ES2535178T3 - Método isotérmico rápido altamente sensible para la detección de mutaciones puntuales y SNP, conjunto de cebadores y kit para el mismo - Google Patents

Abstract

Método de detección de la presencia de una mutación puntual en una molécula de ácido nucleico diana en un contexto de moléculas de ácido nucleico de tipo natural, comprendiendo el método las etapas de: 1) proporcionar una muestra de ácido nucleico; 2) poner en contacto dicha muestra de ácido nucleico, en condiciones de reacción apropiadas, con una disolución que comprende una mezcla de oligonucleótidos y una ADN polimerasa que tiene actividad de desplazamiento de hebra en condiciones de hibridación, en el que dicha mezcla de oligonucleótidos consiste en cebadores adecuados para amplificación isotérmica mediada por bucle de la región de la molécula de ácido nucleico diana que incluye la posición de ácido nucleico de la mutación puntual que va a detectarse, comprendiendo dichos cebadores: i. un primer cebador externo F3 y un segundo cebador externo B3; ii. un primer cebador interno FIP y un segundo cebador interno BIP, en el que FIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' F2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' F1c y BIP consiste en una secuencia de ácido nucleico en 3' B2 y una secuencia de ácido nucleico en 5' B1c, en el que F2 puede reconocer e hibridarse con una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como F2c y B2 puede reconocer e hibridarse con una región de la molécula de ácido nucleico diana designada como B2c, en el que F2c y B2c son regiones diferentes ubicadas en hebras opuestas de la molécula de ácido nucleico diana, en el que o bien B2c está en el sentido de 3' de la mutación puntual o bien F2c está en el sentido de 5' de 30 la mutación puntual, y en el que si B2c está en el sentido de 3' de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de F2c o en el sentido de 3' de la secuencia de F2c y en el sentido de 5' de la secuencia de F1c, o si F2c está en el sentido de 5' de la mutación puntual, entonces dicha mutación puntual está ubicada en la secuencia de B2c o en el sentido de 5' de la secuencia de B2c y en el sentido de 3' de la secuencia de B1c; iii. un cebador extensible mutante de tallo-bucle que comprende: - una secuencia de bucle central que puede reconocer e hibridarse selectivamente con una región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual, de manera que la secuencia de bucle central puede reconocer e hibridarse con la molécula de ácido nucleico diana sólo si está presente la mutación puntual, y - una secuencia de extremo 5' y una secuencia de extremo 3' que son complementarias entre sí de manera que se forma un tallo tras hibridación intramolecular, siendo la afinidad de hibridación de la secuencia de bucle central con la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual mayor que la afinidad de hibridación intramolecular de la secuencia en 5' con la secuencia en 3' de manera que, si está presente la mutación puntual, la secuencia de bucle central se aparea con y amplifica la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual; iv. un resto no extensible que puede reconocer e hibridarse selectivamente con las moléculas de ácido nucleico de tipo natural; 3) incubar la mezcla resultante a una temperatura constante; 4) detectar una señal indicativa de amplificación de la región de la molécula de ácido nucleico diana que comprende la mutación puntual.