BR112012000604A2

BR112012000604A2 - método isotérmico rápido altamente sensível para a detecção de mutações pontuais e snps, conjunto de iniciadores e kit deles

Info

Publication number: BR112012000604A2
Application number: BR112012000604-5A
Authority: BR
Inventors: Daniel Adlertein; Giulia Amicarelli; Giulia Minnucci
Original assignee: Biotrin International Limited
Priority date: 2009-07-10
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2020-08-11
Also published as: ATE554189T1; EP2272978A9; EP2272978B1; EP2451968B1; ES2535178T3; US20120171676A1; WO2011003690A8; WO2011003690A1; ES2386514T3; US9404149B2; JP5841939B2; EP2272978A1; EP2451968B8; JP2012531919A; EP2451968A1; DK2272978T3

Abstract

MÉTODO ISOTÉRMICO RÁPIDO ALTAMENTE SENSÍVEL PARA A DETECÇÃO DE MUTAÇÕES PONTUAIS E SNPS, CONJUNTO DE INICIADORES E KIT DETES. O presente invento se refere a um método para detectar uma mutação pontual de uma sequência de nucieotideos por um aperfeiçoamento do método de amplificação LAMP (amplificação isotérmica mediada por Iaço), bem como a um conjunto de iniciadores e a um kit para eles. Como uma forma não limitativa de realização do presente invento, o invento se refere à mutação G1849T do gene JAK2.

Description

h .

1 /44 Método isotérmico rápido altamente sensível para a detecção de mutações

P pontuais e SNPs, conjunto de iniciadores e kit deles. Refere-se o presente invento a um método para detectar uma mutação pontual ou SNP em uma sequência de nucleotídeos por meio de um 5 método de amplificação LAMP (ampiificação isotérmica mediada por laço) aperfeiçoado, bem como a um conjunto de iniciadores e a um kit para executar o método do presente invento. De acordo com uma forma não limitativa de realização do presente invento, o método, o conjunto de iniciadores e o kit são adequados para detectar a mutação G1849T (V617F) no gene JAK2. 10 Desordens mieloproliferativas (MPD) são desordens clonais de progenitores hematopoiéticos e incluem as MPDs clássicas: leucemia mieloide crônica (CML), policitemia vera (PV), trombocitemia essencial (ET) e mielofibrose primária (PMF), bem como leucemia eosinofilica crônica (CEL), leucemia mielomonocÍtica crônica (CMML) e mastocitose sistêmica (SM), e outras. Nas duas décadas passadas, foram . 15 identificados alelos mutantes em CML, CMML, CEL e SM2-5, e em cada caso a mutação causadora resulta em ativação constitutiva de sinalização de tirosina quinase. As causas genéticas das MPDS mais comuns permaneceram desconhecidas até a identificação de mutações que ativam a sinalização janus quinase 2 (JAK2) na maioria dos pacientes com PV, ET ou PMF (1, 2, 3, 4). JAK2 é um membro da família Janus de não-receptores e 20 tirosina quinases citoplásmicos, que também inclui JAKI, JAK3 e TYK2. A mutação é uma i substituição guanina-timidina na posição 1849 na sequência de codificação JAK2 - - (Gen8ank no. NM_ 004972, SEQ ID NO: 1), numeração iniciando no códon de partida ATG, correspondendo à posição 2343 de SEQ ID NO: 1. Tal mutação resulta numa substituiçào de valina por fenilalanina no aminoácido 617 da proteina JAK2 (JAK2V617F), 25 dentro do domínio pseudoquinase JH2 (5). A perda de autoinibição JAK2 resulta na ativação constitutiva da quinase, análoga a outras mutações nas MPDS e leucemia que aberrantemente ativam tirosina quinases (6, 7, 8). O sequênciamento direto é sensivel somente a cerca de * 20% de DNA mutante num fundo selvagem (9, 10). Esta questão é muito relevante às 30 desordens mieloides crônicas, em que o sangue e medula são frequentemente compostos de uma mistura de elementos neoplásicos e hematopoiéticos normais residuais. Este é especialmente o caso de ET e MDS, em que mutações genéticas fenotipicamente aparentes podem estar presentes em clones muito pequenos compreendendo menos de 10% da população celular total da medula. james et al. (11) 35 exploraram essa questão especificamente com relação a JAK2 1849 G-T realizando uma série de experimentos de mistura com células de eritroleucemia HEL, que têm a mutação JAK2, misturadas com células de eritroleucemia TF-I, que não têm. Eles falharam em

2 /44 detectar alelos quando estava presente em < 5°/0 do DNA total. Com DNA de pacientes mutantes homozigotos diluido em DNA de uma pessoa saudável, o sequênciamento foi

A ainda menos sensivel (10%) que foi com as linhagens celulares (12). Um método comum usado para a detecção de mutações em . 5 ácidos nucleicos é a amplificação alelo específica (ARMS - Amplification Refractory Mutation System). Ela explora o fato de que os iniciadores oligonucleotídeos devem estar perfeitamente pareados nas suas extremidades 3' por uma DNA polimerase para estender estes iniciadores durante a PCR (12). Ao projetar iniciadores oligonucleotideos que correspondem somente a uma mutação pontual específica de DNA, tal como a que 10 codifica JAK2 V617F, a ARMS pode distinguir entre alelos polimórficos. Portanto, estas técnicas são conhecidas pelos nomes alternativos de PCR alelo especlfica (AS-PCR) ou PCR de iniciador especifico de sequência. A sensibilidade da ARMS é de até 1 a 2°/0 (13) de DNA mutante num fundo selvagem. O monitoramento em tempo real da acumdação de produto . 15 PCR durante o termociclo pode ser valiosa como um método semiquantitativo e ensaios de curva DNA-fusão podem ser usados em çonjunto com a PCR em tempo real. Da mesma forma, james et al. (14) compararam o sequênciamento por corante fluorescente com dois sistemas diferentes de detecção de mutação baseados em PCR em tempo real, um usando um instrumento LightCycler (Roche Diagnostics) e o outro usando uma 0 20 máquina Taqman ABI Prism 7500 (Applied Biosystems). Estas técnicas de PCR em m ' tempo real detectaram de 0,5 a 1°6 de DNA de linhagem celular HEL diluído em DNA de linhagem celular TF-I e de 2 a 4°/j de DNA de paciente homozigoticamente mutado diluido em DNA de uma pessoa saudável. Uma análise de polimorfismo por restrição de comprimento 25 de fragmento (RFLP) é possível uma vez que a mutação G-T de JAK2 1849 abole um motivo na sequência JAK2 selvagem que é reconhecido pela enzima de restrição BsaXl. Embora a abolição de ijm sÍtio de restrição não seja tão satisfatória quanto a criação de um novo sitio, porque a reação de clivagem enzimática negativa poderia ser devida ou à . ausência da mutação ou à falha do procedimento de digestão, ela pode ser útil como uma 30 primeira análise de passagem. A sensibilidade proporcional relatada depende em parte do método usado para detectar os fragmentos e é de aproximadamente 20% de DNA mutante em fundo selvagem (15, 16). O pirosequênciamento é um método de genotipação rápida que depende da liberação de pirofosfato (PPi) quando um dNTP é incorporado numa 35 cadeia de DNA em crescimento durante a poIimerização de DNA por gabarito (17). O pirosequênciamento de JAK2 usando o sistema automatizado PSQ HS 96 (Biotage, Upsala, Suécia) foi tentado por vários grupos (17, 18) com experimentos de diluição

3 /44 similares àqueles descritos acima mostrando uma sensibilidade de ensaio relatada de 5 a 10°/o de alelos mutantes em um fundo selvagem. Várias outras técnicas de detecção de mutação foram descritas, incluindo análise de polimorfismo conformacional de fita única (SSCP), 5 eletroforese em gel com gradiente de desnaturação (DGGE), cromatografia líquida de alto desempenho de desnaturação (DHPLC), ensaios de extensão de iniciadores de nucleotideo único (Pronto), e outros. De fato, a DHPLC pode detectar confiavelmente a mutação genômica subjacente do DNA JAK2 V617F, e pode detectar mutações numa proporcionalidade de <1 a 2°/0. Entretanto, a DHPLC e as outras técnicas são ou 10 tecnicamente desafiadoras ou trabalhosas, ou ambos. Elas não permitem uma alta produtividade a um custo adequado para um laboratório clínico (SSCP e DGGE) ou exigem um investimento inicial considerável em equipamento (DHPLC). Teoricamente, as técnicas baseadas em proteínas também poderiam ser usadas para detectar a mutação JAK2 V617F, mas elas são geralmente 15 incômodas, e o acesso a tais recursos é Iimitado. Portanto, os ensaios baseados em proteinas são usualmente não preferidos se forem praticáveis testes baseados em DNA ou RNA. O pedido de patente europeia EP A 1692281 descreve um método para a detecção da mutação G1849T JAK2 baseada em amplificação por PCR. 20 O método do estado da técnica exibe várias limitações.

W

L Primeiramente, o baixo nível de sensibilidade, que no melhor dos casos permite a detecção da sequência mutante JAK2 até 1°/0 da amostra. Tal sensibilidade exige o enriquecimento dos mutantes via isolamento de granulócitos antes da extraçào. Esta é uma etapa trabalhosa que consome tempo resultando em cerca de 2 horas adicionais aos 25 procedimentos já demorados (de 2 a 5 horas) exigidos para o diagnóstico. Além disso, todos os métodos previamente ilustrados são relativamente trabalhosos e caros, frequentemente exigindo equipamento especializado que nem sempre pode estar prontamente disponivel. Os inventores estabeleceram um novo método LAMP de 30 detecção de mutação pontual ou SNP em uma molécula de ácido nucleico, que é particularmente seletivo e rápido. Os inventores também estabeleceram um novo conjunto de iniciadores e um kit para executar o método do presente invento. O método para detectar uma mutação pontual em ácido nucleico ou SNP e o conjunto de iniciadores e seu kit são caracterizados pelas caracteristicas definidas nas reivindicações anexas, 35 que formam uma parte integral da descrição. O método do presente invento difere da tecnologia LAMP convencional que é descrita no pedido de patente EP A 1020534 e que é ilustrado aqui na

4 /44 Fig. 1. O método do presente invento permite a amplificação e detecção seletiva simultânea de uma única substituição de base em uma amostra de ácido nucleico Além * disso, o método do presente invento é fácil de ser executado, uma vez que requer r instrumentação simples e qs resU|tados podem ser gerados num único tubo de reação. 5 Por estas razões, ele também é menos caro em comparação com os métodos do estado da técnica. O método do presente invento supera as limitações e desvantagens das técnicas do estado da técnica, resultando numa sensibilidade maior (até 0,01% de sequências mutantes num fundo selvagem); ele é isotérmico e rápido, 10 completando o diagnóstico em uma hora de reação. Em adição, o método do presente invento permite avaliar se a quantidade do alelo mutante, tal como por exemplo o alelo JAK2 mutante, que está presente na amostra testada, é superior ou inferior a 50°/o, provendo uma indicação de se o sujeito testado é heterozigótico ou homozigótico para a mutação pontual de ácido nucleico ou SNP de interesse.

, 15 Portanto, um primeiro aspecto do presente invento é um método para detectar a presença de uma mutação pontual numa molécula alvo de ácido nucleico com um fundo de moléculas de ácido nucleico selvagens, o método compreendendo as etapas de: 0 1) prover uma amostra de ácido nucleico 20 2) contatar dita amostra de ácido nucleico, sob condições de reação apropriadas, com \ uma solução compreendendo uma mistura de oKgonucleotldeos e uma DNA - polimerase tendo atividade de deslocamento de fita sob condições de hibridização, em que dita mistura de o|igonuc|eotÍdeos consiste de iniciadores adequados para ampiificação isotérmica mediada por laço da região da molécula alvo de ácido 25 nucleico incluindo a posição no ácido nucleico da mutação pontual a ser detectada, ditos iniciadores compreendendo: i. um primeiro iniciador externo F3 e um segundo iniciador externo B3: ii. um primeiro iniciador interno FlP e um segundo iniciador interno BlP, em que FlP consiste de uma sequência F2 de ácido nucleico 3' e uma 30 sequência Flc de ácido nucleico 5', e BlP consiste de uma seqUência B2 de ácido nucleico 3' e uma sequência Blc de ácido nucleico 5', em que F2 é capaz de reconhecer e hibridizar-se a uma região da molécula alvo de ácido nucleico designada como F2C e B2 é capaz de reconhecer e hibridizar-se a uma região da molécula alvo de ácido nucleico designada 35 como B2C, em que F2C e B2C são regiões diferentes situadas em fitas opostas da molécula alvo de ácido nucleico,

5 /44 em que B2C está a jusante da mutação pontual ou F2C está a montante da mutação pontual, e em que se B2C está a jusante da mutação pontual, então dita mutação pontual está situada na sequência F2C ou a jusante da sequência F2C e a montante da sequência Flc, ou se F2C está a montante da mutação pontual, então dita mutação pontual está situada na sequência B2c ou a montante da sequência B2C e a jusante da sequência BIC. iii. um iniciador extensivel mutante haste-laço compreendendo: - uma sequência de laço central capaz de reconhecer seletivamente e hibridizar-se a uma região da molécula alvo de ácido nucleico compreendendo a mutação pontual, de modo que a sequência de laço central seja capaz de reconhecer e hibridizar-se à molécula alvo de ácido nucleico somente se a mutação pontual estiver presente, e - uma sequência terminal 5' e uma sequência terminal 3' que são complementares uma à outra para formar uma haste com a hibridização intramolecular, a afinidade de hibridização da sequência do laço central à região da molécula alvo de ácido nucleico compreendendo a mutação pontual sendo maior que a afinidade de hibridização intramolecular da sequência 5' à sequência 3' de modo que, se o ponto de hibridização estiver presente, a sequência de laço central pareia e amplifica a região da molécula alvo de ácido nucleico compreendendo o ponto de mutação; iv. uma porçào não extensível que é capaz de seletivamente reconhecer e hibridizar-se às moléculas de ácido nucleico selvagem; 3) incubar a mistura resultante a temperatura constante; 4) detectar um sinal indicativo de amplificação da região da molécula alvo de ácido nucleico compreendendo a mutação pontual.

A primeira etapa do método implica em obter a amostra de ácido nucleico a ser testada, tal como por exemplo de um paciente suspeito de portar a mutação pontual de interesse, seja na forma heterozigótica ou na forma homozigótica.

Numa forma preferida de realização do presente invento, os dois iniciadores internos FlP e BlP são projetados sobre uma região da molécula alvo de ácido nucleico compreendendo a posição no ácido nucleico da mutação pontual a ser detectada de modo que a mutação pontual esteja situada na região entre a sequência F2c e a sequência Flc ou entre a sequência B2C e a sequência BIC.

Numa forma de realização alternativa, a mutação pontual está situada na região sondada por B2 ou F2,

6 /44 ou seja dentro da sequência F2C ou dentro da sequência B2C.

Numa outra forma preferida de realização, a sequência na . extremidade 5' e a sequência na extremidade 3' do iniciador extensivel mutante haste- laço tem comprimento de pelo menos 3 nucleotideos.

O iniciador extensível mutante * 5 haste-laço pode alternativamente ser designado como um "iniciador extensível mutante auto-pareado", ou mais simplesmente como um "iniciador extensível auto-pareado" (LB ou LF). Numa outra forma preferida de realização do método de acordo com o presente invento, a porção não extensivel ê um ácido nucleico peptidico 10 (PNA), que tem preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento.

Os DNAS e RNAS consistem respectivamente de uma cadeia principal de açúcar desoxirribose e ribose, enquanto a cadeia principal de PNA é feita de unidades de repetição N-(2-aminoetil)-glicina ligadas por ligações peptidicas.

As bases purina e pirimidina são ligadas à cadeia principal por ligações metileno-carbonila.

Os PNAS são

. 15 ilustrados como peptídeos, com o terminal N na primeira (esquerda) posição e o terminal C na direita.

Uma vez que a cadeia principal de PNA nào contém qualquer grupo fosfato, a ligação entre fitas PNNDNA é mais forte que entre fitas DNNDNA devido à falta de repulsão eletrostática.

Numa forma de realização mais preferida do presente . 20 invento, o ácido nucleico peptidico (PNA) compreende uma sequència de bases que é b capaz de hibridizar com a região da molécula de ácido nucleico que inclui a mutação . pontual putativa (ou seja, que inclui a posição de ácido nucleico da mutação pontual a ser detectada), resultando com isso na formação de duas estruturas de dupla fita, uma com a molécula alvo de ácido nucleico selvagem e a outra com a molécula alvo de ácido 25 nucleico mutada.

A temperatura de fusão da estrutura de dupla fita resultante da hibridização do PNA com a molécuia aivo de ácido nucleico na ausência da mutação pontual (i.e., com a sequència selvagem) é designada como (Tm) = X e a temperatura de fusão da estrutura de dupla fita resultante da hibridização do PNA com a molécula alvo de ácido nucleico na presença do ponto de mutação (i.e., com a sequência mutada) é 30 designado como (TM) = Y.

De acordo com uma forma preferida de realização, Y " Temperatura de lncubação "= X, e X é pelo menos 5°C maior que Y.

Numa forma alternativa de realização do presente invento, a porção não extensivel é um iniciador não extensível selvagem haste-laço, que compreende: 35 - uma sequência central de laço capaz de seletivamente reconhecer e hibridizar a uma região da molécula de ácido nucleico selvagem compreendendo a posição do ácido nucleico da mutação pontual a ser detectada;

7 /44 - uma sequência terminal 5' e uma sequência terminal 3' sendo complementares uma à outra para formar uma haste, de modo que dita sequência do laço central tenha uma maior afinidade de hibridização à região compreendendo a sequência selvagem da molécula de ácido nucleico que a

V 5 afinidade de hibridização da sequência terminal 5' à sequência terminai 3', de modo que resulte no pareamento e bloqueamento da amplificação da sequência selvagem. Os técnicos da área sabem do fato que a hibridização entre a sequência terminal 5' e a sequência terminal 3' é uma hibridização intramolecular. Numa forma preferida de realização do presente invento, a 10 DNA polimerase tendo atividade de deslocamento de fita sob as condições de reação é a polimerase de fragmento grande Bst; alternativamente, é um fragmento ou uma combinação de fragmentos de Bca (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), fago ij29, fago MS-2, Z-Taq, KOD, Klenow. Numa forma preferida de realização, a temperatura de . 15 reação constante está compreendida entre 62 e 67°C. Numa forma preferida de reaiização do presente invento, o sinal indicativo de amplificação da molécula nucleotideo compreendendo a mutação pontual é detectado por turbidimetria. Alternativamente, o sinal indicativo de amplificação da molécula nucleotÍdeo compreendendo a mutação pontual é detectado por 0 20 fluorescência ou por quaisquer outros meios adequados de detecção. Numa outra forma preferida de realização do presente . invento, a molécula alvo de ácido nucleico compreende a região do gene humano JAK2 (Gen8ank no. NG _009904, SEQ ID NO: 2) contendo a substituição putativa guanidina- timidina na base 93526 de SEQ ID NO: 2, correspondendo à posição de nucleotídeo 25 1849 a partir do códon de inicio na sequência de codificação JAK2 (Gen8ank no. NM _004972, SEQ ID NO: 1), que por sua vez corresponde à posição 2343 de SEQ ID NO: 1. Preferencialmente, os primeiro e segundo iniciadores . externos F3 e B3 estão situados respectivamente nas regiões de introns flanqueando o 30 éxon 14 do gene humano JAK2 (Gen8ank no. NG _ 009904, SEQ ID NO: 2) que contém a substituição putativa de base G ~ T na posição 93526. Mais preferencialmente, F3 consiste de uma sequência de nucleotideo abrangendo as posições de 93367 a 93388 de SEQ ID NO: 2 e B3 consiste de uma sequência de nucleotideos que é complementar à região de nucleotideos entre as posições 93561 e 93582 de SEQ ID NO: 2. 35 Preferencialmente, os primeiro e segundo iniciadores internos FlP e BlP são projetados como segue: o iniciador FIP consiste de uma sequência F2 situada na região Íntron a montante do éxon 14 de JAK2 (preferencialmente entre as posições 93408 e 93425 de

8 /44 SEQ ID NO: 2) e de uma sequência FIC que é complementar aos nucleotideos de 93445 a 93470 de SEQ ID NO: 2; o iniciador BlP consiste de uma sequência B2 complementar a uma região compreendendo os nucleotideos de 93538 a 93559 de SEQ ID NO: 2, que inclui as primeiras dezoito bases do Íntron a jusante, e de uma sequência Blc situada na

V 5 posição de 93486 a 93515 de SEQ ID NO: 2. A sequência central do laço do iniciador extensível mutante haste-laço consiste preferencialmente de nucleotídeos 93516 a 93529 de SEQ ID NO: 2. A sequência de bases PNA consiste preferencialmente dos nucleotideos de 93518 a 93534 de SEQ ID NO: 2. Mais preferencialmente, os iniciadores adequados para 10 amplificação isotérmica mediada por laço, que são empregados para executar o método de acordo com o presente invento, consistem das seguintes sequências: F3 5"GCATCTTTATTATGGCAGAGAG-3' (SEQ 1D NO: 3): B3 5'-TGCTCTGAGAAAGGCATTA-3' (SEQ ID NO: 4): FIP 5'-GCTGCWC~G~GACTMGG~TGGACMCAGTC~CMC-3' (SEQ ID NO: 5): . 15 BlP 5'-GC17TCTCACAAGCATTTGG I I I IAAATTAGCCTGTAG | | I IACTTACTCTC-3' (SEQ ID NO: 6): lniciador extensivel mutante haste Iaço: 5'-GTCTCCACTGGAGTATG | | i CTGTGGAGAC-3' (SEQ ID NO: 8). Numa forma de realização mais preferida, a porção não 20 extensivel é uma molécula PNA, preferencialmente tendo a estrutura '"GAGTATGTGTCTGTGGA'°"" (SEQ ID NO: 9). O método do presente invento também é adequado para avaiiar quantitativamente a quantidade de alelos mutantes (p.ex. dos alelos mutantes JAK2 presentes) numa amostra de ácido nucleico, p.ex., para avaliar se a mutação 25 pontuai está numa forma homozigótica ou heterozigótica. lsto é alcançado pela comparação quantitativa do sinal indicativo de amplificação da região da molécula alvo do ácido nucleico compreendendo a mutação pontual obtida a partir da amostra, com o dito sinal obtido a partir de pelo menos um calibrador. Numa forma preferida de realização, o pelo menos um calibrador consiste de uma percentagem predeterminada (°/0) de 30 moléculas alvo de ácidos nucleicos num fundo de moléculas de ácido nucleico selvagens, em que dita percentagem predeterminada (°/j) é preferencialmente de cerca de 10°/o. Por exemplo, analisando a eficiência de amplificação de amostras não diluidas e diluidas 1:5 em comparação com 3 calibradores (p.ex. 100%, 10°/o e 1°/0 de plasmideo mutante G1849T JAK em fundo plasmideo selvagem), é possÍvel determinar se a quantidade de 35 alelos mutantes nas amostras de teste é maior ou menor que 50%, que é indicativo de homozigose ou heterozigose. O método do presente invento também é adequado para

9 /44 detectar outras mutações genéticas responsáveis por patoiogias diferentes, tais como KRAS, EGFR, bem como para detectar SNPS. 0 Um outro aspecto do presente invento é um conjunto de iniciadores para detectar a presença de uma mutação pontual numa molécula alvo de

V 5 ácido nucleico num fundo de moléculas de ácido nucleico selvagem por amplificação isotérmica mediada por laço, o conjunto de iniciadores compreendendo um primeiro lniciador externo F3, um segundo iniciador externo B3, um primeiro iniciador interno F\P, um segundo iniciador interno BlP e um iniciador extenslvel mutante haste-laço, todos como definido acima com referência ao método do presente invento. 10 De acordo com uma forma preferida de realização, o conjunto de iniciadores compreende um primeiro iniciador externo F3 consistindo de SEQ ID NO: 3, um segundo iniciador externo B3 consistindo de SEQ ÍD NO: 4, um primeiro iniciador interno FIP consistindo de SEQ ID NO: 5, um segundo iniciador interno BlP consistindo de SEQ ID NO: 6, e um iniciador extensivel mutante haste-laço consistindo . 15 deSEQÍDNO:8. Uma forma adicional preferida de realização do presente invento é um conjunto de iniciadores como definido acima adicionalmente compreendendo uma porção não extensivel que é capaz de hibridizar com as moléculas de ácido nucleico selvagens. A porção nào extensível é por exemplo um ácido nucleico . 20 peptídico (PNA) ou um iniciador não extensivel haste-laço, como definido nas reivindicações anexas. Um PNA que tenha pelo menos 10 bases de comprimento é mais . preferido. O PNA ilustrado na lista de sequências como SEQ ID NO: 9 é a forma de realização mais preferida da porção não extensivel. Um aspecto adicional do presente invento é um kit para 25 detectar a presença de uma mutação pontual numa molécula alvo de ácido nucleico num fUndo de moléculas de ácido nucleico selvagens por amplificação isotérmica mediada por laço, o kit compreendendo um conjunto de iniciadores como definido acima bem como uma ou mais DNA polimerases tendo atividade de deslocamento de fita. A DNA poIimerase é preferencialmente escolhida dentre o grupo que consiste de polimerase de 30 grande fragmento Bst, fragmentos Bca (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), fago 1"129, fago MS-2, Z-Taq, KOD, Klenow, e quaisquer combinações deles. A DNA polimerase mais preferida é a polimerase de grande fragmento Bst. O kit de acordo com o presente invento pode conter componentes convencionais adicionais tais como por exemplo um ou mais calibradores, 35 meios para detectar e/ou quantificar a amplificação das moléculas alvo de ácido nucleico, bem como instruções para executar o ensaio. A escolha e uso de tais componentes adicionais é parte das habilidades dos técnicos da área.

10 /44 O escopo do presente invento adicionalmente compreende um iniciador oligonucleotideo isolado escolhido dentre o grupo que consiste de SEQ ID

P NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, bem como um , ácido nucleico peptidico (PNA) de 6 a 24 bases de comprimento, compreendendo uma 5 sequência de bases que é capaz de hibridizar a uma região do DNA genômico JAK 2 (SEQ ID NO: 2) incluindo a posição 93526 de SEQ ID NO: 2, ou a uma região do CDNA de JAK2 (SEQ ID NO: 1) incluindo a posição 2343 de SEQ ID NO: 1. Uma forma preferida de realização do PNA do presente invento compreende a seguinte sequência de bases: 10 NH,- GAGTATGTGTCTGTGGA-COOH (SEQ ID NO:9), em que G é guanina, A é adenina,TétiminaeCécitosina. O presente invento é adicionalmente descrito abaixo por meio de exemplos especificos não limitativos, com referência aos seguintes desenhos: Figura 1. Principio LAMP (estado da técnica) . 15 A reação de amplificação é realizada empregando-se 4 iniciadores oIiµnucleotÍdeos especificos por 6 regiões diferentes da sequência genômica alvo. Os iniciadores internos hibridizam-se às sequências complementares da molécula alvo de ácido nucleico e são estendidos pela DNA polimerase; o produto de amplificação é deslocado em duas etapas pelos iniciadores externos (F3, B3) e formatado como uma . 20 estrutura dupla de haste-laço (estrutura de partida) (painel A). A estrutura de partida é r simultaneamente amplificada a partir das extremidades 3' livres e por um outro iniciador . interno (painel B). Os concatàmeros DNA construidos pelas repetições invertidas do módulo inicial são progressivamente sintetizados de forma exponencial (painel C). Figura 2. Estratégia LAMP "HALTERE" 25 Na configuração do presente ensaio ilustrado na Fig. 2, os oIigonucleotÍdeos Flc e Blc contidos nos iniciadores internos FIP e BIP são . complementares a regiões não sobrepostas do gene JAK2 que termina e começa . respectivamente uma base a montante e uma base a jusante do nucleotideo de interesse na posição 1849 do códon de inicio na sequência de codificação JAK2. Além disso, a 30 base da extremidade 5' dos iniciadores FIP e BlP é especifica para o nucleotídeo mutado na sequência JAK2 e ambos iniciadores internos têm uma base incompativel na terceira base a partir da extremidade 3'. Quando a reação contém o alelo alvo selvagem e é formada uma estrutura do tipo haltere, as sequências Flc e Blc especificas a mutantes não são pareadas na extremidade 3' bloqueando qualquer amplificação alvo adicional. 35 Diferentemente, se o alelo alvo mutante estiver presente na solução, as sequências Flc e Blc especificas a mutantes hibridizam-se perfeitamente à região alvo complementar do ácido nucleico e são estendidas pela DNA polimerase.

11 /44 Figura 3. Estratégia LAMP "iniciador de Iaço aleio específico" O nucleotideo na extremidade 3' do iniciador de laço

P especifico a mutante é complementar ao nucleotídeo T mutado na posição 1849 na .R sequência de codificação JAK2. Em adição, este iniciador de laço contém uma base

V 5 incompativel na terceira base a partir da extremidade 3'. Se a reação contém a sequência JAK2 selvagem, a extremidade 3' do iniciador de laço específico a mutante não se pareia com a sequência alvo resultando em nenhuma amplificação. Diferentemente, se as sequências JAK2 mutantes estiverem presentes em solução, o iniciador de laço específico a mutante hibridiza perfeitamente à sequência alvo complementar e é 10 estendido pela DNA polimerase. Figura 4. Estratégia LAMP "iniciadores haste-laço" Um conjunto universal (insensivel a mutantes) de iniciadores compreendendo os oligonucleotideos F3, B3, FlP e BlP para obter um haltere apresentando o nucleotídeo T putativo mutado na região do laço. Um primeiro iniciador . 15 haste-laço é incluido, projetado para reconhecer a base mutada na estrutura haltere de fita única, juntamente com um segundo iniciador haste-laço modificado complementar à sequência JAK2 selvagem e contendo uma extremidade 3' não extensível. Quando a sequência JAK2 mutada está presente na amostra de ácido nucleico (painel A), o iniciador haste-laço especifico a mutante quebra sua estrutura interna para parear com a 4 20 sequência alvo e é estendido pela DNA polimerase. Reciprocamente, se a sequência alvo . selvagem estiver presente na amostra, o iniciador haste-laço não extensível modificado . hibridiza com a sequência alvo selvagem bloqueando a amplificação desta sequência (efeito de silenciamento). Figura 5. Estratégia LAMP "iniciador haste-laço específico a mutante com PNA" 25 Um conjunto universal (insensivel a mutantes) de iniciadores compreendendo os oIigonucleotÍdeos F3, B3, FIP e BlP para obter um haltere apresentando o nucleotideo T putativo mutado na região do iaço. Um primeiro iniciador haste-laço é inciuido, projetado para reconhecer a base mutada na estrutura haltere de fita única, juntamente com uma molécula PNA. O PNA é projetado para ser complementar 30 à região de laço compreendida entre B2 e Blc e abrangendo a posição do ácido nucleico da mutação pontual a ser detectada. Ela forma um duplex estável com a sequência JAK2 selvagem, evitando assim a hibridização e extensão do iniciador haste-laço especifico a mutante e suprimindo a amplificação não específica da sequência selvagem (painel B). O PNA não hibridiza à sequência JAK2 mutada por causa da afinidade mais baixa (painel 35 A). Figura 6. Sensibilidade do ensaio LAMP "Haltere" A reação de amplificação foi realizada numa amostra

12 /44 -- ? 4/ contendo 7 x 10' cps/µL de pIasmideo selvagem JAK2 (quadrados), em um controle sem alvo e em diluições seriadas em água de plasmideo mutante JAK2 (de 7 x 10' cps/µL a 7 x 10 cps/µL, pontos romboides, e 7 cps/µL, ponto circular). Cada amostra foi testada três ' vezes. As barras de erro representam um desvio padrão. Em comparação com o 5 plasmideo selvagem, a sequência alvo mutante é amplificada com eficlência maior até uma concentração de amostra de 7 x 10 cps/µL. O presente ensaio mostra a linearidade entre as amostras de plasmldeo mutantes 7 x 10' cps/µL e 7 x 10 cps/µL. Figura 7. Sensibilidade do ensaio LAMP "iniciador de Iaço mutante alelo específico" 10 A reação de amplificação foi realizada numa amostra contendo 7 x 10' cps/µL de plasmídeo selvagem JAK2 (pontos quadrados), em um controle sem alvo e em diluições seriadas em água de plasmideo mutante JAK2 (de 7 x 10' cps/µL a 7 x 10 cps/µL, pontos romboides). Cada amostra foi testada três vezes. As barras de erro representam um desvio padrão. Em comparação com o plasmideo . 15 selvagem, a sequência alvo mutante é amplificada com eficiência maior até uma concentração de amostra de 7 x 102 cps/µL. O presente ensaio mostra a linearidade entre as amostras de plasmideo mutantes 7 x 10' cps/µL e 7 x 10 cps/µL. Figura 8. Sensibilidade do ensaio LAMP "iniciador haste-laço" A reação de amplificação foi realizada numa amostra * 20 contendo 7 x 10' cps/µL de plasmídeo selvagem JAK2 (pontos quadrados), em um controle sem alvo e em diluições seriadas plasmídeo mutante JAK2 em plasmideo

W selvagem variando de 75% a 1°/0, quantidade total de 35000 cps de DNA por reação. Cada amostra foi testada três vezes. As barras de erro representam um desvio padrão. Em comparação com o plasmídeo selvagem, a sequência alvo mutante é amplificada 25 com eficiência maior até uma amostra de dose de 1°/0 (350 copias de plasmideo mutante em 34650 cópias do plasmídeo pai original). O ensaio mostra linearidade entre as amostras de plasmídeo mutantes 100% e 1°/0 em fundo selvagem. Figura 9. LAMP "iniciador haste-laço com PNA" Desempenho do ensaio em amostras de pIasmideo mutante 30 e selvagem (35000 cps cada) com e sem PNA. Na ausência de PNA, o plasmideo JAK2 selvagem é amplificado de forma não especifica pelo iniciador haste-laço especifico a mutante, com um atraso de 5 minutos com relação à sequência alvo mutada. Em contraste, quando o PNA é adicionado à mistura de reação, o plasmídeo selvagem é amplificado pelo iniciador haste-laço específico a mutante com um atraso de uma hora e 35 somente 5 minutos de atraso são medidos para a amplificação específica do plasmideo JAK2 mutante. O PNA forma um duplex estável somente com a sequência complementar selvagem evitando a hibridização e extensão do iniciador haste-laço especifico a mutante

13 /44

¶ causando com isso uma mudança de uma hora no tempo de amplificação da sequência selvagem.

Figura 10. Seletividade do ensaio LAMP "iniciador haste-laço com PNA" Desempenho do ensaio em amostras de plasmideo JAK2 5 mutadas (350000 cps), amostras de plasmideo JAK2 selvagem (350000 cps) e em plasmídeos mutados em diluições seriadas em fundo selvagem nas seguintes proporções: 1, 0,5, 0,1 0,05 e 0,01°/o.

As barras de erro correspondem a 1 desvio padrão.

Nenhuma amplificação foi detectada para a amostra selvagem (plasmideo selvagem 350000 cps) dentro de uma hora de reação.

A amplificação especifica da sequência alvo 10 mutante foi detectada até as sequências mutantes 0,01% em fundo selvagem (35 cópias de plasmideo mutante total em 349650 cópias de plasmídeo selvagem). O ensaio é linear até uma concentração de 0,1°/o de plasmídeos mutantes (350 cópias de plasmideo mutante total em 349650 cópias de plasmídeo selvagem). Figura 11. Reação de controle LAMP . 15 Conjunto universal (insensível a mutantes) de iniciadores incluindo os oligonucleotideos F3, B3, FlP e BlP.

Este método é projetado para amplificar a sequência alvo de DNA genômico independente da presença da mutação específica.

Tal ensaio de controle permite avaliar a eficiência de amplificaçào dos iniciadores na presença de inibidores no tubo de reação. . 20 Figura 12. Reação de controle LAMP em amostras de ácido nucleico JAK2 b selvagem e mutante . A eficiência de amplificação do conjunto universal (insensível a mutante) de iniciadores incluindo os oligonucleotideos F3, B3, FlP e BlP é comparável para todas as amostras analisadas: 100% de plasmídeo JAK2 selvagem, 25 100°6, 1O°/j e 1°/1 de plasmideo JAK2 mutante.

Um atraso ou ausência de amplificação da sequência alvo é indicativo da presença de inibidores de reação ou de problemas nas condições de reação.

Figura 13. Principio de estimativa de cópias alélicas JAK2 mutantes numa amostra de ácidos nucleicos 30 Para estimar se a quantidade de cópias alélicas de JAK2 numa amostra de ácido nucleico é maior ou menor que 50%, a LAMP modificada com iniciador haste-laço especifico a mutante e PNA é realizada em amostras não diluídas e diluidas 1:5. Se uma amostra contém mais de 50% de cópias alélicas JAK2 mutantes, o minuto de amplificação limiar da sequência alvo está compreendido entre o (min)t do 35 calibrador 100% e o calibrador 10°6 para ambas amostras não diluída (painel A) e diluída (painel B). Se uma amostra contém menos de 50% de cópias alélicas JAK2 mutantes, o minuto de amplificação limiar da sequência alvo está compreendido entre o t(min) do

14 /44 calibrador 100% e o calibrador 10°/o para as amostras não diluidas (painel A), e entre o < min(t) do calibrador 1O°/o e o calibrador 1°/0 para as amostras diluídas (painel B).

Figura 14. Estimativa de cópias alélicas JAK2 mutantes em amostras de ácido nucleico contendo mais de 50'/o de sequências alvo mutadas Quatro amostras de ácido contendo mais de 50% de 5 plasmideo JAK2 mutante em fundo selvagem (respectivamente 60%, 70%, 80°/o e 90%) foram diluídos 1:5 e analisados usando o ensaio LAMP iniciador haste-laço com PNA, juntamente com três calibradores consistindo de 100°/o, 10% e 1°/0 de plasmídeos JAK2 mutantes em fundo selvagem. Para todas as quatro amostras, o minuto de amplificação limiar estava compreendido entre o min(t) do calibrador 100% e o min(t) do calibrador 10 10°/o. Figura 15. Estimativa de cópias alélicas JAK2 mutantes em amostras de ácido nucleico contendo menos de 50°/o de sequências alvo mutadas Quatro amostras de ácido contendo 5O°/j ou menos de plasmídeo JAK2 mutante em fundo selvagem (respectivamente 40%, 30% e 20%) foram · 15 diluídos 1:5 e analisados usando o ensaio LAMP iniciador haste-laço com PNA, juntamente com três calibradores consistindo de 100%, 10% e 1°/j de plasmídeos JAK2 mutantes em fundo selvagem. A amplificação da amostra de 50°6 diluída 1:5 ocorreu no mesmo minuto limiar da amostra do calibrador 10%. Para as três amostras restantes, o minuto de amplificação limiar estava compreendido entre o min(t) do calibrador 1O°/o e o 20 min(t) do calibrador 1°/0. Os seguintes exemplos são providos somente a titulo de ilustraçào e não se destinam a limitar o escopo do presente invento como definido nas reivindicações anexas. Exemplo 1 - Materiais, métodos e resultados da estratégia halteres LAMP 25 modificada JAK2 Reagentes Os plasmideos JAK2 foram providos pelo fornecedor GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante.

30 Em detalhes: - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base G no nucleotÍdeo 93526, chamado de "plasmideo selv"; - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base T no nucleotídeo 93526, chamado de "plasmideo mut".

lniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha), 35 chamados de "iniciadores": - GA211 (F3) 5' GTCAAACAACAATTCTTTGTACT 3' (SEQ ID NO: 10):

15 /44 ¶ - GA212 (B3) 5' AGCTGTGATCCTGAAACTG 3' (SEQ id NO: 11): - GA216 (FlP) 5' - AATATAcTccATMTTTccAAATgcTTTcmcnTgMgcAgcAAgT 3' (SEQ id NO: 12): - GA220 (BIP) 5' TTTTGTGGAGACGAGAGTMGTMAACTACATMACCAGATGCTCTGA 5 3'(SEQID NO: 13): - GA221 (LF) 5' GTGAGAAAGCTTGCTCATCAT 3' (SEQ ID NO: 14): - GA222 (LB) 5' AGGCTTTCTAATGCCTTTC 3' (SEQ ID NO: 15).

Tampão de reação: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8, 50 mM Kcl, 40 mM MgSO,, 50 mM de (NH4)2SO4, 0,5°/o Tween, 5% DMSO ("buffer 5x") 10 mistura 25 mM cINTPs (Fermentas) ("cjNTPs") polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("polimerase") água apirogênica estéril (SALF Spa) ("ddw") Procedimento Preparação da amostra . 15 O preparo da mistura de reação foi como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), 0,8 µM de iniciadores de laço (LF e LB), solução tampão lx, 1,4 mM de mistura CINTPs, 8 U de polimerase Bst. O volume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e. 20 µL de mistura de reação + 5 µL de amostra). Manter sempre os .

, 20 reagentes no gelo. Preparar a mistura para pelo menos 17 amostras, compreendendo 3 controles negativos (7 x 10' cps/µL de plasmideo selvagem), 12 controles positivos (3 amostras 7 x 103 cps/µL de plasmldeo mutante, 3 amostras 7 x 102 cps/µL de plasmídeo mutante, 3 amostras 7 x 10 cps/µL de plasmideo mutante, 3 amostras 7 cps/µL de plasmídeo mutante), 1 controle sem alvo.

16 /44 ) Bst poiimerase 8 )1 l1 I1 )1 ¶ ! cINTPS 25 mM 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 ) ddw para 20 µL j13.18 13.18 13.18 13.18 13.18 13.18 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira. Manter a tira no gelo. Sempre manter a mistura de reação no gelo de agora em diante. Preparar diluições em série do alvo ("diluições alvo") a partir da solução enviada (plasmídeo selv e pIasmídeo mut). A solução enviada é uma soiução 7 x 10'° cópias/µL. Diluir inicialmente o plasmideo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 5 mM, então diluir em série para 7 x 10' cps/µL, 7 x 10' cps/µL, 7 x 10 cps/µL e 7 cps/µL emTris 10 mM. Diluiro plasmideoselva 7 x 1O'cps/µLemTris 10 mM.

Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata.

Adicionar 5 µL das diiuições alvo partindo da amostra menos concentrada para a mais 10 concentrada. Fechar todos os tubos.

Reação A reação segue o esquema de método das figuras 1 e 2.

Programar o turbidímetro (Teramecs) para incubação a temperatura constante e monitoração em tempo real para turbidez, a fim de obter uma temperatura de reação constante de 66°C por 1 hora. 15 Colocar as tiras no instrumento imediatamente antes de iniciar os programas. lniciar o programa.

Análise de dados Analisar a variação de absorbância em termos de a.u.

(unidades arbitrárias de absorbância) para encontrar o tempo limiar para cada amostra 20 analisada. O tempo Iimiar é o minuto em que a absorbância da amostra, após subtração da linha base, atinge o valor de unidade arbitrária que representa o limiar (neste caso 0,1 a.u.). O tempo limiar atingido por cada amostra é correlacionado com seu log de cópias de DNA/µL.

' 25 Resultados A estratégia "LAMP JAK2 haltere" é baseada no método LAMP Eiken para detecção de SNP (descrito em EP 1231281, 20, 21, 22, bem como em http:Moopamp.eiken.co.jp/e/lamp/snps _ anim.html).

No presente arranjo de ensaio ilustrado na Fig. 2, os oligonucleotideos Flc e Blc contidos nos iniciadores FlP e BIP são complementares às 30 sequências não sobrepostas do gene JAK2 que termina e começa respectivamente uma base a montante e uma base a jusante do nucleotideo de interesse na posição 1849 a partir do códon de partida na sequência de codificação de JAK2. Além disso, a base de extremidade 5' dos iniciadores FIP e BlP é específica para o nucleotídeo T mutado na

17 /44 v sequência JAK2 e ambos iniciadores internos têm uma base não correspondente na terceira base a partir da extremidade 3'. Quando a reação contém o alelo alvo selvagem e uma estrutura haltere é formada, as sequências F1C e Blc não se pareiam na extremidade 3' bloqueando qualquer amplificação adicional. Diferentemente, se o alelo 5 alvo mutante estiver presente na solução, as sequências Flc e Blc especificas a mutante hibridizam perfeitamente à região alvo do ácido nucieico complementar e são estendidas pela DNA polimerase. Como mostrado na Fig. 6, concentrações decrescentes de plasmideo mutante foram detectadas pelo ensaio LAMP variando de 7 x 10' cps/µL a 7 10 cps/µL (35 cópias de piasmídeo mutante tota!). Em baixa concentrações da sequência alvo de ácido nucleico, este arranjo de ensaio LAMP não poderia discriminar entre plasmideos mutante e selvagem que são de fato amplificados numa concentração de 7 x 10' cps/µL. Uma vez que um valor de seletividade menor que 1°/0 é exigido a fim de superar as Iimitações dos métodos de ensaio previamente descritos na literatura, . 15 nenhuma vantagem clara foi obtida com a presente abordagem. Exemplo 2 - Materiais, métodos e resultados da estratégia LAMP modificada por JAK2 "extensão de iniciador de Iaço aleio especifico" Reagentes Os plasmideos JAK2 foram providos pelo fornecedor h

L 20 GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante. Em detalhes:

P - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base G no nucleotideo 93526, chamado de "plasmídeo selv"; - Piasmldeos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ 1D 25 NO:2, incluindo uma base T no nucleotídeo 93526, chamado de "plasmídeo mut". lniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha), chamados de "iniciadores": · JAKR5 (F3) 5' TCTATAGTCATGCTGAAAGTAGGAG 3' (SEQ ID NO: 16) JAKR2 (B3) 5' AAGGCATTAGAAAGCCTGTAGT 3' {SEQ ID NO: 17) 30 JAKR7 (FlP) 5' ACAAAGAATTGTTGTTTGACTGTTGTCCATTGCATC177AWATGGCAGAGAGM 3'(SEQID NO: 18) JAKR8 (BlP) 5' AgTcTTTc1TTgAAgcAgcAAgTATgATgnAcnAcTcTcgTcTccAcAgA 3' (SEQ ID NO: 19) JAKR9 (LB) 5' AGCATTTGGI | j IAAATTATGGAGTA,GGTT 3' (SEQ ID NO: 20).

35 A base sublinhada corresponde a um nucleotideo incompatível; a base em negrito corresponde ao nucleotídeo mutado na posição 1849 a partir do códon inicial ATG da sequência de codificação JAK2.

18 /44 Tampão de reação: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8, 50 mM Kci, 40 mM MgSO,, 50 mM de (NH4)2SO4, 0,5°/o Tween, 5°/j DMSO ("buffer 5x") mistura 25 mM CINTPS (Fermentas) ("dNTPs") polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("polimerase") água apirogênica estérii (SALF Spa) ("ddw") Procedimento Preparação da amostra Estocar os iniciadores em aliquotas. É melhor estocar soluções a -20°C, enquanto diluições de trabalho devem ser armazenadas a 4°C.

Preparar a mistura de reação como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), 0,8 µM de iniciador de laço (LB), solução tampão 1x, 1,4 mM de mistura dNTPs, 8 U de polimerase Bst. O volume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e.

20 µL de mistura de reação " 5 µL de amostra). Manter sempre os reagentes no gelo.

Preparar a mistura para pelo menos 14 amostras, compreendendo 3 controles negativos (7 x 10' cps/µL de plasmídeo selvagem), 9 controles positivos (3 amostras 7 x 103 cps/µL de plasmideo mutante, 3 amostras 7 x 10' cps/µL de plasmideo mutante, 3 amostras 7 x 10 cps/µL de piasmídeo mutante), 1 controle sem alvo.

Tabela 2 - composição da mistura de amostras I Tubo de amostra ) 1-3 I 4-6 ) 7-9 j1o-12 p3j5 j16-19 I plasmfdeo plasmídeo plasmldeo plasmideo plasmídeo Ivo a ser adicionado selv mut mut mut mut (5µL) 7x1O' 7x1O' 7x1O' 7x1O |7 cps/µL ) )cps/µL |cps/µL |cps/µL jcps/µL jjAKR5100 µM 1Ií6sr6:6sr1~ |0.05 i 0.05 l 0.05 |JAKR2100 µM 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 )JAKR710OµM 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 )JAKR810OµM 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 ) JAKR9100 µM 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 ) LAÜP Buher lOx 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Bst po|imèrase 8 U/µL 1 1 1 1 1 1 : dhÍTPs 25 mM 1.4 1.4 1,4 1.4 1.4 1.4 ddw para 20 µL 14 14 14 14 14 14 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira. Manter a tira no geio. Sempre manter a mistura de reação no gelo de agora em diante.

Preparar diluições em sêrie do alvo ("diluições alvo") a partir da solução enviada (plasmídeo selv e plasmideo mut). A solução enviada é uma solução

19 /44

7 x 10'° cópias/µL.

Diluir inicialmente o plasmídeo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 mM, então diluir em série para 7 x 10' cps/µL, 7 x 10' cps/µL, 7 x 10 cps/µL em Tris 10 mM.

DiluiroplasmÍdeoselva7x1O'cps/µLemTris 1OmM.

Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata. 5 Adicionar 5 µL das diluições alvo partindo da amostra menos concentrada para a mais concentrada.

Fechar todos os tubos.

Reação A reação segue o esquema de método da figura 3. Programar o turbidímetro (Teramecs) para incubação a 10 temperatura constante e monitoração em tempo real para turbidez, a fim de obter uma temperatura de reação constante de 65°C por 1 hora.

Colocar as tiras no instrumento imediatamente antes de iniciar os programas. lniciar o programa.

Análise de dados Analisar a variação de absorbância em termos de a.u. . 15 (unidades arbitrárias de absorbância) para encontrar o tempo limiar para cada amostra analisada.

O tempo limiar é o minuto em que a absorbância da amostra, após subtração da linha base, atinge o valor de unidade arbitrária que representa o limiar (neste caso 0,1 a.u.). O tempo limiar atingido por cada amostra é correlacionado com seu log de cópias

20 de DNA/µL.

Resultados A presente abordagem consiste na amplificação seletiva de uma sequência mutante usando um iniciador de laço especifico a mutante (Fig 3). Foi projetado um conjunto universal (insensivel a mutante) de iniciadores incluindo os 25 oligonucleotídeos F3, B3, FlP e BIP para obter uma estrutura halteres apresentando a mutação putativa na região de laço compreendida entre 82 e Blc.

Em adição, foi projetado um iniciador de Iaço apresentando a Última base na extremidade 3' complementar ao nucleotideo T mutado na posição 1849 da sequência de codificação JAK2 e uma base não correspondente na terceira base a partir da extremidade 3'. 30 Se a reação contém a sequência alvo selvagem a extremidade 3' do iniciador de laço específico a mutante não pareia ao nucleotideo complementar, resultando assim em nenhuma amplificação.

Diferentemente, se as sequências mUtantes JAK2 estiverem presente em solução, o iniciador de laço específico a mutante hibridiza perfeitamente à sequência complementar e é estendido pela DNA 35 polimerase.

A avaliação do ensaio foi feita em amostras de plasmídeos mutantes em concentrações variando de 7 x 10' cps/µL a 7 x 10 cps/µL (35000 e 350

20 /44 cópias de plasmídeo mutante total) e numa amostra selvagem contendo 7 x 10' cps/µL,

Y todas amostras testadas em triplicata. Com o presente método, a amplificação não específica foi detectada para a amostra de plasmídeo selvagem em 7 x 10' cps/µL e em amostras mutante e selvagem em concentrações de 7 x 10 cps/µL não poderiam ser 5 discriminadas. Uma vez que um valor de seletividade menor que 1°/0 é exigido a fim de superar as limitações dos métodos de ensaio previamente descritos na literatura, nenhuma vantagem clara foi obtida com a presente abordagem (Fig. 7). Exemplo 3 - Materiais, métodos e resultados da estratégia LAMP modificada por JAK2 "iniciador haste-laço" 10 Reagentes Os plasmideos JAK2 foram providos pelo fornecedor GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante.

Em detalhes: - Plasmídeos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID · 15 NO:2, incluindo uma base G no nucleotideo 93526, chamado de "plasmídeo selv"; - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base T no nucleotideo 93526, chamado de "plasmideo mut".

Iniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon, chamados de "iniciadores": * 20 GA231 (F3) 5' GCATCTTTATTATGGCAGAGAG 3' (SEQ ID NO: 3) ga232 (b3) 5' tgctctgagaaaggcatta 3' (seq id no: 4) . GA233 (FlP) 5' GCTGCTTCAAAGAAAGACTMGG~TGGACAACAGTCAMCAAC 3' {SEQ id no: 5) ga234 (BlP) 5' gctttctcacaagcatttgg i i | iaaattagcctgtag | | i iacttactctc 3' 25 (seq id no: 6) ga235 (lf) 5' gtctccactggagtatgtg.tctgtggagamc 3' (seq id no: 7) a base sublinhada corresponde ao nucleotídeo selvagem na posição 1849 a partir do ' códon de inicio ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM_ 004972). ddC significa didesoxi-citosina não extensível. 30 GA236 (LB) 5' GTCTCCACTGGAGTATGTYCTGTGGAGAC 3' (SEQ ID NO: 8) a base sublinhada corresponde ao nucleotÍdeo mutado na posição 1849 a partir do códon de início ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM_ 004972). Tampão de reação: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8, 50 mM Kcl, 40 mM MgSO,, 50 mM de (NH4)2SO,, 0,5°/o Tween, 5°/0 DMSO ("buffer 5x") 35 mistura 25 mM dNTPs (Fermentas) ("CINTPS") polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("polimerase") água apirogênica estéril (SALF Spa) ("ddw")

21 /44 Procedimento Preparação da amostra Estocar os iniciadores em alíquotas. É melhor estocar soluções a -20°C, enquanto diluições de trabalho devem ser armazenadas a 4°C. 5 Preparar a mistura de reação como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), 0,8 µM de iniciador de laço (LF não extensivel e LB), solução tampão lx, 1,4 mM de mistura dNTPs, 8 U de poIimerase Bst. O voIume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e. 20 µL de mistura de reação + 5 µL de amostra). Manter sempre os 10 reagentes no gelo. Preparar a mistura para pelo menos 26 amostras, compreendendo 3 controles negativos (100°/o de plasmídeo selvagem, 7 x 10' cps/µL), 21 controles positivos (3 amostras 100% de ptasmideo mutante 7 x 10' cps/µL, 3 amostras 75% de plasmideo mutante diluido em plasmideo selvagem, 3 amostras 50°6 de pIasmídeo mutante diluído em plasmideo selvagem, 3 amostras 25°/o de plasmídeo mutante diluido · 15 em plasmideo selvagem, 3 amostras 10% de plasmídeo mutante diluido em plasmideo selvagem, 3 amostras 5°/0 de plasmídeo mutante diluido em plasmideo selvagem, 3 amostras 1°/0 de plasmideo mutante diluÍdo em plasmideo selvagem), um controie sem alvo. Tabela 3 - composição da mistura de amostras Tubo de amostra ) 1-3 ! 4-6 l 7-9 ) 10-12 Í 13-15 )plasmídeo plasmldeo plasmídeo |mut mut mut plasmideo plasmideo j5,25x1o' 3,5X1O' 1,75x1O' Alvo a ser adicionado selv mut |cps/µL, cps/µL, |cps/µL, (5µL) 7x103 7x1O' )pIasmídeo plasmídeo |píasmideo cps/µL cps/µL jselv selv )selv |1,75x1O' |3,5x103 |5,25XIO' jcps/µL |cps/µL |cps/µL t ) 0.05 I 0.05 GA231 100 µM 0.05 0.05 ! 0.05 GA232 100 µM 0.05 0.05 I 0.05 i 0.05 i 0.05 GA233 100 µM 0.4 0.4 I 0.4 I 0.4 i 0.4 GA234 100 µM 0.4 0.4 i 0.4 I 0.4 i 0.4 GA235 100 µM 0.2 0.2 l 0.2 m_ ) 0.2 m_ GA236 100 µM LAMP Buffer lOx

0.2

2.5

0.2

2.5 I 0.2 I 2.5 i 2.5 m_ I 2.5 Bst polimerase 8 U/µL 1 1 I1 i'i 1.4 !'I 1.4 dNTPs 25 mM 1.4 1.4 ) 1.4

22 /44 ddw para 20 µL 13.8 13.8 13.8 13.8 13.8 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira.

Manter a tira no gelo.

Sempre manter a mistura de reação no gelo de agora em diante.

Preparar diluições em série do alvo ("diluições alvo") a partir da soIução enviada (plasmideo selv e plasmídeo mut). A solução enviada é uma solução 7 x iO'Q cópias/µL.

Diluir inicialmente o plasmideo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 mM, então diluir em série o plasmídeo mutante em plasmideo selvagem para obter as seguintes concentrações de sequências mutantes em fundo selvagem: 75°/o, 50°/o, 25°/o, 10°/,, 5°/,, 1°/0 (quantidade total por tubo, 7 x 103 cps/µL) . Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata.

Adicionar 5 µL das diiuições alvo partindo da amostra menos concentrada para a mais concentrada.

Fechar todos os tubos.

Reação A reação segue o esquema de método da figura 4. Programar o turbidímetro (Teramecs) para incubação a temperatura constante e monitoração em tempo real para turbidez, a fim de obter uma temperatura de reação constante de 65°C por 1 hora.

Colocar as tiras no instrumento imediatamente antes de iniciar os programas.

Iniciar o programa.

Análise de dados Analisar a variação de absorbância em termos de a.u. (unidades arbitrárias de absorbância) para encontrar o tempo limiar para cada amostra analisada O tempo limiar é o minuto em que a absorbância da amostra, após subtraçâo da Iinha base, atinge o valor de unidade arbitrária que representa o limiar (neste caso 0,1 a.u.). O tempo limiar atingido por cada amostra é correlacionado com seu log de cópias de DNA/µL.

Resultados A presente abordagem consiste na amplificação seletiva de uma sequência mutante baseada num projeto particular de iniciador de laço resultando na hibridização seletiva de tal iniciador de laço no haltere formado a partir da sequência mutante (Fig. 4). Foi desenvolvido um conjunto universal (insensivel a mutantes) de iniciadores incluindo os cdigonucleotideos F3, B3, FlP e BlP para obter uma estrutura haltere apresentando a mutação putativa na região do laço compreendida entre Bl e B2. Não foram detectadas diferenças principais ao realizar tais experimentos em sequências alternativas contendo o nucleotídeo putativo mutado na região do laço em B2 ou entre B2 e Blc.

Foi incluido no conjunto de iniciadores um iniciador de laço particular apresentando uma região de sequência de 8 bases na sua extremidade 5' complementar

23 /44 a sua própria sequência na extremidade 3'. Consequentemente, este iniciador de laço especial forma uma estrutura intramolecular de grampo de cabelo que está em equilíbrio com sua forma aberta na temperatura de reação (65°C). Quando a sequència JAK2 mutada está presente na 5 amostra, tal iniciador de laço modificado quebra sua estrutura interna para se hibridizar à sequência alvo complementar de acordo com o equilibrio termodinâmico (Tm entre o iniciador e o alvo especifico = 65°C). O iniciador de laço hibridizado ao alvo mutado especifico é então estendido pela polimerase e a amplificação pode proceder adicionalmente.

Como característica adicional, o iniciador de laço específico para a 10 mutação JAK2 G~T apresenta uma Tm com a sequência alvo selvagem (59°C) menor que com a estrutura intramolecular de grampo de cabelo (65°C). Assim, numa amostra contendo a sequência JAK2 selvagem, tal diferença em valores Tm resulta num auto- sequestro do iniciador de laço modificado que prefere se dobrar na estrutura de grampo de cabelo que formar um duplex com o alvo não especifico, uma vez que as forças intramoleculares são maiores que as intermo|ecU|ares. - 15 Para Iimitar a competição deste iniciador de laço pelas sequências selvagens que provavelmente estariam presentes em grande excesso na amostra cIínica, foi incluido no arranjo da reação um segundo iniciador de laço com estrutura análoga e contendo uma sequência de nucleotideos complementar à sequência 20 JAK2 selvagem, i.e., com a base G na posição 1849 a partir do códon inicial (Gene8ank no.

NM_ 004972). A extremidade 3' deste iniciador de laço "competidor" é tornada não extensivel por uma modificaçào (3' didesoxi). A tarefa deste competidor é "silenciar" a sequência selvagem, permitindo assim que o iniciador específico a mutante 25 encontre seu alvo.

Quando o iniciador "competidor" reconhece a sequência selvagem complementar, ele quebra sua estrutura intramolecular para hibridizar ao alvo selvagem, de acordo com a maior afinidade (Tm da duplex formada pelo alvo selvagem e iniciador de laço modificado selvagem = 67°C). O iniciador de Iaço hibridizado ao alvo 30 selvagem não é extensivel, resultando em nenhuma amplificaçào de sequências selvagens.

Uma vez que a reação é conduzida a temperatura constante, o iniciador haste-laço específico a selvagem fica anexado às sequências selvagens evitando assim a hibridização não especifica do iniciador de laço mutante.

Em contraste ao iniciador de laço específico a mutante, o 35 iniciador "competidor" apresenta uma Tm com a sequência alvo mutante (62°C) menor que a estrutura intramolecular de grampo de cabelo formada com ele mesmo (65°C). Assim, as forças intramoleculares maiores comparadas com as intermoleculares causam

24 /44 o auto-sequestro do iniciador haste-laço modificado que prefere se dobrar na estrutura 4 grampo de cabelo em vez de formar um duplex com a sequência alvo mutante.

A seletividade do presente ensaio foi avaliada pela realização da amplificação da sequência alvo em diluições seriadas de plasmideo 5 mutante em fundo selvagem (Fig. 8). A seletividade alcançada é significativamente menor que 1°/0 (350 cópias de plasmídeo mutante total em 34650 cópias de plasmídeo selvagem) indicando um desempenho melhor que os ensaios previamente descritos na literatura. A linearidade do ensaio é detectada entre 1OO°/o de 10 plasmideo mutante (35000 cps) e 1°/0 de mutante em 99°/o de plasmideos selvagens (350 cópias de pIasmideo mutante em 34650 cópias de plasmídeo selvagem), permitindo assim a detecção e quantificação da baixa percentagem de sequências mutantes em grandes quantidades de plasmideos selvagens. Portanto, foi alcançado um aperfeiçoamento significativo com tal abordagem LAMP implementada.

' 15 Exemplo 4 - Materiais, métodos e resultados da estratégia LAMP modificada por JAK2 "iniciador hastejaço com PNA" Reagentes Os plasmideos JAK2 foram providos pelo fornecedor GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante. a , 20 Em detalhes: - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base G no nucleotideo 93526, chamado de "plasmideo selv"; - Plasmídeos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base T no nucleotldeo 93526, chamado de "plasmideo mut".

25 lniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon, chamados de "iniciadores": GA231 (F3) 5' GCATCTTTATTATGGCAGAGAG 3' (SEQ id NO: 3) GA232 (B3) 5' TGCTCTGAGAAAGGCATTA 3' (SEQ ID NO: 4) GA233 (FlP) 5' GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGG~TGGACAACAGTC~CAAC 3' (SEQ ID 30 NO: 5) GA234 (BlP) 5' GCTTTCTCACAAGCATTTGG | | l IAAATTAGCCTGTAG i l l IACTTACTCTC 3' (SEQID NO: 6) GA236 (LB) 5' GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC 3' (SEQ ID NO: 8) a base sublinhada corresponde ao nucleotideo mutado na posição 1849 a partir do códon 35 de inicio ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM_ 004972). PNA: sintetizado por Eurogentec, chamado de PNA GM43 '"GAGTATGTG,TCTGTGGA'°°' (SEQ ID NO: 9).

25 /44 y A base sublinhada corresponde ao nucleotídeo selvagem na posição 1849 a partir do códon de início ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM _004972). Tampão de reação: 100 mM de Tris-HCl PH 8,8, 50 mM Kcl, 40 mM MgSO,, 50 mM de (NHJ,SO,, 0,5°/, Tween, 5°/0 DMSO ("buffer 5x") 5 mistura 25 mlvl cINTPS (Fermentas) ("dNTPs") polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("polimerase") água apirogênica estéril (SALF Spa) ("ddw") Procedimento Preparação da amostra 10 Estocar os iniciadores em aliquotas. É melhor estocar soluções a -20°C, enquanto diluições de trabalho devem ser armazenadas a 4°C. Preparar a mistura de reação como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), 0,8 µM de iniciador de laço auto pareado especifico a JAK2 mutante (LB), 0,8 µM de PNA, solução " 15 tampão lx, 1,4 mM de mistura dNTPs, 8 U de polimerase Bst. O volume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e. 20 µL de mistura de reação " 5 µL de amostra). Manter sempre os reagentes no gelo. Preparar a mistura para pelo menos 23 amostras, compreendendo 3 controles negativos (100% de plasmideo selvagem, 7 x 10' cps/µL), 18 controles positivos (3 amostras 100% de plasmídeo

Ó . 20 mutante, 3 amostras 1°/0 de plasmideo mutante diluído em plasmideo selvagem, 3 amostras 0,5°/, de plasmideo mutante diluido em plasmideo selvagem, 3 amostras 0,1%

S de plasmídeo mutante diluido em plasmideo selvagem, 3 amostras 0,05% de plasmideo mutante diluído em plasmídeo selvagem, 3 amostras 0,01% de plasmideo mutante diluido em plasmídeo selvagem - quantidade total de DNA 7 x 10' cps/µL), um controle sem 25 alvo. Tabela 4 - composição da mistura de amostras Tubo de amostra 1-3 4-6 7-9 10-12 13-15 16-19 plasmídeo plasmídeo plasmídeo plasmídeo mut mut mut mut plasmideo pIasmideo 7X1O' 3,5X102 7X1O 3,5X1O Alvo a ser adicionado selv mut CPS/µL, cps/µL, cps/µL, cps/µL, (5µL) 7x1O' 7x1O' plasmídeo plasmídeo plasmídeo plasmídeo cps/µL cps/µL selv selv selv selv 6,93X1O' 6,65x1O' 6,993x1O' 6,9965x1O' cps/µL cps/µL cps/µL cps/µL GA231 100 µM 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 GA232 100 µM 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

26 /44 )GA23310OµM I 0.4 ) 0.4 I 0.4 I 0-4 I 0.4 I 0.4 i GA234 100 µM ) 0.4 I 0.4 I 0.4 I 0.4 ) 0.4 ! 0.4 ) PNAIOO µM ) 0.2 I 0.2 I 0.2 I 0.2 l 0.2 I 0.2 I GA23610OµM ) 0.2 I 0.2 i 0.2 I 0.2 I 0.2 i 0.2 LAMP Buffer 5x 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 Bst polimerase 8 U/µL 1 1 1 1 1 1 dNTPs 25 mM 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 ddw para 20 µL 13.8 13.8 13.8 13.8 13.8 13.8 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira. Manter a tira no gelo. Sempre manter a mistura de reação no gelo de agora em diante.

Preparar diluições em série do alvo ("diluições alvo") a partir da solução enviada (plasmídeo selv e piasmídeo mut). A solução enviada é uma solução 7 x 10'° cópias/µL. Diluir inicialmente o plasmideo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 mM, então diluir em série o plasmídeo mutante em plasmídeo selvagem para obter as seguintes concentrações de sequências mutantes em fundo selvagem: 1°/,, 0,5°/õ, 0,1°/o, 0,05%, 0,01% (quantidade total por tubo, 7 x 10' cps/µL) .

Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata.

Adicionar 5 µL das diluições alvo partindo da amostra menos concentrada para a mais concentrada. Fechar todos os tubos.

Reação A reação segue o esquema de método da figura 5.

Programar o turbidimetro (Teramecs) para incubação a temperatura constante e monitoração em tempo real para turbidez, a fim de obter uma temperatura de reação constante de 65°C por 1 hora.

Coiocar as tiras no instrumento imediatamente antes de iniciar os programas. lniciar o programa.

Análise de dados Analisar a variação de absorbância em termos de a.u.

(unidades arbitrárias de absorbância) para encontrar o tempo limiar para cada amostra analisada. O tempo limiar é o minuto em que a absorbãncia da amostra, após subtração da linha base, atinge o valor de unidade arbitrária que representa o limiar (neste caso 0,1 a.u.). O tempo limiar atingido por cada amostra é correlacionado com seu log de cópias de DNAJµL.

Resultados Esta abordagem consiste na amplificação seletiva de uma sequência mutante baseada num projeto particular de iniciador de laço, resultando na hibridização de tal iniciador de laço ao haltere formado a partir da sequência mutante

27 /44 b (Fig. 5). Foi desenvolvido um conjunto universal (insensivel a mutantes) de iniciadores incluindo os oligonucleotídeos F3, B3, FlP e BlP para obter uma estrutura haltere apresentando a mutação putativa na região do laço compreendida entre Bl e B2. Não foram detectadas diferenças principais ao realizar tais experimentos em sequências 5 alternativas contendo o nucleotideo putativo mutado na região do laço em B2 ou entre B2 e Blc.

Foi incluído no conjunto de iniciadores um iniciador de laço particular apresentando uma região de sequência de 8 bases na sua extremidade 5' complementar a sua própria sequência na extremidade 3'. Consequentemente, este iniciador de laço especial forma uma estrutura intramolecular de grampo de cabelo qUe está em equilibrio 10 com sua forma aberta na temperatura de reação (65°C). Quando a sequência JAK2 mutada está presente na amostra, tal iniciador de laço modificado quebra sua estrutura interna para se hibridizar à sequência alvo complementar de acordo com o equilíbrio termodinâmico (Tm entre o iniciador e o alvo especifico = 65°C). O iniciador de laço hibridizado ao alvo mutado ' 15 especifico é então estendido pela polimerase e a amplificação pode proceder adicionalmente.

Como caracteristica adicional, o iniciador de laço especifico para a mutação JAK2 G~T apresenta uma Tm com a sequência alvo selvagem (59°C) menor que com a estrutura intramolecular de grampo de cabelo (65°C). Assim, numa amostra contendo a sequência JAK2 selvagem, tal diferença em valores Tm resulta num auto- ' 20 sequestro do iniciador de laço modificado que prefere se dobrar na estrutura de grampo . de cabelo que formar um duplex com o alvo não especifico, uma vez que as forças intramoleculares são maiores que as intermoleculares.

Para aumentar ainda mais a capacidade de discriminação do sistema LAMP baseado no iniciador haste-laço seletivo, foi adicionado à mistura de 25 reação um ácido nucléico peptídico (PNA). Os PNAS são o|igonuc|eotÍdeos não extensiveis e não desiocáveis em que a cadeia principal de ribose-fosfato é substituida por unidades (2- aminoetil)-glicina ligadas por ligações amida.

Cada base emparelhada DNA/PNA contribui mais com a estabilidade da estrutura duplex que o pareamento de bases DNNDNA 30 regular.

Portanto, uma única incompatibilidade num duplex PNNDNA resulta numa diferença significativa em Tm.

Uma sonda PNA completamente complementar à sequência do gene JAK2 selvagem evita a hibridização e extensão do iniciador haste- laço específico a mutante, sUprimindo a amplificaçào não específica da sequência selvagem.

Na presença de uma Única incompatibilidade, o PNA não inibe a hibridização 35 do iniciador de iaço, que leva à amplificação.

Portanto, o PNA pode ser usado para bloquear seletivamente a sequência selvagem presente na amostra.

O PNA é projetado para ser complementar à região do laço

28 /44 compreendida entre B2 e Blc apresentando o nucleotídeo G selvagem.

Ele forma um * duplex estável somente com a sequência complementar selvagem (Tm = 65,7°C), evitando a hibridização e extensão do iniciador haste-laço especifico a mutante e portanto suprimindo a amplificação da sequência selvagem.

O PNA não hibridiza à sequência 5 JAK2 mutada por causa da afinidade menor (Tm = 56°C). A eficiência do PNA como grampo de amplificação seivagem foi avaliada comparando-se o desempenho de reações de amplificação executadas com e sem o PNA em amostras 7 x 10' cps/µL de plasmideo selvagem e mutante (Fig. 9). A análise da curva de amplificação revelou que a presença do PNA levou a um atraso de 10 uma hora na amplificação não especifica do plasmídeo selvagem pelo iniciador haste- laço especifico a mutante e a um atraso de 5 minutos na amplificação específica do pIasmideo mutante.

Reciprocamente, na ausência do PNA a amplificação não específica do plasmideo selvagem pelo iniciador haste-laço especifico a mutante ocorreu com somente 5 minutos de atraso em comparação com a sequência alvo especifica mutada. ' 15 O atraso observado na amplificação selvagem é explicado pela formação de um duplex estável entre o PNA e a sequência selvagem complementar, evitando assim a hibridização não especifica e extensão do iniciador haste-laço especifico a mutante.

Para determinar a seletividade deste formato de ensaio LAMP, as reações de amplificação foram realizadas em diluições seriadas de plasmideo * , 20 mutante em fundo selvagem (Fig. 10). Uma vez que a seletividade alcançada é de menos que 0,01% (35 cópias de plasmideo mutante total em 34965 cópias de plasmideo . selvagem), a presente abordagem exibe uma seietividade maior que a dos ensaios descritos no estado da técnica, cerca de 3 logs maior com relação ao sequênciamento direto, RFLP e pirosequênciamento, e cerca de 2 logs maior com relação a ARMS, 25 técnicas em tempo real e análise de curva de fusão de DNA.

Em resumo, o presente formato de ensaio LAMP representa um aperfeiçoamento significativo com relação às estratégias previamente descritas neste documento e aos métodos de detecção ilustrados na literatura: i) a amplificação não especifica da amostra selvagem (350000 cps plasmideo selvagem) é retardada em cerca 30 de uma hora, ii) a amplificação especifica do alvo mutante é detectada até 0,O1°/o de sequências mutantes em fundo selvagem (35 cópias de plasmideo mutante total em 349965 cópias de plasmídeo selvagem), iii) a seletividade do ensaio é cerca de 2 logs maior que a seletividade de outras abordagens descritas na literatura, iv) a linearidade do ensaio é até 0,1% de sequências mutantes (350 cópias de plasmideo mutante em 35 349650 cópias de plasmideo selvatem), permitindo assim a detecção e quantificação de uma baixa percentagem de alelos mutantes num grande excesso de DNA selvagem.

Exemplo 5 - LAMP "iniciador haste-laço com PNA" em amostras clinicas:

29 /44

W comparação com ARMS Um total de 29 amostras de DNA extraídas de pacientes na Ospedali Riuniti di Bergamo foram analisadas usando a estratégia JAK2 LAMP "iniciador haste-laço com PNA", como descrito no Exemplo 4. Os resultados obtidos foram 5 comparados com os dados obtidos no Hospital usando a tecnologia ARMs. A ARMs explora o fato que os iniciadores oligonucleotideos devem estar perfeitamente pareados nas suas extremidades 3' para que uma DNA polimerase estenda estes iniciadores durante PCR. Projetando-se os iniciadores oligonucleotÍdeos que correspondam à extremidade 3' da mutação pontual JAK2 específica, ARMS pode distinguir entre os alelos 10 selvagem e mutante. Como mostrado na Tabela 5, a amostra LAMP detectou como positiva todas as amostras previamente diagnosticadas como tal por ARMS. Dentre as 15 amostras que resultaram negativas por ARMs, 11 foram diagnosticadas como negativa por LAMP e 4 como baixo positivo. Para excluir que estas 4 amostras ' 15 discordantes fossem falsos positivos no ensaio LAMP e para confirmar que o diagnóstico de mutação era devido a maior seletividade do método LAMP implementado, as amostras discordantes foram testadas usando um terceiro ensaio. Tal ensaio foi baseado na amplificação da região JAK2 de interesse por PCR na presença da molécula PNA complementar ao alvo selvagem com a finalidade de enriquecer a base mutada, se t . 20 presente, pela supressão da amplificação da sequência selvagem via grampeamento PNA. Se um enriquecimento de amostra de 20% do alelo mutante fosse obtido, a r sequência alterada poderia ser detectada por uma abordagem de sequênciamento direto. Os iniciadores (GA231 forward e GA232 reverse) e o PNA eram como descrito previamente (Exemplo 4). A amplificação foi realizada em tampão de reação lx contendo 25 2,5 mM de MgCl,, 200 µM CINTPS, 500 nM de iniciadores forward e reverse, 1,5 M de Í PNA e 0,025 U de Taq Gold num volume final de 45 µL. Um volume de 5 µL de sequência alvo (20 ng/µL) foi adicionado à mistura de reação e a solução foi incubada num termociclo, seguindo um programa térmico consistindo de 10 min. A 95°C seguido de 35 cicbsde30sa94°C,40sa62°C,30sa58°Ce30sa72°Ceterminandocom1Omina 30 72°C para a extensão final. As quatro amostras clinicas discordantes, uma amostra controle sem alvo e um controle positivo e um negativo contendo respectivamente o alvo pIasmideo mutante e selvagem foram testados em duplicata. Após a reação, os produtos de amplificação foram separados num gel de agarose e visualisados usando Et8r. Nenhuma amplificação foi detectada para o controle sem alvo; uma banda fraca estava 35 visivel no gel de agarose para o controle negativo e uma forte banda para o controle positivo. Os produtos PCR das quatro amostras clinicas foram subsequentemente analisados via sequênciamento automático, todos mostrando um pico duplo na posição

30 /44 1849 a partir do códon inicial ATG (Gene8ank no. NM _004972), correspondendo respectivamente à base Guanina (selvagem) e à base Timina (mutada). Estes resultados confirmaram que as quatro amostras discordantes foram corretamente diagnosticadas como portando a substituição de bases G~T por LAMP, enquanto ARMS detectou-as 5 como falsos negativos.

4 [ .

>

31 /44 Tabela 5 LAMP iniciador de laço amostra ARMS auto- areado çom PNA RT" +(baixQ) — PEVl . . ACGl "T" + bema —+ + bilu + + paan +(baixc) boma . . — olin palo + + boed + + sage + + bagi + + fegi + + beal + + talu + + capi + + sagi + + @E' ::C + |peca + + — Elu . + )bilu2 + (baixo) :nagi . È!ast . Eosa . . gual — Êocl . Êmg . + (baixo) |saba ianpi . .

Exemplo 6 - Estratégia LAMP modificado por JAK2 fluorescente "iniciador haste- laço" Reagentes Os plasmideos JAK2 foram providos pelo fornecedor GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante. Em detalhes: - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base G no nucleotideo 93526, chamado de "plasmideo selv"; - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base T no nucleotÍdeo 93526, chamado de "plasmídeo mut". lniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon, chamados de "iniciadores":

32 /44 ga231 (F3) 5' GCATCTTTATTATGGCAGAGAG 3' (SEQ id NO: 3) . GA232 (b3) 5' TGCTCTGAGAAAGGCATTA 3' (SEQ ID NO: 4) GA233 (fip) 5' GCTGCTTCAAAGAAAGACTAAGGMATGGACMCAGTCAAACMC 3' (SEQ ID no: 5) 5 GA234 (BlP) 5' GCTTTCTCACAAGCATTTGG I | i IAAATTAGCCTGTAGTTTTACTTACTCTC 3' (SEQ ID NO: 6) GA236 (LB) 5' TAMRA-TGTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC 3' {SEQ ID NO: 8) a base sublinhada corresponde ao nucledídeo mutado na posição 1849 a partir do códon de inicio ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM _004972). A base 10 Timina em negrito na extremidade 5' não tem uma base complementar na sequência alvo. Ela foi adicionada para separar o fluoróforo da base Guanina a jusante, o que tem um efeito extintor. GA235 (LF) 5'-5'GTCTCCACTGGAGTATGTGTCTGTGGAGAddC 3' (SEQ ID NO: 7) a base sublinhada corresponde ao nucleotídeo mutado na posição 1849 a partir do códon 15 de início ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM _004972); ddC significa didesoxi-citosina não extensível. Tampão de reaçâo: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8, 50 mM Kcl, 40 mM MgSO,, 50 mM de (NH4)2SO4, 0,5°/o Tween ("buffer 5x") mistura 25 mM cÍNTPS (Fermentas) ("cINTPS")

P . 20 polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("poiimerase") água apirogênica estéril (SALF Spa) ("ddw") * Procedimento Preparação da amostra Estocar os iniciadores em alíquotas. É melhor estocar 25 soluções a -20°C, enquanto diluições de trabalho devem ser armazenadas a 4°C.

P Preparar a mistura de reação como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), 0,8 µM de iniciador de laço auto pareado fluorescente específico para JAK2 mutante (LB), 0,8 µM de iniciador de laço auto pareado não extensivel para JAK2 selvagem (LF), solução tampão 30 lx, 1,4 mM de mistura dNTPs, 8 U de polimerase Bst. O voIume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e. 20 µL de mistura de reação + 5 µL de amostra). Manter sempre os reagentes no gelo. Preparar a mistura para pelo menos 23 amostras, compreendendo 3 controles negativos (100% de plasmideo selvagem, 7 x 10' cps/µL), 18 controles positivos (3 amostras 100°/o de plasmídeo mutante, 3 amostras 35 1'/j de plasmideo mutante diluído em plasmldeo selvagem, 3 amostras 0,5% de plasmídeo mutante diluido em plasmídeo selvagem, 3 amostras 0,1°/o de plasmídeo mutante diluído em pIasmídeo selvagem, 3 amostras 0,05% de plasmideo mutante diluído 1

33 /44 em plasmídeo selvagem, 3 amostras 0,01% de plasmideo mutante diluído em plasmideo . selvagem - quantidade total de DNA 7 x 10' cps/µL), um controle sem alvo.

N ) ddw para 20 µL 13.8 13.8 13.8 13.8 13.8 13.8 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira. Manter a tira 5 no gelo. Sempre manter a mistura de reação no gelo de agora em diante. Preparar diluições em série do alvo ("diluições alvo") a partir da solução enviada (plasmideo selv e plasmídeo mut). A soIução enviada é uma solução 7 x 10'° cópias/µL. Diluir inicialmente o plasmideo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 mM, então diluir em série o plasmídeo mutante em plasmídeo selvagem para obter as 10 seguintes concentrações de sequências mutantes em fundo selvagem: 1°/j, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,O1°/o (quantidade total portubo, 7 x 10' cps/µL) .

Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata.

15 Reação A reação segue o esquema de método da figura 4.

Programar o turbidimetro (Teramecs) para incubação a temperatura constante e monitoração em tempo real para turbidez, a fim de obter uma

34 /44 temperatura de reação constante de 65°C por 1 hora.

Análise de dados 5 O iniciador de laço auto pareado fluorescente na reação produz um sinal fluorescente uma vez que seja excitado por uma emissão de luz de comprimento de onda apropriado.

Quando a reação LAMP ocorre, o iniciador de laço auto pareado fluorescente hibridiza com a sequência alvo complementar sendo consequentemente incorporado nos produtos de amplificação.

O iniciador de Iaço auto 10 pareado fluorescente é projetado para ser complementar a uma sequência contendo pelo menos um nucleotideo Guanina próximo da extremidade 5'. A base Guanina pode absorver o comprimento de onda emitido pelo fluoróforo (TAMRA, no nosso caso), causando a extinção do sinal fluorescente.

Neste caso a detecção da amplificação da sequência alvo durante a reação LAMP é baseada na medida da diminuição do sinal 15 fluorescente a fim de encontrar um tempo limiar para cada amostra sob análise.

O tempo Iimiar é o minuto no qual o sinal de fluorescência da reação atinge 50% de extinção.

Para cada amostra, o tempo limiar é correlacionado com o log de cópias de DNA/µL.

Resultados A presente abordagem consiste na amplificação seletiva de . 20 uma sequência mutante baseada num projeto particular de iniciador de laço resultando na hibridização seletiva de tal iniciador de laço ao haleter formado a partir da sequência mutante (Fig. 4). Foi desenvolvido um conjunto universal (insensivel a mutantes) de iniciadores incluindo os oligonucleotideos F3, B3, FlP e BlP para obter uma estrutura haltere apresentando a mutação putativa na região do laço compreendida entre Bl e B2. 25 Não foram detectadas diferenças principais ao realizar tais experimentos em sequências alternativas contendo o nucleotídeo putativo mutado na região do laço em B2 ou entre B2 e Blc.

Foi incluido no conjunto de iniciadores um iniciador de Iaço particular apresentando uma região de sequência de 8 bases na sua extremidade 5' complementar a sua própria sequência na extremidade 3'. Consequentemente, este iniciador de laço 30 especial forma uma estrutura intramolecdar de grampo de cabelo que está em equilíbrio com sua forma aberta na temperatura de reação (65°C). Quando a sequência JAK2 mutada está presente na amostra, tal iniciador de laço modificado quebra sua estrutura interna para se hibridizar à sequência alvo complementar de acordo com o equilibrio termodinâmico (Tm entre o 35 iniciador e o alvo especifico = 65°C). O iniciador de laço hibridizado ao alvo mutado especifico é então estendido pela polimerase e a amplificação pode proceder adicionalmente.

Como caracteristica adicional, o iniciador de laço específico para a

35 /44 mutação JAK2 G~T apresenta uma Tm com a sequência alvo selvagem (59°C) menor que com a estrutura intramolecular de grampo de cabelo (65°C). Assim, numa amostra contendo a sequência JAK2 selvagem, tal diferença em valores Tm resulta num auto- sequestro do iniciador de laço modificado que prefere se dobrar na estrutura de grampo de cabeio que formar um duplex com o alvo não especifico, uma vez que as forças 5 intramoleculares são maiores que as intermoleculares. Para limitar a competição deste iniciador de laço por sequências selvagens provavelmente presentes em grande excesso na amostra clinica, foi incluído no arranjo de reação um segundo iniciador de iaço com estrutura análoga e 10 contendo uma sequência de nucleotÍdeos complementar à sequência JAK2 selvagem, i.e. Com uma base G na posição 1849 a partir do códon de inicio (Gene8ank no.

NM _ 004972). A extremidade 3' deste iniciador de Iaço "competidor" é tornada nào extensivel por uma modificação (3' didesoxi). A tarefa deste competidor é 15 "silenciar" a sequência selvagem, permitindo assim que o iniciador específico a mutante encontre seu alvo. Quando o iniciador "competidor" reconhece a sequência selvagem complementar, ele quebra sua estrutura intramolecular para hibridizar ao alvo selvagem, de acordo com a maior afinidade (Tm da duplex formada pelo alvo selvagem e . 20 iniciador de laço modificado selvagem = 67°C). O iniciador de laço hibridizado ao alvo selvagem não é extensivel, resultando em nenhuma amplificação de sequências selvagens. Uma vez que a reação é conduzida a temperatura constante, o iniciador haste-laço especifico a selvagem fica anexado às sequências selvagens evitando assim a hibridização não específica do iniciador de laço mutante.

25 Em contraste ao iniciador de laço especifico a mutante, o iniciador "competidor" apresenta uma Tm com a sequência alvo mutante (62°C) menor que a estrutura intramolecular de grampo de cabelo formada com ele mesmo (65°C). Assim, as forças intramoleculares maiores comparadas com as intermoleculares causam o auto-sequestro do iniciador haste-laço modificado que prefere se dobrar na estrutura 30 grampo de cabelo em vez de formar um duplex com a sequência alvo mutante. Para seguir a reação num instrumento em tempo real, a extremidade 5' do iniciador haste-laço específico a mutante foi marcada com um corante FAM. Para evitar a ligação do fluoróforo à base Guanina presente na extremidade 5' do iniciador de laço modificado, que tem um efeito extintor, foi adicionada uma base Timina à 35 extremidade do oligonucleotideo. O iniciador modificado-marcado, quando presente em soIução, emite um sinal fluorescente se excitado com luz de comprimento de onda apropriado. Quando a reação LAMP inicia e continua, o iniciador haste-laço fluorescente

36 /44 é incorporado nos produtos da amplificação. As bases Guanina presentes na sequência de nucleotideos complementares podem absorver o comprimento de onda emitido pelo fluoróforo, causando uma extinção detectável do sinal fluorescente em tempo real. Portanto, a acumulação de produtos de amplificação pode ser monitorada por toda a 5 reação LAMP medindo-se a diminuição no sinal fluorescente causada por este "efeito de extinção". Exemplo 7 - Reação LAMP de controle Reagentes Os plasmídeos JAK2 foram providos pelo fornecedor 10 GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante. Em detalhes: - PIasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base G no nucleotídeo 93526, chamado de "piasmideo selv"; - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID 15 NO:2, incluindo uma base T no nucleotideo 93526, chamado de "plasmideo mut". lniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon, chamados de "iniciadores": GA231 (F3) 5' GCATCTTTATTATGGCAGAGAG 3' (SEQ ID NO: 3) GA232 (B3) 5' TGCTCTGAGAAAGGCATTA 3' (SEQ ID NO: 4) '. . 20 GA233 (FlP) 5' gcTgcTTcAAAgAAAgAcTAAggAAATggAcmcAgTc~cAAc 3' (SEQ ID

V NO: 5) 0 GA234 (BlP) 5' GCTTTCTCACAAGCATTTGG I I I IAAATTAGCCTGTAG I l I IACTTACTCTC 3' (SEQ ID NO: 6) Tampão de reação: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8, 50 mM Kcl, 40 mM MgSO,, 50 mM de 25 (NH4),SO4, 0,5% Tween ("buffer 5x") mistura 25 mM cINTPS (Fermentas) ("dNTPs") polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("poIimerase") água apirogênica estéril (SALF Spa) ("ddw") Procedimento 30 Preparação da amostra Estocar os iniciadores em alíquotas. É melhor estocar soluções a -20°C, enquanto diluições de trabalho devem ser armazenadas a 4°C.

Preparar a mistura de reação como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), solução 35 tampão lx, 1,4 mM de mistura dNTPs, 8 U de polimerase Bst. O voiume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e. 20 µL de mistura de reação + 5 µL de amostra). Manter sempre os reagentes no gelo. Preparar a mistura para pelo

37 /44 menos 23 amostras, compreendendo 3 controles negativos (100°/o de plasmideo selvagem, 7 x 10' cps/µL), 9 controles positivos (3 amostras 100% de plasmideo mutante, 3 amostras 10°/o de plasmideo mutante dikhdo em plasmideo selvagem, 3 amostras 1°/0 de plasmideo mutante diluido em plasmideo selvagem), um controle sem alvo.

Tabela 7 - composi,ção da mistura de amostras ) Tubo de amostra I 1-3 ) 4-6 I 7-9 |iO-12 pIasmídeo mut plasmldeo mut )AIvO a ser adicionado)plasmldeo selv )plasmÍdeo mut)7x1O' cps/µL,)7x1O CPS/µL7| )(5µL) )7x1O' cps/µl |7x1O' cps/µL )plasmídeo selv )plasmfdeo selv |6,3x1O' cps/µL j6,93x1o' cps/µL ) GA231 i"òo µM 0.05 0.05 0.05 0.05 jgA23210oµM 0.05 0.05 0.05 0.05 jgÃ233100µM 0.4 0.4 0.4 0.4 ) GA234100 µM 0.4 0.4 0.4 0.4 LAMP Buffer 5x 2.5 2.5 2.5 2.5 Bst polimerase 8 U/µL 1 1 1 1 dNTPs 25 mM 1.4 1.4 1.4 1.4 ddw para 20 µL 13.8 13.8 13.8 13.8 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira. Manter a tira · no gelo. Sempre manter a mistura de reação no gelo de agora em diante. Preparar diluições em série do alvo ("diluições alvo") a partir da solução enviada (pIasmldeo selv e plasmideo mut). A solução enviada é uma soluçào 7 x 10'° cópias/µL Diluir inicialmente o plasmideo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 mM, então diluir em série o plasmideo mutante em plasmídeo selvagem para obter as seguintes concentrações de sequèncias mutantes em fundo selvagem: 1O°/j, 1%(quantidade total por tubo, 7 x 10' cps/µL) .

Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata.

Reação A reação segue o esquema de método da figura 11.

Colocar as tiras no instrumento imediatamente antes de iniciar os programas. lniciar o programa. Análise de dados

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Analisar a variação de absorbância em termos de a.u. (unidades arbitrárias de absorbância) para encontrar o tempo limiar para cada amostra analisada.

O tempo limiar é o minuto em que a absorbância da amostra, após subtração da linha base, atinge o valor de unidade arbitrária que representa o limiar (neste caso 0,1 5 a.u.). O tempo limiar atingido por cada amostra é correlacionado com seu log de cópias de DNAjµL.

Resultados A presente abordagem consiste numa amplificação insensível a mutante da sequência do gene JAK2 usando os iniciadores F3, B3, FlP e BlP 10 (Fig. 11). Foi empregado o mesmo conjunto de iniciadores descrito no Exemplo 4, excluindo o PNA e o iniciador haste-laço especifico a mutante da mistura de reação.

A detecção de amplificação de sequência alvo no "ensaio LAMP de controle" é indicativa de parâmetros de qualidade diferente tais como a correta correspondência de bases de iniciadores ao gabarito, as condições de extensão eficiente e a ausência de inibidores na 15 solução de reação.

Reciprocamente, a ausência ou atraso da amplificação da amostra de ácido nucléico no "ensaio LAMP de controle" destaca problemas no arranjo da reação (i.e., composição do tampão, temperatura, qualidade dos iniciadores, etc.) ou a presença de um inibidor na mistura de reação.

Para avaliar tal método de ensaio de controle, um painel de - 20 amostra clinica foi analisado em duplicata usando ambos ensaio LAMP especifico para detectar a mutação G~T (Exemplo 4) e o "ensaio LAMP de controle". Quando a sequência de ácido nucleico é amplificada em ambos ensaios, é obtido um resultado validado e a amostra é considerada contendo a mutação V617F.

Quando a sequência de ácido nucléico é amplificada pelo "ensaio LAMP de controle" e não pela "estratégia LAMP 25 modificada por JAK2 iniciador haste-laço com PNA", novamente é obtido um resultado validado e a amostra é diagnosticada como uma amostra JAK2 selvagem.

No caso de nenhuma amplificação de sequência alvo no "ensaio LAMP de controle", a análise deve ser considerada inválida.

A avaliação do "ensaio LAMP de controle" foi realizada em 30 amostras de DNA de plasmídeo contendo respectivamente 7 x 103 cps/µL de plasmídeo selvagem e mutante e em amostras contendo 10°6 e 1°/0 de plasmídeo mutante em fundo selvagem, 35000 cópias no total (Fig. 12). Todas as amostras de ácido nucléico testadas exibiram eficiência de amplificação comparável indicando assim a ausência de inibidores de reação. 35 Exemplo 8 - Estimativa da quantidade de sequências JAK2 mutantes numa amostra usando o ensaio LAMP "iniciador haste-laço com PNA" Reagentes

39 /44 .

Os plasmideos JAK2 foram providos pelo fornecedor GeneArt (Regensburg, Alemanha) e continham a sequência JAK2 selvagem ou mutante.

Em detalhes: - Plasmideos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID 5 NO:2, incluindo uma base G no nucleotídeo 93526, chamado de "plasmídeo selv"; - Plasmídeos JAK2 cuja inserção corresponde à sequência 93249-93731 de SEQ ID NO:2, incluindo uma base T no nucleotídeo 93526, chamado de "plasmideo mut". lniciadores: sintetizados pelo fornecedor Eurofins MWG Operon, chamados de "iniciadores": 10 GA231 (F3) 5' GCATCTTTATTATGGCAGAGAG 3' (SEQ ID NO: 3) GA232 (B3) 5' TGCTCTGAGAAAGGCATTA 3' (SEQ ID NO: 4) GA233 (FIP) 5' GCTGCTTCAAAGAAAGACTMGGAAATGGACAACAGTC~CMC 3' (SEQ ÍD NO: 5) GA234 (BlP) 5' GCTTTCTCACAAGCATTTGG I I I IAAATTAGCCTGTAG I I I IACTTACTCTC 3' 15 (SEQ ID NO: 6) GA236 (LB) 5' GTCTCCACTGGAGTATGTTTCTGTGGAGAC 3' (SEQ ID NO: 8) a base sublinhada corresponde ao nucleotídeo mutado na posição 1849 a partir do códon de inicio ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM_ 004972).

PNA: sintetizado por Eurogentec, chamado de PNA GM43 - 20 '"GAGTATGTG,TCTGTGGA'°°' (SEQ ID NO: 9). A base sublinhada corresponde ao nucleotÍdeo selvagem na posição 1849 a partir do códon de inicio ATG na sequência de codificação JAK2 (Gene8ank no. NM_ 004972). Tampão de reação: 100 mM de Tris-HCl pH 8,8, 50 mM Kcl, 40 mM MgSO,, 50 mM de (NH4)2SO4, 0,5% Tween ("buffer 5x") 25 mistura 25 mM cINTPS (Fermentas) ("CINTPS") . polimerase Bst de fragmentos grandes 8 U/µL (New England Biolabs) ("polimerase") água apirogênica estéril (SALF Spa) ("ddw") Procedimento Preparação da amostra 30 Estocar os iniciadores em aliquotas. É melhor estocar soluções a -20°C, enquanto diluições de trabalho devem ser armazenadas a 4°C.

Preparar a mistura de reação como segue: 0,2 µM de iniciadores externos (F3 e B3), 1,6 µM de iniciadores internos (FlP e BlP), 0,8 µM de iniciador de laço auto pareado especifico a JAK2 mutante (LB), 0,8 µM de PNA, solução 35 tampão lx, 1,4 mM de mistura dNTPs, 8 U de poiimerase Bst. O volume final da mistura de reação deve ser de 4/5 do volume de reação total (i.e. 20 µL de mistura de reação + 5 µL de amostra). Manter sempre os reagentes no gelo. Preparar a mistura para pelo

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menos 23 amostras, compreendendo 3 controles negativos (100°/o de plasmideo selvagem, 7 x 10' cps/µL), 9 controles calibradores positivos (3 amostras 100% de plasmideo mutante, 3 amostras 10°/o de plasmideo mutante diluído em plasmídeo selvagem, 3 amostras 1°/0 de plasmídeo mutante diluido em plasmídeo selvagem), um 5 controle sem alvo.

Tabela 8 - composição da mistura de amostras I Tubo de amostra ! 1-3 ) 4-6 i 7-9 ) 10-12 plasmídeo mut plasmídeo mut )Alvo a ser adicionado!p|asmÍdeo selv |piasmÍdeo mut j7x1o' cps/µL,)7x1O cps/µLi| |(5µL) |7x103 cps/µL |7x1O' cps/µL )plasmídeo selv |piasmÍdeo selv |6,3x1O' cps/µL )6,93x1O' cps/µL i I GA23110OµM 0.05 0.05 0.05 0.05 I GA232100 µM l 0.05 0.05 0.05 0.05 )GA23310OµM ) 0.4 0.4 0.4 0.4 " Í GA234100 µM 0.4 0.4 0.4 0.4 I PNAIOO µM 0.2 0.2 0.2 0.2 ) GA23610OµM ) 0.2 0.2 0.2 0.2 ) LAMP Buffer 1Ox 2.5 2.5 2.5 2.5 I Bst polimerase 8 U/µL 1 1 1 1 | dNTPs 25 mM I 1.4 1.4 1.4 1.4 I ddw para 20 µL 13.8 13.8 13.8 13.8 Dispensar 20 µL da mistura de reação na tira. Manter a tira no gelo Sempre manter a mistijra de reação no gelo de agora em diante.

Preparar diluições em série do alvo ("diluições alvo") a partir 10 da solução enviada (plasmídeo selv e pIasmídeo mut). A solução enviada é uma solução 7 x 10'° cópias/µL. Diluir inicialmente o plasmideo mutante a 7 x 10' cópias/µL em Tris 10 mM, então diluir em série o plasmídeo mutante em plasmídeo selvagem para obter as seguintes concentrações de sequências mutantes em fundo selvagem: 10°/o, 1°/, (quantidade total por tubo, 7 x 10' cps/µL) .

15 Adicionar 5 µL de diluições alvo às tiras, em triplicata. Adicionar 5 µL das diluições alvo partindo da amostra menos concentrada para a mais concentrada. Fechar todos os tubos.

Reação A reação segue o esquema de método da figura 5.

20 Programar o turbidimetro (Teramecs) para incubação a temperatura constante e monitoração em tempo real para turbidez, a fim de obter uma temperatura de reação constante de 65°C por 1 hora.

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P & Colocar as tiras no instrumento imediatamente antes de iniciar os programas. Iniciar o programa. Análise de dados Analisar a variação de absorbância em termos de a.u.

5 (unidades arbitrárias de absorbância) para encontrar o tempo limiar para cada amostra analisada. O tempo limiar é o minuto em que a absorbância da amostra, após subtração da linha base, atinge o valor de unidade arbitrária que representa o limiar (neste caso 0,1 a.u.). O tempo limiar atingido por cada amostra é correlacionado com seu log de cópias de DNNµL. 10 Resultados Um subconjunto de pacientes são homozigotos para o alelo' JAK2 V617F. O mecanismo de homozigose resulta da recombinação mitótica e duplicação do alelo mutante, conhecida como dissomia uniparental adquirida'. A heterozigose ou homozigose do alelo mutante JAK2 está correlacionada com a prognose, 15 resultando assim na importância de determinar se a quantidade de cópias alélicas mutantes JAK2 na amostra é maior ou menor que 50%. De acordo com a presente abordagem, as amostras desconhecidas são analisadas como não diluídas e diluídas 1:5 usando o ensaio LAMP "iniciador haste-laço com PNA" previamente descrito no Exemplo 4. Em adiçào, o arranjo . 20 do ensaio inclui três amostras calibradoras contendo respectivamente 100%, 10°/o e 1°/j de cópias de plasmídeo JAK2 mutante em fundo selvagem. Se a quantidade de sequências alvo JAK2 mutantes na amostra de ácido nucléico for maior que 50°/o, a amplificação em tempo real de dita sequência alvo é detectada num tempo entre os minutos limiares de amplificação do calibrador 100% e do calibrador 1O°/o tanto no caso 25 de amostras não diluidas (Fig. 13, painel A) e de amostras diluidas 1:5 (Fig. 13, painel B). Um desempenho de amplificação diferente é detectado para amostras de ácido nucléico contendo menos que 50% de quantidade de sequência JAK2 mutante uma vez que os fragmentos amplificados alvo nas amostras não diluídas são detectados mais cedo que no calibrador 10°/o (Figura 13, painel A) enquanto que o minuto limiar de amplificação nas 30 amostras correspondentes diluidas 1:5 é medido num tempo entre o min(t) do calibrador 1O°/o e o min(t) do calibrador 1°/0 (Figura 13, painel B). A presente abordagem foi testada realizando-se a reação LAMP "iniciador haste-laço com PNA" em amostras de controle (7 x 10' cps/µL de plasmídeo selvagem, 7 x 10' cps/µL de plasmídeo mutante em 6,3 x 10' cps/µL 35 pIasmideo selvagem, 7 x 10 cps/µL de plasmideo mutante em 6,93 x 10' cps/µL plasmídeo selvagem), em quatro amostras consistindo de misturas de plasmídeo JAK2 mutante em fundo selvagem em proporções maiores que 50% (respectivamente 60°/o,

42 /44 70%, 80%, 90°/o) e em quatro amostras consistindo de misturas de plasmideo JAK2 mutante em fundo selvagem na proporção de 5O°/j ou menos (respectivamente 40°/o, 3O°/q, 20°/o). Exceto pelos controles, todas as amostras foram analisadas como não diluídas (5 µL dos 7 x 10' cps/µL para cada reação) e diluída 1:5 em Tris4-lCl1O mM. 5 Para as amostras de teste contendo mais de 50°/o de cópias alélicas JAK2 mutantes e diluídas 1:5, a amplificação da seqUência alvo foi detectada após a amplificação da sequência correspondente no calibrador 100% e antes do calibrador 10% (Figura 14). Para as amostras apresentando quantidade de 5O°/j de cópias alélicas JAK2 mutantes e diluidas 1:5, a amplificação da sequência alvo foi 10 registrada no mesmo minuto limiar da amostra do calibrador 1O°/q (Figura 15). Para as amostras de teste contendo menos de 50°6 de cópias alélicas JAK2 mutantes e diluidas 1:5, a amplificação da sequência alvo foi detectada num minuto limiar intermediário entre o tempo de amplificação dos calibradores 10°6e 1%(Figura15). 15 Portanto, usando a presente abordagem é possível estimar se a quantidade de cópias alélicas mutantes JAK2 numa amostra de ácido nucléico é maior ou menor que 50%. Tal informação é cIinicamente muito relevante uma vez que ela provê indicação sobre a heterozigose ou homozigose numa amostra o que por sua vez está correlacionado com a prognose da doença. 20 Referências

1. Levine, R. L. et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Ce// 7, 387-397 (2005).

2. james, C. et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes 25 polycythaemia vera. Nature 434, 1144-1148 (2005).

3. Baxter, E. J. et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human t myeloproliferative disorders. Lancet 365, 1054-1061 (2005).

4. Kralovics, R. et al. A gain of function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N. Engl. J. Med. 352, 1779-1 790 (2005). 30 5. Nelson ME, Steensma DP: JAK2 V617F in myeloid disorders: what do we know now, and where are we headed? Leuk Lymphoma 2006, 47:177-194

6. James C, Ugo V, Le Couedic J-P, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, Garcon L, Raslova H, Berger R, Bennaceur-Griscelli A, Villeval JL, Constantinescu SN, Casadevall N, Vainchenker W: A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes 35 polycythaemia vera. Nature 2005, 434:1144-1148

7. De Keersmaecker K, Cools J: Chronic myeloproliferative disorders: a tyrosine kinase tale. Leukemia 2005, 20:200-205

43 /44

8. Kaushansky K: On the molecular origins of the chronic myeloproiiferative disorders: it all makes sense. Blood 2005, 105:4187-4190

9. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, Vassiliou GS, Bench AJ, Boyd EM, Curtin N, Scott MA, Erber WN, Green AR: Acquired mutation of the 5 tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. The Lancet 2005, 365:1054- 1061

10. Smith TA, Whelan J, Parry Pj: Detection of single-base mutations in a mixed population of cells: a comparison of SSCP and direct sequencing. Genet Anal Tech Appi 1992, 9:143-145 10 11. james C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier l, Couedic JP, Giraudier S, Roy L, Saulnier P, Lacroix L, Maury S, Tulllez M, Vainchenker W, Ugo V, Casadevall N: Detection of JAK2 V617F as a irst intention diagnostic test for erythrocytosis. Leukemia 2006, 20:350-353

12. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith 15 JC, Markham AF: Analysis of any point mutation in DNA: the amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 1989, 17:2503-2516

13. jones AV, Kreil S, Zoi K, Waghorn K, Curtis C, Zhang L, Score J, Seear R, Chase AJ, Grand FH, White H, Zoi C, Loukopoulos D, Terpos E, Vervessou EC, Schultheis B, Emig M, Ernst T, Lengfelder E, Hehlmann R, Hochhaus A, Oscier D, Silver RT, Reiter A, Cross 20 NC: Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood 2005, 106:2162-2168

14. James C, Delhommeau F, Marzac C, Teyssandier l, Couedic JP, Giraudier S, Roy L, Saulnier P, Lacroix L, Maury S, Tulliez M, Vainchenker W, Ugo V, Casadevall N: Detection of JAK2 V617F as a first intention diagnostic test for erythrocytosis. Leukemia 2006, , 25 20:350-353

15. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, Vassiliou GS, Bench AJ, Boyd EM, Curtin N, Scott MA, Erber WN, Green AR: Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. The Lancet 2005, 365:1054- 1061 30 16. Antonioli E, Gug|ielme||i P, Pancrazzi A, Bogani C, Verrucci M, Ponziani V, Longo G, Bosi A, Vannucchi AM: Clinical implications of the JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia. Leukemia 2005, 19:1847-1 849

17. jelinek J, Oki Y, Gharibyan V, Bueso-Ramos C, Prchal JT Verstovsek S, Beran M, Estey E, Kantarjian I-IM, lssa jP: JAK2 mutation 1849G _T is rare in acute leukemias but 35 can be found in CMML, Philadelphia chromosome-negative CML, and megakaryocytic leukemia. Blood 2005, 106:3370-3373

44 /44

18. jones AV: Widespread occurence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood 2005, 106: 2162-2168.

19. Steensma D: JAK2 V617F in myeloid disorders: molecular diagnostic techniques and their clinical utility. Journal of Molecular Diagnostics 2006, 8:397-411.

20. lwasaki M. et al. Genome Letters 2003, 2:119-126.

21. Fukuta S. et al. J Appl Genet 2006, 47:303-308.

22. lkeda S. et al. Pathol. lntern. 2007, 57: 594-599.

Claims

1 /6 Reivindicações

1. "Método para identificar a presença de uma mutação pontual numa molécula ácido nucléico alvo em um fundo de moléculas de ácido nucléico selvagem", o método sendo caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: 5 1) prover uma amostra de ácido nucléico 2) contatar dita amostra de ácido nucléico, sob condições de reação apropriadas, com uma solução compreendendo uma mistura de oligonucleotideos e uma DNA polimerase tendo atividade de deslocamento de fita sob condições de hibridização, em que dita mistura de oligonucleotideos consiste de iniciadores adequados para 10 amplificação isotérmica mediada por laço da região da molécula alvo de ácido nucléico incluindo a posição no ácido nucleico da mutação pontual a ser detectada, ditos iniciadores compreendendo: i. um primeiro iniciador externo F3 e um segundo iniciador externo B3: ii. um primeiro iniciador interno FlP e um segundo iniciador interno BlP, 15 em que FlP consiste de uma sequência F2 de ácido nucléico 3' e uma sequência Flc de ácido nucléico 5', e BlP consiste de uma sequência B2 de ácido nucléico 3' e uma sequência Blc de ácido nucléico 5', em que F2 é capaz de reconhecer e hibridizar-se a uma região da molécula alvo de ácido nucléico designada como F2C e B2 é capaz de reconhecer e hibridizar- " 20 se a uma região da molécula alvo de ácido nucléico designada como B2C, em que F2c e B2C são regiões diferentes situadas em fitas opostas da molécula alvo de ácido nucléico, em que B2C está a jusante da mutação pontual ou F2c está a montante da mutação pontual, e em qUe 25 se B2C está a jusante da mutação pontual, então dita mutação pontual está situada na sequência F2C ou a jusante da sequência F2c e a montante da sequência Flc, ou se F2C está a montante da mutação pontual, então dita mutação pontual está situada na sequência B2C ou a montante da sequência B2C e a jusante da 30 sequência Blc. iii. um iniciador extensível mutante haste-laço compreendendo: - uma sequência de laço central capaz de reconhecer seletivamente e hibridizar-se a uma região da molécula alvo de ácido nucléico compreendendo a mutação pontual, de modo que a sequência de laço central 35 seja capaz de reconhecer e hibridizar-se à molécula alvo de ácido nucléico somente se a mutação pontual estiver presente, e - uma sequência terminal 5' e uma sequência terminal 3' que são

2 /6 complementares uma à outra para formar uma haste com a hibridização intramolecular, a afinidade de hibridização da sequência do laço central à região da molécula alvo de ácido nucléico compreendendo a mutação pontual sendo maior que a afinidade de hibridização intramolecular da sequência 5' à sequência 3' de modo que, se o ponto de hibridização estiver presente, a sequência de laço central pareia e amplifica a região da mo|écU|a alvo de ácido nucléico compreendendo o ponto de mutação; iv. uma porção não extensivel que é capaz de seletivamente reconhecer e hibridizar-se às moléculas de ácido nucléico selvagem; 3) incubar a mistura resultante a temperatura constante; 4) detectar um sinal indicativo de amplificação da região da molécula alvo de ácido nucléico compreendendo a mutação pontual.

2. "Método", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a mutação pontual está situada na região entre a sequêncla F2C e a sequência Flc ou entre a sequência B2C e a sequência Blc.

3. "Método", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato que a mutação pontual está situada na sequência F2C ou na sequência B2C.

4. "Método", de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato que cada uma da sequência de extremidade 5' e sequência de extremidade 3' do iniciador extensível mutante haste-laço tem pelo menos 3 nucleotídeos de comprimento.

5. "Método", de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato que a porção não extensivel é um ácido nucléico peptidico (PNA).

6. "Método", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato que o PNA tem pelo menos 10 bases de comprimento.

7. "Método", de acordo com as reivindicações 5 ou 6, caracterizado pelo fato que a sequência de bases do PNA é tal que a temperatura de fusão da estrutura de dupla fita resultante da hibridização do PNA com a molécula alvo de ácido nucléico na ausência da mutação pontual (Tm = X) é maior que a temperatura de incubação e a temperatura de fusão da estrutura de dupla fita resultante da hibridização do PNA com a molécula alvo de ácido nucléico na presença da mutação pontual (Tm = Y) é menor que a temperatura de incubação, e adicionalmente pelo fato que X é pelo menos 5°C maior que Y.

8. "Método", de acordo com as reivindicações de 1 a 4,

3 /6 .

.

caracterizado pelo fato que a porção não extensivel é um iniciador não extensivel haste- laço selvagem, compreendendo: - uma sequência central de laço capaz de seletivamente reconhecer e hibridizar a uma região da molécula de ácido nucléico selvagem compreendendo a posição do ácido 5 nucléico da mutação pontual a ser detectada; - uma sequência terminal 5' e uma sequência terminai 3' que são complementares uma à outra para formar uma haste com a hibridização intramolecular, a afinidade de hibridização da sequência do laço central à região da molécula de ácido nucléico selvagem compreendendo a posição do ácido nucléico da mutação pontual a ser 10 detectada sendo maior que a afinidade de hibridização intramolecular da sequência 5' à sequência 3' de modo que a sequência de laço central pareie a região da molécda de ácido nucléico selvagem compreendendo a posição de ácido nucléico do ponto de mutação a ser detectado, bloqueando com isso a amplificação.

9. "Método", de acordo com as reivindicações de 1 a 8, 15 caracterizado pelo fato que a DNA polimerase é escoihida dentre o grupo que consiste de grande fragmento de polimerase Bst, fragmentos Bca (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep Vent (exo-), fago IJ29, fago MS-2, Z-Taq, KOD, Klenow, e quaisquer combinações deles.

10. "Método", de acordo com as reivindicações de 1 a 9, " 20 caracterizado pelo fato que a mutação pontual a ser detectada é a mutação g ~ t na posição 2343 de SEQ ID NO: 1.

11. "Método", de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato que o primeiro iniciador externo F3 consiste de SEQ ID NO: 3, o segundo iniciador externo B3 consiste de SEQ ID NO: 4, o primeiro iniciador interno FlP 25 consiste de SEQ ID NO: 5, o segundo iniciador interno BlP consiste de SEQ ID NO: 6 e o * iniciador extensível mutante haste-laço consiste de SEQ ÍD NO: 8.

12. "Método", de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma porção não extenslvel que é um PNA tendo a seguinte sequência de bases: 30 NH,- GAGTATGTGTCTGTGGA -COOH (SEQ ID NO:9), em que G é guanina, A é adenina,TétiminaeCécitosina.

13. "Método", de acordo com as reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender a etapa de avaliar se a mutação pontual está na forma homozigótica ou heterozigótica, pela comparação quantitativa do 35 sinal indicativo de amplificação da região da molécula alvo de ácido nucléico compreendendo a mutação pontual obtida a padir da amostra com o dito sinal obtido a partir de pelo menos um calibrador.

4 /6 .

14. "Método", de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato que o pelo menos um calibrador consiste de uma percentagem predeterminada (°/0) de moléculas alvo mutantes de ácido nucléico num fundo de molécdas de ácido nucléico selvagem, em que a dita percentagem predeterminada (°/0) é 5 preferencialmente em torno de 10°/o.

15. "Conjunto de iniciadores", para detectar por amplificação isotérmica mediada por laço, a presença de uma mutação pontual numa molécula alvo de ácido nucléico num fundo de moléculas de ácido nucléico selvagem, o conjunto de iniciadores sendo caracterizado pelo fato de compreender: 10 i. um primeiro iniciador externo F3 e um segundo iniciador externo B3; ii. um primeiro iniciador interno FlP e um segundo iniciador interno BlP, em que FlP consiste de uma sequência F2 de ácido nucléico 3' e uma sequência Flc de ácido nucléico 5', e BlP consiste de uma sequência B2 de ácido nucléico 3' e uma sequência Blc de ácido nucléico 5', 15 em que F2 é complementar a uma região da molécula alvo de ácido nucléico designada como F2C e B2 é complementar a uma região da molécula alvo de ácido nucléico designada como B2c, em que F2C e B2C são regiões não sobrepostas situadas em fitas opostas da molécula alvo de ácido nucléico, " 20 em que B2C está a jusante da mutação pontual ou F2C está a montante da mutação pontual, e em que se B2C está a jusante da mutação pontual, então dita mutação pontual está situada na sequència F2C ou a jusante da sequência F2C e a montante da sequência Flc, ou 25 se F2C está a montante da mutação pontual, então dita mutação pontual está situada na sequência B2C ou a montante da sequência B2C e a jusante da sequência Blc. iii. um iniciador extensivel mutante haste-laço compreendendo: - uma sequência de laço central complementar a uma região da molécula alvo 30 de ácido nucléico compreendendo a mutação pontual, e - uma sequência terminal 5' e uma sequência terminal 3' que são complementares uma à outra para formar uma haste com a hibridização intramolecular, a afinidade de hibridização da sequência do laço central à região da molécula 35 alvo de ácido nucléico compreendendo a mutação pontual sendo maior que a afinidade de hibridização intramolecular da sequência 5' à sequência 3'.

16. "Conjunto", de acordo com a reivindicação 15,

5 /6 .

caracterizado pelo fato que cada uma da sequência de extremidade 5' e sequência de extremidade 3' do iniciador extensivel mutante haste-laço tem pelo menos 3 nucleotídeos de comprimento.

17. "Conjunto", de acordo com as reivindicações 15 ou 16, 5 caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma porção não extensivel capaz de hibridizar com as moléculas de ácido nucléico selvagem.

18. "Conjunto", de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato que a porção não extensível é um ácido nucléico peptidico (PNA). 10 19. "Conjunto", de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato que o PNA tem pelo menos 10 bases de comprimento.

20. "Conjunto", de acordo com as reivindicações 15 ou 16, caracterizado pelo fato que a porção não extensivel é um iniciador não extensível haste- laço, compreendendo: 15 - uma sequência central de laço complementar a uma região da molécula de ácido nucléico selvagem compreendendo a posição do ácido nucléico da mutação pontual a ser detectada; - uma sequência terminal 5' e uma sequência terminal 3' que são complementares uma à outra para formar uma haste com a hibridização intramolecular, 20 a afinidade de hibridização da sequência do laço central à região da molécula de ácido nucléico selvagem compreendendo a posição do ácido nucléico da mutação pontual a ser detectada sendo maior que a afinidade de hibridização intramolecular da sequência 5' à sequência 3'.

21. "Conjunto", de acordo com as reivindicações de 15 a 20, 25 caracterizado pelo fato que que o primeiro iniciador externo F3 consiste de SEQ ID NO: 3, o segundo iniciador externo B3 consiste de SEQ ID NO: 4, o primeiro iniciador interno FlP consiste de SEQ ID NO: 5, o segundo iniciador interno BlP consiste de SEQ ÍD NO: 6 e o iniciador extensível mutante haste-iaço consiste de SEQ ID NO: 8.

22. "Conjunto", de acordo com a reivindicação 21, 30 caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender uma porção não extensivel que é um PNA tendo a seguinte sequência de bases: NH,- GAGTATGTGTCTGTGGA-COOH (SEQ ID NO:9), em que G é guanina, A é adenina,TétiminaeCécitosina.

23. "Kit para detectar, por amplificação isotérmica mediada 35 por laço, a presença de uma mutação pontual numa molécula alvo de ácido nucléico num fundo de moléculas de ácido nucléico selvagem", o kit sendo caracterizado pelo fato de compreender o conjunto de iniciadores de acordo com as reivindicações de 15 a 22 e

6 /6 .

.

uma DNA polimerase com atividade de deslocamento de fita.

24. "Kit", de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato que a DNA polimerase é escolhida dentre o grupo que consiste de grande fragmento de polimerase Bst, fragmentos Bca (exo-), Vent, Vent (exo-), Deep Vent, Deep 5 Vent (exo-), fago D29, fago MS-2, Z-Taq, KOD, Klenow, e quaisquer combinações deles. 25, "Kit", de acordo com as reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender um ou mais calibradores.

26. "OligonucleotÍdeo isolado", caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre o grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID 10 NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8.

27. "Ácido nucléico peptídico (PNA)", de 6 a 24 bases de comprimento, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de bases que é capaz de hibridizar a uma região do DNA genômico JAK2 (SEQ ID NO: 2) incluindo a posição 93526 de SEQ ID NO: 2 ou a uma região do CDNA JAK2 (SEQ ID NO: 1) 15 incluindo a posição 2342 de SEQ ID NO: 1.

28. "Ácido nucléico peptídico (PNA)", de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de compreender a seguinte sequência de bases: NH,- GAGTATGTGTCTGTGGA-COOH (SEQ ID NO:9), em que G é guanina, A é " 20 adenina,TétiminaeCécitosina.

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r i /1 0 Resumo Método isotérmico rápido altamente sensível para a detecção de mutações pontuais e SNPs, conjunto de iniciadores e kit detes. O presente invento se refere a um método para detectar 5 uma mutação pontual de uma sequência de nucieotideos por um aperfeiçoamento do método de amplificação LAMP (amplificação isotérmica mediada por Iaço), bem como a um conjunto de iniciadores e a um kit para eles. Como uma forma não limitativa de realização do presente invento, o invento se refere à mutação G1849T do gene JAK2.

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