BRPI0014155B1 - Prevention of myocardial, abortion and intra-uterine infection, associated with porcine circovirus-2 - Google Patents

Abstract

patente de invenção: "prevenção da miocardite, do aborto e da infecção intra-uterina, associados com o circovírus-2 porcino". acha-se descrito um poxvírus recombinante, tal como o avipoxvírus, contendo dna estranho de circovírus (2) porcino. acham-se descritas também composições imunológicas contendo o poxvírus recombinante para induzir uma resposta imunológica em um animal hospedeiro ao qual a composição imunológica seja administrada. são descritos também métodos de tratar ou prevenir doença causada pelo circovírus (2) porcino, mediante administração das composições imunológicas da invenção a um animal em necessidade do tratamento ou suscetível à infecção pelo circovírus (2) porcino.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREVENÇÃO DA MIOCARDITE, DO ABORTO E DA INFECÇÃO INTRA-UTERINA, ASSOCIADOS COM O CIRCOVÍRUS-2 DE PORCINO".

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos e/ou composições para a prevenção e/ou tratamento da miocardite causada pelo PCV-2, e/ou infecção intra-uterina, bem como seqüelas patológicas, incluindo, sem que a esta se limitem, a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama; e a métodos e kits para preparar tais composições ou para executar tais métodos, inter alia.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O circovírus-2 de porcino (PCV-2) foi recentemente identificado como um agente que foi consistentemente associado com a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama (PMWS) em populações de suínos em várias partes do mundo (Allan et al., 1998; Ellis etal., 1998). Os isolados do PCV-2 obtidos de porcos infectados em vários países são do ponto de vista genético virtualmente idênticos e são claramente diferentes do PCV (CCL33, PCV-1) que foi originalmente identificado nos anos de 1970 como um contaminante não-citopático da linhagem celular dos rins porcinos (PK/15) (Meehan etal., 1998; Tischer et al., 1974). Porcos com infecções de PCV-2 naturalmente adquiridas ou experimentalmente induzidas presentes, com perda de peso progressiva, taquipnéia, dispnéia e icterícia (Allan et al., 1998; Allan et al., 1999; Ellis et al., 1998; Ellis et al., 1999). As observações patológicas grosseiras que eram diretamente associadas com o antígeno de PCV-2 incluem a linfadenopatia, a pneumonia intersticial, a hepatite e a ne-frite (Allan et al., 1998; Allan etal., 1999; Ellis et al., 1998; Ellis etal., 1999). Ver também a WO-A-99 18214, WO-A-OO 01409, WO-A-99 29717 e WO-A-99 29871. O PCV-2 não foi até agora diretamente ligado ao aborto ou a lesões nos porcos fetais. Assim, até agora, não foi proposto tratar da matéria da miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina causada pelo PCV-2.

OBJETOS E SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Foi surpreendentemente observado que o PCV-2 é um agente causador da miocardite, do aborto e da infecção intra-uterina, bem como da síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama.

Por definição, um imunógeno do PCV-2 pretende abranger o PCV-2 vivo atenuado ou inativado, ou subunidade(s) do PCV-2 obtida(s) por expressão ou por extração in vitro, ou fragmento(s) que compreenda(m) pelo menos um epitopo de interesse que possa ser obtido por síntese química ou por expressão recombinante in vitro, assim como vetor(es) recombinante(s) que compreenda(m) e expresse(em) seqüência(s) ou fragmento(s) ou epito-po(s) in vivo do genoma do PCV-2 conforme aqui descrito ou conforme documentos aqui citados ou referenciados.

Uma definição semelhante se aplica quanto a um imunógeno de outro patógeno porcino, conforme aqui descrito.

Por definição, uma composição imunogênica elicia uma resposta imunogênica - local ou sistêmica. Uma composição de vacina elicia uma resposta protetora local ou sistêmica. A expressão "composição imunogêni-ca" inclui uma “composição de vacina" (como a primeira expressão pode ser composição protetora).

Assim, um objetivo da invenção pode ser prover métodos e/ou composições para a prevenção e/ou tratamento da miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina causados pelo PCV-2, assim como da síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e/ou de seqüelas patológicas que incluam, sem que a esta se limite a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama; e métodos para formular tais composições [composições estas que também podem incluir um imunógeno do parvovírus porcino (PPV)] e usos de um imunógeno do PCV-2 para formular tais composições.

Outro objetivo é também o uso de imunógenos de PCV-2 para preparar composições para prevenção e/ou tratamento da miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina causados pelo PCV-2.

Outro objetivo da invenção é o isolamento e a caracterização de novas cepas de PCV-2 identificadas por 1103 (1103/1 P.2) e 1121 (1121/1 Ρ.1), e seus usos para produzir imunógenos, bem como antígenos e anticorpos para diagnósticos, em relação com a miocardite e/ou aborto e/ou infecção intra-uterina causados pelo PCV-2, bem como a síndrome debili-tante multissistêmica pós-desmama e ou seqüelas patológicas com ela associadas. A invenção também proporciona a inoculação de porcos fêmeas (por exemplo porcas, leitoa) com uma composição compreendendo um (pelo menos um) imunógeno de PCV-2 (composição esta que pode também incluir um imunógeno do parvovírus porcino) antes da parição; e/ou antes do acasalamento e/ou durante a gestação (ou gravidez); e/ou antes do período perinatal ou do nascimento da ninhada; e/ou repetidamente durante um período de vida, para prevenir a miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina associados com o PCV-2, assim como a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2; ou para eliciar uma resposta imunogênica ou protetora contra o PCV-2 e dessa forma prevenir a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e/ou a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o circovírus-2 de porcino e/ou outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2.

Vantajosamente, pelo menos uma inoculação é feita antes do acasalamento. Ela é também vantajosamente seguida por uma inoculação a ser realizada durante a gestação, por exemplo por volta da metade da gestação (por volta de 6 - 8 semanas de gestação) e/ou no final da gestação (por volta de 11 - 13 semanas de gestação). Assim, um regime vantajoso é uma inoculação antes do acasalamento e uma inoculação reforçadora durante a gestação. Depois disso, pode haver a reinoculação antes de cada acasalamento e/ou durante a gestação por volta da metade da gestação (por volta de 6 - 8 semanas de gestação) e/ou no final da gestação (por volta de 11 - 13 semanas de gestação). Preferivelmente, a reinoculação pode se dar apenas durante a gestação.

Em outra modalidade preferida, os leitões, tais como os leitões de fêmeas vacinadas (por exemplo, inoculadas como aqui debatido), são inoculados dentro das primeiras semanas de vida, por exemplo, inoculação em uma e/ou duas e/ou três e/ou quatro e/ou cinco semanas de vida. Mais preferivelmente, os leitões são primeiro inoculados dentro da primeira semana de vida ou dentro da terceira semana de vida (por exemplo, no momento da desmama). Ainda mais vantajoso, tais leitões recebem então o reforço duas (2) a quatro (4) semanas mais tarde (após terem sido primeiro inoculados). Assim sendo, podem-se administrar tanto aos filhotes, como à fêmea (por exemplo, porca, leitoa) composições da invenção e/ou eles podem ser o objeto de realização de métodos da invenção.

Assim, a invenção compreende composições imunogênicas ou de vacina contendo imunógeno(s) de cepa(s) 1103 e/ou 1121 de PCV-2, para prevenir ou tratar a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o circovírus-2 de porcino, assim como a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e outras sequelas patológicas associadas com o PCV-2. E a invenção promove usos de compreensão de um imunógeno PCV-2 para formular um composição imnogênica ou vacina para prevenir ou tratar miocardites e/ou aborto e/ou infecção intra-uterina associada com cir-co-vírus2- de porcino, bem como síndrome de espera multissistêmica pós-desmame e outra seqüela patológica associada com PCV-2.

Ainda mais, a invenção compreende uma composição imunogê-nica ou de vacina para a prevenção e/ou tratamento de miocardite e/ou de aborto e/ou de infecção intra-uterina e/ou da síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama causados pelo PCV-2, compreendendo um carreador e/ou veículo e/ou excipiente e/ou adjuvante farmacêutica ou veterinaria-mente aceitável, e um imunógeno de PCV-2. A composição pode, adicionalmente, incluir pelo menos um imunógeno de pelo menos um patógeno adicional porcino, por exemplo: Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina (PRRS), Mycoplasma hyop-neumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. co/i, Bordetella bronchisep-tica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pseudorabies, Hog cholera, Swine Influenza e Porcine Parvovirus (PPV). Assim, as composi- ções com base em vetores podem incluir pelo menos um imunógeno de pelo menos um patógeno adicional de porcos, tais como um vetor expressando uma seqüência deste patógeno, em que o vetor pode também ser o vetor expressando o imunógeno de PCV-2. O vetor expressando uma seqüência de PCV-2 pode compreender uma seqüência ou fragmento de PCV-2; e a invenção compreende tais moléculas de ácido nucléico, vetores contendo-as, composições compreendendo tais moléculas de ácido nucléico, ou produtos de expressão de vetores de tais moléculas de ácido nucléico, composições compreendendo tais produtos de expressão, sondas ou iniciadores para tais moléculas de ácido nucléico, e métodos para produzir e usar qualquer ou todos os precedentes. O vetor pode compreender um plasmídeo vetor de DNA, uma bactéria tal como um E. coli, um vírus tal como baculovírus, um herpesvírus incluindo os vírus do herpes de porcos, incluindo o vírus da doença de Au-jeszky, um adenovírus incluindo um adenovírus porcino, um poxvírus, incluindo o vírus da vacínia, um avipoxvírus, canaripoxvírus, um racoonpox e um suinepox vírus, e outros. As composições com base em vetor podem compreender um vetor que contenha e expresse uma ORF selecionada do grupo consistindo em ORFs 1 a 13, tais como uma ORF selecionado das ORFs 4, 7, 10 e 13; preferivelmente as ORFs 4 e/ou 13, de um PCV-2, vantajosamente de qualquer uma das cepas de PCV-2 aqui identificadas e, em particular, das cepas 1103 e/ou 1121. E os imunógenos nas composições (ou do PCV-2 e/ou de outro patógeno de porcos) podem ser recombinantemente produzidos. A palavra plasmídeo intenta incluir qualquer unidade de transcrição de DNA na forma de uma seqüência de polinucleotídeos compreendendo a seqüência de PCV a ser expressa. Vantajosamente, o plasmídeo inclui elementos necessários para sua expressão; por exemplo, expressão in vivo. A forma circular do plasmídeos, superespiralada ou de outra forma, é vantajosa; e a forma linear também está incluída dentro do escopo da invenção. O plasmídeo imunogênico ou composição de vacina podem ser administrados por meio de uma pistola de genes, intradermicamente através de um injetor sem agulha, subcutânea ou intramuscularmente, ou pela via mucosa, ou por qualquer outro meio que leve em conta a expressão in vivo, e vantajosamente uma resposta imunogênica ou protetora.

Observa-se que o produto da expressão gerado pelos vetores ou recombinantes nesta invenção, opcionalmente podem também ser isolados e/ou purificados das células infectadas ou transfectadas; por exemplo, para preparar composições para administração a porcos; no entanto, em certos casos, pode ser vantajoso não isolar e/ou purificar um produto de expressão de uma célula; por exemplo, quando a célula e/ou porções dela intensificam o efeito imunogênico do polipeptídeo. E as técnicas para purificação e/ou isolamento de proteínas são conhecidas e podem ser usadas, sem a indevida experimentação, para purificar e/ou isolar produtos de expressão recombinante ou de vetores e/ou subunidades de PCV-2 e/ou outros patógenos porcinos, na prática da invenção; tais técnicas, em geral, podem incluir: precipitação levando-se vantagem da solubilidade da proteína de interesse em concentrações de sal variáveis, precipitação com solventes orgânicos, polímeros e outros materiais, precipitação de afinidade e desnaturação seletiva; cromatografia de coluna, incluindo a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), troca de íons, afinidade, imunoafinida-de ou cromatografia de corante-ligante; imunoprecipitação, filtração de gel, métodos eletroforéticos, ultrafiltração e focalização isoelétrica, e suas combinações, inter alia. A invenção ainda considera métodos para a prevenção e/ou tratamento da miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina causados pelo circovírus-2 porcino (PCV-2) e ou síndrome debilitante multis-sistêmica pós-desmama e/ou seqüelas patológicas com ela associadas com o PCV-2 compreendendo induzir uma resposta imunogênica ou protetora contra o PCV-2 em um porco, compreendendo administrar ao porco uma composição acima mencionada ou aqui descrita.

Assim sendo, a invenção compreende um método para a prevenção e/ou tratamento de miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina causados pelo circovírus-2 de porcino (PCV-2) e/ou síndrome debi- litante multissistêmica pós-desmama e/ou outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2, compreendendo induzir uma resposta imunogênica ou protetora contra o PCV-2 em um porco, compreendendo administrar ao porco uma composição que compreende carreador ou excipiente ou veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável, preferivelmente com um adju-vante, e um agente ativo compreendendo um imunógeno de PCV-2. O método pode ser para a prevenção da miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina causados pelo PCV-2, compreendendo administrar uma composição compreendendo um carreador e um imunógeno de PCV-2 farmacêutica ou veterinariamente aceitável. O imunógeno de PCV-2 pode ser um PCV-2 completo ou PCV-2 inativado vivos. O método pode envolver uma composição que seja uma subunidade imunogênica, ou uma composição de vacina. O método pode envolver a composição adicionalmente incluindo pelo menos um imunógeno de pelo menos um patógeno adicional de porco, incluindo um vetor que expresse um tal imunógeno ou epitopo: por exemplo, o pelo menos um patógeno adicional de porco pode ser selecionado do grupo consistindo em PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleu-ropneumoniae, E. coli, Pseudorabies, Hog cholera, Bordetella bronchisepti-ca, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Swine Influenza e PPV e combinações destes. O método pode envolver um vetor que seja um plasmídeo vetor de DNA, uma bactéria tal como uma E. coli, um vírus tal como o baculovírus, um herpesvírus incluindo o vírus da doença de Au-jeszky, um adenovírus incluindo um adenovírus porcino, um poxvírus, incluindo o vírus da vacínia, um avipoxvírus, canaripoxvírus, e um vírus da varíola suína, e outros. O método pode envolver uma composição com base em vetor adicionalmente incluindo pelo menos uma sequência, fragmento ou epitopo de pelo menos um patógeno adicional de porco, ou um vetor expressando uma tal seqüência, fragmento ou epitopo, em que o vetor pode também ser o vetor que expressa a seqüência, fragmento ou epitopo de PCV-2. O método pode envolver um vetor que contenha e expresse uma ORF selecionada do grupo consistindo em ORFs 1 a 13, por exemplo uma ORF selecionada de ORFs 4, 7, 10 e 13; preferivelmente ORFs 4 e/ou 13. O método também pode envolver uma composição com base em imunógeno em que um ou mais dos imunógenos seja recombinantemente produzidos. Neste método, as fêmeas e os leitões são preferivelmente inoculados como descrito acima.

Em outra modalidade, a invenção envolve um método para preparar qualquer uma das composições acima mencionadas ou neste relatório mencionadas, compreendendo misturar o carreador farmacêutica ou veteri-nariamente aceitável e, possivelmente, um adjuvante, e o imunógeno de PCV-2. O método pode ainda incluir a transfecção ou infecção de uma célula ou hospedeiro com um vetor recombinante que contenha DNA codificando um imunógeno de PCV-2 e expresse esse imunógeno; e, opcionalmente, a purificação e/ou o isolamento do imunógeno da célula. De forma semelhante, o método pode incluir isolar e/ou purificar um imunógeno de PCV-2 do PCV-2, ou isolar o PCV-2 de uma amostra. A invenção também fornece um kit para preparar qualquer uma das composições acima mencionadas ou aqui descritas, ou para realizar qualquer um dos métodos acima mencionados ou aqui descritos compreendendo, em um primeiro recipiente, o carreador ou veículo ou excipiente farmacêutica ou veterinariamente aceitáveis e, em um segundo recipiente, o agente ativo compreendendo o imunógeno de PCV-2, em que os primeiro e segundo recipientes sejam opcionalmente embalados juntos, e o kit opcionalmente inclua instruções para mistura dos ingredientes da composição e/ou administração da composição.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece a administração de qualquer uma das composições acima mencionadas ou aqui descritas, a porcos machos e/ou fêmeas; a prevenção da transmissão do PCV-2 e a prevenção ou tratamento ou controle da miocardite e/ou do aborto e/ou da infecção intra-uterina associados com o circovírus-2 de porcino, bem como a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2. A administração é preferivelmente feita conforme descrito acima. O termo "compreendendo" neste relatório pode significar "inclu- indo" ou pode ter o significado comumente dado ao termo "compreendendo" da Lei de Patentes U.S.

Outros aspectos da invenção são descritos ou são óbvios a partir (e dentro do âmbito da invenção) da seguinte descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA O circovírus-2 porcino (PCV-2) é um agente associado com a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama (PMWS) nas populações suínas. Como mostrado nos Exemplos 1 e 2, o espectro potencial da doença associada com PCV-2 é expandido pela evidência de transmissão vertical e falha de reprodutiva associada.

Em particular, o Exemplo 1 mostra que o PCV-2 foi isolado de uma ninhada de leitões abortados de uma fazenda que experimentava abortos e partos de natimortos de prazo tardio. A miocardite severa difusa estava presente em um porquinho associada com coloração imunohistoquí-mico extensivo quanto ao antígeno de PCV-2. Quantidades variáveis de an-tígeno de PCV-2 estavam também presentes no fígado, nos pulmões e nos rins de múltiplos fetos. A presença de outros agentes que haviam sido associados com as lesões fetais e o aborto nos suínos, incluindo o parvovírus porcino, o vírus da síndrome respiratória reprodutiva, o vírus da encefalomi-ocardite e o enterovírus, não pôde ser estabelecida.

Mais em particular, o Exemplo 2 mostra que os tecidos obtidos de 30 agrupamentos com saúde elevada durante um período de quatro anos, e testados em casos rotineiros de aborto ou falhas reprodutivas, foram positivos quanto ao PCV-2 em duas submissões envolvendo vários leitões natimortos e recém-nascidos não-viáveis apresentando-se com severa miocardite difusa, hipertrofia cardíaca e evidência de congestão passiva crônica. As duas submissões positivas foram da mesma fazenda, mas ocorreram em duas ocasiões diferentes. A presença de PCV-2 nos corações e em outros tecidos dos leitões afetados foi confirmada por imunohistoquímica e isolamento viral. A falha em detectar circovírus porcinos em casos de falha reprodutiva antes de 1999 em áreas de infecções endêmicas apóia a observação de que a doença reprodutiva é uma nova manifestação clínica da in- fecção do PCV-2, e ainda sugere que as modalidades de transmissão sexual, bem como vertical, são responsáveis pela disseminação viral na população de porcos.

Conseqüentemente, a inoculação de porcos, por exemplo porcos fêmeas, tais como porcas ou leitoas, com uma composição que inclua pelo menos um imunógeno de PCV-2 (por exemplo de pelo menos uma cepa escolhida entre as cepas Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 e 1121) (composição essa que pode também incluir pelo menos um imunógeno de pelo menos um outro patógeno porcino, tal como pelo menos um parvovírus porcino, em que, quando um vetor seja usado, este vetor possa co-expressar tanto o(s) imunógeno(s) de PCV-2 quanto o pelo menos um imunógeno do pelo menos outro patógeno porcino, por exemplo imunógeno(s) de PPV, inter alia), em particular em um programa de imunização como descrito acima, pode prevenir a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o PCV-2, assim como a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2.

Assim, a invenção envolve métodos e composições usando imunógeno de PCV-2 para prevenir a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o circovírus-2 de porcino, bem como a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama e outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2. Em particular, os imunógenos das cepas 1103 e/ou 1121 são úteis para métodos e composições que usam o imunógeno do PCV-2 para prevenir a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o circovírus-2 de porcino. A invenção também envolve o uso de qualquer cepa de PCV-2 conhecida ou imunógeno dela originado, para formular uma composição imunogênica ou de vacina para prevenir ou tratar a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o PCV-2, bem como a síndrome multissistêmica pós-desmama e outras seqüelas patológicas associadas com o PCV-2 (estas cepas incluem as cepas Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 e 1121), em particular quando a composição é destinada a ser administrada a leitões, tais como leitões das fêmeas vacinada e, mais particularmente, a porcos fêmeas, em particular a fêmeas grávidas ou fêmeas que serão submetidas a acasalamento; e mais particularmente de acordo com os esquemas de inoculação definidos acima.

Mais particularmente, o uso é para formular tais composições destinadas a prevenir ou tratar a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o PCV-2, em particular quando a composição se destina a ser administrada a leitões tais como os filhotes de fêmeas vacinadas e, mais particularmente, a porcos fêmeas, em particular a fêmeas grávidas ou fêmeas que serão submetidas a acasalamento; e mais particularmente de acordo com os esquemas de inoculação definidos acima. O pelo menos um imunógeno de pelo menos um outro patógeno porcino, pode ser usados como nas vacinas ou composições imunogênicas porcinas conhecidas, ou como no WO 98/03658.

As composições para uso na invenção podem ser preparadas de acordo com técnicas padrão bem-conhecidas daqueles versados nas técnicas veterinárias ou farmacêuticas. Tais composições podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem-conhecidas daqueles versados na técnica veterinária, levando em consideração fatores tais como a idade, sexo, peso, a condição e o tratamento particular do porco, e a via de administração. As composições podem ser administradas sozinhas, ou podem ser simultânea ou seqüencialmente administradas com outras composições da invenção (por exemplo outras composições que incluam um imunógeno de PCV-2) ou com outras composições profiláticas ou terapêuticas (por exemplo, outras composições imunogênicas ou de vacina porcinas). Assim, a invenção também fornece composições multivalentes ou de "coquetel" ou de combinação, e métodos que as empregam. A este respeito, faz-se referência à Patente U.S. número 5.843.456, voltada a composições da raiva e composições de combinação e seu uso.

As composições da invenção podem ser usadas para administração parenteral e mucosa, preferivelmente pelas vias intradérmica ou in-tramuscular. Em particular para a via intradérmica, a injeção pode ser feita usando-se um injetor sem agulha. Quando a administração mucosa é usàda, é possível usar as vias oral, nasal ou ocular.

Em tais composições, o(s) imunógeno(s) pode(m) estar em uma mistura com um carreador, diluente ou excipiente adequados, tais como água estéril, solução salina fisiológica, glicose ou coisa parecida, e/ou preferivelmente com um adjuvante. As composições podem também ser liofili-zadas ou congeladas. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como agentes de tamponamento do pH, adjuvantes, conservantes, exci-pientes poliméricos usados para as vias mucosas, e outros, dependendo da via de administração e da preparação desejada.

Textos padrão, tais como "REMINGTOISTS PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17â edição, 1985, podem ser consultados para a preparação de preparações adequadas, sem a indevida experimentação. Dosagens adequadas também podem ser à base do texto presente e dos documentos aqui citados.

Adjuvantes são substâncias que intensificam a resposta imune aos imunógenos. Os adjuvantes podem incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, soponinas por exemplo Quil A, emulsão água-em-óleo, emulsão óleo-em-água, emulsão água-em-óleo-em-água. A emulsão pode basear-se em particular no óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia); o óleo isoprenóide, tal como esqualano ou esqualeno; o óleo resultante da oligomerização de alquenos, em particular isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, mais particularmente óleos vegetais, oleato de etila, (di(caprilato/caprato) de propile-no glicol, tri(caprilato/caprato) de glicerila ou dioleato de propileno glicol; ésteres de ácidos graxos ou álcoois ramificados, em particular os ésteres de ácido isoesteárico. O óleo é usado em combinação com emuslficantes para formar a emulsão. Os emulsificantes são preferivelmente tensoativos não-iônicos, em particular ésteres de sorbitano, de manitol (por exemplo o oleato de anidromanitol), de glicerol, de poliglicerol, de propileno glicol e de ácidos oléico, isoesteárico, ricinoléico ou hidroxiesteárico, que são opcionalmente etoxilados, e blocos copoliméricos de polioxipropileno-polioxietileno, em particular os produtos Pluronic®, especialmente L121. Ver Hunter et a!., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.). John Wiley and Sons, NY, pp. 51-94 (1995) e Todd et a/., Vaccine 15: 564-570(1997).

Por exemplo, é possível usar a emulsão SPT descrita na página 147 de " Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editado por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995, e a emulsão MF59 descrita na página 183 do mesmo livro.

Por exemplo, a vacina contendo adjuvante é preparada da seguinte maneira: 67% v/v de fase aquosa incluindo o imunógeno são emulsi-ficados em 2,3% p/v de oleato de anidromanitol, 2,6% p/v de ácido oléico etoxilado com 11 EO (óxido de etileno) e 28,1% v/v de óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia) com o auxílio de um turbomisturador emulsificante.

Um método alternativo para preparar a emulsão consiste em emulsificar, mediante passagens através de um homogeneizador de alta pressão, uma mistura de 5% p/v de esqualano, 2,5% p/v de Pluronic® L121, 0,2% p/v de um éster de ácido oléico e de anidrossorbitol etoxilado com 20 EO, 93,2% v/v da fase aquosa compreendendo o imunógeno. É também possível formular com polímeros sintéticos (por exemplo, homo- e copolímeros de ácidos láctico e glicólico, que tenham sido usados para produzir microesferas que encapsulam imunógenos, ver El-dridge et aí., Moi. Immunol. 28: 287-294 (1993), por exemplo microesferas biodegradáveis), com citocinas tais como IL-2 e IL-12 (ver, por exemplo, a Patente U.S. número 5.334.379), e GMCSF, vantajosamente GMCSF porcino (Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos; ver, em geral, as Patentes U.S. números 4.999.291 e 5.461.663, ver também Clark et al., Science 1987, 230: 1229; Grant et aí., Drugs, 1992, 53: 516), inter alia. Certos adjuvantes podem ser expressos in vivo com imunógeno(s) e/ou epitopo(s); por exemplo, citocinas, GMCSF (ver, por exemplo, Inumaru e Takamatsu, Immunol. Cell. Biol., 1995, 73: 474-476, concernente a plasmí-deo codificando e expressando o GMCSF porcino).

Um outro exemplo de um adjuvante é um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico e metacrílico e dos copolímeros de anidrido maléico e derivado de alquenila. Vantajosamente os compostos adjuvantes são os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico qué sejam reticulados, especialmente com polialquenil éteres de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbômero (Phameuropa Vol. 8, ns 2, junho de 1996). Pessoas versadas na técnica podem também referir-se à Patente U.S. número 2.909.462, que descreve tais polímeros acrílicos reticulados com um composto poliidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, preferivelmente não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo pelo menos 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são aqueles que contêm 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem eles próprios conter outros substituintes, tais como metila. Os produtos vendidos sob a denominação de Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) são particularmente apropriados. Eles são reticulados com uma alilsacarose ou com alilpentae-ritritol. Entre eles, devem ser mencionados Carbopol® 974P, 934P e 971P. Entre os copolímeros de anidrido maléico e derivados de alquenila, os copolímeros EMA® (Monsanto), que são copolímeros de anidrido maléico e etileno, lineares ou reticulados, por exemplo reticulados com divinil éter, são preferidos. Referência pode ser feita a J. Fields et a!., Nature, 186: 778-780, 4 de junho de 1960.

Do ponto de vista de sua estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e os copolímeros EMA® são preferivelmente formados de unidades básicas da seguinte formula: em que: Ri e R2, que são idênticos ou diferentes, representam H ou CH3; x = 0 ou 1, preferivelmente x = 1; e y = 1 ou 2, com x + y = 2.

Para os copolímeros EMA®, x = 0 e y = 2. Para os carbômeros, x = y=1. A dissolução destes polímeros em água conduz a uma solução de ácido que será neutralizada, preferivelmente a pH fisiológico, de modo a dar a solução adjuvante em que a própria composição imunogênica, imuno-lógica ou de vacina seja incorporada. Os grupos carboxila do polímero estão então parcialmente na forma COO'.

Preferivelmente, uma solução de adjuvante de acordo com a invenção, especialmente de carbômero, é preparada em água destilada, preferivelmente na presença de cloreto de sódio, a solução obtida sendo em pH acídico. Esta solução de estoque é diluída pela sua adição à quantidade desejada (para obter a concentração final desejada), ou uma sua parte substancial, de água carregada com NaCI, preferivelmente solução salina fisiológica (NaCL 9 g/litro) toda de uma vez em várias porções com concomitante ou subseqüente neutralização (pH 7,3 a 7,4), preferivelmente com NaOH. Esta solução em pH fisiológico será usada como ela é para mistura com a vacina, que pode ser especialmente armazenada na forma seca por congelamento, líquida ou congelada. A concentração polimérica na composição de vacina final pode ser de 0,01% a 2% p/v, por exemplo 0,06 a 1% p/v, tal como 0,1 a 0,6% p/v.

Desta descrição e do conhecimento da prática, o técnico versado pode selecionar um adjuvante adequado, se desejado, e a sua quantidade a ser empregada em uma composição imunológica, imunogênica ou de vacina de acordo com a invenção, sem a indevida experimentação. As composições imunogênica ou de vacina de acordo com a invenção podem ser associadas a pelo menos uma vacina atenuada, inativada ou de subuni-dade, ou vacina recombinante (por exemplo poxvírus como um vetor de DNA plasmídeo) expressando pelo menos um imunógeno ou epitopo de interesse de pelo menos um outro patógeno de porco.

As composições nas formas para várias vias de administração são consideradas pela invenção. E, novamente, a dosagem e via de administração eficazes são determinadas por fatores conhecidos, tais como idade, sexo, peso e outros procedimentos de controle que sejam conhecidos e não requeiram a indevida experimentação. As dosagens de cada agente ativo podem ser como nos documentos aqui citados e/ou podem variar de um ou uns poucos a umas poucas centenas ou milhares de microgramas, por exemplo, 1 μg a 1 mg, para uma composição imunogênica subunitária ou de vacina; e 104 a 1010 TCID50, vantajosamente 106 a 108 TCID50 para uma composição inativada (título antes da inativação) imunogênica ou de vacina. Para uma composição imunogênica ou de vacina atenuadas, a dose pode ser entre 101 e 108 TCID50, vantajosamente entre 103 e 106 TCID50- Recombinantes ou vetores podem ser administrados em uma quantidade adequada para se obter a expressão in vivo correspondente às dosagens aqui descritas e/ou nos documentos aqui citados. Por exemplo, faixas adequadas para as suspensões virais podem ser empiricamente determinadas. O vetor viral ou o recombinante na invenção podem ser administrados a um porco ou infectado ou transfectado nas células em uma quantidade de cerca de pelo menos 103 pfu; mais preferivelmente cerca de 104 pfu a cerca de 1010 pfu, por exemplo cerca de 105 pfu a cerca de 109 pfu, por exemplo cerca de 106 pfu a cerca de 108 pfu, por dose, por exemplo de cerca de 2 ml. E, se mais do que um produto do gene for expresso por mais do que um recombinante, cada recombinante pode ser administrado nestas quantidades; ou cada recombinante pode ser administrado de tal modo que exista, em combinação, uma soma de recombinantes compreendendo estas quantidades.

Nas composições de plasmídeos empregadas na invenção, as dosagens podem ser como descritas nos documentos aqui citados ou como aqui descritas. Por exemplo, quantidades adequadas de cada DNA plasmí-deo em composições de plasmídeos, podem ser de 1 μ9 a 2 mg, preferivelmente de 50 pg a 1 mg. Os documentos aqui citados com respeito aos vetores de DNA plasmídeo podem ser consultados pelo técnico versado para averiguar outras dosagens adequadas para as composições de vetor de DNA plasmídeo da invenção, sem a indevida experimentação.

No entanto, a dosagem da(s) composição(ões), a concentração dos seus componentes e a sincronização da administração da(s) composi-ção(ões), que eliciam uma resposta imunológica adequada, podem ser determinadas por métodos tais como as titulações de anticorpos do soro, por exemplo por ELISA e/ou análise de ensaio de soroneutralização e/ou por avaliação da prova de vacinação em porcos. Tais determinações não requerem a indevida experimentação, a partir do conhecimento do técnico versado, desta descrição e dos documentos aqui citados. E, o tempo para administrações seqüenciais pode ser da mesma forma averiguado pelos processos obteníveis desta descrição, e pelo conhecimento da técnica, sem a indevida experimentação. O imunógeno do PCV-2 pode ser obtido do PCV-2 ou pode ser obtido da expressão recombinante in vitro do(s) gene(s) de PCV-2 ou suas partes ou epitopos. Os métodos para produzir e/ou usar vetores (ou recom-binantes) para expressão podem ser pelos métodos ou análogos aos métodos descritos nas: Patentes U.S. números 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848, 5.942.235, 5.364.773, 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235, 5.756.103, 5.766.599, 6.004.777, 5.990.091, 6.033.904, 5.869.312, 5.382.425, publicações PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update”, PNAS USA 93: 11349-11353, outubro de 1996, Moss, "Genetically engineered poxvirus for recombinant gene expression, vaccination, and sa-fety", PNAS USA 93: 11341-11348, outubro de 1996, Smith et a!., Patente U.S. 4.745.051 (baculovírus recombinante), Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovírus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et aí., "Production of Huma Beta Interferon in In-sect Cells Infected with a Baculovírus Expression Vector", Biologia Molecular e Celular, dezembro de 1983, Vol 3., ηθ 12, pp. 2156-2165; Pennock et a/., "Strong and Regulated Expression os Escherichia coli B-Galactosidade in Infect Cells with a Baculovírus vector41, Biologia Molecular e Celular, março de 1984, Vol. 4, ne 3, pp. 399-406; EPA 0 370 573, pedido de patente U.S. Ns de série 920.197, depositado em 16 de outubro de 1986, publicação da Patente EP Ne 265785, Patente U.S. Ns 4.769.331 (herpesvírus recombi-nante), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors", PNAS USA 93: 11307-11312, outubro de 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors", PNAS USA 93: 11313-11318, outubro de 1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, outubro de 1996, Frolov et ai, "Alphavirus-based expression vectors: Strate-gies and applications", PNAS USA 93: 11371-11377, outubro de 1996, Ki-tson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; Patentes U.S. números 5.591.439, 5.552.143, WO 98/00166, pedidos U.S. autorizados N2 de série 08/675.556 e 08/675.566, ambos depositados em 3 de julho de 1996 (adenovírus re-combinante), Grunhaus et al., 1992, "Adenovírus as cloning vectors", Semi-nars in Virology (Vol. 3), pp. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, pp. 3861-3865, Graham, Tibtech 8, 85-87, abril de 1990, Prevec et al., J. Gen. Virol. 70, 429-434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2261, Science, 259: 1745-49, 1993, e McCIements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoproteín D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, outubro de 1996, e Patentes U.S. números 5.591.639, 5.589.466 e 5.580.859, bem como WO-A 90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797, WO-A-95 11307, WO-A-95 20660, Tang et al., Nature 356, 152-154, 1992, e Furth et al., Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992, com relação aos vetores de expressão de DNA, inter alia. Ver também WO 98/33510; Ju et al., Diabeto-logia, 41: 736-739, 1998 (sistema de expressão lentiviral); Sanford et al., Patente U.S. número 4.945.050; Fischbach et al. (Intracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in IMMUNOLOGY, vol. 9, pp. 271-283 (1997) (sistemas de vetores de DNA); Szoka et al., Patente U.S. número 4.394.448 (método de inserir DNA em células vivas); McCormick et al., Patente U.S. número 5.677.178 (uso de vírus citopáticos); e Patente U.S. número 5.928.913 (vetores para liberação de genes), bem como outros documentos aqui citados. Um vetor viral, por exemplo, selecionado do vírus do herpes de porcos, tais como o vírus da doença de Aujeszky, o adenovírus porcino, o poxvírus, especialmente o vírus da vacínia, o avipoxvírus, o canaripoxvírus, e o swinepox vírus, bem como vetores de DNA (DNA plasmídeos) são vantajosamente empregados na prática da invenção. O produto de expressão do(s) gene(s) de PCV-2 ou partes destes podem ser úteis para gerar anticorpos tais como anticorpos monoclonais ou policlonais que sejam úteis para fins de diagnóstico. De forma semelhante, o(s) produto(s) de expressão do(s) gene(s) de PCV-2 ou partes destes podem ser úteis em aplicações de diagnóstico.

Além disso, uma pessoa versada na técnica pode determinar um epitopo de interesse em um imunógeno de PCV-2, ou em um imunógeno de outro patógeno porcino, sem a indevida experimentação, a partir da presente descrição e do conhecimento da técnica; ver, por exemplo, o WO 98/40500, com respeito à informação geral para determinar um epitopo de interesse ou uma região epitópica de uma proteína, interaíia.

De acordo com a invenção, as composições imunogênicas ou de vacina vantajosas são: uma composição imunogênica ou de vacina coletada de uma cultura celular in vitro que tenha sido infectada com uma preparação purificada de PCV-2, tal como uma preparação purificada de circo-vírus porcino selecionada do grupo consistindo nas preparações depositadas na ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK), sob as seguintes referências: Número de acesso V97100219 (cepa lmp.1008), número V97100218 (cepa lmp.1010) e acesso número V97100217 (cepa lmp.999), depositados em 2 de outubro de 1997, número de acesso V98011608 (cepa lmp.1011-48285) e número V98011609 (cepa lmp.1011-48121) depositado em 16 de janeiro de 1998, número de acesso 00012710 (cepa 1103) e número 00012709 (cepa 1121) depositado em 2 de fevereiro de 2000, ou uma composição imunogênica ou de vacina compreendida de circovírus porcino produzido e isolado da cultura celular in vitro, estas células tendo sido infectadas com um circovírus porcino capaz de ser isolado de uma amostra fisiológica ou de uma amostra de tecido, especialmente lesões, de um porco com a síndrome de PMWS, por exemplo, uma composição tal em que o circovírus porcino seja produzido e isolado de uma linhagem celular de rins de porco, por exemplo, produzida e isolada de células PK/15 livres de contaminação com PCV-1; ou uma composição tal que compreenda ou seja preparada de um extrato ou sobrenadante de cultura, coletado de uma cultura celular in vitro que tenha sido infectada com um tal circovírus. Assim, o circovírus porcino pode ser um imunógeno. Por exemplo, a composição de vacina ou imunogênica pode compreender o imunógeno completo vivo atenuado (por exemplo, vírus), vantajosamente em um veículo ou diluente veterinária ou farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente um adjuvante veterinária ou farmaceuticamente aceitável, bem como, opcionalmente, um estabilizador de secagem por congelamento. O imunógeno (por exemplo, vírus) pode ser inativado e a composição de vacina ou imunogênica pode adicional e/ou opcionalmente compreender um veículo ou diluente veterinária ou farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, um adjuvante veterinária ou farmaceuticamente aceitável. A composição de vacina ou imunogênica pode compreender imunógenos de PCV-2 e/ou imunógenos de vários circovírus porcinos (incluindo PCV-2 ou várias cepas de PCV-2, e incluindo o PCV-1), assim como, opcionalmente, imunógenos adicionais de outro patógeno de porco; por exemplo, PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, Pseudorabies, Hog cholera, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothríx rhusiopathiae, Swine influenza, PPV (ver também o WO-A-OO 01409).

Para a produção de preparações antigênicas de circovírus, os circovírus podem ser obtidos após passagem nas células, em particular nas linhagens celulares, por exemplo as células PK/15. Os sobrenadantes ou extratos da cultura, opcionalmente purificados por técnicas padrão, podem ser usados.

No contexto do PCV atenuado, a atenuação pode ser realizada de acordo com os métodos costumeiros, por exemplo pela passagem sobre as células, preferivelmente pela passagem nas células de porcos, especialmente linhagens celulares, tais como as células PK/15 (por exemplo de 20 a 150, especialmente da ordem de 40 a 100 passagens).

No contexto da vacina inativada, o PCV, com as frações que possam estar presentes, é inativado de acordo com técnicas conhecidas das pessoas versadas na técnica. A inativação será preferivelmente realizada pela via química, por exemplo pela exposição do antígeno a um agente químico, tal como formaldeído (formalina), paraformaldeído, β-propiolactona ou etilenoimina ou seus derivados, e/ou por tratamento físico. O método preferido de inativação será aqui a exposição a um agente químico e, em particular, a etilenoimina ou a β-propiolactona. O imunógeno na composição de vacina ou imunogênica pode ser expresso de um fragmento de DNA contendo uma seqüência de nucleo-tídeo de PCV-2 ou seu fragmento (vantajosamente codificando pelo menos um epitopo), por exemplo selecionado do grupo consistindo nas seqüências designadas pelas referências SEQ IO NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, bem como as SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 (Figuras 1 - 4 e 6 - 7). O imunógeno na composição de vacina ou imunogênica pode ser expresso de um fragmento de DNA contendo uma ORF selecionada do grupo consistindo em ORFs 1 a 13, tais como ORFs 4, 7, 10 e 13; preferivelmente as ORFs 4 e/ou 13, de uma cepa de PCV-2, em particular de uma das cepas acima identificadas (como esboçado no WO-A-99 18214 - ver também a Tabela 1 abaixo). Assim, o imunógeno ou uma parte deste, tal como um epitopo de interesse, podem ser obtidos pela sua expressão in vitro a partir de um recombinante ou um vetor. O imunógeno pode ser ainda purificado e/ou concentrado pelos métodos convencionais. O imunógeno na composição de vacina ou imunogênica pode ser expresso in vivo por um vetor de expressão compreendendo um fragmento de DNA contendo uma seqüência de nucleotídeo de PCV-2, ou seu fragmento (vantajosamente codificando pelo menos um epitopo), por exemplo selecionada do grupo consistindo nas seqüências designadas pelas re- ferências SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, bem como SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 (Figuras 1 - 4 e 6 - 7). De forma semelhante, o imunógeno na composição de vacina, imunogênica ou imunológica pode ser expresso in vivo por um vetor de expressão compreendendo um fragmento de DNA contendo um ORF selecionado do grupo consistindo em ORFs 1-13, tais como ORFs 4, 7, 10 e 13, preferivelmente ORFs 4 e/ou 13, de uma cepa de PCV-2, em particular de uma das cepas acima identificadas. Isto é, a composição de vacina ou imunogênica pode compreender um vetor de expressão que expresse o imunógeno ou uma parte deste, por exemplo um epitopo de interesse, in vivo. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor adequado, tal como um vetor selecionado de plasmídeos de DNA, bactérias tais como E. coli, vírus tais como o baculovírus, o herpesvírus tal como o vírus da doença de Aujeszky, o adenovírus incluindo um adenovírus porcino, o poxvírus, especialmente o vírus da vacínia, o avipoxvírus, o canaripoxvírus, e o swinepox vírus, inter alia (A pessoa versada na técnica pode também referir-se aos pedidos de patente U.S. de Audonnet et al. e Bublot et al., números de série 60/138.352 e 60/138.478, respectivamente, ambos depositados em 10 de junho de 1999, em particular à descrição detalhada e, mais particularmente, aos exemplos ("DNA VACCINE-PCV" e "PORCINE CIRCOVIRUS RECOMBINANT POXVÍRUS VACCINE", respectivamente, anexos como apêndices).

Conseqüentemente, a invenção também compreende moléculas de ácido nucléico e vetores contendo-as, bem como seus produtos de expressão, composições compreendendo tais moléculas de ácido nucléico e/ou vetores e/ou produtos de expressão, bem como métodos para produzir e usar qualquer uma ou todas estas modalidades. A invenção especialmente engloba aqui ORFs e/ou fragmentos que codificam um imunógeno ou epitopo, bem como moléculas de ácido nucléico das cepas 1103 e/ou 1121, em particular suas ORFs 1 a 13, tais como ORFs 4, 7, 10 e 13, preferivelmente ORFs 4 e/ou 13, e seus fragmentos, bem como vetores incluindo estas moléculas de ácido nucléico, composições incluindo estas moléculas de ácido nucléico, vetores ou seus produtos de expressão, composições com- preendendo tais produtos de expressão, iniciadores ou sondas para tais moléculas de ácido nucléico, e usos ou métodos envolvendo estas modalidades, por exemplo detectando, diagnosticando, ensaiando quanto ao PCV-2, para induzir uma resposta imunogênica ou protetora, e outros. > Como mencionado anteriormente, as modalidades da invenção podem incluir anticorpos. Tais anticorpos podem ser anticorpos policlonais ou monoclonais; por exemplo preparados dos circovírus acima mencionados, ou de um polipeptídeo codificado por um fragmento de DNA tendo uma seqüência de PCV-2, por exemplo selecionada do grupo consistindo nas i SEQ ID NOS: 1,2, 3, 4, 6 e 7 (Figuras 1 - 4 e 6 - 7) ou de um polipeptídeo de expressão por um vetor compreendendo uma seqüência de PCV-2, por exemplo selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 6 e 7 (Figuras 1 - 4 e 6 - 7) ou de um polipeptídeo de expressão por um vetor compreendendo DNA incluindo uma ORF selecionada do grupo consistindo nas ORFs de 1 a 13. O técnico versado pode usar técnicas conhecidas na técnica para eliciar anticorpos e gerar anticorpos monoclonais e policlonais. Anticorpos e antígenos podem ser usados em diagnósticos. A invenção também compreende sondas ou iniciadores das cepas de PCV-2 1103 e/ou 1121, que podem ser úteis, por exemplo, em detectar DNA de PCV-2, em particular com respeito a miocardite e/ou aborto e/ou infecção intra-uterina, bem como para ampliar o DNA de PCV-2, por exemplo para preparar um vetor de expressão. Uma sonda ou iniciador podem ser qualquer extensão de pelo menos 8, preferivelmente pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 12, 13, 14 ou 15, tal como pelo menos 20, por exemplo, pelo menos 23 ou 25, por exemplo pelo menos 27 ou 30 nucleotídeos em genoma de PCV-2 ou um gene de PCV-2 que sejam únicos para o PCV-2, e possivelmente para estas cepas, ou que estejam no PCV-2 e sejam pelo menos conservados entre o PCV e a família de circovírus. Quanto aos iniciadores ou sondas de PCR ou de hibridização e seus comprimentos ótimos para isso, referência é também feita a Kajimura et al., GATA 7(4): 71-79 (1990). A hibridização é vantajosamente sob condições de alta estringência, já que a expressão “alta estringência" deve ser enten- dida por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et a!., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora-tory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., e Hames e Higgins, eds., 1985, Nu-cleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK). A hibridização será entendida para ser realizada usando-se técnicas bem-estabelecidas, incluindo, sem que a estas se limitem, a hibridização de Southernblot, a hibridização de Northern blot, a hibridização in situ e, vantajosamente, a hibridização de Southern para fragmentos de DNA amplificados por PCR.

Sondas e iniciadores semelhantes, peptídeos que não sejam proteínas de PCV-2 de comprimento completo, fazem parte da invenção e podem ser de qualquer extensão de pelo menos 8, preferivelmente pelo menos 10, mais preferivelmente pelo menos 12, 13, 14 ou 15, tal como pelo menos 20, por exemplo pelo menos 23 ou 25, por exemplo pelo menos 27 ou 30 aminoácidos em PCV-2, que sejam únicos para o PCV-2, e possivelmente para estas cepas, ou que estejam no PCV-2 e sejam pelo menos conservados entre o PCV e/ou a família de circovírus. Alternativa ou adicionalmente, os aminoácidos da invenção, que não sejam proteínas de PCV-2 de comprimento completo, podem ser uma região epitópica de uma proteína de PCV-2.

As seqüências de PCV-2 são descritas em Meehan et al., 1998 (Cepa lmp.1010; ORF1 nucleotídeos 398-1342; ORF2 nucleotídeos 1381-314; e respectivamente correspondentes a ORF4 e ORF13 na terminologia da invenção (ver tabela 1) no pedido de patente U.S. número de série 09/161.092 de 25 de setembro de 1998 e a COL4 e COL13 no WO-A-9918214). Várias cepas de PCV-2 e suas seqüências são aqui descritas e denominadas Imp1008, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 e 1121. Outras cepas são descritas em A. L. Hamel et al., J. Virol. junho de 1998, vol. 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) e em I. Morozov et al., J. Clinicai Microb. setembro de 1998, vol. 36, 9: 2535-2541, assim como GenBank AF086834, AF086835 e AF086836. Estas seqüências, ou suas ORFs, ou regiões destas codificando um antígeno ou imunógeno ou epitopo de interesse, também podem ser usadas na prática desta invenção. A invenção também abrange as seqüências eqüivalentes àque- Ias usadas ou mencionadas neste relatório e nos documentos aqui citados; por exemplo, as sequências que são capazes de hibridizar à sequência de nucleotídeos sob condições de alta estringência (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989)). Entre as sequências equivalentes, também podem ser mencionados os fragmentos do gene que conservam a imunogenicidade da sequência completa, por exemplo, um epitopo de interesse. A homologia entre o genoma completo dos PCV tipos 1 e 2 é de cerca de 75%. Porém, dentro do tipo 2, a homologia situa-se geralmente acima de 95%. Assim, na prática da invenção, o uso de qualquer cepa de PCV-2 é englobado por equivalência. Um critério pode ser que a cepa seja do tipo 2, por exemplo que a homologia no nível do nucleotídeo do genoma completo seja igual ou maior do que 85%, vantajosamente, 90% ou maior, mais vantajosa mente 95% ou maior, preferivelmente, 97,98 ou 99% ou maior, com as cepas aqui descritas, por exemplo a cepa Imp1010.

Os limites das ORF da cepa Imp1010 são dados na Tabela 1, a seguir;

As ORF são definidas com respeito à cepa Imp1010. A invenção também abrange o uso das ORFs correspondentes em qualquer outra cepa de PCV-2, e qualquer uma das cepas de PCV-2 como aqui definidas ou nos documentos aqui citados. Assim sendo, da sequência de nucleotídeos genômicos, é técnica de rotina determinar as ORF usando-se um software padrão, tal como o MacVector®. Igualmente, o alinhamento de genomas com aquele da cepa 1010 e a comparação com as ORFs da cepa 1010, possibilita a pessoa habilitada na técnica facilmente determinar as ORFs no genoma para outra cepa (por exemplo, aquelas descritas no WO-A-99 18214, diga-se Imp1008, Imp1011 -48121, Imp1011-48285, Imp999, bem como as novas cepas 1103 e 1121). Usar o software ou fazer-se o alinhamento não é experimentação indevida e diretamente fornece acesso a estas ORFs.

Por exemplo, com referência às figuras 6 e 7, as ORFs correspondentes das cepas 1103 e 1121 são conforme dadas na tabela 2 a seguir: Também equivalente e úteis na prática da invenção são as se- qüências de nucleotídeos que não mudam, nem a funcionalidade nem a especificidade da cepa (isto é, da cepa tipo 2) do gene considerado ou daqueles dos polipeptídeos codificados por este gene. As seqüências que diferem através da degenerescência do código devem, naturalmente, ser incluídas na prática da invenção.

Para a ORF4, a homologia entre PCV-1 e PCV-2 é de cerca de 86%, e para a ORF13, a homologia entre PCV-1 e PCV-2 é de cerca de 66%; Assim, seqüências eqüivalentes também úteis na prática da presente invenção, para ORF4, são aquelas seqüências que têm uma homologia igual ou maior do que 88%, vantajosamente 90% ou mais, preferivelmente homologia de 92% ou 95% ou mais, com a ORF4 da cepa Imp1010, e para a ORF13, aquelas seqüências que têm uma homologia igual ou maior do que 80%, vantajosamente 85% ou maior, preferivelmente 90% ou 95% ou maior do que a ORF13 da cepa Imp1010 (usando a terminologia da tabela 1).

Para a homologia com respeito a outras ORFs, pode-se determinar aquelas seqüências que venham de uma cepa de PCV tendo uma ORF4 e/ou uma ORF13 que tenham uma homologia como definido acima com a ORF correspondente da cepa 1010. Para a ORF7, as seqüências úteis na prática da invenção incluem aquelas seqüências que têm uma homologia que é vantajosamente igual ou maior do que 80%, vantajosamente 85% ou maior, preferivelmente 90% ou 95% ou maior, com a ORF7 da cepa Imp1010. Para a ORF10, seqüências úteis na prática da invenção incluem aquelas seqüências que têm uma homologia que é vantajosamente igual ou maior do que 86%, mais vantajosamente 90% ou maior, preferivelmente 95% ou maior, com a ORF10 da cepa Imp1010 (usando a terminologia da tabela 1).

Igualmente, as seqüências eqüivalentes úteis na prática da presente invenção, para a ORF4, são aquelas seqüências que possuem uma homologia igual ou maior do que 88%, vantajosamente 90% ou maior, preferivelmente 92% ou 95% ou maior, com a ORF4 da cepa Imp1010 e, para a ORF13, são aquelas seqüências que possuem uma homologia igual ou maior do que 80%, vantajosamente 85% ou maior, preferivelmente 90% ou 95% ou maior, com a ORF13 da cepa Imp1010.

As ORF4 e ORF13 têm o potencial para codificar proteínas com pesos moleculares previstos de 37,7 kD e 27,8 kD, respectivamente. As ORF7 e ORF10 (correspondem às ORF3 e ORF4 em Meehan et ai, 1998) têm o potencial para codificar proteínas com pesos moleculares previstos de 11,9 e 6,5 kD, respectivamente. As seqüências destas ORFs acham-se também disponíveis no Genbank AF 055392. Elas podem ser incorporadas nos plasmídeos e ser usadas de acordo com a invenção, sozinhas ou em combinação, por exemplo com a ORF4 e/ou a ORF13.

As outras ORFs 1 - 3 e 5, 6, 8-9, 11-12 descritas na tabela acima (COLs 1 - 3 e 5, 6, 8 - 9, 11 - 12, no WO-A-9918214), ou sua(s) regi-ão(ões) codificando um antígeno ou epitopo de interesse, podem ser usadas na prática desta invenção, por exemplo sozinhas ou em combinação, ou de outra forma uma com a outra ou com as ORFs 4 e/ou 13 ou região(ões) destas codificando antígeno(s) ou epitopo(s). De forma semelhante, quanto à homologia, pode-se determinar que existam seqüências eqüivalentes que venham de uma cepa de PCV com uma ORF13 e/ou uma ORF4 que tenham uma homologia conforme definido acima com a ORF correspondente da cepa 1010, como definido aqui ou em Meehan et ai, 1998. Para a ORF7, uma seqüência eqüivalente tem homologia a ela, que é vantajosamente, por exemplo, igual ou mais do que 80%, por exemplo 85% ou maior, preferivelmente 90% ou 95% ou maior com a ORF7 da cepa Imp1010. E, para a ORF10, vantajosamente uma seqüência eqüivalente tem homologia que é igual ou maior do que 86%, mais vantajosamente 90% ou maior, preferivelmente 95% ou maior, com a ORF10 da cepa Imp1010.

Pode-se determinar a homologia da seqüência de nucleotídeos usando-se o programa "Align" de Myers and Miller ("Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988, e disponível na NCBI. Alternativa ou adicionalmente, os termos "homologia" ou "identidade", por exemplo, com respeito a uma seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos, podem indicar uma medida quantitativa da homologia entre duas seqüências. O per- centual de homologia das seqüências pode ser calculado como (Ν„* -N^)*100/Nref, em que NW é o número total de resíduos não-idênticos nas suas seqüências quando alinhadas, e em que NKf é o número de resíduos em uma das seqüências. Daí, a seqüência de DNA AGTCAGTC terá uma similaridade de seqüência de 75% com a seqüência AATCAATC (Nref = 8; NW=2).

Alternativa ou adicionalmente, "homologia" ou "identidade" com respeito às seqüências podem referir-se ao número de posições com nucle-otídeos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na mais curta das duas seqüências em que o alinhamento das duas seqüências pode ser determinado de acordo com o algoritmo de Wil-bur e Lipman (Wilbur e Lipman, 1983 PNAS USA 80: 726, por exemplo usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de intervalo de 4, e análise e interpretação dos dados das seqüências, incluindo alinhamento, com o auxílio de computador, podem ser convenientemente realizadas usando-se programas comercial mente disponíveis (por exemplo, Intelligenetics® Suite, In-telligenetics Inc., CA). Quando as seqüências de RNA são ditas serem similares, ou têm um grau de identidade ou homologia de seqüência com as seqüências de DNA, a timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual a uracila (U) na seqüência de RNA.

As seqüências de RNA dentro do escopo da invenção podem ser derivadas das seqüências de DNA, por timidina (T) na seqüência de DNA sendo considerada igual a uracila (U) nas seqüências de RNA.

Adicional ou alternativamente, a similaridade ou identidade ou homologia podem ser determinadas usando-se o programa BlastP (Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402) e disponível na NCBI. As seguintes referências fornecem algoritmos para comparar a identidade ou homologia relativa dos resíduos de aminoácido de duas proteínas e, adicionalmente com ou alternativamente, com respeito ao precedente, os preceitos nestas referências podem ser usados para determinar o percentual de homologia ou de identidade: Needleman, S. B. e Wunsch, C. D., "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins", J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970); Smith, T. F. e Waterman, M. S. "Comparison of Biosequences", Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981); Smith, T. F., Waterman, M. S. e Sadler, J. R. "Statistical cha-racterization of nucleicacid sequence functional domains", Nucleic Acids Res.., 11: 2205-2220 (1983); Feng, D. F. e Dolittle, R. F., "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees", J. of Mo-lec. Evol., 25: 351-360 (1987); Higgins, D. G. e Sharp, P. M., "Fast and sen-sitive multiple sequence alignmente on a microcomputer", CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson, J. D., Higgins, D. G. e Gibson, T. J., "CusterW: im-proving the sensitivity of propgressive multiple sequence alignmente through sequence wheighing, positions specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res., 22: 4673-480 (1994); e Devereux, J., Haeberlie, P. e Smithies, O., "A comprehensive set of sequence analysis progran for the VAX", Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984). A invenção ainda compreende usos de um imunógeno de PCV-2, ou sozinho ou em outra combinação com um imunógeno de outro patóge-no porcino para gerar composições de acordo com a invenção, por exemplo, misturar os ingredientes; e a invenção também compreende, portanto, kits em que os componentes acham-se individualmente contidos e opcionalmente os recipientes são embalados juntos para mistura e/ou administração, em que o kit também pode opcionalmente incluir instruções para mistura e/ou administração.

Embora a invenção tenha sido debatida em termos de administrar a porcos fêmeas composições imunogênicas ou de vacina compreendendo um imunógeno de PCV-2, a invenção pode também compreender administrar tais composições a porcas ou leitoas e/ou a varrão, como aqui descrito; Assim, tanto a mãe quanto a cria (por exemplo, porca, leitoa) e o varrão podem receber a administração das composições da invenção e/ou podem ser o objeto do desempenho de métodos da invenção. Conseqüen-temente, as populações de porcos podem receber administração das composições da invenção e/ou podem ser o objeto do desempenho dos métodos da invenção.

De acordo com a presente invenção, as composições imunogê-nicas e de vacina podem compreender imunógenos de mais do que uma cepa de PCV-2. Por exemplo, é possível combinar imunógenos das cepas 1121 e 1103, de uma ou de ambas estas cepas com pelo menos uma outra cepa aqui descrita, ou qualquer outra combinação. A presente invenção proporciona métodos que permitem a uma pessoa versada na técnica avaliar a eficácia de vacinas contra PCV-2. Um primeiro método é um método ELISA ou com soroneutralização. Um segundo método é uma vacinação seguida pela prova com uma cepa de PCV-2 virulenta, por exemplo uma das cepas aqui descritas. Em outras palavras, a invenção permite que se controle quanto aos imunógenos do PCV, incluindo imunógenos de PCV-1, capazes de eliciar uma resposta imunogênica ou protetora contra PCV-2. Tais imunógenos de PCV são então úteis para prevenir ou tratar porcos, em particular, contra a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o PCV-2, bem como contra PMWS e/ou outras seqüelas patológicas com ela associadas.

Assim, um aspecto da invenção é fornecer composições imuno-gênicas ou vacinais que compreendam um imunógeno de PCV e sejam capazes de eliciar uma resposta imunogênica ou protetora contra PCV-2. A invenção refere-se também a métodos de imunização ou vacinação usando-se um tal imunógeno, assim como ao uso de um tal imunógeno para produzir uma tal composição imunogênica ou vacinai. A invenção ainda será agora descrita por meio do seguinte Exemplo e Resultados, fornecidos para ilustração, e não devem ser considerados como uma limitação da invenção. A Figura 1 apresenta a SEQ ID NO: 1, a seqüência de DNA do PCV do genoma da cepa Imp. 1011-48121. A Figura 2 apresenta a SEQ ID NO: 2, a seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 1011-48285. A Figura 3 apresenta a SEQ ID NO: 3, a seqüência de DNA do genoma da cepa Imp. 999. A Figura 4 apresenta a SEQ ID NO: 4, a seqüência do genoma da cepa Imp. 1010. A Figura 5 apresenta a SEQ ID NO: 5, a seqüência de DNA do genoma da cepa PK/15. A Figura 6 apresenta a SEQ ID NO: 6, a seqüência de DNA do genoma da cepa 1103, isolada em Alberta, Canadá, k significa g (G) ou t (T), y significa c (C) ou t (T). Estas variações da seqüência foram observadas na população viral. A Figura 7 apresenta a SEQ ID NO: 7, a seqüência de DNA do genoma da cepa 1121, isolada em Saskatoon, Canadá.

EXEMPLO E RESULTADOS EXEMPLO/RESULTADO 1: MIOCARDITE, ABORTO E INFECÇÃO INTRA-UTERINA ASSOCIADOS COM O PCV-2 Os abortos em tempo tardio e ninhadas de leitões tanto com leitões natimortos quanto mumificados ocorreram em uma nova instalação de suínos com 450 porcos fêmeas quando ela entrou em produção. A pseu-dogravidez foi também observada em várias leitoas. As leitoas receberam duas doses de uma vacina inativada contendo parvovírus e imunógenos leptospirais antes da procriação.

Uma ninhada recebida para exame de pós-morte consistia em nove fetos que pareciam terem morrido em vários estágios da gestação. Havia 2 mumificados, 2 macerados, 3 autolisados e 2 leitões natimortos recentes. Lesões foram observadas em exame patológico grosseiro em um feto apenas parcialmente autolisado. Neste feto, ambos os ventrículos do coração estavam dilatados, o fígado estava aumentado e firme e havia tanto hidrotórax quando ascite. Histopatologicamente, havia áreas extensas de degeneração e necrose miocárdica com edema e fibrose branda, e uma infiltração difusa moderada de linfócitos e macrófagos. Havia congestão he-pática generalizada marcante e perda hepatocelular. O baço e os rins também estavam congestionados. Lesões histológicas significativas não foram detectadas nos outros fetos. O manchamento imunohistoquímico para PCV-2 foi realizado como anteriormente descrito, usando-se um anti-soro policlonal de coelho e um anticorpo monoclonal que foram preparados contra PCV-2 em seções de fixação de formalina, processamento rotineiro e implantação de tecido (Ellis et al., 1998; Ellis et al., 1999). No feto com cardiomiopatia dilatada houve manchamento extensivo para o antígeno de PCV-2 na totalidade do mio-cárdio afetado. O manchamento foi mais extensivo em áreas de necrose e pareceu envolver principalmente os miócitos. O manchamento tanto cito-plásmico quanto nuclear estiveram presentes. Em fetos múltiplos houve manchamento extenso no fígado. Em algumas seções, pareceu envolver principalmente o endotélio sinusoidal e as células de Kupfer, enquanto em outros fetos, incluindo aquele com miocardite, houve também manchamento nuclear e citoplásmico de hepatócitos. As células positivamente manchadas foram dispersas na totalidade dos pulmões, e multifocalmente nos rins. A reação em cadeia da polimerase para PCV-2 foi realizada como anteriormente descrito, usando-se tecido congelado (Ellis et al., 1999). O produto da PCR do tamanho esperado para PCV-2 foi amplificado do tecido fetal. O PVC-2 foi isolado do feto com miocardite e de um aglomerado de tecidos de outros fetos na ninhada, mediante inoculação de homogeneizados teciduais nas células PK-15 livres de PCV.

Os tecidos fetais foram também examinados quanto a outros patógenos virais que haviam sido associados com a lesão fetal e os abortos nos suínos, incluindo o parvovírus porcino (PPV), o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRSV), a encefalomiocardite (EMCV) e o enterovírus. O antígeno de PPV não foi detectado pelo teste de anticorpo fluorescente (FAT) ou seções congeladas dos pulmões, fígado e baço dos fetos mumificados ou natimortos. Os homogeneizados do fígado, dos pulmões e do baço dos fetos abortados foram também inoculados em culturas de células PK-15 livres de PCV, células do tubo de Falópio e células Vero porcinas primárias. Vírus citopáticos não foram detectados após três passagens. Os tecidos foram negativos quanto a PPV usando-se PCR. O antígeno de PRRSV não foi detectado por manchamento imunohistoquímico.

Assim sendo, houve lesões fetais e aborto diretamente associa- dos com o PCV-2. Estes resultados também mostram transmissão vertical do vírus.

Em um estudo prévio, o PCV-1 foi isolado de 2 dos 160 fetos de porcos examinados, implicando que este grupo de vírus pode ser verticalmente transmitido; no entanto, o antígeno de PCV-1 não pode ser associado com quaisquer lesões no tecido (Allan et ai., 1995). A exclusão dos outros agentes que haviam sido associados com as lesões fetais e o aborto em suínos, incluindo o PPV (Bolt et al., 1997; Molitor et a/., 1991), PRRSV (La-ger et al., 1996), EMCV (Kim et al., 1989) e o enterovírus (Molitor et al., 1991), indica que o PCV-2 pode causar patologia fetal significativa e subse-qüente aborto.

No entanto, os imunógenos do PCV-1 (ainda de acordo com a definição geral dada no início) podem eliciar uma resposta imunogênica ou protetora contra a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina, bem como a síndrome debilitante multissistêmica pós-desmama, e os er-goimunógenos de PCV-1 também podem ser usados na prática desta invenção (por exemplo, nos métodos, composições, usos etc.) ou sozinhos ou em combinação com os imunógenos do PCV-2 (o vetor pode conter e expressar DNA codificando para tanto para um imunógeno de PCV-1 e/ou epitopo quanto para um imunógeno de PCV-2 e/ou epitopo) e/ou sozinhos ou em combinação com um imunógeno e/ou epitopo de outro patógeno porcino (se um vetor for usado, o vetor pode conter e expressar DNA codificando tanto para um imunógeno de PCV-1 e/ou epitopo quanto para um imunógeno e/ou epitopo de outro patógeno porcino, ou para um imunógeno de PCV-1 e/ou epitopo e um imunógeno de PCV-2 e/ou epitopo, e um imunógeno e/ou epitopo de outro patógeno porcino). Assim, uma pessoa versada na técnica pode alternativa ou adicionalmente usar um imunógeno de PCV-1, e/ou epitopo e/ou vetor codificando um tal imunógeno e/ou epitopo na prática desta invenção, sem qualquer experimentação indevida; por exemplo, para assim proceder, necessita-se apenas ler o texto presente antes deste Exemplo e na conclusão (após) deste Exemplo, e substituir "PCV-2'1 por --PCV-1-- com qualquer modificação secundária com base nos preceitos deste relatório. A síndrome debilitante associada com infecção de PCV-2, o mais freqüentemente ocorre em porcos de 5 -12 semanas dé idade (Allan et ai, 1998; Ellis et ai, 1998). A infecção experimental de suínos recém-nascidos indica um período prodrômico relativamente longo entre a infecção e o desenvolvimento de sinais clínicos associados com o PCV-2 (Allan et ai, 1999; Ellis et ai, 1999). As descobertas aqui mostram que o vírus é transmitido verticalmente ou no período perinatal. Não apenas a transmissão intrauterina do PCV-2 pode resultar em aborto, mas é possível que subletalmente os leitões infectados dentro do útero possam ser os animais que subseqüentemente desenvolvem a PMWS.

Além disso, estes resultados mostram que a inoculação de porcos fêmeas com uma composição compreendendo um imunógeno de PCV-2 (composição que pode também incluir um imunógeno de outro patógeno porcino, por exemplo o parvovírus porcino), antes da reprodução ou do acasalamento, ou antes do período perinatal e/ou durante a gestação, pode prevenir a miocardite e/ou o aborto e/ou a infecção intra-uterina associados com o circovírus-2 de porcino, bem como a síndrome debilitante multissis-têmica pós-desmama e outras sequelas patológicas associadas com o PCV-2, mediante eliciação de uma resposta imunológica ou anticorpos contra PCV-2.

Naturalmente, as composições, os métodos e outros aspectos da invenção podem ser usados ou praticados em animais outros que não os porcos, por exemplo, carneiro, bisão, gado, javali; por exemplo, se o PCV-2 infectar esses outros animais. EXEMPLO/RESULTADO 2: MIOCARDITE E/OU ABORTO E/OU INFECÇÃO INTRA-UTERINA ASSOCIADOS COM O PCV-2 A presença de PCV-2 em leitões recém-nascidos sugere que a transmissão vertical pode ser um importante meio de transmissão viral. Este modo de transmissão pode estar relacionado não apenas à falha reprodutiva, mas também ao desenvolvimento de doença multissistêmica mais tarde na vida. É de interesse determinar se o PVC-2 não detectado previamente (e o PVC-1) foi verticalmente transmitido em áreas produtoras de porcos, onde a PMWS e, por extensão, a infecção do PCV-2, tenha sido endêmica por pelo menos vários anos.

Trinta e oito submissões envolvendo falha reprodutiva recebidas no laboratório de diagnósticos no Western College of Veterinary Medicine (WCVM), Universidade de Saskatchewan, Saskatoon, Canadá, durante um período de quatro anos, de um total de 30 rebanhos com saúde elevada no Canadá, foram avaliadas. Cinco das fazendas das quais as amostras foram obtidas tiveram casos diagnosticados de PMWS. Vinte e sete das trinta e oito submissões (71%) foram classificadas como abortos; cinco destas (13%) também envolveram pelo menos um feto mumificado. Dos 10 casos remanescentes: 5 envolveram leitões natimortos junto com leitões não-viáveis (13%); 2 com natimortos e um ou mais fetos mumificados (5%); 2 com apenas leitões natimortos (5%); e um com apenas fetos mumificados (2,5%). Os diagnósticos de rotina quanto a patógenos outros que não o cir-covírus revelaram 4 casos (11%) em que a etiologia foi determinada como sendo o parvovírus porcino e 2 casos (5%) em que a etiologia foi determinada como sendo de origem bacteriana. Necrópsias grosseiras foram realizadas e os tecidos foram coletados e fixados em formalina tamponada (tempo de fixação de 24 - 72 horas) e, na maioria dos casos, tecidos frescos foram também submetidos a avaliação microbiológica de rotina. Nenhum destes casos havia sido previamente testado quanto ao PCV-2. A técnica da PCR usada para a detecção do PCV-1 e PCV-2 foi realizada como anteriormente descrito (Tischer et al., 1974). O PCV-1 não foi detectado pela PCR em quaisquer submissões compreendendo falha reprodutiva do período de quatro anos. O PCV-2 foi detectado por PCR em duas diferentes submissões que se originavam da mesma unidade de produção de porcos de sítios múltiplos em duas ocasiões separadas na primavera do último ano no período de quatro anos. A primeira destas submissões compreendeu uma ninhada de leitões com evidência grosseira de mio-cardite, hipertrofia e congestão passiva crônica. A identificação imunohistoquímica do PCV-2 nos tecidos foi rea- lizada como anteriormente descrito (Tischer et ai, 1974). O manchamento imunohistoquímico (IHC) quanto ao PCV-2 foi positivo nos corações de todos os seis dos leitões que haviam sido submetidos, enquanto 4 dos 06 foram positivos por PCR do PCV-2 (ver a tabela seguinte). TABELA: DETECÇÃO DO PVC-2 NOS CORAÇÕES FIXADOS EM FORMA-LINA DE PORCOS COM MIOCARDITE MEDIANTE PCR, IHC E ISOLAMENTO VIRAL EM CULTURA CELULAR. A segunda submissão da mesma fazenda consistiu em uma ninhada de quatro leitões em que 2 eram natimortos e 2 outros morreram logo depois do nascimento. Todos os quatro leitões tinham evidência grosseira de uma miocardite severa difusa, hipertrofia cardíaca e congestão passiva crônica. Apenas o coração fresco congelado e os tecidos dos pulmões/baço reunidos foram submetidos para análise. A PCR do PCV-2 foi positiva nos corações de 2 dos 4 leitões e nos tecidos reunidos pulmonares e esplênicos de 4 dos 4 leitões. O isolamento do PCV-2 dos corações afetados e/ou de tecidos dos pulmões e dos baços reunidos foi positivo em 2 dos 4 casos que foram positivos quanto ao PCV-2 por PCR. Com base na sorologia e/ou PCR, outros agentes associados com a falha reprodutiva em suínos, incluindo o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina e o parvovírus porcino, estavam aparentemente circulando no rebanho da criação. No entanto, estes agentes não puderam ser observados como estando associados com as graves lesões cardíacas (ou outras) nos leitões afetados; mas eles podem contribuir para a PMWS. O PCV-2 não foi detectado por PCR ou IHC em quaisquer casos representativos de falha reprodutiva submetida durante os primeiros três anos do período de quatro anos (ele foi detectado em casos de falha reprodutiva submetida durante o último ano do período de quatro anos). De modo a excluir danos ao DNA devido à fixação da formalina como um possível fator adverso que limitasse a capacidade para se detectar o PCV-2 por PCR, a PCR foi realizada em tecidos coletados de quatro leitões recém-desmamados com PMWS, o DNA do PCV-2 foi amplificado em todos os tecidos fixados que haviam sido testados, incluindo: pulmões, fígado, rins e linfonodos brônquicos, de todos os quatro pacientes. Além disso, a sensibilidade do PCV-2 da PCR era independente da extensão de tempo em que cada tecido havia sido fixado na formalina.

Estes resultados confirmam e estendem a observação anterior (West et a!., 1999) de que o PCV-2 pode ser verticalmente transmitido e pode estar presente em grandes quantidades dentro das lesões dos leitões infectados dentro do útero. A transmissão vertical do vírus PCV-2 e o dano fetal resultante, tal como a miocardite, é uma manifestação adicional da doença do PCV-2. Além disso, a falha em detectar o PCV-2 nos casos de falha reprodutiva antes do último ano do período de quatro anos de uma área endêmica de infecção do PCV-2, pode indicar que a transmissão vertical não foi o mecanismo principal responsável pela disseminação inicial da infecção viral. O modo sexual, assim como vertical, de transmissão podem ser atribuídos à amplitude da infecção do PCV-2 nos porcos. EXEMPLO/RESULTADO 3: CULTURA E ISOLAMENTO DAS CEPAS DE CIRCOVÍRUS PORCINO

Os vírus 1103 e 1021 foram isolados respectivamente em Al-berta e Saskatoon, no Canadá, de casos abortivos de acordo com o método .j descrito em J. Ellis et ai, Can. J. Vet. 1998, vol. 39, 44-51. A cultura viral é realizada em culturas de células PK/15, conhecidas como sendo não-contaminadas com o circovírus porcino (PCV), o pestivírus, o adenovírus porcino e o parvovírus porcino (Allan G. et ai, Pa-togênese das infecções experimentais do circovírus porcino de leitões privados do colostro e exame do material fetal dos porcos. Vet. Microbiol. 1995,44: 49-64).

As monocamadas de células PK/15 são dissociadas por tripsini-zação (com uma mistura de tripsina-versena) de culturas confluentes, e absorvidas em meio MEM-SA contendo 15% de soro fetal de bezerro não contaminado pelo pestivírus (= meio MEM-G) em uma concentração final de cerca de 400.000 células por mililitro. Frações alíquotas de 10 ml desta suspensão celular foram então misturadas com frações alíquotas de 2 ml dos inóculos descritos acima, e as misturas finais foram divididas em alíquotas em volumes de 6 ml em dois frascos Falcon de 25 cm2. Estas culturas foram então incubadas a +37°C por 18 horas, sob uma atmosfera contendo 10% de C02.

Após a incubação, o meio de cultura das monocamadas semi-confluentes foi tratado com D-glicosamina 300 mM (Cat. G48175, Sigma-Aldrich Company Limited, Poole, UK) (Tischr, I. et al., Arch. Virol., 1987, 96: 39-57), depois a incubação foi continuada por um período adicional de 48 -72 horas a +37°C. Em seguida a esta última incubação, um dos Falcons de cada inóculo foi submetido a 3 ciclos sucessivos de congelamen-to/descongelamento. As células PK/15 do Falcon remanescente foram tratadas com uma solução de tripsina-versena, ressuspensas em 20 ml de meio MEM-G, e depois inoculadas em Falcons de 75 cm2 em uma concentração de 400.000 células/ml. Os frascos recém-inoculados foram então "superin-fectados" pela adição de 5 ml do lisado correspondente após os ciclos de congelamento/descongelamento.

EXEMPLO/RESULTADO 4: TÉCNICA PARA A DETECÇÃO DE PCV POR IMUNOFLUORESCÊNCIA O processamento inicial de todas as preparações de cultura celular fixadas com acetona foi realizado por uma técnica de imunofluores-cência indireta (IIF), usando uma diluição de 1/100 de uma reunião de soros de porcos adultos. Esta reunião de soros inclui soros de 25 porcas adultas da Irlanda do Norte e sabe-se que contém anticorpos contra uma ampla variedade de vírus porcinos, incluindo o PCV: parvovírus porcino, adenovírus porcino e o vírus da PRRS. A técnica da IIF foi realizada pela colocação do soro (diluído em PBS) em contato com as culturas celulares durante uma hora a +37°C, seguido por duas lavagens em PBS. As culturas celulares foram então manchadas com uma diluição de 1/80 em PBS de um anticorpo de imunoglobulina antiporco de coelho combinada com isotiocianato de fluo-resceína durante uma hora, e depois lavadas com PBS e montadas em tam- pão de glicerol antes da observação microscópica sob luz ultravioleta. EXEMPLO/RESULTADO 5: PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS DO PCV POR CULTURA IN VITRO A cultura das células PK/15 não-contaminadas e a multiplicação viral foram realizadas de acordo com os mesmos métodos do Exemplo 1. As células infectadas foram colhidas após a tripsinização após 4 dias de incubação a 37°C, e enumeradas. A passagem seguinte foi inoculada com 400.000 células infectadas por mililitro.

As várias cepas de PCV-2 aqui descritas, por exemplo as cepas 1103 e 1121, foram assim cultivadas. EXEMPLO/RESULTADO 6: TITULAÇÃO DO PCV-2 A titulação foi realizada em microplacas de 96 cavidades. Uma suspensão de células PK/15 (150.000 células por ml) foi primeiro introduzida (100 μΙ por cavidade). Depois as diluições da cultura viral foram feitas e 100 μΙ delas foram introduzidas nas cavidades. Incubação foi feita a 37°C com CO2. Após 24 horas, foi realizado um tratamento com glicosamina de meia hora a 37°C (quanto às condições, ver o Exemplo 3). O meio de cultura foi então removido e meio fresco foi introduzido. A incubação foi conduzida por 72 horas a 37°C. A revelação dos focos foi feita usando-se um anticorpo monoclonal anti-PVC-2 e um conjugado de camundongos rotulado de FITC.

Este método pode ser usado para titulação para preparar PCV-2 inativado, bem como atenuado vivo.

EXEMPLO/RESULTADO 7: INATIVAÇÃO DOS ANTÍGENOS VIRAIS

Ao término da cultura viral, as células infectadas foram colhidas e lisadas usando-se ultra-som (Branson Sonifier) ou com o auxílio de um moinho coloidal do tipo rotor-estator (UltraTurrax, IKA). A suspensão foi então centrifugada a 3700 g por 30 minutos. A suspensão viral foi inativada com etilenoimina 0,1% durante 18 horas a +37°C ou com beta-propiolactona a 0,5% durante 24 horas a +28°C. Se o título viral antes da inativação fosse inadequado, a suspensão viral era concentrada por ultrafiltração usando-se uma membrana com um corte de 300 kDa (Millipore PTMK300). A suspen- são viral inativada foi armazenada a +5°C.

EXEMPLO/RESULTADO 8: PREPARAÇÃO DA VACINA NA FORMA DE UMA EMULSÃO COM BASE EM ÓLEO MINERAL A vacina é preparada de acordo com a seguinte fórmula: - suspensão de circovírus porcino inativado: 250 ml - Montanide® ISA 70 (SEPPIC): 750 ml A fase aquosa e a fase oleosa foram esterilizadas separadamente por filtração. A emulsão foi preparada pela mistura e homogeneização dos ingredientes com o auxílio de um emulsificador de turbina Sil-verson.

Uma dose da vacina contém cerca de 107’5 de TCID50. O volume de uma dose de vacina é de 0,5 ml para administração pela via intra-dérmica, e de 2 ml para administração pela via intramuscular.

Esta vacina foi usada em um programa de vacinação contra a síndrome debilitante multissistêmica em combinação com a vacina Parvo-vax .

EXEMPLO/RESULTADO 9: PREPARAÇÃO DA VACINA NA FORMA DE UMA EMULSÃO COM BASE EM ÓLEO METABOLIZÁVEL A vacina é preparada de acordo com a seguinte fórmula: - suspensão de circovírus porcino inativado 200 ml - Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml - Radia 7204 (Oleofina): 740 ml A fase aquosa e a fase oleosa são esterilizadas separadamente por filtração. A emulsão é preparada pela mistura e homogeneização dos ingredientes com o auxílio de um emulsificador de turbina Silverson.

Uma dose de vacina contém cerca de 107,5 TCID50. O volume de uma dose de vacina é de 2 ml para administração pela via intramuscular.

Esta vacina é usada em um programa de vacinação contra a síndrome debilitante multissistêmica em combinação com a vacina Parvo- <§> vax .

EXEMPLO/RESULTADO 10: VACINAÇÃO DE LEITÕES COM O VETOR DE PNA (PLASMÍDEO) Grupos de 3 ou 4 leitões, derivados de cesariana no dia 0, foram colocados em isoladores. Os leitões foram vacinados no dia 2 ou com (A) um plasmídeo compreendendo ORF 13 ou com (B) uma mistura deste plasmídeo com outro plasmídeo compreendendo ORF 4, e com uma solução fisiológica para o grupo de controle. Cada plasmídeo foi diluído em solução fisiológica estéril (NaCI 0,9%) em 250 pg/μΙ de concentração final. Um volume de 2 ml foi injetado pela via intramuscular em dois pontos de 1 ml (1 ponto em cada lado do pescoço). Uma segunda injeção da vacina ou place-bo foi administrada no dia 14. A vacinação com DNA foi bem tolerada pelos leitões e nenhuma evidência quanto a reação adversa à vacinação foi observada. Os leitões foram provados no dia 21 mediante administração oro-nasal da suspensão viral do PCV-2, 1 ml em cada narina. Após a prova, os leitões foram pesados uma vez a cada semana. As temperaturas retais foram registradas nos dias 17, 21, 22, 24, 27, 29, 31, 34, 37, 41, 44. No dia 44, mechas fecais são coletadas de cada porquinho para o derramamento do PCV-2. O vírus foi detectado e quantificado por PCR quantitativa. No dia 45 as necrópsias foram realizadas e as amostras teciduais foram coletadas para isolamento do vírus. • Sintomas clínicos: Não existe nenhuma diferença significativa quanto aos ganhos médios de peso corporal ou às temperaturas corporais médias entre os grupos. • Lesões da necrópsia: A única descoberta grosseira observada nos porcos no término foi a linfadenopatia brônquica. As lesões foram classificadas de acordo com os seguintes critérios. 0 = nenhum aumento visível dos linfonodos 1 = aumento brando dos linfonodos, restrito aos linfonodos brônquicos 2 = aumento moderado dos linfonodos, restrito aos linfonodos brônquicos 3 = aumento grave dos linfonodos, extensivos aos linfonodos brônquicos submandibulares pré-escapulares e linfonodos inguinais. std é uma abreviatura de desvio padrão Grupos Classificação da linfadenopatia média std (desvio padrão) N (A) 1,2 1,3 4 (B) 2,0 1,7 3 controles 3,0 0,0 3 N = número de leitões em cada grupo Uma redução das lesões dos linfonodos foi observada em 3 dos 4 leitões imunizados com a mistura (A) e em 1 dos 3 leitões imunizados com a mistura (B). Esta diferença não é significativa (p > 0,05) devido ao alto valor dos desvios padrã© (std). • Carga do vírus nos tecidos dos linfonodos: O reisolamento quantitativo dos vírus foi realizado em homogeneizados teciduais preparados dos linfonodos brônquicos e mesentéricos.

Os dados mostrados correspondem aos títulos dos vírus nos homogeneizados teciduais_após a transformação em logi0. Títulos do PCV-2 Grupos LN brônquicos LN mesentéricos média std média std N (A) 0,9 0,8 0,9 0,8 4 (B) 0,7 0,6 0,2 0,2 3 Controles 2,0 1,1 1,8 1,1 4 Os linfonodos brônquicos pareceram conter a maior parte do vírus infeccioso. Uma redução da carga viral foi observada nos linfonodos brônquicos e mesentéricos dos leitões imunizados ou com a mistura (A) ou com a mistura (B). A redução é significativa (p < 0,05 para a mistura de plasmídeos). • Excreção viral As mechas fecais após a prova foram avaliadas quanto ao derramamento do PCV-2 por PCR, com base na amplificação da ORF 13 do PCV-2. Cada ensaio foi realizado em triplicata em 2 ml de amostra. Os controles não-vacinados eram negativos quanto ao PCV-2 antes da prova e positivos após a prova, confirmando a validade do ensaio de PCR.

Os valores são expressos como log10 (número de moléculas de DNA do PCV-2 na amostra de 2 μΙ).

Log10 do número de moléculas de DNA do PVC-2 Grupos média std N (A) 3,3 0,3 4 (A) 2,9 0,7 3 Controles 3,6 0,6 4 As diferenças entre os grupos não são significativas (p > 0,05). EXEMPLO/RESULTADO 11: VACINAÇÃO DE LEITÕES COM O VETOR VIVO DE CANARIPOX, E RESULTADOS

Grupos de 3 ou 4 leitões, derivados de cesariana, no dia 0 foram colocados em isoladores. No dia 2 os leitões foram vacinados com 108 pfu de (C) um canaripox compreendendo a ORF 13, ou (D) de um canaripox compreendendo a ORF 13 e a ORF 4, ou canaripox parental, em 1 ml de PBS, por via intramuscular no lado do pescoço. Uma segunda injeção de vacina ou placebo foi administrada no dia 14. A vacinação com canaripox foi bem tolerada pelos leitões e nenhuma evidência quanto a reação adversa à vacinação foi observada. Os leitões foram provados no dia 21 mediante administração oronasal de uma suspensão viral de PCV-2, 1 ml em cada narina. No dia 45 as necrópsias foram realizadas e foram coletadas amostras dos tecidos para isolamento do vírus.

Resultados da necrópsia: « A PMWS é caracterizada geralmente por linfadenopatia e, mais raramente, por hepatite ou nefrite. Assim, as observações grosseiras nos linfo-nodos foram classificadas para cada leitão da seguinte maneira: 0 = sem aumento visível dos linfonodos; 1 = aumento brando dos linfonodos restrito aos linfonodos brônquicos; 2 = aumento moderado dos linfonodos, restrito aos linfonodos brônquicos; 3 = aumento grave dos linfonodos, extensivos aos linfonodos brônquicos submandibulares pré-escapulares e linfonodos inguinais.

Grupos Classificação (C) 0,5 0,0 0,0 1,0 média 0,38 desvio padrão 0,48 (D) 0,0 0,5 0,5 1,0 média 0,5 desvio padrão 0,41 Controles 2,0 2.5 2.5 2.5 média 2,38 desvio padrão 0,25 A linfadenopatia brônquica quanto ao PVC-2 é uma observação grosseira proeminente. Uma redução significativa da lesão dos linfonodos em relação ao grupo de controle é observada após a imunização com (C) e (D) (p<0,05).

Tendo assim descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, deve ficar entendido que a invenção definida pelas reivindicações anexas não deve ser limitada aos detalhes particulares descritos no relatório descritivo acima, já que muitas de suas variações evidentes são possíveis, sem que se afaste do espírito e escopo da presente invenção.

REFERÊNCIAS 1. Allan, G. M., McNeilly, F., Cassady, J. P., et al.: 1995, Patogênese do cir-covírus porcino; infecções experimentais dos leitões privados do colostro e exame do material fetal dos porcos. Vet. Microbiol. 44: 49-64. 2. Allan, G. M., McNeilly, F., Kennedy, S., et aí.: 1998, Isolation of porcine circovirus-líke viruses from piglets with a wasting disease in the United States of America and Europe, J. Vet. Diag. Invest. 10: 3-10. 3. Allan, G. M., Kennedy, S., McNeilly, F., et ai.: 1999, Experimental repro-duction os wasting disease and death by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J. Comp. Path. 121: 1-11 (julho de 1999). 4. Bolt, D. M., Hani, H., Muller, E. e Waldvogel, A. S.: 1997, Nonsuppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection. J. Comp. Path. 117: 107-118. 5. Ellis, J. A., Hassard, L., Clark, E. G. et al.: 1998, Isolation of circovirus from lesions of piglets with postweaning multisystemic wasting syndrome. Can. Vet J. 39:44-51. 6. Ellis, J. A., Krakowka, S., Lairmore, M. et al.: 1999, Reproduction os lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. J. Vet. Diag. Invest. 11:3-14. 7. Kim, H. S., Jo, H. S. e Bergeland, Μ. E.: 1989, Serologic, virologic, and histopathologic observations of encephalomyocarditis virus infection in mummified and stillborn pigs. J. Vet. Diag. Invest. 1:101-104. 8. Lager, K. M. e Halbur, P. G.: 1996, Gross and microscopic lesions in porcine fetuses infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Vet. Diag. Invest. 8: 275-282. 9. Meehan, B. M., McNeilly, F., Todd, D., et al.: 1998, Characterization of novel circovirus DNA's associated wasting disease syndromes in pigs. J. Gen. Virol. 79: 2171-2179. 10. Mengeling, W. L., 1992, Porcine parvovirus. In: Diseases of swine, ed. Leman, A. D., 7â edição, pp. 299-311. lowa State University Press, Ames, IA. 11. Molitor, T. W., Orveerakul, K., Zhang, Z. Z. et al.: 1991, Polimerase chain reaction (PCR) amplifícation for detection of porcine parvovirus. J. Vi- rol. Meth. 32: 201-211 12. Pensaert, M. e DeMeurichy, W.: 1973, A porcine enterovirus causing fetal death and mummification. Experimental infection of pregnant female pigs. Zentralbl Veterinaermed Beih 11: 2025. 13. Tischer, L, Rasch, R. e Tochtermann, G.: 1974, Characterization of pa-povavírus- and picomavirus-like particles -in permanent piglet kidney cell //-nes. Zentralbl-Bakertiol-Org-A 226:153-167. 14. West, K. H., Bystrom, J. M., Wojnarowicz, C. et al.: 1999, Myocarditis and abortion associated with intrautenine infection of sows with porcine cir-covirus-2. J. Vet. Diag. Invest. 1.

REIVINDICAÇÕES

Claims (4)

1, Uso de um imunógeno PCV-2 para formular uma composição de vacina compreendendo (i) um imunógeno de PCV-2 e <ü) um carreador, veículo, excipiente ou adjuvante farmaceuticamenie ou veterinariamente aceitável caracterizado pelo fato de que a referida vacina è para reduzir a carga viral de PCV-2 em linfonodos brônquicos e mesentéricos de suínos, em que o imunógeno de PCV-2 é: a. um primeiro vetor plasmideo de DNA compreendendo uma primeira sequência nucleotídica da ORF13 da cepa Imp1010 de PCV-2, ou da cepa Imp1103 de PCV-2 ou da cepa Imp1121 de PCV-2; ou b. um primeiro vetor plasmideo de DNA compreendendo uma primeira sequência nucleotídica da ORF13 da cepa Imp1010 de PCV-2, ou da cepa Imp1103 de PCV-2 ou da cepa Imp1121 de PCV-2, e um segundo vetor plasmideo de DNA compreendendo uma segunda sequência da ORF4 da cepa Imp1010 de PCV-2, ou da cepa Imp1103 de PCV-2 ou da cepa Imp1121 de PCV-2; em que: a cepa Imp1010 de PCV-2 é de SEQ ID No,; 4; a cepa Imp1103 de PCV-2 é de SEQ ID No,: 6; e a cepa Imp1121 de PCV-2 é de SEQ ID No 7,

2, Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência nucleotídica é a ORF13 da cepa lmp1Q1Q de PCV-2.

3, Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a segunda sequência nucleotídica é a QRF4 da cepa lmp101G de PCV-2.

4, Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a vacina é formulada com um adjuvante.