ES2953309T3 - Partículas de fibroína de seda inyectables y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Las invenciones proporcionadas en el presente documento se relacionan con composiciones, métodos, dispositivos de administración y kits para reparar o aumentar un tejido en un sujeto. Las composiciones descritas en el presente documento son inyectables de manera que pueden colocarse en un tejido a tratar con un procedimiento mínimamente invasivo (por ejemplo, mediante inyección) y/o moldearse de manera flexible en un tejido vacío de cualquier forma y/o tamaño. En algunas realizaciones, la composición descrita en el presente documento comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda, que pueden retener su volumen original dentro del tejido durante un período de tiempo. Las composiciones se pueden usar como relleno para reemplazar un vacío de tejido, por ejemplo, para reparación y/o aumento de tejido, o como soporte para soportar la regeneración y/o reconstrucción de tejido. En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar para la reparación o aumento de tejidos blandos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Partículas de fibroína de seda inyectables y usos de las mismas

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio a tenor de 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de los EE. UU. n.° 61/557.603 presentada el 9 de noviembre de 2011.

Apoyo del gobierno

Esta invención se realizó con apoyo gubernamental en virtud de la subvención n.° EB002520 concedida por los Institutos Nacionales de Salud y la W81XWH-08-2-0032 concedida por el ejército de los Estados Unidos. El gobierno tiene determinados derechos en la invención.

Campo técnico de la divulgación

Las invenciones proporcionadas en el presente documento se refieren a materiales a base de fibroína de seda para aplicaciones biomédicas, p. ej., en la reparación, aumento y/o reconstrucción de tejidos blandos.

Antecedentes

La restauración de defectos de tejidos blandos por trauma, escisión quirúrgica o defectos congénitos debe comenzar con una estrategia que mantenga el tamaño y la forma del tejido a dimensiones casi normales durante períodos de tiempo prolongados. Las estrategias clínicas actuales incluyen transferencias de grasas libres y rellenos artificiales. En el caso de pacientes con cáncer de mama que reciben mastectomías, se usan bolsas de silicona rellenas de solución salina o silicona para reemplazar el vacío. Esto deja al paciente con una apariencia y sensación poco naturales, y el riesgo de contractura capsular que da lugar a una cirugía de revisión. Las opciones de injerto de grasa y relleno artificial no logran retener el volumen con el tiempo. Por lo tanto, las opciones de injerto de grasa y relleno artificial pueden requerir un segundo sitio quirúrgico, tener necrosis avascular y generalmente no regeneran el tejido original.

El colágeno bovino y el humano han ganado un amplio uso como materiales inyectables para el aumento y relleno de tejidos blandos. El colágeno, la principal proteína estructural extracelular del cuerpo animal, se ha usado como material de implante para reemplazar o aumentar el tejido conectivo, tal como piel, tendón, cartílago y hueso. Además, el colágeno se ha inyectado o implantado en el cuerpo humano con fines cosméticos durante varios años. Sin embargo, el uso de colágeno en el aumento y/o relleno de tejidos blandos podría ser costoso y no tiene un efecto duradero, por ejemplo, los resultados a menudo solo duran aproximadamente 3 meses.

El ácido hialurónico (HA) es un glicosaminoglicano que se encuentra naturalmente en el cuerpo humano y se distribuye ampliamente en los tejidos conectivo, epitelial y nervioso. Las composiciones de ácido hialurónico no reticulado tienden a degradarse pocos meses después de la inyección y, por lo tanto, requieren una reinyección bastante frecuente para mantener su efecto de aumento de tejidos blandos. Más recientemente, se han usado composiciones de ácido hialurónico reticulado para el aumento de tejidos blandos. Sin embargo, tales composiciones reticuladas contienen partículas bastante grandes, alrededor de aproximadamente 2 mm cada una, de ácido hialurónico suspendido en un gel. Si bien las partículas más grandes podrían tener un efecto más duradero, el tamaño de partícula más grande puede hacer que la inyección sea más difícil y crear una experiencia desagradable para el receptor.

El documento WO 2010/123945 describe una composición inyectable para su uso en el tratamiento de tejidos blandos, comprendiendo dicha composición partículas porosas de fibroína de seda preparadas moliendo un hidrogel de fibroína de seda.

En resumen, las principales desventajas de las estrategias actuales para la regeneración, reparación y/o aumento de tejidos blandos incluyen una gran cantidad de tejidos necesarios para injertar defectos de tejido grandes; morbilidad del sitio del donador, posibilidad de un segundo sitio quirúrgico, necrosis avascular; pérdida de la forma y/o tamaño de los andamios con el tiempo; desajuste del material con el tejido nativo; y fallo en regenerar tejido. En consecuencia, existe una gran necesidad de desarrollar una estrategia o un andamio que pueda administrarse con un procedimiento mínimamente invasivo y que proporcione una retención sostenida de la restauración del volumen durante al menos 3 meses o más, por ejemplo, durante al menos 6 meses o al menos uno año, mientras que el cuerpo gradualmente remodela y regenera el sitio a una estructura y función tisular casi normales.

Resumen

El alcance de esta invención se define en las reivindicaciones. Cualquier “ realización” o “ ejemplo” que se divulgue en la descripción pero que no esté abarcado por las reivindicaciones debe considerarse como presentado únicamente para fines ilustrativos. Las realizaciones en la descripción relativas a los métodos de tratamiento no están abarcadas por las reivindicaciones.

En consecuencia, un aspecto proporcionado en el presente documento es una composición inyectable para su uso en un método para reparar o aumentar un tejido en un sujeto, comprendiendo dicha composición una pluralidad de partículas porosas de fibroína de seda, en donde las partículas porosas de fibroína de seda no son un hidrogel, en donde las partículas de fibroína de seda retienen al menos el 50 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas, en donde las partículas porosas de fibroína de seda tienen una porosidad de al menos 1 % y un tamaño de 500 nm a 5000 μm.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a dicha composición inyectable para su uso en un método para reparar o aumentar un tejido en un sujeto. El método incluye inyectar en el tejido a reparar o aumentar una composición que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda como se define en las reivindicaciones.

En ciertas realizaciones de las composiciones y métodos proporcionados en el presente documento, las partículas de fibroína de seda pueden excluir un péptido anfifílico. En otras realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden incluir un péptido anfifílico. Un péptido anfifílico ilustrativo puede comprender, por ejemplo, un motivo RGD.

La retención de volumen de las partículas de fibroína de seda puede controlarse, en parte, mediante la modulación de las propiedades de degradación y/o solubilidad de las partículas de fibroína de seda. Según la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda están adaptadas para degradarse no más de 50 % de su volumen original, por ejemplo, que incluye no más de 30 %, no más de 10 %, de su volumen original, en al menos aproximadamente 6 semanas, que incluye al menos aproximadamente 3 meses, 6 meses o más.

Dependiendo del tamaño del defecto del tejido y/o las propiedades deseadas de las partículas de fibroína de seda, el tamaño de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse. Las partículas de fibroína de seda tienen un tamaño adecuado para la inyección en un tejido. Según la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda proporcionadas en el presente documento tienen un tamaño de 500 nm a 5000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 2000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 1500 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 425 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 500 μm a aproximadamente 1200 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 800 μm a aproximadamente 1000 μm.

Las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para imitar la morfología estructural de los tejidos nativos y/o para suministrar un agente activo a un área local de un tejido. Según la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda son porosas. En algunas realizaciones, la porosidad de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para imitar la morfología estructural y/o el gradiente de densidades celulares que se encuentran en el tejido nativo. En algunas realizaciones, la porosidad de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para suministrar un agente activo a un tejido en un perfil de liberación predeterminado. En algunas realizaciones, la porosidad de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para retener al menos una parte de su volumen original durante un período de tiempo. Según la invención reivindicada, las partículas porosas de fibroína de seda tienen una porosidad de al menos el 1 %, p. ej., incluyendo al menos aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 15%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o superior. El tamaño de los poros de dichas partículas porosas de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 2000 μm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 0,5 μm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 1000 μm, o de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas modalidades, el tamaño de los poros de las partículas de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas modalidades, el tamaño de los poros de las partículas de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 8 μm a aproximadamente 1000 μm.

Las partículas de fibroína de seda, en una realización, pueden fabricarse mediante la reducción de una fibroína de seda en estado sólido en partículas. Por ejemplo, una fibroína de seda en estado sólido puede reducirse en partículas mediante un medio mecánico, por ejemplo, pero sin limitarse a, micronización, molienda, pulverización, trituración, molido, corte y cualquier combinación de los mismos. La fibroína de seda en estado sólido puede fabricarse por cualquier método conocido en la técnica. Para producir una estructura porosa de fibroína de seda, puede usarse un método de lixiviación con porógenos o cualquier otro reconocido en la técnica. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden no tener propiedades ópticas, por ejemplo, aunque sin limitación, difracción. En tales realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden producirse a partir de una fibroína de seda en estado sólido sin cualquiera de los elementos ópticos impresos o añadidos a la misma.

La composición inyectable descrita en el presente documento que comprende las partículas de fibroína de seda puede comprender además al menos un agente activo. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda de la composición descrita en el presente documento pueden comprender además al menos un agente activo. Los ejemplos no limitantes de los agentes activos pueden incluir agentes biológicamente activos, agentes cosméticamente activos, agentes de adhesión celular, un material de relleno dérmico y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el agente activo puede ser un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente activo puede ser un agente cosméticamente activo. En algunas realizaciones, el agente activo puede ser un material de relleno dérmico.

En algunas realizaciones, la composición inyectable o la composición que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda puede comprender además al menos una célula, p. ej., una célula madre. En algunas realizaciones, la célula puede ser obtenida a partir de un fluido o concentrado biológico, tal como lipoaspirado, aspirado de médula ósea o cualquier combinación de los mismos.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la composición inyectable o la composición que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda puede comprender además un fluido biológico o concentrado, tal como lipoaspirado, aspirado de médula ósea o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la composición inyectable o la composición que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda puede comprender además un lipoaspirado. En estas realización, la composición o la composición inyectable puede comprender partículas de fibroína de seda y un fluido biológico o concentrado (p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea) en una relación de volumen de aproximadamente 1:38 a aproximadamente 12:19, o de aproximadamente 1:19 a aproximadamente 10:19, o de aproximadamente 2:19 a aproximadamente 8:19. En una realización, la composición o la composición inyectable puede comprender partículas de fibroína de seda y un fluido biológico o concentrado (p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea) en una relación de volumen de aproximadamente 3:19. En otra realización, la composición o la composición inyectable puede comprender partículas de fibroína de seda y un fluido biológico o concentrado (p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea) en una relación de volumen de aproximadamente 6:19.

En algunas realizaciones, la composición descrita en el presente documento puede comprender además un hidrogel, p. ej., en una forma de partículas de hidrogel separadas, y/o distribuirse dentro de las partículas de fibroína de seda.

También se describe en el presente documento que la composición descrita en el presente documento puede inyectarse en un tejido a reparar o aumentar mediante cualquier método conocido en la técnica, p. ej., por vía subcutánea, submuscular o intramuscular. Cuando se inyecta en un tejido, algunas realizaciones de la composición pueden estar al menos parcialmente secas. Alternativamente, la composición puede ser al menos parcialmente hidratada, p. ej., la composición puede comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable, p. ej., una solución tamponada, cuando se inyecta en un tejido. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda en la composición son lo suficientemente pequeñas como para que las partículas de fibroína de seda puedan suministrarse a través de una aguja o un catéter sin ninguna compresión previa antes de introducirse en un tejido a reparar o aumentar.

El tejido a reparar o aumentar con la composición y/o el método descrito en la presente descripción puede ser un tejido blando. Ejemplos ilustrativos de un tejido blando incluyen, pero no se limitan a, un tendón, un ligamento, piel, un tejido mamario, un tejido fibroso, un tejido conectivo, un músculo y cualquier combinación de los mismos. En ciertas realizaciones, el tejido blando es piel. En otras realizaciones, el tejido blando es un tejido mamario.

También se proporciona en el presente documento un dispositivo de suministro que comprende una realización de una composición inyectable y/o partículas de fibroína de seda. Un dispositivo de suministro puede incluir cualquier dispositivo de inyección convencional (p. ej., una jeringa) y/o cualquier dispositivo de administración que sea mínimamente invasivo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, se proporciona en el presente documento jeringas que comprenden una realización de una composición inyectable. La jeringa puede comprender además una aguja, una cánula y/o un catéter. En algunas realizaciones, el dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) puede comprender además un vehículo para inyección, p. ej., una solución tamponada. En algunas realizaciones, el dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) puede comprender además un anestésico local.

En algunas realizaciones de cualquier aspecto descrito en el presente documento, las composiciones y/o dispositivos de suministro pueden almacenarse o transportarse a una temperatura de aproximadamente 0 °C y aproximadamente 60 °C, p. ej., entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 60 °C o entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 60 °C. A tales temperaturas, la bioactividad de los agentes activos incrustados o distribuidos dentro de las partículas de fibroína de seda puede estabilizarse durante un período de tiempo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un método ilustrativo para usar una o más realizaciones de las composiciones inyectables descritas en el presente documento. Los pedacitos porosos de armazones de fibroína de seda (p. ej., formados al reducir una fibroína de seda porosa en estado sólido) pueden mezclarse con lipoaspirado como vehículo, que contiene opcionalmente células madre derivadas de tejido adiposo (ASC), para formar una composición inyectable ilustrativa. Después las composiciones inyectables pueden inyectarse en un sujeto, por ejemplo, un modelo animal.

La Figura 2 muestra imágenes de una o más realizaciones de las composiciones inyectables descritas en el presente documento. Las partículas de armazón de fibroína de seda pueden ser de cualquier tamaño, por ejemplo, de submicrómetros a aproximadamente 2 mm. El panel izquierdo muestra que las partículas de armazón de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 425 μm, mientras que el panel derecho muestra que las partículas de armazón de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 0,8 mm a aproximadamente 1 mm.

La Figura 3 muestra un conjunto de imágenes de hematoxilina y eosina de partículas porosas de fibroína de seda inyectables mezcladas con varias relaciones de lipoaspirado en las 6 semanas posteriores a la inyección. Las partículas porosas de fibroína de seda (con un tamaño de poro de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 500 μm) que se muestran en la primera fila de las imágenes se produjeron micronizando un andamio poroso de fibroína de seda con un tamaño de poro de aproximadamente 300 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros, mientras que las que se muestran en la segunda y tercera filas de las imágenes (partículas de fibroína de seda con un tamaño de poro de aproximadamente 8 μm a aproximadamente 1000 μm) se produjeron a partir de un andamio de fibroína de seda con un tamaño de poro de aproximadamente 850 micrómetros a aproximadamente 1000 micrómetros. El término “ dosis” como se usa en la Figura 3 se refiere a la cantidad de las partículas de fibroína de seda inyectadas en un sujeto, p. ej., un modelo animal. En algunas realizaciones, la dosis puede indicarse mediante la relación de volumen final de las partículas de fibroína de seda con el lipoaspirado. Por ejemplo, las relaciones de volumen finales pueden variar de aproximadamente 3:19 a aproximadamente 6:19.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se describen métodos, dispositivos de suministro y kits para reparar o aumentar un tejido en un sujeto. De acuerdo con las realizaciones de varios aspectos descritos en el presente documento, un formato inyectable de armazones de fibroína de seda, es decir, partículas porosas de fibroína de seda, se colocan mediante inyección en un tejido a reparar o aumentar y retienen el 50 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas. Dichas partículas inyectables de fibroína de seda pueden introducirse en un sitio de defecto con un procedimiento mínimamente invasivo, al tiempo que permiten a un experto en la técnica moldear de manera flexible las partículas inyectables de fibroína de seda para ajustarse a un defecto de cualquier forma y/o tamaño.

Partículas de fibroína de seda

Las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden retener su volumen original tras la administración a un tejido (p. ej., mediante inyección) a reparar o aumentar durante un período de tiempo.

Por “volumen original” en referencia a las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento se entiende generalmente el volumen de las partículas de fibroína de seda medido inmediatamente antes de que las partículas de fibroína de seda se coloquen en un tejido a reparar o aumentar, o el incremento correspondiente en el volumen de tejido medido inmediatamente después de que las partículas de fibroína de seda se coloquen en un tejido a reparar o aumentar. Por ejemplo, el volumen original de partículas de fibroína de seda puede medirse, por ejemplo, dentro de aproximadamente 20 minutos, antes o después de que las partículas de fibroína de seda se coloquen en un tejido a reparar o aumentar. En algunos casos, el volumen original de las partículas de fibroína de seda puede medirse, por ejemplo, aproximadamente 10 segundos, aproximadamente 15 segundos, aproximadamente 20 segundos, aproximadamente 25 segundos, aproximadamente 30 segundos, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos, aproximadamente 3 minutos, aproximadamente 4 minutos, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 6 minutos, aproximadamente 7 minutos, aproximadamente 8 minutos, aproximadamente 9 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 11 minutos, aproximadamente 12 minutos, aproximadamente 13 minutos, aproximadamente 14 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 16 minutos, aproximadamente 17 minutos, aproximadamente 18 minutos, aproximadamente 19 minutos, o aproximadamente 20 minutos, antes o después de que las partículas de fibroína de seda se coloquen en un tejido a reparar o aumentar. En algunas realizaciones, el volumen de las partículas de fibroína de seda antes de la colocación en un tejido puede referirse al volumen de las partículas de fibroína de seda en un estado seco. En realizaciones alternativas, el volumen de las partículas de fibroína de seda antes de la colocación en un tejido puede referirse al volumen de partículas de fibroína de seda en un estado hidratado. En otras realizaciones, el volumen de las partículas de fibroína de seda antes de la colocación en un tejido puede referirse al volumen de partículas de fibroína de seda suspendidas en un fluido o un vehículo. En algunas realizaciones, el volumen de las partículas de fibroína de seda antes de la colocación en un tejido puede referirse al volumen de inyección de la mezcla que comprende las partículas de fibroína de seda.

Como se usa en el presente documento, el término “ retener” se refiere al mantenimiento del volumen (p. ej., tamaño y/o forma) de al menos una parte de las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento durante un período de tiempo. De acuerdo con la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda retienen durante un período de al menos 6 semanas al menos el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % de su volumen original o más. En algunas realizaciones, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede retener el 100 % de su volumen original, p. ej., no hay cambios detectables en el volumen, dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede retener al menos aproximadamente el 50 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede retener al menos aproximadamente el 60 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede retener al menos aproximadamente el 70 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede retener al menos aproximadamente el 80 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. El volumen de las partículas de fibroína de seda colocadas en un tejido puede determinarse o indicarse mediante un cambio en al menos una de las propiedades del tejido, p. ej., el volumen del tejido, la elasticidad del tejido y/o la dureza del tejido. En algunas realizaciones, el volumen de las partículas de fibroína de seda colocadas en un tejido puede determinarse a partir de explantes, p. ej., mediciones de peso y/o desplazamiento de volumen. En una realización, el volumen de las partículas de fibroína de seda colocadas en un tejido puede controlarse y/o medirse mediante formación de imágenes.

Las partículas de fibroína de seda pueden retener al menos una parte de su volumen original durante cualquier período de tiempo, p. ej., semanas, meses o años. De acuerdo con la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda retienen al menos el 50 % de su volumen original (que incluye, p. ej., al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 % o más, de su volumen original) durante al menos 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 1 año, al menos aproximadamente 2 años, al menos 3 años, al menos aproximadamente 4 años, al menos 5 años o más. En ciertas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden retener, p. ej., al menos aproximadamente el 70 % de su volumen original o más, durante al menos aproximadamente 3 meses o más. En otras realizaciones, puede no haber cambios significativos en el volumen de las partículas de fibroína de seda después de colocarlas en un tejido a reparar o aumentar durante al menos aproximadamente 3 meses o más. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden retener, p. ej., al menos aproximadamente el 70% de su volumen original o más, durante al menos aproximadamente 6 meses o más (que incluye, p. ej., al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses o más). En otras realizaciones, puede no haber cambios significativos en el volumen de las partículas de fibroína de seda después de colocarlas en un tejido a reparar o aumentar durante al menos aproximadamente 6 meses o más. En realizaciones particulares, las partículas de fibroína de seda pueden retener al menos aproximadamente el 20 % de su volumen original o más durante al menos aproximadamente 1 año o más (que incluye, p. ej., al menos aproximadamente 2 años, al menos aproximadamente 3 años, al menos aproximadamente 4 años, al menos aproximadamente 5 años o más). En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden retener al menos aproximadamente el 50 % de su volumen original o más durante al menos aproximadamente 1 año o más (que incluye, p. ej., al menos aproximadamente 2 años, al menos aproximadamente 3 años, al menos aproximadamente 4 años, al menos aproximadamente 5 años o más).

La retención de volumen de las partículas de fibroína de seda también puede caracterizarse, p. ej., por la degradación de las partículas de fibroína de seda. Generalmente, cuanto más lento se degradan las partículas de fibroína de seda, más tiempo las partículas de fibroína de seda pueden retener su volumen original en un tejido. En consecuencia, algunas realizaciones proporcionadas en el presente documento están dirigidas a composiciones inyectables para el uso en la reparación o aumento de un tejido en un sujeto, comprendiendo las composiciones una pluralidad de partículas de fibroína de seda, en donde al menos una parte de las partículas de fibroína de seda se adapta para degradarse dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo.

Como se usa en referencia a las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento, el término “ degradar” o “ degradación” se refiere a una disminución en el volumen o el tamaño de las partículas de fibroína de seda. La degradación de las partículas de fibroína de seda puede ocurrir por medio de la escisión de las partículas de fibroína de seda en fragmentos más pequeños y/o la disolución de las partículas de fibroína de seda o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradar no más del 50 %, no más del 40 %, no más del 30 %, no más del 20 %, no más del 10 % de su volumen original o menos. En algunas realizaciones, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede exhibir una degradación no significativa (p. ej., no hay cambios detectables en el volumen) dentro del tejido a reparar o aumentar. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradar no más del 50 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradar no más del 40 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradar no más del 30 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradar no más del 20 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo. En una realización, al menos una parte de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradar no más del 10 % de su volumen original dentro del tejido a reparar o aumentar durante un período de tiempo.

Las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradarse a cualquier velocidad. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradar al menos una parte de su volumen original durante cualquier período de tiempo, p. ej., semanas, meses o años. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradar no más del 50 % de su volumen original (que incluye, p. ej., no más del 40 %, no más del 30 %, no más del 20 % o menos, de su volumen original) en al menos 6 semanas, al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 5 meses, al menos aproximadamente 6 meses, al menos aproximadamente 7 meses, al menos aproximadamente 8 meses, al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 10 meses, al menos aproximadamente 11 meses, al menos aproximadamente 1 año, al menos aproximadamente 2 años, al menos aproximadamente 3 años, al menos aproximadamente 4 años, al menos aproximadamente 5 años o más. En ciertas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradar, p. ej., no más del 30 % de su volumen original o menos, en al menos aproximadamente 3 meses o más. En otras realizaciones, puede haber una degradación no significativa (es decir, no hay cambios detectables en el volumen de las partículas de fibroína de seda) después de colocarlas en un tejido a reparar o aumentar durante al menos aproximadamente 3 meses o más. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradar, p. ej., no más del 30 % de su volumen original o menos, en al menos aproximadamente 6 meses o más (que incluye, p. ej., al menos aproximadamente 9 meses, al menos aproximadamente 12 meses, al menos aproximadamente 18 meses o más). En otras realizaciones, puede haber una degradación no significativa (es decir, no hay cambios detectables en el volumen de las partículas de fibroína de seda) después de colocarlas en un tejido a reparar o aumentar durante al menos aproximadamente 6 meses o más. En realizaciones particulares, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradar no más del 80 % de su volumen original o menos en al menos aproximadamente 1 año o más (que incluye, p. ej., al menos aproximadamente 2 años, al menos aproximadamente 3 años, al menos aproximadamente 4 años, al menos aproximadamente 5 años o más). En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para degradar no más del 50 % de su volumen original o menos en al menos aproximadamente 1 año o más.

La misma formulación o una similar de las partículas de fibroína de seda o las composiciones inyectables puede manifestar diferentes respuestas en un sujeto. Solo a modo de ejemplo, la retención de volumen o la velocidad de degradación de las partículas de fibroína de seda en un tejido puede variar de un sujeto a otro, p. ej., debido a diferentes microambientes del tejido, tales como especies y/o niveles de varias proteínas o enzimas (p. ej., enzimas proteolíticas) presentes en el tejido.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para mantener una tasa de retención de volumen y/o una velocidad de degradación constantes durante un período de tiempo. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden adaptarse para tener una velocidad de retención de volumen o una velocidad de degradación que varía con el tiempo. Por ejemplo, las partículas de fibroína de seda pueden recubrirse con un material polimérico, p. ej., fibroína de seda de una concentración diferente y/o un polímero biodegradable y biocompatible diferente. Tal recubrimiento puede poseer una función diferente y/o una velocidad de degradación diferente a la del núcleo de partícula de fibroína de seda. Solo a modo de ejemplo, el recubrimiento de la partícula de fibroína de seda puede contener al menos un agente activo y puede adaptarse para degradarse a una velocidad diferente (p. ej., a una velocidad más rápida) de la del núcleo de partícula de fibroína de seda. Por lo tanto, tras colocar las partículas de fibroína de seda en un tejido, el recubrimiento de las partículas de fibroína de seda puede adaptarse para degradarse más rápido, p. ej., para liberar el agente activo para aliviar el dolor y/o promover la cicatrización de heridas, mientras que el núcleo de las partículas de fibroína de seda puede retener su volumen durante un período de tiempo más prolongado.

La fibroína de seda es un biopolímero candidato particularmente atractivo para ser usado en varias realizaciones descritas en el presente documento, p. ej., debido a su procesamiento versátil, p. ej., procesamiento totalmente acuoso (Sofia et al., 54 J. Biomed. Mater. Res. 139 (2001); Perry et al., 20 Adv. Mater. 3070-72 (2008)), funcionalización relativamente fácil (Murphy et al., 29 Biomat. 2829-38 (2008)), y biocompatibilidad (Santin et al., 46 J. Biomed. Mater. Res. 382-9 (1999)). Por ejemplo, la seda ha sido aprobada por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos como un andamio de ingeniería de tejidos en implantes humanos. Véase Altman et al., 24 Biomaterials: 401 (2003).

Como se usa en el presente documento, la expresión “ fibroína de seda” incluye la fibroína de los gusanos de la seda y la proteína de la seda de las arañas o los insectos. Véase, p. ej., Lucas et al., 13 Adv. Protein Chem. 107 (1958). Puede usarse cualquier tipo de fibroína de seda en diferentes realizaciones descritas en el presente documento. La fibroína de seda producida por gusanos de seda, tales como Bombyx mori, es la más común y representa un recurso renovable y amigable con el planeta. Por ejemplo, la fibroína de seda usada en una película de seda puede obtenerse por extracción de sericina de los capullos de B. mori. Los capullos de los gusanos de la seda orgánicos también están disponibles comercialmente. Sin embargo, hay muchas sedas diferentes, que incluyen la seda de araña (p. ej., obtenida de Nephila clavipes), sedas transgénicas, sedas genéticamente modificadas, tales como las sedas de bacterias, levaduras, células de mamíferos, animales transgénicos o plantas transgénicas (véase, p. ej., el documento WO 97/08315; patente de Estados Unidos n.° 5.245.012), y sus variantes, que pueden usarse.

En varias realizaciones, la fibroína de seda puede modificarse para diferentes aplicaciones y/o propiedades mecánicas o químicas deseadas (p. ej., para facilitar la formación de un gradiente de agente activo en partículas de fibroína de seda). Un experto en la técnica puede seleccionar métodos apropiados para modificar las fibroínas de seda, p. ej., dependiendo de los grupos laterales de las fibroínas de seda, la reactividad deseada de la fibroína de seda y/o la densidad de carga deseada en la fibroína de seda. En una realización, la modificación de la fibroína de seda puede utilizar la química de la cadena lateral de aminoácidos, tal como modificaciones químicas a través de enlaces covalentes o modificaciones a través de la interacción carga-carga. Los métodos de modificación química ilustrativa incluyen, entre otros, la reacción de acoplamiento de carbodiimida (véase, p. ej., la solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2007/0212730), reacción de acoplamiento de diazonio (véase, p. ej., la solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2009/0232963), interacción avidina-biotina (véase, p. ej., la solicitud internacional n.°: WO 2011/011347) y pegilación con derivados activados o químicamente activos del polímero PEG (véase, p. ej., la solicitud internacional n.° WO 2010/057142). La fibroína de seda también se puede modificar a través de modificación génica para alterar funcionalidades de la proteína de seda (véase, p. ej., la solicitud internacional n.° WO 2011/006133). Por ejemplo, la fibroína de seda puede modificarse genéticamente, lo que puede proporcionar una modificación adicional de la seda, tal como la inclusión de un polipéptido de fusión que comprende un dominio de proteína fibrosa y un dominio de mineralización, que puede usarse para formar un compuesto orgánico-inorgánico. Véase el documento WO 2006/076711. Además, la matriz de fibroína de seda puede combinarse con una sustancia química, tal como el glicerol, que, por ejemplo, afecta la flexibilidad de la matriz. Véase, p. ej., el documento WO 2010/042798, Modified Silk films Containing Glycerol.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ partículas de fibroína de seda” generalmente se refiere a partículas que comprenden fibroína de seda. En algunas realizaciones, la expresión “ partículas de fibroína de seda” se refiere a partículas en las que la fibroína de seda constituye al menos aproximadamente el 30 % de la composición total, incluyendo al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 % o más de la composición total. En ciertas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden formarse sustancialmente a partir de fibroína de seda. En varias realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden formarse sustancialmente a partir de fibroína de seda que comprende al menos un agente activo.

Las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden adaptarse para tener cualquier forma, p. ej., una forma esférica, forma poligonal, forma elíptica. Como se usa en referencia a las partículas de fibroína de seda, el término “ partícula” como se usa en el presente documento se refiere a una partícula de cualquier forma, p. ej., aunque sin limitación, una forma esférica, una forma poligonal o una forma elíptica. El tamaño de partícula puede variar con varios factores que incluyen, sin limitaciones, el tamaño del tejido a reparar o aumentar y/o las propiedades deseadas de las partículas de fibroína de seda, p. ej., retención de volumen o perfil de degradación. Según la invención reivindicada, el tamaño de partícula varía de 500 nm a 5000 μm, de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 2000 μm, de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 20 μm a aproximadamente 1000 μm, de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 750 μm o de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 2000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 1500 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 425 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 500 μm a aproximadamente 1200 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 800 μm a aproximadamente 1200 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 5 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 5 μm a aproximadamente 20 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 20 μm a aproximadamente 50 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 50 μm a aproximadamente 100 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 250 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 500 μm a aproximadamente 750 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 750 μm a aproximadamente 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño de aproximadamente 1000 μm a aproximadamente 1200 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño inferior a 1 μm, en algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden ser inherentemente tan pequeñas que pueden suministrarse a través de una aguja y/o un catéter sin ninguna compresión previa. En tales realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden tener un tamaño más pequeño que el diámetro interno de una aguja y/o un catéter de manera que las partículas de fibroína de seda no necesitan compresión previa antes de la inyección en un tejido a través de una aguja y/o un catéter.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden presentar una distribución de tamaños de partícula alrededor del “ tamaño” indicado. En tales realizaciones, la expresión “tamaño de partícula” , como se utiliza en el presente documento, se refiere al modo de una distribución de tamaños de las partículas de fibroína de seda, es decir, el valor que existe con mayor frecuencia en la distribución de tamaños. Los métodos para medir el tamaño de partícula son conocidos por los expertos en la técnica, p. ej., mediante dispersión de luz dinámica (tal como espectroscopia de fotocorrelación, difracción láser, dispersión de luz láser de ángulo bajo (LALLS) y dispersión de luz láser de ángulo medio (MALLS), métodos de oscurecimiento de la luz (tales como el método de análisis de Coulter) u otras técnicas (tales como la reología y la microscopía óptica o electrónica).

Las partículas de fibroína de seda pueden producirse a partir de soluciones de fibroína de seda a base de disolvente orgánico o acuoso. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda producidas a partir de una solución de fibroína de seda a base de disolvente orgánico pueden retener su volumen original durante un período de tiempo más prolongado que las partículas de fibroína de seda de base acuosa. La solución de fibroína de seda a base de disolvente orgánico o de base acuosa usada para fabricar las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento puede prepararse con el uso de cualquier técnica conocida en la técnica. La concentración de fibroína de seda en las soluciones usadas para la reparación o el aumento de tejidos blandos puede adecuarse al requisito de retención de volumen particular, p. ej., si pueden usarse mayores concentraciones de soluciones de fibroína de seda cuando se desea una retención de volumen más prolongada de las partículas de fibroína de seda cuando se inyecta en el tejido a reparar o aumentar. En algunas realizaciones, la solución de fibroína de seda para fabricar las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento puede variar de aproximadamente 4 % (p/v) a aproximadamente 30 % (p/v), inclusive, o de aproximadamente 4 % (p/v) a aproximadamente 20 % (p/v), inclusive. En algunas realizaciones, la solución de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 6 % (p/v) a aproximadamente 20 % (p/v). En algunas realizaciones, la solución de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 6 % (p/v) a aproximadamente 17 % (p/v). Los procesos adecuados para preparar una solución de fibroína de seda se divulgan, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° US 7635755; y las solicitudes internacionales n.°: WO/2005/012606; y ^w O/2008/127401. En la presente descripción puede usarse una etapa de microfiltración. Por ejemplo, la solución de fibroína de seda preparada puede procesarse adicionalmente, p. ej., por centrifugación y/o microfiltración basada en jeringas antes del procesamiento adicional a las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento.

En algunas realizaciones, la fibroína de seda también puede mezclarse con otros polímeros biocompatibles y/o biodegradables para formar partículas poliméricas mixtas que comprenden fibroína de seda. Se puede añadir uno o más polímeros biocompatibles y/o biodegradables (por ejemplo, dos o más polímeros biocompatibles) a la solución de fibroína de seda. El polímero biocompatible que puede usarse en la presente descripción incluye, pero no se limita a, óxido de polietileno (PEO), polietilenglicol (PEG), colágeno, fibronectina, queratina, ácido poliaspártico, polilisina, alginato, quitosano, quitina, ácido hialurónico, pectina, policaprolactona, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, polihidroxialcanoatos, dextranos, polianhídridos, polímeros, PLA-PGA, polianhídrido, poliortoéster, policaprolactona, polifumarato, colágeno, quitosano, alginato, ácido hialurónico y otros polímeros biocompatibles y/o biodegradables. Véase, p. ej., las solicitudes internacionales n.°: WO 04/062697; WO 05/012606.

En algunas realizaciones, puede añadirse al menos un agente activo descrito en el presente documento a la solución de fibroína de seda antes del procesamiento adicional a las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente activo puede dispersarse de manera homogénea o heterogénea dentro de la fibroína de seda, dispersarse en un gradiente, p. ej., con el uso del método de modificación mediado por carbodiimida descrito en la solicitud de patente de Estados Unidos n.° US 2007/0212730.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden formarse primero y después ponerse en contacto con (p. ej., sumergirse en) al menos un agente activo de manera que la superficie abierta de las partículas pueda recubrirse con al menos un agente activo.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden reducirse a partir de una fibroína de seda en estado sólido mediante un medio mecánico. Los medios mecánicos ilustrativos para obtener partículas de fibroína de seda incluyen micronización, molienda, pulverización, trituración, molido, liofilización o cualquier combinación de los mismos. Los métodos para formar una fibroína de seda en estado sólido a partir de una solución de fibroína de seda son bien conocidos por un experto en la materia, p. ej., usando una solución de fibroína de seda a base de disolvente o de base acuosa. Véase, p. ej., Wang Y. et al. (2008) 29 Biomaterials 3415, patente de Estados Unidos n.°: US 7635755; y las solicitudes internacionales n.°: WO/2005/012606; y WO/2008/127401.

De acuerdo con la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento comprenden estructuras porosas, p. ej., para imitar la morfología estructural de un tejido nativo, para modular la velocidad de degradación/velocidad de retención de volumen de las partículas de fibroína de seda y/o para modular el perfil de liberación de un agente activo incrustado en las mismas, si lo hay. Como se usa en la presente descripción, los términos “ poroso” y “ porosidad” se usan generalmente para describir una estructura que tiene una red conectada de poros o espacios vacíos (que pueden ser, por ejemplo, aberturas, espacios intersticiales u otros canales) en todo su volumen. El término “ porosidad” es una medida de los espacios vacíos en un material, y es una fracción del volumen de vacíos respecto al volumen total, como un porcentaje entre 0 y 100 % (o entre 0 y 1).

Las partículas porosas de fibroína de seda pueden configurarse para tener cualquier porosidad, en función de las propiedades deseadas. Según la invención reivindicada, las partículas de fibroína de seda porosa tienen una porosidad de al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o superior. En algunas realizaciones, la porosidad puede variar de aproximadamente 50 % a aproximadamente 99 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 99 % o de aproximadamente 80 % a aproximadamente 98 %. El tamaño de poro y los valores de porosidad total pueden cuantificarse con el uso de métodos y modelos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el tamaño de poro y la porosidad pueden medirse mediante técnicas estandarizadas, tales como la porosimetría de mercurio y la adsorción de nitrógeno. Un experto en la técnica puede determinar la porosidad óptima de las partículas de fibroína de seda usadas con varios fines. Por ejemplo, la porosidad y/o el tamaño de poro de las partículas de fibroína de seda pueden optimizarse en base a la velocidad de degradación deseada o la velocidad de retención de volumen de las partículas de fibroína de seda, los perfiles de liberación de un agente activo desde las partículas de fibroína de seda, y/o la morfología estructural del tejido a reparar o aumentar.

Los poros pueden adaptarse para que tengan cualquier forma, por ejemplo, circular, elíptica o poligonal. Las partículas porosas de fibroína de seda pueden adaptarse para tener un tamaño de poro de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 2000 μm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 0,5 μm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 2 μm a aproximadamente 1500 μm, de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 1000 μm, de aproximadamente 3 μm a 1000 μm, de aproximadamente 1 μm a aproximadamente 500 μm, o de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas modalidades, el tamaño de los poros de las partículas de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 3 μm a aproximadamente 500 μm. En algunas modalidades, el tamaño de los poros de las partículas de fibroína de seda puede variar de aproximadamente 8 μm a aproximadamente 1000 μm. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda no necesitan ser porosas. En tales realizaciones, el tamaño de poro de las partículas de fibroína de seda puede ser menor que 10 nm o no detectable. El término “ tamaño de poro” como se usa en la presente descripción se refiere a una dimensión de un poro. En algunas realizaciones, el tamaño de poro puede referirse a la dimensión más larga de un poro, p. ej., un diámetro de poro que tiene una sección transversal circular, o la longitud de la cuerda de sección transversal más larga que puede construirse a través de un poro que tiene una sección transversal no circular. En otras realizaciones, el tamaño de poro puede referirse a la dimensión más corta de un poro.

Los métodos para generar estructuras porosas dentro de la matriz de fibroína de seda, p. ej., métodos de liofilización, lixiviación de sales y espumación por gas, son bien conocidos en la técnica y se han descrito, p. ej., en la patente de Estados Unidos n.° US 7842780; y las solicitudes de patente de EE. UU. n.°: US 2010/0279112; y US 2010/0279112.

En algunas realizaciones, las partículas porosas de fibroína de seda pueden producirse mediante un método de lixiviación con porógenos (p. ej., método de lixiviación de sales). Véase, p. ej., los documentos US 7842780; y US 2010/0279112. En algunas realizaciones, las partículas porosas de fibroína de seda pueden reducirse a partir de una fibroína de seda porosa en estado sólido mediante un medio mecánico como se analizó anteriormente. Únicamente a modo de ejemplo, la solución de fibroína de seda puede colocarse en un recipiente antiadherente (p. ej., un recipiente recubierto de Teflón) que contiene partículas solubles en agua o porógenos que son insolubles en disolventes orgánicos. Alternativamente, los porógenos pueden mezclarse con la solución de fibroína de seda antes de su colocación en el recipiente. El diámetro de las partículas (porógenos) puede variar de acuerdo con el tamaño de poro predeterminado. Los ejemplos de porógenos solubles en agua que se pueden usar en el presente documento incluyen NaCl, metales alcalinos, haluros de metales alcalinotérreos, fosfatos y sulfatos, cristales de azúcar, microesferas solubles en agua, polisacáridos y microesferas de proteína. La matriz de fibroína de seda seca puede sumergirse luego en agua u otro solvente en el que las partículas o porógenos son solubles pero la fibroína de seda es insoluble, para eliminar las partículas (porógenos), lo que da como resultado una fibroína de seda en estado sólido porosa descrita en el presente documento. La fibroína de seda en estado sólido porosa puede entonces reducirse en las partículas porosas de fibroína de seda descritas en el presente documento, p. ej., mediante un medio mecánico tal como micronización, molienda, pulverización, trituración, molido, liofilización o cualquier combinación de los mismos.

Usando un método de lixiviación con porógenos (p. ej., método de lixiviación con sales), las partículas de fibroína de seda pueden crearse mediante, por ejemplo, aunque sin limitación, micronización de una fibroína de seda en estado sólido con poros correspondientes a un tamaño de porógenos que varía, p. ej., de aproximadamente 300 micrómetros a aproximadamente 500 micrómetros y/o aproximadamente 850 micrómetros a aproximadamente 1000 micrómetros. En algunas realizaciones, el intervalo de tamaño de poro no necesita verse afectado por un proceso de micronización. Dependiendo de cómo se corta (o micronice) la fibroína de seda en estado sólido, las partículas de fibroína de seda resultantes pueden tener un tamaño de poro correspondiente a cualquier parte del intervalo de tamaño de porógenos.

En algunas realizaciones, los poros de las partículas de fibroína de seda no necesitan ser poros intactos (p. ej., que tengan un tamaño de poro que sea una parte del intervalo de tamaño de porógenos, p. ej., al menos aproximadamente 1 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 % o superior, del intervalo de tamaño de porógenos). En algunas realizaciones, los poros de las partículas de fibroína de seda pueden estar intactos (p. ej., que tengan un tamaño de poro sustancialmente igual al tamaño de porógenos). En algunas realizaciones, los poros intactos de las partículas de fibroína de seda pueden permanecer esencialmente iguales al tamaño de los porógenos utilizados, p. ej., entre aproximadamente 300 micrómetros y 500 micrómetros, o entre aproximadamente 850 micrómetros y aproximadamente 1000 micrómetros. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda más pequeñas no necesitan mantener poros intactos y, por tanto, los poros pueden ser mucho más pequeños que el tamaño de los porógenos, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 %, al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 % al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 % al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 % o más, del intervalo de tamaño de porógenos. En varias realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden comprender poros intactos, poros parciales o una combinación de los mismos.

En realizaciones alternativas, las partículas de fibroína de seda porosas pueden producirse mediante el método de liofilización. Véase, p. ej., los documentos US 7842780 y US 2010/0279112. En tales realizaciones, la solución de fibroína de seda colocada en un recipiente antiadherente puede congelarse a temperaturas bajo cero, p. ej., de aproximadamente -80 °C a aproximadamente -20 °C, durante al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas o más, seguido de liofilización. En una realización, la solución de fibroína de seda puede congelarse desde una dirección. En algunas realizaciones, la solución de fibroína de seda puede no contener sal. En algunas realizaciones, puede añadirse alcohol tal como 15 %-25 % de metanol o propanol a la solución de fibroína de seda. La fibroína de seda en estado sólido porosa puede entonces reducirse en las partículas porosas de fibroína de seda descritas en el presente documento, p. ej., mediante un medio mecánico tal como micronización, molienda, pulverización, trituración, molido, liofilización o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la fibroína de seda en estado sólido porosa no se produce por el método de liofilización como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda o una fibroína de seda en estado sólido descritas en el presente documento pueden someterse a un tratamiento posterior que afectará al menos una propiedad de la fibroína de seda. Por ejemplo, el tratamiento posterior de las partículas de fibroína de seda o una fibroína de seda en estado sólido pueden afectar las propiedades de la fibroína de seda, incluyendo el contenido de lámina p, la solubilidad, la capacidad de carga de agente activo, el tiempo de degradación, la permeabilidad del fármaco o cualquier combinación de los mismos. Las opciones de procesamiento posterior de la seda incluyen secado lento controlado (Lu et al., 10 Biomacromolecules 1032 (2009)), recocido con agua (Jin et al., Water-Stable Silk Films with Reduced p-Sheet Content, 15 Adv. Funct. Mats. 1241 (2005)), estiramiento (Demura & Asakura, Immobilization of glucose oxidase with Bombyx mori silk fibroin by only stretching treatment and its application to glucose sensor, 33 Biotech & Bioengin. 598 (1989)), compresión, e inmersión en disolvente, que incluye metanol (Hofmann et al., 2006), etanol (Miyairi et al., 1978), glutaraldehído (Acharya et al., 2008) y 1-etil-3-(3-dimetil aminopropil) carbodiimida (EDC) (Bayraktar et al., 2005).

En algunas realizaciones, el tratamiento posterior de la fibroína de seda en estado sólido o de las partículas de fibroína de seda, p. ej., recocido con agua o inmersión en disolvente, puede permitir el control de la liberación de un agente activo desde las partículas de fibroína de seda. En algunas realizaciones, el tratamiento posterior de la fibroína de seda en estado sólido o de las partículas de fibroína de seda, p. ej., recocido con agua o inmersión en disolvente, puede permitir la modulación de las propiedades de degradación o solubilidad de las partículas de fibroína de seda usadas que se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, el tratamiento posterior de la fibroína de seda en estado sólido o de las partículas de fibroína de seda, p. ej., recocido con agua o inmersión en disolvente, puede permitir la modulación de las propiedades de retención de volumen de las partículas de fibroína de seda usadas que se describen en el presente documento.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden recubrirse con al menos una capa de un polímero biocompatible y/o biodegradable descrito en el presente documento, por ejemplo, para modular las propiedades de degradación y/o retención de volumen de las partículas de fibroína de seda tras la inyección en un tejido a tratar y/o modular la tasa de agentes activos liberados de las partículas de fibroína de seda. En tales realizaciones, el polímero biocompatible y/o biodegradable puede comprender al menos un agente activo.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden recubrirse con moléculas de adhesión celular, p. ej., pero sin limitarse a, fibronectina, vitronectina, laminina, colágeno, cualquier molécula de matriz extracelular reconocida en la técnica y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden esterilizarse. Los métodos de esterilización para dispositivos biomédicos son bien conocidos en la técnica, incluyendo, aunque no de forma limitativa, radiación gamma o ultravioleta, estirilización en autoclave (p. ej., calor/vapor); esterilización con alcohol (p. ej., etanol y metanol); y esterilización con gas (p. ej., esterilización con óxido de etileno).

Además, las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden aprovechar las muchas técnicas desarrolladas para funcionalizar la fibroína de seda (p. ej., agentes activos tales como colorantes y sensores). Véase, p. ej., patente de Estados Unidos n.° 6.287.340, Bioengineered anterior cruciate ligament; documento WO 2004/000915, Silk Biomaterials & Methods of Use Thereof; documento WO 2004/001103, Silk Biomaterials & Methods of Use Thereof; documento WO 2004/062697, Silk Fibroin Materials & Use Thereof; documento WO 2005/000483, Method for Forming inorganic Coatings; documento WO 2005/012606, Concentrated Aqueous Silk Fibroin Solution & Use Thereof; documento WO 2011/005381, Vortex-Induced Silk fibroin Gelation for Encapsulation & Delivery; documento WO 2005/123114, Silk-Based Drug Delivery System; documento WO 2006/076711, Fibrous Protein Fusions & Uses Thereof in the Formation of Advanced Organic/Inorganic Composite Materials; publicación de solicitud de Estados Unidos n.° 2007/0212730, Covalently immobilized protein gradients in three-dimensional porous scaffolds; documento WO 2006/042287, Method for Producing Biomaterial Scaffolds; documento WO 2007/016524, Method for Stepwise Deposition of Silk Fibroin Coatings; documento WO 2008/085904, Biodegradable Electronic Devices; documento WO 2008/118133, Silk Microspheres for Encapsulation & Controlled Release; documento WO 2008/108838, Microfluidic Devices & Methods for Fabricating Same; documento WO 2008/127404, Nanopatterned Biopolymer Device & Method of Manufacturing Same; documento WO 2008/118211, Biopolymer Photonic Crystals & Method of Manufacturing Same; documento WO 2008/127402, Biopolymer Sensor & Method of Manufacturing Same; documento WO 2008/127403, Biopolymer Optofluidic Device & Method of Manufacturing the Same; documento WO 2008/127401, Biopolymer Optical Wave Guide & Method of Manufacturing Same; documento WO 2008/140562, Biopolymer Sensor & Method of Manufacturing Same; documento WO 2008/127405, Microfluidic Device with Cylindrical Microchannel & Method for Fabricating Same; documento WO 2008/106485, Tissue-Engineered Silk Organs; documento WO 2008/140562, Electroactive Biopolymer Optical & Electro-Optical Devices & Method of Manufacturing Same; documento WO 2008/150861, Method for Silk Fibroin Gelation Using Sonication; documento WO 2007/103442, Biocompatible Scaffolds & Adipose-Derived Stem Cells; documento WO 2009/155397, Edible Holographic Silk Products; documento WO 2009/100280, 3-Dimensional Silk Hydroxyapatite Compositions; documento WO 2009/061823, Fabrication of Silk Fibroin Photonic Structures by Nanocontact Imprinting; documento WO 2009/126689, System & Method for Making Biomaterial Structures.

En una realización alternativa, las partículas de fibroína de seda pueden incluir nanopartículas plasmónicas para formar elementos fototérmicos. Este enfoque aprovecha las características superiores de dopaje de la fibroína de seda. Se ha demostrado que la terapia térmica ayuda en la entrega transdérmica de varios agentes, véase Park et al., Effect of Heat on Skin Permeability, 359 Intl. J. Pharm. 94 (2008). En una realización, pueden usarse ráfagas cortas de calor en áreas muy limitadas para maximizar la permeabilidad con efectos perjudiciales mínimos en los tejidos circundantes. Por lo tanto, las partículas de fibroína de seda dopadas con partículas plasmónicas pueden añadir especificidad a la terapia térmica al enfocar la luz para generar calor sólo localmente por medio de las partículas. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden incluir agentes fototérmicos tales como nanopartículas de oro.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden incluir un péptido anfifílico. En otras realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden excluir un péptido anfifílico. Los “ péptidos anfifílicos” poseen propiedades tanto hidrófilas como hidrófobas. Las moléculas anfifílicas generalmente pueden interactuar con las membranas biológicas mediante la inserción de la parte hidrófoba en la membrana lipídica, mientras exponen la parte hidrófila al ambiente acuoso. En alguna realización, el péptido anfifílico puede comprender un motivo RGD. Un ejemplo de un péptido anfifílico es un péptido 23RGD que tiene una secuencia de aminoácidos: HOOC-Gly-ArgGly-Asp-Ile-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly-SerArg-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Arg-NH₂. Otros ejemplos de péptidos anfifílicos incluyen los divulgados en la solicitud de patente de Estados Unidos n.°: US 2011/0008406.

Composiciones inyectables que comprenden partículas de fibroína de seda

En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una composición inyectable para su uso en la reparación o aumento de un tejido en un sujeto que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento, en donde las partículas de fibroína de seda retienen al menos el 50 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “ composición inyectable” generalmente se refiere a una composición que puede suministrarse o administrarse en un tejido con un procedimiento mínimamente invasivo. La expresión “ procedimiento mínimamente invasivo” se refiere a un procedimiento que se lleva a cabo mediante introducción en el cuerpo de un sujeto a través de la piel o a través de una cavidad corporal o una abertura anatómica, pero con el menor daño posible (p. ej., una pequeña incisión, inyección). En algunas realizaciones, la composición inyectable puede administrarse o suministrarse en un tejido mediante inyección. En algunas realizaciones, la composición inyectable puede suministrarse en un tejido a través de una incisión pequeña en la piel seguida de la inserción de una aguja, una cánula y/o un tubo, p. ej., un catéter. Sin pretender imponer ninguna teoría, la composición inyectable se puede administrar o colocar en un tejido mediante cirugía, p. ej., implantación.

En algunas realizaciones, las composiciones inyectables pueden comprender al menos un agente activo descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables pueden comprender al menos una célula. El término “ células” usado en la presente descripción se refiere a cualquier célula, procariota o eucariota, que incluye plantas, levaduras, gusanos, insectos y mamíferos. En algunas realizaciones, las células pueden ser células de mamífero. Las células de mamífero incluyen, sin limitarse a; primate, humano y una célula de cualquier animal de interés, incluidos, sin limitarse a; ratón, hámster, conejo, perro, gato, animales domésticos, tales como equino, bovino, murino, ovino, canino, felino, etc. Las células pueden ser una amplia variedad de tipos de tejido sin limitación, tales como; células hematopoyéticas, neurales, mesenquimales, cutáneas, mucosas, estromales, del bazo musculares, reticuloendoteliales, epiteliales, endoteliales, hepáticas, renales, gastrointestinales, pulmonares, células T, etc. También se incluyen células madre, células madre pluripotentes (iPSC), células madre embrionarias (ES), células derivadas de ES y progenitores de células madre, incluyendo, sin limitación, células hematopoyéticas, neurales, estromales, musculares, cardiovasculares, hepáticas, pulmonares y gastrointestinales y células madre derivadas de tejido adiposo. En una realización, las células son células madre derivadas de tejido adiposo. En algunas realizaciones, las células pueden ser células ex vivo o cultivadas, p. ej., in vitro. Por ejemplo, en el caso de las células ex vivo, las células se pueden obtener de un sujeto, cuando el sujeto está sano y/o afectado por una enfermedad.

Las células se pueden obtener, a modo de ejemplo no limitativo, mediante biopsia u otros medios quirúrgicos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las células adiposas pueden cosecharse de un sujeto mediante técnicas convencionales de liposucción o aspiración. En tales realizaciones, las células pueden derivarse de un lipoaspirado. En otras realizaciones, las células pueden derivarse de un aspirado de médula ósea. Dependiendo de los tipos de tejidos a reparar o aumentar, las células pueden derivarse de cualquier fluido o concentrado biológico, p. ej., un lipoaspirado o un lipoaspirado de médula ósea.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la composición inyectable o las partículas de fibroína de seda pueden suministrarse directamente con un fluido o concentrado biológico, p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea. En algunas realizaciones, la composición inyectable o la composición que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda puede comprender además un fluido o concentrado biológico, tal como lipoaspirado, aspirado de médula ósea o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la composición inyectable o la composición que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda puede comprender además un lipoaspirado.

En estas realización, la composición o la composición inyectable puede comprender partículas de fibroína de seda y un fluido biológico o concentrado (p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea) en una relación de volumen de aproximadamente 1:38 a aproximadamente 12:19, o de aproximadamente 1:19 a aproximadamente 10:19, o de aproximadamente 2:19 a aproximadamente 8:19. En una realización, la composición o la composición inyectable puede comprender partículas de fibroína de seda y un fluido biológico o concentrado (p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea) en una relación de volumen de aproximadamente 3:19. En otra realización, la composición o la composición inyectable puede comprender partículas de fibroína de seda y un fluido biológico o concentrado (p. ej., un lipoaspirado o un aspirado de médula ósea) en una relación de volumen de aproximadamente 6:19.

Las células se pueden obtener de donantes (alogénicos) o de receptores (autólogos). Las células también pueden ser de líneas de cultivo celular establecidas o incluso células que se han sometido a ingeniería genética. Además, las células pueden recolectarse de una multitud de huéspedes, que incluyen pero sin limitarse a, tejidos de autoinjerto humano, mamíferos transgénicos o cultivos bacterianos (posiblemente para el uso como tratamiento probiótico). En ciertas realizaciones, las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda pueden comprender células madre humanas tales como, p. ej., células madre mesenquimales, células madre pluripotentes (iPSC), células madre sinoviales, células madre embrionarias, células madre adultas, células de la sangre del cordón umbilical, células de gelatina de Wharton umbilical, osteocitos, fibroblastos, células nerviosas, lipocitos, adipocitos, células de médula ósea, inmunocitos variados, células precursoras derivadas de tejido adiposo, células progenitoras derivadas de médula ósea, células progenitoras de sangre periférica, células madre aisladas de tejido adulto y células transformadas genéticamente o combinaciones de las células anteriores; o células diferenciadas tales como, p. ej., células musculares, células adiposas.

Las células madre pueden obtenerse con procedimientos mínimamente invasivos a partir de médula ósea, tejido adiposo u otras fuentes en el cuerpo, son muy expandibles en cultivo y pueden inducirse fácilmente a diferenciarse en células formadoras de tejido adiposo después de la exposición a un suplemento inductor adipogénico bien establecido. Las células pueden añadirse a las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento y cultivarse in vitro durante un período de tiempo antes de la administración a una región del cuerpo, o añadirse a las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento y administrarse a una región del cuerpo. Las células pueden sembrarse en las partículas de fibroína de seda durante un período de tiempo corto (menos de 1 día) justo antes de la administración, o pueden cultivarse durante un período más prolongado (más de 1 día) para permitir la proliferación celular y la síntesis de matriz extracelular dentro de la matriz sembrada antes de la administración.

Cuando se utiliza como fuente de células madre, el tejido adiposo puede obtenerse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, el tejido adiposo puede extraerse de un individuo mediante lipoplastia asistida por succión, lipoplastia asistida por ultrasonido y lipectomía por escisión. Además, los procedimientos pueden incluir una combinación de tales procedimientos. La lipoplastia asistida por succión puede ser conveniente para extraer el tejido adiposo de un individuo ya que proporciona un método mínimamente invasivo para recolectar tejido con un potencial mínimo de daño de células madre que puede asociarse con otras técnicas, tales como la lipoplastia asistida por ultrasonido. El tejido adiposo debe recolectarse de una manera que conserve la viabilidad del componente celular y que minimice la probabilidad de contaminación del tejido con organismos potencialmente infecciosos, tales como bacterias y/o virus.

En algunas realizaciones, la preparación de la población de células puede requerir la reducción del componente adipocito maduro cargado de grasa del tejido adiposo. Esto se logra típicamente mediante una serie de etapas de lavado y desagregación en las que el tejido se enjuaga primero para reducir la presencia de lípidos libres (liberados de los adipocitos rotos) y elementos de sangre periférica (liberados de los vasos sanguíneos cortados durante la cosecha del tejido), y después se desagrega para liberar los adipocitos intactos y otras poblaciones de células de la matriz de tejido conectivo. La desagregación puede lograrse con el uso de cualquier técnica o método convencional, que incluye la fuerza mecánica (fuerzas de corte o cizallamiento), digestión enzimática con enzimas proteolíticas individuales o combinadas, tales como colagenasa, tripsina, lipasa, liberasa HI y pepsina, o una combinación de métodos mecánicos y enzimáticos. Por ejemplo, el componente celular de los fragmentos de tejido intacto puede desagregarse mediante métodos que usan la disociación de tejido adiposo mediada por colagenasa, similares a los métodos para recolectar células endoteliales microvasculares en el tejido adiposo, como conocen los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica también conocen métodos adicionales que usan colagenasa que pueden usarse. Además, los métodos pueden emplear una combinación de enzimas, tal como una combinación de colagenasa y tripsina o una combinación de una enzima, tal como la tripsina, y disociación mecánica.

Después la población de células (lipoaspirado procesado) puede obtenerse de los fragmentos de tejido desagregado por reducción de la presencia de adipocitos maduros. La separación de las células puede lograrse mediante sedimentación por densidad de flotación, centrifugación, elutriación, adherencia diferencial y elución de restos en fase sólida, selección mediada por anticuerpos, diferencias en la carga eléctrica; microesferas inmunomagnéticas, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) u otros medios.

Después de la desagregación, la población de células activas puede lavarse/enjuagarse para eliminar los aditivos y/o subproductos del proceso de desagregación (por ejemplo, colagenasa y lípidos libres recién liberados). La población de células activas podría concentrarse después por centrifugación. En una realización, las células se concentran y la colagenasa se elimina al hacer pasar la población de células a través de un sistema de membrana de centrifugación de flujo continuo o similar, tal como, por ejemplo, el sistema divulgado en las patentes de Estados Unidos n.° 5.034.135; y 5.234.608.

Además de lo anterior, existen muchos métodos posteriores al lavado que pueden aplicarse para purificar aún más la población de células. Estos incluyen tanto la selección positiva (selección de las células objetivo), como la selección negativa (eliminación selectiva de células no deseadas) o combinaciones de las mismas. En otra realización, el sedimento de células podría resuspenderse, colocarse sobre (o debajo de) un material fluido formado en un gradiente de densidad continuo o discontinuo y colocarse en una centrífuga para la separación de las poblaciones de células en base a la densidad celular. En una realización similar, podrían usarse enfoques de flujo continuo tales como aféresis y elutriación (con o sin contracorriente). La adherencia al plástico seguida de un período corto de expansión celular también se ha aplicado en poblaciones de células madre adultas derivadas de médula ósea. Este enfoque usa condiciones de cultivo para expandir preferentemente una población, mientras que otras poblaciones se mantienen (y de este modo se reducen por dilución con las células seleccionadas en crecimiento) o se pierden debido a la ausencia de las condiciones de crecimiento requeridas. Las células que se han concentrado, cultivado y/o expandido pueden incorporarse en las partículas de fibroína de seda y/o composiciones inyectables descritas en el presente documento.

En una realización, las células madre se cosechan, las células cosechadas se ponen en contacto con un medio adipogénico durante un tiempo suficiente para inducir la diferenciación a adipocitos y los adipocitos se cargan en una matriz biocompatible que se implanta. En realizaciones adicionales, al menos algunas de las células madre pueden diferenciarse a adipocitos, de modo que inicialmente está presente una mezcla de ambos tipos de células que cambia con el tiempo sustancialmente a solo adipocitos, con células madre presentes en cantidades pequeñas a indetectables. El tejido adiposo se fabrica in vivo por las células madre o se prepara ex vivo por las células madre.

Se pueden emplear varios tipos de células diferentes o combinaciones de los mismos en las composiciones inyectables, en dependencia de los tipos de tejidos a reparar o aumentar. Estos tipos de células incluyen, pero no se limitan a: células de músculo liso, células de músculo esquelético, células de músculo cardíaco, células epiteliales, células endoteliales, células uroteliales, fibroblastos, mioblastos, condrocitos, condroblastos, osteoblastos, osteoclastos, queratinocitos, hepatocitos, células de conductos biliares, células de islotes pancreáticos, tiroides, paratiroides, suprarrenales, hipotalámicas, pituitarias, ováricas, testiculares, células de glándulas salivales, adipocitos y células precursoras. Únicamente a modo de ejemplo, las células de músculo liso y las células endoteliales pueden emplearse cuando las composiciones inyectables se usan para reparar o aumentar tejidos musculares y/o vasculares, tales como tejidos vasculares, esofágicos, intestinales, rectales o uretrales; los condrocitos pueden incluirse en composiciones inyectables para tejidos cartilaginosos; los fibroblastos pueden incluirse en composiciones inyectables destinadas a reemplazar y/o mejorar cualquiera de la amplia variedad de tipos de tejido (p. ej., piel) que contiene matriz extracelular, p. ej., colágeno; los adipocitos pueden incluirse en composiciones inyectables destinadas a reparar o aumentar cualquiera de la amplia variedad de tejidos adiposos. En general, cualquier célula que se encuentre en el tejido natural puede incluirse en las composiciones inyectables usadas para el tejido correspondiente. Además, pueden incluirse células progenitoras, tales como mioblastos o células madre, para producir sus tipos de células diferenciadas correspondientes.

En algunas realizaciones, las composiciones inyectables pueden comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión “ portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración de las partículas de fibroína de seda y opcionalmente un agente activo. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y agentes isotónicos y retardantes de la absorción, que son compatibles con las partículas de fibroína de seda y la actividad del agente activo, si lo hay, y son fisiológicamente aceptables para el sujeto. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, medio de cultivo celular, tampones (p. ej., solución salina tamponada con fosfato), poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. En algunas realizaciones, el portador farmacéutico puede ser una solución tamponada (p. ej., PBS).

Además, pueden añadirse varios aditivos que mejoran la estabilidad, la esterilidad y la isotonicidad de las composiciones inyectables, que incluyen conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. En muchos casos, puede ser deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. Las composiciones inyectables también pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, aditivos gelificantes o que aumentan la viscosidad, conservantes, colorantes y similares, dependiendo de la preparación deseada. Se pueden consultar textos estándar, tales como “ REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE” , 17a edición, 1985 incorporado en la presente por referencia, para preparar preparaciones adecuadas, sin experimentación excesiva.

La viscosidad de las composiciones inyectables puede mantenerse al nivel seleccionado con el uso de un agente espesante farmacéuticamente aceptable. En una realización, se usa metilcelulosa porque está disponible de forma fácil y económica y es fácil trabajar con ella. Otros agentes espesantes adecuados incluyen, por ejemplo, goma de xantano, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, carbómero y similares. La concentración preferida del espesante dependerá del agente seleccionado y la viscosidad deseada para la inyección. El punto importante es usar una cantidad que logre la viscosidad seleccionada, p. ej., la adición de tales agentes espesantes a algunas realizaciones de las composiciones inyectables.

Típicamente, cualquier aditivo (además de las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento y/o agentes activos adicionales) puede estar presente en una cantidad de 0,001 a 50 % en peso de peso seco o en una solución tamponada. En algunas realizaciones, el agente activo puede estar presente en el orden de microgramos a miligramos a gramos, tal como aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 5 % en peso, aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 % en peso, aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 0,05 % en peso o aproximadamente 0,001 a aproximadamente 20% en peso, aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10% en peso y aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 % en peso. Para cualquier composición farmacéutica a administrar a un sujeto que lo necesite, se prefiere determinar la toxicidad, tal como mediante la determinación de la dosis letal (LD) y d L50 en un modelo animal adecuado, p. ej., de roedor tal como ratón; y la dosificación de la o las composiciones, la concentración de componentes en las mismas y el tiempo de administración de la o las composiciones, que provocan una respuesta adecuada. Tales determinaciones no requieren una experimentación excesiva a partir del conocimiento del experto en la técnica.

Agentes activos

En algunas realizaciones, la composición inyectable y/o las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden comprender además al menos un agente activo. El agente activo puede mezclarse, dispersarse o suspenderse en la composición inyectable, y/o puede distribuirse o incrustarse en las partículas de fibroína de seda. En algunas realizaciones, el agente activo puede distribuirse, incrustarse o encapsularse en las partículas de fibroína de seda. En algunas realizaciones, el agente activo puede recubrirse sobre superficies de las partículas de fibroína de seda. En algunas realizaciones, el agente activo puede mezclarse con las partículas de fibroína de seda para formar una composición inyectable. El término “ agente activo” también puede abarcar combinaciones o mezclas de dos o más agentes activos, como se describe a continuación. Los ejemplos de agentes activos incluyen, pero no se limitan a, un agente biológicamente activo (p. ej., un agente terapéutico), un agente cosméticamente activo (p. ej., un agente antienvejecimiento), un agente de adhesión celular (p. eje., moléculas de unión a integrina) y cualquier combinación de los mismos.

La expresión “ agente biológicamente activo” , como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier molécula que ejerce al menos un efecto biológico in vivo. Por ejemplo, el agente biológicamente activo puede ser un agente terapéutico para tratar o prevenir una patología o afección en un sujeto. Los ejemplos de agentes biológicamente activos incluyen, sin limitación, péptidos, peptidomiméticos, aptámeros, anticuerpos o una parte de los mismos, moléculas similares a anticuerpos, ácidos nucleicos (ADN, ARN, ARNic, ARNhc), polisacáridos, enzimas, antagonistas o agonistas de receptores, hormonas, factores de crecimiento, médula ósea autógena, antibióticos, agentes antimicrobianos, moléculas pequeñas y agentes terapéuticos. Los agentes biológicamente activos también pueden incluir, sin limitaciones, agentes antiinflamatorios, anestésicos, agentes activos que estimulan la formación de tejidos y/o la cicatrización y regeneración de tejidos naturales, y cualquier combinación de los mismos.

Los agentes antiinflamatorios pueden incluir, pero no se limitan a, naproxeno, sulindaco, tolmetina, ketorolaco, celecoxib, ibuprofeno, diclofenaco, ácido acetilsalicílico, nabumetona, etodolaco, indometacina, piroxicam, inhibidores de cox-2, ketoprofeno, medicamentos antiplaquetarios, salsalato, valdecoxib, oxaprozina, diflunisal, flurbiprofeno, corticosteroides, inhibidores de MMP y modificadores de leucotrienos o combinaciones de los mismos.

Los agentes que aumentan la formación de nuevos tejidos y/o estimulan la curación o el nuevo crecimiento del tejido nativo en el sitio de la inyección pueden incluir, aunque no de forma limitativa, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento epidérmico (EGF), péptidos activados por tejido conjuntivo (CTAP), factores osteogénicos que incluyen proteínas morfogénicas óseas, heparina, angiotensina II (A-II) y fragmentos de las mismas, factores de crecimiento similares a la insulina, factores de necrosis tumoral, interleucinas, factores estimulantes de colonias, eritropoyetina, factores de crecimiento nervioso, interferones, análogos biológicamente activos, fragmentos y derivados de dichos factores de crecimiento y cualquier combinación de los mismos.

Los anestésicos pueden incluir, pero no se limitan a, los usados en aplicaciones caudales, epidurales, inhalables, inyectables, retrobulbares y espinales, tales como bupivacaína, lidocaína, benzocaína, cetacaína, ropivacaína y tetracaína, o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones, los agentes activos pueden ser agentes cosméticamente activos. Por la expresión “ agente cosméticamente activo” se entiende un compuesto que tiene un efecto cosmético o terapéutico sobre la piel, el cabello o las uñas, p. ej., agentes antienvejecimiento, agentes contra los radicales libres, agentes aclarantes, agentes blanqueadores, agentes despigmentantes, agentes de oscurecimiento tales como agentes autobronceadores, colorantes, agentes antiacné, agentes de control del lustre, agentes antimicrobianos, agentes antiinflamatorios, agentes antimicóticos, agentes antiparasitarios, analgésicos externos, agentes bloqueadores solares, fotoprotectores, antioxidantes, agentes queratolíticos, detergentes/tensioactivos, humectantes, nutrientes, vitaminas, potenciadores energéticos, agentes antitranspirantes, astringentes, desodorantes, depiladores, agentes reafirmantes, agentes anticallos, relajantes musculares, agentes para el acondicionamiento del cabello, las uñas y/o la piel y cualquier combinación de los mismos.

En una realización, el agente cosméticamente activo puede seleccionarse de, pero sin limitarse a, el grupo que consiste en hidroxiácidos, peróxido de benzoílo, azufre y resorcinol, ácido ascórbico, D-pantenol, hidroquinona, metoxicinamato de octilo, dióxido de titanio, salicilato de octilo, homosalato, avobenzona, polifenólicos, carotenoides, captadores de radicales libres, ceramidas, ácidos grasos poliinsaturados, ácidos grasos esenciales, enzimas, inhibidores de enzimas, minerales, hormonas tales como estrógenos, esteroides tales como hidrocortisona, 2-dimetilaminoetanol, sales de cobre tales como cloruro de cobre, coenzima Q10, ácido lipoico, aminoácidos tales como prolina y tirosina, vitaminas, ácido lactobiónico, acetil coenzima A, niacina, riboflavina, tiamina, ribosa, transportadores de electrones tales como NADH y FADH₂, y otros extractos botánicos tales como aloe vera, botón de plata y soja, y derivados y mezclas de los mismos. Los ejemplos de vitaminas incluyen, pero no se limitan a, vitamina A, vitaminas B (tales como vitamina B3, vitamina B5 y vitamina B12), vitamina C, vitamina K y vitamina E, y derivados de las mismas.

En una realización, los agentes cosméticamente activos pueden ser antioxidantes. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes solubles en agua tales como compuestos de sulfhidrilo y sus derivados (por ejemplo, metabisulfito de sodio y N-acetilcisteína), ácido lipoico y ácido dihidrolipoico, resveratrol, lactoferrina, ácido ascórbico y derivados de ácido ascórbico (por ejemplo, palmitato de ascorbilo y polipéptido de ascorbilo). Los antioxidantes solubles en aceite adecuados para el uso en las composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, hidroxitolueno butilado, tocoferoles (p. ej., acetato de tocoferilo), tocotrienoles y ubiquinona. Los extractos naturales que contienen antioxidantes adecuados para el uso en las composiciones inyectables descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitarse a, extractos que contienen flavonoides e isoflavonoides y sus derivados (p. ej., genisteína y diadzeína) y extractos que contienen resveratrol. Ejemplos de tales extractos naturales incluyen semilla de uva, té verde, corteza de pino y propóleos. Otros ejemplos de antioxidantes pueden encontrarse en las páginas 1612-13 del Manual ICI.

En algunas realizaciones, los agentes activos pueden ser agentes de adhesión celular. Los ejemplos de agentes de adhesión celular incluyen, pero no se limitan a, ácido hialurónico, colágeno, ácido hialurónico/colágeno reticulado, una molécula de unión a integrina, quitosano, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, proteoglicanos, cualquier derivado de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda pueden comprender además al menos un material adicional para el aumento de tejidos blandos, p. ej., materiales de relleno dérmico, que incluyen, pero no se limitan a, microesferas de poli(metacrilato de metilo), hidroxilapatita, poli(ácido L-láctico), colágeno, elastina y glucosaminoglucanos, ácido hialurónico, productos de relleno dérmico comerciales tales como BOTOX® (de Allergan), DYSPORT®, COSMODERM®, EVOLENCE®, RADIESSE®, RESTYLANE®, JUVEDERM® (de Allergan), SCULPTRA®, PERLANE®, y CAPTIQUE®, y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la composición inyectable y/o las partículas de fibroína de seda pueden comprender nanopartículas metálicas (p. ej., pero sin limitarse a, nanopartículas de oro), moléculas ópticas (p. ej., pero sin limitarse a, moléculas fluorescentes y/o puntos cuánticos), y cualquier otro agente de contraste reconocido en la técnica, p. ej., para la obtención de imágenes biomédicas.

En diversas realizaciones, las composiciones inyectables pueden almacenarse o transportarse secas o hidratadas.

Cuando los agentes activos se incrustan en las partículas de fibroína de seda, la bioactividad de los agentes activos (p. ej., al menos aproximadamente 30% de la bioactividad de los agentes activos) puede estabilizarse durante un período de tiempo (p. ej., días, semanas o meses) en condiciones específicas. Tales condiciones pueden incluir, pero no se limitan a, un ciclo de cambio de estado (p. ej., ciclos de congelación y descongelación), temperaturas (p. ej., por encima de 0 °C), presiones de aire, humedad y exposición a la luz. Véase la solicitud de Estados Unidos con n.° de serie: 61/477.737. Algunas realizaciones de la composición inyectable pueden almacenarse o transportarse entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 60 °C, aproximadamente 10 °C y aproximadamente 60 °C, o aproximadamente 15 °C y aproximadamente 60 °C. En estas realizaciones, las composiciones inyectables pueden almacenarse o transportarse a temperatura ambiente mientras que la bioactividad de los agentes activos (p. ej., al menos aproximadamente 30 % de la bioactividad de los agentes activos) puede estabilizarse durante un período de tiempo, p. ej., al menos aproximadamente 3 semanas o más.

Aplicaciones de las composiciones inyectables y las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento

Las composiciones inyectables descritas en el presente documento pueden usarse en una variedad de usos médicos, que incluyen, sin limitación, rellenos para espacio tisular, moldes para la reconstrucción o regeneración de tejidos, andamios para células en aplicaciones de ingeniería de tejidos o como vehículo/portador para el suministro de fármacos. Una pluralidad de partículas de fibroína de seda inyectadas en un tejido a reparar o aumentar puede actuar como un andamio para imitar las matrices extracelulares (ECM) del cuerpo y/o promover la regeneración de tejidos. El andamio puede servir como soporte físico y/o como molde adhesivo para que las células proliferen en el mismo. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden no contener células. Sin embargo, las partículas de fibroína de seda pueden recubrirse con agentes de adhesión celular, p. ej., colágeno y/o quimioatrayentes, p. ej., factores de crecimiento, que pueden atraer células del huésped a las partículas de fibroína de seda y brindar soporte a la proliferación celular. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden sembrarse con células antes de la administración a un tejido objetivo a reparar o aumentar.

En algunas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inyectables que pueden usarse para rellenar, dar volumen y/o regenerar un tejido que lo necesite. Las composiciones inyectables pueden usarse generalmente para rellenar o dar volumen a tejidos, para el aumento de tejidos blandos, reemplazo, mejora cosmética y/o reparación de tejidos en un sujeto. Además, las composiciones inyectables pueden usarse para rellenar cualquier vacío o hendidura de tejido que se forme naturalmente (por ejemplo, envejecimiento) o que se cree mediante un procedimiento quirúrgico para la extracción de tejido (por ejemplo, un quiste dérmico o un tumor sólido), tratamiento con corticosteroides, reacción inmunológica que da lugar a lipoatrofia, daño tisular producto de lesiones por impacto o tratamiento terapéutico (por ejemplo, radioterapia o quimioterapia). Las composiciones inyectables también pueden usarse para elevar las depresiones de cicatrices.

En ciertas realizaciones, las composiciones inyectables pueden usarse para el aumento de tejidos blandos. Como se usa en la presente descripción, por el término “ aumentar” o “ aumento” se entiende incrementar, rellenar, restaurar, mejorar o reemplazar un tejido. En algunas realizaciones, el tejido puede perder su elasticidad, firmeza, forma y/o volumen. En algunas realizaciones, el tejido puede perderse (p. ej., la extracción de un tejido) o dañarse de manera parcial o completa. En estas realizaciones, el término “ aumentar” o “ aumento” también puede referirse a la disminución, reducción o alivio de al menos un síntoma o defecto en un tejido (por ejemplo, pero no limitado a, pérdida de elasticidad, firmeza, forma y/o volumen en un tejido; presencia de un hueco o una indentación en un tejido; pérdida de función en un tejido) inyectando en el tejido al menos una composición inyectable descrita en el presente documento. En tales realizaciones, al menos un síntoma o defecto en un tejido puede disminuirse, reducirse o aliviarse en al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 % o más, en comparación con ningún tratamiento. En algunas realizaciones, al menos un síntoma o defecto en un tejido puede disminuirse, reducirse o aliviarse en al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o más, en comparación con ningún tratamiento. En algunas realizaciones, al menos un síntoma o defecto en un tejido puede disminuirse, reducirse o aliviarse en un 100 % (sin defectos o el defecto es indetectable por un experto en la técnica), en comparación con ningún tratamiento. En otras realizaciones, el tejido puede aumentarse para prevenir o retrasar la aparición de defectos en un tejido, p. ej., pérdida de elasticidad, firmeza, forma y/o volumen en un tejido, o signos de arrugas. Como se usa en la presente descripción, la frase “ aumento de tejidos blandos” se usa generalmente en referencia a la alteración de una estructura de tejido blando, que incluye, pero sin limitarse a, incrementar, rellenar, restaurar, mejorar o reemplazar un tejido, por ejemplo, para mejorar la apariencia cosmética o estética del tejido blando. Por ejemplo, el aumento de senos (también conocido como agrandamiento de senos, mamoplastia de agrandamiento, mamoplastia de aumento) altera el tamaño y la forma de los senos de una mujer para mejorar la apariencia cosmética o estética de la mujer. Los ejemplos de aumento de tejidos blandos incluyen, pero no se limitan a, aumento de tejido dérmico, relleno las líneas, pliegues, arrugas, depresiones faciales menores y labios hendidos, especialmente en la cara y cuello; corrección de deformidades menores debido al envejecimiento o enfermedad, incluso en manos y pies, dedos de manos y pies; aumento de las cuerdas vocales o glotis para rehabilitar el habla; relleno dérmico de líneas del sueño y líneas de expresión; reemplazo de tejido dérmico y subcutáneo perdido debido al envejecimiento; aumento de labios, relleno de las patas de gallo y del surco orbitario alrededor del ojo; aumento de mama; aumento de mentón; aumento de la mejilla y/o nariz; agente volumétrico para soporte periuretral, relleno de indentaciones en el tejido blando, dérmico o subcutáneo, debido, por ejemplo, a una liposucción excesiva u otro traumatismo; relleno de acné o cicatrices traumáticas; relleno de líneas nasolabiales, líneas nasoglabelares y líneas intraorales. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden usarse para tratar lipodistrofias faciales. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables pueden usarse para el aumento y/o reconstrucción de senos.

En algunas realizaciones, las composiciones inyectables pueden usarse para la reparación de tejidos blandos. El término “ reparación” o “ reparar” como se usa en la presente descripción, con respecto a un tejido, se refiere a cualquier corrección, refuerzo, reacondicionamiento, remediación, regeneración, relleno de un tejido que restaura el volumen, la forma y/o la función del tejido. En algunas realizaciones, “ reparación” incluye la reparación completa y la reparación parcial. Por ejemplo, el volumen, la forma y/o la función de un tejido a reparar puede restaurarse en al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 % o más, en comparación con ningún tratamiento. En algunas realizaciones, el volumen, la forma y/o la función de un tejido a reparar puede restaurarse en al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o más, en comparación con ningún tratamiento. En algunas realizaciones, el volumen, la forma y/o la función de un tejido a reparar puede restaurarse en un 100 % (sin defectos o el defecto es indetectable por un experto en la técnica), en comparación con ningún tratamiento. En diversas realizaciones, las composiciones inyectables pueden usarse para reparar cualquier tejido blando analizado anteriormente, p. ej., mamario, piel y cualquier tejido blando susceptible al aumento de tejidos blandos. En algunas realizaciones, el término “ reparación” o “ reparar” se usa en el presente documento indistintamente con el término “ regeneración” o “ regenerar” cuando se usa en referencia al tratamiento de tejidos.

En algunas realizaciones, las composiciones inyectables pueden usarse para la reconstrucción de tejidos blandos. Como se usa en la presente descripción, la frase “ reconstrucción de tejidos blandos” se refiere a la reconstrucción de una estructura de tejido blando que se dañó o perdió gravemente, por ejemplo, por un accidente drástico o una extracción quirúrgica. Por ejemplo, la reconstrucción de senos es la reconstrucción de un seno, usualmente en mujeres. Los métodos convencionales para construir un seno de apariencia natural generalmente involucran el uso de tejido autólogo o material protésico. En algunas realizaciones, dicha reconstrucción de senos puede incluir la reforma de una areola y un pezón de apariencia natural, en donde tal procedimiento puede involucrar el uso de implantes o colgajos reubicados del propio tejido de la paciente. En algunas realizaciones, la administración de composiciones inyectables y/o partículas de fibroína de seda en una región de tejido blando a reconstruir puede mantener la forma y/o el tamaño de la estructura de tejido blando reconstruida durante un período de tiempo, p. ej., al menos 6 semanas, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses o más.

Sin desear limitarse, pueden usarse algunas realizaciones de las composiciones inyectables para el aumento o reparación de tejidos duros (musculoesqueléticos), tales como el aumento o reparación de hueso, cartílago y ligamento.

Las composiciones inyectables y las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento también pueden usarse para rellenar un tejido que se encuentra en o cerca de un implante protésico, por ejemplo, pero sin limitarse a, un implante de seno convencional o un implante de reemplazo de rodilla. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables y las partículas de fibroína de seda pueden usarse como interfaz entre un implante protésico y un tejido, p. ej., para rellenar un vacío entre el implante protésico y el tejido, y/o para prevenir que el tejido entre en contacto directo con el implante protésico. Solo a modo de ejemplo, después de colocar un implante protésico (p. ej., un implante de seno) en un sujeto, puede introducirse una composición inyectable descrita en la presente descripción en o adyacente al implante para rellenar cualquier espacio vacío entre el implante y el tejido (p. ej., tejido mamario) y/o “ esculpir” el tejido para una apariencia más natural.

En cualquiera de los usos descritos en el presente documento, las partículas de fibroína de seda podrían combinarse con células con fines de una reparación biológicamente mejorada. Las células podrían recolectarse de una multitud de huéspedes, que incluyen, pero sin limitarse a, tejidos de autoinjerto humano o mamíferos transgénicos. Más específicamente, las células humanas usadas pueden comprender células seleccionadas de células madre (p. ej., células madre derivadas de tejido adiposo), osteocitos, fibroblastos, lipocitos, inmunocitos variados, células de lipoaspirados o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las células pueden añadirse después de enjuagar las propias partículas de fibroína de seda. Se pueden mezclar en las partículas de fibroína de seda, solución portadora o mezcla de partículas de fibroína de seda y solución portadora antes de la inyección.

En algunas realizaciones, la administración de las células (p. ej., células madre o lipoaspirado) con partículas de fibroína de seda o una composición inyectable descrita en el presente documento puede mejorar o acelerar la integración al huésped y/o la formación de tejido con el tiempo. Las células pueden mezclarse con las partículas de fibroína de seda o una composición inyectable descrita en el presente documento, o pueden administrarse antes, simultáneamente o después de introducir las partículas de fibroína de seda o una composición inyectable en un sitio objetivo. Sin desear limitarse a la teoría, las células pueden secretar factores proangiogénicos y/o factores de crecimiento en el sitio objetivo. A medida que el tejido se regenera o se remodela para rellenar un vacío o reparar un defecto, las partículas de fibroína de seda pueden degradarse en consecuencia. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden integrarse con el tejido huésped regenerado.

Además, los agentes activos tales como agentes terapéuticos, productos farmacéuticos o factores de crecimiento específicos añadidos a las proteínas de fibroína de seda para fines de un mejor resultado pueden introducirse en cualquiera o en una combinación de varios puntos en todo el proceso de producción de la partícula de fibroína de seda. En algunas realizaciones, estos factores pueden añadirse a la solución de fibroína de seda o la fase con acelerante antes del secado y la solidificación, pueden empaparse en la matriz de fibroína de seda durante el proceso de enjuague de acelerante, o pueden recubrirse sobre el volumen de fibroína de seda después del enjuague. El agente activo que contiene la fibroína de seda en estado sólido puede entonces reducirse a partículas mediante el uso de los métodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, una fibroína de seda en estado sólido puede reducirse a partículas antes de introducir un agente activo en las partículas de fibroína de seda. Por ejemplo, un agente activo puede empaparse en las partículas de fibroína de seda, recubrirse sobre las partículas de fibroína de seda o introducirse en un fluido portador antes o después de mezclarlo con las partículas de fibroína de seda.

En algunos aspectos, la composición inyectable y las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden usarse como rellenos de espacio tisular. En una realización, el relleno de espacio tisular es un relleno dérmico. El relleno dérmico puede usarse para mejorar la apariencia o la afección de la piel, que incluye, pero sin limitarse a, rehidratar la piel, proporcionar mayor elasticidad a la piel, reducir la aspereza de la piel, hacer que la piel se tense, reducir o eliminar las líneas o marcas de estiramiento, proporcionar a la piel mejor tono, lustre, brillo y/o luminosidad, reducir o eliminar las arrugas en la piel, proporcionar a la piel resistencia a las arrugas y reemplazar la pérdida de tejido blando.

Un relleno dérmico que comprende partículas de fibroína de seda puede modularse en cuanto a su dureza y opacidad de la partícula a través de la alteración de la concentración de fibroína de seda y el método de formulación. En una realización, puede producirse un relleno dérmico mediante la formación de una fibroína de seda en estado sólido a partir de una solución de fibroína de seda de aproximadamente 6 % (p/v) a aproximadamente 20 % (p/v), seguido de la reducción de la fibroína de seda en estado sólido a partículas de fibroína de seda de manera que puedan inyectarse en un tejido a través de una aguja o una cánula. La aguja o la cánula pueden tener un diámetro externo no mayor que 3 mm, no mayor que 2 mm, no mayor que 1 mm, no mayor que 0,8 mm, no mayor que 0,6 mm, no mayor que 0,4 mm, no mayor que 0,2 mm o no mayor que 0,1 mm. En algunas realizaciones, el calibre de la aguja o la cánula puede variar de 12 a 34, de 15 a 34, de 20 a 32 o de 25 a 30. El tamaño de la aguja o la cánula puede determinarse de modo que permita una fuerza de extrusión adecuada de menos de 40 N (fuerza de inyección suministrable nominal para una mano humana).

En consecuencia, otro aspecto descrito en el presente documento proporciona un método para mejorar una afección y/o apariencia de la piel en un sujeto que lo necesite. Los ejemplos no limitantes de una afección y/o apariencia de la piel incluyen deshidratación, falta de elasticidad de la piel, aspereza, falta de tensión de la piel, líneas y/o marcas de estiramiento de la piel, palidez de la piel y arrugas de la piel. El método comprende inyectar una composición inyectable descrita en la presente descripción en una región dérmica del sujeto, en donde la inyección mejora la afección y/o apariencia de la piel. Por ejemplo, mejorar la apariencia de la piel incluye, pero no se limita a, rehidratar la piel, proporcionar mayor elasticidad a la piel, reducir la aspereza de la piel, hacer que la piel se tense, reducir o eliminar las líneas o marcas de estiramiento, proporcionar a la piel un mejor tono, lustre, brillo y/o luminosidad para reducir la palidez, reducir o eliminar las arrugas en la piel y proporcionar a la piel resistencia a las arrugas.

Como se usa en la presente descripción, el término “ región dérmica” se refiere a la región de la piel que comprende la unión epidérmica-dérmica y la dermis, que incluye la dermis superficial (región papilar) y la dermis profunda (región reticular). La piel está compuesta por tres capas primarias: la epidermis, que proporciona impermeabilización y sirve como barrera para la infección; la dermis, que sirve como ubicación para los apéndices de piel; y la hipodermis (capa adiposa subcutánea). La epidermis no contiene vasos sanguíneos y se alimenta por difusión desde la dermis. El tipo principal de células que componen la epidermis incluye, pero no se limita a, queratinocitos, melanocitos, células de Langerhans y células de Merkel.

La dermis es la capa de piel debajo de la epidermis que consiste en tejido conectivo y amortigua el cuerpo contra la tensión y la deformación. La dermis se conecta estrechamente a la epidermis mediante una membrana basal. También alberga muchas terminaciones mecanorreceptoras/nerviosas que proporcionan la sensación de tacto y calor. Contiene los folículos pilosos, glándulas sudoríparas, glándulas sebáceas, glándulas apocrinas, vasos linfáticos y vasos sanguíneos. Los vasos sanguíneos en la dermis proporcionan alimento y eliminación de desechos de sus propias células, así como del estrato basal de la epidermis. La dermis se divide estructuralmente en dos áreas: un área superficial adyacente a la epidermis, llamada región papilar, y un área profunda más gruesa conocida como la región reticular.

La región papilar está compuesta por tejido conectivo areolar laxo. Se llama así por sus proyecciones en forma de dedos llamadas papilas que se prolongan hacia la epidermis. Las papilas proporcionan a la dermis una superficie “ irregular” que se interconecta con la epidermis, lo que fortalece la conexión entre las dos capas de la piel. La región reticular se encuentra profunda en la región papilar y usualmente es mucho más gruesa. Está compuesta por tejido conectivo irregular denso y recibe su nombre de la concentración densa de fibras colágenas, elásticas y reticulares que se entretejen en la misma. Estas fibras proteicas proporcionan a la dermis sus propiedades de resistencia, extensibilidad y elasticidad. Dentro de la región reticular también se encuentran las raíces del cabello, las glándulas sebáceas, las glándulas sudoríparas, los receptores, las uñas y los vasos sanguíneos. Las marcas de estiramiento del embarazo también se encuentran en la dermis.

La hipodermis no es parte de la piel y se encuentra debajo de la dermis. Su fin es adherir la piel a los huesos y músculos subyacentes, así como suministrarle vasos sanguíneos y nervios. Consiste en tejido conectivo laxo y elastina. Los tipos de células principales son fibroblastos, macrófagos y adipocitos (la hipodermis contiene el 50 % de la grasa corporal). La grasa sirve como relleno y aislamiento para el cuerpo.

Los métodos de tratamiento descritos en el presente documento no forman parte de la invención reivindicada, sino que se proporcionan como aplicaciones ilustrativas de las composiciones reivindicadas. En una realización, en el presente documento se proporciona un método para tratar la deshidratación de la piel, que comprende inyectar en una región dérmica que padece deshidratación de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición rehidrata la piel, tratando así la deshidratación de la piel.

En otra realización, un método para tratar una falta de elasticidad de la piel comprende inyectar a una región dérmica que padece una falta de elasticidad de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición aumenta la elasticidad de la piel, tratando así una falta de elasticidad de la piel.

En otra realización más, un método para tratar la rugosidad de la piel comprende inyectar en una región dérmica que padece rugosidad de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición disminuye la rugosidad de la piel, tratando así la rugosidad de la piel.

En aún otra realización, un método para tratar una falta de firmeza de la piel comprende inyectar en una región dérmica que padece una falta de firmeza de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición hace que la piel se reafirme, tratando así una falta de firmeza cutánea.

En una realización adicional, un método para tratar una línea o marca de estiramiento de la piel comprende inyectar a una región dérmica que padece una línea o marcar de estiramiento de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición reduce o elimina la línea o marca de estiramiento de la piel, tratando así una línea o marca de estiramiento de la piel.

En otra realización, un método para tratar palidez de la piel comprende inyectar a una región dérmica que padece palidez de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición aumenta el tono o la luminosidad de la piel, tratando así la palidez de la piel.

En otra realización, un método para tratar las arrugas de la piel comprende inyectar a una región dérmica que padece arrugas de la piel una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición reduce o elimina las arrugas de la piel, tratando así las arrugas de la piel.

En otra realización más, un método para tratar, prevenir o retrasar la formación de arrugas de la piel comprende inyectar a una región dérmica susceptible o que muestra signos de arrugas una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un portador de fluido biológico (p. ej., un lipoaspirado) y/o un agente activo, en donde la inyección de la composición hace que la piel sea resistente a las arrugas de la piel, tratando, evitando o retrasando así la formación de arrugas de la piel.

El experto en la técnica puede determinar la cantidad eficaz y el cronograma de administración de las partículas de fibroína de seda inyectadas en una región dérmica teniendo en cuenta varios factores, que incluyen, sin limitación, el tipo de afección de la piel, la ubicación de la afección de la piel, la causa de la afección de la piel, la gravedad de la afección de la piel, el grado de alivio deseado, la duración del alivio deseado, la formulación particular de partícula de fibroína de seda usada, la velocidad de degradación o retención de volumen de la formulación de partícula de fibroína de seda particular usada, la farmacodinámica de la formulación de partícula de fibroína de seda particular usada, la naturaleza de los otros compuestos incluidos en la formulación de partícula de fibroína de seda particular usada, las características particulares, los antecedentes y los factores de riesgo del individuo, tales como, p. ej., edad, peso, salud general y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden inyectarse en una región dérmica cada 3 meses, cada 6 meses, cada 9 meses, cada año, cada dos años o más.

En otro aspecto, las composiciones inyectables pueden usarse como relleno dérmico para el volumen dérmico para reconstruir o aumentar una parte del cuerpo de tejido blando, tal como, p. ej., un labio, un seno, una parte del seno tal como el pezón, un músculo o cualquier otra parte blanda del cuerpo donde se use tejido adiposo y/o conectivo para proporcionar forma, aislamiento u otra función biológica. En los rellenos usados para estas aplicaciones, la concentración de fibroína de seda y/o la cantidad de un portador (p. ej., solución salina) añadida a la mezcla de partícula de fibroína de seda puede ajustarse para las restricciones relevantes de un ambiente biológico dado. Por ejemplo, las partículas de fibroína de seda para el aumento de senos pueden adaptarse en cuanto a la dureza de la partícula y la retención de volumen a través de la alteración de la concentración de fibroína de seda y el método de procesamiento. Por ejemplo, puede usarse aproximadamente 4 % (p/v) a aproximadamente 8 % (p/v) de concentración de fibroína de seda, que contiene opcionalmente un agente activo, p. ej., células adiposas tales como células madre derivadas de tejido adiposo o células de lipoaspirado, para producir las partículas de fibroína de seda. El contenido de portador en el caso de solución salina puede estar en el orden de 0 % a 25 % (v/v). También deben considerarse otros factores tales como, por ejemplo, el tipo de defecto, el tamaño del defecto y las necesidades de una profundidad específica de inyección del relleno.

Sin desear limitarse, si bien la inyección es mínimamente invasiva, también puede usarse otro método de administración, p. ej., implantación, cuando sea necesario, p. ej., para reparar o argumentar un área de defecto grande. Por ejemplo, para inyección dérmica y aumento de labios, puede usarse una aguja de jeringa con un tamaño de 26 g - 30 g. En aplicaciones que involucran grandes cantidades de relleno, p. ej., la reconstrucción de senos o aumento de senos puede usarse un tamaño de partícula más grande y una aguja de diámetro más grande tal como 23 g - 27 g o un calibre de aguja más pequeño para administrar el relleno. En algunas realizaciones, también puede emplearse cirugía, p. ej., implantación, para administrar grandes cantidades de relleno y/o alcanzar una cierta profundidad de los tejidos.

Por consiguiente, otro aspecto más descrito en el presente documento proporciona un método de reconstrucción, reparación o aumento de tejidos blandos, comprendiendo el método administrar una o más realizaciones de una composición inyectable descrita en el presente documento a una región de tejido blando de un individuo que lo necesite. Por ejemplo, la composición inyectable puede comprender una pluralidad de partículas de fibroína de seda, y opcionalmente un agente activo y/o un portador (p. ej., un portador de fluido biológico tal como un lipoaspirado). Un experto en la técnica puede determinar los métodos de administración de una composición inyectable descrita en la presente descripción. En algunas realizaciones, el método de administración puede ser inyección. En algunas realizaciones, el método de administración puede ser cirugía, p. ej., implantación.

Si bien las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento pueden aplicarse directamente en una región objetivo (p. ej., inyección o cirugía), en algunas realizaciones, una composición inyectable y/o partículas de fibroína de seda divulgadas en el presente documento también puede usarse para rellenar un dispositivo médico implantable expandible, tal como, p. ej., una bolsa de implante de seno expandible, que se coloca en un área de defecto. En tales realizaciones, en el presente documento se proporciona un método de reconstrucción, reparación o aumento de tejidos blandos, comprendiendo el método colocar un dispositivo médico implantable en una región de tejido blando de un individuo en la ubicación deseada; y expandir el dispositivo al rellenar el dispositivo con partículas de fibroína de seda y/o composiciones inyectables descritas en el presente documento, en donde la expansión del dispositivo médico al rellenarlo con partículas de fibroína de seda y/o composiciones inyectables descritas en el presente documento puede reconstruir o aumentar el tejido blando.

Las partículas de fibroína de seda o las composiciones inyectables divulgadas en el presente documento también pueden usarse junto con procedimientos de embolización por radiología intervencionista para bloquear vasos sanguíneos (arterias) anormales (p. ej., con el fin de detener la hemorragia) u órganos (para detener la función en exceso, p. ej., la embolización del bazo para el hiperesplenismo) que incluye la embolización de la arteria uterina para el tratamiento percutáneo de fibromas uterinos. La modulación de la dureza de la partícula de fibroína de seda y la tasa de retención de volumen puede realizarse mediante la alteración de la concentración de fibroína de seda y los métodos de procesamiento como se describió anteriormente.

Las partículas de fibroína de seda o las composiciones inyectables divulgadas en el presente documento pueden usarse para reparar el espacio vacío en una columna vertebral, p. ej., creado mediante cirugía de extracción del núcleo del disco vertebral, para ayudar a mantener la distancia normal entre los cuerpos vertebrales adyacentes. En algunas realizaciones, puede usarse un relleno de disco vertebral que comprende una pluralidad de partículas de fibroína de seda para reparar el espacio vacío presente en la columna vertebral, p. ej., entre cuerpos vertebrales y/o en un disco vertebral roto. En tales realizaciones, puede usarse una concentración de fibroína de seda de aproximadamente 4 % (p/v) a aproximadamente 10% (p/v) para fabricar las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento. Agentes acelerantes y/o activos también pueden mezclarse con partículas de fibroína de seda y/o composiciones inyectables antes, durante o después de la inyección en el sitio de interés.

Las partículas de fibroína de seda o las composiciones inyectables divulgadas en el presente documento pueden usarse para rellenar la cavidad vítrea para brindar soporte a la estructura del globo ocular y mantener la posición de la retina. Un experto en la técnica puede ajustar la viscosidad de la composición inyectable descrita en la presente descripción para la viscosidad del fluido vítreo en el ojo.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables pueden usarse como molde para la reconstrucción o aumento de tejidos, p. ej., la reconstrucción o aumento de tejidos blandos (p. ej., aumento de senos), o incluso para defectos pequeños de huesos o cartílagos tales como fracturas. La administración de las partículas de fibroína de seda o las composiciones inyectables descritas en el presente documento puede usarse para facilitar el crecimiento y la proliferación de cartílago/células óseas y brindar soporte a la deposición de la matriz de colágeno para mejorar así la reparación del cartílago/hueso. En otro aspecto, antes de la administración, las células de cartílago donante pueden sembrarse o mezclarse con las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en el presente documento para expandir la población de células y así promover el desarrollo de tejido cartilaginoso. En algunas realizaciones, a las partículas de fibroína de seda pueden añadirse factores de crecimiento específicos tales como TGF-p o proteínas morfogénicas óseas (BMP) que brindan soporte a la formación de tejido cartilaginoso u óseo, respectivamente.

En otra realización, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en el presente documento pueden usarse para cirugía plástica facial, tal como, p. ej., la reconstrucción de nariz. La estrategia de reconstrucción analizada anteriormente para reparar un defecto del cartílago/hueso también puede ser aplicable para la cirugía plástica facial.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en el presente documento pueden usarse como andamios para brindar soporte al crecimiento celular para la ingeniería de tejidos. Por ejemplo, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en el presente documento pueden administrarse en un sitio de la herida o incisión para promover la cicatrización o el cierre de la herida. Los métodos generalmente comprenden administrar una composición inyectable o partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento, en el sitio de la herida o incisión y permitir que la herida o incisión cicatrice mientras las partículas de fibroína de seda se erosionan o absorben en el cuerpo y se reemplazan con el tejido viable propio del individuo. Los métodos pueden comprender además sembrar las partículas de fibroína de seda o mezclar la composición inyectable con material celular viable, ya sea del individuo o de un donante, antes o durante la administración.

En otro aspecto, la composición inyectable que comprende partículas de fibroína de seda puede usarse, de manera directa o indirecta, en métodos para reparar, aumentar o reconstruir un tejido en un sujeto, p. ej., aumentar o reconstruir el seno de un ser humano. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables o partículas de fibroína de seda pueden colocarse directamente en un tejido (p. ej., un tejido mamario) a reparar o aumentar, p. ej., mediante inyección. Las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden inyectarse en un tejido (p. ej., un tejido mamario) cada 6 meses, cada año, cada 2 años, cada 3 años o más. En otras realizaciones, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden usarse para mejorar el soporte de un implante de tejido convencional, p. ej., mediante la mejora del soporte de la posición del polo inferior de un implante de seno. En realizaciones alternativas, el método generalmente puede comprender administrar una composición inyectable y/o partículas de fibroína de seda cerca o en la proximidad de un implante de tejido, por ejemplo, un implante de seno convencional, y sembrar la composición inyectable y/o las partículas de fibroína de seda con material celular viable antes o durante la administración. En otra realización más, puede usarse una composición inyectable y/o partículas de fibroína de seda para cubrir de manera parcial o completa un implante de tejido (p. ej., un implante de seno) para proporcionar una interfaz beneficiosa con el tejido huésped y reducir el potencial de colocación incorrecta o contractura capsular.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en el presente documento pueden usarse como rellenos para promover o brindar soporte a la adipogénesis, p. ej., para tratar lipodistrofias faciales. En tales realizaciones, las composiciones inyectables y/o las partículas de fibroína de seda pueden sembrarse o mezclarse con células asociadas al tejido adiposo, tales como células madre derivadas de tejido adiposo o lipoaspirado, antes de o simultáneamente con la inyección en un área objetivo que sufre lipodistrofias faciales en un sujeto. En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda pueden inyectarse cada 3 meses, cada 6 meses, cada 9 meses, cada año, o cada dos años o más, para mantener el tratamiento.

En otra realización más, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en el presente documento pueden usarse como andamio para células útiles para la reparación de nervios periféricos. Las partículas de fibroína de seda pueden suministrarse (p. ej., por medio de inyección) a la ubicación del defecto nervioso con o sin dispositivo adicional para ayudar a la conexión a los extremos de los nervios. Para tal fin, pueden añadirse factores de crecimiento específicos tales como el factor de crecimiento nervioso (NGF), que brinda soporte a la regeneración de nervios, a las composiciones inyectables y/o mezclarse con partículas de fibroína de seda antes o durante la administración. En tales realizaciones, pueden usarse partículas de fibroína de seda más blandas, p. ej., usando una concentración de fibroína de seda de aproximadamente 0,5 (p/v) a aproximadamente 3 % (p/v). Dependiendo del microambiente cerebral, también pueden usarse partículas de fibroína de seda más duras. Las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables pueden infundirse o añadirse con factores terapéuticos apropiados de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.

Cualquier célula descrita en el presente documento puede sembrarse sobre una superficie de partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento. Por ejemplo, las partículas de fibroína de seda pueden sumergirse en un medio de crecimiento apropiado para las células de interés y después exponerse directamente a las células. Se permite que las células proliferen en la superficie y los intersticios de las partículas de fibroína de seda. Después, las partículas de fibroína de seda se retiran del medio de crecimiento, se lavan si es necesario y se administran. Alternativamente, las células pueden colocarse en un tampón adecuado o un medio de crecimiento líquido y extraerse a través de las partículas de fibroína de seda mediante el uso de filtración al vacío. Las células también pueden mezclarse con solución de fibroína de seda antes de formar las partículas de fibroína de seda, para capturar al menos algunas de las células dentro de las partículas de fibroína de seda. En otra realización, las células de interés pueden dispersarse en una solución apropiada (p. ej., un medio de crecimiento o tampón) y después pulverizarse sobre partículas de fibroína de seda. Por ejemplo, la electropulverización involucra someter una solución que contiene células con una viscosidad y concentración apropiadas a un campo eléctrico suficiente para producir una pulverización de pequeñas gotas de solución cargadas que contienen células.

En algunas realizaciones, las partículas de fibroína de seda o las composiciones inyectables que comprenden al menos un agente activo pueden usarse como plataforma para el suministro de fármacos. Por ejemplo, las partículas de fibroína de seda pueden formarse con un agente farmacéutico ya sea arrastrado o unido a las partículas y después administrarse en el cuerpo (p. ej., mediante inyección, implantación o incluso administración oral). En algunas realizaciones, un agente activo puede mezclarse con partículas de fibroína de seda y/o composiciones inyectables y después administrarse en el cuerpo (p. ej., mediante inyección, implantación o incluso administración oral). Para una liberación prolongada o sostenida, las partículas de fibroína de seda pueden manipularse, p. ej., para modular su contenido de lámina beta, su retención de volumen y/o velocidad de degradación. Para controlar aún más el perfil de liberación del fármaco, las partículas de fibroína de seda que contienen fármacos farmacéuticamente activos pueden mezclarse con una fase adicional de gel de fibroína de seda que actúa como un portador con o sin un componente inductor de viscosidad, un tensioactivo y/o un fluido lubricante incluido como solución salina. Las partículas de fibroína de seda unidas a productos terapéuticos también pueden reticularse adicionalmente para mejorar la estabilidad y prolongar el período de liberación. En un enfoque alternativo, las partículas de fibroína de seda pueden mezclarse con otros polímeros, por ejemplo, ácido hialurónico, para prolongar la liberación de ciertos factores de crecimiento o citocinas y estabilizar la funcionalidad. Además, las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables también pueden usarse para recubrir sistemas de suministro de fármacos coaxiales, p. ej., por pulverización.

Como se usa en la presente descripción, el término “ liberación sostenida” se refiere a la liberación de un fármaco farmacéuticamente activo durante un período de aproximadamente siete días o más. En aspectos de esta realización, una plataforma de suministro de fármacos que comprende las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables libera un fármaco farmacéuticamente activo durante un período de, p. ej., al menos aproximadamente 7 días después de la administración, al menos aproximadamente 15 días después de la administración, al menos aproximadamente 30 días después de la administración, al menos aproximadamente 45 días después de la administración, al menos aproximadamente 60 días después de la administración, al menos aproximadamente 75 días después de la administración o al menos aproximadamente 90 días después de la administración.

Como se usa en la presente descripción, el término “ liberación prolongada” se refiere a la liberación de un fármaco farmacéuticamente activo durante un período de tiempo de menos de aproximadamente siete días. En tales realizaciones, una plataforma de suministro de fármacos que comprende las partículas de fibroína de seda y/o las composiciones inyectables descritas en la presente descripción puede liberar un fármaco farmacéuticamente activo durante un período de, p. ej., aproximadamente 1 día después de la administración, aproximadamente 2 días después de la administración, aproximadamente 3 días después administración, aproximadamente 4 días después de la administración, aproximadamente 5 días después de la administración o aproximadamente 6 días después de la administración.

Dependiendo de la formulación y los métodos de procesamiento de las partículas de fibroína de seda y las aplicaciones asociadas, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden administrarse (p. ej., mediante inyección) periódicamente, por ejemplo, cada 3 meses, cada 4 meses, cada 5 meses, cada 6 meses, cada 7 meses, cada 8 meses, cada 9 meses, cada 10 meses, cada 11 meses, cada año, cada 2 años o más.

En algunas realizaciones de cualquiera de las aplicaciones descritas en el presente documento, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden estar al menos parcialmente secas cuando se administran en un tejido a reparar o aumentar. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden estar secas (p. ej., en ausencia de un portador) cuando se administran en un tejido a reparar o aumentar.

En algunas realizaciones de cualquiera de las aplicaciones descritas en el presente documento, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden estar al menos parcialmente hidratadas cuando se administran en un tejido a reparar o aumentar. En algunas realizaciones, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden estar hidratadas (p. ej., en presencia de un portador, p. ej., una solución tamponada y/o lipoaspirado) cuando se administran en un tejido a reparar o aumentar.

En algunas realizaciones de cualquiera de las aplicaciones descritas en el presente documento, las composiciones inyectables o las partículas de fibroína de seda pueden inyectarse por vía subcutánea, submuscular o intramuscular.

En algunas realizaciones, los métodos y/o composiciones descritos en el presente documento pueden usarse en la región dérmica. En algunas realizaciones, los métodos y/o composiciones descritos en el presente documento pueden usarse en la capa epidérmica, la capa dérmica, la capa hipodérmica o cualquier combinación de las mismas.

Dispositivos de suministro y kits que comprenden partículas de fibroína de seda

En el presente documento también se describen dispositivos de suministro que comprenden una composición inyectable o partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento. Los dispositivos de suministro pueden ser cualquier dispositivo de suministro convencional utilizado para fines de inyección, p. ej., una jeringa. Por consiguiente, un aspecto adicional proporcionado en el presente documento es una jeringa que comprende una composición inyectable o partículas de fibroína de seda.

En algunas realizaciones, el dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) puede comprender además una aguja. En algunas realizaciones, el dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) puede comprender además un catéter o una cánula.

En varias realizaciones, el dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) puede incluir un portador de inyección, p. ej., una solución tamponada.

En varias realizaciones, el dispositivo de suministro (p. ej., una jeringa) puede incluir un anestésico.

En el presente documento se proporciona además un kit que comprende una realización de una composición inyectable o partículas de fibroína de seda empaquetada en una jeringa con una aguja o una cánula. En algunas realizaciones, un anestésico local puede mezclarse con la composición inyectable o las partículas de fibroína de seda dentro de la jeringa. En realizaciones alternativas, un anestésico local puede empaquetarse en un recipiente separado o en una jeringa separada. Por ejemplo, es conveniente aplicar un anestésico local a un tejido objetivo a tratar antes de un tratamiento adicional. Un anestésico ilustrativo incluye, pero no se limita a, lidocaína. En dependencia de la aplicación, el kit puede incluir tamaños de jeringas de 0,5 ml a 60 ml, donde las aplicaciones que requieren volúmenes más grandes (por ejemplo, rellenos óseos, rellenos de disco) se suministran en una jeringa de mayor tamaño. Además, el calibre de la aguja puede ajustarse de acuerdo con el sitio de inyección con un intervalo aceptable de agujas de 10 g a 30 g. Por ejemplo, pueden usarse agujas de 26 g a 30 g para inyecciones intradérmicas.

En algunas realizaciones, el kit puede comprender además una pluralidad de jeringas (cada una con una aguja) con una composición inyectable o partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento. Cada jeringa puede empaquetarse individualmente.

En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un recipiente que contiene una solución tamponada o un portador de inyección.

En algunas realizaciones, el kit puede comprender además al menos una jeringa vacía adicional. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además al menos una aguja adicional. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además al menos un catéter o una cánula.

Algunas definiciones de términos seleccionados

Como se utiliza en la presente memoria, un “ sujeto” significa un ser humano o un animal. Normalmente, el animal es un vertebrado tal como un primate, roedor, animal doméstico o animal salvaje. Los primates incluyen chimpancés, monos cynomolgus, monos araña y macacos, p. ej., Rhesus. Los roedores incluyen ratones, ratas, marmotas, hurones, conejos y hámsteres. Los animales domésticos y salvajes incluyen vacas, caballos, cerdos, ciervos, bisontes, búfalos, especies felinas, p. ej., gatos domésticos, especies caninas, p. ej., perros, zorros, lobos, especies de aves, p. ej., pollos, emú, avestruz y peces, p. ej., trucha, bagre y salmón. En ciertas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, el sujeto es un mamífero, p. ej., un primate, p. ej., un ser humano. Un sujeto puede ser masculino o femenino. Preferentemente, el sujeto es un mamífero. El mamífero puede ser un ser humano, un primate no humano, un ratón, una rata, un perro, un gato, un caballo o una vaca, pero no se limita a estos ejemplos. Los mamíferos diferentes a los seres humanos pueden usarse ventajosamente como sujetos que representan modelos animales de reparación, regeneración y/o reconstrucción de tejidos. Además, los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar animales domesticados y/o mascotas.

El término “ estadísticamente significativo” o “ significativamente” se refiere a la significación estadística y generalmente significa una desviación estándar de dos (2SD) por debajo o por encima de un nivel de referencia. El término se refiere a la evidencia estadística de que existe una diferencia. Se define como la probabilidad de tomar la decisión de rechazar la hipótesis nula cuando la hipótesis nula es realmente verdadera. La decisión a menudo se toma con el uso del valor p.

Como se usa en la presente descripción, los términos “ proteínas” y “ péptidos” se usan indistintamente en la presente descripción para designar una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos alfa-amino y carboxi de residuos adyacentes. Los términos “ proteína” y “ péptido” , que se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a un polímero de aminoácidos proteicos, que incluyen aminoácidos modificados (por ejemplo, fosforilados, glicosilados, etcétera) y análogos de aminoácidos, independientemente de su tamaño o función. Aunque “ proteína” se usa a menudo en referencia a polipéptidos relativamente grandes y “ péptido” se usa a menudo en referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se superpone y varía. El término “ péptido” como se usa en la presente descripción se refiere a péptidos, polipéptidos, proteínas y fragmentos de proteínas, a menos que se indique de otra manera. Los términos “ proteína” y “ péptido” se usan indistintamente en la presente descripción cuando se refieren a un producto génico y fragmentos del mismo. Por lo tanto, los péptidos o proteínas ilustrativos incluyen productos génicos, proteínas de origen natural, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos y otros equivalentes, variantes, fragmentos y análogos de los anteriores.

El término “ ácidos nucleicos” usado en la presente descripción se refiere a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) y, cuando corresponda, ácido ribonucleico (ARN), polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes de la misma modificadas de manera conservadora (por ejemplo, sustituciones de codones redundantes) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, las sustituciones de codones degeneradas pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer, et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985), y Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Debe entenderse que el término “ ácido nucleico” también incluye, equivalentes, derivados, variantes y análogos de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos monocatenarios (sentido o antisentido) y bicatenarios.

La expresión “ARN corto de interferencia” (ARNpi), también denominado en el presente documento “ARN pequeño de interferencia” se define como un agente que funciona para inhibir la expresión de un gen diana, p. ej., por ARNi. Un ARNpi puede sintetizarse químicamente, puede producirse por transcripción in vitro o puede producirse dentro de una célula huésped. Las moléculas de ARNpi también pueden generarse mediante la escisión de ARN bicatenario, donde una cadena es idéntica al mensaje a inactivar. El término “ARNpi” se refiere a pequeños dúplex de ARN inhibidores que inducen la vía de interferencia de ARN (ARNi). Estas moléculas pueden variar en longitud (generalmente 18-30 pares de bases) y contienen grados variables de complementariedad con su ARNm objetivo en la cadena antisentido. Algunos ARNpi, pero no todos, tienen bases salientes desapareadas en el extremo 5' o 3' de la cadena codificante 60 y/o la cadena no codificante. El término “ARNpi” incluye dúplex de dos cadenas separadas, así como cadenas individuales que pueden formar estructuras de horquilla que comprenden una región dúplex.

El término “ARNhc” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a ARN de horquilla corto que funciona como una especie de ARNi y/o ARNpi, pero se diferencia en que las especies de ARNhc tienen una estructura similar a una horquilla bicatenaria para una mayor estabilidad. El término “ARNi” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a ARN de interferencia o a moléculas de interferencia de ARN que son moléculas de ácido nucleico o análogos de las mismas, por ejemplo, moléculas basadas en ARN que inhiben la expresión génica. ARNi se refiere a un medio de silenciamiento génico postranscripcional selectivo. El ARNi puede dar lugar a la destrucción de un ARNm específico, o previene el procesamiento o la traducción del ARN, tal como el ARNm.

El término “ enzimas” , como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula de proteína que cataliza las reacciones químicas de otras sustancias sin destruirse o alterarse sustancialmente al finalizar las reacciones. El término puede incluir enzimas de origen natural y enzimas obtenidas por bioingeniería o mezclas de las mismas. Los ejemplos de familias de enzimas incluyen quinasas, deshidrogenasas, oxidorreductasas, GTPasas, carboxiltransferasas, aciltransferasas, descarboxilasas, transaminasas, racemasas, metiltransferasas, formiltransferasas y a-cetodescarboxilasas.

Como se usa en la presente descripción, el término “ aptámeros” significa una secuencia de nucleótidos monocatenaria, parcialmente monocatenaria, parcialmente bicatenaria o bicatenaria que puede reconocer específicamente una molécula o grupo de moléculas no oligonucleotídicas seleccionadas. En algunas realizaciones, el aptámero reconoce la molécula o el grupo de moléculas no oligonucleotídicas por un mecanismo diferente al apareamiento de bases de Watson-Crick o la formación de tríplex. Los aptámeros pueden incluir, sin limitación, segmentos de secuencia definidos y secuencias que comprenden nucleótidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados y nucleótidos que comprenden modificaciones de la cadena principal, puntos de ramificación y residuos no nucleotídicos, grupos o puentes. Los métodos para seleccionar aptámeros para la unión a una molécula se conocen ampliamente en la técnica y son de fácil acceso para un experto en la técnica.

Como se usa en la presente descripción, el término “ anticuerpo” o “ anticuerpos” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a un fragmento de unión al antígeno monoclonal o policlonal con la región Fc (fragmento cristalizable) o fragmento de unión a FcRn de la región Fc. El término “ anticuerpos” también incluye “ moléculas similares a anticuerpos” , tales como fragmentos de los anticuerpos, p. ej., fragmentos de unión al antígeno. Los fragmentos de unión al antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o mediante escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Los “ fragmentos de unión al antígeno” incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, dAc y fragmentos de región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de dominio único, anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir al polipéptido unión a un antígeno específico. Los anticuerpos lineales también se incluyen para los fines descritos en la presente descripción. Los términos Fab, Fc, pFc', F(ab')₂ y Fv se emplean con significados inmunológicos estándar (Klein, Immunology (Klein, Immunology (John Wiley, Nueva York, N.Y., 1982); Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nueva York); y Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)). Los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno específicos para varios antígenos están disponibles comercialmente de proveedores tales como R&D Systems, BD Biosciences, e-Biosciences y Miltenyi, o pueden generarse contra estos marcadores de superficie celular mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Como se usa en el presente documento, la expresión “ regiones determinantes de complementariedad” (CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión al antígeno. Cada dominio variable tiene típicamente tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Cada región determinante de complementariedad puede comprender residuos de aminoácidos de una “ región determinante de complementariedad” como se define por Kabat (es decir, aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H₂) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un “ lazo hipervariable” (es decir, aproximadamente los residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H₂) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). En algunos casos, una región determinante de complementariedad puede incluir aminoácidos tanto de una región CDR definida de acuerdo con Kabat como de un lazo hipervariable.

La expresión “ anticuerpos lineales” se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. , Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.

La expresión fragmentos de anticuerpo “ Fv de cadena sencilla” o “ scFv” , como se usa en la presente descripción, se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. Preferentemente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. (Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994)).

El término “ diacuerpos” , como se usa en la presente descripción, se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH - VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. (EP 404,097; WO 93/11161; Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sd. EE. UU., P0:6444-6448 (1993)).

Como se usa en la presente descripción, el término “ moléculas pequeñas” se refiere a moléculas naturales o sintéticas que incluyen, pero sin limitarse a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, aptámeros, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, que incluyen compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 5000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 1000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular menor que aproximadamente 500 gramos por mol, y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de tales compuestos.

El término “ antibióticos” se usa en la presente descripción para describir un compuesto o composición que disminuye la viabilidad de un microorganismo, o que inhibe el crecimiento o la reproducción de un microorganismo. Como se usa en esta divulgación, un antibiótico pretende incluir además un agente antimicrobiano, bacteriostático o bactericida. Los antibióticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, penicilinas, cefalosporinas, penems, carbapenems, monobactamas, aminoglucósidos, sulfonamidas, macrólidos, tetraciclinas, lincosides, quinolonas, cloranfenicol, vancomicina, metronidazol, rifampina, isoniazida, espectinomicina, trimetoprima y sulfametoxazol.

El término “ agentes terapéuticos” se reconoce en la técnica y se refiere a cualquier resto químico que es una sustancia biológica, fisiológica o farmacológicamente activa que actúa de manera local o sistémica en un sujeto. Los ejemplos de agentes terapéuticos, también denominados “ fármacos” , se describen en referencias bibliográficas bien conocidas tales como the Merck Index, the Physicians Desk Reference, y The Pharmacological Basis of Therapeutics, e incluyen, sin limitación, medicamentos; vitaminas; complementos minerales; sustancias utilizadas para el tratamiento, prevención, diagnóstico, cura o mitigación de una enfermedad o malestar; sustancias que afectan a la estructura o función del cuerpo; o profármacos, que se vuelven biológicamente activos o más activos después de que se hayan colocado en un entorno fisiológico. Pueden usarse varias formas de un agente terapéutico que pueden liberarse desde la composición en cuestión a tejidos o fluidos adyacentes tras la administración a un sujeto. Los ejemplos incluyen esteroides y ésteres de esteroides (p. ej., estrógenos, progesterona, testosterona, androsterona, colesterol, noretindrona, digoxigenina, ácido cólico, ácido desoxicólico y ácido quenodesoxicólico), compuestos que contienen boro (p. ej., carborano), nucleótidos quimioterapéuticos, fármacos (p. ej., antibióticos, antivirales, antifúngicos), enediínos (por ejemplo, caliqueamicinas, esperamicinas, dinemicina, cromóforo de neocarzinostatina y cromóforo de kedarcidina), complejos de metales pesados (p. ej., cisplatino), antagonistas de hormonas (p. ej., tamoxifeno), proteínas no específicas (que no son anticuerpos) (p. ej., oligómeros de azúcares), oligonucleótidos (p. ej., oligonucleótidos antisentido que se unen a una secuencia de ácido nucleico objetivo (p. ej., secuencia de ARNm)), péptidos, proteínas, anticuerpos, agentes fotodinámicos (p. ej., rodamina 123), radionúclidos (p. ej., I-131, Re-186, Re-188, Y-90, Bi-212, At-211, Sr-89, Ho-166, Sm-153, Cu-67 y Cu-64), toxinas (p. ej., ricina) y productos farmacéuticos basados en la transcripción.

Como se usa en la presente descripción, el término “ hormonas” generalmente se refiere a hormonas, análogos y miméticos de las mismas de origen natural o no natural. En ciertas realizaciones, el término “ hormonas” se refiere a cualquier hormona usada en el tratamiento terapéutico, p. ej., el tratamiento con hormona de crecimiento. Como se usa en la presente descripción, “ hormona de crecimiento” o “ GH” se refiere a la hormona de crecimiento en secuencia nativa o en forma variante, y de cualquier fuente, ya sea natural, sintética o recombinante. Los ejemplos incluyen la hormona de crecimiento humano (hGH), que es la GH natural o recombinante con la secuencia nativa humana (somatotropina o somatropina), y la hormona de crecimiento recombinante (rGH), que se refiere a cualquier GH o variante producida por medio de tecnología de ADN recombinante, que incluye somatrem, somatotropina y somatropina. En una realización, las hormonas incluyen insulina.

Como se usa en la presente descripción, un “ agente de contraste” puede ser cualquier resto químico que se usa para incrementar el grado de diferencia entre la parte más clara y la más oscura de una exploración o una imagen, p. ej., durante una exploración u obtención de imágenes médicas, en relación con una exploración realizada sin el uso de un agente de contraste. Por ejemplo, los agentes de contraste pueden incluir agentes de formación de imágenes que contienen radioisótopos tales como indio o tecnetio; colorantes que contienen yodo, gadolinio o cianina; enzimas tales como peroxidasa de rábano picante, GFP, fosfatasa alcalina o p-galactosidasa; sustancias fluorescentes tales como derivados de europio, sustancias luminiscentes tales como derivados de N-metilacridio o similares. En algunas realizaciones, los agentes de contraste pueden incluir nanopartículas de oro y/o puntos cuánticos.

Como se usa en la presente descripción, el término “ sustancialmente” significa una proporción de al menos aproximadamente 60 %, o preferentemente al menos aproximadamente 70 % o al menos aproximadamente 80 %, o al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 % o al menos aproximadamente 99 % o más, o cualquier número entero entre 70 % y 100 %. En algunas realizaciones, el término “ sustancialmente” significa una proporción de al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 98 %, al menos aproximadamente 99 % o más, o cualquier número entero entre 90 % y 100 %. En algunas realizaciones, el término “ sustancialmente” puede incluir el 100 %.

Como se usa en la presente descripción, el término “ que comprende” significa que también pueden estar presentes otros elementos además de los elementos definidos presentados. El uso de “ que comprende” indica inclusión más que limitación.

La expresión “ que consiste en” se refiere a los componentes del mismo como se describe en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no mencionado en esa descripción de la realización.

Como se usa en la presente descripción, el término “ que consiste esencialmente en” se refiere a aquellos elementos requeridos para una modalidad determinada. El término permite la presencia de elementos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s) o funcional(es) de esa modalidad de la invención.

Aparte de en los ejemplos operativos, o donde se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción utilizados en la presente memoria deben considerarse modificados en todos los casos por el término “ aproximadamente” . El término “ aproximadamente” , cuando se usa en relación con porcentajes puede significar ±1 %.

Los términos singulares “ un” , “ una” y “ el” y “ la” incluyen los referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra “ o” pretende incluir “y” a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque en la puesta en práctica o ensayo de esta descripción se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. La abreviatura, “ p. ej.” deriva de la expresión latina exempli gratia y se utiliza en el presente documento para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura “ p. ej.” es sinónimo del término “ por ejemplo” .

A menos que se explique de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Las definiciones de términos comunes en enfermedades y trastornos, técnicas de separación y detección pueden encontrarse en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-18-2); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, los protocolos y los reactivos, etc., particulares, descritos en el presente documento y, por tanto, pueden variar. La terminología utilizada en la presente memoria tiene el único propósito de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que se define únicamente por las reivindicaciones.

Algunas realizaciones descritas en el presente documento se ilustran adicionalmente mediante el siguiente ejemplo que no debe considerarse limitativo.

Ejemplos

Ejemplo 1. Comparación de partículas de andamio de fibroína de seda de inyectables (según la invención reivindicada) con otros andamios de fibroína de seda o hidrogeles (ambos no según la invención reivindicada).

Materiales y métodos ilustrativos

Materiales: Todos los productos químicos y disolventes utilizados en los Ejemplos para la preparación del andamio de seda se adquirieron en Sigma Aldrich (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario. Se adquirió agua estéril y solución salina en Invitrogen (Carlsbad, CA). Cabe señalar que pueden usarse materiales equivalentes y adquirirse en otros proveedores comerciales.

Preparación de soluciones de fibroína de seda: Se adquirieron capullos de gusanos de seda de Bombyx mori en Takimia Shoji Co. (Yokohamga, Japón). Los capullos se cortaron en pedazos y se hirvieron en Na2CO₃0,02 M durante aproximadamente 10-60 minutos, y preferentemente durante aproximadamente 30 minutos. Las fibras de fibroína de seda resultantes se enjuagaron en agua destilada y se dejaron secar. Las fibras de fibroína de seda secas se volvieron a solubilizar en LiBr 9,3 M a 60 °C, durante aproximadamente 1-4 horas, hasta que se disolvieron. La solución de fibroína de seda se dializó, con un valor de corte de peso molecular de 3500 Daltons, contra agua destilada por al menos 6 cambios de agua. La solución de fibroína de seda acuosa se liofilizó todavía seca y luego se disolvió en hexafluoro-iso-propanol (HFIP) para producir una solución de fibroína de seda basada en disolvente al 17 % (p/v).

Preparación de andamios porosos de fibroína de seda: Los andamios porosos de fibroína de seda se formaron ya sea de soluciones de fibroína de seda de base acuosa o basadas en disolvente (p. ej., 6 %-20 % p/v). Se usaron porógenos (p. ej., sales tales como cloruro de sodio NaCl) con un tamaño que varía de 100 micrómetros a 1,2 milímetros. Los porógenos se envasaron en un recipiente recubierto con Teflón, y la solución de fibroína de seda se vertió sobre la sal. El recipiente se cubrió y se dejó reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1-3 días. A continuación, el recipiente se dejó sin cubrir durante aproximadamente 1 día. El recipiente se colocó en agua destilada para lixiviar la sal. Alternativamente, el andamio puede colocarse en un baño de metanol o recocer en agua durante aproximadamente 1 hora a aproximadamente 1 día para inducir adicionalmente la formación de lámina beta. En algunas realizaciones, los andamios porosos de fibroína de seda pueden recubrirse adicionalmente con moléculas de matriz extracelular, tales como laminina, para facilitar la unión de células. En algunas realizaciones, los andamios porosos de fibroína de seda pueden recubrirse sin moléculas de matriz extracelular.

Preparación de andamios porosos de fibroína de seda inyectables: Los andamios porosos de fibroína de seda de base acuosa o a base de disolvente se desmenuzaron manualmente o mediante medios mecánicos, por ejemplo, con una cuchilla giratoria, tal como las de los procesadores de alimentos convencionales. Los armazones desmenuzados se pasaron a través de tamices de varias aberturas para obtener el intervalo de tamaño deseado. Los andamios desmenuzados se dejaron secar y después se esterilizaron en autoclave para esterilizarlos. Los andamios desmenuzados, esterilizados en autoclave, secos (denominados “ partículas de andamio de fibroína de seda” a continuación) se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso.

Preparación de hidrogeles de fibroína de seda inyectables (“ geles sometidos a agitación vorticial de fibroína de seda” ): La solución acuosa de fibroína de seda (p. ej., -4 % p/v) se esterilizó primero al pasar a través de una unidad de filtro de 0,22 micrómetros. La solución de fibroína de seda estéril se concentró luego, por ejemplo, a soluciones de -8 %, -10 % y -12 % p/v, mediante el uso de unidades de filtro centrífugas (Unidad de filtro centrífuga Amicon Ultra-15, Millipore, Billerica, MA) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Para formar los hidrogeles de fibroína de seda inyectables, se empleó un método de agitación vorticial (Yucel et al, 2009. Biophys J. 97: 2044). Brevemente, las soluciones acuosas de fibroína de seda se agitaron en vórtex (Vortex-Genie 2, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) con potencia y tiempo variables, dependiendo del volumen de la muestra y de la concentración, hasta que la solución transparente se volvió turbia. La solución turbia se puso a ~37 °C durante aproximadamente 30 minutos para inducir adicionalmente la gelificación. Después de 30 minutos, el hidrogel solo o mezclado con lipoaspirado se cargó en una jeringa y se inyectó.

Métodos de inyección: Los andamios de fibroína de seda se inyectaron a través de diferentes métodos, p. ej., por vía subcutánea, intramuscular o submuscular, en una variedad de preparaciones. Las preparaciones ilustrativas incluyen, aunque sin limitación, estado seco, estado seco mezclado con lipoaspirado, estado hidratado (p. ej., en agua estéril o solución salina normal), o estado hidratado mezclado con lipoaspirado.

Inyecciones in vivo: Se usó un modelo de rata desnuda hembra para evaluar los andamios de fibroína de seda y los hidrogeles descritos en el presente documento. También pueden usarse otros modelos de mamíferos (p. ej., modelos de ratón, conejo, canino o porcino) dependiendo de las aplicaciones de los andamios de fibroína de seda inyectables y los tejidos a modelar para el tratamiento. Las ratas de seis meses de edad se pesaron y anestesiaron con isoflurano en oxígeno antes de la inyección. Se usó un total de aproximadamente 1 ml por inyección. Brevemente, los andamios de fibroína de seda secos se sumergieron en solución salina o lipoaspirado inmediatamente antes de cargarlos en un catéter. La jeringa cargada se unió a una cánula no superior a 2 mm de diámetro interno. Las inyecciones subcutáneas se realizaron por encima de los músculos pectorales. Se realizaron inyecciones intramusculares y submusculares entre los músculos pectoral mayor y pectoral menor o debajo de los músculos pectorales, respectivamente. Se realizó un método de inyección subcutánea en abanico en el dorso de la rata. Véase, por ejemplo, la Figura 1. Las muestras inyectadas se explantaron y evaluaron para determinar el peso, la retención de volumen y los resultados histológicos después de 1, 2, 10 y 30 días. La retención de volumen se realizó mediante 2 métodos, por ejemplo, mediciones en balanza y desplazamiento de volumen. En algunas realizaciones, se implantaron andamios porosos de fibroína de seda completos (5 mm de diámetro x 2 mm de altura) en las mismas ubicaciones para comparación.

Histología: Los explantes se cortaron a la mitad y se fijaron en formalina al 10 % durante la noche a 4 °C. Un grupo se incrustó en medio de congelación OCT, se crioseccionó en secciones de 10 micrómetros y se tiñó con Oil Red O. La mitad restante se colocó a través de una serie de etapas de deshidratación, se incrustó en parafina y se cortó en secciones de 10 micrómetros. Se colocaron tres secciones continuas en cada portaobjetos y se tiñeron de acuerdo con métodos histológicos estándar para hematoxilina y eosina (H y E), o se procesaron para inmunohistoquímica. Después de la recuperación del antígeno, las secciones se incubaron con anticuerpos de núcleo antihumano CD31, CD68, CD80, CD163, antirrata primarios durante aproximadamente 1 hora. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos biotinilados secundarios creados en la especie de los anticuerpos primarios durante aproximadamente 1 hora. Se usó el kit de detección de anticuerpo Vector Labs ABC junto con un sustrato DAB para mejorar la expresión colorimétrica.

Resultados

En algunas realizaciones, los geles sometidos a agitación vorticial de fibroína de seda, solos o mezclados con lipoaspirado, pueden ser reabsorbidos más rápido que el lipoaspirado solo en un estudio de 6 semanas. Por consiguiente, algunas realizaciones de los geles sometidos a agitación vorticial de fibroína de seda pueden no ser ideales para las aplicaciones que requieren una retención de tamaño y/o forma durante un tiempo prolongado tal como 6 semanas o más. Sin embargo, en algunas realizaciones, las propiedades de retención de volumen del gel sometido a agitación vorticial de fibroína de seda se pueden ajustar, por ejemplo, mediante modulación de la concentración de fibroína de seda y/o agitación vorticial o velocidad de cizallamiento de la solución de fibroína de seda.

Los andamios porosos de fibroína de seda implantados pueden retener su forma y tamaño durante un período de tiempo prolongado. Sin embargo, los andamios porosos de fibroína de seda implantados generalmente requieren que sean colocadas una o más incisiones. Adicionalmente, los andamios porosos de fibroína de seda implantados generalmente se vacían al rellenar un hueco anatómico particular antes de la cirugía, y/o no pueden moldearse durante la cirugía para rellenar un hueco de forma irregular.

A diferencia de los geles sometidos a agitación vorticial de fibroína de seda o los andamios porosos de fibroína de seda implantados, un armazón poroso de fibroína de seda inyectable (p. ej., partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento) puede servir como una terapia que es mínimamente invasiva y capaz de mantener su tamaño y forma durante al menos aproximadamente 1 mes, al menos aproximadamente 2 meses, al menos aproximadamente 3 meses, al menos aproximadamente 4 meses, al menos aproximadamente 6 meses, o al menos aproximadamente 1 año o más, mientras que aún es un producto listo para usar. Si bien los andamios de fibroína de seda inyectables (p. ej., las partículas de fibroína de seda descritas en el presente documento) pueden reducir la administración a un procedimiento mínimamente invasivo, también pueden permitir al cirujano moldear de manera flexible los andamios de fibroína de seda inyectables (p. ej., en forma de partículas) en cualquier forma o defecto de tamaño.

Como se muestra en la Tabla 1, se usaron diferentes combinaciones de diversos parámetros relacionados con los parámetros del andamio y/o métodos de inyección para evaluar la aplicación in vivo de andamios de fibroína de seda inyectables.

Tabla 1: Diversas combinaciones de parámetros ilustrativos relacionados con las propiedades de partícula de andamio inyectable y los métodos de inyección

En algunas realizaciones, se emplearon dos métodos diferentes de procesamiento de la fibroína de seda para alterar la tasa de degradación de la fibroína de seda. Se ha demostrado previamente que los implantes de andamio poroso de fibroína de seda en un modelo de rata subcutáneo se degradan dentro de los 3-6 meses cuando se preparan con el método acuoso, pero permanecen durante al menos hasta 2 años cuando se preparan con un método a base de disolvente (Wang et al. 2008. Biomaterials. 29: 3415). Por consiguiente, cualquier método puede usarse para preparar los andamios de fibroína de seda inyectables, dependiendo de las propiedades deseadas de los andamios, aplicaciones y/o tejidos a tratar. En algunas realizaciones, pueden usarse métodos acuosos para preparar andamios de fibroína de seda inyectables. En otras realizaciones, pueden usarse métodos a base de disolventes para preparar andamios de fibroína de seda inyectables. En este Ejemplo, se estudiaron los andamios de fibroína de seda inyectables preparados mediante métodos de base acuosa y a base de disolvente para evaluar la integración después de que el material de fibroína de seda se haya introducido completamente y la integración a largo plazo del material. Los puntos temporales tempranos (p. ej., 1-2 días) pueden utilizarse para evaluar los signos de inflamación aguda, mientras que los puntos temporales posteriores se evalúan para la integración general del tejido, la vascularidad, la retención de volumen y la degradación del andamio.

Otra variable a evaluar fue un intervalo de tamaño de poro. Los poros más pequeños, 300-500 micrómetros se compararon con poros más grandes, 850-1000 micrómetros. Además, se evaluaron varios diámetros de las partículas de andamio de fibroína de seda inyectables, como se muestra en la Tabla 1. En algunas realizaciones, también pueden producirse partículas de andamio de fibroína de seda inyectables inferiores a varios micrómetros. En algunas realizaciones, a medida que las partículas de andamio de fibroína de seda se degradan, no producen una respuesta inflamatoria adversa debido a su tamaño. Como se muestra en la Tabla 1, las partículas de andamio de fibroína de seda pueden estar secas o hidratadas. Una de las ventajas de usar partículas de andamio de fibroína de seda secas es que pueden usarse ya preparadas. Otro beneficio de las partículas secas es su capacidad de infundirse en las partículas de andamio mientras se elimina la necesidad de prehidratarlas.

Las diferentes ubicaciones de inyección, como se muestra en la Tabla 1, pretenden representar ejemplos de sitios de inyección clínicos para una variedad de aplicaciones, pero no deben interpretarse como limitantes. Por ejemplo, las inyecciones subcutáneas pueden ser representativas de los rellenos de defectos de tejidos blandos; las inyecciones subcutáneas, submusculares e intramusculares pueden ser representativas de reconstrucciones de mama.

En algunas realizaciones, los andamios de fibroína de seda inyectables (p. ej., no sembradas o sembradas con células) también pueden aumentar la vascularización en un tejido a tratar en al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o más, en comparación con un tejido no tratado o un tejido tratado con composiciones inyectables no de seda.

En algunas realizaciones, los andamios de fibroína de seda inyectables sembrados con células, por ejemplo, ASC o lipoaspirado, también pueden aumentar su integración con el tejido huésped en al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con un tejido tratado con andamios de fibroína de seda inyectables no sembrados.

En algunas realizaciones, los andamios de fibroína de seda inyectables sembrados con células, por ejemplo, ASC o lipoaspirado, pueden aumentar la regeneración de tejido adiposo en al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o más, en comparación con un tejido tratado con andamios de fibroína de seda inyectables no sembrados.

Ejemplo 2. Estudios in vivo de andamios de fibroína de seda inyectables

Materiales y métodos ilustrativos

Preparación de andamios porosos de fibroína de seda inyectables: En realizaciones particulares, los andamios porosos de fibroína de seda se formaron a partir de soluciones de seda a base de disolvente (17 % p/v). Los porógenos pueden usarse para crear poros con los andamios. En ciertas realizaciones, se usaron porógenos de NaCl con un tamaño que varía de aproximadamente 300-500 micrómetros. En ciertas realizaciones, se usaron porógenos de NaCl con un tamaño que varía de aproximadamente 850-1000 micrómetros. Se envasaron porógenos de NaCl en un recipiente recubierto de Teflón, y se vertió la disolución de seda sobre la sal. El recipiente se cubrió y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1-3 días. A continuación, el recipiente se dejó sin cubrir durante 1 día. El recipiente se colocó en agua destilada para lixiviar la sal. En algunas realizaciones, los andamios resultantes de seda se colocaron en un baño de metanol durante 1 día para inducir aún más la formación de la lámina beta. A continuación, pueden producirse andamios porosos de fibroína de seda inyectables mediante el uso de los métodos descritos en el Ejemplo 1, p. ej., mediante la reducción del andamio poroso de fibroína de seda en piezas más pequeñas. Véase, p. ej., la Figura 2.

Preparación de lipoaspirado procesado: Se obtuvo un lipoaspirado de cirugía plástica electiva el mismo día de inyección del andamio. El lipoaspirado se transportó asépticamente a temperatura ambiente justo después de la cirugía. Se añadieron aproximadamente 30 ml de lipoaspirado a un tubo cónico de 50 ml y se centrifugó a temperatura ambiente a 1000 rpm durante 10 minutos. Se retiró la sangre y los lípidos libres. El tejido restante se colocó en placas de Petri estériles. Los andamios porosos de fibroína de seda inyectables se colocaron en el lipoaspirado procesado durante 1 hora antes de la inyección.

Métodos de inyección: Se extrajo un ml de andamio poroso de fibroína de seda desmenuzado y lipoaspirado en una jeringa de 1 ml. Las relaciones de volumen finales de lipoaspirado respecto a los andamios de seda podrían variar de 19:3 (dosis baja) a 19:6 (dosis alta). En algunas realizaciones, el andamio inyectable y la mezcla de lipoaspirado se inyectaron por vía subcutánea a través de una aguja de calibre 24, en un estado hidratado con lipoaspirado, en la parte posterior de un ratón atímico. Véase, p. ej., la Figura 1.

Histología: La muestra de explante y las construcciones se procesaron de acuerdo con los protocolos de histología estándar. Las muestras fijadas con formalina se colocaron a través de una serie de disolventes de deshidratación y finalmente parafina usando un procesador de tejido automatizado. Las muestras se incrustaron en parafina, se cortaron en secciones de 10 micrómetros y se dejaron adherir sobre portaobjetos de vidrio. Las secciones se rehidrataron y se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se obtuvieron imágenes.

Resultados

A las 6 semanas después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se recogieron los materiales inyectados. Se midió el peso y la masa de las masas explantadas. No se encontraron diferencias en el cambio de peso relativo o cambio de masa con las partículas de fibroína de seda producidas a partir de fibroína de seda porosa en estado sólido de porosidades variables (p. ej., poros de 300-500 micrómetros frente a poros de 850-1000 micrómetros) o relaciones relativas de andamio de fibroína de seda respecto a lipoaspirado (p. ej., 3:19 vs. 6:19) en dicho punto temporal.

Como se muestra en la Figura 3, se detectó el lipoaspirado inyectado (flechas de línea) en todos los grupos. Dentro del lipoaspirado inyectado, se detectaron piezas de andamio de fibroína de seda inyectables (flechas punteadas). Los materiales de fibroína de seda inyectados no indujeron una respuesta proinflamatoria; sin embargo, los macrófagos se detectaron en la periferia de la masa inyectada.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inyectable para su uso en un método para reparar o aumentar un tejido en un sujeto, comprendiendo dicha composición una pluralidad de partículas porosas de fibroína de seda, en donde las partículas porosas de fibroína de seda no son un hidrogel, en donde las partículas de fibroína de seda retienen al menos el 50 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas, en donde las partículas porosas de fibroína de seda tienen una porosidad de al menos 1 % y un tamaño de 500 nm a 5000 |jm.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde las partículas de fibroína de seda excluyen un péptido anfifílico, en donde dicho péptido anfifílico comprende un motivo RGD.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde las partículas de fibroína de seda retienen al menos: (a)

50 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 3 meses; (b)

50 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 meses; (c)

60 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas; (d)

70 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas; (e)

80 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 6 semanas; o (f)

70 % de su volumen original dentro del tejido durante al menos 3 meses.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las partículas de fibroína de seda están adaptadas para degradarse no más de: (a) 50 % de su volumen original en al menos 6 semanas; (b) 50 % de su volumen original en al menos 3 meses; (c) 30 % de su volumen original en al menos 6 semanas; (d) 10 % de su volumen original en al menos 6 semanas; o (e) 30 % de su volumen original en al menos 3 meses.

5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde: (a) las partículas porosas de fibroína de seda tienen una porosidad de al menos: (i) 5 %, 10 %, 15 % o 30 %; (ii) 50 %; o (iii) 70 %; y/o (b) los poros tienen un tamaño de: (i) 10 jm a 1000 jm ; o (ii) 1 jm a 1000 jm ; y/o (c) las partículas de fibroína de seda tienen un tamaño de 1 jm a 2000 jm o de 10 jm a 1500 jm .

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las partículas porosas de fibroína de seda se fabrican reduciendo una fibroína de seda porosa en estado sólido a partículas mediante medios mecánicos.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición inyectable o las partículas de fibroína de seda comprende(n) además al menos un agente activo, opcionalmente en donde el al menos un agente activo es un agente biológicamente activo, un agente cosméticamente activo, un agente de adhesión celular, un agente de contraste o cualquier combinación de los mismos.

8. La composición de la reivindicación 7, en donde: (a) el agente biológicamente activo se selecciona de un agente terapéutico, un anestésico, un factor de crecimiento celular, un péptido, un peptidomimético, un anticuerpo o una parte del mismo, ácido nucleico, un polisacárido y cualquier combinación de los mismos; (b) el agente de adhesión celular se selecciona de ácido hialurónico, colágeno, ácido hialurónico/colágeno reticulado, una molécula de unión a integrina, quitosano, elastina, fibronectina, vitronectina, laminina, proteoglicanos y cualquier derivado de los mismos; o (c) el agente cosméticamente activo se selecciona del grupo que consiste en un agente antienvejecimiento, un agente contra los radicales libres, un antioxidante, un agente hidratante, un agente blanqueador, un colorante, un agente despigmentante, un agente bloqueador solar, un relajante muscular y cualquier combinación de los mismos.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una célula, en donde la célula es opcionalmente una célula madre.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un fluido o concentrado biológico, opcionalmente en donde: (a) dicho fluido o concentrado biológico se selecciona de lipoaspirado, aspirado de médula ósea o cualquier combinación de los mismos; y/o (b) la relación de volumen de las partículas de fibroína de seda respecto al fluido o concentrado biológico varía de 1:19 a 12:19, o en donde la relación de volumen de las partículas de fibroína de seda respecto al fluido o concentrado biológico varía de 3:19 a 6:19.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde: (a) la composición inyectable o las partículas de fibroína de seda comprende(n) además un hidrogel o un material de relleno dérmico, en donde el material de relleno térmico se selecciona de microesferas de poli(metacrilato de metilo), hidroxilapatita, poli(ácido L-láctico), ácido hialurónico, colágeno y cualquier combinación de los mismos; y/o (b) la composición inyectable comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Un dispositivo de suministro o jeringa que comprende una composición inyectable de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además opcionalmente una aguja, catéter y/o portador de inyección.

13. La composición, dispositivo o jeringa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para reparar o aumentar un tejido en un sujeto, comprendiendo el método inyectar en el tejido a reparar o aumentar la composición de la reivindicación 1, en donde: (a) la inyección se realiza por vía subcutánea, submuscular o intramuscular; (b) la inyección se realiza con una aguja, en donde el calibre de aguja puede variar de 12 a 34, de 15 a 34, de 20 a 32 o de 25 a 30; (c) la composición está al menos parcialmente seca cuando se inyecta en el tejido; (d) la composición está al menos parcialmente hidratada cuando se inyecta en el tejido; o (e) el tejido es un tejido blando, en donde el tejido blando se selecciona opcionalmente de un tendón, un ligamento, piel, un tejido mamario, un tejido fibroso, un tejido conectivo, un músculo y cualquier combinación de los mismos.

14. La composición, dispositivo o jeringa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para reparar o aumentar un tejido en un sujeto, comprendiendo el método inyectar en el tejido a reparar o aumentar la composición de la reivindicación 1 en una región dérmica del sujeto.

15. La composición, dispositivo o jeringa de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en un método para reparar o aumentar un tejido en un sujeto humano.