BR112012000260B1

BR112012000260B1 - célula hospedeira microbiana transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, para fermentar um material celulósico, construções de ácido nucleico, vetor de expressão, polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica, e, polinucleotídeo isolado que codifica o mesmo

Info

Publication number: BR112012000260B1
Application number: BR112012000260-0A
Authority: BR
Inventors: Ye Liu; Lan Tang; Wenping Wu; Jason Quinlan; Randall Kramer
Original assignee: Novozymes A/S; Novozymes, Inc.
Priority date: 2009-07-07
Filing date: 2010-07-07
Publication date: 2020-11-17
Also published as: EP2451957B1; WO2011005867A8; BR112012000260A2; US8242328B2; EP2451957A1; WO2011005867A1; US20110010805A1; US20120185970A1; US8465949B2; CN102597243B; US8143021B2; CA2767169A1; DK2451957T3; CN102597243A; US20130045505A1; BR112012000260A8

Abstract

CÉLULA HOSPEDEIRA MICROBIANA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR EM POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CÉLULA PRECURSORA, PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA PARA DEGRADAR OU CONVERTER UMA MATERIAL CELULÓSICO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO PARA FERMENTAR UM MATERIAL CELULÓSICO,CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEÍCO, VETOR DE EXPRESSÃO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO TENDO ATIVIDADE DE INTENSIFICAÇÃO CELULOLÍTICA E, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO QUE CODIFICA O MESMO. A presente invenção diz respeito a polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz rspeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim com aos métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Description

Declaração dos Direitos às Invenções Feitas Sob Pesquisa e Desenvolvimento Patrocinados pelo Governo Federal

Esta invenção foi feita parcialmente com o suporte do Governo sob Acordo Cooperativo DE-FC36-08GO18080 outorgado pelo Department of Energy. O governo tem certos direitos nesta invenção.

Referência a uma Listagem de Sequência

Este pedido contêm uma Listagem de Sequência na forma legível por computador, que é aqui incorporada por referência.

Referência a um Depósito de Material Biológico

Este pedido contém uma referência a um depósito de Material Biológico, depósito este que é aqui incorporado por referência.

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada

A celulose é um polímero do açúcar simples glicose ligado pelas ligações beta-1,4. Muitos micro-organismos produzem enzimas quehidrolisam glicanos ligados em beta. Estas enzimas incluem endoglicanases, celobio-hidrolases, e beta-glicosidases. As endoglicanases digerem o polímero celulose em locais aleatórios, abrindo-os ao ataque pelas celobio- hidrolases. As celobio-hidrolases sequencialmente liberam moléculas de celobiose das extremidades da celulose polimérica. A celobiose é um dímero ligado em beta-1,4 solúvel em água de glicose. As beta-glicosidases hidrolisam celobiose para glicose.

A conversão de estoques de alimentação lignocelulósicos em etanol tem as vantagens da pronta disponibilidade de quantidades grandes de estoque de alimentação, a desejabilidade de evitar a queima ou descarte em aterro sanitário dos materiais, e a limpeza do combustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, safras herbáceas, e resíduos sólidos municipais têm sido considerados como estoques de alimentação para a produção de etanol. Estes materiais primariamente consistem de celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que a celulose é convertida para glicose, a glicose é facilmente fermentada pela levedura em etanol.Seria vantajoso na técnica melhorar a capacidade para degradar enzimaticamente estoques de alimentação lignocelulósicos.

A WO 2005/074647 divulga polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos destes de Thielavia terrestris. A WO 2005/074656 divulga um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e o polinucleotídeo deste de Thermoascus aurantiacus. A WO 2007/089290 divulga um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e o polinucleotídeo deste de Trichoderma reesei.

A presente invenção provê polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

Sumário da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica selecionados do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80 % identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alta estringência com (i) a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) o filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii);

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % identidade de sequência com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA;

(d) uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e

(e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de intensificação celulolítica.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construções de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir os polipeptídeos.

A presente invenção também diz respeito a métodos para degradar ou converter um material celulósico, que compreendem: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método compreende ainda recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um produto de fermentação, que compreendem: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais micro-organismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito a métodos de fermentar um material celulósico, que compreendem: fermentar o material celulósico com um ou mais micro-organismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação. Em um outro aspecto, o método compreende ainda recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 21 de SEQ ID NO: 2, que é operavelmente ligada a um gene que codifica uma proteína; construções de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes que compreendem o polinucleotídeo; e métodos de produzir uma proteína.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a sequência de DNA genômico e a sequência de aminoácido deduzida de um gene da cepa NN046877 de Penicillium pinophilum que codifica um polipeptídeo GH61A tendo atividade de intensificação celulolítica (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).

A Figura 2 mostra um mapa de restrição de pPFJO355.

A Figura 3 mostra um mapa de restrição de pPpin7.

A Figura 4 mostra um mapa de restrição de pGEM-T-Ppin7.

A Figura 5 mostra a hidrólise vs. concentração do polipeptídeo GH61A de Penicillium pinophilumadicionado tendo atividade de intensificação celulolítica. Círculos abertos: grau de hidrólise de 3 dias; círculos fechados: grau de hidrólise de 7 dias. Dados não corrigidos quanto aos açúcares presentes no líquido de PCS. Os dados são ajustados com um modelo modificado, não cooperativo, de saturação-aglutinação.

Definições

Atividade de intensificação celulolítica: O termo “atividade de intensificação celulolítica” significa uma atividade biológica catalisada por um polipeptídeo GH61 que intensifica a hidrólise de um material celulósico pela enzima tendo atividade celulolítica. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de intensificação celulolítica é determinada medindo-se o aumento nos açúcares redutores ou o aumento do total de celobiose e glicose da hidrólise de um material celulósico pela enzima celulolítica sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida de 50 a 99,5 % p/p de proteína de enzima celulolítica e 0,5 a 50 % p/p proteína de um polipeptídeo GH61 tendo atividade de intensificação celulolítica por 1 a 7 dias a 50°C comparada a uma hidrólise de controle com carga de proteína total igual sem atividade de intensificação celulolítica (1 a 50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST® 1,5L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) na presença de 2 a 3 % de peso de proteína total de beta-glicosidade de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com a WO 02/095014) ou 2 a 3 % de peso de proteína total de beta-glicosidade de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzidos em Aspergillus oryzae como descrito na WO 2002/095014) de carga de proteína de celulase são usados como a fonte da atividade celulolítica.

Os polipeptídeos GH61 tendo atividade de intensificação celulolítica intensificam a hidrólise de um material celulósico catalisado pela enzima tendo atividade celulolítica pela redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para atingir o mesmo grau de hidrólise preferivelmente pelo menos 1,01 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,05 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,10 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, e o mais preferivelmente pelo menos 20 vezes.

Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %, por exemplo pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e pelo menos 100 % da atividade de intensificação celulolítica do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Família 61 da glicosídeo hidrolase: O termo “Família 61 da glicosídeo hidrolase” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que cai dentro da Família 61 da glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosil hydrolases com base em amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosil hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglicanase(s), celobio-hidrolase(s), beta-glicosidade(s), ou combinações destas. Os dois métodos básicos para medir a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total, e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglicanases, celobio-hidrolases, e beta-glicosidades) como revisado em Zhang et al., Outlook for cellulase melhora: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é usualmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman Nθ 1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose algal, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio da atividade celulolítica total mais comum é o ensaio do papel de filtro usando papel de filtro Whatman N° 1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).Para os propósitos da presente invenção, a atividade da enzima celulolítica é determinada medindo-se o aumento na hidrólise de um material celulósico pela(s) enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1 a 20 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em PCS por 3 a 7 dias a 50°C comparada a uma hidrólise de controle sem a adição de proteína de enzima celulolítica. As condições típicas são reações de 1 ml, PCS lavada ou não lavada, 5 % de sólidos insolúveis, 50 mM de acetato de sódio pH 5, 1 mM de MnSO4, 50°C, 72 horas, análise de açúcar pela coluna AMINAX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Endoglicanase: O termo “endoglicanase” significa uma endo- l,4-(l,3;l,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3,2,1,4), que catalisa endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal, e outros materiais vegetais contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglicanase pode ser determinada medindo-se a redução na viscosidade do substrato ou aumento nas extremidades redutoras determinada por um ensaio de açúcar redutor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para os propósitos da presente invenção, a atividade de endoglicanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268, no pH 5, 40°C.

Celobio-hidrolase: O termo “celobio-hidrolase” significa uma 1,4-beta-D-glicano celobio-hidrolase (E.C. 3,2,1,91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celooligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glicose ligado em 1,4-beta, que libera celobiose das extremidades redutoras e não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohidrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). Para os propósitos da presente invenção, a atividade de celobio-hidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos por Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Lever et al.pode ser utilizado para avaliar a hidrólise de celulose em forragem de milho, enquanto que os métodos de van Tilbeurgh et al. e Tomme et al.podem ser usados para determinar a atividade de celobio-hidrolase em um derivado de dissacarídeo fluorescente, 4-metilumbeliferil-β-D-lactosideo.

Beta-glicosidade: O termo “beta-glicosidade” significa uma beta-D-glicosídeo glicoidrolase (E.C. 3,2,1,21), que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D- glicose. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de beta- glicosidade é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al.,2002, Extracellular beta-D-glucosidade from Chaetomium thermophilum var. coprophilum',produção, purification and some biochemical propriedades, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidade é definida como 1,0 pmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 25°C, pH 4,8 de 1 mM de p-nitrofenil-beta-D-glicopiranosídeo como substrato em 50 mM de citrato de sódio contendo 0,01 % de TWEEN® 20.

Enzima hemicelulolitica on hemicelulase: Os termos “enzima hemicelulolitica” ou “hemicelulase” significam uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom, D. e Shoham, Y. Microbial hemicellulases. Current Opinion In Microbiology, 2003, 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação de biomassa vegetal. Os exemplos de hemicelulases incluem, mas não são limitados a, uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase, e uma xilosidase. Os substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo hetrerogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por intermédio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede da célula vegetal, reticulando-as em uma rede robusta. As hemiceluloses também são covalentemente ligadas à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e a organização das hemiceluloses requerem a ação combinada de muitas enzimas para a sua degradação completa. Os módulos catalíticos das hemicelulases são glicosídeo hidrolases (GHs) que hidrolisam ligações glicosídicas, ou carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam as ligações de grupos laterais de éster de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser designados dentro das famílias GH e CE marcados pelos números. Algumas famílias, com dobra similar global, podem ser agrupadas ainda em clãs, alfabeticamente marcados (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidrato está disponível na base de dados Carbohidrate-Active Enzymes (CAZy). As atividades de enzimas hemicelulolíticas podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & Appl. Chem. 59: 1739-1752.Atividade que degrada xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade que degrada xilano” ou “atividade xilanolítica” significam uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano. Os dois métodos básicos para medir a atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (por exemplo, endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa- glicuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glicuronil esterases). Progresso recente nos ensaios de enzimas xilanolíticas foi resumido em várias publicações incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xilanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glucuronoil esterase - Novel carbohidrate esterase produzida by Schizophillum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, e Kubicek, 1997, The beta-D-xilosydase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xilano xilohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

A atividade que degrada xilano total pode ser medida determinando-se os açúcares redutores formados de vários tipos de xilano, incluindo, por exemplo, xilanos de forragem de aveia, madeira de faia, e madeira de lariço, ou pela determinação fotométrica de fragmentos de xilano tingidos liberados de vários xilanos covalentemente tingidos. O ensaio de atividade xilanolítica total mais comum é fundamentado na produção de açúcares redutores de 4-O-metil glicuronoxilano polimérico como descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of métodos for assay of xilanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de xilanase também pode ser determinada com 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em 0,01 % de Triton X-100 e 200 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 pmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6 de 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em 200 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6.Para os propósitos da presente invenção, a atividade que degrada xilano é determinada medindo-se o aumento na hidrólise de xilano da madeira do vidoeiro (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) pela(s) enzima(s) que degradam xilano sob as seguintes condições típicas: reações de 1 ml, 5 mg/ml de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolitica /g de substrato, 50 mM de acetato de sódio pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio da hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohidrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilan- xiloidrolase (E.C. 3,2,1,8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosidicas em xilanos. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em 0,01 % de Triton X-100 e 200 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 jumol de azurina produzido por minuto a 37°C, pH 6 a partir de 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em 200 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6.

Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta- D-xiloside xiloidrolase (E.C. 3,2,1,37) que catalisa a exo-hidrólise de beta (1—»4)-xilooligossacarídeos curtos, para remover resíduos de D-xilose sucessivos dos terminais não redutores. Para os propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 pmol do ânion de p-nitrofenolato produzido por minuto a 40°C, pH 5 a partir de 1 mM de p- nitrofenil-beta-D-xilosídeo como substrato em 100 mM de citrato de sódio contendo 0,01 % de TWEEN® 20.

Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3,1,1,72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila, e acetato de p-nitrofenila. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxilano esterase é determinada usando 0,5 mM de acetato de p-nitrofenila como substrato em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 contendo 0,01 % de TWEEN® 20. Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ânion p- nitrofenolato por minuto no pH 5, 25°C.

Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma 4- hidróxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3,1,1,73) que catalisa a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) de um açúcar esterificado, que é usualmente arabinose em substratos “naturais”, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato). A feruloil esterase também é conhecida como ácido ferúlico esterase, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, éster cinamoílico hidrolase, FAEA, cinAE, FAE-I, ou FAE-II. Para os propósitos da presente invenção, a atividade da feruloil esterase é determinada usando 0,5 mM de p-nitrofenilferulato como substrato em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0. Uma unidade de feruloil esterase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ânion p-nitrofenolato por minuto no pH 5, 25°C.

Alfa-glicuronidase: O termo “alfa-glicuronidase” significa uma alfa-D-glicosiduronato glicuronoidrolase (EC 3,2,1,139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glicuronosídeo para D-glicuronato e um álcool. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glicuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glicuronidase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmol de ácido glicurônico ou 4-O-metilglicurônico por minuto no pH 5, 40°C.

Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L-arabino- furanosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofurano- hidrolase (EC 3,2,1,55) que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L- arabinofuranosídeo não redutores terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima atua sobre alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanas contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos, e arabinogalactanas. A alfa-L- arabinofuranosidase também é conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Para os propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano do trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por ml de acetato de sódio a 100 mM pH 5 em um volume total de 200 pl por 30 minutos a 40°C seguido pela análise de arabinose pela cromatografia em coluna AMINAX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).Material celulósico: O material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede de célula primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose, e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida depois que a célula parou de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada pela lignina polimérica covalentemente reticulada à hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-D- glicano linear, enquanto que as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos, e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora geralmente polimorfa, a celulose é encontrada no tecido vegetal primariamente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. As hemiceluloses usualmente ligam hidrogênio à celulose, assim como às outras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular.

A celulose é geralmente encontrada, por exemplo, nas hastes, folhas, palhas, cascas, e sabugos de plantas ou folhas, ramos, e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não é limitado a, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduos sólidos municipais, papel residual, e polpa e resíduo de moinho de papel (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioetanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Tailor &Francis, Washington D. C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor geral, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). E aqui entendido que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material da parede da célula vegetal contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemicelulose e lignina.

Em um aspecto, o material celulósico é material herbáceo. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo florestal. Em um outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel residual. Em um outro aspecto, o material celulósico é polpa e resíduo de moinho de papel.

Em um outro aspecto, o material celulósico é forragem de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é sabugo de milho. Em um outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em um outro aspecto, o materialcelulósico é palha de arroz. Em um outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo. Em um outro aspecto, o material celulósico é o painço amarelo. Em um outro aspecto, o material celulósico é eulália. Em um outro aspecto, o material celulósico é bagaço.

Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose algal. Em um outro aspecto, o material celulósico é fiapo de algodão. Em um outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico amorfo. Em um outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro.

O material celulósico pode ser usado como tal ou pode ser submetido ao pré-tratamento, usando os métodos convencionais conhecidos na técnica, como aqui descrito. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado.

Forragem de milho pré-tratada: Os termos “PCS” ou “Forragem de milho pré-tratada” significam um material celulósico derivado da forragem de milho pelo tratamento com calor e ácido sulfurico diluído.

Material contendo Xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material que compreende um polissacarídeo de parede de célula vegetal contendo uma cadeia principal de resíduos de xilose ligados em beta-(l-4). Xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma cadeia principal de beta-(l-4)-D-xilopiranose, que é ramificada pelas cadeias de carboidrato curtas. Eles compreendem o ácido D-glicurônico ou seu éster 4-O-metílico, L-arabinose, e/ou vários oligossacarídeos, compostos de D-xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose, e D-glicose. Os polissacarídeos do tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, que incluem glicuronoxilanos, (arabino)glicuronoxilanos, (glicurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos, e heteroxilanos complexos. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polim. Sei. 186: 1-67.

No métodos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado. Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

Isolado ou Purificado: Os termos “isolado” ou “purificado” significam um polipeptídeo ou polinucleotídeo que é removido de pelo menos um componente com o qual o mesmo esta naturalmente associado. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 % puro, como determinado pela SDS-PAGE e um polinucleotídeo pode ser pelo menos 1 % puro, por exemplo, pelo menos 5 % puro, pelo menos 10 % puro, pelo menos 20 % puro, pelo menos 40 % puro, pelo menos 60 % puro, pelo menos 80 % puro, pelo menos 90 % puro, ou pelo menos 95 % puro, como determinado pela eletroforese de agarose.

Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo na sua forma fmal a seguir da tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, tais como processamento de terminal N, truncagem de terminal C, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos de 22 a 322 de SEQ ID NO: 2 com base no programa de SignalP (Nielsen et al., 1997, Proteína Engineering 10: 1-6) que prognostica os aminoácidos de 1 a 21 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal. E conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido de terminal C e/ou terminal N diferente) expressado pelo mesmo polinucleotídeo.

Sequência que codifica polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto, a sequência que codifica polipeptídeo maduro éos nucleotídeos de 64 a 1018 de SEQ ID NO: 1 com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prognostica nucleotídeos de 1 a 63 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptideo de sinal. Em um outro aspecto, a sequência que codifica polipeptídeo maduro é a sequência de cDNA contida nos nucleotídeos de 64 a 1018 de SEQ ID NO: 1.

Identidade de sequência: A relacionabilidade entre duas sequências de aminoácido ou entre duas sequências de nucleotídeo é descrita pelos parâmetros “identidade de sequência”.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácido é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente a versão 3.0.0 ou posteriores. Os parâmetros opcional usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). A saída do Needle rotulado “identidade mais longa” (obtida usando a opção -nobrief) é usado como a identidade percentual e é calculada como segue:(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeo é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente a versão 3.0.0 ou posteriores. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e o EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBINUC4.4). A saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:(Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento - Número total de Intervalos no Alinhamento)

Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo tendo um ou mais (vários) aminoácidos deletados do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento tem atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 255 resíduos de aminoácido, por exemplo, pelo menos 270 resíduos de aminoácido ou pelo menos 285 resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (vários) nucleotídeos deletados da extremidade 5 ’ e/ou 3 ’ de uma sequência que codifica polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto, uma subsequência contém pelo menos 765 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 810 nucleotídeos ou pelo menos 855 nucleotídeos da sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

Variante alélica: O termo “variante alélica” significa qualquer um de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através da mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou pode codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácido alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

Sequência codificadora: O termo “sequência codificadora” significa um polinucleotídeo, que diretamente especifica a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites de sequência codificadora são geralmente determinados por uma matriz de leitura aberta, que usualmente começa com o códon de partida ATG ou códons de partida alternativos tais como GTG e TTG e extremidades com um códon de parada tal como TAA, TAG, e TGA. A sequência codificadora pode ser um polinucleotídeo de DNA, cDNA, sintético ou recombinante.

cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, unida, obtida de uma célula eucariótica. O cDNA carece de sequências de íntron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário é um precursor para o mRNA que é processado através de uma série de etapas, incluindo a junção, antes de aparecer como mRNA unido maduro.

Construção de ácido nucleico: O termo “construção de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de filamento único ou duplo, que é isolado de um gene que ocorre naturalmente ou é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos em uma maneira que de outro modo não existiriam na natureza ou que são sintéticos. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo com o termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucleico contém as sequências de controle requeridas para a expressão de uma sequência codificadora da presente invenção.

Sequências de controle: O termo “sequências de controle” significa todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranha ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativo ou estranho entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não são limitados a, uma sequência líder, sequência de poliadenilação, sequência pró-peptídeo, promotor, sequência de sinal de peptídeo, e terminador de transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada transcricional e traducional. As sequências de controle podem ser fornecidas com ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação de sequências de controle com a região codificadora do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificadora de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle direciona a expressão de sequência codificadora.

Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- traducional e secreção.

Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e é operavelmente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem a sua expressão.

Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que seja suscetível à transformação, transfecção, transdução, e outros com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer progénie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação.

Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica que compreende uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou deleção de um ou mais (vários) resíduos de aminoácido em uma ou mais (várias) posições. Uma substituição significa uma substituição de um aminoácido que ocupa uma posição com um aminoácido diferente; uma deleção significa a remoção de um aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar um ou mais (vários) aminoácidos, por exemplo, de 1 a 5 aminoácidos, adjacentes a um aminoácido que ocupa uma posição.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos Tendo Atividade de intensificação Celulolítica

A presente invenção diz respeito aos polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica selecionados do grupo que consiste de

(a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;

(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA;

(e) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de intensificação celulolítica.

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou pelo menos 100 %, que têm atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto, o polipeptídeos difere em não mais do que dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos, e em um aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende ou consiste de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou é um fragmento desta tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende ou consiste dos aminoácidos de 22 a 322 de SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica que são codificados pelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência alta ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) o filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii) (J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta, assim como a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento desta, podem ser usados para planejar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar polipeptídeos que codificam DNA tendo atividade de intensificação celulolítica de cepas de gêneros ou espécies diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o DNA genômico ou cDNA do gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de Southern blotting padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente nesse ponto. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 14, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos no comprimento. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos no comprimento. Tanto a sonda de DNA quanto a de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com P, H, S, biotina, ou avidina). Tais sondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras cepas pode ser triada quanto a DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. O DNA genômico ou outro DNA de tais outras cepas podem ser separados pela eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado podem ser transferidos para e imobilizados em nitrocelulose ou outro material carregador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que sejam homólogos com a SEQ ID NO: 1 ou uma subsequência desta, o material carregador é preferivelmente usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza a uma sonda de ácido nucleico rotulada que corresponde à SEQ ID NO: 1; à sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; à sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; seu filamento complementar de comprimento total; ou uma subsequência desta; sob condições de estringência muito baixa a muito alta. As moléculas às quais a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, película de raio X.

Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro desta; ou um fragmento desta. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é o polinucleotídeo contido no plasmídeo pGEM-T-Ppin7 que está contido na E. coli DSM 22711, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é o polipeptídeo maduro que codifica a região contida no plasmídeo pGEM-T-Ppin7 que está contido na E. coli DSM 22711.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento, as condições de estringência muito baixa a muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 microgramas/ml de DNA de esperma de salmão cortado e desnaturado, e 25 % de formamida para as estringências muito baixas e baixas, 35 % de formamida para estringências médias e média-altas, ou 50 % de formamida para estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos de Southern blottingpadrão por 12 a 24 horas de modo ideal. O material carregador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando 2X SSC, 0,2 % de SDS a 45°C (estringência muito baixa), a 50°C (estringência baixa), a 5 5°C (estringência média), a 60°C (estringência média- alta), a 65°C (estringência alta), e a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos no comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização e hibridização em cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo da Tm calculada usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 1390) em NaCl 0,9 M, Tris-HCl 0,09 M pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blottingpadrão por 12 a 24 horas de modo ideal. O material carregador é finalmente lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1 % de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada.

A presente invenção também diz respeito aos polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica codificados pelos polinucleotídeos tendo uma identidade de sequência à sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.

A presente invenção diz respeito às variantes que compreendem uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência homóloga desta. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é substituições ou inserções de aminoácido conservativas que não afetam significantemente a dobra e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina no terminal de amino; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação pela mudança da carga líquida ou uma outra função, tal como um trato de poli- histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituções de aminoácido que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, Em, The proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças que ocorrem mais habitualmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

Altemativamente, as mudanças de aminoácido são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato, mudar o pH ideal, e outros.

Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo precursor pode ser identificado de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese loco-dirigida ou mutagênese de varredura alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de intensificação celulolítica para identificar resíduos de aminoácido que são críticas para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinada pela análise física da estrutura, como

TI determinada por técnicas tais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou rotulação de fotoafmidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas da análise de identidades com polipeptídeos que são relacionados com o polipeptídeo precursor.

As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido únicas ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de triagem relevante, tal como aquele divulgado por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erro, demonstração de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; Patente U.S. N° 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de triagem de alto rendimento, automatizados para detectar atividade de polipeptídeos clonados, mutageneizados expressados pelas células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893- 896). As moléculas de DNA mutageneizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuais em um polipeptídeo.O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 não é maior do que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9.

O polipeptídeo pode ser polipeptídeo híbrido em que uma porção de um polipeptídeo é fundida no terminal N ou no terminal C de uma porção de um outro polipeptídeo.

O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fundido ou polipeptídeo de fusão clivável em que um outro polipeptídeo é fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo fundido é produzido pela fusão de um polinucleotídeo que codifica um outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidos na técnica, e incluem ligar as sequência codificadoras que codificam os polipeptídeos de modo que eles estejam na matriz e que a expressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. As proteínas de fusão também podem ser construídas usando a tecnologia da inteína em que as fusões são criadas pós-traducionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

Um polipeptídeo de fusão pode compreender ainda um sítio de divagem entre os dois polipeptídeos. Na secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado que libera os dois polipeptídeos. Os exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não são limitados aos sítios divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505- 512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de intensificação CelulolíticaUm polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção pode ser obtido a partir de micro-organismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de” como aqui usado em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa em que o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram-positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphilococcus, Streptococcus,ou Streptomycestendo atividade de intensificação celulolítica, ou um polipeptídeo bacteriano gram-negativo tal como um polipeptídeo de Campilobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella,ou Ureaplasma.

Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

O polipeptídeo também pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces,

Schizosaccharomyces, ou Yarrowia;ou um polipeptídeo fúngico filamentoso tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium,

Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophillum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xilaria.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Penicillium.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminaarum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Penicillium pinophilum.

Será entendido que para as espécies anteriormente mencionadas a invenção abrange tanto o estado perfeito quanto o imperfeito, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente do nome da espécie pelo qual são conhecidos. Aqueles habilitados na técnica facilmente reconhecerão a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismoen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

O polipeptídeo pode ser identificado e obtido de outras fontes incluindo micro-organismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc), usando as sondas mencionadas acima. Técnicas para isolar micro-organismos de habitats naturais são bem conhecidas no ramo. O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser depois obtido triando-se similarmente uma biblioteca genômica ou de cDNA de um outro micro-organismo ou amostra de DNA misturada. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se técnicas que são bem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo são conhecidos na técnica e incluem isolação de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação destas. A clonagem dos polinucleotídeos de tal DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando-se a reação da cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida ou triagem de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como reação da cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada na ligação (LAT) e amplificação com base em polinucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados de uma cepa de Penicillium, ou um outro ou organismo relacionado e assim, por exemplo, pode ser uma espécie alélica ou variante da região que codifica o polipeptídeo do polinucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que compreendem ou que consistem de polinucleotídeos tendo um grau de identidade de sequência para a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA de pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica.

A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas que não ocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir em algum modo engendrado do polipeptídeo isolado da sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ideal, ou semelhante. A variante pode ser construída com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sua sequência de cDNA, por exemplo, uma subsequência desta, e/ou pela introdução das substituições de nucleotídeo que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácido do polipeptídeo, mas que corresponde ao uso do códon do organismo hospedeiro intencionado para a produção da enzima, ou pela introdução de substituições de nucleotídeo que pode dar origem a uma sequência de aminoácido diferente. Para uma descrição feral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de estringência alta, ou condições de estringência muito alta com (i) a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) o filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii); ou variantes alélicas e subsequências destas (Sambrook et al., 1989, supra), como aqui definido.

Em um aspecto, o polinucleotídeo compreende ou consiste de SEQ ID NO: 1, a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência contida no plasmídeo pGEM-T-Ppin7 que está contido na E. coli DSM 22711; ou uma subsequência de SEQ ID NO: 1 que codifica um fragmento de SEQ ID NO: 2 tendo atividade de intensificação celulolítica.

Construções de Ácido Nucleico

A presente invenção também diz respeito às construções de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligadas a uma ou mais (várias) sequências de controle que direciona a expressão de sequência codificadora em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modos para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidos na técnica.

A sequência de controle pode ser uma sequência promotora, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. A sequência promotora contém sequências de controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra atividade transcricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e podem ser obtidos de genes que codificam polipeptídeos extracelular ou intracelular homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa- amilase de Bacillus amiloliquefaciens (amyQ), gene da alfa-amilase de

Bacillus licheniformis (amil), gene da penicilinase do Bacillus licheniformis (penP), gene da amilase maltogênica do Bacillus stearothermophilus (amyM), gene da levansucrase Bacillus subtilis (sacB), genes xilA e xilB Bacillus subtilis, operon lac de E. coli, gene agarase Streptomyces coelicolor (dagA), e gene beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Outros promotores são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácido de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae,protease equivalente a tripsina de Fusarium oxisporum (WO 96/00787), amiloglicosidade de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidade de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase II de Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei, endoglicanase IV de Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene que codifica uma alfa-amilase neutra em Aspergillus em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene que codifica triose fosfate isomerase em Aspergillus; os exemplos não limitantes incluem promotores modificados do gene que codifica a alfa-amilase neutra em Aspergillus niger em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene que codifica a triose fosfate isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae)', e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinase Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1), e 3- fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

A sequência de controle também pode ser uma sequência terminadora de transcrição adequada, que é reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência terminadora é operavelmente ligada ao terminal 3’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para a antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidade de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae,e protease equivalente à tripsina de Fusarium oxisporum.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1), e gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase de Saccharomyces cerevisiae.Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência de controle também pode ser uma sequência líder adequada, quando transcrita é uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é operavelmente ligada ao terminal 5’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada.

Os líderes preferidos para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes para a TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

A sequência de controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada ao terminal 3’ do polinucleotídeo e, quando transcrito, é reconhecido pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada.

As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans,protease equivalente à tripsina de Fusarium oxisporum, e alfa-glicosidade de Aspergillus niger.

As sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

A sequência de controle também pode ser uma região de peptídeo de sinal codificadora que codifica um peptídeo de sinal ligado ao terminal N de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeo no trajeto secretor da célula. A extremidade 5’ de sequência codificadora do polinucleotídeo pode inerentemente conter uma sequência codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligada na matriz de leitura de tradução com o segmento de sequência codificadora que codifica o polipeptídeo. Altemativamente, a extremidade 5’ de sequência codificadora pode conter uma sequência codificadora de peptídeo de sinal que é estranha à sequência codificadora. A sequência codificadora de peptídeo de sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificadora não contém naturalmente uma sequência codificadora de peptídeo de sinal. Altemativamente, a sequência codificadora de peptídeo de sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificadora de peptídeo de sinal natural de modo a intensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência codificadora de peptídeo de sinal que direciona o polipeptídeo expressado no trajeto secretor de uma célula hospedeira de escolha pode ser usada.

As sequências codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para as células hospedeiras bacterianas são as sequências codificadoras de peptídeo de sinal obtidas a partir do genes para amilase maltogênica de BacillusNCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis,beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus,proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

As sequências codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para as células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificadoras de peptídeo de sinal obtidas a partir dos genes para a amilase neutra de

Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglicanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

Os peptídeos de sinal úteis para as células hospedeiras de levedura são obtidas a partir dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificadoras de peptídeo de sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

A sequência de controle também pode ser uma sequência codificadora de propeptídeo que codifica um propeptídeo posicionado no terminal N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um propolipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido a um polipeptídeo ativo pela clivagem catalítica ou autocatalítica do propeptídeo do propolipeptídeo. A sequência codificadora de propeptídeo pode ser obtida a partir dos genes para a protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

Onde tanto a sequência de peptídeo de sinal quanto a de propeptídeo estão presentes no terminal N de um polipeptídeo, a sequência de propeptídeo é posicionada a seguir do terminal N de um polipeptídeo e a sequência de peptídeo de sinal é posicionada a seguir do terminal N de sequência de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar sequências reguladoras que permitem a regulagem da expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor da glicoamilase de Aspergillus niger,o promotor da TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae, e o promotor da glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que possibilitam a amplificação do gene, em sistemas eucarióticos, Estas sequências reguladoras incluem o gene da di-hidrofoliato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes da metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo seria operavelmente ligado com a sequência reguladora.

Vetores de expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcricionais e traducionais. Os vários nucleotídeos e sequências de controle podem ser unidos entre si para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para possibilitar a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica em tais sítios. Altemativamente, o polinucleotídeo pode ser expressado inserindo-se o polinucleotídeo ou uma construção de ácido nucleico que compreende a sequência em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificadora está localizada no vetor de modo que a sequência codificadora é operavelmente ligada com as sequências de controle apropriadas para a expressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode realizar a expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor tipicamente dependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor deva ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

O vetor pode ser um vetor que replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação do qual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma, ou um cromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) o mesmo foi integrado. Além disso, um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, pode ser usado.

O vetor preferivelmente contém um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene, o produto do qual fornece resistência a biocida ou virai, resistência aos metais pesados, prototrofia aos auxótrofos, e outros.

Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dalde Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibiótico tal como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, ou tetraciclina. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célula hospedeira filamentosa fúngica incluem, mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoil transferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pirG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), assim como equivalentes destes. Preferido para o uso em uma célula de Aspergillussão os genes amdS e pirG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

O vetor preferivelmente contém um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode contar com a sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma pela recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração pela recombinação homólogo no genoma da célula hospedeira em uma localização(ões) precisa(s) no cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos integracionais devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como de 100 a 10.000 pares de base, de 400 a 10.000 pares de base, e de 800 a 10.000 pares de base, que têm um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser polinucleotídeos não codificador ou codificador. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira pela recombinação não homóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender ainda uma origem de replicação que possibilita o vetor replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador plasmídico que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. Os termos “origem de replicação” ou “replicador plasmídico” significam um polinucleotídeo que possibilita um plasmídeo ou vetor replicar in vivo.

Os exemplos de origem bacteriana de replicação são as origens de replicação dos plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação na E. coli, e pUBl 10, pE194, pTA1060, e pAMBl que permitem a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem 2 micron de replicação, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). A isolação do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizadas de acordo com os métodos divulgados na WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópia do polinucleotídeo pode ser obtido pela integração de pelo menos uma cópia adicional de sequência no genoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e desse modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

A presente invenção também diz respeito às células hospedeiras recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Uma construção ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de modo que a construção ou vetor sejam mantidos como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico auto-replicante como descrito mais no princípio. O termo “célula hospedeira” abrange qualquer progénie de uma célula precursora que não é idêntica à célula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá um grande grau depende do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procariota ou um eucariota.

A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram positiva ou Gram negativa. As bactérias Gram positivas incluem, mas não limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphilococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não limitadas a, Campilobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillusincluindo, mas não limitado a, às células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula Streptococcusincluindo, mas não limitado a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não limitado a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

A introdução de DNA em uma célula de Bacillus,por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), pelo uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209- 221), pela eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou pela conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), pela conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou pela transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas,por exemplo, pode ser efetuada pela eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Métodos 64: 391-397) ou pela conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus,por exemplo, pode ser efetuada pela competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), pela transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-207), pela eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou pela conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

A célula hospedeira também pode ser uma eucariota, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta, ou fungo.

A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos” como aqui usado inclui os filós Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definidos por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assim como os Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura” como aqui usado inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencente aos Fungos Imperfeitos (Blastomycetes). Visto que a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A., Passmore, S. M., e Davenport, R. R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Série N2 9, 1980).

A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis ou Yarrowia lipolitica.

A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos Filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definida por Hawks worth et al., 1995, supra). Os fungos filamentoso são geralmente caracterizados por um composto de parede micelial de quitina, celulose, glicano, quitosano, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo pelas leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é pelo brotamento de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophillum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminaarum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergilluse Trichoderma são descritos na EP 238023 e Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474 e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar espécies de Fusariumsão descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J. N. e Simon, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Penicillium. Em um aspecto mais preferido, a célula é de Penicillium pinophilum. Em um aspecto mais preferido, a célula é de Penicilliumpinophilum NN46877.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo e (b) recuperar o polipeptídeo.

As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada pelo cultivo em frasco agitado, e fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lote, lote alimentado, ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizados em um meio adequado e sob condições que permitam que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não é secretado, o mesmo pode ser recuperado a partir de lisados de célula.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo.

O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas não limitados a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

Os polipeptídeos podem ser purificados por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, por troca iônica, por afinidade, hidrofóbica, por cromatofocalização, por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amónio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J. C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obter polipeptídeos substancialmente puros.

Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção que expressa o polipeptídeo usado como um fonte do polipeptídeo.

Plantas

A presente invenção também diz respeito a plantas isoladas, por exemplo, uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta, que compreendem um polinucleotídeo isolado da presente invenção assim como a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado a partir da planta ou parte de planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo podem ser usados como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou destruir um fator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot são gramas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), grama forrageira tal como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho (milho).

Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais como tremoço, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceaé), tais como couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Os exemplos de partes de planta são caule, calo, folhas, raiz, fruta, sementes, e tubérculos assim como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos de célula de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomas e citoplasma também são considerados ser uma parte de planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem tecidual, é considerado ser uma parte de planta. Do mesmo modo, partes de planta tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes de planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

Também incluídos dentro do escopo da presente invenção estão a progénie de tais plantas, partes de planta, e células de planta.

A planta transgênica ou célula de planta que expressam um polipeptídeo podem ser construídas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta são construídos pela incorporação de uma ou mais (várias) construções de expressão que codificam um polipeptídeo no genoma hospedeiro da planta ou genoma de cloroplasto e propagando a planta ou célula de planta modificadas resultantes em uma planta transgênica ou célula de planta.

A construção de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo operavelmente ligado com sequências reguladoras apropriadas requeridas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar células hospedeiras nas quais a construção de expressão foram integradas e as sequências de DNA necessárias para a introdução da construção dentro da planta em questão (o último depende do método de introdução de DNA a ser usado).

A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências de sinal ou trânsito, é determinada, por exemplo, com base de quando, onde, e como o polipeptídeo é desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser desenvolvimentalmente, específica de estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser alvejado a um tecido específico ou parte de planta tais como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, o promotor da ubiquitina 1 do milho, e o promotor da actina 1 do arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de depósito de armazenagem tais como sementes, tubérculos de batata, e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de depósito metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene da proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor napA da proteína de armazenagem de Brassica napus,ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, como descrito na WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor de rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene da adenina metiltransferase viral de chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor pin2 indutível por ferimento da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573- 588). Do mesmo modo, o promotor pode ser indutível pelos tratamentos abióticos tais como temperatura, seca, ou alterações na salinidade ou induzido pelas substâncias exogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios vegetais tais como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

Um elemento intensificador de promotor também pode ser usado para se obter expressão mais alta de um polipeptídeo na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.

O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma de planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas no ramo, incluindo transformação mediada por Agrobacterium,transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística eeletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Atualmente, a transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciensé o método de escolha para gerar dicots transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e também pode ser usada para transformar monocots, embora outros métodos de transformação sejam frequentemente usados para estas plantas. Atualmente, o método de escolha para gerar monocots transgênicas é o bombardeamento de partícula (partículas microscópicas de ouro ou tungsténio revestidas com o DNA transformador) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocots está fundamentado na transformação de protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos de transformação adicionais para o uso de acordo com a presente divulgação incluem aqueles descritos nas Patentes U.S. N~ 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade).

A seguir da transformação, os transformantes tendo incorporado a construção de expressão são selecionados e regerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente o procedimento de transformação é designado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas seguintes gerações usando-se, por exemplo, co-transformação com duas construções de T-DNA separadas ou excisão específica de sítio do gene de seleção por uma recombinase específica.

Além da transformação direta de um genótipo de planta particular com uma construção preparada de acordo com a presente invenção, as plantas transgênicas podem ser fabricadas cruzando-se uma planta tendo a construção com uma segunda planta que careça da construção. Por exemplo, uma construção que codifique um polipeptídeo pode ser introduzida em uma variedade de planta particular pelo cruzamento, sem a necessidade para transformar sempre diretamente uma planta daquela variedade dada. Portanto, a presente invenção abrange não apenas uma planta diretamente regerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progénie de tais plantas. Como aqui usado, progénie pode referir-se à descendência de qualquer geração de uma planta precursora preparada de acordo com a presente invenção. Tal progénie pode incluir uma construção de DNA preparada de acordo com a presente invenção, ou uma porção de uma construção de DNA preparada de acordo com a presente invenção. Cruzar resultados na introdução de um transgene em uma linhagem de planta pela polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora. Os exemplos não limitantes de tais etapas são articuladas ainda na Patente U.S. Ns 7.151.204.

As plantas podem ser geradas através de um processo de conversão retrocruzada. Por exemplo, as plantas incluem plantas aludidas como um genótipo convertido por retrocruzamento, linhagem, congênita, ou híbrida.

Os marcadores genéticos podem ser usados para ajudar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um fundo genético em um outro. A seleção assistida por marcador oferece vantagens relativas ao cruzamento convencional em que a mesma pode ser usada para evitar erros causados pelas variações fenotípicas. Além disso, marcadores genéticos podem fornecer dados com respeito ao grau relativo de germoplasma de elite na progénie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outro modo teria um fundo genético não agronomicamente desejável é cruzado com um precursor de elite, marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progénie que não apenas possui o traço de interesse, mas também têm uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Deste modo, o número de gerações requeridas para introgredir um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção que compreendem: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Remoção ou Redução da Atividade de intensificação Celulolítica

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir um mutante de uma célula precursora, que compreende romper ou deletar um polinucleotídeo, ou uma porção deste, que codifica um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula precursora quando cultivada sob as mesmas condições.

A célula mutante pode ser construída pela redução ou eliminação da expressão do polinucleotídeo usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições, ou deleções. Em um aspecto preferido, o polinucleotídeo é inativado. O polinucleotídeo a ser modificado ou inativado pode ser, por exemplo, a região codificadora ou uma parte desta essencial para a atividade, ou um elemento regulador requerido para a expressão da região codificadora. Um exemplo de uma tal sequência reguladora ou de controle pode ser uma sequência promotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão do polinucleotídeo. Outras sequências de controle para a modificação possível incluem, mas não são limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, sequência de peptídeo de sinal, terminador de transcrição, e ativador transcricional.

A modificação ou inativação do polinucleotídeo pode ser realizada submetendo-se a célula precursora à mutagênese e selecionar quanto a células mutantes em que a expressão do polinucleotídeo foi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutageneizante físico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado, ou submetendo-se a sequência de DNA à mutagênese gerada pela PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação destes agentes mutageneizantes.

Os exemplos de um agente mutageneizante físico ou químico adequado para o presente propósito incluem irradiação de ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, metano sulfonato de etila (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico, e análogos de nucleotídeo.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamente realizada incubando-se a célula precursora a ser mutageneizada na presença do agente mutageneizante de escolha sob condições adequadas, e triando-se e/ou selecionando-se quanto às células mutantes que exibem expressão reduzida ou nenhuma do gene.

A modificação ou inativação do polinucleotídeo podem ser realizadas pela introdução, substituição, ou remoção de um ou mais (vários) nucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido para a sua transcrição ou tradução. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, a remoção do códon de partida, ou uma mudança ma matriz de leitura aberta. Tal modificação ou inativação podem ser realizadas pela mutagênese loco- dirigida ou mutagênese gerada pela PCR de acordo com métodos conhecidos no ramo. Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, isto é, diretamente na célula que expressa o polinucleotídeo a ser modificado, épreferido que a modificação seja realizada in vitrocomo exemplificado abaixo.

Um exemplo de um modo conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de um polinucleotídeo está fundamentada nas técnicas de substituição de gene, deleção de gene, ou rompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, uma sequência de ácido nucleico que corresponde ao polinucleotídeo endógeno é mutageneizado in vitropara produzir uma sequência de ácido nucleico defeituosa que é depois transformada na célula precursora para produzir um gene defeituoso. Pela recombinação homóloga, a sequência de ácido nucleico defeituosa substitui o polinucleotídeo endógeno. Pode ser desejável que o polinucleotídeo defeituoso também codifique um marcador que possa ser usado para a seleção de transformantes em que o polinucleotídeo foi modificado ou destruído. Em um aspecto particularmente preferido, o polinucleotídeo é rompido com um marcador selecionável tal como aquele aqui descrito.

A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subsequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNA é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex no comprimento.

O dsRNA é preferivelmente um RNA interferente pequeno (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA é RNA interferente pequeno (siRNAs) para inibir a transcrição. Em um outro aspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibir a tradução.

A presente invenção também diz respeito a tais moléculas de RNA de filamento duplo (dsRNA), que compreende uma porção da sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 para inibir a expressão do polipeptídeo em uma célula. Embora a presente invenção não seja limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de filamento único (ssRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao dsRNA, o mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado de interferência de RNA (RNAi).

Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados no silenciamento de gene. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para seletivamente degradar o RNA usando um dsRNAi da presente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Os métodos para fabricar e usar moléculas de dsRNA para seletivamente degradar RNA são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, as Patentes U.S. N~ 6.489.127, 6.506.559, 6.511.824 e 6.515.109.

A presente invenção diz respeito ainda a uma célula mutante de uma célula precursora que compreende um rompimento ou deleção de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma sequência de controle deste ou um gene silenciado que codifica o polipeptídeo, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo ou nenhum polipeptídeo comparada com a célula precursora.

As células mutantes deficientes em polipeptídeo são particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos nativos e heterólogos. Portanto, a presente invenção diz respeito ainda a métodos de produzir um polipeptídeo nativo ou heterólogo, que compreende: (a) cultivar a célula mutante sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo “polipeptídeos heterólogos” significa polipeptídeos que não são nativos para a célula hospedeira, por exemplo, uma variante de uma proteína nativa. A célula hospedeira pode compreender mais do que uma cópia de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo nativo ou heterólogo.

Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados pelos métodos conhecidos na técnica.

Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente isento de intensificador celulolítico é de interesse particular na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fúngicas tais como enzimas. As células deficientes em intensificador celulolítico também podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores, e seus semelhantes. O termo “polipeptídeos eucarióticos” inclui não apenas polipeptídeos nativos, mas também aqueles polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificadas pelas substituições, deleções ou adições de aminoácido, ou outras de tais modificações para intensificar a atividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e seus semelhantes.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um produto de proteína essencialmente livre da atividade de intensificação celulolítica que é produzida por um método da presente invenção.

Composições

A presente invenção também diz respeito às composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo “enriquecido” indica que a atividade de intensificação celulolítica da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o componente enzimático principal, por exemplo, uma composição de mono-componente. Altemativamente, a composição pode também compreender uma ou mais (várias) enzimas adicionais, tais como uma acetilxilano esterase, amilase, alfa-L-arabinofuranosidase, catalase, celobio-hidrolase, celulase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, endoglicanase, alfa-glicuronidase, esterase, feruloil esterase, glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, lacase, lipase, manosidase, peroxidase, polifenoloxidase, xilanoase, ou beta-xilosidase.

As composições polipeptídicas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de um líquido ou uma composição seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na técnica.

Usos

A presente invenção também está direcionada aos seguintes métodos para usar os polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica, ou composições dos mesmos.

A presente invenção também diz respeito aos métodos para degradar ou converter um material celulósico, que compreendem: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método compreende ainda recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de produzir um produto de fermentação, que compreendem: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (vários) micro-organismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

A presente invenção também diz respeito aos métodos de fermentar um material celulósico, que compreendem: fermentar o material celulósico com um ou mais (vários) micro-organismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação. Em um outro aspecto preferido, o método compreende ainda recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar um material celulósico aos açúcares fermentáveis e converter os açúcares fermentáveis a muitas substâncias úteis, por exemplo, combustíveis, etanol potável, e/ou produtos de fermentação (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases e outros). A produção de um produto de fermentação desejado a partir de material celulósico tipicamente envolve o pré-tratamento, a hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

O processamento de material celulósico de acordo com a presente invenção pode ser realizado usando processos convencionais na técnica. Além disso, os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.

A Hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas não são limitadas a, hidrólise e fermentação separadas (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); sacarificação e co-fermentação simultâneas (SSCF); hidrólise e fermentação híbridas (HHF); hidrólise e co-fermentação separadas (SHCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHCF) e conversão microbiana direta (DMC). SHF usa as etapas de processo separadas para primeiro hidrolisar enzimaticamente material celulósico aos açúcares fermentáveis, por exemplo, açúcares de glicose, celobiose, celotriose e pentose e depois fermentar os açúcares fermentáveis para etanol. Na SSF, a hidrólise enzimática de material celulósico e a fermentação de açúcares para etanol são combinados em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, no Handbook on Bioethanol: Prodution and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). A SSCF envolve a co- fermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J. e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). A HHF envolve uma etapa de hidrólise separada e além disso, uma etapa de sacarificação e hidrólise simultâneas, que podem ser realizadas no mesmo reator. As etapas em um processo HHF pode ser realizado em temperaturas diferentes, isto é, sacarificação enzimática de alta temperatura seguida pela SSF a uma temperatura mais baixa que a cepa de fermentação pode tolerar. A DMC combina todos os três processos (produção de enzima, hidrólise e fermentação) em uma ou mais (várias) etapas onde os mesmos organismos são usados para produzir as enzimas para a conversão de material celulósico para açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zil, W. H. e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). E aqui entendido que qualquer método conhecido na técnica que compreende pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação ou uma combinação destes pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção.

Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado de lote alimentado, um reator agitado de lote, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo tamponado contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for a cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V. e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K. e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53- 65) ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reator adicionais incluem: reatores de leito fluidizado, de cobertura de fluxo ascendente, imobilizado e tipo extrusora para a hidrólise e/ou fermentação.

Pré-tratamento. Na prática dos métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes de material celulósico da parede da célula vegetal (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materials for efficient bioethanol prodution, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas prodution: A review, Int. J. of Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioprodutos and Biorefining-Biofpr. 2'. 26-40).

O material celulósico também pode ser submetido à redução do tamanho da partícula, pré-embebimento, umectação, lavagem ou condicionamento antes do pré-tratamento usando métodos conhecidos na técnica.

Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas não são limitados a, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento com cal, oxidação a úmido, explosão a úmido, explosão de fibra com amónia, pré-tratamento com organosolv e pré-tratamento biológico. Os pré-tratamentos adicionais incluem pré-tratamentos com percolação com amónia, ultrassom, eletroporação, micro-onda, CO2supercrítico, H2O supercrítica, ozônio e irradiação gama.

O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Altemativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose ou celobiose. Na maioria dos casos a própria etapa de pré-tratamento resulta em alguma conversão da biomassa aos açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para romper os componentes da parede de célula vegetal, que incluem lignina, hemicelulose e celulose para tomar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. O material celulósico é passado para ou através de um vaso de reação onde vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e pressão requeridas e são retidas nesse ponto durante o tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferivelmente feito de 140 a 230°C, mais preferivelmente de 160 a 200°C e o mais preferivelmente de 170 a 190°C, onde a faixa de temperatura ideal depende de qualquer adição de um catalisador químico. O tempo de residência para o pré-tratamento com vapor é preferivelmente de 1 a 15 minutos, mais preferivelmente de 3 a 12 minutos e o mais preferivelmente de 4 a 10 minutos, onde o tempo de residência ideal depende da faixa de temperatura e qualquer adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite cargas de sólidos relativamente altas, de modo que o material celulósico é geralmente apenas úmido durante o pré- tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material depois do pré-tratamento, que é conhecida como explosão a vapor, isto é, descarga rápida até a pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível pela fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de Patente U.S. Ne 20020164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose aos monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida apenas em um grau limitado.

Um catalisador tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente de 0,3 a 3 % p/p) é frequentemente adicionado antes do pré-tratamento com vapor, o que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762).

Pré-tratamento Químico: O termo “tratamento químico” refere-se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina. Os exemplos de processos de pré-tratamento químicos adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação a úmido, fibra de amónia/ explosão de congelamento (AFEX), percolação com amónia (APR) e pré-tratamentos com organosolv.

No pré-tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SO4 e água para formar uma pasta fluida, aquecida pelo vapor até a temperatura desejada e depois de um tempo de residência descarregado até a pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com vários projetos de reator, por exemplo, reator de fluxo plugado, reatores de contra-corrente ou reatores de leito de recuo em contra-corrente contínuo (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

Vários métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas também podem ser usados. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não são limitados a, pré-tratamento com cal, oxidação a úmido, percolação com amónia (APR) e fibra de amônia/explosão de congelamento (AFEX).

Pré-tratamento com cal é realizada com carbonato de cálcio, hidróxido de sódio ou amónia em baixas temperaturas de 85 a 150°C e tempos de residência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673- 686). A WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900 e WO 2006/110901 divulgam métodos de pré-tratamento usando amónia.

A oxidação a úmido é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente de 180 a 200°C por 5 a 15 minutos com a adição de um agente oxidativo tal como peróxido de hidrogênio ou pressão excessiva de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1 a 40 % de matéria seca, mais preferivelmente de 2 a 30 % de matéria seca e o mais preferivelmente de 5 a 20 % de matéria seca e frequentemente o pH inicial é aumentado pela adição de álcali tal como carbonato de sódio.

Uma modificação do método de pré-tratamento de oxidação a úmido, conhecida como explosão a úmido (combinação de oxidação a úmido e explosão a vapor), pode movimentar a matéria seca em até 30 %. Na explosão a úmido, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento depois de um certo tempo de residência. O pré-tratamento é depois terminado pela descarga até a pressão atmosférica (WO 2006/032282).

A explosão com fibra de amónia (AFEX) envolve tratar o material celulósico com amónia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas tais como 90 a 100°C e alta pressão tal como 17 a 20 bar por 5 a 10 minutos, onde o teor de matéria seca pode ser tão alta quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). O pré-tratamento AFEX resulta nadespolimerização da celulose e hidrólise parcial da hemicelulose. Os complexos de lignina-carboidrato são clivados.O pré-tratamento com organosolv deslignifica o material celulósico pela extração usando etanol aquoso (etanol de 40 a 60 %) de 160 a 200°C por 30 a 60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473- 481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é usualmente adicionado como um catalisador. No pré-tratamento com organosolv, a maioria da hemicelulose é removida.

Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85 e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686 e Pedido Publicado U.S. 2002/0164730.Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento ácido e mais preferivelmente como um tratamento ácido diluído e/ou brando contínuo. O ácido é tipicamente ácido sulfurico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes. O tratamento com ácido brando é conduzido na faixa de pH preferivelmente de 1 a 5, mais preferivelmente de 1 a 4 e o mais preferivelmente de 1 a 3. Em um aspecto, a concentração de ácido está preferivelmente na faixa de 0,01 a 20 % em peso de ácido, mais preferivelmente de 0,05 a 10 % em peso de ácido, ainda mais preferivelmente de 0,1 a 5 % em peso de ácido e o mais preferivelmente de 0,2 a 2,0 % em peso de ácido. O ácido é contatado com material celulósico e mantido a uma temperatura na faixa de preferivelmente de 160 a 220°C e mais preferivelmente de 165 a 195°C, por períodos variando de segundos a minutos, por exemplo, de 1 segundo a 60 minutos.

Em um outro aspecto, o pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra de amónia (etapa de pré-tratamento com AFEX).

Em um outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma pasta fluida aquosa. Em aspectos preferidos, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10 e 80 % em peso, mais preferivelmente entre 20 e 70 % em peso e o mais preferivelmente entre 30 e 60 % em peso, tal como em tomo de 50 % em peso. O material celulósico pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

Pré-tratamento Mecânico: O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem a úmido ou moagem de bola vibratória).

Pré-tratamento Físico: O termo “pré-tratamento físico” refere- se a qualquer pré-tratamento que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina a partir do material celulósico. Por exemplo, o pré-tratamento físico pode envolver irradiação (por exemplo, irradiação de micro-onda), vaporização/explosão a vapor, hidrotermólise e combinações dos mesmos.

O pré-tratamento físico pode envolver alta pressão e/ou alta temperatura (explosão a vapor). Em um aspecto, alta pressão significa pressão na faixa preferivelmente de cerca de 300 a cerca de 600 psi (2070 a 4140 kPa), mais preferivelmente de cerca de 350 a cerca de 550 psi (2415 a 3795 kPa) e o mais preferivelmente de cerca de 400 a cerca de 500 psi (2760 a 3450 kPa), tal como em tomo de 450 psi (3105 kPa). Em um outro aspecto, alta temperatura significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300°C, preferivelmente de cerca de 140 a cerca de 235°C. Em um aspecto preferido, o pré-tratamento mecânico é realizado em um processo de batelada, sistema hidrolisador de pistola de vapor que usa alta pressão e alta temperatura como definido acima, por exemplo, um Hidrolisador Sunds disponível da Sunds Defibrator AB, Suécia.

Pré-tratamento Físico e Químico Combinados: O material celulósico pode ser pré-tratado tanto física quanto quimicamente. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver tratamento com ácido diluído ou brando e tratamento com alta temperatura e/ou pressão. Os pré- tratamentos físicos e químicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, como desejado. Um pré-tratamento mecânico também pode ser incluído.

Consequentemente, em um aspecto preferido, o material celulósico é submetido ao pré-tratamento mecânico, químico ou físico ou qualquer combinação destes para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

Pré-tratamento Biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou a liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina a partir do material celulósico. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar micro-organismos que solubiliza lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pré-treatment of biomass, no Handbook on Bioethanol: Prodution and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treataments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosical biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Prodution, Himmel, M. E., Baker, J. O. e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Série 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, Ethanol prodution from renewable resource, em Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn- Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol prodution, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Prodution of ethanol from lignocellulosic materials: State of the art, Adv. Biochem. Eng./ Biotechnol. 42: 63-95).

Sacarificação. Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico, por exemplo pré-tratado, é hidrolisado para romper a celulose e altemativamente também a hemicelulose aos açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. As enzimas das composições também podem ser adicionadas sequencialmente.

A hidrólise enzimática é preferivelmente realizada em um ambiente aquoso adequado sob condições que podem ser facilmente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica. Em um aspecto preferido, a hidrólise é realizada sob condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ideal para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser realizada como um processo de lote alimentado ou contínuo onde o material celulósico pré-tratado (substrato) é alimentado gradualmente, por exemplo, a uma solução de hidrólise contendo enzima.

A sacarificação é geralmente realizada em reatores ou fermentadores de tanque agitado sob condições de pH, temperatura e mistura controladas. As condições de tempo de processo, temperatura e pH adequadas podem ser facilmente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada preferivelmente por cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente de cerca de 16 a cerca de 72 horas e o mais preferivelmente de cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está preferivelmente na faixa de cerca de 25°C a cerca de 70°C, mais preferivelmente de cerca de 30°C a cerca de 65°C e mais preferivelmente de cerca de 40°C a 60°C, em particular de cerca de 50°C. O pH está preferivelmente na faixa de cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente de cerca de 3,5 a cerca de 7 e o mais preferivelmente de cerca de 4 a cerca de 6, em particular em tomo do pH 5. O teor de sólidos secos está preferivelmente na faixa de cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente de cerca de 10 a cerca de 40 % em peso de o mais preferivelmente de cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

Em um aspecto, a composição de enzima compreende ou compreende ainda uma ou mais (várias) proteínas selecionadas do grupo que consiste de uma celulase, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma suolenina. Em um outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase, e uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glucuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanoase, e uma xilosidase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende ou compreende ainda uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolítica e uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma endoglicanase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma celobio-hidrolase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma beta-glicosidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma acetilmanana esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma acetilxilano esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ácido coumárico esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma feruloil esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma glicuronidase (por exemplo, alfa-D-glicuronidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma glicuronoil esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma mananase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma manosidase (por exemplo, beta- manosidase). Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma xilanoase. Em um aspecto preferido, a xilanoase é uma xilanoase da Família 10. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma xilosidase.

Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma expansina. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma esterase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma enzima ligninolítica. Em um aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma lacase. Em um outro aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma manganês peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma lignina peroxidase. Em um outro aspecto preferido, a enzima ligninolítica é uma enzima que produz H2C>2. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma pectinase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma peroxidase. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma protease. Em um outro aspecto, a composição de enzima compreende uma suolenina.

Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionadas antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação ou durante ou depois da propagação do(s) micro-organismo(s) fermentador(es).

Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem bem ser proteínas do tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas do tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (vários) componentes podem ser proteínas nativas de uma célula, que é usada como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (vários) outros componentes da composição de enzima. Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser produzidos como monocomponentes, que são depois combinados para formar a composição de enzima. A composição de enzima pode ser uma combinação de preparações de proteína de multicomponente e monocomponente.

As enzimas usadas nos métodos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para o uso nos processos aqui descritos, tais como, por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células removidas, um lisado de célula com ou sem fragmentos celulares, uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado não pulverizável, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. As preparações de enzima líquida, por exemplo, pode ser estabilizada pela adição de estabilizadores tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou um outro poliol, e/ou ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo com processos estabelecidos.

As quantidades ideais das enzimas e polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica dependem de vários fatores incluindo, mas não limitado à mistura de enzimas celulolíticas componentes, o substrato celulósico, a concentração de substrato celulósico, o(s) pré-tratamento(s) do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para a Sacarificação e Fermentação Simultâneas).

Em um aspecto preferido, uma quantidade eficaz de enzima(s) celulolítica(s) para material celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais 76 preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e o mais preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.

Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficaz de polipeptídeo(s) tendo atividade de intensificação celulolítica para material celulósico é de cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, e o mais preferivelmente de cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g de material celulósico.

Em um outro aspecto preferido, uma quantidade eficaz de polipeptídeo(s) tendo atividade de intensificação celulolítica para enzima(s) celulolítica(s) é de cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente de cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente de cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,1 a cerca de 0,25 g, e o mais preferivelmente de cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g de enzima(s) celulolítica(s).

As enzimas podem ser derivadas ou obtidas a partir de qualquer origem adequada, incluindo, a origem bacteriana, fúngica, de levedura, vegetal, ou mamífera. O termo “obtida” significa aqui que a enzima pode ter sido isolada de um organismo que naturalmente produz a enzima como uma enzima nativa. O termo “obtida” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro utilizando métodos aqui descritos, em que a enzimarecombinantemente produzida é nativa ou estranha para o organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácido modificada, por exemplo, tendo um ou mais (vários) aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência de aminoácido nativa ou uma enzima produzida pelos processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. Abrangidos dentro do significado de uma enzima nativa estão variantes naturais e dentro do significado de uma enzima estranha estão variantes obtidas recombinantemente, tal como pela mutagênese loco- dirigida ou embaralhamento.

Um polipeptídeo tendo atividade de enzima pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillustendo atividade de enzima, ou um polipeptídeo bacteriano Gram negativo tal como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasmatendo atividade de enzima.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis polipeptídeo tendo atividade de enzima.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade de enzima.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans tendo atividade de enzima.

O polipeptídeo tendo atividade de enzima também pode ser um polipeptídeo fúngico, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia tendo atividade de enzima; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium,

Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania,

Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xilaria tendo atividade de enzima.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformistendo atividade de enzima.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium celulolíticaus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknow ens e, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium tòrulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccatatendo atividade de enzima.

Os mutantes quimicamente modificados ou engendrados de proteína de polipeptídeos tendo atividade de enzima também podem ser usados.

Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser um componente recombinante, isto é, produzidos pela clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e célula subsequente transformada com a sequência de DNA e expressada em um hospedeiro (ver, por exemplo, a WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estranha ao hospedeiro), mas o hospedeiro pode sob certas condições ser também um hospedeiro homólogo (a enzima é nativa ao hospedeiro). As proteínas celulolíticas de monocomponente também podem ser preparadas pela purificação de uma tal proteína a partir de um caldo de fermentação.

Em um aspecto, a um ou mais (várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação de enzima celulolítica comercial. Os exemplos de preparações de enzima celulolítica comercial adequados para o uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC® Ctec (Novozymes A/S), CELLUCLAST® (Novozymes A/S), NOVOZYM® 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME® (Novozymes A/S), CEREFLO® (Novozymes A/S), e ULTRAFLO® (Novozymes A/S), ACCELERASE® (Genencor Int), LAMINEX® (Genencor Int.), SPEZYME® CP (Genencor Int.), ROHAMENT® 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas de celulase são adicionadas em quantidades eficazes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e o mais preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos. As enzimas de celulase são adicionadas em quantidades eficazes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e o mais preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

Os exemplos de endoglicanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem, mas não são limitadas a, uma endoglicanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente U.S. N° 5.275.944; WO 96/02551; Patente U.S. N2 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglicanase III de Thermobifida fusca (WO 05/093050); e endoglicanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

Os exemplos de endoglicanases fúngicas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem, mas não são limitados a, uma endoglicanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263; acesso no GENBANK® n° M15665); endoglicanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63: 11-22; acesso no GENBANK® n° M19373); endoglicanase III de Trichoderma reesei(Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; acesso no GENBANK® no. AB003694); e endoglicanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; acesso no GENBANK® no. Z33381); endoglicanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884); endoglicanase de Aspergillus kawachii(Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439); endoglicanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); endoglicanase de Fusarium oxysporum (acesso no GENBANK® no. L29381); endoglicanase de Humicola grisea var. thermoidea (acesso no GENBANK® no. AB003107); endoglicanase de Melanocarpus albomyces (acesso no GENBANK® no. MAL515703); endoglicanase de Neurospora crassa (acesso no GENBANK® no. XM_324477); endoglicanase V de Humicola insolens; endoglicanase Myceliophthora thermophila CBS 117.65; endoglicanase de basidiomicete CBS 495.95; endoglicanase de basidiomicete CBS 494.95; endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B; endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C); endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C; endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E; endoglicanase de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F; endoglicanase de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A; e endoglicanase de Trichoderma reesei cepa No. VTT-D-80133 (acesso no GENBANK® no. Ml5665).

Os exemplos de celobio-hidrolases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, celobio-hidrolase I de Trichoderma reesei; celobio-hidrolase II de Trichoderma reesei; celobio- hidrolase I de Humicola insolens, celobio-hidrolase II de Myceliophthora thermophila, celobio-hidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A), celobio- hidrolase I de Chaetomium thermophilum, e celobio-hidrolase II de Chaetomium thermophilum.

Os exemplos de beta-glicosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, beta-glicosidase de Aspergillus oryzae', beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus', beta- glicosidase de Penicillium brasilianum IBT 20888; beta-glicosidase de Aspergillus niger, e beta-glicosidase de Aspergillus aculeatus.

O polipeptídeo de Aspergillus oryzaetendo atividade de beta- glicosidase pode ser obtido de acordo com a WO 2002/095014. O polipeptídeo de Aspergillus fumigatustendo atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com a WO 2005/047499. O polipeptídeo de Penicillium brasilianumtendo atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com a WO 2007/019442. O polipeptídeo de Aspergillus nigertendo atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. O polipeptídeo de Aspergillus aculeatus tendo atividade de beta-glicosidase pode ser obtido de acordo com Kawaguchi etal., 1996, Gene 173: 287-288.

A beta-glicosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glicosidase é a proteína de fusão da variante Bg da beta- glicosidase de Aspergillus oryzaeou a proteína de fusão da beta-glicosidase de Aspergillus oryzaeobtida de acordo com a WO 2008/057637.

Outras endoglicanases, celobio-hidrolases, e beta-glicosidases são divulgadas em numerosas famílias da Glicosil Hydrolase usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309- 316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas na EP 495.257, EP 531.315, EP 531.372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente U.S. N2 4.435.307, Patente U.S. N2 5.457.046, Patente U.S. N2 5.648.263, Patente U.S. N2 5.686.593, Patente U.S. N2 5.691.178, Patente U.S. N2 5.763.254, e Patente U.S. N2 5.776.757.

Em um aspecto, a uma ou mais (várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação de enzima hemicelulolitica comercial. Os exemplos de preparações de enzima hemicelulolitica comercial adequada para o uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME® (Novozymes A/S), CELLIC® Htec (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanoase (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzymes), HSP 6000 Xilanoase (DSM), DEPOL® 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL® 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOL® 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).

Os exemplos de xilanoases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, xilanoase de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), xilanoases de Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), e xilanoases de Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210).

Os exemplos de beta-xilosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, beta-xilosidase de Trichoderma reesei (número de acesso no UniProtKB/TrEMBL Q92458), Talaromyces emersonii (número de acesso no SwissProt Q8X212), e Neurospora crassa (Número de acesso no SwissProt Q7SOW4).

Os exemplos de acetilxilano esterases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, acetilxilano esterase de Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), acetilxilano esterase de Neurospora crassa (número de acesso UniProt q7s259), acetilxilano esterase de Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846), acetilxilano esterase de Chaetomium globosum (número de acesso Uniprot Q2GWX4), acetilxilano esterase de Chaetomium gracile(número de acesso GeneSeqP AAB82124), acetilxilano esterase de Phaeosphaeria nodorum(número de acesso Uniprot Q0UHJ1), e acetilxilano esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709).

Os exemplos de ácido ferúlico esterases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, feruloil esterase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), feruloil esterase de Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3), e feruloil esterase de Neosartoryafischeri (Número de acesso de UniProt A1D9T4).

Os exemplos de arabinofuranosidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, arabinofuranosidase de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073383) e arabinofuranosidase de Aspergillus niger (número de acesso GeneSeqP AAR94170).

Os exemplos de alfa-glicuronidases úteis nos métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, alfa-glicuronidase de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alccl2), alfa-glicuronidase de Trichoderma reesei (número de acesso UniProt Q99024), alfa-glicuronidase de Talaromyces emersonii(número de acesso UniProt Q8X211), alfa- glicuronidase de Aspergillus niger(número de acesso UniProt Q96WX9), alfa-glicuronidase de Aspergillus terreus(Número de acesso no SwissProt Q0CJP9), e alfa-glicuronidase de Aspergillus fumigatus(Número de acesso no SwissProt Q4WW45).

As enzimas e proteínas usadas nos métodos da presente invenção podem ser produzidas pela fermentação das cepas microbianas mencionadas acima em um meio nutriente contendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos adequados, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J. W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para o cultivo e produção de enzima são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J. E., e Ollis, D. F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulte na expressão ou isolação de uma enzima. A fermentação, portanto, pode ser entendida como compreendendo cultivo de frasco agitado, ou fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentações contínuas, de batelada, lote alimentado, ou estado sólido) em laboratório ou fermentadores industriais realizados em um meio adequado e sob condições que possibilitem que a enzima seja expressada ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelo métodos descritos acima podem ser recuperadas do meio de fermentação e purificadas pelos procedimentos convencionais.Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos a partir do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (vários) micro-organismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” referem-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreenda uma etapa de fermentação. Os processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na industrial de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), indústria do couro e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador e podem ser facilmente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica.Na etapa de fermentação, açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados a um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura. A hidrólise (sacarificação) e a fermentação podem ser separadas ou simultâneas, como aqui descrito.

Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação e do processo utilizado, como é bem conhecido na técnica.

O termo “meio de fermentação” é aqui entendido referir-se a um meio antes do(s) micro-organismo(s) fermentador(es) ser(serem) adicionado(s), tal como, um meio resultante de um processo de sacarificação, assim como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF).“Micro-organismo fermentador” refere-se a qualquer micro- organismo, que inclui organismos bacterianos e fúngicos, adequados para o uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores Cg e/ou C5 ou uma combinação destes. Tanto o organismo fermentador C6 quanto o C5 são bem conhecidos na técnica. Os micro-organismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

Os exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

Os exemplos de micro-organismos fermentadores que podem fermentar açúcares C6 incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura. A levedura preferida inclui as cepas de Saccharomyces spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.

Os exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar açúcares C5 incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como levedura. A levedura fermentadora C5 preferida inclui as cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, tal como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida,preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis ou Candida utilis.

Outros organismos fermentadores incluem cepas de Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis', Hansenula, tal como Hansenula anómala', Kluyveromyces, tal como K. fragilis', Schizosaccharomyces, tal como S. pombe', e E. coli, especialmente as cepas de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento de etanol.

Em um aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Kluyveromyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida.Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii.Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Pachysolen. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em um outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é um Pichia stipitis. Em um outro aspecto preferido, a levedura é um Bretannomyces. Em um outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Celulose bioconversion technology, no Handbook on Bioethanol: Prodution and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179- 212).

As bactérias que podem eficientemente fermentar hexose e pentose ao etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).

Em um aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium.Em um outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.

As leveduras comercialmente disponíveis adequadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, a levedura ETANOL RED® (disponível da Fermentis/Lesaffre, USA), FALI® (disponível da Fleischmann’s Yeast, USA), SUPERSTART® e levedura fresca THERMOSACC® (disponíveis da Ethanol Technology, WI, USA), BIOFERM® AFT e XR (disponíveis da NABC - North American Bioprodutos Corporation, GA, USA), GERT STRAND® (disponível da Gert Strand AB, Suécia) e FERMIOL® (disponível da DSM Specialties).

Em um aspecto preferido, o micro-organismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade para fermentar açúcares de pentose, tais como xilose utilizando, arabinose utilizando e xilose e arabinose co-utilizando micro-organismos.

A clonagem de genes heterólogos em vários fermentadores de micro-organismo tem levado à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses para etanol (co-fermentação) ((Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xilose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glicose and xilose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xilose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walffidsson et al., 1995, Xilose-metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TALI genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xilose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol prodution from xilose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol prodution, Biotechnol. Bioeng. 58: 204- 214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465- 4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).

Em um aspecto preferido, o micro-organismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em um outro aspecto preferido, o micro-organismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis. Em um outro aspecto preferido, o micro-organismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em um outro aspecto preferido, o micro-organismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxitoca. Em um outro aspecto preferido, o micro-organismo de fermentação geneticamente modificado é Kluyveromyces sp.

E bem conhecido na técnica que os organismos descritos acima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como aqui descrito.

O micro-organismo fermentador é tipicamente adicionado à lignocelulose degradada ou hidrolisado e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, tal como de cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura está tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 60°C, em particular de cerca de 32°C ou 50°C e de cerca do pH 3 a cerca do pEl 8, tal como em tomo do pH 4 a 5, 6 ou 7.

Em um aspecto preferido, a levedura e/ou um outro micro- organismo são aplicados ao material celulósico degradado e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente de 24 a 60 horas. Em um aspecto preferido, a temperatura está preferivelmente entre cerca de 20°C a cerca de 60°C, mais preferivelmente de cerca de 25°C a cerca de 50°C e o mais preferivelmente de cerca de 32°C a cerca de 50°C, em particular de cerca de 32°C ou 50°C e o pH é geralmente de cerca do pH 3 a cerca do pH 7, preferivelmente em tomo do pH 4 a 7. Entretanto, alguns organismos de fermentação, por exemplo, bactérias, têm temperatura de fermentação ideal mais alta. A levedura ou um outro micro-organismo são

preferivelmente aplicados em quantidades de aproximadamente 10 a 10 , preferivelmente de aproximadamente 10 a 10 , especial e aproximadamente de 2 x 108 contagens de célula viável por ml de caldo de fermentação. Orientação adicional com respeito ao uso da levedura para fermentação pode ser encontrada, por exemplo, em “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T. P. Lyons e D. R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é por meio deste incorporada por referência.

Para a produção de etanol, a seguir da fermentação a pasta fluida fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os métodos da invenção podem ser usados como, por exemplo, etanol combustível, etanol de beber, isto é, álcoois neutros potáveis ou etanol industrial.

Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer um dos processos aqui descritos para melhorar ainda mais o processo de fermentação e em particular, o desempenho do micro-organismo fermentador, tal como, a taxa de intensificação e o rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se a estimuladores para o crescimento dos micro-organismos fermentadores, em particular, levedura. Os estimuladores de fermentação preferidos para o crescimento incluem vitaminas e minerais. Os exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e Vitaminas A, B, C, D e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al.,Improving ethanol prodution and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é por meio deste incorporada por referência. Os exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem fornecer nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glicônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glicônico, ácido glicurônico, ácido glutárico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico); uma cetona (por exemplo, acetona); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); e um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Deve ser entendido que o termo “álcool” abrange uma substância que contém uma ou mais porções de hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é butanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3- propanodiol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em um outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol prodution from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, M. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological prodution of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processes for fermentative prodution of xilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. e Blaschek, H. P., 2003, Prodution of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BAI 01 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido acético . Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido adípico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido ascórbico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido cítrico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido 2,5- diceto-D-glicônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido fórmico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é oácido fumárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é oácido glucárico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é oácido glicônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é oácido glicurônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido glutárico. Em um outro aspecto preferido, o ácido orgânico é o ácido 3- hidroxipropiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido itacônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido láctico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido málico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido malônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido oxálico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido propiônico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido succínico. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R. e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid prodution from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448. uma cetona. Deve ser entendido que o termo “cetona” abrange uma substância que contém uma ou mais porções de cetona. Em um outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em um outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é o ácido aspártico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é o ácido glutâmico. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em um outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poli(glutamic acid) prodution and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

Em um outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é H2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Em um outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen prodution by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. em Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for metane prodution: A review.Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica que inclui, mas não é limitado a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado pelos métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 % em vol. pode ser obtido, que pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etanol de beber, isto é, álcoois neutros potáveis ou etanol industrial.

Peptídeo de sinal

A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 21 de SEQ ID NO: 2. O polinucleotídeo pode compreender ainda um gene que codifica uma proteína, que é operavelmente ligado ao peptídeo de sinal. A proteína é preferivelmente estranha ao peptídeo de sinal e/ou propeptídeo.

A presente invenção também diz respeito às construções de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem um tal polinucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos de produzir uma proteína, que compreendem: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um tal polinucleotídeo; e (b) recuperar a proteína.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não é aqui intencionada a se referir a um comprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange peptídeos, oligopeptídeos, e polipeptídeos. O termo “proteína” também abrange dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste, enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Por exemplo, a proteína pode ser uma oxidorredutase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase tal como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta- galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, lacase, uma outra lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolitica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolitica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanoase.

O gene pode ser obtido a partir de qualquer procariótica, eucariótica, ou outra fonte.

A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção.

Exemplos Meios

As placas de PDA foram compostas de 39,0 gramas de ágar dextrose de batata e água destilada até 1 litro.

As placas de YG ágar foram compostas de 5,0 g de extrato de levedura, 10,0 g de glicose, 20,0 g de ágar, e água destilada até 1 litro.

O meio NNCYP-PCS foi composto de 5,0 g de NaNO3, 3,0 g de NH4CI, 2,0 g de MES, 2,5 g de ácido cítrico, 0,2 g de CaCl2 2H2O, 1,0 g de Bacto Peptona, 5,0 g de extrato de levedura, 0,2 g de MgSCC 7H2O, 4,0 g de K2HPO4, 1,0 ml de solução de elementos traço COVE, 2,5 g de glicose, 25,0 g de PCS, e água destilada até 1 litro.

A solução de elementos traço COVE foi composta de 0,04 g de Na2B4O7-10H2O, 0,4 g de CuSO4-5H2O, 1,2 g de FeSO4-7H2O, 0,7 g de MnSO4-H2O, 0,8 g de Na2MoO2-2H2O, 10 g de ZnSO4-7H2O, e água destilada até 1 litro.

As placas de LB ágar foram compostas de 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar, e água destilada 1 litro.

O meio SOC foi composto de 2 % de triptona, 0,5 % de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSÜ4, e 20 mM de glicose.O meio YPM foi composto de 1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona, e 2 % de maltose.

As placas de meio mínimo foram compostas de 6 g de NaNO3, 0,52 g de KC1, 1,52 g de KH2PO4, 1 ml de solução de elementos traço COVE, 20 g de Noble ágar, 20 ml de glicose a 50 %, 2,5 ml de MgSO4‘7H2O a 20 %, 20 ml de uma solução de biotina a 0,02 %, e água destilada até 1 litro.

Exemplo 1: Isolação da cepa NN046877 de Penicillium pinophilum de amostra de solo

Penicillium pinophilum NN046877 foi isolado a partir de um solo de Hunan, China plaqueando-se diretamente a amostra de solo em uma placa de PDA seguido pela incubação a 37°C por 5 dias. A cepa foi depois purificada pela transferência dos micélios em uma placa de YG ágar. A cepa NN046877 foi identificada como Penicillium pinophilum com base na caracterização tanto morfológica quanto molecular (sequenciamento ITS).

Exemplo 2: Isolação do RNA da cepa NN046877 de Penicillium pinophilum

A cepa NN46877 de Penicillium pinophilum foi inoculada em uma placa de PDA e incubada por 4 dias a 37°C no escuro. Vários tampões de micélios-PDA foram inoculados em frascos agitados de 500 ml cada um contendo 100 ml de meio NNCYP-PCS. Os frascos foram incubados por 5 dias a 37°C com agitação a 160 rpm. Os micélios foram coletados no dia 4 e dia 5. Depois os micélios de cada dia foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados em um congelador a -80°C até o uso.

Os micélios congelados foram transferidos em um almofariz e pistilo pré congelados em nitrogênio líquido e triturados até um pó fino. O RNA total foi preparado a partir dos micélios pulverizados para o dia 4 e dia 5 pela extração com reagente de TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O RNA enriquecido com poli A foi isolado usando um Kit mTRAP® Total (Active Motif, Carlsbad, CA, USA).

Exemplo 3: Construção de uma biblioteca de cDNA da cepa de Penicillium pinophilum

O cDNA de filamento duplo para o dia 4 e dia 5 foi sintetizado usando um Kit de Construção de Biblioteca de cDNA SMART® (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japão). O cDNA foi clivado com Sfi I usando métodos padrão e o cDNA foi fracionado no tamanho pela eletroforese em gel de agarose a 0,8 % usando 44 mM de Tris base, 44 mM de ácido bórico, 0,5 mM de tampão de EDTA (TBE). Uma fração de cDNA de 500 pares de base e maior foi excisada do gel e purificada usando um Kit GFX® PCR DNA e Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) de acordo com as instruções do fabricante. Depois quantidades iguais de cDNA do dia 4 e dia 5 foram reunidos para a construção da biblioteca.

O cDNA foi depois direcionalmente clonado pela ligação em pMHas7 clivado com Sfi I (WO 2009/037253) usando T4 ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi submetida à eletroporação em células DH10B® ELECTROMAX® de E. coli(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) usando um GENE PULSER® e Controlador de Pulso (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a 25 pF, 25 mAmp, 1,8 kV com uma cubeta de 1 mm de intervalo de acordo com o procedimento do fabricante.

As células submetidas à eletroporação foram plaqueadas em placas de LB ágar suplementadas com 50 mg de canamicina por litro. Uma reunião de plasmídeo de cDNA foi preparada a partir de 60.000 transformantes no total da ligação do vetor pMHas7 original. O DNA plasmídico foi preparado diretamente da reunião de colônias usando um Kit QIAGEN® Plasmid (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Exemplo 4: Construção de um transposon SigA4 contendo o gene repórter da β-lactamase

Um transposon contendo o plasmídeo designado pSigA4 foi construído a partir do transposon pSigA2 contendo o plasmídeo descrito na WO 01/77315 de modo a criar uma versão melhorada do transposon de captação de sinal de pSigA2 com fundo de seleção diminuído. O transposon pSigA2 contém um sinal menos a construção de beta-lactamase codificado no próprio transposon. A PCR foi usada para criar uma deleção do gene da beta- lactamase intacta encontrada na cadeia principal de plasmídeo usando a DNA polimerase PROOFSTART® (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha) e os seguintes iniciadores fosforilados em 5’ (TAG Copenhagen, Dinamarca):SigA2NotU-P:5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’ (SEQ ID NO: 3)SigA2NotD-P:5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’ (SEQ ID NO: 4)

A reação de amplificação foi composta de 1 pl de pSigA2 (10 ng por pl), 5 pl de 10X Tampão PROOFSTART® (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha), 2,5 pl de mistura de dNTP (20 mM), 0,5 pl de SigA2NotU-P (10 mM), 0,5 pl de SigA2NotD-P (10 mM), 10 pl de solução Q (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha), e 31,25 pl de água desionizada. Um Ciclador Térmico de DNA ENGINE® (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) foi usado para a amplificação programada para um ciclo a 95°C por 5 minutos; e 20 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 62°C por 30 segundos, e 72°C por 4 minutos.

Um produto de reação de PCR de 3,9 kb foi isolado pela eletroforese em gel de agarose a 0,8 % usando tampão de 40 mM de Tris base-20 mM de acetato de sódio-1 mM de EDTA dissódico (TAE) e 0,1 pg de brometo de etídio por ml. A faixa de DNA foi visualizada com a ajuda de um Sistema de Formação de Imagem EAGLE EYE® (Stratagene, La Jolla, CA,USA) a 360 nm. A faixa de DNA de 3,9 kb foi excisada do gel e purificada usando um Kit GFX® PCR DNA e Gel Band Purification de acordo com as instruções do fabricante.

O fragmento de 3,9 kb foi auto-ligado a 16°C durante a noite com 10 unidades de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Inc., Ipwich, MA, USA), 9 pl do fragmento de PCR de 3,9 kb, e 1 pl de 1 OX tampão de ligação (New England Biolabs, Inc., Ipwich, MA, USA). A ligação foi inativada por calor por 10 minutos a 65°C e depois digerido com Dpn I a 37°C por 2 horas. Depois da incubação, a digestão foi purificada usando um Kit GFX® PCR DNA e Gel Band Purification.

O material purificado foi depois transformado em células competentes TOP 10® da E. coli(TIANGEN Biotech (Beijing) Co. Ltd., Pequin, China) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de transformação foi cultivada em placas de LB ágar suplementadas com 25 pg de cloranfenicol por ml. As minipreparações de plasmídeo foram preparadas a partir de vários transformantes e digeridas com Bgl II. Um plasmídeo com a construção correta foi escolhido. O plasmídeo foi designado pSigA4. O plasmídeo pSigA4 contém o transposon flanqueado por Bgl II SigA2 idêntico a aquele divulgado na WO 01/77315.

Uma amostra de 60 pl de plasmídeo pSigA4 DNA (0,3 pg/pl) foi digerido com Bgl II e separado pela eletroforese em gel de agarose a 0,8 % usando tampão de TBE. Uma faixa de DNA SigA2 transposon de 2 kb foi eluída com 200 pl de tampão EB (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha) e purificado usando um Kit GFX® PCR DNA e Gel Band Purification de acordo com as instruções do fabricante e eluído em 200 pl de tampão EB. SigA2 foi usado para a captação de sinal assistida por transposon.

Exemplo 5: Captação de Sinal Assistida por Transposon da Cepa de Penicillium pinophilum

Uma descrição completa de captação de sinal assistido por transposon pode ser encontrado na WO 01/77315. A reunião de plasmídeo foi tratada com transposon SigA2 e HYPERMU® MuA transposase (Epicenter Biotechnologies, Inc., Madison, WI, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para a rotulação de transposon in vitroda biblioteca de cDNA de Penicillium pinophilum, 2 pl de transposon SigA2 contendo aproximadamente 100 ng de DNA foram misturados com 1 pl da reunião de DNA plasmidico da biblioteca de cDNA de Penicillium pinophilumcontendo 1 pg de DNA, 1 pl de HYPERMU® MuA transposase, e 2 pl de 1 OX tampão (Epicenter Biotechnologies, Inc., Madison, WI, USA) em um volume total de 20 pl e incubada a 30°C por 3 horas seguido pela adição de 2 pl de tampão de parada (Epicenter Biotechnologies, Inc., Madison, WI, USA) e inativação por calor a 75°C por 10 minutos. O DNA foi precipitado pela adição de 2 pl de acetato de sódio 3 M pH 5 e 55 pl de etanol a 96 % e centrifugado a 10.000 x g por 30 minutos a 4°C. A pelota foi lavada em etanol a 70 %, seco ao ar na temperatura ambiente, e recolocado em suspensão em 10 pl de água desionizada.

Um volume de 2 pl da reunião de plasmídeo rotulado com transposon foi submetido à eletroporação em 50 pl de células DH10B® ELECTROMAX® da E. coliusando um GENE PULSER® e Controlador de Pulso a 25 pF, 25 mAmp, 1,8 kV com uma cubeta de 1 mm de intervalo de acordo com o procedimento do fabricante.

As células submetidas à eletroporação foram incubadas em meio SOC por 1 hora a 37° C com agitação a 225 rpm antes de serem plaqueadas no seguinte meio seletivo: meio LB ágar suplementado com 50 pg de canamicina por ml; meio LB ágar suplementado com 50 pg de canamicina por ml e 15 pg de cloranfenicol por ml; e meio LB ágar suplementado com 50 pg de canamicina por ml, 15 pg de cloranfenicol por ml, e 30 pg de ampicilina por ml.

A partir do cultivo em placa da eletroporação em meio LB ágar suplementado com canamicina, cloranfencol e ampicilina, aproximadamente 200 colônias por 50 pl foram observadas depois de 3 dias a 30° C. Todas as colônias foram plaqueadas em réplica em meio LB ágar suplementado com 50 pg de canamicina por ml, 15 pg de cloranfenicol por ml, e 100 pg de ampicilina por ml. Quinhentas colônias foram recuperadas sob esta condição de seleção. O DNA plasmídico das colônias foram sequenciadas com os iniciadores de transposon avançados e reversos (iniciadores A e B), mostrados abaixo, de acordo com o procedimento divulgado na WO 01/77315.Iniciador A:5’-agcgtttgcggccgcgatcc-3’ (SEQ ID NO: 5) Iniciador B:5’-ttattcggtcgaaaaggatcc-3’ (SEQ ID NO: 6)

Exemplo 6: Montagem e anotação de sequência

As sequências de DNA foram obtidas a partir de SinoGenoMax Co., Ltd., Pequin, China. As leituras de sequência do iniciador A e iniciador B para cada plasmídeo foram cortadas para remover as sequências de vetor e transposon. As sequências montadas foram agrupadas em contíguos pelo uso do programa PhredPhrap (Ewing et al., 1998, Genome Research 8: 175-185; Ewing e Green, 1998, Genome Research 8: 186-194). Todos os contíguos foram subsequentemente comparados com as sequências disponíveis nas bases de dados de sequências de DNA e proteína públicas (TrEMBL, SWALL, PDB, EnsemblPep, GeneSeqP) pelo uso do programa BLASTX 2.0al9MP-WashU [14-Jul-1998] [Build linux-x86 18:51:44 30-Jul- 1998] (Gish et al., 1993, Nat. Genet. 3: 266-72). A proteína da Família GH61 foi identificada diretamente pela análise dos resultados BlastX.

Exemplo 7: Clonagem do gene do polipeptídeo GH61A de Penicillium pinophilum a partir do DNA genômico

Penicillium pinophilumNN046877 foi cultivado em uma placa de PDA a 37°C por 4 a 5 dias. Os micélios foram coletados diretamente da placa de ágar em um almofariz esterilizado e congelado em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foram triturados, por almofariz e pistilo, até um pó fino, e o DNA genômico foi isolado usando um Kit DNEASY® Plant Mini (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA).

Com base na sequência de cDNA obtida no Exemplo 6, os iniciadores de oligonucleotideo, mostrados abaixo, foram designados para amplificar o gene ghól do DNA genômico de Penicillium pinophilum NN046877. Um Kit Clonagem IN-FUSION® CF Dry-down (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) foi usada para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pPFJO355 (Figura 2), sem a necessidade quanto a digestão de restrição e ligação.Iniciador de sentido:5 ’-ACACAACTGGGGATCCACCATGCCTTCTACTAAAGTCGCTG-3 ’ (SEQ ID NO: 7)Iniciador de anti-sentido:5 ’-GTCACCCTCTAGATCTTCAAAGGACAGTAGTGGTGATGAC-3 ’ (SEQ ID NO: 8)

As letras em negrito representaram a sequência codificadora e a sequência remanescente foi homóloga para os sítios de inserção de pPFJO355.

O vetor de expressão pPFJO355 contém o promotor da TAKA-amilase derivado de Aspergillus oryzae, os elementos de terminador da glicoamilase de Aspergillus niger, sequências derivadas de pUC19 para seleção e propagação na E. coli, e um gene pirG de Aspergillus nidulans, que codifica uma orotidina descarboxilase para a seleção de transformantes de uma cepa de AspergilluspirG mutante.Vinte picomoles de cada um dos iniciadores acima foram

usados em uma reação de PCR composta de DNA genômico de Penicillium pinophilum NN046877, 10 pl de 5X Tampão de GC (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 1,5 pl de DMSO, 2,5 mM de cada um de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, e 0,6 unidade de PHUSION® High-Fidelity DNA Polimerase (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) em um volume final de 50 pl. A amplificação foi realizada usando um Ciclador Térmico Peltier (MJ Research Inc., South San Francisco, CA, USA) programado para desnaturar a 98°C por 1 minuto; 5 ciclos cada um de desnaturação a 98°C por 15 segundos, recozendo a 56°C por 30 segundos, com um aumento de 1°C por ciclo e alongamento a 72°C por 75 segundos; 25 ciclos cada um a 98°C por 15 segundos, 65°C por 30 segundos, e 72°C por 75 segundos; e uma extensão final a 72°C por 10 minutos. O bloco térmico depois foi a um ciclo de embebimento de 4°C.

Os produtos de reação foram isolados pela eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão de TBE onde uma faixa de produto de aproximadamente 1,0 kb foi excisada do gel, e purificada usando um Kit ilustra GFX® PCR DNA e Gel Band Purification (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) de acordo com as instruções do fabricante.

O plasmídeo pPFJO355 foi digerido com Bam HI e Bgl II, isolado pela eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão de TBE, e purificado usando um Kit ilustra GFX® PCR DNA e Gel Band Purification.

O fragmento de gene e o vetor digerido foram ligados entre si usando um Kit de Clonagem pela PCR IN-FUSION® CF Dry-down resultando em pPpin7 (Figura 3) em que a transcrição do gene de polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A foi sob o controle de um promotor do gene para a alfa-amilase de Aspergillus oryzae. A operação de clonagem foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, 30 ng de pPFJO355 digerido com Bam HI e Bgl II, e 60 ng do produto de PCR do polipeptídeo GH61A de Penicillium pinophilum purificado foram adicionadosa um frasco de reação e recolocado em suspensão em um volume final de 10 pl pela adição de água desionizada. A reação foi incubada a 37°C por 15 minutos e depois 50°C por 15 minutos. Três pl da reação foram usados para transformar células competentes TOP 10® da E. colL Um transformante da E. coli contendo pPpin7 foi detectado pela PCR de colônia e o DNA plasmídico foi preparado usando um Kit QIAPREP® Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA). O gene do polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A inserido em pPpin7 foi confirmado pelo sequenciamento de DNA usando um Analisador de DNA 3730XL (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA, USA).

O mesmo fragmento de PCR foi clonado no pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA) usando um Sistema de Vetor pGEM-T para gerar pGEM-T-Ppin7 (Figura 4). O gene do polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A inserido no pGEM-T-Ppin7 foi confirmado pelo sequenciamento de DNA usando um Analisador de DNA 3730XL. A cepa T-Ppin7 da E. coli,contendo pGEM-T-Ppin7, foi depositada com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Braunschweig, Alemanha, em 24 de junho de 2009 e designado com o número de acesso DSM 22711.

Exemplo 8: Caracterização do gene do polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A

Os dados de sequência de nucleotídeo foram examinados quanto a qualidade e todas as sequências foram comparadas entre si com a assistência do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA).

A sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) e a sequência de aminoácido deduzida (SEQ ID NO: 2) de sequência genômica do polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A são mostradas nas Figuras IA e 1B. O fragmento genômico codifica um polipeptídeo de 322 aminoácidos, interrompido por 1 íntron de 52 pares de base (nucleotídeos de 102 a 153). O teor de % de G+C de sequência codificadora de comprimento total e de sequência codificadora madura são 53,42 % e 53,38 %, respectivamente. Usando o programa de software SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo de sinal de 21 resíduos foi prognosticado. A proteína madura prognosticada contêm 301 aminoácidos com uma massa molecular prognosticada de 32,68 kDa.

Um alinhamento global aos pares comparativo de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência de aminoácido deduzida do polipeptídeo maduro do gene de polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A compartilhou 75 % de identidade (excluindo os intervalos) com a sequência de aminoácido deduzida de um gene de polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus GH61A (número de acesso no GeneSeq AUP68836).

Exemplo 9: Expressão do polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A tendo atividade de intensificação celulolítica em Aspergillus oryzae

Protoplastos de Aspergillus oryzae HowBlOl (WO 95/35385) foram preparados de acordo com o método de Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422 e transformados com três pg de pPpin7. A transformação produziu cerca de 50 transformantes. Quatro transformantes foram isolados em placas de meio Mínimo individuais.

Os quatro transformantes foram inoculados separadamente em 3 ml de meio YPM em uma placa de 24 reservatórios e incubados a 30°C com agitação a 150 rpm. Depois de 3 dias de incubação, 20 pl do sobrenadante de cada cultura foram analisados pela SDS-PAGE usando um Gel NUPAGE®NOVEX® 4 a 12 % Bis-Tris com MES (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O gel resultante foi tingido com INSTANT BLUE® (Expedeon Ltd., Babraham Cambridge, UK). A SDS-PAGE mostrou que a maioria dos transformantes teve uma faixa maior de aproximadamente 64 kDa. A cepa de expressão foi designada A. oryzae EXP02769.

Inclinações de A. oryzae EXP02769 foram lavadas com 10 ml de meio YPM e inoculadas em frascos de 2 litro cada contendo 400 ml de meio YPM para gerar caldo para a caracterização da enzima. As culturas foram colhidas no dia 3 e filtradas usando uma membrana de 0,45 pm de DURAPORE® (Millipore, Bedford, MA, USA).

Exemplo 10: Purificação de polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A recombinante tendo atividade de intensificação celulolítica

Um volume de 1 litro de sobrenadante de Aspergillus oryzae Exp02769 foi precipitado com sulfato de amónio (80 % de saturação) e redissolvido em 100 ml de tampão Bis-Tris a 25 mM no pH 6,0, e depois dialisado contra o mesmo tampão e filtrado através de um filtro de 0,45 mm; o volume final foi de 200 ml. A solução foi aplicada a uma coluna de Fluxo Rápido Q SEPAHROSE® de 40 ml (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) equilibrada em tampão Bis-Tris a 25 mM no pH 6,0, e a proteína GH61A recombinante foi eluída com um gradiente de NaCl linear (0 a 0,25 M). As frações da coluna foram analisadas pela SDS-PAGE como descrito no Exemplo 9. As frações contendo uma faixa de aproximadamente 64 kDa foram reunidas. Depois a solução reunida foi concentrada pela ultrafiltração.

Exemplo 11: Concentração e quantificação de polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A tendo atividade de intensificação celulolítica

A amostra purificada do Exemplo 10 foi concentrada ainda usando um concentrador Ultracentrífugo MWCO Amicon de 10 kDa (Millipore, Bedford, MA, USA) até aproximadamente um volume 10 vezesmenor. O filtrado concentrado foi trocado em tampão em 20 mM de Tris- (hidroximetil)aminometano pH 8,0 e dessalinizado usando uma coluna de dessalinização BIO-GEL® P-6 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) pré-equilibrada com 20 ml de Tris-(hidroximetil)aminometano a 20 mM pH 8,0 (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA), pela adição de 3 ml de amostra e eluição com 3 ml do mesmo tampão. A proteína de Penicillium pinophilum GH61A, concentrada, dessalinizada foi quantificada usando um Kit de Ensaio de Proteína de Microplaca BCA® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) com albumina sérica bovina (Pierce, Rockford, IL, USA) como um padrão nas concentrações entre 0 e 0,8 mg por ml. A quantificação foi realizada em triplicata. A pureza da enzima foi confirmada usando gradiente de 8 a 16 % de SDS-PAGE a 200 V por 1 hor, e tingindo com corante de Coomassie BIO-SAFE® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

Exemplo 12: Pré-tratamento de forragem de milho

Forragem de milho foi pré-tratada no U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácido sulfúrico diluído. As seguintes condições foram usadas para o pré-tratamento: 1,4 % em peso de ácido sulfurico a 165°C e 107 psi por 8 minutos. Os sólidos insolúveis em água na forragem de milho pré-tratada contiveram 57,5 % de celulose, 4,6 % de hemicelulose e 28,4 % de lignina. A celulose e a hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise em ácido sulfurico de dois estágio com análise subsequente de açúcares pela cromatografia líquida de alto desempenho usando o Procedimento Analítico Padrão da NREL #002. A lignina foi determinada gravimetricamente depois de hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfurico usando o Procedimento Analítico Padrão NREL #003.

A forragem de milho pré-tratada foi moída e lavada com água antes do uso. A forragem de milho pré-tratada moída e lavada (peso secoinicial de 32,35 %) foi preparada pela moagem em um triturador de multi- utilidade a úmido Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, índia), e lavagem subsequente repetidamente com água desionizada e separando por decantação a fração sobrenadante. O peso seco da forragem de milho pré-tratada moída, lavada com água foi descoberta ser 7,114 %.

Exemplo 13: Efeito do polipeptídeo de Penicillium pinophilum GH61A tendo atividade de intensificação celulolítica sobre a hidrólise enzimática de forragem de milho pré-tratada

A hidrólise de forragem de milho pré-tratada foi conduzida usando placas de 96 reservatórios profundos de 2,2 ml (Axygen, Union City, CA, USA) contendo uma massa de reação total de 1 g. A hidrólise foi realizada com 5 % de sólidos totais de forragem de milho pré-tratada, lavada, equivalente a 28,75 mg de celulose por ml, em 50 mM de tampão de acetato de sódio pH 5,0 contendo 1 mM de sulfato de manganês e uma composição de celulase de Trichoderma reesei (CELLUCLAST® suplementado com beta-glicosidade de Aspergillus oryzae disponível da Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca; a composição da celulase é designada aqui nos Exemplos como “composição de celulase de Trichoderma reesei”) a 4 mg por g de celulose. O polipeptídeo GH61A de Penicillium pinophilum tendo atividade de intensificação celulolítica foi adicionado em concentrações entre 0 e 93 % (p/p) de proteína total. As placas foram seladas usando um selador térmico de placa ALPS-300® (Abgene, Epsom, Reino Unido) e incubadas a 50°C por 0 a 168 horas com agitação a 150 rpm. Todos os experimentos foram realizados em duplicata ou triplicata.

Em vários pontos de tempo entre 24 e 168 horas de incubação, alíquotas de 100 pl foram removidas e o grau de hidrólise foi ensaiado pela cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) usando o protocolo descrito abaixo.Para a análise de HPLC, as amostras foram filtradas com uma placa de filtro de 96 reservatórios de 0,45 pm MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, USA) e os filtrados analisados quanto ao teor de açúcar como descrito abaixo. As concentrações de açúcar das amostras diluídas em 0,005 M de H2SO4 foram medidas usando uma coluna 4,6 x 250 mm AMINAX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) pela eluição com 0,5 % p/p de ácido benzóico-H2SO4 5 mM em uma vazão de 0,6 ml por minuto a 65°C por 11 minutos, e a quantificação pela integração dos sinais de glicose e celobiose da detecção de índice refrativo (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) calibrado pelas amostras de açúcar puro. Os equivalentes resultantes foram usados para calcular a porcentagem de conversão de celulose para cada reação. O grau de cada hidrólise foi determinada como a fração de celulose total convertida para celobiose + glicose, e não foi corrigida quanto aos açúcares solúveis presentes no líquido de forragem de milho pré-tratada.

Todo o processamento dos dados de HPLC foi realizado usando o software Kaleidagraph (Synergy software, Reading, PA, USA). As concentrações de açúcar medidas foram ajustadas quanto ao fator de diluição apropriado. A glicose e celobiose foram cromatograficamente separadas e integradas e as suas respectivas concentrações determinadas independentemente. Entretanto, para calcular a conversão total da glicose e celobiose os valores foram combinados. A hidrólise fracionai é relatada como a conversão de massa global para [glicose+celobiose]/[celulose total]. Os pontos de dados em triplicata foram calculados em média e o desvio padrão foi calculado.

A hidrólise fracionai foi plotada como uma função da concentração da proteína GH61A de Penicillium pinophilum e ajustada com um modelo de saturação-aglutinação modificado usando Kaleidagraph. Os dados como mostrados na Figura 5 demonstraram a intensificação da hidrólise pela composição da celulase de Trichoderma reesei pela adição do polipeptídeo GH61A de Penicillium pinophilumtendo atividade de intensificação celulolítica. A adição do polipeptídeo GH61A de 0 a 93 % (p/p) intensificou a hidrólise pela composição de celulase de Trichoderma reesei em 23,4 ± 1,6 %, de 60,0 ± 1,3 % para 73,3 ± 2,1 % de conversão de glicano depois de 3 dias de hidrólise, e intensificou a hidrólise em 27,7 +1,9 %, de 71,3 ± 1,3 % para 99,0 ± 2,3 % de conversão de glicano depois de 7 dias de hidrólise.

Depósito de Material Biológico

O seguinte Material Biológico foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Alemanha, e dado o seguinte número de acesso:

Depósito Número de acesso Date de DepósitoE. coli (pGEM-T-Ppin7) DSM 22711 24 de Junho de 2009

A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente a uma pessoa determinada pelas leis de patente estrangeiras a ser para isso designada. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível como requerido pelas leis de patente em países em que as contrapartes do pedido objeto, ou a sua progénie são depositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para a prática da invenção objeto em detrimento dos direitos de patente garantidos pela ação governamental.

A presente invenção é descrita ainda pelos seguintes parágrafos numerados:

[1] Um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica, selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alta estringência com (i) a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) o filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (d) uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (e) um fragmento de um polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que tem atividade de intensificação celulolítica.

[2] O polipeptídeo do parágrafo 1, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[3] O polipeptídeo do parágrafo 2, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 85 % de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[4] O polipeptídeo do parágrafo 3, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 90 % de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[5] O polipeptídeo do parágrafo 4, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 95 % de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[6] O polipeptídeo do parágrafo 5, que compreende uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 97 % de identidade com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[7] O polipeptídeo do parágrafo 1, que compreende ou que consiste de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2; ou um fragmento desta tendo atividade de intensificação celulolítica.

[8] O polipeptídeo do parágrafo 7, que compreende ou que consiste de sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

[9] O polipeptídeo do parágrafo 7, que compreende ou que consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[10] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de alta estringência com (i) a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii).

[11] O polipeptídeo do parágrafo 10, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de estringência muito alta com (i) a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de cDNA contida na sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento total de (i) ou (ii).

[12] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[13] O polipeptídeo do parágrafo 12, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 85 % de identidade com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[14] O polipeptídeo do parágrafo 13, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 90 % de identidade com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[15] O polipeptídeo do parágrafo 14, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelomenos 95 % de identidade com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[16] O polipeptídeo do parágrafo 15, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 97 % de identidade com a sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[17] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou que consiste de sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1; ou uma subsequência desta que codifica um fragmento tendo atividade de intensificação celulolítica.

[18] O polipeptídeo do parágrafo 17, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou que consiste de sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1.

[19] O polipeptídeo do parágrafo 17, que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou que consiste da sequência que codifica polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.

[20] O polipeptídeo do parágrafo 1, em que o polipeptídeo é uma variante que compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[21] O polipeptídeo do parágrafo 1, que é codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pGEM-T-Ppin7 que é contido na E. coli DSM 22711.

[22] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 21, em que o polipeptídeo maduro é formado dos aminoácidos de 22 a 322 de SEQ ID NO: 2.

[23] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 22, em que a sequência que codifica polipeptídeo maduro é formada dos nucleotídeos de 64 a 1018 de SEQ ID NO: 1.

[24] Uma composição que compreende o polipeptídeo dequalquer um dos parágrafos de 1 a 23.

[25] Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 23.

[26] Uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 25 operavelmente ligado a uma ou mais (várias) sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[27] Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 25 operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo.

[28] Um método para produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 23, que compreende: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[29] Um método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica, que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira do parágrafo 27 sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[30] Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 23.

[31] Um método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica, que compreende: (a) cultivar a planta transgênica ou célula de planta do parágrafo 30 sob condições condutoras para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[32] Um método para produzir um mutante de uma célula precursora, que compreende inativar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos de 1 a 23, que resulta na produção do mutante menos do polipeptídeo do que da célula precursora.

[33] Uma célula mutante produzida pelo método do parágrafo 32.

[34] A célula mutante do parágrafo 33, compreendendo ainda um gene que codifica uma proteína nativa ou heteróloga.

[35] Um método para produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar a célula mutante dos parágrafos 33 ou 34 sob condições condutoras para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[36] Uma molécula de RNA inibidora de filamento duplo (dsRNA) que compreende uma subsequência do polinucleotídeo do parágrafo 25, em que opcionalmente o dsRNA é um siRNA ou uma molécula de miRNA.

[37] A molécula de RNA inibidor de filamento duplo (dsRNA) do parágrafo 36, que é de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex no comprimento.

[38] Um método para inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica em uma célula, que compreende administrar à célula ou expressar na célula a molécula de RNA inibidora de filamento duplo (dsRNA) do parágrafo 36.

[39] Uma célula produzida pelo método do parágrafo 38.

[40] A célula do parágrafo 39, que compreende ainda um gene que codifica uma proteína nativa ou heteróloga.

[41] Um método para produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar a célula do parágrafo 39 ou 40 sob condições condutoras para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[42] Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 21 de SEQ ID NO: 2.

[43] Uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada aopolinucleotídeo do parágrafo 42, em que o gene é estranho para o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal.

[44] Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 42, em que o gene é estranho para o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal.

[45] Um método para produzir uma proteína, que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo do parágrafo 42, em que o gene é estranho para o polinucleotídeo que codifica o peptídeo de sinal, sob condições condutoras para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[46] Um método para degradar ou converter um material celulósico, que compreende: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 23.

[47] O método do parágrafo 46, em que o material celulósico é pré-tratado.

[48] O método dos parágrafos 46 ou 47, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma celulase, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma enzima ligninolítica, um apectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma suolenina.

[49] O método do parágrafo 48, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase, e uma beta-glicosidase.

[50] O método do parágrafo 48, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanoase, e uma xilosidase.

[51] O método de qualquer um dos parágrafos de 46 a 50, que compreende ainda recuperar o material celulósico degradado.

[52] O método do parágrafo 51, em que o material celulósico degradado é um açúcar.

[53] O método do parágrafo 52, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste de glicose, xilose, manose, galactose, e arabinose.

[54] Um método para produzir um produto de fermentação, que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica de qualquer um dos parágrafos de 1 a 23; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais micro-organismos fermentadores para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[55] O método do parágrafo 54, em que o material celulósico é pré-tratado.

[56] O método dos parágrafos 54 ou 55, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma celulase, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma suolenina.

[57] O método do parágrafo 56, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase, e uma beta-glicosidase.

[58] O método do parágrafo 56, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, umamananase, uma manosidase, uma xilanoase, e uma xilosidase.

[59] O método de qualquer um dos parágrafos de 54 a 58, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.

[60] O método de qualquer um dos parágrafos de 54 a 59, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, ou um gás.

[61] Um método de fermentar um material celulósico, que compreende: fermentar o material celulósico com um ou mais microorganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica de qualquer um do parágrafos de 1 a 23.

[62] O método do parágrafo 61, em que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.

[63] O método do parágrafo 62, que compreende ainda recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[64] O método de qualquer um dos parágrafos de 61 a 63, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

[65] O método de qualquer um dos parágrafos de 61 a 64, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma celulase, uma hemicelulase, uma expansina, uma esterase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease, e uma suolenina.

[66] O método do parágrafo 65, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma endoglicanase, uma celobio-hidrolase, e uma beta-glicosidase.

[67] O método do parágrafo 65, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste de uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, umaarabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glicuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanoase, e uma xilosidase.

[68] O método de qualquer um dos parágrafos de 62 a 67, emque o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, ou um gás.A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelos aspectos aqui divulgados, visto que estes aspectos são intencionados como ilustrações de vários aspectos da invenção. Qualquer umdos aspectos equivalentes são intencionados a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas tomar-se-ão evidentes a aqueles habilitados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são intencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, apresente divulgação incluindo as definições controlarão.

Claims

1. Célula hospedeira microbiana transgênica, caracterizadapelo fato de que compreende um polinucleotídeo heterólogo codificando umpolipeptídeo GH61 possuindo atividade de intensificação celulolítica, em queo polinucleotídeo consiste na SEQ ID NO: 1 ou suas sequências degeneradasque codificam o mesmo polipeptídeo GH61 de SEQ ID NO: 2, ou osnucleotídeos 64 a 1018 da SEQ ID NO: 1 ou suas sequências degeneradas quecodificam o mesmo polipeptídeo GH61 dos aminoácidos 22 a 322 da SEQ IDNO: 2.

2. Método para produzir um polipeptídeo GH61 tendoatividade de intensificação celulolítica, caracterizadopelo fato de quecompreende:(a) cultivar a célula hospedeira microbiana transgênica comodefinida na reivindicação 1 para a produção do polipeptídeo GH61; e(b) recuperar o polipeptídeo GH61.

3. Método para produzir um mutante de uma célula precursora,caracterizadopelo fato de que compreender romper ou deletar umpolinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou suas sequências degeneradasque codificam o mesmo polipeptídeo GH61 de SEQ ID NO: 2, que resulta nacélula mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula precursora.

4. Construção de ácido nucleico, caracterizadapelo fato decompreender um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado a umasequência de nucleotídeo que codifica um peptídeo sinal compreendendo ouconsistindo nos nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 1 ou suas sequênciasdegeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo sinal dos aminoácidos 1 a21 da SEQ ID NO: 2, em que o gene é de outra origem à sequência denucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

5. Método para produzir uma proteína, caracterizadopelo fatode que compreende: (a) cultivar uma célula hospedeira microbiana transgênica paraa produção da proteína, em que a célula hospedeira microbiana transgênicacompreende a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 4,e(b) recuperar a proteína.

6. Método para degradar um material celulósico, caracterizadopelo fato de que compreende: tratar o material celulósico com umacomposição de enzima compreendendo o polipeptídeo GH61 tendo atividadede intensificação celulolítica consistindo na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos22 a 322 da SEQ ID NO: 2.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que compreende adicionalmente recuperar o material celulósicodegradado.

8. Método para produzir um produto de fermentação,caracterizado pelo fato de que compreende:(a) sacarificar um material celulósico com uma composição deenzima compreendendo o polipeptídeo GH61 tendo atividade deintensificação celulolítica consistindo na SEQ ID NO: 2 ou aminoácidos 22 a322 da SEQ ID NO: 2;(b) fermentar o material celulósico sacarificado com um oumais microorganismos fermentadores para produzir o produto defermentação; e(c) recuperar o produto de fermentação a partir dafermentação.

9. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato decompreender um polinucleotídeo consistindo na SEQ ID NO: 1 ou suassequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo GH61 de SEQID NO: 2, ou os nucleotídeos 64 a 1018 da SEQ ID NO: 1 ou suas sequênciasdegeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo GH61 dos aminoácidos 22 a 322 da SEQ ID NO: 2, operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

10. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de5 compreender a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 9.