BR112014011188B1

BR112014011188B1 - composição injetável para utilização na reparação ou aumento de tecido em indivíduo e dispositivo de entrega compreendendo a referida composição

Info

Publication number: BR112014011188B1
Application number: BR112014011188-0A
Authority: BR
Inventors: Evangelia Bellas; Kacey Marra; J. Peter Rubin; David L. Kaplan
Original assignee: Trustees Of Tufts College; University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education; Wake Forest University Health Sciences
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2012-11-09
Publication date: 2020-05-19
Also published as: BR112014011188A2; JP2018089388A; US20180339084A1; EP2788040A1; BR112014011188A8; EP2788040A4; ES2953309T3; EP4257202B1; KR20200093073A; CA2890366A1; MX2014005702A; US20210244850A1; US9931434B2; JP2015502199A; AU2012335106A1; JP6362540B2; KR20230066481A; US20140308362A1; EP4257202A2; WO2013071107A1

Abstract

resumo partículas de fibroína de seda injetáveis e uso das mesmas as invenções aqui apresentadas referem-se a composições, métodos, dispositivos de entrega e kits para reparar ou aumentar um tecido num sujeito. as composições aqui descritas são injetáveis de tal modo que eles podem ser colocados em um tecido a ser tratado com um procedimento minimamente invasivo (por exemplo, por injeção) e / ou ser moldado de forma flexível dentro de um vazio de tecido de qualquer forma e / ou tamanho. em algumas formas de realização, a composição aqui descrita compreende uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, o qual pode reter o seu volume original no prazo de tecido por um período de tempo. as composições podem ser usadas como material de enchimento para substituir o vazio do tecido, por exemplo, para a reparação e / ou o aumento do tecido, ou como um andaime para apoiar a regeneração e / ou reconstrução de tecidos. em algumas concretizações, as composições aqui descritas podem ser utilizadas para a reparação ou aumento de tecidos moles.

Description

“COMPOSIÇÃO INJETÁVEL PARA UTILIZAÇÃO NA REPARAÇÃO OU AUMENTO DE TECIDO EM INDIVÍDUO E DISPOSITIVO DE ENTREGA COMPREENDENDO A REFERIDA COMPOSIÇÃO

REFERÊNCIA CRUZADA PARA APLICAÇÕES RELACIONADAS

[0001] Este pedido reivindica o benefício ao abrigo de 35 USC § 119 (e), do Pedido Provisório dos EUA N_

61/557.603 depositado em 09 de novembro de 2011, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

APOIO GOVERNAMENTAL

[0002] Esta invenção foi feita com o apoio do governo, concessão N_ EB002520 concedido pelos Institutos Nacionais de Saúde e W81XWH-08-2-0032 concedido pelo Exército dos EUA. O governo tem determinados direitos na invenção.

CAMPO TÉCNICO DA DIVULGAÇÃO

[0003] As invenções aqui fornecidas geralmente se referem a materiais à base de fibroína de seda para aplicações biomédicas, por exemplo, na reparação aumento e/ou reconstrução de tecidos moles.

FUNDAMENTOS

[0004] A restauração de defeitos de tecidos moles de trauma, excisão cirúrgica ou defeitos congênitos deve começar com uma estratégia que irá manter o tamanho e forma do tecido de dimensões quase normais para prazos longos. Estratégias clínicas atuais incluem transferências livre de gordura e enchimentos artificiais. No caso de pacientes com câncer da mama recebendo mastectomia, conchas de silicone cheias com solução salina ou silicone são utilizadas para substituir o vazio. Isso deixa o paciente com uma aparência

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2/128 e sensação não natural, e o risco de contratura capsular resultando em uma cirurgia de revisão. O enxerto de gordura e as opções de preenchimento artificiais não conseguem manter o volume ao longo do tempo. Assim, o enxerto de gordura e opções de enchimento artificiais podem requerer um segundo local de cirurgia, têm necrose avascular e geralmente não regeneram o tecido original.

[0005] Colágeno bovino e humano ganharam amplo uso como materiais injetáveis para aumento e enchimento de tecidos moles. O colágeno, a principal proteína estrutural extracelular do corpo do animal, tem sido utilizado como um material de implante para substituir ou aumentar o tecido conjuntivo, tal como a pele, tendão, cartilagem e osso. Além disso, o colágeno tem sido injetado ou implantado no corpo humano para fins cosméticos por uma série de anos. No entanto, a utilização de colágeno no aumento e/ou enchimento do tecido mole pode ser caro e não tem um efeito de longa duração, por exemplo, os resultados geralmente duram apenas cerca de 3 meses.

[0006] O ácido hialurônico (HA) é um glicosaminoglicano que se encontra naturalmente no corpo humano e é amplamente distribuído por todos tecidos conjuntivo, epitelial e neural. As composições de ácido hialurônico não reticulado tendem a degradar dentro de alguns meses após a injeção e, portanto, necessitam de reinjeção bastante frequente para manter seu efeito de aumento dos tecidos moles. Mais recentemente, as composições de ácido hialurônico reticulado têm sido utilizadas para o aumento de tecido mole. No entanto, tais composições reticuladas contêm partículas relativamente

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3/128 grandes, em torno de cerca de 2 mm cada, de ácido hialurônico em suspensão em um gel. Enquanto as partículas de maior dimensão podem ter um efeito mais duradouro, o tamanho de partícula maior pode tornar mais difícil a injeção e criar uma experiência desagradável para um recipiente.

[0007] Em resumo, as principais desvantagens das estratégias atuais para a regeneração reparação e/ou aumento de tecidos moles incluem uma grande quantidade de tecidos necessários para enxertia de grandes defeitos do tecido; morbidade do sítio doador, possibilidade de segundo sítio cirúrgico, necrose avascular; perda de forma e/ou tamanho dos suportes ao longo do tempo; incompatibilidade material com tecido nativo; e falha para regenerar tecido. Por conseguinte, existe uma forte necessidade de desenvolver uma estratégia ou uma estrutura de suporte que possa ser administrada com um procedimento minimamente invasivo e que irá proporcionar uma retenção prolongada de restauração de volume durante pelo menos 3 meses ou mais, por exemplo, durante pelo menos 6 meses ou pelo menos um ano, enquanto que o corpo gradualmente remodela e regenera o local em uma estrutura e função de tecido quase normal.

RESUMO

[0008] Formas de realização dos vários aspectos aqui descritos baseiam-se, pelo menos em parte, na engenharia dos suportes de fibroína de seda em um formato de injetáveis, por exemplo, partículas de fibroína de seda, que pode manter pelo menos uma porção do volume original no interior de um tecido a ser reparado ou aumentado por um período de tempo. Por exemplo, essas partículas de fibroína

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4/128 de seda podem ser colocadas com um procedimento minimamente invasivo (por exemplo, injeção) dentro do tecido de um indivíduo a ser reparado ou aumentado como um material de enchimento para substituir o espaço vazio, por exemplo, para o aumento ou reparação de tecido, ou como um suporte, por exemplo, para a regeneração ou reconstrução de tecidos.

[0009] Por conseguinte, um aspecto aqui fornecido é uma composição injetável para utilização na reparação ou aumento de um tecido em um indivíduo, que compreende uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, em que pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda mantêm, pelo menos, uma porção (por exemplo, pelo menos cerca de 50%) do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado por um período de tempo (por exemplo, pelo menos cerca de 6 semanas).

[0010] Um outro aspecto aqui fornecido refere-se a um método para reparar ou aumentar um tecido em um indivíduo. O método inclui a colocação no tecido a ser reparado ou aumentado de uma composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, em que pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda mantêm, pelo menos, uma parte do seu volume original (por exemplo, pelo menos, cerca de 50% ou mais) dentro do tecido durante um período de tempo (por exemplo, pelo menos, cerca de 6 semanas ou mais). Em uma forma de realização, a composição é colocada o tecido a ser reparado ou aumentado por injeção.

[0011] Em certas formas de realização das composições e métodos aqui fornecidos, as partículas de fibroína de seda podem excluir um peptídeo anfifílico. Em outras formas de realização, as partículas de fibroína de

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5/128 seda podem incluir um peptídeo anfifílico. Um peptídeo

anfifílico exemplar, por exemplo,	pode	compreender	uma
porção de RGD.
[0012] Em algumas formas	de	realização,	as
composições e métodos aqui fornecidos,	pelo menos,	uma

porção das partículas de fibroína de seda podem manter, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original, incluindo, pelo menos, cerca de 60%, pelo menos, cerca de 70%, pelo menos, cerca de 80% ou mais, do seu volume original no interior do tecido por um período de tempo.

[0013] Em algumas formas de realização da composição e método aqui proporcionados, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda podem manter, pelo menos, uma parte do seu volume original por, pelo menos, cerca de 6 semanas, pelo menos, cerca de 3 meses, pelo menos, cerca de 6 meses ou mais.

[0014] O volume de retenção das partículas de fibroína de seda pode ser, em parte, controlado pela modulação das propriedades de degradação e/ou de solubilidade das partículas de fibroína de seda. Em tais formas de realização, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 50% do seu volume original, por exemplo, incluindo não mais do que 30%, não mais do que 10%, do seu volume original, em, pelo menos, cerca de 6 semanas, incluindo, pelo menos, cerca de 3 meses, 6 meses ou mais.

[0015] Dependendo do tamanho do defeito do tecido e/ou propriedades desejadas das partículas de fibroína de seda, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para ser de qualquer tamanho. Em algumas formas de

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6/128 realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho adequado para injeção em um tecido. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda aqui fornecidas podem ter um tamanho de cerca de 500 nm a cerca de 5000 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 μη a cerca de 2000 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 10 μη a cerca de 1500 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 μη a cerca de 1000 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 μη a cerca de 500 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 3 μη a cerca de 425 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 500 μη a cerca de 1200 μη. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 800 μη a cerca de 1000 μη.

[0016] As partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para simular a morfologia estrutural de tecidos naturais e/ou para fornecer um agente ativo a um local de um tecido. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda podem ser porosas. Em algumas formas de realização, a porosidade das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para imitar a morfologia e/ou gradiente estrutural de densidades celulares encontradas no tecido nativo. Em algumas formas de realização, a porosidade das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para administrar um

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7/128 agente ativo a um tecido em um perfil de liberação prédeterminado. Em algumas formas de realização, a porosidade das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para manter, pelo menos, uma parte do seu volume original, durante um período de tempo. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda porosa pode ter uma porosidade de pelo menos cerca de 1%, por exemplo, incluindo pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de

90% ou superior. O tamanho dos poros de tais partículas de fibroína de seda porosa podem variar de cerca de 10 nm a cerca de 2000 pm, a partir de cerca de 50 nm a cerca de

1500 pm, a partir de cerca de 0, pm 5 a cerca de 1500 pm, a partir de cerca de 1 pm a cerca de 1000 pm, ou a partir de cerca 1 pm a cerca de 500 pm. Em algumas formas de realização, o tamanho dos poros das partículas de fibroína de seda porosa pode variar de cerca de 3 a cerca de 500 pm pm. Em algumas formas de realização, o tamanho dos poros das partículas de fibroína de seda porosa pode variar de cerca de 8 pm a cerca de 1000 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda não precisam ser porosas.

[0017] As partículas de fibroína de seda, na forma de realização, podem ser fabricadas por uma redução de fibroína de seda no estado sólido em partículas. Por exemplo, uma fibroína de seda no estado sólido pode ser reduzida em partículas por meios mecânicos, por exemplo, mas não limitado a, micronização, moagem, pulverização,

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8/128 esmagamento, trituração, corte e quaisquer combinações destes. Uma fibroína de seda no estado sólido pode ser feita por qualquer método conhecido na arte. Para produzir uma estrutura de fibroína de seda porosa, o método de lixiviação porogênico ou qualquer outro reconhecido na arte pode ser utilizado. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter propriedades óticas, por exemplo, mas não limitado a, de difração. Em tais formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser produzidas a partir de uma fibroína de seda no estado sólido sem quaisquer elementos óticos impressos em ou adicionados a esta.

[0018] A composição injetável aqui descrita compreendendo as partículas de fibroína de seda podem ainda compreender, pelo menos, um agente ativo. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda da composição aqui descrita podem ainda compreender, pelo menos, um agente ativo. Exemplos não limitativos de agentes ativos podem incluir agentes biologicamente ativos, agentes cosmeticamente ativos, agentes de ligação de células, um material de enchimento dérmico e quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser um agente terapêutico. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser um agente cosmeticamente ativo. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser um material de enchimento dérmico.

[0019] Em algumas formas de realização, a composição injetável ou a composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda pode ainda compreender, pelo menos, uma célula, por exemplo, uma

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9/128 célula-tronco. Em algumas formas de realização, a célula pode ser obtida a partir de um fluido ou concentrado biológico, tal como lipoaspirado, aspirado de medula óssea ou quaisquer combinações dos mesmos.

[0020] Assim, em algumas formas de realização, a composição injetável ou a composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda pode ainda compreender um fluido ou concentrado biológico, tal como lipoaspirado, aspirado de medula óssea ou quaisquer combinações dos mesmos. Em uma forma de realização, a composição injetável ou a composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda pode ainda compreender um lipoaspirado. Nestas formas de realização, a composição ou a composição injetável pode compreender partículas de fibroína de seda e um fluido ou concentrado biológico (por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea) em uma proporção em volume de cerca de 1:38 a cerca de 10:19, ou cerca de 1:19 a cerca de 10:19, ou cerca de 2:19 a cerca de 08:19. Em uma forma de realização, a composição ou a composição injetável pode compreender partículas de fibroína de seda e um fluido ou concentrado biológico (por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea) em uma proporção em volume de cerca de 03:19. Em uma outra forma de realização, a composição ou a composição injetável pode compreender partículas de fibroína de seda e um fluido ou concentrado biológico (por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea) em uma proporção em volume de cerca de 6:19.

[0021] Em algumas formas de realização, a composição aqui descrita pode ainda compreender um hidrogel,

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10/128 por exemplo, na forma de partículas de hidrogel distintas, e/ou distribuídas dentro das partículas de fibroína de seda.

[0022] Diversas formas de realização da composição aqui descrita podem ser administradas em um tecido a ser reparado ou aumentado por quaisquer métodos conhecidos na arte, por exemplo, por via subcutânea, por via submuscular, ou por via intramuscular. Quando injetadas em um tecido, algumas formas de realização da composição podem ser, pelo menos, parcialmente secas. Alternativamente, a composição pode ser, pelo menos, parcialmente hidratada, por exemplo, a composição pode ainda compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma solução tamponada, quando injetada em um tecido. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda na composição são suficientemente pequenas de modo a que as partículas de fibroína de seda podem ser entregues através de uma agulha ou um cateter sem qualquer compressão prévia, antes de ser introduzida em um tecido a ser reparado ou aumentado.

[0023] O tecido a ser reparado ou aumentado pela composição e/ou o método aqui descrito pode ser um tecido mole. Exemplos ilustrativos de um tecido mole incluem, mas não estão limitados a, um tendão, um ligamento, pele, tecido da mama, tecido fibroso, um tecido conjuntivo, músculo e quaisquer combinações destes. Em certas formas de realização, o tecido mole é a pele. Em outras formas de realização, o tecido mole é um tecido mamário.

[0024] Um dispositivo de entrega que compreende uma forma de realização de uma composição injetável e/ou partículas de fibroína de seda também é aqui fornecido. Um

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11/128 dispositivo de entrega pode incluir qualquer dispositivo de injeção convencional (por exemplo, uma seringa) e/ou qualquer dispositivo de entrega que é minimamente invasivo. Por conseguinte, em algumas formas de realização, são fornecidas neste documento uma forma de realização referente a seringas, compreendendo de uma composição injetável. A seringa pode ainda compreender uma agulha, uma cânula, e/ou um cateter. Em algumas formas de realização, o dispositivo de entrega (por exemplo, uma seringa) pode ainda compreender um transportador injetável, por exemplo, uma solução tamponada. Em algumas formas de realização, o dispositivo de entrega (por exemplo, uma seringa) pode compreender ainda um anestésico local.

[0025] Em algumas formas de realização de todos os aspectos aqui descritos, as composições e/ou dispositivos de entrega podem ser armazenados ou transportados, a uma temperatura de cerca de 0°C e cerca de 60°C, por exemplo, entre cerca de 10°C e cerca de 60°C ou entre cerca de 15°C e cerca de 60°C. Em tais temperaturas, a bioatividade dos agentes ativos incorporados ou distribuídos no interior das partículas de fibroína de seda pode ser estabilizada por um período de tempo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0026] A FIGURA 1 mostra um método exemplar de utilização de uma ou mais formas de realização das composições injetáveis descritas neste documento. Os pedaços de suporte de fibroína de seda porosa (por exemplo, formados por redução de fibroína de seda porosa no estado sólido em partículas ou pedaços) podem ser misturados com lipoaspirado como veículo, opcionalmente contendo célulasPetição 870200016497, de 03/02/2020, pág. 23/144

12/128 tronco derivadas de tecido adiposo (ASCs), para formar uma composição injetável exemplar. As composições injetáveis podem então ser injetadas em um indivíduo, por exemplo, um modelo animal.

[0027] A FIGURA 2 mostra imagens de uma ou mais formas de realização das composições injetáveis descritas neste documento. As partículas de suporte de fibroína de seda podem ser de qualquer tamanho, por exemplo, a partir de submicra a cerca de 2 mm. O painel esquerdo mostra que as partículas de suporte de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 3 pm a cerca de 425 pm, enquanto que o painel direito mostra que as partículas de suporte de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 0,8 mm a cerca de 1 mm.

[0028] A FIGURA 3 mostra um conjunto de imagens de hematoxilina e eosina de partículas porosas de fibroína de seda injetáveis misturadas com várias proporções de lipoaspirado a 6 semanas pós-injeção. As partículas porosas de fibroína de seda (com um tamanho de poro de cerca de 3 pm a cerca de 500 pm), como mostrado na primeira linha das imagens, foram obtidas pela micronização de um suporte de fibroína de seda porosa com um tamanho de poro de cerca de 300 pm a cerca de 500 pm, enquanto que os mostrados nas segunda e terceira linhas das imagens (partículas de fibroína de seda com um tamanho de poro de cerca de 8 pm a cerca de 1000 pm) foram produzidas a partir de um suporte de fibroína de seda com um tamanho de poro de cerca de 850 pm a cerca de 1000 pm. O termo dose, como utilizado na FIGURA 3, refere-se à quantidade de partículas de fibroína de seda injetada em um indivíduo, por exemplo, um modelo

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13/128 animal. Em algumas formas de realização, a dose pode ser indicada pela proporção em volume final de partículas de fibroína de seda para lipoaspirado. Por exemplo, as proporções de volume finais podem variar desde cerca de 3:19 até cerca de 6:19.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] Aqui descritos estão métodos, composições, dispositivos de entrega, e kits para reparar ou aumentar um tecido em um indivíduo. De acordo com formas de realização dos vários aspectos aqui descritos, um formato injetável de suportes de fibroína de seda (por exemplo, partículas de fibroína de seda) pode ser colocado (por exemplo, por injeção) em um tecido a ser reparado ou aumentado e manter, pelo menos, uma porção do seu volume original (por exemplo, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original) dentro do tecido a ser reparado ou aumentado por um período de tempo (por exemplo, pelo menos, cerca de 6 semanas). Tais partículas de fibroína de seda injetáveis podem ser introduzidas em um local de defeito com um procedimento minimamente invasivo, ao mesmo tempo que permite um perito na arte de moldar de forma flexível aspartículas de fibroína de seda injetáveis para se encaixar em um defeito de qualquer forma e/ou tamanho.

Partículas de fibroína de seda

[0030] As partículas de fibroína de seda aqui descritas podem manter seu volume original após a administração a um tecido (por exemplo, por injeção) para ser reparado ou aumentado por um período de tempo.

[0031] Por volume original, em referência às partículas de fibroína de seda aqui descritas, é geralmente

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14/128 significado o volume de partículas de fibroína de seda, conforme medido imediatamente antes de as partículas de fibroína de seda serem colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado, ou o correspondente aumento no volume de tecido como medido imediatamente após as partículas de fibroína de seda serem colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado. Por exemplo, o volume original de partículas de fibroína de seda pode ser medido, por exemplo, dentro de cerca de 20 minutos, antes ou depois de as partículas de fibroína de seda serem colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado. Em alguns casos, o volume inicial das partículas de fibroína de seda pode ser medido, por exemplo, cerca de 10 segundos, cerca de 15 segundos, cerca de 20 segundos, cerca de 25 segundos, cerca

de 30 segundos	, cerca de 1	minuto, 2	minutos, cerca	de	3
minutos, cerca	de	4 minutos,	cerca de 5	minutos, cerca	de	6
minutos, cerca	de	7 minutos,	cerca de 8	minutos, cerca	de	9
minutos, cerca	de	10 minutos	, cerca de	11 minutos, cerca	de
12 minutos, cerca	de 13 minutos, cerca	de 14 minutos,	cerca

de 15 minutos, cerca de 16 minutos, cerca de 17 minutos, cerca de 18 minutos, cerca de 19 minutos ou cerca de 20 minutos, antes ou depois de as partículas de fibroína de seda serem colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado. Em algumas formas de realização, o volume das partículas de fibroína de seda, antes de colocar em um tecido, pode referir-se ao volume das partículas de fibroína de seda no estado seco. Em formas de realização alternativas, o volume das partículas de fibroína de seda, antes de colocar em um tecido, pode referir-se ao volume de partículas de fibroína de seda no estado hidratado. Em

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15/128 outras formas de realização, o volume das partículas de fibroína de seda, antes de colocar em um tecido, pode referir-se ao volume de partículas de fibroína de seda em suspensão em um líquido ou um veículo. Em algumas formas de realização, o volume das partículas de fibroína de seda, antes de colocar em um tecido, pode referir-se ao volume de injeção da mistura que compreende as partículas de fibroína de seda.

[0032] Tal como aqui utilizado, o termo manter refere-se a manter o volume (por exemplo, o tamanho e/ou forma) de, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda aqui descritas ao longo de um período de tempo. Em algumas formas de realização, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter, durante um período de tempo, pelo menos, cerca de 20% do seu volume original, incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% do seu volume original ou superior. Em algumas formas de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda podem manter durante um período de tempo de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20% do seu volume original ou superior. Em algumas formas de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter 100% do seu volume original, por exemplo, não há alterações detectáveis no volume dentro do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção

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16/128 das partículas de fibroína de seda podem manter, pelo menos, cerca de 1% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter, pelo menos, cerca de 60% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter, pelo menos, cerca de 70% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter, pelo menos, cerca de 80% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. O volume das partículas de fibroína de seda colocadas em um tecido pode ser determinado ou indicado por uma mudança em, pelo menos, uma das propriedades do tecido, por exemplo, o volume de tecido, a elasticidade do tecido e/ou dureza do tecido. Em algumas formas de realização, o volume das partículas de fibroína de seda colocadas em um tecido pode ser determinado a partir de explantes, por exemplo, as medições de peso e/ou de deslocamento de volume. Em uma forma de realização, o volume das partículas de fibroína de seda colocadas em um tecido pode ser monitorado e/ou medido por geração de imagem.

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[0033] As partículas de fibroína de seda podem manter, pelo menos, uma parte do seu volume original, por qualquer período de tempo, por exemplo, semanas, meses ou anos. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem manter, por exemplo, pelo menos cerca de 50% do seu volume original (incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, ou mais, do seu volume original), durante, pelo menos, cerca de 6 semanas, pelo menos cerca de 7 semanas, pelo menos cerca de 8 semanas, pelo menos

cerca	de	3	meses,	pelo	menos	cerca	de	4	meses,	pelo	menos
cerca	de	5	meses,	pelo	menos	cerca	de	6	meses,	pelo	menos
cerca	de	7	meses,	pelo	menos	cerca	de	8	meses,	pelo	menos
cerca	de	9	meses,	pelo	menos cerca	de	10	meses,	pelo	menos
cerca	de	11	meses	, pelo menos	cerca de 1	ano,	pelo menos,
cerca	de	2	anos,	pelo	menos 3	anos	, pelo	menos	cerca	de 4
anos,	pelo	menos	5 anos ou	mais	. Em	certas	formas de

realização, as partículas de fibroína de seda podem manter, por exemplo, pelo menos cerca de 70% do seu volume original, ou mais, durante, pelo menos, cerca de 3 meses ou mais. Em outras formas de realização, pode não haver mudanças significativas no volume das partículas de fibroína de seda após colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado por, pelo menos, cerca de 3 meses ou mais. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem manter, por exemplo, pelo menos cerca de 70% do seu volume original, ou mais, durante, pelo menos, cerca de 6 meses ou mais (incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses ou mais). Em outras formas de realização, pode não haver

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18/128 mudanças significativas no volume das partículas de fibroína de seda após colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado por, pelo menos, cerca de 6 meses ou mais. Em determinadas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem manter, pelo menos, cerca de 20% do seu volume original ou mais durante, pelo menos, cerca de 1 ano ou mais (incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 2 anos, pelo menos, cerca de 3 anos, pelo menos, cerca de 4 anos, pelo menos, cerca de 5 anos ou mais). Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem manter, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original ou mais durante, pelo menos, cerca de 1 ano ou mais (incluindo, por exemplo, pelo menos, cerca de 2 anos, pelo menos cerca de 3 anos, pelo menos cerca de 4 anos, pelo menos cerca de 5 anos ou mais). Em uma forma de realização, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda pode manter, pelo menos, cerca de 1%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40% do seu volume original, ou mais, no interior do tecido a ser reparado ou aumentado por, pelo menos, cerca de 6 semanas (incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 6 meses, ou mais).

[0034] O volume de retenção das partículas de fibroína de seda também pode ser caracterizado por, por exemplo, degradação das partículas de fibroína de seda. Geralmente, quanto mais lentamente as partículas de fibroína de seda degradarem, por mais tempo as partículas de fibroína de seda podem manter seu volume original em um

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19/128 tecido. Consequentemente, algumas formas de realização aqui proporcionadas são dirigidas às composições injetáveis para utilização na reparação ou aumento de um tecido em um indivíduo, as composições compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, em que pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda são adaptadas para se degradar no tecido a ser reparado ou aumentado ao longo de um período de tempo.

[0035] Tal como utilizado em referência às partículas de fibroína de seda aqui descritas, o termo degradar ou degradação refere-se a uma diminuição do volume ou tamanho das partículas de fibroína de seda. A degradação das partículas de fibroína de seda pode ocorrer por meio de clivagem das partículas de fibroína de seda em fragmentos menores e/ou dissolução das partículas de fibroína de seda ou seus fragmentos. Em algumas formas de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 80% do seu volume original, incluindo, por exemplo, não mais do que 70%, não mais do que 60%, não mais do que

50%, não mais do que 40%, não mais do que 30%, não mais do que 20%, não mais do que 10% do seu volume original ou menos. Em algumas formas de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode exibir qualquer degradação significativa (por exemplo, não há alterações detectáveis em volume) no interior do tecido a ser reparado ou aumentado. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 50% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou

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20/128 aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 40% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 30% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 20% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo. Em uma forma de realização, pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda pode ser adaptada para degradar não mais do que 10% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado, por um período de tempo.

[0036] As partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para se degradar, em qualquer taxa. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para degradar, pelo menos, uma parte do seu volume original, durante um período de tempo, por exemplo, semanas, meses, ou anos. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para se degradar, por exemplo, não mais do que 50% do seu volume original (incluindo, por exemplo, não mais do que 40%, não mais do que 30%, não mais do que 20% ou menos, do seu volume original) por, pelo menos, cerca de 6 semanas, pelo menos cerca de 7 semanas, pelo menos cerca de 8

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semanas, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos	cerca	de	4
meses, pelo menos cerca de 5 meses, pelo menos	cerca	de	6
meses, pelo menos cerca 7 meses, pelo menos	cerca	de	8
meses, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos	cerca	de	10
meses, pelo menos cerca de 11 meses, pelo menos	cerca	de	1
ano, pelo menos cerca de 2 anos, pelo menos cerca de 3	anos

pelo menos cerca de 4 anos, pelo menos cerca de 5 anos ou mais. Em certas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para se degradar, por exemplo, não mais do que 30% do seu volume original ou menos, por, pelo menos, cerca de 3 meses ou mais. Em outras formas de realização, pode não haver qualquer degradação significativa (ou seja, não há alterações detectáveis no volume das partículas de fibroína de seda), após colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado por, pelo menos, cerca de 3 meses ou mais. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para se degradar, por exemplo, não mais do que 30% do seu volume original ou menos, em pelo menos cerca de 6 meses ou mais (incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 9 meses, pelo menos cerca a 12 meses, pelo menos cerca de 18 meses ou mais tempo). Em outras formas de realização, não pode haver degradação significativa (ou seja, não há alterações detectáveis no volume das partículas de fibroína de seda), após colocadas em um tecido a ser reparado ou aumentado por, pelo menos, cerca de 6 meses ou mais. Em formas de realização particulares, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para degradar não mais do que 80% do seu volume original ou menos em, pelo menos, cerca de 1 ano ou mais (incluindo, por exemplo, pelo menos cerca de 2 anos,

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22/128 pelo menos, cerca de 3 anos, pelo menos cerca de 4 anos, pelo menos cerca de 5 anos ou mais). Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para degradar não mais do que 50% do seu volume original ou menos em, pelo menos, cerca de 1 ano ou mais.

[0037] A mesma ou semelhante formulação das partículas de fibroína de seda ou composições injetáveis podem manifestar respostas diferentes em um indivíduo. A título de exemplo apenas, o volume de retenção ou a taxa de degradação das partículas de fibroína de seda em um tecido pode variar de um indivíduo para outro, por exemplo, por causa dos diferentes microambientes do tecido, tais como espécies e/ou níveis de várias proteínas ou enzimas (por exemplo, enzimas proteolíticas) presentes no tecido.

[0038] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para manter uma taxa constante de retenção de volume e/ou taxa de degradação ao longo de um período de tempo. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser adaptadas para ter uma taxa de retenção de volume ou taxa de degradação variando com o tempo. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda podem ser revestidas com um material polimérico, por exemplo, fibroína de seda de uma concentração diferente operação e/ou um polímero biodegradável e biocompatível diferente. Tal revestimento pode possuir uma função diferente e/ou uma taxa de degradação diferente do núcleo da partícula de fibroína de seda. A título de exemplo apenas, o revestimento da partícula de fibroína de seda pode conter, pelo menos, um agente ativo e ser adaptado para degradar a uma velocidade

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23/128 diferente (por exemplo, a uma taxa mais rápida) do que o núcleo da partícula de fibroína de seda. Assim, após a colocação das partículas de fibroína de seda em um tecido, o revestimento das partículas de fibroína de seda pode ser adaptado para se degradar mais rapidamente, por exemplo, para liberar o agente ativo para aliviar a dor e/ou para promover a cicatrização de feridas, enquanto o núcleo das partículas de fibroína de seda pode manter o seu volume por um longo período de tempo.

[0039] A fibroína de seda é um biopolímero candidato particularmente atrativo para ser utilizado em várias formas de realização aqui descritas, por exemplo, devido ao seu processamento versátil, por exemplo, todo processamento aquoso (Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater.

Res. 139 (2001), Perry et al., 20 Adv. Mater. 3070-72 (2008)), funcionalização relativamente fácil (Murphy et al., 29 Biomat. 2829-38 (2008)) e biocompatibilidade (Santin et al., 46 J. Biomed. Mater. Res. 382-9 (1999 )). Por exemplo, a seda foi aprovada pela U.S. Food and Drug Administration (FDA - Administração de Alimentos e Fármacos do EUA) como um suporte de engenharia de tecidos em implantes humanos.

Ver Altman et al., 24 Biomaterials: 401 (2003).

[0040] Tal como aqui utilizado, o termo fibroína de seda inclui fibroína de bicho da seda e de inseto ou de proteína de seda de aranha. Ver, por exemplo, Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958). Qualquer tipo de fibroína de seda pode ser utilizado em diferentes formas de realização aqui descritas. Fibroína de seda produzida por bichos, como Bombyx mori, é a mais comum e representa um recurso renovável ecologicamente correto. Por exemplo, a

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24/128 fibroína de seda utilizada em uma película de seda pode ser alcançada através da extração de sericina dos casulos de B.

mori. Casulos de bicho da seda orgânicos também estão disponíveis comercialmente. Existem muitas sedas diferentes, no entanto, incluindo seda de aranha (por exemplo, obtidas a partir de Nephila clavipes), sedas transgênicas, sedas manipuladas geneticamente, tais como sedas de bactérias, leveduras, células de mamíferos, animais transgênicos ou plantas transgênicas (ver, por exemplo, WO 97/08315; Patente dos EUA N- 5.245.012) e as suas variantes, que podem ser utilizadas.

[0041] Em várias formas de realização, a fibroína de seda pode ser modificada para as diferentes aplicações e/ou propriedades mecânicas ou químicas desejadas (por exemplo, para facilitar a formação de um gradiente de agente ativo em partículas de fibroína de seda). Um perito na arte pode selecionar métodos apropriados para modificar a fibroína de seda, por exemplo, dependendo dos grupos laterais da fibroína seda, reatividade desejada da fibroína de seda e/ou densidade de carga desejada sobre a fibroína de seda. Em uma forma de realização, a modificação de fibroína de seda pode utilizar a química do aminoácido da cadeia lateral, tal como as modificações químicas através de ligação covalente ou modificações por meio de interação carga-carga. Métodos de modificação química exemplares incluem, mas não estão limitados a, reação de acoplamento de carbodiimida (ver, por exemplo, Pedido de Patente EUA N_ US 2007/0212730), reação de acoplamento de diazônio (ver, por exemplo, Pedido de Patente EUA N_ US 2009/0232963), interação avidina-biotina (ver, por exemplo, Pedido de

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25/128 patente internacional N°: WO 2011/011347) e peguilação de derivados quimicamente ativos ou ativados do polímero PEG (ver, por exemplo, Pedido Internacional N- WO 2010/057142).

A fibroína de seda pode também ser modificada através da modificação do gene para alterar funcionalidades da proteína da seda (ver, por exemplo, o Pedido de Patente Internacional WO 2011/006133). Por exemplo, a fibroína de seda pode ser geneticamente modificada, o que pode fornecer para uma nova modificação da seda, tal como a inclusão de um polipeptídeo de fusão compreendendo um domínio de proteína fibrosa e um domínio de mineralização, o qual pode ser utilizado para formar um compósito orgânico-inorgânico. Veja-se WO 2006/076711. Além disso, a matriz de fibroína de seda pode ser combinada com um produto químico, tal como o glicerol, que, por exemplo, atinge a flexibilidade da matriz. Ver, por exemplo, WO 2010/042798, Modified Silk films Containing Glycerol (Filmes de Seda Modificados Contendo Glicerol).

[0042] Tal como aqui utilizada, a frase partículas de fibroína de seda geralmente se referem a partículas que

compreendem	fibroína	de	seda. Em	algumas	formas de
realização,	a frase	partículas de	fibroína	de seda
refere-se a	partículas	de	fibroína de	seda que	constituem,
pelo menos,	cerca de	30%	da composição total,	incluindo,
pelo menos,	cerca de	40%,	pelo menos	cerca de	50%, pelo
menos cerca	de 60%, pelo	menos cerca	de 70%,	pelo menos

cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95% ou mais, da composição total. Em certas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser substancialmente formadas a partir de fibroína de seda. Em

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26/128 várias formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser substancialmente formadas a partir de fibroína de seda compreendendo, pelo menos, um agente ativo.

[0043] As partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser adaptadas para serem de qualquer forma, por exemplo, uma forma esférica, forma poligonal, forma de elipse. Tal como utilizado em referência a partículas de fibroína de seda, o termo partícula, conforme aqui utilizado, refere-se a uma partícula de qualquer forma, por exemplo, mas não limitado a, uma forma esférica, uma forma poligonal ou uma forma elíptica. O tamanho de partícula pode variar de acordo com um certo número de fatores, incluindo, sem limitações, o tamanho do tecido a ser reparado ou aumentado e/ou propriedades desejadas das partículas de fibroína de seda, por exemplo, o volume de retenção ou perfil de degradação. Em algumas formas de realização, o tamanho de partícula pode variar de cerca de 500 nm a cerca de 5000 pm, de cerca de 1 pm a cerca de 2000 pm, de cerca de 10 pm a cerca de 1500 pm, de cerca de 20 pm a cerca de 1000 pm, de cerca de 50 pm a cerca de 750 pm ou de cerca de 100 pm para cerca de 500 pm. Em certas formas de realização, as partículas de fibroína de seda aqui fornecidas podem ter um tamanho de cerca de 500 nm a cerca de 5000 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 pm a cerca de 2000 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 10 pm a cerca de 1500 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 pm a cerca de 1000 pm. Em algumas

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27/128 formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 pm a cerca de 500 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 3 pm a cerca de 425 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 500 pm a cerca de 1200 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 800 pm a cerca de 1200 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1 pm a cerca de 5 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 5 pm a cerca de 20 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 20 pm a cerca de 50 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 50 pm a cerca de 100 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 100 pm a cerca de 250 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 500 pm a cerca de 750 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 750 pm a cerca de 1000 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho de cerca de 1000 pm a cerca de 1200 pm.

Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho inferior a 1 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser inerentemente muito pequenas que podem ser

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28/128 entregues por meio de uma agulha e/ou de um cateter sem qualquer compressão prévia. Em tais formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ter um tamanho menor do que o diâmetro interno de uma agulha e/ou de um cateter de modo a que as partículas de fibroína de seda não necessitam de compressão prévia antes de injeção no tecido por meio de uma agulha e/ou de um cateter.

[0044] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem apresentar uma distribuição de tamanhos de partículas em todo o tamanho indicado. Em tais formas de realização, o termo tamanho de partícula conforme aqui utilizado refere-se ao modo de distribuição do tamanho de partículas de fibroína de seda, ou seja, o valor que ocorre com mais frequência na distribuição de tamanho. Os métodos para medição do tamanho de partículas são conhecidos por um perito na arte, por exemplo, por dispersão de luz dinâmica (tais como espectroscopia de fotocorrelação, difração de laser, espalhamento de luz laser de baixo ângulo (LALLS), e espalhamento de luz laser de ângulo médio (MALLS)), métodos de obscurecimento da luz (como o método de análise de Coulter), ou outras técnicas (tais como a reologia e microscopia de luz ou eletrônica).

[0045] As partículas de fibroína de seda podem ser produzidas a partir de soluções de fibroína de seda de base aquosa ou à base de solventes orgânicos. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda produzidas a partir de uma solução de fibroína de seda à base de solvente orgânico pode manter o seu volume inicial por um período de tempo maior do que as partículas de fibroína de

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29/128 seda de base aquosa. A solução de fibroína de seda de base aquosa ou de solvente orgânico utilizada para a preparação de partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser preparadas utilizando quaisquer técnicas conhecidas na arte. A concentração de fibroína de seda em soluções utilizadas para a reparação ou aumento de tecidos moles pode ser adaptada para o especial requisito de retenção de volume, por exemplo, se concentrações mais elevadas de soluções de fibroína de seda podem ser utilizadas quando tempo mais longo de retenção do volume das partículas de fibroína de seda é desejado quando injetadas no tecido a ser reparado ou aumentado. Em algumas formas de realização, a solução de fibroína de seda para fazer as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem variar entre cerca de 4% (p/v) a cerca de 30% (p/v), inclusive, ou cerca de 4% (p/v) a cerca

20% (p/v), inclusive. Em algumas formas de realização, a solução de fibroína de seda pode variar desde cerca de 6% (p/v) a cerca de 20% (p/v). Em algumas formas de realização, a solução de fibroína de seda pode variar desde cerca de 6% (p/v) a cerca de 17% (p/v). Os processos adequados para a preparação de solução de fibroína de seda são descritos, por exemplo, na Patente EUA N°: US 7635755; e Pedidos

Internacionais N°E: WO/2005/012606 e WO/2008/127401. Um passo de microfiltração pode ser aqui utilizado. Por exemplo, a solução de fibroína de seda preparada pode ser ainda processada, por exemplo, por centrifugação e/ou microfiltração a base de seringa antes de outros processamentos adicionais nas partículas de fibroína de seda aqui descritas.

[0046] Em algumas formas de realização, a fibroína

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30/128 de seda pode ser também misturada com outros polímeros biocompatíveis e/ou biodegradáveis para formar partículas de polímero misturados que compreendem fibroína de seda. Um ou mais polímeros biocompatíveis e/ou biodegradáveis, (por exemplo, dois ou mais polímeros biocompatíveis) podem ser adicionados à solução de fibroína de seda. O polímero biocompatível que pode ser aqui utilizados inclui, mas não está limitado a, óxido de polietileno (PEO), polietilenoglicol (PEG), colágeno, fibronectina, queratina, ácido aspártico, polilisina, alginato, quitosano, quitina, ácido hialurônico, pectina, policaprolactona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, poli-hidroxialcanoatos, dextranos, polianidridos, polímero, PLA-PGA, polianidrido, poliortoéster, policaprolactona, polifumarato, colágeno, quitosano, alginato, ácido hialurônico e outros polímeros biocompatíveis e/de biodegradáveis. Veja-se, por exemplo, os Pedidos Internacionais N°B: WO 04/062697, WO 05/012606.

[0047] Em algumas formas de realização, pelo menos um agente ativo aqui descrito pode ser adicionado à solução de fibroína de seda antes de processamento adicional das partículas de fibroína de seda aqui descritas. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser disperso homogeneamente ou heterogeneamente no interior da fibroína de seda, disperso em um gradiente, por exemplo, utilizando o método de modificação mediado por carbodiimida descrito no Pedido de Patente dos EUA N- US 2007/0212730.

[0048] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser formadas primeiro e depois postas em contato com (por exemplo, mergulhadas em), pelo menos, um agente ativo de tal modo que a

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31/128 superfície livre das partículas possa ser revestida com, pelo menos, um agente ativo.

[0049] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser reduzidas a partir de um de fibroína de seda no estado sólido, através de meios mecânicos. Meios mecânicos exemplares para a obtenção de partículas de fibroína de seda incluem micronização, moagem, pulverização, esmagamento, trituração, liofilização ou qualquer combinação destes. Métodos de formar um fibroína de seda no estado sólido a partir de uma solução de fibroína de seda são bem conhecidos para um perito na arte, por exemplo, utilizando uma solução de fibroína de seda de base aquosa ou à base de solvente. Veja-se, por exemplo, Wang Y. et al. (2008) 29 Biomaterials 3415, Patente dos EUA N°: US

7.635.755; e Pedidos Internacionais N°t: WO/2005/012606 e

WO/2008/127401.

[0050] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem compreender estruturas porosas, por exemplo, para imitar a morfologia estrutural de um tecido original, para modular a taxa de degradação/taxa de retenção de volume das partículas de fibroína de seda, e/ou para modular o perfil de liberação de um agente ativo embebido no material, se algum. Tal como aqui utilizados, os termos porosos e porosidade são geralmente utilizados para descrever uma estrutura que tem uma rede ligada de poros ou espaços vazios (que pode ser, por exemplo, aberturas, espaços intersticiais ou outros canais) em todo o seu volume. O termo porosidade é uma medida de espaços vazios no

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32/128 material, e uma fração de volume de espaços vazios sobre o

volume	total, em	percentagem,	entre 0	e 100% (ou entre	0 e
1).
	[0051] Em	algumas	formas	de realização,	as
partículas de	fibroína de	seda	porosas podem	ser

configuradas para ter qualquer porosidade, dependendo das propriedades desejadas. Por exemplo, em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda porosas podem ter uma porosidade de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais alto. Em algumas formas de realização, a porosidade pode variar de cerca de 50% a cerca de 99%, de cerca de 70% a cerca de 99%, ou de cerca de 80% a cerca de 98%. O tamanho dos poros e os valores de porosidade total podem ser quantificados utilizando métodos convencionais e modelos conhecidos por peritos na arte. Por exemplo, o tamanho dos poros e a porosidade podem ser medidos por técnicas padronizadas, tais como porosimetria de mercúrio e adsorção de nitrogênio. Um perito na arte pode determinar a porosidade ótima das partículas de fibroína de seda utilizadas para várias finalidades. Por exemplo, o tamanho da porosidade e/ou dos poros das partículas de fibroína de seda podem ser otimizados com base na taxa de degradação ou taxa de retenção de volume desejada das partículas de fibroína de seda, perfis de liberação de um agente ativo das partículas de fibroína de seda, e/ou a morfologia

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33/128 estrutural do tecido a ser reparado ou aumentado.

[0052] Os poros podem ser adaptados para terem qualquer forma, por exemplo, circular, elíptica ou poligonal. As partículas de fibroína de seda porosas podem ser adaptadas para terem um tamanho de poro de cerca de 10 nm a cerca de 2000 pm, a partir de cerca de 50 nm a cerca de 1500 pm, a partir de cerca de 0,5 pm a cerca de 1500 pm, a partir de cerca de 1 pm a cerca de 1500 pm, a partir de cerca 2 pm a cerca de 1500 pm, a partir de cerca de 1 pm a cerca de 1000 pm, a partir de cerca de 3 pm a 1000 pm, a partir de cerca de 1 pm a cerca de 500 pm ou a partir de cerca de 3 pm a cerca de 500 pm. Em algumas formas de realização, o tamanho dos poros das partículas de fibroína de seda porosas pode variar de cerca de 3 pm a cerca de 500 pm. Em algumas formas de realização, o tamanho dos poros das partículas de fibroína de seda porosas pode variar de cerca de 8 pm a cerca de 1000 pm. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda não precisam de ser porosas. Em tais formas de realização, o tamanho dos poros das partículas de fibroína de seda pode ser inferior a 10 nm, ou não-detectável. O termo tamanho de poro, tal como aqui utilizado refere-se a uma dimensão de poro. Em algumas formas de realização, o tamanho de poro pode referir-se à dimensão mais comprida de um poro, por exemplo, um diâmetro do poro que tem uma seção transversal circular, ou o comprimento da corda da seção transversal mais longa que pode ser construída através de um poro tendo uma seção transversal não circular. Em outras formas de realização, o tamanho de poro pode referir-se à dimensão mais curta do poro.

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[0053] Os métodos para a geração de estruturas porosas dentro da matriz de fibroína de seda, por exemplo,

liofilização,	lixiviação de sal e métodos de formação	de
espuma de gás,	são bem conhecidos na	arte	e foram descritos
em, por exemplo, Patente dos EUA	No	EUA 7.842.780;	e
Pedidos de Patente dos EUA N°r:	US 2	010/0279112 e	US
2010/0279112,	cujos conteúdos são	aqui	incorporados	por
referência na	sua totalidade.
[0054]	Em algumas formas	de	realização,	as

partículas de fibroína de seda porosos podem ser produzidas por um método de lixiviação porogênico (por exemplo, o método de lixiviação de sal). Ver, por exemplo, US 7842780 e US 2010/0279112. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda porosas podem ser reduzidas de uma fibroína de seda porosa no estado sólido por meios mecânicos, como discutido anteriormente. A título de exemplo apenas, a solução de fibroína de seda pode ser colocada dentro de um recipiente antiaderente (por exemplo, um recipiente revestido com Teflon) contendo partículas solúveis em água, ou porogênios que são insolúveis em solventes orgânicos. Alternativamente, os porogênios podem ser misturados com a solução de fibroína de seda antes da colocação no recipiente. O diâmetro das partículas (porogênios) pode variar de acordo com o tamanho dos poros pré-determinado. Exemplos de porogênios solúveis em água que podem ser utilizados na presente invenção incluem, NaCl, metais alcalinos, haletos de metais de alcalinos terrosos, fosfatos e sulfatos, cristais de açúcar, microesferas solúveis em água, polissacarídeos e microesferas de proteína. A matriz de fibroína de seda seca pode então ser

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35/128 imersa em água ou outro solvente em que as partículas, ou porogênios sejam solúveis mas a fibroína de seda seja insolúvel, para remover as partículas (porogênios), resultando em um fibroína de seda porosa no estado sólido aqui descrita. A fibroína de seda porosa no estado sólido pode então ser reduzida às partículas de fibroína de seda porosas aqui descritas, por exemplo, por meios mecânicos, tais como micronização, moagem, pulverização, esmagamento, trituração, liofilização ou qualquer combinação dos mesmos.

[0055] Utilizando um método de lixiviação porogênico (por exemplo, o método de lixiviação de sal), as partículas de fibroína de seda podem ser criadas por, por exemplo, mas não limitado a, uma micronização da fibroína de seda no estado sólido com poros correspondente a um tamanho de porogênio que varia a partir de, por exemplo, de cerca de 300 pm a cerca de 500 pm e/ou de cerca de 850 pm a cerca de 1000 pm. Em algumas formas de realização, o intervalo de tamanho de poro não necessita ser afetado por um processo de micronização. Dependendo de como a fibroína de seda no estado sólido é cortada (ou micronizada), as partículas resultantes de fibroína de seda podem ter um tamanho de poro correspondente a qualquer porção do intervalo de tamanho do porogênio. Em algumas formas de realização, os poros das partículas de fibroína de seda não precisam ser poros intactos (por exemplo, possuindo um tamanho de poro para ser uma parte da faixa de tamanho do porogênio, por exemplo, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos

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36/128 cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou mais alto, do intervalo de tamanho do porogênio). Em algumas formas de realização, os poros das partículas de fibroína de seda podem ser intactos (por exemplo, possuindo um tamanho de poro substancialmente igual ao tamanho do porogênio). Em algumas formas de realização, os poros intactos das partículas de fibroína de seda podem permanecer essencialmente os mesmos que o tamanho dos porogênios utilizados, por exemplo, entre cerca de 300 pm e 500 pm, ou entre cerca de 850 pm e cerca de 1000 pm. Em algumas formas de realização, as partículas menores de fibroína de seda não precisam manter poros intactos e, portanto, os poros podem ser muito menores do que o tamanho dos porogênios, por exemplo, pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98% ou mais alto, do intervalo de tamanho do porogênio. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda não precisam ser porosas. Em várias formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem compreender poros intactos, poros parciais ou uma combinação dos mesmos.

[0056] Em formas de realização alternativas, as partículas de fibroína de seda porosas podem ser produzidas pelo método de liofilização. Ver, por exemplo, US 7842780 e US 2010/0279112. Em tais formas de realização, a solução de

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37/128 fibroína de seda colocada em um recipiente antiaderente pode ser congelada a temperaturas abaixo de zero, por exemplo, a partir de cerca de -80°C a cerca de -20°C, durante, pelo menos, cerca de 12 horas, pelo menos cerca de 24 horas, ou mais, seguido de liofilização. Em uma forma de realização, a solução de fibroína de seda pode ser congelada a partir de uma direção. Em algumas formas de realização, a solução de fibroína de seda pode não conter nenhum sal. Em algumas formas de realização, álcool, tal como 15%-25% de metanol ou propanol, pode ser adicionado à solução de fibroína de seda. A fibroína de seda porosa no estado sólido pode então ser reduzida às partículas de fibroína de seda porosas aqui descritas, por exemplo, por meios mecânicos, tais como micronização, moagem, pulverização, esmagamento, trituração, liofilização ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas formas de realização, a fibroína de seda no estado sólido poroso não é produzida pelo método de liofilização, tal como aqui descrito.

[0057] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda ou uma fibroína de seda no estado sólido aqui descrita pode ser sujeita a um póstratamento que vai afetar, pelo menos, uma propriedade de fibroína de seda. Por exemplo, o pós-tratamento de partículas de fibroína de seda ou uma fibroína de seda no estado sólido pode afetar as propriedades de fibroína de seda, incluindo teor de folha β, solubilidade, capacidade de carga do agente ativo, tempo de degradação, permeabilidade de fármacos ou quaisquer combinações dos mesmos. Opções de pós-processamento de seda incluem secagem

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38/128 lenta e controlada (Lu et al. , 10 Biomacromolecules 1032 (2009)), recozimento em água (Jin et al., WaterStable Silk Films with Reduced β-Sheet Content, 15 Adv. Funct. Mats. 1241 (2005)), alongamento (Demura & Asakura, Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor, 33 Biotech & Bioengin 598 (1989)), compactação e imersão em solvente, incluindo metanol (Hofmann et al., 2006), etanol (Miyairi et al., 1978), glutaraldeído (Acharya et al., 2008) e 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) (Bayraktar et al., 2005).

[0058] Em algumas formas de realização, o póstratamento da fibroína de seda no estado sólido ou de partículas de fibroína de seda, por exemplo, recozimento em água ou imersão em solvente, pode permitir controlar a liberação de um agente ativo das partículas fibroína de seda. Em algumas formas de realização, o pós-tratamento da fibroína de seda no estado sólido ou de partículas de fibroína de seda, por exemplo, recozimento em água ou imersão em solvente, pode permitir a modulação da degradação ou propriedades de solubilidade das partículas de fibroína de seda aqui descritas. Em algumas formas de realização, o pós-tratamento da fibroína de seda no estado sólido ou de partículas de fibroína de seda, por exemplo, recozimento em água ou imersão em solvente, pode permitir a modulação das propriedades de retenção de volume das partículas de fibroína de seda aqui descritas.

[0059] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser revestidas com, pelo menos, uma camada de um polímero

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39/128 biocompatível e/ou biodegradável aqui descrito, por exemplo, para modular as propriedades de degradação e/ou de retenção do volume das partículas de fibroína de seda após injeção em um tecido a ser tratado e/ou para modular a taxa de agentes ativos liberados das partículas de fibroína de seda.

Em tais formas de realização, o polímero biocompatível e/ou biodegradável pode compreender, pelo menos, um agente ativo.

[0060] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser revestidas com moléculas de adesão celular, por exemplo, mas não limitado a, fibronectina, vitronectina, laminina, colágeno, quaisquer moléculas de matriz extracelular reconhecidas na arte e quaisquer combinações destes.

[0061] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser esterilizadas. Métodos de esterilização de dispositivos biomédicos são bem conhecidos na arte, incluindo, mas não limitado a, radiação gama ou ultravioleta, tratamento em autoclave (por exemplo, calor/vapor); esterilização em álcool (por exemplo, etanol e metanol); e esterilização com gás (por exemplo, esterilização por óxido de etileno).

[0062] Além disso, as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem tirar vantagem das muitas técnicas desenvolvidas para funcionalizar fibroína de seda (por exemplo, agentes ativos tal como corantes e sensores). Veja-se, por exemplo, Patente dos EUA N- 6.287.340,

Ligamento Cruzado Anterior Bioconstruído; WO 2004/000915, Biomateriais de Seda e Métodos de Utilização; WO 2004/001103, Biomateriais de Seda e Métodos de Utilização dos Mesmos; WO 2004/062697, Materiais de Fibroína de Seda e

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Utilização dos mesmos; WO 2005/000483, Método de formação de revestimentos inorgânicos; WO 2005/012606, Solução de Fibroína de Seda Aquosa Concentrada & Utilização da mesma; WO 2011/005381, Gelificação de Fibroína de Seda Induzida por Vortex para Encapsulamento e Entrega; WO 2005/123114, Sistema de Entrega de Fármaco à Base de Seda; WO 2006/076711, Fusões de Proteína fibrosa & Utilizações das mesmas na formação de Materiais Compósitos

Orgânicos/Inorgânicos Avançados; Publicação de Aplicação dos EUA N° 2007/0212730, Gradientes de Proteína

Covalentemente Imobilizada em Suportes Porosos

Tridimensionais; WO 2006/042287, Método para a Produção de Suportes de Biomaterial; WO 2007/016524, Método de Deposição em Etapas de Revestimentos de Fibroína de Seda; WO 2008/085904, Dispositivos Eletrônicos Biodegradáveis; WO 2008/118133, Microesferas de Seda para Encapsulamento e Liberação Controlada; WO 2008/108838, Dispositivos e Métodos Microfluídicos para a Fabricação dos Mesmos; WO 2008/127404, Dispositivo de Biopolímero Nanopadronizado e Método de Fabricação do Mesmo; WO 2008/118211, Cristais Fotônicos de Biopolímero e Método de Fabricação dos Mesmos; WO 2008/127402, Sensor de Biopolímero e Método de Fabricação do Mesmo; WO 2008/127403, Dispositivo

Optofluidico de Biopolímero e Método de Fabricação do Mesmo; WO 2008/127401, Guia de Ondas Óticas de Biopolímero e Método de Fabricação do Mesmo; WO 2008/140562, Sensor de Biopolímero e Método de Fabricação do Mesmo; WO 2008/127405, Dispositivo Microfluidico com Microcanal Cilíndrico e Método para a Fabricação do Mesmo; WO 2008/106485, Órgãos de seda Contruídos por Tecidos; WO 2008/140562,

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Dispositivos ópticos e Eletro-ópticos de Biopolímero Eletroativo e Método de Fabricação dos Mesmos; WO 2008/150861, Método para Gelificação de Fibroína de Seda Utilizando Sonicação; WO 2007/103442, Suportes

Biocompatíveis e células-tronco derivadas de tecido adiposo; WO 2009/155397, Produtos de Seda Holográficos Comestíveis; WO 2009/100280, Composições de Hidroxiapatita de Seda Tridimensionais; WO 2009/061823, Fabricação Estruturas Fotônicas de Fibroína de Seda pela Impressão por Nanocontato; WO 2009/126689, Sistema e Método para a Fabricação de Estruturas de Biomaterial.

[0063] Em uma forma de realização alternativa, as partículas de fibroína de seda podem incluir nanoparticulas plasmônicas para formar elementos fototérmicos. Esta abordagem tira proveito das características de dopagem superiores de fibroína de seda. A terapia térmica tem sido mostrada ajudar na distribuição transdérmica de vários agentes, ver Park et al., Effect of Heat on Skin Permeability (Efeito do calor sobre a permeabilidade da pele), 359 Intl. J. Pharm. 94 (2008). Em uma forma de realização, rajadas de calor em áreas muito limitadas podem ser utilizados para maximizar a permeabilidade com o mínimo de efeitos prejudiciais sobre os tecidos circundantes. Assim, as partículas de fibroína de seda dopadas com partículas plasmônicas podem adicionar especificidade à terapia térmica, concentrando-se a luz para gerar calor localmente somente através das partículas. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem incluir agentes fototérmicos, tais como nanopartículas de ouro.

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[0064] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem incluir um peptídeo anfifílico. Em outras formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem excluir um peptídeo anfifílico. Os peptídeos anfifílicos possuem as suas propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas. Moléculas anfifílicas geralmente podem interagir com membranas biológicas por meio da inserção da parte hidrofóbica na membrana lipídica, enquanto expondo a parte hidrofílica ao ambiente aquoso. Em algumas formas de realização, o peptídeo anfifílico pode compreender uma porção de RGD. Um exemplo de um peptídeo anfifílico é um peptídeo 23RGD tendo uma sequência de aminoácidos: HOOC-Gly-ArgGly-Asp-Ile-Pro-Ala-Ser-Ser-LysGly-Gly-Gly-Gly-SerArg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-NH2.

Outros exemplos de peptídeos anfifílicas incluem os divulgados no Pedido de Patente dos EUA N°: EUA 2011/0008406.

Composições injetáveis compreendendo partículas de fibroína de seda

[0065] Em outro aspecto, é aqui fornecida uma composição injetável para utilização na reparação ou aumento de um tecido de um indivíduo, que compreende uma pluralidade de partículas de fibroína de seda aqui descritas, em que, pelo menos, uma porção das partículas de fibroína de seda mantem seu volume original (por exemplo, pelo menos cerca de 50% ou mais) no interior do tecido a ser reparado ou aumentado por um período de tempo (por exemplo, pelo menos cerca de 6 semanas ou mais).

[0066] Tal como aqui utilizado, o termo composição injetável geralmente refere-se a uma composição que pode

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43/128 ser entregue ou administrada a um tecido com um procedimento minimamente invasivo. O termo procedimento minimamente invasivo refere-se a um processo que é realizado por entrar no corpo do indivíduo através da pele ou através de uma cavidade corporal ou uma abertura anatômica, mas com o menor dano possível (por exemplo, de uma pequena incisão, injeção). Em algumas formas de realização, a composição injetável pode ser administrada ou entregue em um tecido através de injeção. Em algumas formas de realização, a composição injetável pode ser entregue para um outro tecido através de uma pequena incisão na pele seguido por inserção de uma agulha, uma cânula, e/ou tubagem, por exemplo, um cateter. Sem querer estar limitado, a composição injetável pode ser administrada ou colocada em um tecido por cirurgia, por exemplo, implantação.

[0067] Em algumas formas de realização, as composições injetáveis podem compreender, pelo menos, um agente ativo aqui descrito. Em algumas formas de realização, as composições injetáveis podem compreender, pelo menos, uma célula. O termo células aqui utilizado refere-se a qualquer célula, procariota ou eucariota, incluindo plantas, fungos, vermes, insetos e mamíferos. Em algumas formas de realização, as células podem ser células de mamíferos. As células de mamíferos incluem, sem limitação; primata, humano e uma célula de um animal de interesse, incluindo sem limitação; rato, hamster, coelho, cão, gato, animais domésticos, tais como equinos, bovinos, murinos, ovinos, caninos, felinos, etc. As células podem ser de uma ampla variedade de tipos de tecidos, tais como, sem limitação; hematopoiético, neural, mesenquimais, cutâneo, mucosa,

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44/128 estromal, baço muscular, reticuloendotelial, epitelial, endotelial, hepática, renal, gastrointestinal, pulmonar, células T, etc. As células-tronco, células-tronco pluripotentes (iPSCs), células tronco embrionárias (ES), células derivadas de ES e progenitores de células-tronco também são incluídas, incluindo, sem limitação, célulastronco hematopoiéticas, neurais, estroma, musculares, cardiovasculares, hepáticas, pulmonares e gastrointestinais e células-tronco derivadas de tecido adiposo. Em uma forma de realização, as células são células-tronco derivadas de tecido adiposo. Em algumas formas de realização, as células podem ser células ex vivo ou de cultura, por exemplo, in vitro. Por exemplo, para células ex vivo, as células podem ser obtidas a partir de um indivíduo, em que o indivíduo é saudável e/ou afetado com uma doença.

[0068] As células podem ser obtidas, como um exemplo não limitativo, por biópsia ou outros meios cirúrgicos conhecidos aos peritos na arte. Em algumas formas de realização, as células adiposas podem ser colhidas a partir de um indivíduo por meio de técnicas convencionais de lipoaspiração ou aspiração. Em tais formas de realização, as células podem ser derivadas a partir de um lipoaspirado. Em outras formas de realização, as células podem ser derivadas a partir de um aspirado de medula óssea. Dependendo dos tipos de tecidos a serem reparados ou aumentados, as células podem ser derivadas de qualquer fluido ou concentrado biológico, por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea.

[0069] Assim, em algumas formas de realização, a composição injetável ou as partículas de fibroína de seda

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45/128 podem ser entregues diretamente com um fluido ou concentrado biológico, por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea. Em algumas formas de realização, a composição injetável ou a composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda pode ainda compreender um fluido ou concentrado biológico, tal como lipoaspirado, aspirado de medula óssea ou quaisquer combinações dos mesmos. Em uma forma de realização, a composição injetável ou a composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda pode ainda compreender um lipoaspirado.

[0070] Nestas formas de realização, a composição ou a composição injetável pode compreender partículas de fibroína de seda e um fluido ou concentrado biológico (por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea) em uma proporção em volume de cerca de 1:38 a cerca de 12:19, ou de cerca de 1:19 a cerca de 10:19, ou de cerca de 2:19 a cerca de 08:19. Em uma forma de realização, a composição ou a composição injetável pode compreender partículas de fibroína de seda e um fluido ou concentrado biológico (por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea) em uma proporção em volume de cerca de 3:19. Em uma outra forma de realização, a composição ou a composição injetável pode compreender partículas de fibroína de seda e um fluido ou concentrado biológico (por exemplo, um lipoaspirado ou um aspirado de medula óssea) em uma proporção em volume de cerca de 6:19.

[0071] As células podem ser obtidas a partir de doadores (alogênicos) ou a partir de destinatários (autólogo). As células também podem ser de linhas de

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46/128 cultura de células estabelecidas, ou mesmo células que tenham sido submetidas a engenharia genética. Além disso, as células podem ser recolhidas a partir de uma grande variedade de hospedeiros, incluindo, mas não limitado a tecidos de auto enxerto humanos, mamíferos transgênicos ou culturas bacterianas (eventualmente para uso como um tratamento de probiótico). Em certas formas de realização, as composições injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda podem compreender células-tronco humanas, tais como, por exemplo, as células-tronco mesenquimais, células-tronco pluripotentes (iPSCs), células-tronco derivadas de sinoviais, células-tronco embrionárias, células-tronco adultas, células do sangue do cordão umbilical, células de geléia umbilical de Wharton, osteócitos, fibroblastos, células neuronais, lipócitos, adipócitos, células da medula óssea, imunócitos variados, células precursoras derivadas de tecido adiposo, células progenitoras derivadas de medula óssea, células progenitoras do sangue periférico, célulastronco isoladas a partir de tecido adulto e células geneticamente transformadas ou combinações das células acima; ou células diferenciadas, tais como, por exemplo, células musculares, células adiposas.

[0072] As células-tronco podem ser obtidas com os procedimentos minimamente invasivos da medula óssea, tecido adiposo, ou outras fontes, no corpo, são altamente expansível em cultura, e podem ser facilmente induzidas para se diferenciarem em células que formam tecido adiposo após a exposição a um suplemento indução adipogênica bem estabelecido. As células podem ser adicionadas às composições injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda

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47/128 aqui descritas e cultivadas in vitro durante um período de tempo antes da administração à uma região do corpo, ou adicionadas a composições injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda aqui descritas e administrados à uma região do corpo. As células podem ser semeadas nas partículas de fibroína de seda por um curto período de tempo (menos de 1 dia) imediatamente antes da administração, ou cultivadas durante um período de tempo (mais do que 1 dia) para permitir a proliferação celular e a síntese de matriz extracelular na matriz semeada antes da administração.

[0073] Quando utilizado como uma fonte de célulastronco, o tecido adiposo pode ser obtido por qualquer método conhecido para uma pessoa com conhecimento comum na arte. Por exemplo, o tecido adiposo pode ser removido a partir de um indivíduo por lipoplastia assistida por sucção, lipoplastia assistida por ultrassom e lipectomia com excisão. Além disso, os processos podem incluir uma combinação de tais processos. A lipoplastia assistida por sucção pode ser desejável para remover o tecido adiposo de um indivíduo, uma vez que fornecer um método minimamente invasiva de recolha de tecido com um potencial mínimo de danos às células-tronco que pode ser associada a outras técnicas, tais como lipoplastia assistida por ultrassom. O tecido adiposo deve ser recolhido de um modo que preserve a viabilidade do componente celular e minimize a probabilidade de contaminação do tecido com organismos potencialmente infecciosos, tais como bactérias e/ou vírus.

[0074] Em algumas formas de realização, a preparação da população de células pode exigir o

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48/128 esgotamento do componente de adipócitos maduros em gordura do tecido adiposo. Isto é tipicamente conseguido através de uma série de passos de lavagem e de desagregação em que o tecido é enxaguado primeiro, para reduzir a presença de lipídios livres (liberado a partir de adipócitos rompidos) e elementos do sangue periférico (lançados a partir de vasos sanguíneos cortados durante a colheita de tecido), e depois desagregado para liberar adipócitos intactos e outras populações de células da matriz do tecido conjuntivo. A desagregação pode ser obtida utilizando quaisquer técnicas e métodos convencionais, incluindo a força mecânica (picagem ou forças de corte), a digestão enzimática com enzimas proteolíticas individuais ou combinatórias, tais como colagenase, tripsina, lipase, Liberase HI e pepsina, ou uma combinação de métodos mecânicos e enzimáticos. Por exemplo, o componente celular dos fragmentos de tecidos intactos pode ser separado por métodos que utilizem a dissociação mediada por colagenase de tecido adiposo, semelhante aos métodos para a recolha de células endoteliais microvasculares no tecido adiposo, como é conhecido dos peritos na arte. Métodos adicionais utilizando colagenase que podem ser utilizados também são conhecidos aos peritos na arte. Além disso, os métodos podem empregar uma combinação de enzimas, tais como uma combinação de colagenase e tripsina, ou uma combinação de uma enzima, tais como tripsina, e dissociação mecânica.

[0075] A população de células (lipoaspirado processado) pode então ser obtida a partir dos fragmentos de tecido desagregados por redução da presença de adipócitos maduros. A separação das células pode ser

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49/128 conseguida por sedimentação de densidade flutuante, centrifugação, decantação, adesão diferencial e eluição a partir de porções de fase sólida, seleção mediada por anticorpos, diferenças de carga eléctrica; esferas imunomagnéticas, seleção de células ativadas por fluorescência (FACS), ou outros meios.

[0076] Após a desagregação, a população celular ativa pode ser lavada/enxaguada para remover os aditivos e/ou subprodutos do processo de desagregação (por exemplo, colagenase e lipídio livre recém-liberado). A população de células ativas pode, então, ser concentrada por centrifugação. Em uma forma de realização, as células são concentradas e a colagenase removida por passagem da população de células por meio de um sistema de membrana giratório de fluxo contínuo, ou outros semelhantes, tais como, por exemplo, o sistema divulgado nas Patentes dos EUA N— 5.034.135 e 5.234.608, que são aqui incorporadas por referência.

[0077] Em adição ao exposto, existem muitos métodos de pós-lavagem que podem ser aplicados para purificar ainda mais a população de células. Estes incluem tanto a seleção positiva (selecionando as células alvo), seleção negativa (remoção seletiva de células indesejadas), ou suas combinações. Em uma outra forma de realização, o sedimento celular poderia ser ressuspenso em camadas sobre (ou sob) um material fluido formado em um gradiente de densidade contínuo ou descontínuo e colocado em uma centrífuga para a separação de populações de células com base na densidade de células. Em uma forma de realização semelhante, as abordagens de fluxo contínuo tais como aférese e elutriação

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50/128 (com ou sem contracorrente) poderiam ser utilizadas. A adesão a plástico seguido por um curto período de expansão celular também tem sido aplicada em populações de célulastronco adultas derivadas da medula óssea. Esta abordagem utiliza condições de cultura para expandir, preferencialmente, uma população enquanto outras populações são tanto mantidas (e, assim, reduzidas pela diluição com as crescentes células selecionadas) quanto perdidas devido à falta de condições de crescimento necessárias. As células que tenham sido concentradas, cultivadas e/ou expandidas podem ser incorporadas nas partículas de fibroína de seda e/ou composições injetáveis descritas neste documento.

[0078] Em uma forma de realização, as célulastronco são colhidas, as células colhidas são contatadas com um meio adipogênico durante um tempo suficiente para induzir a diferenciação em adipócitos, e os adipócitos são carregados em uma matriz biocompatível que é implantada. Em adicional formas de realização, pelo menos, algumas das células-tronco podem ser diferenciadas em adipócitos, de modo que uma mistura de ambos os tipos de células está presente inicialmente, que muda com o tempo para substancialmente apenas adipócitos, com as células-tronco estando presentes em quantidades pequenas à indetectáveis. O tecido adiposo é fabricado in vivo pelas células-tronco ou preparado ex vivo pelas células-tronco.

[0079] Um número de diferentes tipos de células ou combinações destes podem ser empregues nas composições injetáveis, dependendo dos tipos de tecidos a serem reparados ou aumentados. Estes tipos de células incluem, mas não estão limitados a: células do músculo liso, células

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51/128 do músculo esquelético, células musculares cardíacas, células epiteliais, células endoteliais, células uroteliais, fibroblastos, mioblastos, condrócitos, condroblastos, osteoblastos, osteoclastos, queratinócitos, hepatócitos, células do duto biliar, células das ilhotas pancreáticas, tireoide, paratireoide, adrenal, hipotálamo, hipófise, ovários, testículos, células de glândulas salivares, adipócitos e células precursoras. A título de exemplo apenas, as células do músculo liso e células endoteliais podem ser empregues quando as composições injetáveis são utilizadas para reparar ou aumentar tecidos musculares e/ou vasculares, tal como tecidos vasculares, esofágicos, intestinais, retais, ou uretrais; condrócitos podem ser incluídos em composições injetáveis para tecidos cartilaginosos; fibroblastos podem ser incluídos em composições injetáveis destinadas a substituir e/ou melhorar qualquer da grande variedade de tipos de tecidos (por exemplo, pele) que contém matriz extracelular, por exemplo, colágeno; adipócitos podem ser incluídos em composições injetáveis destinadas a reparar ou aumentar qualquer da grande variedade de tecidos adiposos. Em geral, quaisquer células que são encontradas no tecido natural podem ser incluídas nas composições injetáveis utilizadas para o tecido correspondente. Além disso, as células progenitoras, tais como mioblastos ou células-tronco, podem ser incluídas para produzir os correspondentes tipos de células diferenciadas.

[0080] Em algumas formas de realização, as composições injetáveis podem compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Tal como aqui utilizado, o

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52/128 termo veículo farmaceuticamente aceitável refere-se a um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitável para administração das partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um agente ativo. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardadores isotônicos e de absorção e que são compatíveis com as partículas de fibroína de seda e a atividade do agente ativo, se houver, e que são fisiologicamente aceitáveis ao indivíduo. As formulações farmacêuticas adequadas para injeção incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, meio de cultura de células, tampões (por exemplo, solução salina tamponada com fosfato), poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido, e afins), misturas adequadas dos mesmos. Em algumas formas de realização, o veículo farmacêutico pode ser uma solução tamponada (por exemplo, PBS).

[0081] Além disso, vários aditivos que melhoram a estabilidade, esterilidade e isotonicidade das composições injetáveis, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e tampões podem ser adicionados. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e outros semelhantes. Em muitos casos, pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. As composições injetáveis podem conter substâncias auxiliares, tais como

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53/128 agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH, aditivos melhoradores de gelificação ou viscosidade, conservantes, corantes e similares, dependendo da preparação desejada. Textos padrões, tais como REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 17a edição, 1985, aqui incorporado por referência, podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida.

[0082] A viscosidade das composições injetáveis pode ser mantida no nível selecionado utilizando um agente espessante farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização, a metilcelulose é utilizada porque é facilmente e economicamente disponível e é fácil de trabalhar. Outros agentes espessantes adequados incluem, por exemplo, goma xantana, carboximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, carbômero e semelhantes. A concentração preferida do agente espessante vai depender do agente selecionado e da viscosidade desejada para a injeção. O ponto importante é a utilização de uma quantidade que vai atingir a viscosidade

selecionada	, por exemplo	, a adição	de tais	agentes
espessantes	, em algumas	formas de	realização,	das
composições	injetáveis.
[008	3] Tipicamente,	quaisquer aditivos (além	das
partículas	de fibroína	de seda e/ou	agentes	ativos
adicionais	aqui descritos)	podem estar	presentes	em	uma

quantidade de 0,001 a 50% em peso de peso seco, ou em uma solução tamponada. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode estar presente na ordem de microgramas a miligramas a gramas, tal como de cerca de 0,0001 a cerca de 5% em peso, cerca de 0,0001 a cerca de 1% em peso, cerca de 0,0001 a cerca de 0,05% em peso, ou cerca de 0,001 a cerca

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20% em peso, cerca de 0,01 a cerca de 10% em peso, e cerca de 0,05 a cerca de 5% em peso. Para qualquer composição farmacêutica a ser administrada a um indivíduo em necessidade da mesma, é preferido determinar a toxicidade, tais como por determinação da dose letal (LD) e LD50 em um modelo animal adequado, por exemplo, roedores, tais como o rato; e, a dosagem da (s) composição (ões), concentração dos componentes nela e tempo de administração da (s) composição (ões), que provocam uma resposta adequada. Tais determinações não exigem experimentação indevida a partir do conhecimento de um especialista na matéria.

Agentes ativos

[0084] Em algumas formas de realização, a composição injetável e/ou as partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ainda compreender pelo menos um agente ativo. O agente ativo pode ser misturado, disperso ou suspenso na composição injetável, e/ou pode ser distribuído ou incorporado nas partículas de fibroína de seda. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser distribuído, incorporado ou encapsulado nas partículas de fibroína de seda. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser revestido na superfície das partículas de fibroína de seda. Em algumas formas de realização, o agente ativo pode ser misturado com as partículas de fibroína de seda de modo a formar uma composição injetável. O termo agente ativo também pode incluir combinações ou misturas de dois ou mais agentes ativos, conforme descrito abaixo. Exemplos de agentes ativos incluem, mas não estão limitados a, um agente biologicamente ativo (por exemplo, um agente terapêutico), um agente cosmeticamente ativo (por exemplo,

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55/128 um agente antienvelhecimento), um agente de ligação celular (por exemplo, moléculas de ligação a integrina) e quaisquer combinações destes.

[0085] O termo agente biologicamente ativo, tal como aqui utilizado, refere-se a qualquer molécula que exerce pelo menos um efeito biológico in vivo. Por exemplo, o agente biologicamente ativo pode ser um agente terapêutico para tratar ou prevenir um estado de doença ou condição em um indivíduo. Exemplos de agentes biologicamente ativos incluem, sem limitação, peptídeos, aptâmeros, peptidomiméticos, anticorpos ou uma porção do mesmo, moléculas semelhantes a anticorpos, ácidos nucleicos (ADN, ARN, ARNsi, shRNA), polissacarídeos, enzimas, antagonistas ou agonistas, hormônios, fatores de crescimento, medula óssea autogênea, antibióticos, agentes antimicrobianos, moléculas pequenas e agentes terapêuticos. Os agentes biologicamente ativos também podem incluir, sem limitações, agentes anti-inflamatórios, anestésicos, agentes ativos que estimulam a formação de tecido, e/ou cura e recrescimento de tecidos naturais e quaisquer combinações dos mesmos.

[0086] Os agentes anti-inflamatórios podem incluir, mas não estão limitados a, naproxeno, sulindaco, tolmetina, cetorolaco, celecoxib, ibuprofeno, diclofenaco, ácido acetilsalicílico, nabumetona, etodolaco, indometacina, piroxicam, inibidores COX-2, cetoprofeno, medicamentos antiplaquetas, salsalato, valdecoxib, oxaprozina, diflunisal, flurbiprofeno, corticosteróides, inibidores de MMP e modificadores de leucotrienos ou suas combinações.

[0087] Os agentes que aumentam a formação de novos

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56/128 tecidos e/ou estimulam a cicatrização ou recrescimento de tecido natural no local de injeção podem incluir, mas não estão limitados a, fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de crescimento transformante (TGF-β, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fatores de crescimento epidérmico (EGFs), peptídeos ativados do tecido conjuntivo (CTAPS), fatores osteogênicos, incluindo proteínas morfogênicas do osso, heparina, angiotensina II (A-II) e seus fragmentos, fatores de crescimento semelhantes à insulina, fatores de necrose tumoral, interleucinas, fatores estimulantes de colônias, eritropoietina, fatores de crescimento dos nervos, interferões, análogos biologicamente ativos, fragmentos e derivados de tais fatores de crescimento, e quaisquer combinações dos mesmos.

[0088] Os anestésicos podem incluir, mas não estão limitados a, aqueles utilizados em aplicações caudais, epidurais, por inalação, injetáveis, retrobulbar, e espinhais, como a bupivacaína, lidocaína, benzocaína, cetacaína, ropivacaína e tetracaína, ou suas combinações.

[0089] Em algumas formas de realização, os agentes ativos podem ser agentes cosmeticamente ativos. Pelo termo agente cosmeticamente ativo significa um composto que tem um efeito cosmético ou terapêutico sobre a pele, cabelo, unhas ou, por exemplo, agentes antienvelhecimento, agentes antirradicais livres, agentes de clareamento, agentes de branqueamento, agentes de despigmentação, agentes de escurecimento como agentes autobronzeadores, corantes, agentes antiacne, agentes de controle de brilho, agentes antimicrobianos, agentes anti-inflamatórios, agentes

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57/128 antimicóticos, agentes antiparasitários, analgésicos externos, agentes bloqueadores de sol, fotoprotetores, antioxidantes, agentes queratolíticos, detergentes/surfactantes, hidratantes, nutrientes, vitaminas, intensificadores de energia, agentes antitranspirantes, adstringentes, desodorizantes, removedores de cabelo, agentes de endurecimento, agentes anticalo, relaxantes musculares, agentes para condicionamento do cabelo, unha, e/ou pele, e qualquer combinação dos mesmos.

[0090] Em uma forma de realização, o agente cosmeticamente ativo pode ser selecionado de entre, mas não se limitando a, o grupo que consiste em hidroxi ácidos, peróxido de benzoíla, resorcinol de enxofre, ácido ascórbico, D-pantenol, hidroquinona, metoxicinamato de octila, dióxido de titânio, salicilato de octila, homosalato, avobenzona, polifenóis, carotenóides, varredores de radicais livres, ceramidas, ácidos graxos poli-insaturados, ácidos graxos essenciais, enzimas, inibidores de enzimas, minerais, hormônios tais como estrogênios, esteróides, tais como hidrocortisona, 2dimetilaminoetanol, sais de cobre, tais como cloreto de cobre, coenzima Q10, ácido lipóico, aminoácidos tal como prolina e tirosina, vitaminas, ácido lactobiônico, acetilcoenzima A, niacina, riboflavina, tiamina, ribose, elétrons transportadores, tais como NADH e FADH2, e outros extratos botânicos tais como aloe vera, matricária, e soja, e derivados e suas misturas. Exemplos de vitaminas incluem, mas não estão limitados a, vitamina A, vitamina Bs (tais como vitamina B3, vitamina B5 e vitamina B12), vitamina C,

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58/128 vitamina K e vitamina E, e os seus derivados.

[0091] Em uma forma de realização, os agentes cosmeticamente ativos podem ser antioxidantes. Exemplos de antioxidantes incluem, mas não estão limitados a, antioxidantes solúveis em água, tais como compostos de sulfidrila e seus derivados (por exemplo, metabissulfito de sódio e N-acetil-cisteína), ácido lipóico e ácido dihidrolipóico, resveratrol, lactoferrina, ácido ascórbico, e derivados de ácido ascórbico (por exemplo, palmitato de ascorbila e polipeptídeo ascorbil). Antioxidantes solúveis em óleo apropriados para utilização nas composições aqui descritas incluem, mas não estão limitados a, hidroxitolueno butilado, tocoferóis (por exemplo, acetato de tocoferol), tocotrienóis e ubiquinona. Extratos naturais contendo antioxidantes adequados para uso em composições injetáveis descritas neste documento, incluem, mas não estão limitados a, extratos contendo flavonóides e isoflavonas e os seus derivados (por exemplo, genisteína e diadzeína), e os extratos contendo resveratrol. Exemplos de tais extratos naturais incluem sementes de uva, chá verde, casca de pinheiro e própolis. Outros exemplos de antioxidantes podem ser encontrados nas páginas 1612-1613 do ICI Handbook.

[0092] Em algumas formas de realização, os agentes ativos podem ser agentes de ligação celulares. Exemplos de agentes de ligação celulares incluem, mas não estão limitados a, ácido hialurônico, colágeno, ácido hialurônico/colágeno reticulados, uma molécula de ligação a integrina, quitosano, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, proteoglicanos, os seus derivados e quaisquer

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59/128 combinações destes.

[0093] Em algumas formas de realização, as composições injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda podem ainda compreender, pelo menos, um material adicional para aumento de tecido mole, por exemplo, materiais de enchimento dérmico, incluindo, mas não limitado a, microesferas de poli(metacrilato de metila), hidroxiapatita, ácido poli-L-láctico, colágeno, elastina e glicosaminoglicanas, ácido hialurônico, produtos de preenchimento dérmico comercial como BOTOX® (da Allergan), DYSPORT®, COSMODERM®, EVOLENCE®, RADIESSE®, Restylane®, JUVEDERM® (da Allergan), SCULPTRA®, PERLANE® e Captique®, e quaisquer combinações destes.

[0094] Em alguns pontos de realização, a composição injetável e/ou partículas de fibroína de seda podem compreender nanopartículas metálicas (por exemplo, mas não limitado a, nanopartículas de ouro), moléculas ópticas (por exemplo, mas não limitado a, moléculas fluorescentes, e/ou pontos quânticos), e qualquer outro agente reconhecido na técnica de contraste, por exemplo, para imagens biomédicas.

[0095] Em várias formas de realização, as composições injetáveis podem ser armazenadas ou transportadas secas ou hidratadas.

[0096] Quando os agentes ativos são incorporados nas partículas de fibroína de seda, a bioatividade dos agentes ativos (por exemplo, pelo menos cerca de 30% da bioatividade dos agentes ativos) pode ser estabilizada durante um período de tempo (por exemplo, dias, semanas ou meses) em condições específicas. Tais condições podem incluir, mas não estão limitadas a, um ciclo de mudança de

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60/128 estado (por exemplo, ciclos de congelamentodescongelamento), temperaturas (por exemplo, acima de 0°C), pressões de ar, umidade e exposição à luz. Ver o Pedido dos

EUA número de série: 61/477.737. Algumas formas de realização da composição injetável podem ser armazenadas ou transportadas entre cerca de 0°C e cerca de 60°C, cerca de 10°C e cerca de 60°C, ou cerca de 15°C e cerca de 60°C. Nestas formas de realização, as composições injetáveis podem ser armazenadas ou transportadas à temperatura ambiente, enquanto a bioatividade dos agentes ativos (por exemplo, pelo menos cerca de 30% da bioatividade dos agentes ativos) pode ser estabilizada durante um período de tempo, por exemplo, a menos de cerca de 3 semanas ou mais.

Aplicações das composições injetáveis e partículas de fibroína de seda aqui descritas

[0097] As composições injetáveis descritas neste documento podem ser utilizadas em uma variedade de utilizações médicas, incluindo, sem limitação, agentes de enchimento para o espaço de tecido, modelos para a reconstrução ou regeneração de tecidos, suportes para as células em aplicações de engenharia de tecidos, ou como um veículo/transportador para entrega do fármaco. Uma pluralidade de partículas de fibroína de seda injetadas em um tecido a ser reparado ou aumentado pode atuar como um suporte para imitar as matrizes extracelulares (ECM) do corpo, e/ou promover a regeneração de tecido. O suporte pode servir tanto como um suporte físico e/ou um modelo de adesivo para as células proliferarem aí. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem não conter células. No entanto, as partículas de fibroína de

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61/128 seda podem ser revestidas com agentes de fixação celular, por exemplo, colágeno, e/ou quimiotáxicos, por exemplo, fatores de crescimento, que podem atrair células hospedeiras para as partículas de fibroína de seda e auxiliar na proliferação celular. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser semeadas com células antes da administração a um tecido alvo a ser reparado ou aumentado.

[0098] Em algumas formas de realização, são aqui fornecidas composições injetáveis que podem ser utilizadas para preencher, dar volume, e/ou regenerar um tecido em necessidade do mesmo. As composições injetáveis podem em geral, ser utilizadas para enchimento de tecido ou dar volume, aumento de tecido mole, substituição, valorização estética e/ou reparação de tecido em um indivíduo. Além disso, as composições injetáveis podem ser utilizadas para o enchimento de tecido de qualquer cavidade, ou recesso, que são formados quer naturalmente (por exemplo, envelhecimento) ou criados por procedimentos cirúrgicos para a remoção de tecido (por exemplo, um quisto dérmico ou um tumor sólido), tratamento com corticosteróides, reação imunológica resultante em lipodistrofia, danos no tecido resultantes de lesões de impacto ou tratamento terapêutico (por exemplo, radioterapia ou quimioterapia). As composições injetáveis podem também ser utilizadas para aumentar as depressões de cicatrizes.

[0099] Em certas formas de realização, as composições injetáveis podem ser utilizadas para o aumento de tecido mole. Tal como aqui utilizado, o termo aumentando ou aumento significa aumentar, preencher,

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62/128 restaurar, melhorar ou substituir um tecido. Em algumas formas de realização, o tecido pode perder a sua elasticidade, a firmeza, a forma e/ou volume. Em algumas formas de realização, o tecido pode ser parcialmente ou completamente perdido (por exemplo, remoção de um tecido) ou danificado. Nestas formas de realização, o termo aumentando ou aumento também pode referir-se a diminuir,

reduzir	ou aliviar pelo menos	um sintoma ou	defeito em um
tecido	(por exemplo,	mas	não	limitado	a,	perda de
elasticidade, firmeza,	forma	e/ou	volume	de	um tecido;
presença	de um espaço	vazio	ou um	recorte	em	um tecido,
perda de	função de um	tecido)	, por	injeção	no	tecido com,

pelo menos, uma composição injetável aqui descrita. Em tais formas de realização, pelo menos um sintoma ou defeito em um tecido pode ser diminuído, reduzido ou atenuado por, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais, quando comparado com o não tratamento. Em algumas formas de realização, pelo menos, um sintoma ou defeito em um tecido pode ser diminuído, reduzido ou atenuado por, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou mais, em comparação com o não tratamento. Em algumas formas de realização, pelo menos, um sintoma ou defeito em um tecido pode ser diminuído, reduzido ou aliviado por 100% (sem defeitos ou o defeito não é detectável por um perito na arte), em comparação com o não tratamento. Em outras formas de realização, o tecido pode ser aumentado para prevenir ou retardar o aparecimento de manifestação de defeito em um tecido, por exemplo, perda de

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63/128 elasticidade, firmeza, forma e/ou volume de um tecido, ou sinais de rugas. Tal como aqui utilizada, a frase aumento de tecido mole é geralmente utilizada em referência a alterar uma estrutura de tecido mole, incluindo mas não se limitando a, aumento, preenchimento, restauração, melhora ou a substituição de um tecido, por exemplo, para melhorar a aparência cosmética ou estética do tecido mole. Por exemplo, o aumento dos seios (também conhecida como ampliação dos seios, mamoplastia de ampliação, mamoplastia de aumento) altera o tamanho e a forma dos seios de uma mulher para melhorar a aparência estética ou estética da mulher. Exemplos de aumento de tecidos moles inclui, mas não está limitado a, o aumento do tecido dérmico; preenchimento de linhas, dobras, rugas, pequenas depressões faciais e lábios leporinos, especialmente no rosto e pescoço; correção de deformidades menores devido ao envelhecimento ou doença, incluindo nas mãos e nos pés, dedos das mãos e pés; aumento das cordas vocais ou glote para reabilitar a fala; preenchimento cutâneo de linhas de sono e linhas de expressão; substituição dérmica e tecido subcutâneo perdido devido ao envelhecimento; aumento dos lábios; preenchimento de pés de galinha e do sulco orbital ao redor do olho; aumento do peito; aumento do queixo; aumento da bochecha e/ou nariz; agente de volume para suporte periuretral, enchimento de recortes nos tecidos moles, dérmicos ou subcutâneos, devido a, por exemplo, lipoaspiração de excesso de zelo ou outro trauma; enchimento de acne ou cicatrizes traumáticas; preenchimento de linhas nasolabiais, linhas nasoglabelares e linhas intraorais. Em algumas formas de realização, as composições

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64/128 injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda aqui descritas podem ser utilizadas para tratar lipodistrofias faciais. Em algumas formas de realização, as composições injetáveis podem ser utilizadas para o aumento e/ou reconstrução dos seios.

[0100] Em algumas formas de realização, as composições injetáveis podem ser utilizadas para a reparação de tecido mole. O termo reparo ou reparar, tal como aqui utilizado, em respeito a um tecido, refere-se a qualquer correção, reforço, recondicionamento, remediação, regeneração, enchimento de um tecido que restaura o volume, a forma e/ou a função do tecido. Em algumas formas de realização, a reparação inclui completa reparação e reparação parcial. Por exemplo, o volume, a forma e/ou função de um tecido a ser reparado podem ser restaurados por, pelo menos, cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou mais, quando comparado com o não tratamento. Em algumas formas de realização, o volume, a forma e/ou função de um tecido a ser reparado podem ser restaurados por, pelo menos, cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 97%, ou mais, em comparação com o não tratamento. Em algumas formas de realização, o volume, a forma e/ou função de um tecido a ser reparado podem ser restaurados por 100% (sem defeitos ou o defeito não é detectável por um perito na arte), em comparação com o não tratamento. Em várias formas de realização, as composições injetáveis podem ser utilizadas para reparar quaisquer tecidos moles discutidos anteriormente, por exemplo, da mama, da pele, e de

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65/128 quaisquer tecidos moles passíveis de aumento de tecido mole. Em algumas formas de realização, os termos reparar ou reparo são aqui utilizados alternadamente com os termos regeneração ou regenerar, quando utilizados em referência ao tratamento de tecidos.

[0101] Em algumas formas de realização, as composições injetáveis podem ser utilizadas para a reconstrução de tecidos moles. Tal como aqui utilizada, a frase reconstrução de tecidos moles refere-se a reconstrução de uma estrutura de tecido mole que foi severamente danificado ou perdido, por exemplo, por um acidente dramático ou remoção cirúrgica. Por exemplo, a reconstrução da mama é a reconstrução de uma mama, geralmente em mulheres. Os métodos convencionais de construção de uma mama com aparência natural geralmente envolvem o uso de tecido autólogo ou material protético. Em algumas formas de realização, tal reconstrução da mama, pode incluir a reforma de uma aréola e mamilo com aparência natural, que tal procedimento pode envolver o uso de implantes ou abas realocadas de tecido do próprio paciente.

Em algumas formas de realização, a administração de composições injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda em uma região de tecido mole a ser reconstruída pode manter a forma e/ou tamanho da estrutura de tecido mole reconstruída, durante um período de tempo, por exemplo, pelo menos 6 semanas, pelo menos cerca de 2 meses, pelo menos cerca de 3 meses ou mais.

[0102] Sem se pretender ficar limitado, algumas formas de realização das composições injetáveis podem ser utilizadas para o aumento ou reparação de tecido duro

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66/128 (musculoesquelético), tais como aumento ou reparação de osso, cartilagem e ligamento.

[0103] As composições injetáveis e partículas de fibroína de seda aqui descritas também podem ser utilizadas para o enchimento de um tecido localizado no ou perto de um implante de prótese, por exemplo, mas não limitado a, um implante da mama ou implante de substituição de joelho convencional. Em algumas formas de realização, as composições injetáveis e partículas de fibroína de seda podem ser utilizadas para fazer a interface entre um implante protético e um tecido, por exemplo, para preencher um espaço vazio entre o implante da prótese e o tecido, e/ou para evitar que o tecido entre em contato direto com o implante de prótese. A título de exemplo apenas, após a colocação de um implante de prótese (por exemplo, um implante da mama) em um indivíduo, uma composição injetável aqui descrita pode ser introduzida no, ou adjacente ao, implante para encher qualquer espaço vazio entre o implante e o tecido (por exemplo, tecido da mama) e/ou esculpir o tecido para um olhar mais natural.

[0104] Em qualquer dos usos aqui descritos, partículas de fibroína de seda podem ser combinadas com as células para fins de reparação reforçada biologicamente. As células podem ser recolhidas a partir de uma grande variedade de hospedeiros, incluindo, mas não limitados a tecidos de autoenxerto humanos ou animais transgênicos. Mais especificamente, as células humanas utilizadas podem compreender células selecionadas a partir de células-tronco (por exemplo, derivadas de células-tronco de adipócitos), osteócitos, fibroblastos, lipócitos, imunócitos variados, a

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67/128 partir de células lipoaspiradas ou quaisquer combinações as mesmas. Em algumas formas de realização, as células podem ser adicionadas após a lavagem das próprias partículas de fibroína de seda. Elas podem ser misturadas nas partículas de fibroína de seda, solução veículo ou mistura de partículas de fibroína de seda e solução veículo, antes da injeção.

[0105] Em algumas formas de realização, a administração das células (por exemplo, as células-tronco ou lipoaspiradas) com partículas de fibroína de seda ou uma composição injetável aqui descrita pode melhorar ou acelerar a integração do hospedeiro e/ou a formação de tecido ao longo do tempo. As células podem ser misturadas com as partículas de fibroína de seda ou uma composição injetável aqui descrita, ou elas podem ser administradas antes, simultaneamente com, ou após as partículas de fibroína de seda ou uma composição injetável ser introduzida no local de destino. Sem pretender ser limitado pela teoria, as células podem secretar fatores próangiogênicos e/ou fatores de crescimento no local de destino. À medida que o tecido regenera ou remodela para encher um espaço vazio ou reparar um defeito, as partículas de fibroína de seda podem degradar em conformidade. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem integrar-se com o tecido do hospedeiro regenerado.

[0106] Além disso, agentes ativos, tais como agentes terapêuticos, fármacos, ou fatores de crescimento específicos às partículas de fibroína de seda, para fins de melhor resultado, podem ser introduzidos em qualquer ou uma

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68/128 combinação de vários pontos ao longo do processo de produção das partículas de fibroína de seda. Em algumas formas de realização, estes fatores podem ser adicionados à solução de fibroína de seda ou a fase de catalisador antes da secagem e solidificação, podem ser embebidos no interior da matriz de fibroína de seda durante o processo de lavagem acelerador, ou podem ser revestidos sobre a massa de fibroína de seda após a lavagem. O agente ativo contendo fibroína de seda no estado sólido pode então ser reduzido a partículas, utilizando os métodos aqui descritos. Em algumas formas de realização, uma fibroína de seda no estado sólido pode ser reduzida em partículas antes da introdução de um agente ativo nas partículas de fibroína de seda. Por exemplo, um agente ativo pode ser embebido nas partículas de fibroína de seda, revestido sobre as partículas de fibroína de seda, ou introduzido em um fluido portador antes ou depois da mistura com as partículas de fibroína de seda.

[0107] Em alguns aspectos, a composição e as partículas de fibroína de seda injetáveis aqui descritas podem ser utilizadas como agentes de enchimento de espaço do tecido. Em uma forma de realização, o material de enchimento do espaço de tecido é um material de enchimento dérmico. O material de enchimento dérmico pode ser utilizado para melhorar a aparência da pele ou condição, incluindo, mas não limitado a, a reidratação da pele, proporcionando maior elasticidade para a pele, reduzindo a aspereza da pele, tornando a pele mais esticada, reduzindo ou eliminando linhas ou marcas de estiramento, o que dá a pele melhor tom, brilho, clareza e/ou radiação, reduzindo

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69/128 ou eliminando rugas na pele, proporcionando resistência à rugas na pele e substituindo a perda de tecidos moles.

[0108] Um preenchimento dérmico compreendendo partículas de fibroína de seda pode ser modulado para a dureza e opacidade das partículas através da alteração da concentração de fibroína de seda e método de formulação. Em uma forma de realização, um material de enchimento dérmico pode ser produzido por formação de uma fibroína de seda no estado sólido a partir de uma solução de fibroína de seda de cerca de 6% (p/v) a cerca de 20% (p/v), seguido por redução da fibroína de seda no estado sólido em partículas de fibroína de seda de modo a que elas possam ser injetadas em um tecido através de uma agulha ou cânula. A agulha ou cânula pode ter um diâmetro externo não maior do que 3 mm, não maior do que 2 mm, não maior do que 1 mm, não maior do que 0,8 mm, não maior do que 0,6 mm, não maior do que 0,4 mm, não maior do que 0,2 mm ou não maior do que 0,1 mm. Em algumas formas de realização, o calibre da agulha ou cânula pode variar de 12 a 34, 15 e 34, 20 a 32, ou 25 a 30. O tamanho da agulha ou cânula pode ser determinado para permitir uma força de extrusão adequada inferior a 40 N (força de injeção de entrega nominal para uma mão humana).

[0109] Deste modo, um outro aspecto aqui descrito fornece um método de melhoria de uma condição e/ou aparência da pele em um indivíduo com essa necessidade. Exemplos não-limitativos de uma condição e/ou aparência da pele ou incluem desidratação, falta de elasticidade da pele, rugosidade, falta de retesamento da pele, linha e/ou marcas de estiramento da pele, palidez da pele e rugas da pele. O método compreende a injeção de uma composição injetável

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70/128 aqui descrita em uma região dérmica do sujeito, em que a injeção melhora a condição e/ou aparência da pele. Por exemplo, uma melhoria da aparência da pele inclui, mas não estão limitados a, reidratação da pele, fornecimento de maior elasticidade para a pele, redução da aspereza da pele, tornar a pele mais esticada, redução ou eliminação de linhas ou marcas de estiramento, dar à pele uma melhor tonalidade, brilho, clareza e/ou irradiação para reduzir palidez, redução ou eliminação de rugas na pele, e fornecimento de uma resistência à rugas na pele.

[0110] Conforme aqui utilizado, o termo região dérmica refere-se à região da pele que compreende a junção dermo-epidérmica e a derme, incluindo a derme superficial (região papilar) e a derme profunda (região reticular). A pele é composta de três camadas principais: a epiderme, que fornece impermeabilização e serve como uma barreira à infecção; a derme, que serve como um local para os apêndices da pele; e hipoderme (camada adiposa subcutânea). A epiderme não contém vasos sanguíneos, e é alimentada pela difusão da derme. Os principais tipos de células que compõem a epiderme incluem, mas não estão limitados a, queratinócitos, melanócitos, células de Langerhans e células de Merkel.

[0111] A derme é a camada de pele abaixo da epiderme que consiste de tecido conjuntivo e amortece o corpo do stress e tensão. A derme é firmemente ligada à epiderme por uma membrana basal. Ela também abriga muitas terminações mecanorreceptoras/nervosas que fornecem o sentido do tato e do calor. Ela contém os folículos do cabelo, glândulas sudoríparas, glândulas sebáceas,

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71/128 glândulas apócrinas, vasos linfáticos e vasos sanguíneos. Os vasos sanguíneos na derme fornecem alimentação e remoção de resíduos de suas próprias células, bem como do estrato basal da epiderme. A derme é estruturalmente dividida em duas áreas: a área superficial junto à epiderme chamada região papilar, e uma área mais grossa, profunda, conhecida como a região reticular.

[0112] A região papilar é composta de tecido conjuntivo areolar frouxo. Ela é nomeada por suas projeções digitiformes chamadas papilas que se estendem em direção à epiderme. As papilas fornecem à derme uma superfície irregular que interdigita com a epiderme, reforçando a ligação entre as duas camadas da pele. A região reticular encontra-se profundamente na região papilar e é, geralmente, muito mais espessa. Ela é composta de tecido conjuntivo denso irregular, e recebe o seu nome da densa concentração de fibras colágenas, elásticas e reticulares que tecem ao longo dela. Estas fibras de proteínas da derme dão as suas propriedades de resistência, extensibilidade e elasticidade. Também localizada no interior da região reticular são as raízes do cabelo, glândulas sebáceas, glândulas sudoríparas, receptores, unhas e vasos sanguíneos. As estrias da gravidez também estão localizadas na derme.

[0113] A hipoderme não faz parte da pele, e fica abaixo da derme. Sua finalidade é unir a pele ao osso e músculo subjacente, bem como fornecê-la com os vasos sanguíneos e nervos. É composta por tecido conjuntivo frouxo e elastina. Os principais tipos de células são fibroblastos, macrófagos e adipócitos (a hipoderme contém 50% de gordura corporal). A gordura serve como o

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72/128 estofamento e isolamento para o corpo.

[0114] Em uma forma de realização, é aqui fornecido um método para tratar a desidratação da pele, que compreende a injeção à uma região dérmica, que sofre de desidratação da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição reidrata a pele, tratando assim a desidratação da pele.

[0115] Em uma outra forma de realização, um método de tratamento de uma falta de elasticidade da pele compreende a injeção à uma região dérmica, sofrendo de uma falta de elasticidade da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição aumenta a elasticidade da pele, tratando assim uma falta de elasticidade da pele.

[0116] Em ainda outra forma de realização, um método de tratamento de aspereza da pele compreende a injeção à uma região dérmica, sofrendo de aspereza da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente

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73/128 ativo, em que a injeção da composição diminui a aspereza da pele, tratando assim a aspereza da pele.

[0117] Em ainda outra forma de realização, um método de tratamento de uma falta de retesamento da pele compreende a injeção à uma região dérmica, sofrendo de uma falta de retesamento da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição torna a pele mais esticada, tratando assim uma falta de retesamento da pele.

[0118] Em uma outra forma de realização, um método de tratamento de uma linha ou marca de estiramento da pele compreende a injeção à uma região dérmica, sofrendo de uma linha ou marca de estiramento da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição reduz ou elimina a linha ou marca de estiramento da pele, tratando, assim, uma linha ou marca de estiramento da pele.

[0119] Em uma outra forma de realização, um método de tratamento de palidez da pele compreende a injeção à uma região dérmica, sofrendo de palidez da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode

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74/128 compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição aumenta o tom ou brilho da pele, tratando assim palidez da pele.

[0120] Em uma outra forma de realização, um método de tratamento de rugas da pele compreende a injeção à uma região dérmica, sofrendo de rugas da pele, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição reduz ou elimina as rugas da pele, tratando assim as rugas da pele.

[0121] Em ainda outra forma de realização, um método de tratar, prevenir ou retardar a formação de rugas na pele compreende a injeção à uma região dérmica, susceptível a, ou a exibir sinais de rugas, de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descritas. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um veículo fluido biológico (por exemplo, um lipoaspirado) e/ou um agente ativo, em que a injeção da composição torna a pele resistente a rugas da pele, tratando assim, prevenindo ou retardando a formação de rugas na pele.

[0122] A quantidade efetiva e horário de administração das partículas de fibroína de seda injetada em uma região dérmica podem ser determinados por uma pessoa

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75/128 com conhecimentos correntes na arte tomando em consideração diversos fatores, incluindo, sem limitação, o tipo de doença de pele, a localização da condição da pele, a causa da condição da pele, a gravidade da condição da pele, o grau de alívio desejado, a duração do alívio desejado, a formulação particular das partículas de fibroína de seda utilizadas, a taxa de degradação ou volume de retenção da formulação de partículas fibroína de seda particular utilizada, a farmacodinâmica da formulação de partícula de fibroína de seda particular utilizada, a natureza dos outros compostos incluídos na formulação da partícula de fibroína de seda particular utilizada, das características particulares, história e fatores de risco do indivíduo, como, por exemplo, idade, peso, saúde geral, e quaisquer combinações destes. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser injetadas em uma região dérmica a cada 3 meses, a cada 6 meses, a cada 9 meses, a cada ano, a cada dois anos ou mais.

[0123] Em outro aspecto, as composições injetáveis podem ser utilizadas como material de enchimento dérmico para crescimento dérmico para reconstruir ou aumentar uma parte do corpo do tecido mole, tal como, por exemplo, um lábio, um seio, uma parte da mama tal como o mamilo, um músculo, ou qualquer outra parte do corpo mole onde o tecido adiposo e/ou conjuntivo é utilizado para fornecer a forma, isolamento, ou outra função biológica. Em enchimentos utilizados para estas aplicações, a concentração de fibroína de seda e/ou a quantidade de um veículo (por exemplo, solução salina) adicionados a mistura de partícula de fibroína de seda pode ser ajustada para os

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76/128 limites relevantes de um dado ambiente biológico. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda para o aumento dos seios podem ser adaptadas para a dureza das partículas e retenção de volume por meio da alteração da concentração da fibroína de seda e método de processamento. Por exemplo, cerca de 4% (p/v) a cerca de 8% (p/v) de concentração de fibroína de seda, contendo, opcionalmente, um agente ativo, por exemplo, células adiposas tais como células-tronco derivadas de tecido adiposo ou células de lipoaspirado, pode ser utilizado para produzir as partículas de fibroína de seda. O teor de veículo no caso de solução salina pode ser da ordem de 0% a 25% (v/v). Outros fatores, como, por exemplo, tipo de defeito, tamanho do defeito e as necessidades para uma profundidade específica de injeção do enchimento, também devem ser considerados.

[0124] Sem se pretender ficar limitado, enquanto a injeção é minimamente invasiva, outro método de administração pode ser também ser utilizado, por exemplo, a implantação, quando necessária, por exemplo, para reparar ou aumentar uma área de defeito grande. Por exemplo, para injeção dérmica e aumento dos lábios, uma agulha de seringa de tamanho 26 g - 30 g pode ser utilizada. Em aplicações que envolvem grandes quantidades de material de enchimento, por exemplo, a reconstrução da mama ou aumento dos seios, um tamanho de partícula maior e uma agulha de calibre maior, tal como 23 g - 27 g ou calibre da agulha menor podem ser utilizados para administrar o material de enchimento. Em algumas formas de realização, a cirurgia, por exemplo, o implante pode também ser utilizado para administrar grandes quantidades de material de enchimento e/ou alcançar uma

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77/128 certa profundidade de tecido.

[0125] Deste modo, ainda outro aspecto aqui descrito fornece um método de reconstrução, reparação ou aumento de tecidos moles, o método compreendendo a administração de uma ou mais formas de realização de uma composição injetável aqui descrita a uma região do tecido mole de um indivíduo com necessidade da mesma. Por exemplo, a composição injetável pode compreender uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, e, opcionalmente, um agente ativo e/ou um veículo (por exemplo, um veículo de fluido biológico, tal como um lipoaspirado). Os métodos de administração de uma composição injetável aqui descrita podem ser determinados por um perito na arte. Em algumas formas de realização, o método de administração pode ser por injeção. Em algumas formas de realização, o método de

administração	pode ser	uma	cirurgia, por exemplo,
implantação.
[0126]	Embora	as	composições injetáveis e/ou
partículas de	fibroína	de	seda	aqui descritas possam ser

aplicadas diretamente sobre uma zona alvo (por exemplo, injeção ou cirurgia), em algumas formas de realização, uma composição injetável e/ou partículas de fibroína de seda aqui divulgadas podem também ser utilizadas para encher um dispositivo médico implantável expansível, tais como, por exemplo, um invólucro de implantes da mama expansível, que é colocado em uma área do defeito. Em tais formas de realização, é aqui fornecido um método de reconstrução, de reparação ou de aumento de tecidos moles, o método compreendendo a colocação de um dispositivo médico implantável em uma região de tecido mole de um indivíduo no

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78/128 local desejado; e expansão o dispositivo pelo enchimento do dispositivo com partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento, em que a expansão do dispositivo médico, preenchendo-o com partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento, pode reconstruir ou aumentar o tecido mole.

[0127] As partículas de fibroína de seda ou composições injetáveis aqui descritas podem ser também utilizadas em conjunto com os procedimentos de embolização de radiologia intervencionista para bloquear vasos (por exemplo, com o objetivo de parar o sangramento) ou órgãos (para parar a função adicional, por exemplo embolização do baço para hiperesplenismo) anormais do sangue (artéria), incluindo a embolização da artéria uterina para tratamento percutâneo de miomas uterinos. A modulação da taxa de retenção de dureza e volume das partículas de fibroína de seda pode ser feita por meio da alteração da concentração e métodos de processamento de fibroína de seda conforme descrito anteriormente.

[0128] As partículas de fibroína de seda ou composições injetáveis aqui divulgadas podem ser utilizadas para reparar o espaço vazio de uma coluna, por exemplo, criado por cirurgia da coluna de remoção de núcleo rígido, para ajudar a manter a distância normal entre os corpos vertebrais adjacentes. Em algumas formas de realização, um material de enchimento do disco vertebral que compreende uma pluralidade de partículas de fibroína de seda pode ser utilizado para reparar o espaço vazio presente na coluna, por exemplo, entre os corpos vertebrais e/ou em um disco de

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79/128 coluna rompido. Em tais formas de realização, uma concentração de fibroína de seda de cerca de 4% (p/v) a cerca de 10% (p/v) pode ser utilizada para fabricar as partículas de fibroína de seda aqui descritas. Agentes de aceleração e/ou ativos podem também ser misturados com partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis antes, durante, ou depois da injeção ao local de interesse.

[0129] As partículas de fibroína de seda ou composições injetáveis aqui divulgadas podem ser utilizadas para encher a cavidade do vítreo para suportar a estrutura do globo ocular e manter a posição da retina. A viscosidade da composição injetável aqui descrita pode ser ajustada para a viscosidade do fluido vítreo ocular por um perito na arte.

[0130] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis podem ser utilizadas como um modelo para a reconstrução ou aumento de tecidos, por exemplo, a reconstrução ou aumento de tecidos moles (por exemplo, aumento da mama), ou até mesmo para pequenos defeitos de cartilagem ou osso, tais como fraturas. A administração de partículas de fibroína de seda ou as composições injetáveis descritas neste documento podem ser utilizadas para facilitar o crescimento interno e proliferação de células de cartilagem/osso e suporte de matriz de deposição de colágeno para, assim, melhorar a reparação de cartilagem/osso. Em outro aspecto, antes da administração, as células de cartilagem doadoras podem ser semeadas ou misturadas com as partículas de fibroína de seda e/ou as

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composições	injetáveis	descritas	neste documento para
expandir	a	população	de células	e, assim, promover	a
formação	de	tecido de	cartilagem.	Em algumas formas	de

realização, os fatores de crescimento específicos tais como TGF-β ou as proteínas morfogênicas do osso (BMPs), que suportam cartilagem ou a formação de tecido ósseo, respectivamente, podem ser adicionadas nas partículas de fibroína de seda.

[0131] Em uma outra forma de realização, as partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento podem ser utilizadas para cirurgia estética facial, tais como, por exemplo, na reconstrução do nariz. A estratégia de reconstrução discutida acima para reparar um defeito da cartilagem/osso também pode ser aplicada para a cirurgia plástica facial.

[0132] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento podem ser utilizadas como suportes para suportar o crescimento de células para a engenharia de tecidos. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento podem ser administradas em uma incisão ou local de ferida para promover a cicatrização de feridas ou fechamento de feridas. Os métodos compreendem geralmente a administração de uma composição ou partículas de fibroína de seda injetáveis aqui descritas, na ferida ou local de incisão e permitindo à ferida ou incisão curar, enquanto as partículas de fibroína de seda são erodidas ou absorvidas no corpo e são substituídas pelo próprio tecido viável do indivíduo. Os métodos podem ainda compreender a semeação

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81/128 das partículas de fibroína de seda, ou mistura da composição injetável com material celular viável, quer a partir do indivíduo ou de um doador, antes ou durante a administração.

[0133] Em outro aspecto, a composição injetável compreendendo partículas de fibroína de seda pode ser utilizada diretamente ou indiretamente em métodos de reparação, aumento, ou reconstrução de um tecido em um indivíduo, por exemplo, aumento ou reconstrução da mama de um ser humano. Em algumas formas de realização, as composições injetáveis ou partículas de fibroína de seda podem ser diretamente colocadas em um tecido (por exemplo,

um tecido	da	mama) para	ser	reparado ou	aumentado,	por
exemplo,	por	injeção.	As	composições	injetáveis	ou
partículas	de	fibroína de	seda podem ser	injetadas em	um

tecido (por exemplo, um tecido mamário) a cada 6 meses, a cada ano, a cada 2 anos, a cada 3 anos, ou mais. Em outras formas de realização, as composições injetáveis ou de partículas de fibroína de seda podem ser utilizadas para melhorar o suporte de um implante de tecido convencional, por exemplo, pelo reforço de apoio da posição do polo inferior de um implante. Em formas de realização alternativas, o método pode, geralmente, compreender a administração de uma composição injetável e/ou partículas de fibroína de seda perto ou na proximidade de um implante de tecido, por exemplo, um implante de mama convencional, e semear a composição injetável e/ou partículas de fibroína de seda com material celular viável antes ou durante a administração. Em ainda outra forma de realização, uma composição injetável e/ou partículas de fibroína de seda

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82/128 podem ser utilizadas para cobrir parcial ou completamente um implante de tecido (por exemplo, um implante da mama), para proporcionar uma interface benéfica com o tecido do hospedeiro e para reduzir o potencial para mau posicionamento ou contratura capsular.

[0134] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento podem ser utilizadas como enchimentos para promover ou apoiar a adipogênese, por exemplo, para o tratamento de lipodistrofia facial. Em tais formas de realização, as composições injetáveis e/ou partículas de fibroína de seda podem ser semeadas ou misturadas com células de tecido adiposo associado, essas células-tronco derivadas de tecido adiposo ou lipoaspirado, antes ou simultaneamente à injeção de uma área alvo que sofre de lipodistrofia facial em um indivíduo. Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda podem ser injetadas a cada 3 meses, a cada 6 meses, a cada 9 meses, todos os anos, de dois em dois anos, ou mais, para manter o tratamento.

[0135] Em ainda outra forma de realização, as partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento podem ser utilizadas como suporte para as células úteis à reparação de nervos periféricos. Partículas de fibroína de seda podem ser entregues (por exemplo, através de injeção) para o local do defeito de nervo com ou sem dispositivo adicional para auxiliar a ligação ao terminal nervoso. Para tal propósito, os fatores de crescimento específicos tais como o fator de crescimento do nervo (NGF), que suporta a regeneração do

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83/128 nervo, pode ser adicionado em composições injetáveis e/ou misturado com as partículas de fibroína de seda, antes ou durante a administração. Em tais formas de realização, partículas mais suaves de fibroína de seda, por exemplo, utilizando uma concentração de fibroína de seda de cerca de 0,5 (p/v) a cerca de 3% (p/v), podem ser utilizadas.

Dependendo do microambiente do cérebro, partículas de fibroína de seda mais duras podem também ser utilizadas. As partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis podem ser infundidas com ou adicionadas a fatores terapêuticos adequados de acordo com os métodos descritos acima.

[0136] Quaisquer células aqui descritas podem ser semeadas sobre a superfície de partículas de fibroína de seda aqui descritas. Por exemplo, partículas de fibroína de seda podem ser submersas em um meio de crescimento adequado para as células de interesse, e, em seguida, diretamente expostas às células. As células são deixadas proliferar na superfície e interstícios das partículas de fibroína de seda. As partículas de fibroína de seda são, então, removidas do meio de crescimento, lavadas se necessário, e administradas. Alternativamente, as células podem ser colocadas em um tampão adequado ou meio líquido e puxadas através das partículas de fibroína de seda utilizando filtração a vácuo. As células também podem ser misturadas com uma solução de fibroína de seda antes da formação as partículas de fibroína de seda, capturando de, pelo menos, algumas das células dentro das partículas de fibroína de seda. Em uma outra forma de realização, as células de interesse podem ser dispersas em uma solução apropriada

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84/128 (por exemplo, um meio de crescimento ou tampão) e, em seguida, pulverizadas sobre as partículas de fibroína de seda. Por exemplo, eletro-pulverização envolve sujeitar uma solução contendo as células, com uma viscosidade e concentração adequadas, a um campo eléctrico suficiente para produzir uma pulverização de gotículas carregadas de solução que contém as células.

[0137] Em algumas formas de realização, as partículas de fibroína de seda ou composições injetáveis compreendendo, pelo menos, um agente ativo podem ser utilizadas como uma plataforma para a entrega do fármaco. Por exemplo, as partículas de fibroína de seda podem ser formadas com um agente farmacêutico tanto pelo arraste em ou ligadas às partículas e, em seguida, administradas para dentro do corpo (por exemplo, por injeção, implantação ou mesmo administração por via oral). Em algumas formas de realização, um agente ativo pode ser misturado com partículas de fibroína de seda e/ou composições injetáveis e, em seguida, administrado para dentro do corpo (por exemplo, por injeção, implantação ou mesmo administração por via oral). Para a liberação prolongada ou sustentada, as partículas de fibroína de seda podem ser manipuladas, por exemplo, para modular o seu teor de folha beta, para a sua taxa de retenção de volume e/ou degradação. Para controlar ainda mais o perfil de liberação do fármaco, as partículas de fibroína de seda contendo fármaco farmaceuticamente ativo podem ser misturadas com uma fibroína de seda de fase em gel adicional agindo como um veículo, com ou sem um componente indutor de viscosidade, um agente tensoativo, e/ou um fluido lubrificante incluído

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85/128 como soro fisiológico. As partículas de fibroína de seda terapeuticamente ligadas também podem ser ainda reticuladas para aumentar a estabilidade de prolongamento do período de liberação. Em uma abordagem alternativa, as partículas de fibroína de seda podem ser misturadas com outros polímeros, por exemplo, ácido hialurônico, para prolongar a liberação de determinados fatores de crescimento ou citocinas e para estabilizar a funcionalidade. Além disso, as partículas de fibroína de seda e/ou composições injetáveis podem também ser utilizadas para o revestimento de sistemas de entrega de fármacos coaxiais, por exemplo, por pulverização.

[0138] Conforme aqui utilizado, o termo liberação controlada refere-se à liberação de um fármaco farmaceuticamente ativo durante um período de cerca de sete dias ou mais. Em aspectos dessa forma de realização, uma plataforma de entrega de fármaco que compreende partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis libera um fármaco farmaceuticamente ativo ao longo de um período

de, por exemplo,	pelo	menos	cerca	de	7	dias	após	a
administração,	de	pelo	menos	cerca	de	15	dias	após	a
administração,	de	pelo	menos	cerca	de	30	dias	após	a
administração,	de	pelo	menos	cerca	de	45	dias	após	a
administração,	de	pelo	menos	cerca	de	60	dias	após	a
administração,	de	pelo	menos	cerca	de	75	dias	após	a
administração,	ou	pelo	menos	cerca	de	90	dias	após	a

administração.

[0139] Conforme aqui utilizado, o termo liberação prolongada refere-se à liberação de um fármaco farmaceuticamente ativo durante um período de tempo inferior a cerca de sete dias. Em tais formas de realização,

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86/128 uma plataforma de entrega de fármaco que compreende partículas de fibroína de seda e/ou as composições injetáveis descritas neste documento podem liberar um fármaco farmaceuticamente ativo ao longo de um período de, por exemplo, cerca de 1 dia após a administração, cerca de 2 dias após a administração, cerca de 3 dias após a administração, cerca de 4 dias após a administração, cerca

de 5 dias após	a	administração,	ou cerca de 6	dias	após	a
administração.
[0140]	De	acordo com as	formulações e	métodos	de
processamento	de	partículas de	fibroína de	seda	e	as

aplicações associadas, as composições injetáveis ou as partículas de fibroína de seda podem ser administradas (por exemplo, por injeção), periodicamente, por exemplo, a cada

3 meses, a cada 4	meses,	a cada	5 meses, a cada 6	meses, a
cada 7	meses,	a	cada 8	meses,	a cada 9 meses, a	cada 10
meses,	a cada	11	meses,	a cada	ano, a cada 2 anos	ou mais
tempo.	[0141]	Em	algumas	formas	de realização de	qualquer

uma das aplicações aqui descritas, as composições injetáveis ou as partículas de fibroína de seda podem ser, pelo menos, parcialmente secas, quando administradas em um tecido a ser reparado ou aumentado. Em algumas formas de realização, as composições injetáveis ou as partículas de fibroína de seda podem ser secas (por exemplo, na ausência de um veículo), quando administradas em um tecido a ser reparado ou aumentado.

[0142] Em algumas formas de realização de qualquer uma das aplicações aqui descritas, as composições injetáveis ou as partículas de fibroína de seda podem ser,

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87/128 pelo menos, parcialmente hidratadas, quando administradas em um tecido a ser reparado ou aumentado. Em algumas formas de realização, as composições injetáveis ou as partículas de fibroína de seda podem ser hidratadas (por exemplo, na presença de um veículo injetável, por exemplo, uma solução tampão e/ou lipoaspirado), quando administradas em um tecido a ser reparado ou aumentado.

[0143] Em algumas formas de realização de qualquer uma das aplicações aqui descritas, as composições injetáveis ou as partículas de fibroína de seda podem ser injetadas por via subcutânea, por via submuscular ou por via intramuscular.

[0144] Em algumas formas de realização, os métodos e/ou composições aqui descritos podem ser utilizados na região dérmica. Em algumas formas de realização, os métodos e/ou composições aqui descritos podem ser utilizados na camada de epiderme, camada de derme, camada da hipoderme ou quaisquer combinações dos mesmos.

Dispositivos de entrega e kits compreendendo partículas de fibroína de seda

[0145] Os dispositivos de administração compreendendo uma composição injetável ou partículas de fibroína de seda aqui descritas são também aqui fornecidos. Os dispositivos de entrega podem ser quaisquer dispositivos de liberação convencionais utilizados para fins de injeção, por exemplo, uma seringa. Por conseguinte, um aspecto adicional aqui fornecido é uma seringa que compreende uma composição injetável ou partículas de fibroína de seda.

[0146] Em algumas formas de realização, o dispositivo de entrega (por exemplo, uma seringa) pode

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88/128 ainda compreender uma agulha. Em algumas formas de realização, o dispositivo de entrega (por exemplo, uma seringa) pode ainda compreender um cateter ou cânula.

[0147] Em várias formas de realização, o dispositivo de entrega (por exemplo, uma seringa) pode incluir um veículo injetável, por exemplo, uma solução tamponada.

[0148] Em várias formas de realização, o dispositivo de entrega (por exemplo, uma seringa) pode incluir um anestésico.

[0149] Além disso é aqui fornecido um kit que compreende uma forma de realização de uma composição injetável ou partículas de fibroína de seda embaladas em uma seringa com uma agulha ou cânula. Em algumas formas de realização, um anestésico local pode ser misturado com a composição injetável ou partículas de fibroína de seda no interior da seringa. Em formas de realização alternativas, um anestésico local pode ser empacotado em um recipiente separado ou em seringas separadas. Por exemplo, é desejável aplicar uma anestesia local a um tecido alvo a ser tratado, antes do tratamento adicional. Um anestésico exemplar inclui, mas não está limitado a, lidocaína. Dependendo do aplicativo, o kit pode incluir tamanhos de seringas de 0,5 ml a 60 ml, onde as aplicações requerem volumes maiores (por exemplo, enchimentos de osso, enchimentos de disco) são fornecidas em um tamanho da seringa maior. Além disso, o calibre da agulha pode ajustado de acordo com o local da injeção com uma faixa aceitável de agulhas de 10 g a 30 g. Por exemplo, agulhas de 26 g a 30 g podem ser utilizadas para injeções intradérmicas.

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[0150] Em algumas formas de realização, o kit pode ainda compreender uma pluralidade de seringas (cada um com uma agulha) contendo uma composição injetável ou partículas de fibroína de seda aqui descritas. Cada seringa pode ser empacotada individualmente.

[0151] Em algumas formas de realização, o kit pode ainda compreender um recipiente contendo uma solução tampão ou um veículo de injeção.

[0152] Em algumas formas de realização, o kit pode ainda compreender, pelo menos, uma seringa vazia adicional. Em algumas formas de realização, o kit pode ainda compreender, pelo menos, uma agulha adicional. Em algumas formas de realização, o kit pode ainda compreender, pelo menos, um cateter ou cânula.

Formas de realização dos vários aspectos aqui descritos podem ser ilustradas pelos seguintes parágrafos numerados:

1. Um método para reparar ou aumentar um tecido de um indivíduo, que compreende: injetar no tecido a ser reparado ou aumentado uma composição compreendendo uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, em que pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

2. O método do parágrafo 1, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 3 meses.

3. O método do parágrafo 2, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no

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90/128 interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 meses.

	4. O	método de quaisquer dos	parágrafos	1-3,	em
que a	referida	pelo menos uma porção	de partículas	de
fibroína de seda	retém, pelo menos, ce	rca de 60%	do	seu
volume	original	no interior do tecido	por, pelo	menos,

cerca de 6 semanas.

5. O método do parágrafo 4, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 70% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

6. O método do parágrafo 5, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 80% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

7. O método de quaisquer dos parágrafos 1-6, em

que a	referida	pelo menos	uma	porção	de	partículas	de
fibroína de seda	retém, pelo menos, cerca	de 70% do	seu
volume	original	no interior	do tecido	por,	pelo menos	, 3
meses.
	8. O	método de quaisquer dos	parágrafos 1-7,	em
que a	referida	pelo menos	uma	porção	de	partículas	de
fibroína de seda	é adaptada	para	degradar não mais do	que
50% do	seu volume original	em,	pelo	meno	s, cerca de 6

semanas.

9. O método do parágrafo 8, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 50% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 3 meses.

10. O método de quaisquer dos parágrafos 1-9, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de

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91/128 fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 30% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 6 semanas.

11.	O método	do parágrafo	10,	em que	a referida
pelo menos uma	porção	de partículas	de	fibroína	de seda é
adaptada para	degradar	não mais do	que	10% do	seu volume

original em, pelo menos, cerca de 6 semanas.

12. O método de qualquer dos parágrafos 1-11, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 30% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 3 meses.

13. O método de qualquer dos parágrafos 1-12, em que as partículas de fibroína de seda são porosas.

14. O método do parágrafo 13, em que as partículas de fibroína de seda porosas têm uma porosidade de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, ou pelo menos cerca de 30%.

15. O método do parágrafo 14, em que as partículas de fibroína de seda porosas têm uma porosidade de, pelo menos, cerca de 50%.

16. O método do parágrafo 15, em que as partículas de fibroína de seda porosas têm uma porosidade de, pelo menos, cerca de 70%.

17. O método de qualquer dos parágrafos 13-16, em que os poros têm um tamanho de cerca de 10 nm a cerca de 1000 pm.

18. O método do parágrafo 17, em que os poros têm um tamanho de cerca de 1 pm a cerca de 1000 pm.

19. O método de qualquer dos parágrafos 1-18, em

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92/128 que as partículas de fibroína de seda têm um tamanho de cerca de 500 nm a cerca de 5000 pm.

20.	O método	do	parágrafo	19,	em	que	as
partículas de fibroína de a cerca de 2000 pm.	seda	têm um tamanho	de cerca	de 1
21.	O método	do	parágrafo	20,	em	que	as

partículas de fibroína de seda têm um tamanho de cerca de 10 pm a cerca de 1500 pm.

22. O método de qualquer dos parágrafos 1-21, em que as partículas de fibroína de seda porosas são reduzidas a partir de uma fibroína de seda porosa no estado sólido por meios mecânicos.

23. O método do parágrafo 22, em que o meio mecânico é selecionado a partir do grupo constituído por micronização, moagem, pulverização, esmagamento, trituração, corte e quaisquer combinações destes.

24. O método de qualquer dos parágrafos 22-23, em que a fibroína de seda porosa no estado sólido é formada por um método de lixiviação porogênico.

25. O método de qualquer dos parágrafos 1-24, em que a composição ou as partículas de fibroína de seda compreende (m) ainda, pelo menos, um agente ativo.

26. O método do parágrafo 25, em que o pelo menos um agente ativo é um agente biologicamente ativo, um agente cosmeticamente ativo, um agente de ligação celular, um agente de contraste ou quaisquer combinações dos mesmos.

27. O método do parágrafo 26, em que o agente biologicamente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste em um fármaco, um agente terapêutico, um anestésico, um fator de crescimento celular, um peptídeo,

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93/128 um peptidomimético, um anticorpo ou uma sua porção, uma molécula semelhante a anticorpo, ácido nucleico, um polissacarídeo e quaisquer combinações destes.

O método do parágrafo 26, em que o agente de ligação celular é selecionado de entre o grupo que consiste em ácido hialurônico, colágeno, ácido hialurônico/colágeno reticulados, uma molécula de ligação a integrina, quitosano, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, proteoglicanos, qualquer dos seus derivados e quaisquer combinações destes.

29. O método do parágrafo 26, em que o agente cosmeticamente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste de um agente antienvelhecimento, agente antiradicais livres, um antioxidante, um agente hidratante, um agente de branqueamento, um corante, um agente de despigmentação, um agente de proteção solar, um relaxante muscular e quaisquer combinações destes.

30. O método de qualquer dos parágrafos 1-29, em que a composição compreende ainda uma célula.

31. O método do parágrafo 30, em que a célula é uma célula-tronco.

32. O método de qualquer dos parágrafos 1-31, em que a composição compreende ainda um fluido ou concentrado biológico.

33. O método do parágrafo 32, em que o fluido ou concentrado biológico é lipoaspirado, aspirado de medula óssea ou quaisquer combinações dos mesmos.

34. O método de parágrafo 32, em que o fluido ou concentrado biológico é lipoaspirado.

35. O método de qualquer dos parágrafos 32-34,

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94/128 em que a proporção de volume das partículas de fibroína de seda para o fluido ou concentrado biológico varia de cerca de 1:19 a cerca de 12:19.

36. O método de parágrafos 32-34, em que a proporção de volume das partículas de fibroína de seda para o fluido ou concentrado biológico varia de cerca de 3:19 a cerca de 6:19.

37. O método de qualquer dos parágrafos 1-36, em que a composição ou as partículas de fibroína de seda compreende (m) ainda um hidrogel.

38. O método de qualquer dos parágrafos 1-37, em que a composição ou as partículas de fibroína de seda compreende (m) ainda um material de enchimento dérmico.

39. O método do parágrafo 38, em que o material de enchimento dérmico é selecionado a partir do grupo que consiste de poli (metacrilato de metila), microesferas de hidroxiapatita, ácido poli-L-láctico, ácido hialurônico, colágeno e quaisquer combinações destes.

40. O método de qualquer dos parágrafos 1-39, em que a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

41.	O método de qualquer dos	parágrafos	1-40, em
que a injeção	é realizada por via s	ubcutânea,	por via
submuscular ou	por via intramuscular.
42.	O método de qualquer dos	parágrafos	1-41, em

que a injeção é realizada com uma agulha com um calibre de cerca de 25-26.

43. O método de qualquer dos parágrafos 1-42, em que a composição é, pelo menos parcialmente, seca, quando injetada no tecido.

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44. O método de que a composição é, pelo qualquer dos parágrafos 1-43, em menos parcialmente, hidratada, quando injetada no tecido.

45.

O método de qualquer dos parágrafos 1-44, em que o tecido é um tecido mole.

46.

O método do ponto 45, em que o tecido mole é selecionado a partir do grupo consistindo de um tendão, um ligamento, pele, tecido da mama, tecido fibroso, um tecido conjuntivo, músculo e quaisquer combinações destes.

47. O método do parágrafo 46, em que tecido mole é a pele.

48. O método do parágrafo 46, em que tecido mole é um tecido mamário.

49. O método de qualquer dos parágrafos

1-48, em que o indivíduo é um indivíduo mamífero.

50.

O método do ponto 49, em que o indivíduo mamífero é um ser humano.

51.

método de qualquer dos parágrafos 1-50, em que a composição é armazenada ou transportada seca.

52. O método do parágrafo

51, em que a composição é armazenada ou transportada a uma temperatura entre cerca de 0°C e cerca de 60°C.

53. O método do parágrafo

52, em que a composição é armazenada ou transportada a uma temperatura entre cerca de 10°C e cerca de 60°C.

54. O método do parágrafo

53, em que a composição é armazenada ou transportada a uma temperatura entre cerca de 15°C e cerca de 60°C.

55. O método de qualquer dos parágrafos 1-54, em que as partículas de fibroína de seda não incluem um

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96/128 peptídeo anfifílico.

56. O método do parágrafo 55, em que o peptídeo anfifílico compreende uma porção de RGD.

57. A composição

injetável para utilização na

reparação ou aumento de um tecido em um indivíduo, que compreende uma pluralidade de partículas de fibroína de seda, em que pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

58. A composição do parágrafo 57, em que as partículas fibroína de seda excluir um peptídeo anfifílico.

59. A composição do parágrafo 58, em que o peptídeo anfifílico compreende uma porção de RGD.

60. A composição de qualquer dos parágrafos 5759, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 3 meses.

61. A composição de qualquer dos parágrafos 5760, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 50% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 meses.

62. A composição de qualquer dos parágrafos 5761, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 60% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

63. A composição do parágrafo 62, em que a

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97/128 referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 70% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

64. A composição do parágrafo 63, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 80% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, cerca de 6 semanas.

65. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

64, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda retém, pelo menos, cerca de 70% do seu volume original no interior do tecido por, pelo menos, 3 meses.

66. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

65, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 50% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 6 semanas.

67. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

66, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 50% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 3 meses.

68. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

67, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 30% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 6 semanas.

69. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

68, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do

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98/128 que 10% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 6 semanas.

70. A composição de qualquer dos parágrafos 5769, em que a referida pelo menos uma porção de partículas de fibroína de seda é adaptada para degradar não mais do que 30% do seu volume original em, pelo menos, cerca de 3 meses.

71.

A composição de qualquer dos parágrafos 5770, em que as partículas de fibroína de seda são porosas.

72.

A composição do parágrafo 71, em que as partículas de fibroína de seda porosas têm uma porosidade de pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de

10%, pelo menos cerca de

15%, ou pelo menos cerca de 30%.

73.

A composição do parágrafo 72, em que as partículas de fibroína de seda porosas têm uma porosidade de pelo menos cerca de 50%.

74.

A composição do parágrafo 73, em que as partículas de fibroína de seda porosas têm uma porosidade de pelo menos cerca de 70%.

75.

A composição de qualquer dos parágrafos 7174, em que os poros têm um tamanho de cerca nm a cerca de 1000 pm.

76.

A composição do parágrafo 75, em que os poros têm um tamanho de cerca de 1 pm a cerca de

1000 pm.

77. A composição de qualquer dos parágrafos 5776, em que as partículas de fibroína de seda têm um tamanho de cerca de 500 nm a cerca de 5000 pm.

78. A composição do parágrafo 77, em que as partículas de fibroína de seda têm um tamanho de cerca 1 pm

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99/128 a cerca de 2000 pm.

79. A composição do ponto 78, em que as partículas de fibroína de seda têm um tamanho de cerca 10 pm a cerca de 1500 pm.

80. A composição de qualquer dos parágrafos 71-

79, em que as partículas de fibroína de seda porosas são reduzidas a partir de uma fibroína de seda porosa no estado sólido por meios mecânicos.

81. A composição do parágrafo 80, em que o meio mecânico é selecionado a partir do grupo constituído por micronização, moagem, pulverização, esmagamento, trituração, corte e quaisquer combinações destes.

82. A composição do parágrafo 80 ou 81, em que o poro da fibroína de seda porosa no estado sólido é formado por um método de lixiviação porogênico.

83. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

82, em que a composição injetável ou as partículas de fibroína de seda compreende (m) ainda, pelo menos, um agente ativo.

84. A composição do parágrafo 83, em que o pelo menos um agente ativo é um agente biologicamente ativo, um agente cosmeticamente ativo, um agente de ligação celular, um agente de contraste, ou quaisquer combinações dos mesmos.

85. A composição do parágrafo 84, em que o agente biologicamente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste de um agente terapêutico, um anestésico, um fator de crescimento celular, um peptídeo, um peptidomimético, um anticorpo ou uma sua porção, uma molécula semelhante a anticorpo, ácido nucleico, um polissacarídeo e quaisquer combinações destes.

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86. A composição do parágrafo 84, em que o agente de ligação celular é selecionado de entre o grupo que consiste em ácido hialurônico, colágeno, ácido hialurônico/colágeno reticulados, uma molécula de ligação a integrina, quitosano, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, proteoglicanos, quaisquer seus derivados e quaisquer suas combinações.

87. A composição do parágrafo 84, em que o agente cosmeticamente ativo é selecionado a partir do grupo que consiste de um agente antienvelhecimento, agente antiradicais livres, um antioxidante, um agente hidratante, um agente de branqueamento, um corante, um agente de despigmentação, um agente de proteção solar, um relaxante muscular e quaisquer combinações destes.

88. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

87, compreendendo ainda uma célula.

89. A composição do parágrafo 88, em que a célula é uma célula-tronco.

90. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

89, que compreende ainda um fluido ou concentrado biológico.

91. A composição do parágrafo 90, em que o fluido ou concentrado biológico é lipoaspirado, aspirado de medula óssea ou quaisquer combinações dos mesmos.

92. A composição do parágrafo 90, em que o fluido ou concentrado biológico é lipoaspirado.

93. A composição de qualquer dos parágrafos 90-

92, em que a proporção de volume das partículas de fibroína de seda para o fluido ou concentrado biológico varia de cerca de03:19 a cerca de 6:19.

94. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

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93, em que a composição injetável ou as partículas de fibroína de seda compreende (m) ainda um hidrogel.

95.

A composição de qualquer dos parágrafos

5794, em que a composição injetável ou as partículas de fibroína de seda compreende (m) ainda um material de enchimento dérmico.

96. A composição do ponto 95, em que o material de enchimento dérmico é selecionado a partir do grupo que consiste de poli(metacrilato de metila), microesferas de hidroxiapatita, ácido poli-L-láctico, ácido hialurônico, colágeno e quaisquer combinações dos mesmos.

97. A composição de qualquer dos parágrafos 57-

96, em que a composição injetável compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

98.	A	composição	de qualquer	dos	parágrafos 57-
97, em que	a	composição	injetável	é	armazenada ou
transportada	seca	.
99.	A	composição	do parágrafo	98, em que a

composição injetável é armazenada ou transportada a uma temperatura entre cerca de 0°C e cerca de 60°C.

100. A composição do parágrafo 99, em que a composição injetável é armazenada ou transportada a uma temperatura entre cerca de 10°C e cerca de 60°C.

101. A composição do parágrafo 100, em que a composição injetável é armazenada ou transportada a uma temperatura entre cerca de 15°C e cerca de 60°C.

102. Um dispositivo de liberação compreendendo uma composição injetável de qualquer um dos parágrafos 57101.

103. O dispositivo de entrega de parágrafo 102,

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102/128 compreendendo ainda uma seringa.

104. O dispositivo de entrega de parágrafo 103, em que a seringa compreende ainda uma agulha.

105. O dispositivo de entrega de qualquer um dos parágrafos 102-104, compreendendo ainda um cateter.

106. O dispositivo de entrega de qualquer um dos parágrafos 102-105, compreendendo ainda um veículo injetável.

107. Uma seringa compreendendo uma composição injetável de qualquer um dos parágrafos 57-101.

108. A seringa de parágrafo 107, compreendendo ainda uma agulha.

109. A seringa de parágrafo 107 ou 108, compreendendo ainda um cateter.

110. A seringa de qualquer dos parágrafos 107-109, compreendendo ainda um veículo injetável.

Algumas definições de termos selecionados

[0153] Conforme aqui utilizado, um indivíduo significa um humano ou animal. Normalmente, o animal é um vertebrado, tal como um primata, roedor, animal doméstico ou de caça. Primatas incluem chimpanzés, macacos cynomologous, macacos-aranha e macacos, por exemplo, Rhesus.

Roedores incluem camundongos, ratos, marmotas, furões, coelhos e hamsters. Os animais domésticos e de caça incluem vacas, cavalos, porcos, veados, bisontes, búfalos, espécies de felinos, por exemplo, gato doméstico, espécie canina, por exemplo, cão, raposa, lobo, espécies de aves, por exemplo, frango, ema, avestruz, e peixes, por exemplo, truta, peixe-gato e salmão. Em certas formas de realização dos aspectos aqui descritos, o indivíduo é um mamífero, por

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103/128 exemplo, um primata, por exemplo, um ser humano. Um indivíduo pode ser masculino ou feminino. De preferência, o indivíduo é um mamífero. O mamífero pode ser um humano, primata não-humano, camundongo, rato, cão, gato, cavalo ou vaca, mas não estão limitados a estes exemplos. Mamíferos diferentes dos seres humanos podem ser vantajosamente utilizados como indivíduos que representam modelos animais de reparação, regeneração e/ou reconstrução de tecidos. Além disso, os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para tratar animais domésticos e/ou animais de estimação.

[0154] O termo estatisticamente significativo ou significativamente refere-se a significância estatística e, geralmente, significa um desvio padrão de dois (2 DP) acima ou abaixo de um nível de referência. O termo referese a evidência estatística de que existe uma diferença. Ele é definido como a probabilidade de tomar uma decisão de rejeitar a hipótese nula quando a hipótese nula é realmente verdade. A decisão é muitas vezes feita com o valor de p.

[0155] Conforme aqui utilizado, os termos proteína e peptídeos são aqui utilizados indiferentemente para designar uma série de resíduos de aminoácidos ligados a outros por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carboxila de resíduos adjacentes. Os termos proteína e peptídeo, que são aqui utilizados indiferentemente, referem-se a um polímero de aminoácidos da proteína, incluindo os aminoácidos modificados (por exemplo, fosforilados, glicosilados, etc.) e análogos de aminoácidos, independentemente do seu tamanho ou função. Apesar de proteína ser frequentemente utilizado em

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104/128 referência a polipeptídeos relativamente grandes, e peptídeo ser muitas vezes utilizado em referência aos polipeptídeos pequenos, o uso destes termos na arte sobrepõe e varia. O termo peptídeo, tal como aqui utilizado, refere-se a peptídeos, polipeptídeos, proteínas e fragmentos de proteínas, a menos que indicado de outra forma. Os termos proteína e peptídeo são utilizados alternadamente aqui para se referir a um produto do gene e dos seus fragmentos. Assim, os peptídeos ou proteínas exemplares incluem produtos de genes, proteínas que ocorrem naturalmente, seus homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, fragmentos e análogos dos anteriores.

[0156] O termo ácidos nucleicos aqui utilizado refere-se a polinucleotídeos como ácido desoxirribonucleico (DNA) e, quando apropriado, ácido ribonucleico (RNA), os seus polímeros tanto na forma de fita simples ou fita dupla. A menos que especificamente limitado, o termo engloba ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes ao ácido nucleico de referência e são metabolizados de forma semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. Salvo indicação em contrário, uma sequência de ácido nucleico particular abrange também implicitamente variantes modificadas de forma conservadora da mesma (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, as substituições de códons degenerados podem ser alcançadas através da geração de sequências nas quais a terceira posição de um ou

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105/128 mais (ou todos) códons selecionados é substituída com resíduos de base mista e/ou desoxinosina (Batzer et al. , Nucleic Acid Res 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol.

Chem. 260:2605-2608 (1985), e Rossolini et al., Mol. Cell.

Probes 8:91-98 (1994)). O termo ácido nucleico também deve ser entendido como incluindo, como equivalentes, derivados, variantes e análogos tanto de RNA quanto DNA feitos a partir de análogos de nucleotídeos, e, polinucleotídeos de fita simples (sense ou antisense) e dupla.

[0157] O termo curtas de RNA de interferência (siRNA), também referido aqui como pequeno RNA interferente é definido como um agente que funciona para inibir a expressão de um gene alvo, por exemplo, por RNAi.

Um siRNA pode ser quimicamente sintetizado, pode ser produzido por transcrição in vitro, ou pode ser produzido dentro de uma célula hospedeira. As moléculas de siRNA também podem ser geradas por clivagem de ARN de cadeia dupla, em que uma fita é idêntica à mensagem a ser inativada. O termo siRNA refere-se a pequenas cadeias duplas de ARN inibidores que induzem a interferência de RNA (RNAi). Estas moléculas podem variar em comprimento (geralmente 18-30 pares de bases) e conter vários graus de complementaridade ao seu RNAm alvo na cadeia antisense. Alguns, mas não todos, os siRNA têm bases desemparelhadas salientes em 5' ou 3' da cadeia sense 60 e/ou a cadeia antisense. O termo siRNA inclui cadeias duplas de duas fitas separadas, bem como as cadeias simples que podem formar estruturas hairpin que compreendem uma região de dúplex.

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[0158] O termo shRNA conforme aqui utilizado refere-se a RNA hairpin curto que funciona como espécies de RNAi e/ou siRNA, mas difere em que as espécies de shRNA são estruturas do tipo hairpin de cadeia dupla para o aumento da estabilidade. O termo RNAi conforme aqui utilizado refere-se a RNA de interferência, ou moléculas de ARN de interferência são moléculas de ácidos nucleicos ou seus análogos, por exemplo, moléculas à base de RNA, que inibem a expressão gênica. RNAi refere-se a um meio de silenciamento de genes pós-transcricional seletivo. RNAi

pode resultar	na	destruição	de mRNA específico,	ou	impede o
processamento	ou	tradução de	ARN, tal	como	mRNA.
[0159]	O	termo enzimas, tal	como	aqui	ut	ilizado,
refere-se a uma	molécula de	proteína	que	catalisa	reações

químicas de outras substâncias sem ser destruída ou substancialmente alterada após a conclusão das reações. O termo pode incluir enzimas que ocorrem naturalmente e as enzimas de bioengenharia ou suas misturas. Exemplos de famílias de enzimas incluem quinases, desidrogenases, oxidoreductases, GTPase, carboxil-transferase, acil transferase, decarboxilases, transaminases, racemases, metil transferases, formil transferases e αcetodecarboxilases.

[0160] Conforme aqui utilizado, o termo aptâmeros significa uma cadeia simples, cadeia parcialmente simples, cadeia parcialmente dupla ou sequência de nucleotídeos de cadeia dupla, capaz de reconhecer especificamente uma molécula não-oligonucleótido selecionada ou grupo de moléculas. Em algumas formas de realização, o aptâmero reconhece a molécula não oligonucleótido ou grupo de

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107/128 moléculas através de um mecanismo diferente do pareamento de bases de Watson-Crick ou de formação triplex. Aptâmeros pode incluem, sem limitação, os segmentos de sequência definidos e compreendendo sequências de nucleotídeos, ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, análogos de nucleotídeos, nucleotídeos modificados e os nucleotídeos que constituem modificações de espinha dorsal, pontos de ramificação e resíduos não-nucleotídeos, grupos ou pontes. Os métodos para a seleção de aptâmeros de ligação a uma molécula são bem conhecidos na técnica e facilmente acessíveis para um perito na arte.

[0161] Conforme aqui utilizado, o termo anticorpo ou anticorpos refere-se a uma imunoglobulina intacta ou a um fragmento de ligação ao antígeno monoclonal ou policlonal com a Região Fc (fragmento cristalizável) ou fragmento de ligação a FcRn da região Fc. O termo anticorpos também inclui as moléculas semelhantes a anticorpo, tal como os fragmentos de anticorpos, por exemplo, fragmentos de ligação ao antígeno. Fragmentos de ligação ao antígeno podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação a antígeno incluem, inter alia, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, e fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia simples (scFv), anticorpos de domínio simples, anticorpos quiméricos, diacorpos, e polipeptídeos que contêm, pelo menos, uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir ligação ao antígeno específica para o polipeptídeo. Os anticorpos lineares são também incluídos para os fins aqui descritos.

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Os termos Fab, Fc, pFc', F(ab')2 e Fv são empregues com os significados imunológicos normais (Klein, Imunology (John Wiley, New York, NY, 1982); Clark, WR (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque) e Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)). Os anticorpos ou fragmentos de antígeno de ligação específicos para vários antígenos estão comercialmente disponíveis a partir de fornecedores, tais como R & D Systems, BD Biosciences, e-Biosciences e Miltenyi, ou podem ser produzidos contra estes marcadores da superfície celular através de métodos conhecidos aos peritos na arte.

[0162] Conforme aqui utilizado, o termo Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs, ou seja, CDR1, CDR2, e CDR3) refere-se aos resíduos de aminoácidos de um domínio variável de anticorpo na presença dos quais são necessários para a ligação ao antígeno. Cada domínio variável tipicamente tem três regiões CDR identificadas como CDR1, CDR2 e CDR3. Cada região determinante de complementaridade podem compreender resíduos de aminoácidos de uma região determinante de complementaridade, tal como definido por Kabat (isto é, com os resíduos de 24-34 (LI),

50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (HI), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- Ed. Serviço de saúde Pública, Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, Md. (1991)) e/ou os resíduos de um loop hipervariável (isto é, sobre os resíduos 26-32 (LI), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (Hl), 53-55 (H2) e 96-101

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109/128 (H3) no domínio variável da cadeia pesada, Chothia e Lesk J. Mol. Biol 196:901-917 (1987)). Em alguns casos, uma região determinante de complementaridade pode incluir aminoácidos, tanto de uma região CDR definida de acordo com Kabat quanto um loop hipervariável.

[0163] A expressão anticorpos lineares refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al. , Protein Eng., 8 (10):1057-1062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (VH-CH1-VH-CH1) em que, em conjunto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno. Os anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

[0164] As expressões Fv de cadeia simples ou fragmentos de anticorpos scFv, tal como aqui utilizadas, destinam-se a significar os fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. De preferência, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. (Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., SpringerVerlag, New York, páginas 269-315 (1994)).

[0165] O termo diacorpos, como aqui utilizado, refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno, fragmentos que compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) ligado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH - VL). Utilizando um ligante que é

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110/128 demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antígeno. (EP 404.097, WO 93/11161; Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Sd. EUA, P0:6444-6448 (1993)).

[0166] Conforme aqui utilizado, o termo moléculas pequenas refere-se a moléculas naturais ou sintéticas, incluindo, mas não limitado a, peptídeos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, análogos de polinucleotídeos, polinucleotídeos, aptâmeros, nucleotídeos, análogos de nucleotídeos, compostos orgânicos ou inorgânicos (isto é, incluindo compostos heteroorgânicos e organometálicos) tendo um peso molecular inferior a cerca de 10.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 5.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 1.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular inferior a cerca de 500 gramas por mol, e sais, ésteres, e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.

[0167] O termo antibióticos é aqui utilizado para descrever um composto ou composição que diminui a viabilidade de um microrganismo, ou que inibe o crescimento ou a reprodução de um microrganismo. Como utilizado nesta divulgação, um antibiótico tem ainda o objetivo de incluir um agente antimicrobiano, bacteriostático ou bactericida. Exemplos de antibióticos incluem, mas não se limitam a, penicilinas, cefalosporinas, penemas, carbapenemas,

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111/128 monobactamas, aminoglicosidos, sulfonamidas, macrolidos, tetraciclinas, lincosídeos, quinolonas, cloranfenicol, vancomicina, metronidazol, rifampicina, isoniazida, espectinomicina, trimetoprim e sulfametoxazol.

[0168] O termo agentes terapêuticos é reconhecido na arte e refere-se a qualquer unidade química que é uma substância biológica, fisiológica ou farmacologicamente ativa que age localmente ou sistemicamente em um indivíduo. Exemplos de agentes terapêuticos, também referidos como fármacos, estão descritos em referências da literatura bem conhecidas, tais como o índice Merck, Physicians Desk Reference, e The Pharmacological Basis of Therapeutics, e incluem, sem limitação, medicamentos; vitaminas;

suplementos minerais; substâncias utilizadas para o tratamento, prevenção, diagnóstico, cura ou mitigação de uma doença ou enfermidade; substâncias que afetam a estrutura ou função do corpo; ou pró-fármacos, que se tornam biologicamente ativos ou mais ativos após terem sido colocados em um ambiente fisiológico. Várias formas de um agente terapêutico podem ser utilizadas que são capazes de serem liberadas da composição do indivíduo para os tecidos adjacentes ou fluidos por administração a um indivíduo. Exemplos incluem esteróides e ésteres de esteróides (por exemplo, estrogênio, progesterona, testosterona, androsterona, colesterol, noretindrona, digoxigenina, ácido eólico, ácido deoxicólico e ácido quenodesoxicólico), compostos contendo boro (por exemplo, carborano), nucleotídeos quimioterapêuticos, fármacos (por exemplo, antibióticos, antivirais, antifúngicos), enediinos (por exemplo, caliqueamicinas, esperamicinas, dinemicina,

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112/128 cromóforo de neocarzinoestatina e cromóforo cedarcidina), complexos de metais pesados (por exemplo, cisplatina), antagonistas de hormônios (por exemplo, tamoxifeno), proteínas não-específicas (não-anticorpo) (por exemplo, oligômeros de açúcar), oligonucleotídeos (por exemplo, oligonucleotídeos antisense que se ligam a uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, sequência de mRNA)), peptídeos, proteínas, anticorpos, agentes fotodinâmicos (por exemplo, rodamina 123), radionuclídeos (por exemplo, I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166,

Sm-153, Cu-67 e Cu-64), toxinas (por exemplo, rícino), e produtos farmacêuticos à base de transcrição.

[0169] Tal como aqui utilizado, o termo hormônios geralmente refere-se a hormônios de ocorrência natural ou não natural, análogos e mímicos dos mesmos. Em certas formas de realização, o termo hormônios refere-se a todos os hormônios utilizados no tratamento terapêutico, por exemplo, o tratamento de hormônio de crescimento. Tal como aqui utilizado, hormônio de crescimento ou GH refere-se ao hormônio de crescimento na sequência nativa ou em forma variante, e de qualquer fonte, quer natural, sintética, ou recombinante. Exemplos incluem o hormônio de crescimento humano (hGH), que é GH natural ou recombinante com a sequência nativa humana (somatotropina ou somatropina), e hormônio de crescimento recombinante (rGH), que se refere a qualquer GH ou variante produzida por meio de tecnologia de

DNA recombinante, incluindo somatrem, somatotropina e somatropina. Em uma forma de realização, hormônios incluem insulina.

[0170] Conforme aqui utilizado, um agente de

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113/128 contraste pode ser qualquer grupo químico que é utilizado para aumentar o grau de diferença entre a parte mais clara e mais escura de uma varredura ou uma geração imagem, por exemplo, durante a verificação médica ou de imagem, em relação a um digitalizar realizada sem o uso de um agente de contraste. Por exemplo, os agentes de contraste podem incluir agentes de imagem contendo radioisótopos tais como índio ou tecnécio; corantes contendo iodo, gadolínio ou cianina; enzimas, tais como peroxidase de rábano, GFP, fosfatase alcalina, ou β-galactosidase; substâncias fluorescentes, tais como os derivados de európio; substâncias luminescentes tais como os derivados N-

metilacrídio	ou	semelhantes.	Em algumas	formas de
realização, os	agentes de contraste podem incluir
nanoparticulas	de	ouro e/ou pontos	de quantum.
[0171]	Conforme aqui	utilizado,	o	termo
substancialmente	significa uma	proporção de	pelo	menos
cerca de 60%,	ou,	de preferência,	pelo menos cerca	de 70%

ou, pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 97%, ou pelo menos cerca de 99% ou mais, ou qualquer inteiro entre 70% e 100%. Em algumas formas de realização, o termo substancialmente significa uma proporção de pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% ou mais, ou qualquer inteiro entre 90% e 100%. Em algumas formas de realização, o termo substancialmente pode incluir 100%.

[0172] Conforme aqui utilizado, o termo compreendendo significa que outros elementos podem também estar presentes, além dos elementos definidos apresentados.

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O uso do termo compreendendo significa a inclusão em vez de limitação.

[0173] O termo constituído por refere-se aos seus componentes, tal como aqui descritos, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado nesta descrição da forma de realização.

[0174] Conforme aqui utilizado, o termo consistindo essencialmente de refere-se aos elementos necessários para uma dada forma de realização. O termo permite a presença de elementos que não afetam materialmente a (s) característica (s) básica (s) e nova (s) ou funcional da forma de realização da invenção.

[0175] Exceto nos exemplos operativos ou onde indicado em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação aqui utilizados devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo cerca de. O termo cerca de quando utilizado em conexão com percentagens pode significar ± 1%.

[0176] Os termos singulares um, uma, e o incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra ou destina-se a incluir e a menos que o contexto indique claramente o contrário. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testes da presente descrição, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. A abreviatura e.g. é derivada do latim exempli gratia, e é aqui utilizado para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviatura e.g. é sinônimo do termo por exemplo.

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[0177] A menos que explicado em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar perito na arte à qual pertence esta divulgação. Definições de termos comuns em doenças e distúrbios, técnicas de separação e detecção podem ser encontradas no The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18^a edição, publicado pela

Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (Eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd.,

1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Global, publicado pelo VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 156081-569-8).

[0178] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada a específica metodologia, protocolos e reagentes, etc., aqui descritos e, como tal, pode variar. A terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas formas de realização particulares, e não se destina a limitar o âmbito da presente invenção, que é definido somente pelas reivindicações.

[0179] Todas as patentes e outras publicações identificadas ao longo da especificação são aqui expressamente incorporadas por referência, com o objetivo de descrever e revelar, por exemplo, os métodos descritos nestas publicações que podem ser utilizados em ligação com o presente invento. Estas publicações são fornecidas somente para sua divulgação antes da data de apresentação do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm

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116/128 direito a antecipar a divulgação em virtude da invenção, antes ou por qualquer outro motivo. Todas as declarações quanto à data ou representação quanto ao conteúdo destes documentos são baseadas na informação disponível aos candidatos e não constituem qualquer admissão quanto à exatidão das datas ou conteúdo desses documentos.

[0180] Algumas formas de realização aqui descritas são ainda ilustradas pelo exemplo seguinte, que não deve ser interpretado como limitante.

[0181] Os conteúdos de todas as referências citadas ao longo deste pedido, os exemplos, assim como as figuras e tabelas, são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Comparação de partículas de suporte de fibroína de seda injetáveis com outros suportes de fibroína de seda ou hidrogéis

Materiais e Métodos exemplares

[0182] Materiais: Todos os produtos químicos e solventes utilizados nos Exemplos para a preparação de suporte de seda foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) a menos que indicado de outra forma. Água estéril e solução salina foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA). Deve notar-se que materiais equivalentes podem ser utilizados e adquiridos a partir de outros vendedores comerciais.

[0183] Preparação de soluções de fibroína de seda: casulos de bicho da seda Bombyx mori foram adquiridos da Tajimia Shoji Co. (Yokohama, Japão). Casulos foram cortados em pedaços, e cozidos em de Na2CO3 0,02 M durante cerca de

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10-60 minutos, e de preferência durante cerca de 30 minutos. As fibras de fibroína de seda resultantes foram enxaguadas em água destilada e deixadas secar. As fibras de fibroína de seda secas foram resolubilizadas em LiBr 9,3 M, a 60°C, durante cerca de 1-4 horas, até à dissolução. A solução de fibroína de seda foi dializada, com um corte de peso molecular de 3500 Daltons, contra água destilada durante pelo menos seis mudanças de água. A solução de fibroína de seda aquosa foi liofilizada até secar e em seguida dissolvida em hexa-fluoro-iso-propanol (HFIP) para se obter uma solução de fibroína de seda à base de solvente 17% (p/v).

[0184] Preparação do suporte de fibroína de seda porosa: suportes de fibroína de seda porosa foram formados a partir de qualquer solvente aquoso ou soluções à base de fibroína de seda (por exemplo, 6% a 20% p/v). Porogênios (por exemplo, sais tais como cloreto de sódio NaCl) foram utilizados com um tamanho variando entre 100 pm e 1,2 mm. Porogênios foram embalados em um recipiente revestido de Teflon, e uma solução de fibroína de seda foi vertida sobre o sal. O recipiente foi coberto e deixado em repouso à temperatura ambiente durante cerca de 1-3 dias. O recipiente foi então deixado descoberto por cerca de 1 dia. O recipiente foi colocado dentro de água destilada para lixiviar o sal. Alternativamente, o suporte pode ser colocado em um banho de metanol ou de recozimento em água por cerca de 1 hora a cerca de 1 dia para induzir ainda formação de folha beta. Em algumas formas de realização, os suportes de fibroína de seda porosa podem ser adicionalmente revestidos com moléculas da matriz

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118/128 extracelular, tais como laminina, para facilitar a fixação das células. Em algumas formas de realização, os suportes de fibroína de seda porosa podem ser revestidos sem moléculas da matriz extracelular.

	[0185]	Preparação de	suportes de	fibroína	de	seda
porosa	injetáveis: suportes	de fibroína	de seda	de	base
aquosa	ou de	solventes foram picados manualmente	ou	por

meios mecânicos, por exemplo, com uma lâmina de rotação, tais como os processadores de alimentos convencionais. Suportes picados foram passadas através de crivos de várias aberturas para obter a faixa de tamanhos desejada. Os suportes picados foram deixados secar e então auto clavados para esterilizar. Os suportes auto clavados, secos, picados (denominado como partículas de suporte de fibroína de seda abaixo) são armazenados à temperatura ambiente até o uso.

[0186] Preparação de hidrogéis de fibroína de seda injetáveis (géis de vortex de fibroína de seda): Solução aquosa de fibroína de seda (por exemplo, «4% p/v) foi esterilizada em primeiro lugar através da passagem por uma unidade de filtro de 0,22 pm. A solução de fibroína de seda esterilizada foi então concentrada, por exemplo, a soluções de «8%, «10%, e «12% p/v, utilizando unidades de filtro de centrífuga (unidade de filtro de centrífuga Ultra-15 Amicon, Millipore, Billerica, MA), de acordo os protocolos dos fabricantes. Para formar os hidrogéis de fibroína de seda injetáveis, um método de centrifugação foi empregue (Yucel et al., 2009 Biophys J. 97:2044). Resumidamente, as soluções aquosas de fibroína de seda foram agitadas (Vortex-Genie 2, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) com

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119/128 potência e tempo variáveis, dependendo do volume e concentração da amostra, até que a solução transparente tornou-se turva. A solução turva foi colocada a «37°C durante cerca de 30 minutos para induzir ainda a gelificação. Após 30 minutos, o hidrogel sozinho ou misturado com lipoaspirado foi carregado em uma seringa e injetado.

[0187] Métodos de injeção: Suportes de fibroína de seda foram injetados por meio de métodos diferentes, por exemplo, por via subcutânea, intramuscular, ou por via submuscular, em uma variedade de preparações. Preparações exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, estado seco, estado seco misturado com lipoaspirado, estado hidratado (por exemplo, em água estéril ou solução salina normal), ou estado hidratado misturado com lipoaspirado.

[0188] Injeções in vivo: Um modelo de rato nu feminino foi utilizado para avaliar os suportes de fibroína de seda e hidrogéis aqui descritos. Outros modelos de mamíferos (por exemplo, rato, coelho, canino, ou modelos suínos) também podem ser utilizados, dependendo das aplicações dos suportes de fibroína de seda injetáveis e tecidos a serem modelados para o tratamento. Ratos de seis meses de idade foram pesados e anestesiados com isoflurano em oxigênio antes da injeção. Um total de cerca de 1 ml foi utilizado por injeção. Resumidamente, partículas de suporte de fibroína de seda secas foram imersas em solução salina ou lipoaspiradas imediatamente antes do carregamento para uma seringa. A seringa preenchida foi ligada a uma cânula não maior do que 2 mm de diâmetro interno. Injeções subcutâneas foram realizadas acima dos músculos peitorais.

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As injeções intramusculares e submusculares foram realizadas entre os músculos peitoral maior e peitoral menor ou por baixo dos músculos peitorais, respectivamente. Um método de injeção subcutânea ventilada foi realizado no dorso do rato. Veja-se, por exemplo, a FIG. 1. As amostras injetadas foram extraídas e avaliadas quanto ao peso, volume de retenção e os resultados histológicos após 1, 2, 10, 30 dias. Retenção de volume foi realizada por dois métodos, por exemplo, medidas de escala e deslocamento de volume. Em algumas formas de realização, suportes de fibroína de seda porosa inteiros (5 mm de diâmetro x 2 mm de altura) foram implantados nos mesmos locais, para comparação.

[0189] Histologia: Os explantes foram cortados ao meio e fixados em formol a 10% durante a noite a 4°C. Um grupo foi embebido no meio de congelamento OCT, crioseccionado em de 10 pm, e corados com Oil Red O. A metade restante foi colocada através de uma série de etapas de desidratação, incluída em parafina e cortadas em seções de 10 pm. Três seções contínuas foram colocadas em cada lâmina, e coradas de acordo com métodos histológicos padrão para hematoxilina e eosina (H & E), ou processados para imuno-histoquímica. Após a recuperação de antígenos, as seções foram incubadas com CD31, CD68, CD80, CD163 antirato primário, anticorpos anti-humanos de núcleo por cerca de 1 hora. As seções foram então incubadas com anticorpos secundários biotinilados originados nas espécies de anticorpos primários durante cerca de 1 hora. O kit de detecção de anticorpo Vector Labs ABC foi utilizado juntamente com um substrato DAB para aumentar a expressão

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121/128 colorimétrica.

RESULTADOS

[0190] Em algumas formas de realização, géis de vórtex de fibroína de seda, sozinhos ou misturados com lipoaspirado, podem ser reabsorvidos mais depressa do que lipoaspirado sozinho em um estudo de 6 semanas. Por conseguinte, algumas formas de realização do gel de vórtex de fibroína de seda pode não ser ideal para aplicações que necessitam de um tamanho e/ou retenção por um período de tempo prolongado, tal como 6 ou mais semanas. No entanto, em algumas formas de realização, as propriedades de retenção do volume do gel de vórtice de fibroína de seda pode ser ajustado, por exemplo, através da modulação da concentração de fibroína de seda, e/ou centrifugação, ou taxa de corte da solução de fibroína de seda.

[0191] Os suportes de fibroína de seda porosa implantados podem manter a sua forma e tamanho ao longo de um período de tempo prolongado. No entanto, os suportes de fibroína de seda porosa implantados, geralmente, requerem uma ou mais incisões para serem colocados. Além disso, os suportes de fibroína de seda porosa são geralmente implantados para preencher um espaço vazio anatômico particular, antes da cirurgia, e/ou eles não podem ser moldados durante a cirurgia para preencher um espaço vazio de forma irregular.

[0192] Ao contrário de géis de vórtex de fibroína de seda ou implantados, um suportes de fibroína de seda porosa injetável (por exemplo, partículas de fibroína de seda aqui descritas) pode servir como uma terapia que é minimamente invasiva e capaz de manter a sua forma e

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122/128 tamanho por, pelo menos, cerca de 1 mês, pelo menos cerca de 2 meses, pelo menos cerca de 3 meses, pelo menos cerca de 4 meses, pelo menos cerca de 6 meses ou pelo menos cerca de 1 ano ou mais, enquanto continua a ser um produto acabado. Embora os suportes de fibroína de seda injetáveis (por exemplo, partículas de fibroína de seda aqui descritas) possam reduzir a administração a um procedimento minimamente invasivo, também podem permitir o cirurgião a moldar de forma flexível os suportes de fibroína de seda injetáveis (por exemplo, em forma de partículas) em qualquer formato ou tamanho do defeito.

[0193] Conforme demonstrado na Tabela 1, foram utilizadas diferentes combinações de vários parâmetros relacionados com os parâmetros de suporte e/ou métodos de injeção para avaliar a aplicação in vivo de suportes de fibroína de seda injetáveis .

Tabela 1: Várias combinações de parâmetros exemplares relacionados com as propriedades das partículas de suporte injetável e métodos de injeção

Diâmetro da Partícula (pm)	Tamanho do poro de um suporte de fibroína de seda (pm)	Veículo de injeção	Estado de hidratação	Local de injeção	Pontos de tempo
Submícron	300-500	Sem veículo	Seco	Subcutâneo	1 dia
1-5	850-1000	Soro	Hidratado	Intramuscular	2 dias
5-20		Lipoaspirado	(salino)	Submuscular	10 dias
20-50					14 dias
50-100					1 mês
100-250
500-750
750-1000
1000-2000

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[0194]	Em	algumas	formas de	realização, foram
utilizados dois métodos	diferentes	de processamento	de
fibroína	de	seda	para alterar a taxa de degradação	de
fibroína	de	seda	Foi	previamente	demonstrado que	os
implantes	de	suporte de	fibroína de	seda porosa em	um

modelo de rato subcutâneo degrada dentro de 3-6 meses, quando preparado com o método aquoso, mas permanecem por, pelo menos até 2 anos, quando preparados com o método à base de solvente (Wang et al. 2008. Biomaterials 29:3415). Deste modo, qualquer método pode ser utilizado para preparar suportes de fibroína de seda injetáveis, dependendo das propriedades desejadas dos suportes, aplicações e/ou tecidos a serem tratados. Em algumas formas de realização, podem ser utilizados métodos aquosos para a preparação de suportes de fibroína de seda injetáveis. Em outras formas de realização, podem ser utilizados métodos à base de solvente para a preparação de suportes de fibroína de seda injetáveis. Neste Exemplo, suportes de fibroína de seda injetáveis preparados por ambos os métodos de base aquosa e de solvente foram estudados para avaliar a integração depois de o material de fibroína de seda ser completamente desaparecido e integração a longo prazo do material. Os pontos de tempo iniciais (por exemplo, 1-2 dias) podem ser utilizados para avaliar sinais de inflamação aguda, enquanto que os pontos de tempo posteriores são avaliados para a integração total do tecido, vascularização, retenção de volume e degradação do suporte.

[0195] Uma outra variável a ser avaliada foi faixa de tamanho dos poros. Poros menores, 300-500 pm foram comparados com poros maiores, 850-1000 pm. Além disso,

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124/128 vários diâmetros das partículas de suporte de fibroína de seda injetáveis, tal como mostrado na Tabela 1, foram avaliados. Em algumas formas de realização, partículas de suporte de fibroína de seda injetáveis menores do que alguns pm podem também ser produzidas. Em algumas formas de realização, como as partículas de suporte de fibroína de seda são degradantes, não produzem uma resposta inflamatória adversa devido ao seu tamanho. Como mostrado na Tabela 1, as partículas de suporte de fibroína de seda podem ser secas ou hidratadas. Uma das vantagens da utilização de partículas de suporte de fibroína de seda secas é que elas podem ser utilizadas prontas para uso. Outra vantagem das partículas secas é a sua capacidade de infundir as partículas de suporte, enquanto eliminando a necessidade de pré-hidratar.

[0196] Os diferentes locais de injeção, como mostra a Tabela 1, se destinam a representar exemplos de locais de injeção clínicos para uma variedade de aplicações, mas eles não devem ser interpretados como limitantes. Por exemplo, injeções subcutâneas podem ser representativas dos enchimentos de defeitos dos tecidos moles; injeções subcutânea, intramuscular e submuscular podem ser representativas da reconstrução da mama.

[0197] Em algumas formas de realização, os suportes de fibroína de seda injetáveis (por exemplo, não semeado ou célula-semeado) podem também aumentar a vascularização de um tecido a ser tratado, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou

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125/128 mais, em comparação com um tecido não-tratado ou um tecido tratado com composições injetáveis sem ser de seda.

[0198] Em algumas formas de realização, os suportes de fibroína de seda injetáveis semeados com células, por exemplo, ASC ou lipoaspirado, também podem aumentar a sua integração com o tecido do hospedeiro em, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais, em comparação com um tecido tratado com suportes de fibroína de seda injetáveis não semeados.

[0199] Em algumas formas de realização, os suportes de fibroína de seda injetáveis semeados com células, por exemplo, ASC ou lipoaspirado, pode aumentar a regeneração do tecido adiposo por, pelo menos, cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais, em comparação com um tecido tratado com suportes de fibroína de seda injetáveis não semeados.

Exemplo 2. Estudos in vivo de suportes porosos de fibroína de seda injetáveis

Materiais e Métodos exemplares

[0200] Preparação de suportes porosos de fibroína de seda injetáveis: Em formas de realização particulares, suportes porosos de fibroína de seda foram formados a partir de soluções de seda à base de solventes (17% p/v). Porogênios podem ser utilizados para criar poros com os suportes. Em certas formas de realização, NaCl porogênios com um tamanho que varia de cerca de 300-500 pm foram

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126/128 utilizados. Em certas formas de realização, NaCl porogênio com um tamanho que varia de cerca de 850-1000 pm foram utilizados. NaCl porogênio foi empacotado em um recipiente revestido de Teflon, e uma solução de seda foi vertida sobre o sal. O recipiente foi coberto e deixado em repouso à temperatura ambiente durante 1-3 dias. O recipiente foi, em seguida, deixado descoberto durante 1 dia. O recipiente foi colocado dentro de água destilada para lixiviar o sal.

Em algumas formas de realização, os suportes de seda resultantes foram colocados em um banho de metanol durante 1 dia para induzir ainda a formação de folha beta. Suportes porosos de fibroína de seda injetáveis podem então ser produzidos utilizando os métodos descritos no Exemplo 1, por exemplo, pela redução do suporte poroso de fibroína de seda em pedaços menores. Veja-se, por exemplo, FIG. 2.

[0201] Preparação de lipoaspirado processado:

Lipoaspirado de cirurgia plástica eletiva foi obtido no mesmo dia da injeção do suporte. O lipoaspirado foi transportado de forma asséptica em temperatura ambiente logo após a cirurgia. Aproximadamente 30 ml de lipoaspirado foi adicionado a um tubo cônico de 50 ml e centrifugado à temperatura ambiente a 1000 rpm durante 10 minutos. O sangue e lipídios livres foram removidos. O tecido restante foi colocado em placas de Petri estéreis. Os suportes porosos de fibroína de seda injetáveis foram colocados no lipoaspirado processado durante 1 hora antes da injeção.

[0202] Métodos de injeção: 1 ml de suportes porosos de fibroína de seda picado e lipoaspirado foi elaborado para uma seringa de 1 ml. As relações de volume finais do lipoaspirado para suportes de seda pode variar de 19:3

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127/128 (dose baixa) a 19:6 (dose alta). Em algumas formas de realização, a mistura de suporte injetável e lipoaspirado foi injetada por via subcutânea através de uma agulha de calibre 24, em um estado hidratado com lipoaspirado, nas costas de um rato atímico. Veja-se, por exemplo, FIG. 1.

[0203] Histologia: Amostra de explante e construtos foram processados de acordo com os protocolos de histologia padrão. As amostras fixadas em formalina foram colocadas em uma série de solventes da desidratação e, finalmente, parafina utilizando um processador de tecidos automatizado. As amostras foram embebidas em parafina, cortados em seções de 10 gm, e deixadas aderir em lâminas de vidro. Os cortes foram reidratados e corados com hematoxilina e eosina, e fotografados.

RESULTADOS

[0204] Em 6 semanas após a injeção, os ratos foram sacrificados e os materiais injetados foram colhidos. As massas extraídas foram medidas para o seu peso e massa. Nenhuma diferença na mudança de peso relativo ou variação da massa foram encontrados com partículas de fibroína de seda produzidos a partir de fibroína de seda porosa no estado sólido de porosidades diferentes (por exemplo, poros de 300-500 gm vs poros de 850-1000 gm) ou proporções relativas de suporte de fibroína de seda para lipoaspirado (por exemplo, 3:19 vs 6:19) a tal ponto do tempo.

[0205] Conforme mostrado na FIG. 3, o lipoaspirado injetado (setas de linha) foi detectado em todos os grupos. Dentro do lipoaspirado injetado, pedaços de suporte de fibroína de seda injetáveis foram detectados (setas pontilhadas). Os materiais de fibroína de seda injetado não

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128/128 provocam uma resposta pró-inflamatória; contudo macrófagos foram detectados na periferia da massa injetada.

Claims

1. Composição injetável para utilização na reparação ou aumento de um tecido em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de partículas de fibroína de seda porosa, em que pelo menos uma porção das partículas de fibroína de seda porosa retém pelo menos 50% do seu volume original no interior do tecido a ser reparado ou aumentado por pelo menos 6 semanas, em que as partículas de fibroína de seda porosa possuem a porosidade de pelo menos 1%, e em que a fibroína de seda constitui pelo menos 30% em volume da composição total, em que as partículas de fibroína de seda não compreendem um material de hidrogel.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas de fibroína de seda porosa excluem um peptídeo anfifílico.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas de fibroína de seda porosa têm uma porosidade de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 30%.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os poros têm um tamanho de 10 nm a 1000 pm.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas de fibroína de seda porosa têm um tamanho de 500 nm a 5000 pm.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas de fibroína de seda porosa são reduzidas a partir de uma fibroína de seda porosa no estado sólido por um meio mecânico.

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7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição injetável ou as partículas de fibroína de seda porosa compreende(m) ainda pelo menos um agente ativo.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um agente ativo é um agente biologicamente ativo, um agente cosmeticamente ativo, um agente de ligação celular, um agente de contraste ou quaisquer combinações dos mesmos.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma célula.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o agente de ligação celular é selecionado do grupo consistindo em ácido hialurônico, colágeno, ácido hialurônico reticulado, colágeno reticulado, uma molécula de ligação a integrina, quitosano, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, proteoglicanos, quaisquer dos seus derivados e quaisquer combinações destes.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o agente cosmeticamente ativo é selecionado do grupo consistindo em um agente antienvelhecimento, agente anti-radicais livres, um antioxidante, um agente hidratante, um agente de branqueamento, um corante, um agente de despigmentação, um agente de proteção solar, um relaxante muscular e quaisquer combinações destes.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição injetável ou as

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3/3 partículas de fibroína de seda compreende(m) ainda um material de enchimento dérmico.

13. Dispositivo de entrega caracterizado pelo fato de que compreende a composição injetável como definida na reivindicação 1.

14. Dispositivo de entrega, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma seringa.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as partículas de fibroína de seda são suspensas em um veículo.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição inclui ainda lidocaína.