RO114837B1 - Metoda pentru determinarea activitatii imunologice a substantelor care induc citokina, a raspunsului imunologic in tratamentul cu substanta care induce citokina, si compozitie pentru aplicarea metodei - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă pentru determinarea activității imunologice a substanțelor care induc citokina, a răspunsului imunologic în tratamentul cu substanța care induce citokina precum și la compoziții pentru aplicarea metodei; fiind utile în medicina umană în urmărirea deficiențelor imunlogice și bolilor aferente.

Este cunoscut că citokinele, cum ar fi interferonii (IFN) și factorii de necroză tumorală (TNF) sunt proteine asemănătoare hormonilor care joacă un rol important, practic în toate reacțiile imunologice, ca și în procesul de reglare responsabil de întreținerea homeostazei. Producerea unor astfel de citokine poate fi indusă de anumite substanțe care prezintă o activitate bioactivă și activitate imunologică-modulatoare. Există, desigur, o importantă nevoie pentru determinarea corectă și ușoară a activității imunulogice a unor astfel de substanțe bioactive.

Testele folosite până în prezent, pentru determinarea activității imunologice, sunt numeroase, dar dificil de determinat. Când se testează clinic o nouă compoziție terapeutică cu efect imunologic eficiența sa imunologică se evaluează prin monitorarea numeroaselor sale caracteristici determinalbile analitic, folosind metode standard. Odată activitatea dovedită, rezultă necesitatea unor teste singulare reprezentative care permit verificarea rapidă a stării pacientului în funcție de răspunsul său imunologic. In studiile clinice, evaluarea nivelelor serului IFN poate fi dificilă, imprecisă și eronată. Interferonii sunt produși adesea local în diferite țesuturi, cu durată scurtă de viață, acțiunea lor este paracrină (doar în imediata vecinătate) și sunt puternic legați de receptorii celuari și de proteinele purtătoare.

Este cunoscută o metodă pentru determinarea capacității de rezervă imunologică, necunoscută, a unui pacient prin stimularea leucocitelor din sânge periferic uman, cu un mitogen puternic cunoscut și în plus, cu un amplificator. Astfel, se prevede să se recolteze sânge perferic uman (PBL) de la pacienții supuși la imunoterapie, care deci pot avea o capacitate redusă de rezervă imunologică sau pot fi lipsiți de această capacitate. Se prevede modul cum se verifică un pacient în privința capacității de rezervă imunlogică; dacă această capacitate de rezervă se situează deasupra unui anumit nivel minim, atunci pacientul va primi tratament cu un mitogen și amplificator, dacă respectiva capacitate de rezervă nu se află deasupra unui anumit nivel minim, pacientul nu va primi un astfel de tratament.

In această metodă nu se arată nimic în legătură cu determinarea hiporeactivității la inducerea interferonului pentru a întrerupe administrarea medicamentului pe o perioadă de timp și a relua terapia imunomodulatoare după ce s-a verificat susceptibilitatea recăpătată a leucocitelor din sângele periferic (PBL) pentru inducere de citokină.

Metoda pentru determinarea activității imunologice a substanțelor care induc citokina în conformitate cu prezenta invenție cuprinde:

a) o cultură de celulă, cuprinzând leucocite din sânge periferic uman (PBL) obținută din donatori care nu au hiporeactivitate la inducerea interferonului, este preparată cu un mediu nutritiv nemitogenic favorabil pentru cultura de țesut preferabil conținând RPMI-1640 mediu, cu un adaos de 10% ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de circa 8 x 10⁶ leucocite/ml sau

b) o suspensie de celule rezidente peritoneal (RPC) de la șoarece BALB/c, care nu este stimulată imunologic sau care nu prezintă o producție spontană foarte ridicată de citokină, este preparată cu un mediu nutritiv nemitogenic favorabil pentru cultura de

RO 114837 Bl țesut, preferabil conținând RPMI-1640 mediu cu un adaos de 1 □% de ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de aproximativ 1-2x10¹⁰ celule/ml la care cultura celulei a) sau suspensia celulei b) este tratată cu o soluție din respectiva substanță, preferabil conținând un mediu nutritiv Eagle sau RPMI-1640 și 0,1 ... 200 pg din 50 respectiva substanță pe ml soluție pentru a induce avantajos după o perioadă de incubație de 12 la 24 ore, producerea de citokine care apoi sunt determinate în conformitate cu metodele de identificare din stadiul tehnicii, incluzând de preferință un control pozitiv și un control negativ. Citokinele determinate conțin interferon și factor de necroză tumorală, iar substanța este selecta tă din grupul constând din extract de turbă, 55 o fracțiune din extractul de turbă și un anumit produs derivat din turbă. Un amplificator sintetic nepeptidic este adăugat la respectiva soluție, acest amplificator fiind de preferință selectat din grupul constând dintr-un medicament nesteroidal, antiinflamator și inhibitor al sintezei postaglandinei un compus organic cu seleniu ca cel descris anterior, un derivat de isotiazol, și analogi, omologi și metaboliți ai acestora, și cel mai 60 preferabil fiind alt compus ITCL sau indometacin.

Metoda pentru detemrinarea răspunsului imunologic în tratamentul cu o substanță care induce citokină, în conformitate cu prezenta invenție, cuprinde:

a) pacientul este supus unui tratament repetat cu respectiva substanță;

b) cultura de leucocite din sângele periferic (PBL) este obținută de la acest 65 pacient;

c) o soluție dintr-o astfel de substanță este adăugată la această cultură (PBL) ca să inducă citokină conținând interferon și preferabi, factor de necroză tumorală.

d) citokinele sunt apoi determinate în conformitate cu metodele de identificare din stadiul tehnicii, pentru a recunoaște când apare hiporeactivitatea la inducerea 70 interferonului cu o doză suplimentară din această substanță și pentru a detemrina când pacientul recapătă capacitatea să răspundă la o altă doză de substanță după o perioadă de pauză.

Compoziția pentru aplicarea metodelor de mai sus, în conformitate cu prezenta invenție, conține cultură de celule de leucocite din sânge periferic uman (PBL) obținută 75 de la donatori care nu sunt hiporeactivi la inducerea interferonului, și un mediu nutritiv nemitogenic potrivit pentru cultura de celule tisulare, preferabil conținând RPMI-1640 mediu cu un adaos de 10% de ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de aproximativ 8 x 10⁶ leucocite sau conține o suspensie de celule rezidente peritoneal (RPC) care nu sunt stimulate imunologic sau care nu prezintă o producție spontană 8 o foarte ridicată de citokină și un mediu nutritiv nemitogenic favorabil pentru cultura de celule tisulare preferabil conținând RPMI-1640 mediu cu un adaos de 10% ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de aproximativ 1-2x10⁶ celule/ml. Compoziția mai poate conține un amplificator sintetic nepeptidic preferabil selectat din grupul constând dintr-un medicament nesteroidal antiimflamatoriu și inhibitor al sintezei 85 prostaglandinei și un compus organic cu seleniu, un derivat de isotiazol și analogi, omologi și metaboliți ai acestora și cel mai preferabil fiind alt compus ITCL sau indometacin.

Deci, metoda corespunzătoare prezentei invenții permite să se stabilească dacă o substanță testată este capabilă să inducă producerea diferitelor citokine și permite o 90 verificare rapidă și eficientă a proprietăților unor astfel de substanțe și anume activitatea

RO 114837 Bl lor imunologică la fiecare etapă de producere, separare, purificare și formulare în compoziții finale.

Este cunoscut că procesele tehnologice pentru preparare, purificare și/sau separarea substanțelor active imunologic, cum ar fi în particular extractele de turbă sunt, de regulă, procese în mai multe etape și există întotdeauna necesitatea de a stabili o încercare sigură și rapidă pentru un control riguros al producției. Mai mult, întrucât substanțele sunt de natură complexă ca și cazul extractelor de turbă, este important să se dispună de un test similar pentru determinarea activității fracțiilor individuale ale unor astfel de substanțe. A fost de asemenea necesar să se elaboreze o metodă de încercare la micronivel, deoarece produșii de analiză sunt foarte costisitori.

Următoarele patru constatări au permis să se soluționeze problemele de mai sus:1) unele extracte de turbă imunoactive induc producerea citokinelor, cum ar fi interferonii și factorii de necroză tumorală, în culturi in vitro a leucocitelor sângelui periferic, inducția fiind dependentă de doză; 2) interferonul ~P(și TNF - a) este produs în cantități semnificativ mai mari de celule peritoneale (RPC) ale șoarecilor BALB/c când au loc tratamente cu extracte imunoactive de turbă, comparativ cu eliberarea spontană a acestor citokine în probele netratate; 3] anumite extracte de turbă, încercate in vitro cum s-a menționat mai sus, arată un efect sinergetic în combinație cu imunomodulatori cunoscuți, cum sunt compușii organici ai seleniului, p-clorofenilamida acidului 3-metil-5benzoilaminoizotiazol-4-carboxilic și indometacinul. Aceasta permite utilizarea unor cantități mult mai mici de substanță imunologic active pentru ași dovedi activitatea și 4) sângele periferic uman (PBL) al voluntarilor sănătoși tratați cu TTP (un anumit produs derivat din turbă] administrat oral cu o doză zilnică de 5 mg, încercat pentru inducerea unor citokine, IFN-α, IFN- γ, și TNF-a, își pierde capacitatea de a răspunde inducției citokinelor cu soluție TTP după o administrare orală prelungită și neîntreruptă și își recapătă această capacitate după cca. 2 săptămâni de lipsă.

Metoda conformă prezentei invenții cuprinde etapele de tratare a unei culturi de leucocite din sângele uman periferic (PBL) sau a unei suspensii de celule rezidente peritoneal (RPC) de șoareci BALB/c, cu o soluție a substanței de testat în scopul de a induce producția de citokine și apoi determinarea numitelor citokine în conformitate cu metodele standard de identificare.

Cultura de leucocite din sângele periferic (PBL) folosită conform primei variante sau ca reprezentare a metodei rapide, este o cultură de termen scurt preparată din leucocite proaspete de la oamni sănătoși, cu un mediu nutritiv adecvat țesutului culturii. Densitatea recomandată pentru o cultură pregătită a fi folosită este de cca. 8x O⁶ leucocite/ml. Soluția de testat este de preferat a fi folosită într-o concentrație de D,1 ... 2OO pg/ml. Metoda este, în particular, aplicabilă pentru încercarea extractelor de turbă.

O deterinare la scară micro este posibilă când soluția de testat, de exemplu un extract de turbă sau o fracție din acesta, este amestecată cu un agent imunomodulator, cum ar fi un medicament nonsteroidal antiinflamator, de preferință o substanță aleasă dintr-un grup ce conține compuși organici ai seleniului, cum sunt ebselenul, anumiți derivați izo-tiazolici, cum ar fi p-clorofenilamida acidului 3-metil-5 benzoilamino-izotiazol-4carboxilic și indometacin, ca și analogi, omologi și metaboliți ai acestor substanțe.

RO 114837 Bl

Exemple de compuși organici ai seleniului care pot fi folosiți în acest scop sunt compuși cu formulele 1 ... 3 de mai jos; compusul cu formula 2 (ebselen) fiind de preferat:

145 (1) Bis-[2-(N-fenilcarboxamido]-fenil diseleniură

150 (2) 2-fenil-1,2-benzizoselenazol-3(2H)-onă (Ebselen PZ 51)

155

160 (3) Bis-[2-(N-(2-piridil) carboxamido)]-fenildiseleniură.

Exemple de derivați izotiazolici care pot fi folosiți pentru scopurile de mai sus sunt compuși cu formula generală I

165

a

H--CONHR _nhcor₂ (I]

170 în care R₁ este halofenil, de preferință clorofenil, R₂ este fenil și R₃ este un alchil inferior, de preferință metil. Atomul halogen în grupul halofenil, grupul clorofenil R, este de preferință în poziția p a inelului fenil.

Compusul preferat al formulei I de mai sus este p-clorofenilamida acidului 3-metil5-benzoilamino-izotiazol-4 carboxilic, de exemplu compusul cu formula I unde R.] este pclorfenil, R₂ este fenil și R₃ este metil. Pentru a scurta, acest compus va fi menționat în continuare ca “compusul ITCL”. Sinteza lui și proprietățile acestuia sunt cunoscute din literatura de specialitate.

Toți agenții imunomodulatori, la care s-a făcut referire mai sus ca fiind necesari determinărilor la scară micro, de exemplu compușii organici cu seleniu, derivații izotiazolici și indometacinul au în comun faptul că sunt antiinflamatorii non-steroidali care

175

180

RO 114837 Bl inhibă sinteza prostaglandinelor. Ei amplifică rezultatele testului prin metoda corespunzătoare prezentei invenții. Din acest motiv ei sunt, cu deosebire utili la deterinările micro. Amplificarea rezultatelor poate fi de 5 ... 20 de ori.

Dintre toți compuși non-steroidali antiinflamatorii diferiți, utilizați în scopul amplificării sunt de preferat compușii organici ai seleniului (1, 2 și 3] și compusul ITCL, dar în special indometacinul.

In prezenta invenție se utilizează diferite antiseruri care recunosc individual citokinele induse. Aceste seruri sunt cunoscute și folosite pentru testarea și standardizarea diferitelor citokine. Identificarea citokinelor induse ar trebui să aibă loc în momentul desăvârșirii formării citokinei și înainte de proteoliza sa. Printre diferitele citokine induse, unele se formează încet și rămân stabile în soluție, cum ar fi de exemplu interferonul γ, în timp ce altele se formează rapid și sunt predispune proteolizei, cum ar fi de exemplu factorii de necroză tumorală.

Metoda descrisă mai sus poate fi aplicată de asemenea pentru determinarea răspunsului imunologic al individului la o anumită substanță imunoactivă, cu condiția că un astfel de răspuns imunologic să nu fie stimulat de alți factori, cum ar fi de exemplu infecțiile virale sau bacteriale. Se poate aplica pentru supravegherea răspunsului la medicament a pacienților individuali, pentru determinarea dozei optime a stimulatorului terapeutic al citokinei, cum este TTP, ca și pentru stabilirea schemei efective pentru administrarea medicamentului. Metoda se bazează pe evaluarea stării de hiporeactivitate la stimularea IFN.

Astfel prezenta invenție se referă, de asemenea, la o metodă de determinare a răspunsului imunologic a unui subiect uman la o terapie care folosește o citokină ca substanță indusă imunomodulator. Numita metodă constă în aceea că o cultură de leucocite din sânge periferic (PBL) a unui subiect uman tratat cu o astfel de substanță imunomodulatoare se tratează la intervale definite de timp cu soluția unei substanțe administrată pentru a stimula producerea de citokine, care sunt apoi determinate conform metodelor standard (inclusiv testele ELISA pentru citokine], în scopul de a stabili momentul dezvoltării hiporeactivității la substanță, după administrarea prelungită a substanței, ca și momentul redobândirii capacității de a răspunde la o doză suplimentară de substanță după o anumită perioadă de absență.

Intervalele de timp sunt de preferință 7-14 zile.

Intr-o variantă optimă, metoda de mai sus se aplică în cursul unei terapii folosind extract de turbă ca substanță imunomodulatoare stimulatoare de citokine.

In conformitate cu o variantă optimă particulară a invenției această metodă se aplică în cursul unei terapii, folosind TTP ca substanță imunomodulatoare stimulatoare de citokine, numita TTP fiind inter alia subiectul aplicării patentului nr. PCT/EP 92/00491, unde numitul TTP, caracteristicile sale și producerea sunt descrise detaliat.

Având în vedere cele de mai sus, prezenta invenție se referă la TTP ori de câte ori se utilizează, testează sau se determină în confomritate cu metodele prezentei invenții.

Invenția de față preconizează de asemenea, în varianta sa secundară, o metodă de încercare care este adecvată pentru supravegherea rapidă a proceselor tehnologice la prepararea, purificarea, separarea și alte etape referitoare la substanțele imunoactive. De exemplu, când o suspensie de celule rezidente peritoneal (RPC) la șoareci BALB/c se tratează cu soluția de testat, interferonul-β de șoareci este stimulat, ca și factorul de

RO 114837 Bl

230 necroză tumorală. Ambii pot fi detectați și determinați calitativ conform metodelor standard de identificare. In această metodă se folosește o suspensie de celule proaspete rezistente peritoneal (RPC) de șoarece, care conține aproximativ 1x10⁶ celule ml. Soluția de testat este preparată într-un mediu nutritiv Eagle sau RPMI-1640 cu supliment de 10% ser făt vițel. Rezultatele obținute sunt evaluate după o curbă de etalonare trasată cu o substanță model. Ca substanță model poate fi utilizată o probă din aceeași substanță imunologic activă, testată pe o cale tradițională. Din nou, metoda este recomandată în mod deosebit pentru supravegherea procesului de obținere a extractelor de turbă ca și la analiza fracțiilor lor.

Metoda de față este foarte simplă și eficientă, comparativ cu alte metode cunoscute în domeniu, pentru că se bazează pe stimularea directă a interferonului-β, în locul efectului secundar de formare a anticorpilor (cum este cazul într-un număr de teste convenționale). Până în prezent nu a fost posibil să se găsească o metodă similară din cauza faptului că imunosistemul șoarecilor diferă semnificativ de imunosistemul uman, și testele care sunt recunoscute ca indicatoare ale răspunsului imunologic uman (cum ar fi prezența interferonilor în țesuturile splinei sau limfonodelor etc.) nu sunt valabile la cele mai bune teste de laborator pe animale, de exemplu cu șoareci de tipul BALB/c.

S-a descoperit acum că un răspuns imunologic clar la șoarecii BALB/c poate fi obținută când celulele rezidente peritoneal (RPC) sunt alese ca material biologic de testare, fiind utilizate suspensii proaspete de astfel de celule. Pentru fiecare testare este suficient să se sacrifice numai trei animale. Rezultatle se obțin în câteva ore. Materialul biologic poate fi folosit ca cultură, și se poate stabili o linie corespunzătoare de macrofagi.

Metoda conformă prezentei invenții folosește materialul biologic, concret o cultură de leucocite de sânge periferic (PBL) sau o suspensie de celule rezidente pertoneal (RPC) a șoarecilor BALB/c conform informațiilor date mai sus. Prezenta și concentrația fiecărei citokine se determină prin metode de testare și standardizare a interferonilor cunoscute din literatura de specialitate. Determinarea întregului spectru de citokine induse identifică starea imunologică a pacientului.

Pentru o corectă evaluare a rezultatelor este important ca materialul biologic pentru desfășurarea ambelor variante ale metodei preconizate de prezenta invenție să fie alese de la donatori corespunzători. In cazul leucocitelor umane, probele luate de la subiecți care prezintă hiporeactivitate (cazuri rare), de exmeplu un nivel redus al răspunsului imunologic, trebuie excluse la evaluare. In cazul suspensiei RPC de șoareci BALB/c, probele luate de la animale stimulate suplimentar (de exemplu de la unii infectați) trebuie, de asemenea, excluse de la evaluare. In cazul suspensiilor RPC de șoareci BALB/c, probele nu vor fi luate de la animale prea tinere sau prea bătrâne, deoarece există o deficiență, dependentă de vârstă a producției de citokine la altfel de șoareci. Vor fi alese animale sănătoase, de 5 ... 8 săptămâni. Probele care arată o producție spontană foarte mare de citokine trebuie eliminate, în special când se testează substanțe imunoregulatoare, deoarece nu se poate observa nici o sporire a inducerii citokinelor sau, uneori, nici măcar diminuarea unei astfel de inducții.

Această aplicație a metodei corespunzătoare prezentei invenții, la care amplificarea rezultatelor se realizează prin amestecarea unui medicament non-steroidal antiinflamatoriu (una din substanțele la care s-a făcut referire mai sus, cum ar fi compusul ITLC sau compușii organici cu seleniu 1,2 și 3, dar de preferat indometacinul)

235

240

245

250

255

260

265

270

RO 114837 Bl la soluția de testat, este o încercare la scară micro, recomandată în special la determinarea activității induse TNF și IFN. Acest test este economic, rapid, aplicabil la încercarea unui mare număr de probe simultan și adecvat standardizării și, cel puțin parțial, automatizării.

Cele două variante ale metodei corespunzătoare prezentei invenții sunt descrise ca exemple mai detaliate, în continuare:

Prepararea soluției substanței de testat: substanța de testat, de exemplu un extract de turbă, se dizolvă în apă bidistilată sterilă la o concentrație de 10 mg/ml. Probele sunt sterilizate prin filtrare în filtre antibacteriale de 0,45 um, la maximum 600 kPa Millipore^tRl. Apoi, soluțiile se fac într-un mediu complet RPMI-164O care conține ser de făt bovin inactivat la cald (FBS).

A) Varianta PBL:

Stimularea citokinei

Straturi de piele de la donatori sănătoși de sânge pot fi obținute de la centre regionale de transfuzie. Alternativ, leucocite de sânge periferic (PBL] pot fi izolate din sângele venos heparinizat al voluntarilor sănătoși prin centrifugare Ficoll-Hypaque^(R’ (sau Histopaque^(Rl) cu gradient de densitate (g = 1,077] cu dublă spălare ulterioară a celulelor. Eritrocitele au fost distruse prin tratarea cu NH4CI conform datelor cunoscute din literatura de specialitate (Producerea și purificarea parțială a interferonului uman imun. Meth. Enzymol. 119, 54, 1988). S-au utilizat leucocitele de la un singur donator conținând cca. 8x10⁶ leucocite/ml în mediu RPM-1640 suplimentat cu 10% ser făt bovin (FBS), glutamină-L și antibiotice. Toate loturile de FBS au fost testate anterior. S-a folosit numai FBS nemitogenic la culturi PBL. S-au adăugat stimulatori citokinici la 200 ... 1000 pl volume de culturi. Stimulatorii citokinici de referință au fost fitohemaglutinina (PHA). Culturile stimulate de PBL au fost incubate într-o atmosferă de 5% C02 în aer la 37°C, timp de 20 ore și centrifugate. Soluția centrifugată limpede a fost stocată la 4°C și încercată ca activitate IFN timp de o săptămână. Părțile superficiale folosite pentru determinarea activității TNF au fost stocate la -90°C sau în azot lichid pentru a evita inactivarea produsă de proteoliză.

încercarea interferonului

Monostraturile confluente de celule A549 au fost preparate în microtăvi cu mediu esențial minim modificat Dulbecco (DMEM) cu 10% FBS, glutamină-L și antibiotice (penicilină 100 unități/ml și streptomicină 100 pg/ml). Probele IFN diluate s-au adăugat celulei monostrat și incubate la 37°C timp de 20 ore în aer cu 5% C0₂. Celulele au fost apoi spălate și supuse acțiunii virusului encefalomiocarditic (EMCV). Termenul IFN a fost definit ca diluție a probei care reduce efectul virusului citopatogenic la 50% după 48 ore incubație. S-a folosit de asemenea metoda MTT (bromură de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5difeniltetrazoliu, care este cunoscută din literatura de specialitate. Reexaminarea și alte dezvoltări ale unei metode colorimetrice precise și rapide pentru măsurarea creșterii celulelor/morții celulelor. (J.lmmunol.Meth. 1989, 119, 203-210) pentru măsurarea celulelor moarte în scanner ELISA. Standardele de laborator ale IFN trebuie incluse în toate încercările de exemplu, leucocite IFN-γ uman recombinat (activitate specifică 2.10⁶ unități/mg), leucocite umane naturale IFN-γ (3x10⁶ lU/ml).

IncercareaTNF

Activitatea citotoxică a TNF s-a măsurat în celule l_g_2g conform datelor cunoscute din literatura de specialitate (Compararea încercărilor celulelor citotoxice in vitro pentru

RO 114837 Bl

325 factorul de necroză tumorală. J. Immunol. Meth. 68, 1667, 1984). Probele și soluția de actinomicină D (5 pg/ml) s-au adăugat la culturile monostrat de celule. După incubație la 37°C efectele citotoxice ale TNF s-au determinat fie prin exminarea microscopică a culturilor, fie folosind metode MTT. Cantitatea care provoacă aproximativ 50% distrugerea culturilor de celule s-a definit ca unitatea de activitate TNF. Compoziția cu un preparat de TNF-α, a arătat că o unitate în probă a fost egală cu 100 ... 200 pg/ml TNF.

Teste de neutralizare a citokinelor

Citokinele produse de PBL tratat cu preparatele examinate pot fi identificate prin teste de neutralizare cu anticorpi specifici (Inglot și alții, Organoseleniurile ca potențiali imunostimulatori și inductori a interferonului gama și ai altor leucocite din sângele uman periferic, Experiența 1990, 46, 308-311). Mai mult, diverse seturi ELISA pot fi utilizate pentru detemrinarea imunoactivității unei citokine definite.

Comentariu

In soluțiile obținute din celulele de cultură limfoide pot fi găsite și identificate prin alte metode standard citokine, altele decât TNF și IFN, de exemplu Interleukine (IL-1-10), GM-CSF, TGF-β, etc.

B) Varianta RPC: inducția citokinei

Celulele rezidente peritoneal la șoareci (RPC) se obțin de la șoareci de cca. 6 săptămâni BALB/c omorâți cu eter, prin injectarea în cavitatea peritoneală a 5 ml de mediu complet RPMI-1640, la temperatura camerei. Mediul de spălare conținând RPC este colectat în tuburile centrifugei de 50 ml răcite cu gheață. RPC nu sunt nici spălate, nici centrifugate. Celulele sunt numărate într-un hemocitometru Burker și suspendate la o densitate de 1 ... 1,5x10⁶ celule/ml. O astfel de densitate de celule se impune pentru toate încercările de măsurare a efectelor variatelor concentrații de preparare (de la 0,1 ... 500 pg/ml). Controalele negative și pozitive se includ în toate testele. Controlul negativ măsoară eliberarea spontană a TNF sau IFN la RPC incubat cu mediu complet RPMI-1640 fără stimulatori, în timp ce controlul pozitiv arată efectul stimulatorului standard lipopolizaharoid (LPS din E. Coli 055:85, Sigma 1-10 pg/ml). Toate culturile sunt incubate la 26°Ctimp de 26 ore. După aceasta, culturile sunt centrifugate la 1000 rotații/min timp de 10 min și se colectează soluția limpede deasupra. Utilizând o pipetă automată se diluează soluția de deasupra de la 1:2 la 1:256.

Bioîncercările citokinelor

Pentru determinarea activității TNF cu soluțiile centrifugate din culturile RPC se folosesc monstraturi de culturi de celule l_g_2g vechi de 20 ore. Celule de șoarece fibroase tip Lggg cu 2x1ο⁴ celule percursă în 100 μ mediu complet, se însămânțează pe plăci cu suprafața plană în 96 de surse și incubate timp de 20 ore la 37°C pentru a obține monostratul.Transferul soluției centrifugate trebuie să fie foarte precis. In metoda culturilor incubate, celulele Lg₂g se țin 24 ore la 37°C în atmosferă de 5% C0₂ în aer.

Evaluări

1) Se fac citirile efectelor citotoxice la microscopul invers.

2) Testul MTT (bromură de 3- 4,5-dimetiltiazol-il-]-2,5-difeniltetrazolium).

Pentru măsurarea celulelor moarte cu culturi de celule Lg₂9· ^se adaugă 25 μΙ de soluție colorată MTT la o concentrație de 5 mg/ml în fiecare sursă a microplăcilor. Apoi se incubează plăcile 2 ore la 37°C într-o atmosferă de 5% C0₂ în aer. In continuare, se adaugă la fiecare sură 100 μΙ soluție de solvent care conține 45 ml dimetilformamidă,

330

335

340

345

350

355

360

365

RO 114837 Bl

13,5 g de SDS (dodecil sulfat de sodiu] și 55 ml apă distilată. Incubația are loc timp de 12 ore la 37°C într-un incubator cu C0₂. Rezultatele testului de culoare MTT sunt citite pe un indicator Multiskan 34O/CC folosind un filtru 570 nm. Trebuie să se folosească TNF - a recombinat de referință.

încercarea biologică a interferonului.

IFN este încercat prin incubarea efectului citopatic cauzat de virusul șoarecilor encefalomiocarditic (ENCVîn celulele l_g_2g ale șoarecelui, referință MU IFN α/β). Efectul citopatic este observat la un microscop invers și este de asemenea măsurat prin metoda MTT după cum urmează:

Metoda MTT (după Berg și alții): o nouă bioîncercare sensibilă pentru cuantificarea precisă a activității interferonului ca funcție măsurată prin dehidrogenaza miticondrială (Metosa APMIS, 98, 156 - 162). Astfel, MTT (bromura 3/4,5-dimetiltiazol-2-il/2,5-difenil tetrazolin) se diluează în RBS la o concentrație de 5 mg/ml. Pentru măsurarea celulelor moarte cu culturi l_g₂₉ se adaugă la fiecare sursă a microplăcilor 25 pl de MTT soluție colorată la o concentrație de 5 mg/ml. Proba de referință de TNF sau IFN este inclusă pentru control. Apoi, plăcile sunt incubate 2 ore la 37°C, într-o atomosferă de 5% C0₂în aer. In continuare, se adaugă la fiecare sursă 1OO pl de soluție care cnține 45 ml dimetilformamidă, 13,5 g de SDS (dodecil sulfat de sodiu) și 55 ml apă distilată. După o incubație de peste noapte la 37°C se măsoară densitățile optice la 570 nm folosind un indicator microplacă Start Fac Aeareness Technology Inc. 2100, utilizând soluția tampon de extracție ca probă oarbă.

Atât TNF-α, cât și IFN-β și alte citokine, pot fi testate folosind seturi de probă comerciale ELISA.

O compoziție pentru desfășurarea metodei conform prezentei invenții conține apa de cultură a țesutului dublu procesat, într-un mediu de cultură și seruri în completarea mediului de cultură care pot fi atât PBL uman sau RPC de șoareci. Astfel un set de diagnosticare (Kit de stimulate a citokinelor) pentru utilizare în varianta PBL a prezentei metode (pentru 10 ... 20încercări manuale) poate conține următoarele:

1) Apa de cultură a unui țesut dublu procesat, 100 ml Histopaque^(Rl sau FicollHypaque^lR)-1077 (mediu de gradient densitate), 100 ml

3] Mediu RPMI-1640, 2 x 100 ml (bicarbonat de sodiu și glutamină-L, filtrat steril, testată la endotoxină).

4] Ser de făt bovin (FBS) 20 ml, cu conținut redus de endotoxină și hemoglobina

5] Lecitină din Phaseolus vulgaris 0,5 mg (Fitohemagglutină-PHA-P)

6] Tuburi cu fund rotund cu capace, polipropilenă, sterile pentru culturi de țesuturi 17 x 100 mm, capacitate 14 ml, 25 buc la cutie

7] Plăci de cultură de țesuturi cu capace, 2 plăci, 96 surse, fund plat, sterile.

Un astfel de set PBL poate fi utilizat ca un așa numit sistem de protecție în fază secundară, pentru confirmarea rezultatelor obținute cu celulele RPC sau câteodată ca sistem direct de protecție pentru mai multe substanțe care pot fi inactive ca imunomodulari la rozătoare, de exemplu compușii organici ai seleniului.

Un set pentru diagnosticare (set stimulator citokine) pentru utilizarea în varianta RPC a prezentei metode (pentru 10 ... 20 teste manuale, poate conține următoarele:

1] Apă de cultură de țesuturi dublu procesate, 100 ml

2] Mediu RPMI-1640, 2 x 100 ml (testat cu bicarbonat de sodiu și glutamină-L), steril, filtrat, endotoxină).

RO 114837 Bl

415

3) Ser de făt bovin (FBS), 20 ml, cu conținut redus de endotoxină și hemoglobină.

4) Lipopolizaharidă (LPS) 0,5 mg, din E.coli 0127: BS

5) Tuburi cu fund rotund cu capace, sterile, 25 buc la cutie polipropilenă, pentru cultură de țesuturi, 12 x 75 mm, capacitate 6 ml

6) Plăci cu culturi de țesuturi cu capace, 5 plăci, 96 surse, fund plat, sterile.

□ compoziție pentru desfășurarea metodei conform prezentei invenții care implică amplificarea rezultatelor, este recomandată în special testelor la micro scară, conține, pe de o parte o cultură PBL sau o suspensie RPC și pe de altă parte un medicament non-steroidal antiinflamator, de preferință o substanță selecționată dintr-un grup de compuși organici cu seleniu, cu ar fi ebsenul, indometacinul sau compusul ITCL și derivați analogi, omologi și metaboliți ai acestor compuși, de preferință indometacinul.

Se dau, în continaure, exemple de realizare a invenției în legătură cu fig. 1...13 care reprezintă :

- fig. 1, comparație a producției IFN- β cu tratamentul RPC cu TTP, și netratat,

-fig.2, dependența producției IFN de concentrația TTP,

- fig.3, comparație între producțiile de TN-a prin RPC tratat cu TPP și netratat,

- fig.4, dependența producției de TNF, funcție de concentrația TTP,

- fig.5, efectele diferitelor șarje de TTP asupra producerii de IFN și respectiv TNT,

- fig.6, efectele diferitelor șarje de TTP asupra producerii de IFN și respectiv TNT,

- fig.7, rezultatele neutralizării IFN cu seruri policlonale anti-IFN

- fig.8, răspunsul culturilor PBL a unui pacient, la stimulatori IFN în timpul administrării orale a TTP,

- fig.9, răspunsul culturilor PBL a unui pacient, la stimulatori IFN în timpul administrării orale a TTP,

- fig. 10, răspunsul culturilor PBL a unui pacient, la stimulatori TNF în timpul administrării orale a TTP,

- fig. 11 .răspunsul culturilor PBL a unui pacient, la stimulatori TNF în timpul administrării orale a TTP,

- fig. 12, răspunsul culturilor PBL a unui pacient, la stimulatori TNF în timpul administrării orale a TTP,

- fig. 13, răspunsul culturilor PBL a unui pacient, la stimulatori IFN în timpul administrării orale a TTP,

Exemplul 1. Soluțiile individuale de RPC au fost obținute de la 36 șoareci BALB/c femele, de 7 ... 8 săptămâni, omorâți cu eter, prin injectarea în cavitatea peritoneală a 5 ml mediu minim Egale esențial (EMEM), suplimentat cu 10% ser de vițel inactivat la cald. Spălări de la șoareci care conțin 1x10⁶ celule/ml. Suspensiile celulelor de la fiecare șoarece au fost împărțite în două probe distribuite în 2 tuburi. O probă a fost tratată cu 1 □ pg TTP/ml și cealaltă a servit ca control negativ, inducând eliberarea spontană a citokinelor.

Toate culturile au fost incubate la 26°C timp de 20 ore și apoi centrifugate la 1000 rot/min timp de 10 min. Soluțiile centrifugate au fost colectate și testate pentru activitățile IFN-β ca biotest, utiliuzând o micrometodă de inhibare a efectului citopatic produs de EMCV (virusul encefalomiocarditic) în celulele de șoarece Lg_2g. La fiecare test s-a inclus un standard intern de laborator care a fost etalonat în raport cu o referință internațională de preparare a Mu IFN, G 002-904-511, NHI. Efectul citopatic a fost măsurat prin metoda MTT, conform lui Berg și alții: pentru controale nivelul IFN-β a fost

420

425

430

435

440

445

450

455

RO 114837 Bl

... 8 U/ml, media fiind 2, pentru probele tratate cu TTP, nivelul IFN-β a fost 4-127 U/ml, media fiind 16.

Rezultatele sunt prezentate grafic pe desenul anexat din figura 1 (comparație a producției IFN-β cu tratamentul RPC cu TTP și netratat, 1-limita de detecție, 2-medie. In conformitate cu testul mediană P=O,OOOO. Fiecare punct indică mediul ca nivel IFN în RPC izolat de la un șoarece).

Exemplul 2, A fost repetat procedeul descris în exemplul 1 cu un grup de 7 șoareci, însă în loc să se împartă fiecare suspensie RPC de șoarece în 2 probe, numai o suspensie a fost divizată în 4 probe. Probele au fost distribuite în 4 tuburi (1 ml în fiecare). Una din probe a fost un control negativ și celelalte 3 au fost tratate cu 100,10 și 1 pg TTP/ml pentru determinarea dozei de TTP-dependent de IFN-β eliberat. După incubația culturilor 24 ore la 26°C, tuburile au fost centrifugate. In soluțiile clare colectate s-a determinat IFN-β după cum s-a descris în exemplul 1. Rezultatele obținute sunt prezentate în desenul anexat (fig.2 - dependența producției IFN de concentrația TTP). Fiecare curbă se referă la rezultatele obținute pe o suspensie RPC provenită de la u singur șoarece.

Exemplul 3 - S-au urmat procedura descrisă la exemplul 1 cu diferența că s-a determinat TNF-α în locul IFN-β.

Soluțiile centrifugate din culturile RPC netratate și tratate cu 100 pg/ml au fost testate pentru activitatea TNF ca biotest. Ceulele fibroase de șoarece de tipul L_g29 (4x10⁴ celule/sursă în 100 pl de EMEM complet) au fost însămânțate pe plăci cu fundul plat în 96 de surse și incubate 4 ore la 37°C într-o atmosferă de 5% C0₂ în aer. Probele au fost diluate în EMEM cu actinomicină D (concentrație finală 2,4 pg/ml) pe o placă suplimentară. Apoi, mediul de cultură de deasupra monostratului de celule Lg_2g a fost îndepărtat și diluțiile preparate s-au transferat către această cultură folosind o pipetă multicanal. După incubare 20 ore, la 37°C s-au testat culturile pentru celulele moarte prin metoda MTT descrisă mai sus. Rezultatele obținute au fost: pentru controalele negative ale TNF-α nivelul a fost cuprins în intervalul 1-256 U/ml, media fiind 8 U/ml și pentru probele tratate cu TTP nivelul TNF-α a fost de asemenea 2-256, dar media 64 U/ml. Rezultatele obținute sunt reproduse în figura 3 anexată (comparație între producțiile de TNF-α prin RPC tratat cu TTP și netratat. 1- limita de detecție, 2-mediana. Conform cu testul mediana, P = 0,0030. Fiecare punct indică nivelul TNF în RPC izolat de la șoareci individuali).

Exemplul 4. S-a urmat procedura descrisă în exemplul 2 cu diferența că în locul IFN-β s-a determinat TNF-α după descrierea din exemplul 3. Rezultatele obținute sunt arătate în exemplul anexat în figura 4 (Dependența producției de TNF funcție de concentrația TTP).

Exemplul 5. Material biologic. S-au folosit pentru teste peste 115 buc.piele uscată de la donatori sănătoși, individuali de sânge, de la un centru regional de transfuzie. Caracteristicile donatorilor sunt date în tabelul 1.

RO 114837 Bl

Tabelul 1

Caracteristicile donatorilor de sânge utilizați ca sursă de PBL

500

Vârsta (ani)	Nr.	Bărbat	Femeie	Donație
Multiplă	Unică
21-30	24	22	2	24	-
31-40	45	44	1	45	-
41-59	46	44	2	40	6
Total %	115	110	5	109	6
	100	96	4	95	5

505

Dintre donatori, majoritatea sunt bărbați tineri care au donat sânge de mai multe ori. S-a observat că răspunsul PBL a avut variații considerabile la donatorii individuali, redate în tabelul 2.

După cum rezultă din tabelul 2, culturile 10 ... 30% PBL pot să nu răspunsă la o doză de 100 pg/ml TTP, în timp ce numai 7% nu pot fi stimulate la o doză de 10 pg/ml PHA și 20% nu au răspuns la o doză de 10 pg/ml LPS cu producere de IFN și 50% nu au răspuns la aceeași doză de LPS cu producere de TNF.

Tabelul 2

Răspunsul IFN și TNF a PBL de la sângele donatorilor individuali după stimularea cu diferite doze de TTP ori cu stimulatori standard

510

515

520

Stimulator	Doză(pg/ml)	Nr. PBL testați	Nr. IFN (%)	Răspunde la TNF (%)
TTP 010391	100	19	13 (68)	13 (68)
	30	13	6 (46)	9 (69)
	10	15	15 (93)	13 (87)
TTP 020391	100	14	10(71)	11 (79)
	30	12	8(67)	8(67)
	10	10	5 (50)	5 (50)
TTP 101091	100	26	21 (81)	20 (77)
	30	20	9 (45)	8 (40)
	10	24	14(58)	15 (63)
TTP 010991	100	5	5 (100)	4 (80)
	30	4	2(50)	0(0)
	10	5	2 (40)	3 (60)

525

530

RO 114837 Bl [Continuare]

TTP 021091	1OQ	5	4 (80)	4 (80
	30	4	3(75)	4 (100)
	10	5	3 (60)	3 (60)
TTP 111191	100	5	3 (60)	4 (80)
	30	4	2(50)	3(75)
	10	5	4 (80)	2 (40)
TTP (8x)	100	29	19 (66)	10 (34)
	30	24	14 (58)	11 (46)
	10	21	16 (76)	2 (10)
PHA	10	69	64 (93)	54 (78)
LPS	10	41	33 (80)	21 (51)
Fără	-	69	36 (52)	20 (29)

Aceste date sunt esențiale pentru o selecție corespunzătoare a materialului biologic. Culturile PBL care nu dau răspuns sunt detectate prin evaluarea controalelor negative descrise (netratate, eliberare spontană de citokine) și pozitive (tratament cu stimulator standard ca PHA sau LPS).

Tabelul 3

Inducția de IFN sau TNF În diferite șarje la 100 pg/ml extract de turbă în Unități Internaționale de Activitate

IFN /unități/ ml	TNF /unități/ ml
Serii nr.	Număr de teste	Interval	Medie	Număr de teste	Durata testelor
24 ore interv.	Medie	6 zile interv.	Medie
Control fără stimulatori	333	< 10-100	10	41	9-750	27	9-80	9
31090	3	5-30	30	3	ND	ND	9-80	80
291290	21	10-3000	100	14	ND	ND	7-750	40
010391	23	10-2000	60	17	ND	ND	9-160	9
020391	19	10-1000	30	32	9-750	200	9-250	27

RO 114837 Bl

Mediile condiționate au fost depozitate la 4°C înainte de testare.

S-au folosit leucocite din sângele periferic uman de la donatori sănătoși (8.10⁶ celule/ml).

B. Experimentări efectuate

S-au testat probele de extract de turbă luate de la diferite șarje de producție numeroatate ca în tabelul 3 folosind testul PBL descris anterior. In cursul experimentărilor s-au determinat cantitativ interferonul (IFN) și factorul de necroză tumorală (TNF) și s-a determinat activitatea lor, exprimată în Unități Internaționale de Activitate, conform metodei standard menționate mai sus. Experimentările au fost repetate de un număr de ori menționat în tebelul 3. De asemenea sunt redate intervalele și mediile rezultate.

S-a efectuat un test similar cu un preparat standardizat de turbă. La o concentrație de 30 pg/ml activitatea interferonului a fost cuprinsă în intervalul 30 ... 300 Unități Internaționale de Activitate, în timp ce la o concentrație de 100 pg/ml activitatea a fost de 300 ... 1000.

Concentrațiile intermediare prezintă o relație lineară între doză și răspuns. Extractele imunoactive de turbă testate în exemplul de mai sus sunt descrise în Aplicația PCT nr. PCT/EP 92/00491.

Datele din tabelul 3 arată clar că la culturile PBL este esențial a efectua controalele negativă și pozitivă pentru evaluarea rezultatelor. Experimentele ulterioare arată că atunci când nu se iau în considerare culturile fără răspuns PBL și se efectuează evaluarea statistică a unui număr mare de determinări, eficacitatea testelor corespunzătoare invenției nu poate fi pusă la îndoială.

S-a determinat activitatea în 1) teste biologice a citokinelor induse pentru o perioară de peste 2 ani asupra a mai mult de 20 șarje diferite de TTP, inclusiv 10 loturi comerciale standard de medicament, 2) șarje rebutate de producător, datorită activității biologice necorespunzătoare determinate la șoareci care au fost sub standardul stabilit și 3) extractele de laborator de turbă, preparate la scară mică.

Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 4 sub forma principalelor nivele de IFN și TNF induse (cu abaterile standard SD calculate și semnificațiile statistice).

Valorile principale au fost calculate conform tuturor rezultatelor titrărilor IFN și TNF. Cazurile fără răspunsuri au fost considerate ca zero.

^Diferit de “nici unul” (producție spontană de citokine) la ^ap < 0,05, ^bp < 0,01 sau ^cp < 0,001.

Valorile medii corespondente rezultatelor prezentate în tabelul 4 sunt date în tabelul următor 5, în timp ce datele selectate sunt prezentate în formă grafică în figurile 5 și 6, care ilustrează efectele diferitelor șarje de TTP asupra producerii de IFN și respectiv TNF.

575

580

585

590

595

600

605

RO 114837 Bl

Tabelul 4

Efectele diferitelor șarje de TTP asupra producției de IFN și TNF la PBL uman

Stimulator	Doză (pg/ml)	IFN 10g10	TNF unități/ml (± sd)
TTP 010391	100	1,41± 1,07b	1,26 ± 0,91c
	30	0,96 ± 1,07	1,25 ± 0,88b
	10	1,81 ±0,58c	1,45 ± 0,63c
TTP 020391	100	1,23 ± 0,81a	1,35 ±0,75c
	30	1,12 + 0,90	1,14±0,83b
	10	0,75 ± 0,75	0,86 ± 0,90
TTP 101091	100	1,70 + 0.9Γ	1,38 + 0,81c
	30	0,99 ± 1,12	0,61 ± 0,80
	10	1,22 ± 1,07a	0,94 ± 0,76b
TTP 010991	100	2,24 ± 0,30c	1,35 ± O,73b
	30	1,00 ± 1,00	0,1
	10	0,56 ± 0,68	0,88 + 0,73
TTP 021091	100	1,72 ± 0,87b	1,49 ± 0,84b
	30	1,39 ± 0,81	1,79 + 0,20c
	10	1,11 ±0,91	1,01 ± 0,84
TTP 111191	100	1,36 + 1,12	1,18 ± 0,62b
	30	1,00 ± 1,00	1,21 ± 0,71a
	10	1,56 + 0,86a	0,54 ± 0,66
TTP (8x)	100	1,04 ± 0,82a	0,63 ± 0,91
	30	0,88 ± 0,81	0,75 ± 0,84
	10	1,10±0,70b	0,13 ± 0,40a
PHA	10	2,08 ± 0,79c	0,67 ± 0,99c
LPS	10	1,36 ± 0,80c	0,97 ± 1,01b
Fără	-	0,64 ± 0,63	0,42 ± 0,67

RO 114837 Bl

645

Tabelul 5

Efectul diferitelor șarje de TTP asupra producției de IFN și TNF la PBL uman

Stimulator	Doză (pg/ml)	IFN	TNF
unități / ml
TTP 010391	100	30	27
	30	<10	27
	10	100	27
TTP O2O391	100	30	50
	30	30	34
	10	<10	9
TTP 101091	100	100	34
	30	<10	9
	10	45	18
TTP 010991	100	300	27
	30	<10	<9
	10	<10	18
TTP 021091	100	100	27
	30	60	80
	10	60	27
TTP 111191	100	100	18
	30	<10	40
	10	100	<9
TTP (8x)	100	20	<9
	30	10	<9
	10	20	<9
PHA	10	200	80
	10	30	27
Fără	-	10	<9

650

655

660

665

670

Valorile medii au fost calculate din totate rezultatele titrărilor de IFN sau TNF. Identificarea citokinelor induse s-a efectuat prin intermediul neutralizării IFN și TNE induse de TT

Rezultatele exprimentărilor de mai sus sunt redate în figurile 5 și 6.

675

RO 114837 Bl

Efectele diferitelor șarje de TTP asupra producției de IFN prin PBL uman (fig.5). S-au utilizat 7 șarje diferite de TTP. Fiecare punct din grafic se referea la PBL al unui donator individual de sânge. Activitatea IFN se referă la activități în unități antivirale. Suprafața umbrită arată limita datelor nesemnificative. Liniile orizontale indică valorile medii. Stimularea IFN cu 30 și 1OO pg/ml TTP este, din punct de vedere statistic, importantă (la p < 0,05).

Efectele diferitelor șarje de TTP asupra producției de TNF la PBL uman: activitatea TNF este exprimată prin unități citotoxice la celule de șoareci Lg₂₉. Răspunsul la 30, 100 și 200 pg/ml TTP este important (la p < 0,05) (fig.6).

In aceste experimente s-au folosit antiseruri policlonale puternice: IFN-a antinatural, IFN-α anti-limfoblastoid și IFN-θ anti-natural pentru a neutraliza activitatea antivirală în soluțiile centrifugate ale culturilor PBL tratate timp de 20 ore cu trei șarje diferite de TTP. Rezultatele sunt prezentate grafic în figura 7 (Rezultatele neutralizării IFN cu săruri policlonale anti-IFN) și arată că părțile de IFN tipurile a și ϋ produse de PBL de la donori individuali de sânge variază considerabil. Se surgerează că tipul de IFN eliberat de fiecare donor este o caracteristică individuală a donatorului.

Testele de neutralizare efectuate cu un ser puternic policlonal de iepure anti-TNF-a au arătat că TNF indus cu TTP este în principal, TNF tip a. Acest lucru s-a confirmat prin rezultatele neutralizărilor similare efectuate cu ser de iepure policlonal anti-TNF-β care nu au neutralizat activitatea TNF indus prin TTP.

Fig. 7 arată rezultatele neutralizării IFN cu seruri policlonale anti-IFN. Mediile conținând IFN din culturile de PBL incubate cu TTP (s-au folosit trei loturi diferite de TTP și 7 loturi diferite de PBL) au fost tratate cu serurile anti-IFN indicate: 1- preparate netratate; 2-tratate cu anti-Hu- IFN-α; 3-tratate cu anti-HU IFN -Ly; 4-tratate cu anti-Hu IFN-a.

Exemplul 6. S-a urmat procedura descrisă în exemplul 5 pentru a arăta efectul de amplificare datorat prezenței unui amplificator, adică indometacinul, în conformitate cu prezenta invenție.

Fiecare cultură PBL a fost împărțită în mai multe probe. Una din ele a fost un control negativ arătând o degajare spontană de citokine, alta a fost un control pozitiv tratat cu un stimulator citokinic standard puternic de natură indicată mai jos și probele rămase au fost tratate cu TTP 1-100 pg/ml, șarjele nr. 010391 sau 020391, precum și TTP I și TTP II care apar în tabelele 6b și respectiv 6c și 5 pg/ml indometacin + TTP ale acelorași șarje (tabelul 6a) sau 10 pg/ml amestec ITCL + TTP ale acelorași șarje (tabelul 6b) sau 10 sau 20 pg/ml compuși organici cu seleniu (1), (2) sau (3) după definirea de mai sus + TTP ale acelorași șarje. In soluțiile centrifugate ale culturilor incubate s-au determinat IFN și TNF.

Rezultatele obținute sunt arătate mai jos, în tabelele 6a, b și c.

RO 114837 Bl

715

Tabelul 6a

Efectul amplificării inducției citokinelorîn prezența indometacinului

Exp.	Stimulator	Indometacin	Concentrație pg/ml	Citokine Unități/ml)
-] a)	TTP 010391	-	100	300	750
	tt	-	10	30	250
	u	-	1	20	80
	<i	+	100 + 5	1000	2200
	M	+	10 + 5	200	750
	'	+	1 + 5	<10	250
	LPS	-	10	200	500
	Fără	-	-	<10	9
	Fără	+	5	20	27
2 b)	TTP 020391	-	100	600	50
	ii	-	40	20	9
	<(	-	20	10	<9
	«	-	10	<10	80
		+	100 + 5	600	27
	ti	+	40 + 5	100	9
	ti	+	20 + 5	100	9
	ti	+	10 + 5	30	50
	PHA	-	5	600	80
	PHA	+	5 + 5	2000	<9
	Fără	-	-	60	<9
	Fără	+	5	10

720

a) PBL au fost preparate din sânge proaspăt heparinizat prin tehnica de separare Ficoll-Hypaque. Culturile PBL au conținut 7x10⁶ celule/ml.

b] PBL au fost preparate din piele uscată obținută de la Centrul Regional de Transfuzie. Celulele au fost procesate în conformitate cu metoda cunoscută (Mth. Enzymol. 1981, 78, 29-38).

Culturile PBL au conținut 8x10⁶ celule/ml.

Tabelul 6

725

Efectul amplificării inducției citokinelor în prezența compusului ITCL

Exp.	Stimulator	Compus	Concentrația	Citokine IFN	(unități/ml) TNF
1.	TTP 010391	-	100	100	18
	TTP 010391	-	30	100	9
	TTP 010391	+	100+10	3000	80
	TTP 010391	+	30+10	300	80
	PHA	-	10	3000	250

730

735

RO 114837 Bl [Continuare]

	Fără	-	-	10	<9
	Fără	+	10	<10	<9
2.	TTP 1	-	100	3000	27
	TTP 1	-	30	30	<9
	TTP 1	+	100+10	3000	250
	TTP 1	+	30+10	300	9
	PHA	-	10	100	18
	Fără	-	-	10	<9
	Fără	+	10	10	<9

Tabelul 6c

Efectul amplificării inducției citokinelor în prezența compușilor organici cu seleniu

Exp.	Stimulator	Compuși organici cu seleniu	Concentrația pg/ml	Citokine (unități/ml)
IFN	TNF
1	TTP	-	10	100	<9
	TTP	-	5	10	<9
	TTP	Compus (1)	10+20	300	27
	TTP	Compus (1)	5+20	100	27
	TTP	Compus (2)	10+20	300	500
	TTP	Compus (2)	5+20	100	9
	PHA	-	10	100	<9
	Fără	Compus (1)	20	200	9
	Fără	Compus (2]	20	100	27
	Fără	-	-	10	<9
2.	TTP II	-	50	10	<9
	TTP II	-	5	10	<9
	TTP II	Compus (3)	50+10	30	27
	TTP II	Compus (3)	10+10	30	27
	PHA	-	-	30	<9
	Fără	Compus (3)	10	10	<9
	Fără	-	-	10	<9

RO 114837 Bl

Culturile PBL au conținut 8x10⁶ celule/ml. TTP este un preparat de turbă produs la scară redusă. Răspunsul relativ coborât TNF se datorește probabil faptului că pielea uscată a fost stocată 20 ore la 4°C înainte de prepararea culturilor.Compușii organici cu seleniu sunt stimulatori ai citokinelor ca și TTP.

Exemplul 7. S-a efectuat un test diagnostic care să arate efectul administrării pe cale orală a TTP în doze zilnice de 5 mg sub formă de tablete procurabile comercial, asupra culturii PBL in vitro. Ca o doză suplimentară de citokine induse de TTP, conform particularităților date mai jos:

Testul s-a desfășurat pe 4 femei sănătoase voluntare, în vârstă de 43 ... 58 ani, care au donat săptămânal 20 ml sânge venos înainte, în timpul și după-iadministrareaTTP la o doză zilnică de 5mg în tablete. S-au efectuat două regimuri diferite de administrare. Două dintre voluntare (numite în continuare B.K și J.Z.J.) au fost supuse unui tratament cu TTP care constă din trei cicluri de câte 7 zile: medicamentul a fost administrat per os, zilnic, o tabletă de 5 mg timp de o săptămână, urmat de o perioadă de repaus de 7 zile, apoi o nouă perioadă de 7 zile de administrare orală a TTP. Dozajul total a fost de 21 de tablete. Celelalte două voluntare (numite în continuare A.D.I. și W.F) au fost tratate cu câte o tabletă TTP de 5 mg, zilnic, administrată per os, continuu timp de 3 săptămâni. Dozajul total a fost tot de 21 de tablete.

Tabletele TTP de 5 mg folosite au fost un produs comercial standard. Fiecare tabletă conține 5 mg TTP, 43 mg lactoză și 2 mg MYVATEX. Pentru a stimula citokinele în PBL în culturi vitro s-a folosit TTP pudră, ca substanță pură, sub formă de soluție conținând 20 mg TTP/ml de apă distilată, fără pirogen, stocată la 4°C.

Probele de sânge prelevate de la voluntare au fost heparinizate cu soluție, fără conservante, la o concentrație finală de 10 unități/ml și tratate după cum s-a descris anterior pentru a prepara o cultură PBL in vitro, care a fost apoi tratată cu stimulatori de citokina PHA, LPS și TTP, într-un mod descris în exemplele precendente. In concluzie, 200 pg de cultură au fost folosite la fiecare tratament. Soluțiile centrifugate au fost tratate la frig (la 4°C), testate pentru IFN timp de o săptămână, stocate la -20°C și încercate, respectiv pentru TNF, pentru a preveni inactivarea datorită proteolizei spontane.

IFN și TNF au fost testate în același mod ca mai sus. Rezultatele obținute sunt prezentate în anexele, Figurile 8 ... 13 (răspunsul culturilor PBL ale diferitelor paciente la stimulatorii IFN și la cei ai TNF în timpul administrării orale a TTP).

După cum se poate vedea din datele Figurile 8 și 9, răspunsul IFN a primului grup de voluntare, în timpul ciclului de administrare scade și se întoarce la valoarea inițială după pauza de 2 săptămâni. Din contra, răspunsul TNF a arătat, în Figurile 10 și 11, o creștere pe durata administrării TTP și revine la nivelul normal după 2 săptămâni pauză.

Deci datele din fig. 12 și 13, arată că răspunsurile la stimularea citokinelor pe altă cale de administrare la voluntara A.D.I. dovedește că starea de hiporeactivitate la inducția IFN este atinsă după 3 săptămâni de adminsitrare continuă a TTP oral. Starea de hiporeactivitate indicată ca pierdere a capacității culturilor PBL de a răspunde inducției IFN cu soluția TTP dispare după 2 săptămâni de pauză. Din contră, în timpul celor 3 săptămâni de administrare I IP, hiporeactivitatea la inducția TNF nu s-a dezvoltat (fig. 12).

770

775

780

785

790

795

800

805

810

RO 114837 Bl

Reultatele de mai jos indică faptul că doza optimă de imunomodulator, pentru a fi stimulator citokinic, poate fi stabilită individual pentru fiecare pacient tratat, cu un test PBL simplu, conform prezentei invenții.

Claims (9)

1. Revendicări

   1. Metodă pentru determinarea activității imunologice a substanțelor care induc citokina, caracterizată prin aceea că:

   a) o cultură de celulă, cuprinzând leucocite din sânge periferic uman (PBL) obținută de la donatori care nu au hiporeactivitate la inducerea interferonului, este preparată cu un mediu nutritiv nemitogenic favorabil pentru cultura de țesut preferabil conținând RPMI-1640 mediu, cu un adaos de 10% ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de circa 8x10⁶ leucocite/ml sau

   b) o suspensie de celule rezidente peritoneal (RPC) de la șoarece BALB/c, care nu este stimulată imunologic sau care nu prezintă o producție spontană foarte ridicată de citokina, este preparată cu un mediu nutritiv nemitogenic favorabil pentru cultura de țesut, preferabil conținând RPMI-1640 mediu cu un adaos de 10% de ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de aproximativ 1-2x10¹⁰ celule/ml la care cultura celulei a) sau suspensia celulei b) este tratată cu o soluție din respectiva substanță, preferabil conținând un mediu nutritiv Eagle sau RPMI-1640 și 0,1 ... 200 pg din respectiva substanță pe ml soluție pentru a induce avantajos după o perioadă de incubație de 12 la 24 ore, producerea de citokine care apoi sunt determinate în conformitate cu metodele de identificare din stadiul tehnicii, incluzând de preferință un control pozitiv și un control negativ.
2. 2. Metodă conform cu revendicarea 1, caracterizată prin aceea că citokinele determinate conțin interferon și factor de necroză tumorală.
3. 3. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că substanța este selectată din grupul constând din extract de turbă, o fracțiune din extractul de turbă și un anumit produs derivat din turbă (TTP).
4. 4. Metodă conform revendicării 1, caracteirzată prin aceea că un amplificator sintetic nepeptidic este adăugat la respectiva soluție, acest amplificator fiind de preferință selectat din grupul constând dintr-un medicament nesteroidal, antiinflamator inhibitor al sintezei postaglandinei un compus organic cu seleniu ca cel descris anterior, un derivat de isotiazol, și analogi, omologi și metaboliți ai acestora, și cel mai preferabil fiind alt compus ITCL sau indometacin.
5. 5. Metodă pentru determinarea răspunsului imunologic în tratamentul cu o substanță care induce citokină, caracterizată prin aceea că:

   a) pacientul este supus unui tratament repetat cu respectiva substanță;

   b) cultura de leucocite din sângele periferic (PBL) este obținută de la acest pacient;

   c) o soluție dintr-o astfel de substanță este adăugată la această cultură (PBL) ca să inducă citokino conținând interferon și preferabil factor de necroză tumorală.

   d) citokinele sunt apoi determinate în conformitate cu metodele de identificare din stadiul tehnicii, pentru a recunoaște când apare hipoactivitatea la inducerea interferonului cu o doză suplimentară din această substanță și pentru a

   RO 114837 Bl determina când pacientul recapătă capacitatea să răspundă la o altă doză de substanță după o perioadă de pauză.
6. 6. Metodă conform cu revendicarea 5, caracterizată prin aceea că substanța este selectată din grupul constând din extract de turbă, o fracțiune din extract de turbă și un anumit produs derivat din turbă (TTP).
7. 7. Compoziție pentru aplicarea metodei conform cu revendicările 1 sau 5, caracterizată prin aceea că conține cultură de celule de leucocite din sânge periferic uman (PBL) obținut de la donatori care nu sunt hiporeactivi la inducerea iterferonului.și un mediu nutritiv nemitogenic potrivit pentru cultura de celule tisulare, preferabil conținând RPMI-1640 mediu cu un adaos de 10% de ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de aproximativ 8x10⁶ leucocite.
8. 8. Compoziție pentru aplicarea metodei conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că conține o suspensie de celule rezidente peritoneal (RPC) care nu sunt stimulate imunologic sau care nu prezintă o producție spontană foarte ridicată de citokină și un mediu nutritiv nemitogenic favorabil pentru cultura de celule tisulare preferabil conținând RPMI-1640 mediu cu un adaos de 10% ser de făt de vițel nemitogenic și o densitate a celulei de aproximativ 1-2x10⁶ celule/ml.
9. 9. Compoziție conform cu revendicările 7 și 8 caracterizată prin aceea că mai departe conține un amplificator sintetic nepeptidic preferabil selectat din grupul constând dintr-un medicament nesteroidal antiinflamatoriu și inhibitor al sintezei prostaglandinei și un compus organic cu seleniu, un derivat de isotiazol și analogi, omologi și metaboliți ai acestora și cel mai preferabil fiind alt compus ITCL sau indometacin.