢＳ緩衝液で５　ＢＥ／ｍｌの濃度に希釈する。Ｌｅｔｓ培養液による細胞死滅を測定するために、５　ｗ＋ｇ／ｙｄの濃度のＭＴＴ−染料溶液２５μｌをマイクロプレートの各ウェルに加える。これにはＴＮＦ又は［ＦＨの対照試験サンプルも含まれる。次にプレートを５％のＣＯｔを含む空気中で３７℃で２時間インキュベートする。続いて、ジメチルホルムアミド４５　Ｊ、ＳＯ８（ドデシル硫酸ナトリウム）　１３．５　ｇ、蒸留水５５−を含む溶剤溶液１００μｌを各ウェルに加える。３７℃で一晩インキユベートした後で、マイクロプレート読取り器５ｔａｒｔ　Ｆａｘ　Ａｗｉｒｅｏｅｓｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ　Ｉｎｃ、　２１００を用い、抽出緩衝液をブランクとして使用して５７０ｎ−の光学密度を測定する。

ＴＮＦ−ａ、　ＴＮＦ−β及びその他のサイトカインは市販のＥＬＩＳＡ−キットによっても検定できる。

本発明の方法を実施するための組成物は実質的に、２回処理した組織培養水、培養基、培養基を補完する血清、並びにヒｌ−ＦＩＢＬ又はマウスＲＰＣを含むことを特徴とする。

本発明のＰＢＬ−法に使用する診断用キット（サイトカイン誘導キット）（ＩＯ〜２０の手動検定用）は次の項目を備える。

１）　２回処理した組織培養水１０〇−２）旧５ｔｏｐａｑｕｅ　＠　又はＦｌｃｏｌｌ−）１ｙｐａｑｕｅ＠（密度勾配培地）　１００　ｒｎ１３）　ＲＰＭｒ−１６４０培地２Ｘ１００　ｍ／　（重炭酸ナトリウムとＬ−グルタミン添加、滅菌濾過、内毒素試験済）４）　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）　２０　ｉ、内毒素とヘモグロビン低濃度５）　インゲンマメ　（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｌｓ）由来のレクチン０．５ｍｇ（植物凝集素−Ｐ）ＩＡ−Ｐ）６）　蓋付き丸底試験管、ポリプロピレン製、組織培養用に滅菌済、１７Ｘ１００ｍｓ、容量１４−１２５個入り包装７）　蓋付き組織培養用プレート２個、９６個のウェル、平底、滅菌済試薬は米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅａ＋１ｃａｌ　Ｃｏ、又は他の会社より入手できる。

このようなキットは、ＲＰＣ細胞により得られた結果を確かめる所謂２次相スクリーニングシステムにも、又場合によってはげっ肉類中では免疫モジュレータ− として不活性ないくつかの物質例えば有機セレン化合物用の直接スクリーニングシステムにも使用することができる。

本発明のＲＰＣ−法に使用する診断用キット（サイトカイン誘導キット）（１０〜２０の手動検定用）は次の項目を備える。

１）　２回処理した組織培養水１０〇−２）　ＲＰＭＩ−１６４０培地２Ｘ１００　Ｊ　（重炭酸ナトリウムとＬ−グルタミン添加、滅菌濾過、内毒素試験済）３）　ウシ胎児血？！１　（ＦＢＳ）　２０　Ｊ、内毒素とヘモグロビン低濃度４）　大腸菌０１２７：Ｂ８由来のリボ多糖（ＬＰＳ）　０．５　Ｂ５）蓋付き丸底試験管、滅菌済、２５個入り包装、ポリプロピレン製組織培養用、１２Ｘ７５　ａｔｅ、容量６−１７）蓋付き組織培養用プレート５個、９６個のウェル、平底、滅菌済試薬は米国ミズーリ州セントルイスのＳ１ｇ■ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、又は他の会社より入手できる。

結果の増幅を含む本発明の方法を実施するための、特に微量試験に適した組成物は実質的に、一方ではＰ肛−培養又はＲＰＣ−培養を含み他方では非ステロイド系抗炎症薬、好ましくはエブセレンのような有機セレン化合物、インドメタシン又は化合物ＩＴＣＬ及びこれらの化合物の誘導体、類似体、同族体及び代謝物のグループから選ばれた物質、特にインドメタシンを含むことを特徴とする。

次に実施例により本発明を説明する。但しこれらの実施例は本発明の範囲を決して限定するものではない。

実施例１：３６匹の雌の７−８週齢のＢＡＩ、Ｂ／ｃマウスをエーテルで殺し、腹腔に１０％の加熱不活性化したコウシ血清を加えたイーグルの最少必須培地（四εＭ）　５−を注入して、個々のＲＰＣ−溶液を採取した。個々のマウスからの洗浄水は１−２　Ｘ　１０’個／−の細胞を含んでいた。各マウスからの細胞懸濁液を二つのサンプルに分けて二つの試験管に移した。一つのサンプルを１００μｇ　ＴＴＰ／ｍ／で処理し、もう一つのサンプルはサイトカインの自発的放出を観察する負の対照試験に用いた。

全ての培養液を２６℃で２０時間インキュベートしてから１０００　ｒｐｍで１０分間遠心した。上溝を集め、マウスＬ、１．細胞中のＥＭＣＶ　（髄膜炎ウィルス）による細胞変性効果を阻害する微量方法を用いたバイオアッセイによりＩＦＮ−β活性を検定した。いずれの検定にも、米国ＢｅｔｈｅｓｄａのＮ１１ｌ　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）からの国際標準標品Ｍｕ　ＩＦＮ　Ｇ００２−９０４−５１１に対して検定した実験用標準物質が含まれていた。細胞変性効果はＢｅｒｇ等のＭＴＴ−法（ＡＰＭ［Ｓ、　９８．１５６−１６２）により測定した。その結果は次の通りであった。対照試験ではＩＦＮ−βレベルは１〜８Ｕ／ｒｎ１１平均２　Ｕ／−未満であったが、ＴＴＰで処理したサンプルの場合にはＩＦＮ−βレベルが４〜１２７　Ｕ／ｍ／、平均１６　Ｕ／ｍ／であった。この結果を付図１に示す（ＴＴＰ−処理と未処理のＲＰＣにより生産されたＩＦＮ−βの比較。１：検出限界、２：中央値。中央値の有意差検定（メジアンテスト）に於ける差がないとする確率Ｐ・ｏ、　ｏｏｏｏ。各点は個々のマウスから分離したＩｆＰＣ中のＩＦＮのレベルを示す）。

実施例２ニア匹のマウスのグループにより実施例１の方法を繰り返した。但し個々のマウスの各ＲＰＣ懸濁液を二つのサンプルに分ける代わりに一つの懸濁液だけを四つのサンプルに分けて、４個の試験管（各ｌｒｎりに移した。サンプルの一つは負の対照試験用とし、残りの三つはＴＴＰ−用量とＩＦＮ−βの放出との関係を測定するために、それぞれ１００、１０．及びＩａｒＴＴＰ／−で処理した。２６℃ で２４時間インキュベートしてから試験管を遠心した。集めて上清中のＩＦＮ− βを実施例１に記載のように測定した。その結果を付図２に示す（ＩＦＮ−生産とＴＴＰ−濃度との関係）。各曲線はそれぞれのマウスがら得られたＲＰＣ懸濁液の結果を示す。

実施例３：実施例１の方法に従って、ＩＦＮ−βの代わりにＴＮＦ−αを測定した。

１００８ｇ　ＴＴＰ／ｄによる処理及び未処理のＲＰＣ−培養からの上溝を用いてバイオアッセイのＴＮＦ−活性を検定した。マウス繊維芽様り、、。

細胞（完全ＥＭＥＭ　１００ＩＩＩ！中にウェル当たり４ＸｌＯ’個の細胞）をウェル９６個の平底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、　Ｌｌｎｂｒｏ、　Ｆｌｏｗ）中に植え付けて５ｘのＣｏｔを含む空気中で３７℃で４時間インキュベートした。

追加したプレートの中でサンプルをアクチノマイシンを含むＥＭＥＭで希釈去し、マルチヂャネルピペットを用いて調製した希釈液をこの培養に移した。３７℃ で２０時間インキュベート後、前述のＭＴＴ−法により細胞死滅に対してこの培養の検定を行った。その結果は次の通りであった。負の対照試験ではＴＮＦ−α レベルは１〜２５６　Ｕ／−の範囲内で平均８　Ｕ／−であった。ＴＴＰで処理したサンプルの場合にはＴＮＦ−αレベルは同じく　２〜２５６　Ｕ／−であったが、平均は６４　Ｕ／ｍｌであった。

この結果を付図３に示す（ＴＴＰ−処理と未処理のＲＰＣにより生産されたＴＮＦ−αの比較。１：検出限界、２：中央値。中央値の有意差検定に於ける差がないとする確率　Ｐ＝０．００３０．各点は個々のマウスから分離したＲＰＣ中のＴＮＦのレベルを示す）。

実施例４：試験方法は実施例２の方法に準じたが、ＩＦＮ−βの代わりにＴＮＦ−αの測定を実施例３と略同様に実施した。

得られた結果を付図４　（ＴＮＦ−生産とＴＴＰ−濃度との関係）に示す。

実施例５：Ａ、　生物学的材料。検定には、プレスラウ地区輸血センターから得られた、健康な献血者の１１５以上の軟層を使用した。献血者の特性を表１に示す。

表１：ＰＢＬ源として使用した血液供与者の特性年齢　数、男性　女性　採血数回　−回合計　１１５　１１０　５　１０９　６献血者の多くは若い男性で数回の採血を受けた。個々の献血者からのＰＢＬの応答にはかなりの相違が認められた。これを次頁の表２に示す。

表２　種々のＴＴＰバッチ又は標準の誘導物質により刺激された個々の献血者のＰＢｔ、のＩＦＮ−及びＴＮＦ一応答表２の示すように、ＩＦＮ−生産に於いてＰＢＬ−培養の１０〜３０％がＴＴＰ１００μｇ／−の用量に対して反応を示さなかったが、ＰＨＡの用量１０μｇ／−では反応しなか７たのは僅か７％　、　ＬＰＳの用量１０μｇ／ｍｌではこれが２０％であった。ＴＮＦ−生産ではＬＰＳの同じ用量に対して５０Ｘが反応しなかった。この種のデータは生物学的材料を正しく選定するために必要である。応答しないＰＢＬ−培養は負の対照試験（サイトカインの未処理の自発的放出）と正の対照試験（標準の誘導物質、例えばＰＨＡ又はＬＰＧによる処理）との評価により検出される。

状態調節した培地は検定迄４℃で保管した。

健康な献血者からのヒト末梢血液白血球（８Ｘ１０＠細胞／ｄ）を使用した。

Ｂ、　実施した実験表３に示した番号の種々の生産バッチから採取したビート抽出物サンプルを上述のＰＢＬ−試験法により試験した。実験では、インターフェロン（ＩＦＮ＞と腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）とを定量的に測定し、上述の標準方法により国際活性単位により表したサンプルの活性を測定した。実験を表３に記載の回数繰り返した。

同表には結果の範囲と中央値も示しである。

例証のために、標準化したビート標品を用いて同様な試験を行った。３０μｇ／ｄの濃度ではインターフェロン活性は３０〜３００国際活性単位の範囲にあったが、ｌＯＯμｇ／−の濃度ではこれが３００〜１０００国際活性単位の範囲であった。

中間の濃度では用量と応答の間に直線関係が認められた。

表３　国際活性単位で表示した、ビート抽出物の種々のバッチの１００μｇ／− によるＩＦＮ−又はＴＮＦ−誘導上述の例で試験した免疫活性のピート抽出物はＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９２１００４９１に記載の製品である。

表３のデータから結果の評価にはＰＢＬ−培養に於いて負と正の対照試験が必要なことが明らかである。

その他の実験から、応答しなかったＰＢＬ−培養を考慮外さし、数多くの実験を統計的に評価すれば、本発明による試験の効果には疑問の余地のないことが判明する。

表４　ヒトＰＢＬによるＩＦＮ−及びＴＮＦ−生産に及ぼすＴＴＰの種々のバッチの影響２年以上の間に１）バイオアッセイによりその活性を測定した薬剤の標準市販バッチ、２）マウスで測定した生物学的活性が設定した標準を下回るため生産者により除外されたバッチ、及び３）小規模で生産した試験的ビート抽出物とを含む２０バッチ以上のＴＴＰに就いて、そのサイトカイン誘導活性を試験した。得られた結果を、誘導されたＩＦＮ及びＴＮＦの平均レベルと計算した標準偏差及び統計的有意差（ＳＤ）の形で表４に示す。

平均値はＩＦＮ又はＴＮＦ滴定の全ての結果から算出した。非応答の場合はゼロとした。

添字トＣはｒ無処理Ｊ　（サイトカインの自発的生産）からの差が有意でない確率を示し、ａ：　ｐ＜０．０５．　ｂ：　ｐ＜０．０１．　ｃ：　ｐ＜０．００１である。

表４に示した結果に相当する中央値を表５に、又ＩＦＮ−及びＴＮＦ−生産に及ぼすＴＴＰの影響を示す選定したデータをそれぞれ図５、図６に図示した。

中央値はＩＦＮ又はＴＮＦ滴定の全ての結果から算出した。

誘導されたサイトカインの同定はＴＴＰにより誘導されたＩＦＮ及びＴＮＦの中和により実施した。

表５　ヒトＰＢＬによるＩＦＮ−及びＴＮＦ−生産に及ぼすＴＴＰの種々のバッチの影響実験の上述の結果を図５、図６により説明する。

ヒｌ−ＰＢＬによるＩＦＮ−生産に及ぼすＴＴ［’の種々のバッチの影響（図５）。ＴＴＰの七つの異なるバッチを用いた。図の各点は個々の健康な献血者のＰＢ［、を表す。ＩＦＮ〜活性は抗ウイルス性単位に関する。斜線は有意でないデータの限界を示し、水平の線は平均値である。

ＴＴＰの３０及び１００μｇ）−によるＩＦＮの誘導は統計学的に有意である　（ｐ＜０．０５）　。

ヒトＰＢＬによるＴＮＦ−生産に及ぼすＴＴＰの種々のバッチの影響（図６）。

ＴＮＦ−活性はマウスＬ、８．細胞に対する細胞障害の単位で表した。ＴＴＰの３０．１ｏｏ及び２００μｇ／ｌｒｉに対する応答は有意である（ｐ＜０．０５）。

実験には、ＴＴＰの３種の異なるバッチで２０時間処理したＰＢＬ−培養液の上清の抗ウイルス性活性を中和するために、ボテントボリクローナル抗血清、即ち抗ナチュラルＩＦＮ−α、抗リンパ芽球（Ｎａｍａｌｗａ）ＩＦＮ−α及び抗ナチュラルＩＦＮ−γを使用した。付図７　（ポリクローナル抗ＪＦＮ−血清によるＩＦＮの中和の結果）に示すように、個々の献血者からのＰＢＬにより生産されたＩＦＮのα型とγ型にはかなりの相違が見られる。これは、各ＰＢＬ−供与者の放出したＩＦＮの型が供与者特有の性質であることを示唆している。

ボテントボリクローナルウサギ抗ＴＮＦ−α血清（Ｇｅｎｘｙｍｅ　Ｉｎｃ、社）を用いて実施した中和検定により、ＴＴＰにより誘導されたＴＮＦは主としてＴＮＦのα型であることが判明した。この点はウサギポリクローナル抗ＴＮＦ− β血清（Ｇｅｎｘｙｍｅ　Ｉｎｃ、社）を用いて行った同様の中和に於いてこの血清がＴＴＰにより誘導されたＴＮＦ−活性を中和しなかったことからも確認された。

付図７はポリクローナル抗ＩＦＮ−血清によるＩＦＮの中和の結果を示す。ＴＴＰによりインキュベートしたＰＢＬ−培養（ＴＴＰの３種の異なるバッチと７種の異なるＰＢＬを使用）からの培地を含むＩＦＮを図に記載の抗ＩＦＮ−血清により処理した。ｌ：未処理の標品、２：抗ＨｕｌＦＮ−αによる処理、３：抗１１ｕｌＦＮ−Ｌｙによる処理、４：抗ＨｕｌＦＮ−γによる処理。

実施例６：本発明による増殖物質、即ちインドメタシンの存在下の増幅効果を示すために、実施例５の方法を実施した。

各ＰＢＬ−培養を数個のサンプルに分け、その一つはサイトカインの自発的放出を示す負の対照試験、もう一つは下記の性質の標準ボテントサイトキン誘導物質による正の対照試験とし、残りを１〜１００μｇ／−のバッチ番号０１０３９１又は０２０３９１のＴＴＰ、更に表６ｂと６０に記載のＴＴＰ　Ｉ及びＴＴＰ　Ｉ［，５μｇ／−のインドメタシン＋同じバッチのＴＴＰ（表６ａ）、又は１０ｕｇ／−の化合物ＩＴＣＬ＋同じバッチのＴＴＰ　（表６ｂ）、又は１０又は２ｏｔｔｇ／ｍｌの前述の有機セレン化合物（１）、（２）又は（３）十同じバッチのＴＴＰ　（表６ｃ）で処理した。インキュベートした培養の上清中のＩＦＮとＴＮＦとを測定した。

結果を表６ａ、　６ｂ、　６ｃに示す。

１超：　インドメタシンの存在によるサイトカイン誘導の増幅効果ａ）　ＰＢＬをＦ　ｌｃｏ　ｌ　１Ｊｌｙｐａｑｕｅ分離技術によりヘパリンを添加した新鮮な血液より調製した。ＰＢｌ、−培養は７　Ｘ　１０’個／−の細胞を含んでいた。

ｂ）　ＰＢＬを地区の輸血センターから入手した軟層より調製した。細胞をＣａｎ１ｅｌ１等の方法（Ｍｅ　ｔｈ、εｎｚｙｍｏ１．１９８１．７８．２９−３８）により処理した。

ＰＢＬ−培養はｓ　ｘ　ｉｏ’個／−の細胞を含んでいた。

表聾：配合物ＩＴＣＬの存在によるサイトカイン誘導の増幅効果Ｉ！ｆｉ！、：　有機セレン化合物の存在によるサイトカイン誘導の増幅効果ＰＢＬ−培養は８　Ｘ　１０’個／ｍｌの細胞を含んでいた。ＴＴＰは少量生産したビート標品である。ＴＮＦ一応答が比較的低いのは、恐らく培養液を調製する前に軟層を４℃ で２０時間保存したためと思われる。有機セレン化合物はＴＴＰと同様サイトヵインの誘導物質である。

実施例７：ＴＴＰを市販の錠剤の形で毎日５　ｒａｇの用量経口投与した場合の、サイトカインのＴＴＰ誘導の追加用量に対するＩｎ　ｖｌｔｒｏ培養液中のＦＢＩ、の応答に及ぼす影響を示す診断学的試験を実施した。次にこの試験に就いて詳述する。

試験は年齢４３〜５８歳の健康な４人の女性有志者に就いて実施し、ＴＴＰ錠剤を毎日５　ｒａｇの用量経口投与し、投与前、投与中及び投与後に毎週２０−の血液を尺骨の静脈から採取した。投与は次の二つの異なる計画により実施した。

有志者の２人（以下Ｂ、に、及びＪ、　Ｚ、　Ｊ、と称する）は、１週間毎日５　Ｈの錠剤１個の経口投与の３回のサイクルによるＴＴＰの処理を受け、各週の間にそれぞれ１週間の投与中止期間を置いた（第１週投与、第２週休止、第３週投与、第４週休止、第５週投与）。全体の用量は２１錠であった。他の二人（以下Ａ、　Ｄ、　１．　及びＷ、Ｆ、と称する）には毎日５　ｍｇの錠剤１個を連続３週間投与し、その後に２週間の休止期間を置いた。全体の用量は２１錠であった。この処理を繰り返した。

使用した５　ｍｇのＴＴＰ−錠剤はボーランド、ブレスラウのＴＯＲＦＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ　Ｐｈａｒｎａｃｅｕｔｌｃａｌ　Ｆａｃｔｏｒｙの標準商品であった。各錠剤はＴＴＰ　５　ａａｇ　、ラクトース４３　ｍｇ、　ＭＹＶＡＴＥＸ　２　ｍｇを含んでいた。１ｎｖｉｔｒｏ培養液中のＦＢＩ、にサイトカインを誘導するには、粉末状ＴＴＰを純粋物質として原液の形で使用し、発熱物質を含まない再度蒸留した水にこの粉末を２０　ｍｇＴＴＰ／Ｊの濃度に溶解した原液を４℃で保存した。

有志者から採取した血液サンプルは保存料なしでヘパリンＰＯＬＥＡを加えて最終濃度１０単位／−として、前述のようにＩｎ　ｖｉｔｒｏ培養液中のＰＢＬを調製し、これを前例に記載したようにＰＨＡ、　ＬＰＳ及びＴＴＰで処理した。

培養液２００　ｕ　ｇを各処理に使用した。自発的タンパク質分解による不活性化を避けるために、上清を４℃で保存して１週間以内にＩＦＨの検定に供し、又 −２０℃で保存してＴＮＦを検定した。

ＩＦＮとＴＮＦの検定は前述のように実施した。得られた結果を付図８〜１３に示す（ＴＴＰの経口投与の間でのＩＦＮ−誘導物質及びＴＮＦ−誘導物質に対する、種々の患者のＰＢＬ−培養の応答）。

有志者の第一のグループの投与サイクル中のＩＦＮ一応答を示す図８及び９のデータから察知されるように、応答は減少するが２週間の中止後に元の値に回復する。一方ＴＮＦ一応答は図１０と１１に示すようにＴＴＰの投与中は増加し、２週間の中止後に元の値まで低下する。

図１２と１３は有志者Ａ、　Ｄ、　１．への別の投与方法の場合のサイトカイン誘導に対する応答を表した図であるが、ＴＴＰの連続投与３週間後にＴＦＮ−誘導に対する低反応性状態に達することが判る。ＴＴＰ−溶液によるＩＦＮ−誘導に対するＰＢＬ−培養の応答活性の減少を示すこの低反応性は２週間の休止後消滅する。反対に３週間のＴＴＰの投与の間ＴＮＦ−誘導に対する低反応性は現れなかった（図１２）。

以上の結果は、免疫モジュレータ−をサイトカイン誘導物質として使用する場合の最適の用量を、本発明の簡単なＰＢＬ試験により各患者毎に別々に定めることができることを示している。

培地ＰＨＡ１０　ＬＰｓｌｏ　ＴｒＰｌｏｏ　ＴＴＰｌｏ　ＴｒｐＨ地ＰＩ−ｔＡｌｏ　ＬＰＳＩＱ　Ｔ！ア１（Ｘ）　ＴＴＰｌｏ　°ロア１ｍ１ｌｋ　ＰＨＡｌｏ　ＬＰＳｌｏ　−口’Ｐ１００　ＴＴＰｌｏ　°ｎア１補正書の翻訳文提出書く特許法第１８４条の８）平成　６年　４月２６日

Claims

【特許請求の範囲】

１．バイオ活性を有し、サイトカインを誘導する免疫調節物質の免疫学的活性を決定する方法に於いて、ヒト末梢血液白血球（ＰＢＬ）の培養液又はＢＡＬＢ／ｃマウス常在性腹腔細胞（ＲＰＣ）の懸濁液を、試験しようとする物質の溶液でサイトカインの生産を誘導するために処理してから、このサイトカインを標準の同定方法で測定することを特徴とする前記方法。
２．ヒトのＰＢＬ−培養液を使用し、その中に種々のサイトカインを誘導し、次に個々のサイトカインを認識する一組の種々の−好ましくは既知の−血清を使用して、誘導されたサイトカインの各々を定性的且つ定量的に決定することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．ヒトのＰＢＬ−培養液を組織培養に適した栄養培地を用いて調製し且つ直ちに使用可能のＰＢＬ−培養液の濃度が約８×１０６白血球／ｍｌであることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
４．試験しようとする前記溶液の濃度が０．１〜２００μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか１項記載の方法。
５．前記サイトカインのタンパク質分解を避けるため各サイトカインを可及的速やかに同定することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか１項記載の方法。
６．ＰＢＬ−培養液又はＲＰＣ−懸濁液を使用し、且つ前記バイオ活性物質がインターフェロンと腫瘍壊死因子との生産を誘導することを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
７．前記ＲＰＣ−懸濁液が約１〜２×１０６細胞／ｍｌを含むことを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
８．試験すべき前記溶液を、コウシ胎児血清１０％を添加したイーグル又はＲＰＭＩ−１６４０栄養培地の中で調製することを特徴とする請求の範囲第６項又は第７項記載の方法。
９．得られた結果を検量線に対して評価することを特徴とする前記請求の範囲のいずれか１項記載の方法。
１０．ピート抽出物、例えばＴＴＰを試験することを特徴とする前記請求の範囲のいずれか１項記載の方法。
１１．前記ＰＢＬ−法の場合に於いて、非ステロイド系抗炎症薬、好ましくは化合物ＩＴＣＬ及び有機セレン化合物（１−３）、又特に好ましくはインドメタシンを試験しようとする溶液に混合することにより、結果の増幅を達成することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第６項、第８項、第９項又は第１０項のいずれか１項記載の方法。
１２．サイトカインを誘導する免疫調節物質を使用する治療に対するヒト個人の免疫学的応答を測定する方法に於いて、そのような免疫調節物質で処理したヒト個人の末梢血液白血球（ＰＢＬ）の培養液を定められた時間間隔を置いて、サイトカインの生産を誘導するために投与する物質の溶液によって処理し、次にこの誘導されたサイトカインを標準の方法で測定し、前記物質の投与を継続した後の前記物質に対する低反応性の発生の時点と、ある期間投与を中止した後の前記物質の追加投与に対する応答活性の回復の時点とを測定するようにしたことを特徴とする前記方法。
１３．前記時間間隔が約７〜１４日であることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．サイトカイン誘導する免疫調節物質としてピート抽出物を使用する治療の過程に於いて前記方法を適用することを特徴とする請求の範囲第１２項又は第１３項記載の方法。
１５．サイトカインを誘導する免疫調節物質としてＴＴＰを使用する治療の過程に於いて前記方法を適用することを特徴とする請求の範囲第１２項、第１３項又は第１４項記載の方法。
１６．請求の範囲第１項乃至第１５項のいずれか１項記載の方法により必ず使用され、試験され又は測定されるＴＴＰ。
１７．請求の範囲第１項乃至第１５項のいずれか１項記載の方法を実施するための組成物に於いて、これが一方ではＰＢＬ−培養液又はＲＰＣ−懸濁液、他方では非ステロイド系抗炎症薬、特にインドメタシンを含有することを特徴とする前記組成物。