PL205130B1 - Zastosowanie kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych świń - Google Patents

Zastosowanie kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych świń

Info

Publication number
PL205130B1
PL205130B1 PL353068A PL35306800A PL205130B1 PL 205130 B1 PL205130 B1 PL 205130B1 PL 353068 A PL353068 A PL 353068A PL 35306800 A PL35306800 A PL 35306800A PL 205130 B1 PL205130 B1 PL 205130B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
pcv
virus
seq
plasmid
porcine
Prior art date
Application number
PL353068A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353068A1 (pl
Inventor
John Albert Ellis
Gordon Moore Allan
Brian Meehan
Edward Clark
Deborah Haines
Lori Hassard
John Harding
Catherine Elisabeth Charreyre
Gilles Emile Chappuis
George Steve Krakowka
Jean-Christophe Francis Audonnet
Francis Mcneilly
Original Assignee
Merial Sas
Univ Belfast
Univ Saskatchewan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26848763&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL205130(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Merial Sas, Univ Belfast, Univ Saskatchewan filed Critical Merial Sas
Publication of PL353068A1 publication Critical patent/PL353068A1/pl
Publication of PL205130B1 publication Critical patent/PL205130B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych ś wiń .
Świński cirkowirus 2 (PCV-2, cirkowirus świń 2) został niedawno zidentyfikowany jako czynnik, który powtarzalnie był związany z poodsadzeniowym wielonarządowym zespołem wyniszczającym (PMWS) w populacjach świń w kilku częściach świata (Allan i wsp. 1998; Ellis i wsp. 1998). Izolaty PCV-2 otrzymane z zakażonych świń z kilku krajów są na ogół identyczne pod względem genetycznym, i są wyraźnie odrębne od PCV (CCL33, PCV-1), który był oryginalnie zidentyfikowany w latach 1970-tych jako niecytopatyczne zanieczyszczenie linii komórkowej nerki świń (PK/15) (Meehan i wsp. 1998; Tischer i wsp. 1974). U świń z naturalnie nabytymi lub eksperymentalnie zaindukowanymi zakażeniami PCV-2 obserwuje się postępującą utratę wagi, szybkie oddychanie, duszność i żółtaczkę (Allan i wsp. 1998; Allan i wsp. 1999; Ellis i wsp. 1998; Ellis i wsp. 1999). Do ogólnych objawów patologicznych, które bezpośrednio wiążą się z antygenem PCV-2 należą uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatia), śródmiąższowe zapalenie płuc, zapalenie wątroby i zapalenie nerki (Allan i wsp. 1998; Allan i wsp. 1999; Ellis i wsp. 1998; Ellis i wsp. 1999). Patrz też WO-A-99 18214, WO-A-00 01409, WO-A-99 29717 i WO-A-99 29871. Wirus PCV-2 nie był dotychczas kojarzony bezpośrednio z poronieniami lub uszkodzeniami płodów u świń. Również dotychczas nie proponowano zbadania zależności występowania zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronień i/lub zakażeń wewnątrzmacicznych spowodowanych przez PCV-2.
Referencje ponadto dotyczą zgłoszenia US nr 09/082,558 złożonego 21 maja 1998 oraz zgłoszenia US nr 09/161,092 zgłoszonego 25 września 1998, które jest częściową kontynuacją zgłoszenia nr 09/082,558. Zgłoszenia te podane są jako odniesienia jak i każdy dokument cytowany w niniejszym zgłoszeniu jest również włączony jako odniesienie. Referencje odnoszą się do zgłoszenia US nr 09/161,092 złożonego 09/25/98 jako CIP zgłoszenia US 09/082,558 zgłoszonego 05/21/98, zastrzegającego pierwszeństwo z francuskich zgłoszeń nr 97/12382, 98/00873, 98/03707, złożonych 10/03/97, 1/22/98, 3/20/98, z których każdy oraz każdy dokument w nich cytowany jest niniejszym włączony jako odniesienie.
Opisane zostały konstrukty plazmidów kodujących i wyrażających immunogeny cirkowirusów świń (PCV - Porcine CircoVirus) odpowiedzialne za zespół PMWS (wieloukładowy układ wyniszczenia u świni lub poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający), sposoby szczepienia i szczepionki DNA, jak i sposoby wytwarzania i formułowania tych szczepionek. Wszystkie cytowane w niniejszym opisie dokumenty i wszystkie dokumenty podane w cytowanych tu dokumentach są niniejszym włączone jako referencje.
PCV oryginalnie wykryto jako niecytopatogenne zanieczyszczenie w liniach komórek nerki świni PK/15. Wirus ten został zaklasyfikowany wśród Circoviridae razem z wirusem zakaźnej anemii kurcząt (CAV - Chicken Anaemia Virus) i wirusem PBFDV (wirus choroby dzioba i piór u papug - Psittacine Beak and Feather Disease Virus). Są to małe wirusy bezotoczkowe (od 15 do 24 nm), których wspólną cechą jest posiadanie genomu w postaci kolistego jednoniciowego DNA o wielkości 1,76 do 2,31 tysiąca par zasad (kb). Początkowo sądzono, że genom ten koduje polipeptyd o wielkości około 30 kDa (Todd i wsp. Arch. Virol. 1991, 117: 129-135). Niedawne prace wykazały jednak bardziej złożoną transkrypcję (Meehan B.M. i wsp., J. Gen. Virol. 1997, 78: 221-227). Ponadto między trzema znanymi gatunkami cirkowirusów nie ma znaczących homologii sekwencji nukleotydowych lub na poziomie wspólnych determinant antygenowych. Wirus PCV pochodzący z komórek PK/15 jest uważany za nie patogenny. Jego sekwencja jest znana z B. M. Meehan i wsp., J. Gen. Virol. 1997 (78) 221-227. Dopiero bardzo niedawno niektórzy autorzy zaczęli sądzić, że pewne szczepy PCV mogą być patogenne i związane z występowaniem zespołu PMWS (G.P.S. Nayar i wsp. Can. Vet. J., 1997, 38: 385-387 i Clark E. G. Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 499-501). Nayar i wsp. za pomocą technik PCR wykryli DNA PCV u świń z zespołem PMWS.
Przeciwciała monoklonalne i poliklonalne skierowane przeciwko cirkowirusom spotykanym u ś wiń, u których obserwuje się objawy charakterystyczne dla zespołu PMWS były w stanie wykazać różnice między tymi cirkowirusami a cirkowirusami świń wyizolowanymi z hodowli komórek PK-15 (Allan G.M. i wsp. Vet. Microbiol., 1999, 66: 115-123).
Zespół PWMS wykryty w Kanadzie, Stanach Zjednoczonych i Francji jest charakteryzowany klinicznie przez stopniową utratę wagi i objawy takie jak szybkie oddychanie, duszność i żółtaczka.
PL 205 130 B1
Z patologicznego punktu widzenia przejawia się jako nacieki limfocytowe lub ziarniniakowe, uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatie) i rzadziej zapalenie wątroby i limfocytowe lub ziarniniakowe zapalenie nerek (Clark E.G. Proc. Am. Assoc. Swine Prac. 1997: 449-501; La Semaine
Veterinaire Nr 26, suplement do La Semaine Veterinaire 1996 (834): La Semaine Veterinaire 1997 (857): 54; G.P.S. Nayer i wsp. Can. Vet. J., 1997, 38: 385-387).
Te cirkowirusy uzyskane z Ameryki Północnej i Europy są bardzo blisko ze sobą spokrewnione ze stopniem identyczności dla sekwencji nukleotydowej wynoszącym ponad 96%, natomiast stopień identyczności jest mniejszy, od 80%, jeśli porównuje się sekwencje nukleotydowe tych cirkowirusów z sekwencjami cirkowirusów świń izolowanych z komórek PK-15. Zaproponowano dwie podgrupy wirusów: PCV-2 dla cirkowirusów sprzężonych z zespołem PMWS i PCV-1 dla cirkowirusów izolowanych z komórek PK-15 (Meehan B.M. i wsp., J. Gen. Virol. 1998 79: 2171-2179; WO-A-9918214).
Referencje również dotyczą amerykańskich zgłoszeń US nr 09/082,358 zgłoszonego 21 maja, 1998 i US nr 09/161,092 zgłoszonego 25 września 1998 jako częściowa kontynuacja US nr 09/082,558, z których każdy jest tu włączony w postaci odniesienia razem z cytowanymi w nich dokumentami.
W niniejszym zgłoszeniu odniesiono się do kilku publikacji. Referencje do tych dokumentów można znaleźć na końcu opisu i/lub tam gdzie określony dokument został powołany. Dokumenty te należą do dziedziny wynalazku i każdy dokument, do którego się odnoszono lub cytowano w tym zgłoszeniu („niniejszym cytowane dokumenty) jak i każdy dokument, na który się powołano lub zacytowano w niniejszym cytowanych dokumentach są również włączone jako odniesienia.
Poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający (PMWS) jest niedawno rozpoznaną chorobą młodych świń. PMWS charakteryzuje się klinicznie postępującą utratą wagi i innymi objawami takimi jak szybkie oddychanie, duszność i żółtaczka. Z objawów patologicznych zaobserwowano nacieki limfocytowe i ziarniakowe, uogólnione powiększenie węzłów chłonnych i rzadziej limfocytowe i ziarniakowe zapalenie wątroby i nerek (Clark, 1997; Harding, 1997).
Chorobę tę opisano w różnych krajach europejskich jak też w Ameryce Północnej. Nie są obecnie osiągalne metody leczenia i zapobiegania chorobie.
Wiele dowodów wskazuje na cirkowirus świń jako na czynnik etiologiczny PMWS (Ellis i wsp., 1998) Cirkowirusy odzyskiwano ze świń z PMWS i wykazano obecność przeciwciał przeciw świńskiemu cirkowirusowi u chorych świń.
Cirkowirusy są wirusami o jednoniciowym kolistym DNA znajdowanymi u wielu gatunków zwierząt i roślin. Cirkowirusy świńskie oryginalnie wyizolowano jako zanieczyszczenie z ustalonej linii komórkowej świńskiej nerki. Preparat wyizolowanej hodowli komórkowej oznaczono jako PK-15 (Meehan i wsp., 1997). Niedawno, świńskiego cirkowirusa otrzymanego ze świń z PMWS porównano z PK-15. Takie wirusy różnią się znacznie od PK-15 na poziomie sekwencji nukleotydowej jak i białkowej i zostały oznaczone jako PCV2 (Meehan i wsp., 1998; Hamel i wsp., 1998).
W genomie PVC2 zidentyfikowano aż trzynaście otwartych ramek odczytu (ORF) (COL1 do COL13 jak we francuskim zgłoszeniu patentowym 98 03707). Cztery z tych ORF wykazują znaczną homologię z analogicznymi ORF z genomu PK-15. ORF1 (Meehan i wsp., 1998; odpowiadający COL4 we francuskim zgłoszeniu patentowym 98 03707) obejmujący nt (nukleotydy) 398-1342 (GenBank numer dostępu AF055392) potencjalnie może kodować białko o przewidywanej masie cząsteczkowej 37,7 kD. ORF2 (Meehan i wsp., 1998; odpowiada COL13 we francuskim zgłoszeniu patentowym 98 03707) obejmuje nt 1381-1768 połączone z 1-314 (GenBank numer dostępu AF055392) może kodować białko o przewidywanej masie cząsteczkowej 27,8 kD. ORF3 (Meehan i wsp., 1998; odpowiada COL7 z francuskiego zgłoszenia patentowego 98 03707), obejmuje nt 1018-704 (GenBank numer dostępu AF055392) i może kodować białko o przewidywanej masie cząsteczkowej 11,9 kD. ORF4 (Meehan i wsp., 1998; który odpowiada COL10 we francuskim zgłoszeniu patentowym 98 03707) obejmuje nt 912-733 (GenBank numer dostępu AF055392) i może potencjalnie kodować białko o przewidywanej masie cząsteczkowej 6,5 kD.
ORF1 z PCV2 jest wysoce homologiczny (86% identyczności) do ORF1 izolatu PK-15 (Meehan i wsp., 1998). Białko kodowane przez ORF1 PK-15 częściowo scharakteryzowano (Meehan i wsp., 1997; Mankertz i wsp., 1998a). Wiadomo, że jest ono niezbędne do replikacji wirusa i prawdopodobnie jest zaangażowane w replikację wirusowego DNA. Identyczność sekwencji białkowej między odpowiadającymi ORP2 była niższa (66% identyczności) niż dla ORF1, ale każdy z ORF2 wykazywał obecność silnie konserwowanego, zasadowego obszaru na N-końcu, podobnego do obserwowanego w obszarze N-końca głównego białka strukturalnego ptasiego cirkowirusa wirusa zakaźnej anemii
PL 205 130 B1 kurcząt (CAV) (Meehan i wsp., 1998). Niedawno w publikacji Mankertz i wsp. (1998b) zasugerowali, że ORP2 izolatu PK-15 (określany jako ORP 1 w Mankertz i wsp., 1998b) koduje białko kapsydu.
Obserowano większe różnice między odpowiednimi ORP3 i ORP4 izolatu PK-15 i PCV2. W każdym przypadku występowała delecja C-końcowego regionu ORF4 i ORF3 PCV2 w porównaniu z odpowiednimi ORF-ami obecnymi w genomie izolatu PK-15. Najwyż szą homologię sekwencji biał kowych zaobserwowano dla N-końcowych obszarów zarówno ORF3 jak i ORF4 (Meehan i wsp., 1998).
Jak dotąd nie zostały opublikowane analizy transkrypcji genomu PCV2. Niedawno uzyskane dane dla izolatu PK-15 wskazują, że następuje wycinanie intronów w transkrypcie ORF2 (Mankertz i wsp., 1998b).
Wirus krowianki skutecznie wykorzystano do szczepień przeciwko ospie, co doprowadziło do ogólnoświatowej likwidacji ospy w roku 1980. Wraz z wykorzenieniem ospy, istotna stała się inna rola dla wirusów ospy jako wektorów poddanych inżynierii genetycznej przeznaczonych do ekspresji obcych genów (Panicali i Paoletti, 1982; Paoletti i wsp., 1984). Geny kodujące heterologiczne antygeny wyrażano w wirusie krowianki, często osiągając ochronną odporność przeciwko odpowiadającemu patogenowi (omówione przeglądowo w Tartaglia i wsp., 1990). Silnie osłabiony dla szczepionek szczep, oznaczony jako MVA wykorzystano także jako wektor dla szczepionek opartych na wirusie ospy. Wykorzystanie MVA opisano w amerykańskim patencie U.S. nr 5,185,146.
Dwa dodatkowe systemy wektorów szczepionkowych zakładają wykorzystanie wirusów ospy o naturalnym ograniczeniu gospodarza. Oba, wirus ospy drobiu (FPV, Taylor i wsp., 1988a, b) i wirus ospy kanarków (CPV, Taylor i wsp., 1991, 1992) poddano inżynierii genetycznej tak, aby wyrażały produkty obcych genów. Wirus ospy drobiu (FVP) jest modelowym wirusem rodzaju Avipoxvirus z rodziny Poxviridae (Pokswirusów). Wirus powoduje znaczą c ą ekonomicznie chorobę drobiu dobrze kontrolowaną od lat 1920 przez zastosowanie żywych atenuowanych szczepionek. Replikacja wirusów ptasiej ospy jest ograniczona do gatunków ptaków (Matthews, 1982) i nie ma doniesień w literaturze o wydajnej infekcji jakiegokolwiek gatunku nie będącego ptakiem, włączając człowieka, spowodowanej przez wirusa ptasiej ospy. Takie ograniczenie względem gospodarza dostarcza naturalnej bariery bezpieczeństwa przed przenoszeniem wirusa na inne gatunki i powoduje, że jest atrakcyjną propozycją zastosowanie wektorów szczepionkowych opartych na wirusach ptasiej ospy w zastosowaniach weterynaryjnych i podawaniu ludziom.
FPV korzystnie zastosowano jako wektor wyrażający antygeny z patogenów drobiu. Białko hemaglutyniny złośliwego wirusa ptasiej grypy wyrażano w rekombinancie FPV (Taylor i wsp., 1988c). Po zaszczepieniu rekombinantem kurczaków i indyków następowała indukcja odpowiedzi immunologicznej, która powodowała ochronę w stosunku do prowokacji zarówno homologicznym jak i heterologicznym zł oś liwym wirusem grypy (Taylor i wsp., 1988c). Wytworzono tak ż e rekombinanty FPV wyrażające glikoproteiny powierzchniowe wirusa choroby Newcastle (NDV - wirusa rzekomego pomoru drobiu) (Taylor i wsp., 1990; Edbauer i wsp., 1990).
Inne atenuowane wektory wirusów ospy wytworzono przez genetyczne modyfikacje szczepów wirusa typu dzikiego. Wektor NYVAC otrzymany przez usunięcie specyficznej wirulencji i genów specyficzności względem gospodarza z kopenhaskiego szczepu krowianki (Tartaglia i wsp., 1992) okazał się użyteczny jako wektor rekombinowany, w wywoływaniu ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciw wyrażanym obcym antygenom.
Innym uzyskanym technikami inżynierii genetycznej wirusem jest ALVAC, pochodzący od wirusa ospy kanarków. ALVAC nie replikuje się wydajnie w gospodarzu nie będących ptakiem, co zatem charakterystycznie zwiększa jego profil bezpieczeństwa (Taylor i wsp., 1991 i 1992). Zarówno ALVAC i NYVAC są wektorami BSL-1.
Jednym podejściem do opracowania podjednostkowej szczepionki PCV2 jest zastosowanie żywych wektorów wirusowych do wyrażania odpowiednich ORF PVC2. Zrekombinowane wirusy ospy można konstruować w dwóch etapach znanych w dziedzinie i analogicznych ze sposobami tworzenia sztucznych rekombinantów wirusów ospy, takich jak wirus krowianki i wirus ospy ptasiej opisanymi w patentach US Nr 4,769,330, 4,722,848, 4,603,112; 5,110,587; 5,174,993; 5,494,807 i 5,505,941, których ujawnienia niniejszym włączono jako odniesienia. Należy, więc uznać, że będzie bardzo korzystne względem obecnego stanu techniki dostarczenie rekombinowanych wirusów ospy z PCV2 i pochodzących od nich kompozycji i wytworów zwłaszcza rekombinantów PCV2 opartych o ALVAC oraz kompozycji i wytworów od nich pochodzących, a w szczególności takich rekombinantów zawierających ORF1 i/lub ORF2 z PCV2 oraz kompozycji i produktów od nich pochodzących.
PL 205 130 B1
Okazało się zadziwiająco, że PCV-2 jest czynnikiem powodującym zapalenie mięśnia sercowego, poronienia i zakażenia wewnątrzmaciczne, jak i poodsadzeniowy wielonarządowy zespół wyniszczający.
Istota wynalazku dotyczy zastosowania kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych świń, w której kompozycja szczepionkowa obejmuje farmaceutycznie lub weterynaryjnie dopuszczalny nośnik i/lub podłoże i/lub zaróbkę i/lub adiuwant, i immunogen PCV-2, przy czym immunogenem PCV-2 jest inaktywowany PCV-2, lub immunogenem PCV-2 jest atenuowany PCV-2, lub immunogen PCV-2 może być wyrażany z wektora obejmującego fragment DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodująca ORF4 i /lub ORF13 z PCV-2.
Korzystnym wektorem jest wektor ekspresyjny i jest on wybrany z grupy składającej się z plazmidowego DNA, E.coli, bakulowirusów, wirusów herpes, wirusa choroby Aujeszkiego, świńskich adenowirusów, wirusów ospy, wirusa krowianki, wirusa ospy ptasiej, wirusa ospy kanarków i wirusa ospy świń, korzystniej wektorem jest plazmidowy wektor DNA.
Ponadto w równie korzystnym wykonaniu wynalazku wektor zawiera i wyraża ORF13 z PCV-2 lub ORF4 i ORF13 z PCV-2.
Z definicji immunogen PCV-2 ma obejmować ż ywy atenuowany lub inaktywowany PCV-2 lub podjednostkę (podjednostki) z PCV-2 uzyskane przez ekspresję in vitro lub ekstrakcję lub fragment(y) obejmujące przynajmniej jeden interesujący epitop, który może być uzyskany za pomocą syntezy chemicznej lub przez lub ekspresję in vitro rekombinantów jak również zrekombinowanego/ych wektora(ów) obejmującego/ych i wyrażającego/ych in vivo sekwencję/e lub fragment/y lub epitop/y genomu PCV-2 jak tu ujawniono lub takich jak w cytowanych dokumentach lub podanych jako odnośniki.
Podobna definicja dotyczy immunogenu innego patogenu świni jak zostało to ujawnione w opisie wynalazku.
Według definicji kompozycja immunogenna wywołuje odpowiedź immunogenną - lokalną lub ogólnoustrojową. Kompozycja szczepionki wywołuje odpowiedź ochronną lokalną lub ogólnoustrojową. Określenie „kompozycja immunogenna obejmuje „kompozycję szczepionkową (jako że poprzednie określenie może dotyczyć kompozycji ochronnej).
Tak więc opisane rozwiązania będą dotyczyć sposobów i/lub kompozycji dla zapobiegania i/lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego powodowanego przez PCV-2 i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego jak i poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego i/lub patologicznych następstw obejmujących, ale nie ograniczonych do, poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego; jak i sposobów formułowania takich kompozycji (które to kompozycje mogą także zawierać immunogen parwowirusa świni (PPV)) oraz również zastosowania immunogenu z PCV-2 do formułowania takich kompozycji.
Stąd możliwe jest zastosowanie immunogenów PCV-2 do przygotowania kompozycji przeznaczonej do zapobiegania i/lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronień i/lub zakażeń wewnątrzmacicznych powodowanych przez PCV-2.
Przedstawiono również izolację i charakterystykę nowych szczepów PCV-2 określonych jako 1103 (1103/1 P.2) i 1121 (1121/1 P.1) i ich zastosowanie do wytwarzania immunogenów jak i antygenów i przeciwciał do zastosowania w diagnostyce, w związku z zapaleniem mięśnia sercowego i/lub poronieniem i/lub zakażeniem wewnątrzmacicznym, jak i poodsadzeniowym wielonarządowym zespołem wyniszczającym i/lub związanym z nim patologicznymi następstwami powodowanym przez PCV-2.
Zgłaszający stwierdził, że konstrukty plazmidów kodujące i wyrażające immunogeny PCV-2 mogą być stosowane do immunizacji świń przeciwko zespołowi PMWS.
Immunogeny PCV-2 mogą być stosowane w kombinacji z immunogenami PCV-1 tak, aby również immunizować zwierzęta przeciwko PCV-2.
Jest mniej korzystne stosowanie samych immunogenów z PCV-1. Do immunizacji świń mogą być stosowane konstrukty plazmidów kodujące i wyrażające immunogen PCV-1 lub PCV-2, w szczególnoś ci obejmują ce otwarte ramki odczytu (ORF) 1 i/lub 2 z PCV-1 i ORF1 i/lub 2 z PVC-2.
Jest oczywiste, że w rozwiązaniach według wynalazku mogą być również wykorzystywane plazmidy kodujące i wyrażające ekwiwalentne sekwencje nukleotydowe to znaczy sekwencje, które nie zmieniają ani funkcjonalności ani specyficzności szczepu ze względu na rozważany gen lub polipeptydy kodowane przez ten gen. Będzie to również dotyczyło sekwencji różniących się ze względu na degenerację kodu.
PL 205 130 B1
Sekwencje PCV-2 stosowane w przykładach pochodzą z Meehan i wsp. powyżej (nukleotydy ORF1 389-1342; nukleotydy ORF2 1381-314; i odpowiadają odpowiednio ORF4 i ORF13 w US 09/161,092 z 25 września 1998 oraz COL4 i COL13 w WO-A-9918214). Inne sekwencje PCV-2 zostały opublikowane w WO-A-9918214 i są nazwane Imp1008, Imp999, Imp1011-48285 i Imp1011-48121 jak i w A.L. Hamel i wsp. J. Virol., czerwiec 1998, tom 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) oraz w I. Morozov i wsp. J. Clinical Microb. wrzesień 1998 tom 36, 9: 2535-2541 jak i GenBank jako AF086834, AF086835 i AF086836, co daje dostęp do ekwiwalentnych sekwencji ORF.
Rozwiązania opisane w wynalazku mogą również wykorzystywać ekwiwalentne sekwencje, w tym znaczeniu, ż e są one zdolne do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej rozważ anego genu w warunkach o wysokiej ostrości. Wśród ekwiwalentnych sekwencji mogą być także wymienione fragmenty genów zachowujące immunogenność całej sekwencji. Inne ORF 1-3 i 5-11 ujawnione w US 09/161,092 z 25 wrześ nia 1998 (COL 1-3 i 5-12 w WO-A-9918214) w szczególnoś ci ORF7 i 10 mogą być stosowane w warunkach tu opisanych w kombinacjach lub inaczej ze sobą lub z ORF1 i ORF2 jak tu zdefiniowano.
Rozwiązania według wynalazku pozwalają na prowadzenie szczepienia samic świń (np. macior, loszek) kompozycją obejmującą (przynajmniej jeden) immunogen PCV-2 (która to kompozycja może też zawierać immunogen z parwowirusa świni) przed rozmnażaniem i/lub przed kopulacją, i/lub w czasie ciąży i/lub przed okresem okoł oporodowym lub prosieniem; i/lub wielokrotnie w czasie ż ycia, aby zapobiec zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniu i/lub zakażeniu wewnątrzmacicznemu związanemu z PCV-2 jak i poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu i innym patologicznym konsekwencjom zwią zanym z PCV-2 lub, aby wywoł a ć immunogenną lub ochronną odpowiedź przeciwko PCV-2 i w ten sposób zapobiec poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu i/lub zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniu i/lub zakażeniu wewnątrzmacicznemu związanemu z cirkowirusem-2 świni i/lub innym patologicznym następstwom związanym z PCV-2.
Korzystnie, co najmniej jedno szczepienie jest prowadzone przed pokryciem. Następnie korzystnie szczepienie wykonuje się w czasie ciąży tzn. w około połowie ciąży (w około 6-8 tygodniu ciąży) i/lub na końcu ciąży (w około 11-13 tygodniu ciąży). Tak, więc w korzystnym reżimie podawania szczepienie następuje przed pokryciem i przypominające szczepienie jest prowadzone w trakcie ciąży. Następnie może być prowadzone ponowne szczepienie przed każdym pokryciem i/lub w czasie ciąży w około połowie ciąży (w około 6-8 tygodniu ciąży) i/lub na końcu ciąży (w około 11-13 tygodniu ciąży). Korzystnie ponowne szczepienie można wykonywać jedynie w czasie ciąży.
W innym korzystnym wykonaniu prosiaki, takie jak prosiaki ze szczepionych samic (na przykł ad, zaszczepionych tak jak tu opisano) są szczepione w czasie pierwszych tygodni życia np. szczepienie jest przeprowadzone w wieku pierwszego i/lub drugiego i/lub trzeciego i/lub czwartego i/lub piątego tygodnia życia. Bardziej korzystnie prosiaki szczepi się najpierw w pierwszym tygodniu życia lub w trzecim tygodniu ż ycia (tzn. w momencie odstawienia od piersi). Jeszcze bardziej korzystnie takie prosiaki następnie otrzymują dawkę wspomagającą dwa (2) do cztery (4) tygodnie później (po pierwszym szczepieniu). Stąd zarówno potomstwo jak i świnie płci żeńskiej (np. maciory, loszki) mogą otrzymać kompozycje przedstawione w opisie wynalazku.
Zatem możliwe jest wytworzenie immunogennych lub szczepionkowych kompozycji zawierających immunogen(y) ze szczepu (szczepów) PCV-2 1103 i/lub 1121 do zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego związanego z PCV-2 jak i poodsadzeniowego wielonarzą dowego zespołu wyniszczają cego i innych patologicznych następstw związanych z PCV-2.
Immunogen PCV-2 może być zastosowany do formułowania kompozycji immunogennej lub szczepionkowej do zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego związanego z PCV-2 jak i poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego i innych patologicznych konsekwencji związanych z PCV-2.
Taka kompozycja immunogenna lub szczepionkowa przeznaczona do zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego związanego z PCV-2 jak i poodsadzeniowego wielonarzą dowego zespołu wyniszczają cego moż e zawierać noś nik i/lub podłoże i/lub zaróbkę i/lub adiuwant dopuszczalny farmaceutycznie lub w weterynarii i immunogen PCV-2.
Kompozycja może dodatkowo zawierać przynajmniej jeden immunogen, z co najmniej jednego dodatkowego patogenu świni, na przykład, zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRUS), MyPL 205 130 B1 coplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, pseudowścieklizny, cholery świń, grypy świń i parwowirusa świń (PPV). Tak więc, kompozycje oparte na wektorach mogą zawierać co najmniej jeden immunogen świni z co najmniej jednego dodatkowego patogenu świni, taki jak wektor wyrażający sekwencję patogenu, przy czym wektor może również być wektorem wyrażającym immunogen PCV-2. Wektor wyrażający sekwencje PCV-2 może obejmować sekwencję lub fragment PCV-2. W opisie zostały przedstawione takie cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory je zawierające, kompozycje obejmujące takie cząsteczki kwasu nukleinowego lub produkty ekspresji wektora z takich cząsteczek kwasu nukleinowego, kompozycje obejmujące takie produkty ekspresji, sondy lub startery dla takich cząsteczek kwasu nukleinowego i sposoby wytwarzania lub zastosowania dowolnego lub wszystkich wymienionych powyżej.
Wektor może obejmować DNA wektorowego plazmidu, bakterię taką jak E. coli, wirus taki jak bakulowirus, wirus opryszczki w tym herpeswirusy świni, w tym wirus choroby Aujeszky'ego, adenowirus w tym adenowirus świni, wirus ospy, w tym wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków, wirus ospy szopa i wirus ospy świni, i tym podobne. Kompozycje oparte na wektorze mogą zawierać wektor, który zawiera i wyraża ORF wybrany z grupy złożonej z ORF 1 do 13, taki jak ORF wybrany z ORF 4, 7, 10 i 13, korzystnie ORF4 i/lub 13 z PCV-2, korzystnie z dowolnego ze szczepów PCV-2 tu zidentyfikowanych i w szczególności szczepów 1103 i/lub 1121. Ponadto immunogen w kompozycjach (albo PCV-2 i/lub z innego patogenu ś wini) moż e być wytworzony w sposób zrekombinowany.
Słowo plazmid ma obejmować dowolną jednostkę transkrypcyjną DNA w postaci sekwencji polinukleotydowej obejmującej sekwencję PCV, która ma ulec ekspresji. Korzystnie plazmid obejmuje elementy niezbędne do jego ekspresji, na przykład ekspresji in vivo. Korzystna będzie kolista forma plazmidu, superskręcona lub nie, jaki plazmid w formie liniowej. Plazmidowa kompozycja immunogenna lub szczepionkowa może być podawana za pomocą pistoletu genowego, śródskórnie przy pomocy bezigłowego wtryskiwacza, podskórnie lub domięśniowo lub poprzez śluzówki, lub w dowolny inny sposób, który pozwala na ekspresję in vivo, i korzystnie wytworzenie odpowiedzi immunogennej lub ochronnej.
Należy zauważyć, że produkt ekspresji wytwarzany przez opisane wektory lub rekombinanty może też dowolnie być izolowany i/lub oczyszczany z komórek zakażonych lub transfekowanych, przykładowo aby wytworzyć kompozycje do podawania świniom, jednak w niektórych przypadkach może być korzystne nie izolowanie i/lub oczyszczanie produktu ekspresji z komórki, szczególnie jeśli komórka lub jej części wzmagają efekt immunogenny polipeptydu. Ponadto są znane techniki oczyszczania i/lub izolacji białek, które mogą zostać zastosowane bez nadmiernego eksperymentowania, tak aby oczyszczać i/lub izolować produkty zrekombinowane i/lub produkty ekspresji wektora i/lub podjednostek PCV-2 i/lub innych patogenów świni. Takie techniki zasadniczo będą obejmować strącanie z wykorzystaniem przewagi rozpuszczalności interesującego białka w różnych stężeniach soli, strącanie rozpuszczalnikami organicznymi, polimery i inne materiały, strącanie przez powinowactwo i selektywną denaturację, chromatografię kolumnową, w tym wysoce wydajną chromatografię cieczową (HPLC), wymianę jonową, powinowactwo, immunopowinowactwo lub chromatografię z ligandami barwników; immunoprecypitację, filtrację na żelu, metody elektroforetyczne, ultrafiltrację oraz ogniskowanie izoelektryczne i ich kombinacje oraz kombinacje pomiędzy nimi.
W opisie wynalazku przedstawione są sposoby zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego związanego z PCV-2 jak i poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego i innych patologicznych konsekwencji związanych z PCV-2 obejmujące indukcję immunogennej lub ochronnej odpowiedzi przeciw PCV-2 u ś wini, która obejmuje podanie ś wini kompozycji wymienionej uprzednio lub tu ujawnionej.
Stąd opisane rozwiązania umożliwiają prowadzenie sposobu zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego związanego z PCV-2 jak i poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego i innych patologicznych konsekwencji związanym z PCV-2, który to sposób obejmuje indukcje odpowiedzi immunogennej lub ochronnej przeciw PCV-2 u świni i będzie obejmował podanie świni kompozycji zawierającej czynny składnik obejmujący immunogen PCV-2 oraz nośnik lub zaróbkę lub nośnik, korzystnie z adiuwantem dopuszczalne farmaceutycznie lub w weterynarii. Taki sposób może być prowadzony w celu zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego związanego z PCV-2 i może obejmować podanie kompozycji obejmującej nośnik dopuszczalny far8
PL 205 130 B1 maceutycznie lub w weterynarii i immunogen PCV-2. Immunogen PCV-2 może być atenuowanym żywym całym PCV-2 lub inaktywowanym PCV-2. W prowadzeniu sposobu może być wykorzystana kompozycja, która jest kompozycją podjednostkową, immunogenną lub szczepionkową. Sposób może być prowadzony przy wykorzystaniu kompozycji dodatkowo zawierającej przynajmniej jeden immunogen z przynajmniej jednego dodatkowego patogenu świni, zawierającej wektor wyrażający immunogen lub epitop, np. przynajmniej jeden dodatkowy patogen świni może być wybrany z grupy złożonej z PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, pseudowś cieklizny, cholery świń, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, świńskiej grypy i PPV oraz ich kombinacji. W prowadzeniu sposobu może być wykorzystany wektor, który jest plazmidem wektorowym DNA, bakterią taką jak E. coli, wirusem takim jak bakulowirus, wirusem opryszczki (herpeswirusem) w tym wirusem choroby Aujeszky'ego, adenowirusem w tym adenowirusem świni, wirusem ospy, w tym wirusem krowianki, wirusem ptasiej ospy, wirusem ospy kanarków, wirusem świńskiej ospy i im podobnymi. W sposobie może być wykorzystana kompozycja oparta na wektorze dodatkowo zawierającą przynajmniej jedną sekwencję, fragment lub epitop z przynajmniej jednego dodatkowego patogenu świni, lub wektor wyrażający taką sekwencję, fragment lub epitop, przy czym wektor może również być wektorem wyrażającym sekwencję, fragment lub epitop PCV-2. W prowadzeniu sposobu może być wykorzystany wektor, który zawiera i wyraża ORP wybrany z grupy zł o ż onej z ORF1 do 13, taki jak ORF wybrany z ORF 4, 7, 10 i 13, korzystnie ORF 4 i/lub 13. Sposób też może także być prowadzony z zastosowaniem kompozycji opartej na immunogenie, przy czym jeden lub więcej immunogenów jest wytwarzanych w sposób rekombinowany. W tym sposobie samice i/lub prosiaki są korzystnie szczepione jak to opisano powyżej.
W innym wykonaniu sposobów wytworzenia dowolnej z kompozycji wymienionych uprzednio lub tu ujawnionych będą one obejmowały domieszanie nośnika dopuszczalnego farmaceutycznie lub w weterynarii i ewentualnie adiuwanta i immunogenu PCV-2. Sposób moż e dalej obejmować transfekcję lub zakażenie komórki lub gospodarza zrekombinowanym wektorem, który zawiera DNA kodujący immunogen PCV-2 i wyraża ten immunogen oraz dowolnie oczyszczenie i/lub izolację immunogenu z komórki. Podobnie sposób może obejmować izolację i/lub oczyszczenie immunogenu PCV-2 z PCV-2 lub izolację PCV-2 z próbki.
Ujawnione rozwiązania pozwalają również wytworzyć zestaw umożliwiający wytworzenie dowolnej z kompozycji uprzednio wymienionych lub tu ujawnionych lub przeznaczonej do wykonania dowolnego z uprzednio wymienionych lub tu ujawnionych sposobów obejmujący w pierwszym pojemniku nośnik dopuszczalny farmaceutycznie lub w weterynarii lub podłoże lub zaróbkę i w drugim pojemniku składnik czynny zawierający immunogen PCV-2, przy czym pierwszy i drugi pojemnik mogą być pakowane razem lub osobno. Ponadto zestaw może zawierać instrukcję o sposobie mieszania składników kompozycji i/lub podawania kompozycji.
Każda z kompozycji wymienionej powyżej lub tu ujawnionej może być podawana świniom płci męskiej i/lub żeńskiej w celu zapobiegania przekazywaniu PCV-2 i dla zapobiegania i/lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego powodowanego przez PCV/2 i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego jak i poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego i/lub patologicznych konsekwencji związanych z PCV-2. Podawanie przeprowadza się korzystnie w sposób jak został opisany powyżej. Określenie „obejmujący w tym ujawnieniu może oznaczać „zawierający lub może mieć znaczenie szersze, powszechnie nadawane określeniu „obejmujący w Prawie Patentowym USA.
Świński cirkowirus-2 (PCV-2) jest czynnikiem związanym z poodsadzeniowym wielonarządowym zespołem wyniszczającym (PMWS) w populacjach świń. Jak pokazano w Przykładach 1 i 2, potencjalne spektrum choroby związanej z PCV-2 jest poszerzone przez dowody na przekaz pionowy i zwią zanym z nim niepowodzeniem rozmnaż ania.
W szczególności w przedstawionym Przykładzie 1 pokazano, że PCV-2 został wyizolowany z miotu poronionych prosiąt z gospodarstwa, w którym występowały poronienia w późnej ciąży oraz martwe porody. U jednego prosiaka stwierdzono ostre, rozproszone zapalenie mięśnia sercowego z rozległ ym barwieniem immunohistochemicznym na antygen PCV-2. Zmienne iloś ci antygenu PCV-2 były również obecne w wątrobie, płucach i nerkach wielu płodów. Nie stwierdzono obecności innych czynników, które były łączone z uszkodzeniami płodów i poronieniami u świń w tym parwowirusa świni, wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń, wirus zapalenia mięśni i mózgu i mięśnia sercowego (wirus encephalomyocarditis) i enterowirusa.
PL 205 130 B1
Bardziej szczegółowo Przykład 2 wykazuje, że tkanki uzyskane z 30 wysoce zdrowych stad w okresie czterech lat i badane w rutynowych przypadkach poronień lub niepowodzenia rozmnaż ania były PCV-2 dodatnie w dwóch zgłoszeniach obejmujących kilka martwo urodzonych prosiaków i nieżywotnych noworodków z poważnym rozproszonym zapaleniem mięśnia sercowego, hipertrofią serca i oznakami przewlekłego biernego zastoju krwi. Dwa dodatnie przypadki były z tego samego gospodarstwa, ale wystąpiły w dwóch różnych okresach. Obecność PCV-2 w sercach i innych tkankach dotkniętych prosiąt była potwierdzona za pomocą immunohistochemii i izolacji wirusów. Brak wykrycia cikrowirusów świni w przypadkach niepowodzenia rozmnażania przed 1999 w obszarach zakażeń endemicznych potwierdza pogląd, że choroba reprodukcyjna jest nowym klinicznym przejawem zakażenia PCV-2 i dalej sugeruje, że sposoby transmisji płciowe jak i pionowe są odpowiedzialne za rozprzestrzenianie wirusa w populacji świni.
Tak więc, szczepienie świń np. świń płci żeńskiej takich jak maciory lub loszki kompozycją zawierającą przynajmniej jeden immunogen PCV-2 (np. z przynajmniej jednego szczepu wybranego ze szczepów Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 i 1121) (które to kompozycje mogą również zawierać przynajmniej jeden immunogen z co najmniej jednego innego patogenu świni takiego jak parwowirus świń, przy czym gdy jest stosowany wektor może z niego zachodzić jednoczesna ekspresja zarówno immunogenu PCV-2 i przynajmniej jednego immunogenu, z co najmniej jednego innego patogenu świni np. między innymi immunogenu PPV). Szczepienie w szczególności może być prowadzone w schemacie immunizacji jak opisanym powyżej i może zapobiegać zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniom i/lub zakażeniom wewnątrzmacicznym związanym z PCV-2 jaki poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu i innym patologicznym konsekwencjom związanym z PCV-2.
Zatem w opisanych sposobach i kompozycjach wykorzystany jest immunogen PCV-2 tak, aby zapobiegać zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniom i/lub zakażeniom wewnątrzmacicznym związanym z PCV-2 jak i poodsadzeniowym wielonarządowym zespołem wyniszczającymi innym patologicznym konsekwencjom związanym z PCV-2. Szczególnie korzystny będzie immunogen ze szczepu 1103 i/lub szczepu 1121 do zastosowania w sposobach i kompozycjach wykorzystujących immunogen PCV-2, aby zapobiegać zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniom i/lub zakażeniom wewnątrzmacicznym związanym z circovirusem-2 świni.
W celu wytworzenia kompozycji immunogennej lub szczepionkowej, dla zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażeń wewnątrzmacicznych związanych z PCV-2 jak i poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu i innym patologicznym konsekwencjom związanym z PCV-2 można zastosować dowolny znany szczep lub immunogen PCV-2. W szczególności szczepy te obejmują szczepy Imp1008, Imp1010, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 i 1121, w szczególności, jeśli kompozycja ma być podawana prosiakom takim jak prosiaki od zaszczepionych samic a szczególnie samicom świni, w szczególności samicom w ciąży lub samicom, które będą kryte, korzystnie według schematów szczepień zdefiniowanych powyżej.
Bardziej szczegółowo możliwe jest zastosowanie do formułowania takich kompozycji, które są przeznaczone do zapobiegania lub leczenia zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronień i/lub zakażeń wewnątrzmacicznych związanych z PCV-2 w szczególności, jeśli kompozycja ma być podawana prosiakom takim jak prosiaki od zaszczepionych samic i bardziej szczególnie samicom świni, w szczególności samicom w ciąży lub samicom, które będą kryte; i bardziej szczególnie według schematów szczepień zdefiniowanych powyżej.
Przynajmniej jeden immunogen, z co najmniej jednego innego patogenu świni może być stosowany tak jak w znanych szczepionkach lub kompozycjach immunogennych dla świń lub jak zostało to opisane w WO 98/03658.
Kompozycje do stosowania zgodnie z ujawnieniem wynalazku mogą być wytworzone zgodnie ze standardowymi technikami dobrze znanymi specjalistom w naukach weterynaryjnych lub farmaceutycznych i biorąc pod uwagę takie czynniki jak wiek, płeć, waga, jej stan i konkretne traktowanie danej świni i sposób podania. Kompozycje mogą być podawane same lub mogą być podawane razem lub kolejno z innymi kompozycjami przedstawionymi w opisie wynalazku (np. innymi kompozycjami zawierającymi immunogen PCV-2) lub z innymi kompozycjami profilaktycznymi lub terapeutycznymi (np. innymi kompozycjami immunogennymi lub szczepionkowymi). Tak, więc zapewnione są kompozycje wielowartościowe, lub „koktailowe lub ich kombinacyjne oraz sposoby je wykorzystujące. Pod tym względem należy się odnieść do patentu US Nr 5,843,456 dotyczącego kompozycji przeciw wściekliźnie i kombinacji tych kompozycji i ich zastosowań.
PL 205 130 B1
Opisane kompozycje mogą być stosowane do podawania pozajelitowego lub dośluzówkowego korzystnie drogą śródskórną lub domięśniową. W szczególności dla drogi śródskórnej można zastosować iniekcje z wykorzystaniem wtryskiwacza bezigłowego. Gdy podawanie jest prowadzone drogą dośluzówkową, możliwe jest podawanie drogą doustną, donosową lub dooczną.
W takich kompozycjach immunogen(y) mogą być w mieszaninie z odpowiednim nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką takim jak sterylna woda, sól fizjologiczna, glukoza lub tym podobne, i/lub korzystnie z adiuwantem. Kompozycje mogą być też liofilizowane lub zamrożone. Kompozycje mogą również zawierać dodatkowe substancje takie jak czynniki buforujące pH, adiuwanty, środki konserwujące, zaróbki polimerowe stosowane do dróg śluzówkowych i tym podobne w zależności od drogi podania i pożądanego preparatu.
W celu przygotowania odpowiednich preparatów bez nadmiernego eksperymentowania można się odnieść do standardowych publikacji z tej dziedziny takich jak „Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 17, z 1985 roku. Odpowiednie dawki mogą być także ustalone na podstawie wiadomości podanych na tym tekście oraz w cytowanych w nim dokumentach.
Adiuwanty są substancjami, które wzmagają odpowiedzi immunologiczne na immunogeny. Adiuwanty będą zawierać wodorotlenek glinu i fosforan glinu, saponiny np. Quil A, emulsję woda-w-oleju, emulsję olej-w-wodzie, emulsję woda-w oleju-w wodzie. Emulsja może być oparta w szczególności na bazie płynnego lekkiego oleju parafinowego (typu Farmakopea europejska); oleju izoprenoidowego takiego jak skwalan lub skwalen; oleju będącego wynikiem oligomeryzacji alkenów, w szczególności izobutenu lub decenu; estrów kwasów lub alkoholi z liniową grupą alkilową, bardziej szczególnie olei roślinnych, oleinianu etylu, di(kaprylanu/kaprynianu) glikolu propylenowego, tri(kaprylanu/kaprynianu) glicerolu lub dioleinianu glikolu propylenowego; estrów alkoholi lub kwasów tłuszczowych rozgałęzionych, w szczególności estrów kwasu izostearynowy. Olej jest stosowany w połączeniu z emulgantami, aby wytworzyć emulsję. Emulganty są korzystnie niejonowymi środkami powierzchniowo czynnymi w szczególności estrami sorbitanu, mannidu (np. oleinian anhydromannitolu), glicerolu, poliglicerolu, glikolu polipropylenowego i kwasu olejowego, izostearynowego, kwasu rycynolowego lub hydroksystearynowego, które są ewentualnie etoksylowane i bloki kopolimerów polioksypropylenpolioksyetylen w szczególności Pluronic®, w szczególności L121. Patrz Hunter i wsp., The Theory and Practical Application of Adjuvants (red. Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, str. 51-94 (1995) i Todd i wsp., Vaccine, 15:564-570 (1997).
Przykładowo możliwe jest stosowanie emulsji SPT opisanej na stronie 147 „Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach zredagowany przez M. Powell i M. Newman, Plenum Press, 1995, i emulsji MF59 opisanej na stronie 183 tej samej książki.
Na przykład, szczepionkę zawierającą adiuwant przygotowuje się w sposób następujący: 67% obj./obj. fazy wodnej obejmującej immunogen emulguje się w 2,3% wag./obj. oleinianu anhydromannitolu, 2,6% kwasu olejowego etoksylowanego 11 EO (tlenek etylenu) i 28,1% obj./obj. lekkiego płynnego oleju parafinowego (typ Farmakopea europejska) za pomocą emulgującego turbomiksera.
Alternatywny sposób przygotowania emulsji polega na emulgowaniu za pomocą pasaży przez homogenizator wysokociśnieniowy mieszaniny 5% wag./obj. skwalenu, 2,5% wag./obj. Pluronic® L121, 0,2% wag./obj. estru kwasu olejowego i anhydrosorbitolu etoksylowanego 20 EO, 92,3% obj./obj. fazy wodnej obejmującej immunogen.
Jest też możliwe formułowanie z syntetycznymi polimerami (np. homo- i kopolimery kwasu mlekowego i glikolowego, które są stosowane do produkcji mikrosfer, które kapsułkują immunogeny, (patrz Eldridge i wsp. Mol. Immunol. 28:287-294 (1993) np. biodegradowalne mikrosfery), z cytokinami takimi jak IL-2 i IL-12 (patrz np. Patent US Nr 5,334,379) i GMCSF, korzystnie GMCSF świni (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów; patrz opisy Patentów US 4,999,291 i 5,461,663 jak też między innymi Clark i wsp. Science 1987, 230:1229; Granti wsp., Drugs, 1992, 53:516). Niektóre adiuwanty mogą być wyrażane in vitro z immunogenem/ami i epitopem/ami np. cytokiny, GMCSF (patrz, na przykład, Inumaru i Takamatsu, Immunol. Cell. Biol. 1995, 73:474-76 dotyczący plazmidu kodującego i wyrażającego świński GM-CSF.
Dalszym przykładem adiuwanta jest związek wybrany z polimerów kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej. Korzystnymi związkami adiuwanta są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego, które są usieciowane eterami polialkenylowymi cukrów lub polialkoholi. Te związki są znane pod nazwą karbomerów (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjalista może też odnieść się do US Nr 2 909 462 (włączony jako odnośnik), który opisuje takie polimery akrylowe sieciowane związkiem polihyPL 205 130 B1 droksylowanym zawierającym przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, przy czym atomy wodorów przynajmniej trzech hydroksyli są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne o przynajmniej 2 atomach węgla. Korzystne reszty mają od 2 do 4 atomów węgla, np. grup winylowych, allilowych i innych nienasyconych grup etylenowych. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Szczególnie odpowiednie są produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) i są one usieciowane allilo-sacharozą lub allilopentaerytritolem. Wśród nich można podać Carbopol® 974P, 934P i 971P. Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnych alkenylowych, korzystne są kopolimery EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowe albo usieciowane, przykładowo, usieciowane eterem diwinylowym. W tej kwestii można się odnieść się do J. Fields i wsp. Nature 186:778-780, 4 czerwca 1960.
Z punktu widzenia budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego oraz kopolimery EMA® są tworzone korzystnie z jednostek podstawowych o następującym wzorze:
Ri R2
----C-(CHJ x-C-(CH2) y---COOH COOH w którym:
R1 i R2, które są takie same lub różne reprezentują H lub CH3, x = 0 albo 1, korzystnie x = 1, y = 1 albo 2, przy czym x + y = 2.
Dla kopolimerów EMA®, x = 0, y = 2. Dla karbomerów x = y = 1.
Rozpuszczenie tych polimerów w wodzie daje roztwór kwaśny, który należy zneutralizować korzystnie do fizjologicznego pH, w celu otrzymania roztworu adiuwanta, do którego będzie włączona kompozycja immunogenna, immunologiczna lub szczepionkowa. Grupy karboksylowe polimeru są wówczas częściowo w postaci COO-.
Korzystnie roztwór adiuwanta stosowanego w rozwiązaniach według wynalazku, zwłaszcza karbomeru wytwarza się w wodzie destylowanej, korzystnie w obecności chlorku sodu, przy czym uzyskany roztwór ma kwaśny pH. Roztwór wyjściowy rozcieńcza się przez dodanie go do pożądanej ilości (dla uzyskania pożądanego stężenia końcowego) albo istotnej części tej ilości, wody albo roztworu NaCl, korzystnie roztworu fizjologicznego (NaCl 9 g/l) naraz lub w kilku porcjach z równoczesnym lub późniejszym zobojętnieniem (pH 7,3 do 7,4) korzystnie NaOH. Roztwór ten o fizjologicznym pH będzie stosowany jako taki do mieszania ze szczepionką która może być przechowywana w postaci liofilizowanej, płynnej lub zamrożonej.
Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki będzie od 0,01% do 2% wag./obj., np. 0,06% do 1% wag./obj., tak jak od 0,1 do 0,6% wag./obj..
Z niniejszego ujawnienia oraz dziedziny techniki, specjalista moż e wybrać bez nadmiernego eksperymentowania odpowiedni adiuwant, o ile jest to pożądane oraz jego ilość do stosowania w kompozycji immunologicznej, immunogennej lub szczepionkowej.
Opisane kompozycje immunogenne lub szczepionkowe mogą być związane z przynajmniej jedną żywą atenuowaną, inaktywowaną lub podjednostkową szczepionką (jak np. wirus ospy jako wektor lub plazmid DNA) wyrażającą przynajmniej jeden interesujący immunogen lub epitop z przynajmniej jednego innego patogenu świni.
Kompozycje w postaciach przeznaczonych dla różnych dróg podawania są również przewidywane. Podobnie jak poprzednio zostało to opisane skuteczna dawka oraz droga podania są określane przez znane czynniki takie jak wiek, płeć, waga i inne procedury klasyfikacji, które są znane i nie wymagają nadmiernego eksperymentowania. Dawki każdego składnika czynnego mogą być jak jest przedstawione w zacytowanych dokumentach i/lub mogą mieścić się w zakresie od kilkuset lub kilku tysięcy mikrogramów, np. 1 μg do 1 mg, dla immunogennej lub szczepionkowej kompozycji podjednostkowej; i 104 do 1010 TCID50, korzystnie 106 do 108 TCID50 dla inaktywowanej (miano przed inaktywacją) kompozycji immunogennej lub kompozycji szczepionkowej. Dla żywej atenuowanej kompozycji
PL 205 130 B1 immunogennej lub szczepionkowej dawka może być między 101 do 108 TCID50 korzystnie 103 i 106 TCID50.
Rekombinanty lub wektory mogą być podawane w odpowiednich ilościach, tak, aby uzyskać ekspresję in vivo odpowiadającą dawkom niniejszym opisanym i/lub w cytowanych tu dokumentach. Na przykład, odpowiednie zakresy dla zawiesin wirusowych można określać empirycznie. Opisany wektor wirusowy lub rekombinant może być podawany świni drogą zakażenia lub transfekcji do komórek w ilości około przynajmniej 103 pfu (jednostek tworzących łysinki), korzystnie, około 104 pfu do około 1010 pfu, np. około 105 pfu do około 109 pfu, przykładowo około 106 pfu do około 108 pfu, na dawkę np. około 2 ml. I o ile wyrażany jest więcej niż jeden produkt genu przez więcej niż jeden rekombinant, każdy z rekombinantów może być podawany w takiej ilości; lub każdy rekombinant może być podawany tak, że łącznie w kombinacji da to sumę dla rekombinantów obejmującą wskazane ilości.
W kompozycjach plazmidowych stosowanych w rozwią zaniach wedł ug wynalazku mogą być zastosowane dawki tak jak niniejszym opisano lub jak opisano w cytowanych dokumentach. Na przykład odpowiednie ilości każdego plazmidowego DNA w kompozycjach plazmidowych mogą wynosić od 1 μg do 2 mg, korzystnie 50 μg do 1 mg. Zacytowane dokumenty dotyczące wektorów z plazmidowego DNA mogą być poddane konsultacji przez specjalistę bez nadmiernego eksperymentowania tak, aby ustalić odpowiednie dawki dla kompozycji z wektorów plazmidowych DNA, które mogą być wykorzystane w rozwiązaniach według wynalazku.
Dawka kompozycji oraz stężenie w niej składników jak i czas podawania kompozycji, które wywołują odpowiednią odpowiedź immunologiczną mogą być ustalone za pomocą sposobów takich jak miareczkowanie surowic przeciwciałami np. za pomocą oznaczenia ELISA i/lub seroneutralizacji, i/lub przez ocenę prowokacji przez szczepienie świni. Takie oznaczenia nie wymagają nadmiernego eksperymentowania przy stanie wiedzy dostępnym dla specjalisty, niniejszego ujawnienia i wobec zacytowanych tu dokumentów. Również czas właściwy dla kolejnych podań może być ustalony bez nadmiernego eksperymentowania za pomocą przedstawionych niniejszym sposobów oraz dostępnego ogólnie stanu wiedzy.
Immunogen PCV-2 może być uzyskany z PCV-2 lub może być uzyskany z ekspresji in vitro genu lub genów z rekombinantów, lub ich części lub epitopu (epitopów) PCV-2. Sposoby wytworzenia (i zastosowania) wektorów (lub rekombinantów) dla ekspresji mogą być prowadzone według metod ujawnionych między innymi w następujących patentach lub metod analogicznych: US Nr 4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 5,756,103, 5,766,599, 6,004,777, 5,990,091, 6,033,904, 5,869,312, 5,382,425, publikacje PCT WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018, Paoletti „Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, PNAS USA 93:11349-11353, październik 1996, Moss, „Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination and safety PNAS USA 93:11341-11348, październik 1996, Smith i wsp. Patent USA Nr 4,745,051 (zrekombinowany baculowirus), Richardson CD. (redaktor) Methods in Molecular Biology 39, „Baculovirus Expression Protocols (1995 Humana Press Inc.), Smith i wsp. „Production of Huma Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector, Molecular and Cellular Biology, grudzień, 1983, tom 3, Nr 12, str. 2156-2165; Pennock i wsp. „Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Insect Cells with a Baculovirus vector, Molecular and Cellular Biology marzec 1984, tom 4, nr 3 str. 399-406; EPA 0 370 573, zgłoszenie US nr 920,197 złożone 16 października 1986, Patent EP publikacja nr 265785, Patent USA 4,769,331 (zrekombinowany wirus opryszczki), Roizman „The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors, PNAS USA 93:11307-11312, październik 1996, Andreansky i wsp. „The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors PNAS USA 93:11313-11318, październik 1996, Robertson i wsp. „Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to Blymphocytes, PNAS USA 93:11334-11340, październik 1996, Frolov i wsp. „Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications, PNAS USA 93:11371-11377, październik 1996, Kitson i wsp., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991; Patenty US Nr 5,591,439, 5,552,143, WO 98/00166, zaakceptowane zgłoszenia patentowe US Nr 08/675,556 i 08/675,566 oba złożone 3 lipca 1996 (rekombinowane adenowirusy), Grunhaus i wsp., 1992 Adenoviruses as cloning vectors, Seminars in Virology (tom 3) str. 237-52, 1993, Ballay i wsp. EMBO Journal tom 4, str. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, kwiecień, 1990, Prevec i wsp., J. Gen. Virol. 70, 429-434, PCT W091/11525, Felgner i wsp. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science 259:1745-49, 1993 i McClements i wsp. immunization with
PL 205 130 B1
DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease, PNAS USA 93:11414-11420, październik 1996 i Patenty US Nr 5,591,639, 5,589,466 i 5,580,859 jak i WO-A-90 11092, WO-A-93 19183, WO-A-94 21797, WO-A-95 11307, WO-A-95 20660, Tang i wsp., Nature 356, 152-154, 1992 i Furth i wsp. Analytical Biochemistry, 205, 365-368, 1992, dotyczące wektorów ekspresyjnych DNA, między innymi. Patrz też WO 98/33510; Ju i wsp. Jako referencje patrz również Diabetologia, 41:736-739, 1998 (system ekspresyjny lentiwirusów); Sanford i wsp. Patent USA Nr 4,945,050; Fischbach i wsp. (Intracel), WO 90/01543; Robinson i wsp. seminars in Immunology, tom 9, str. 271-283 (1997) (systemy wektorów DNA); Szoka i wsp. Patent US Nr 4,394,448 (sposób wstawiania DNA do żywych komórek); McCormick i wsp. Patent US Nr 5,677,178 (zastosowanie cytopatycznych wirusów); i Patent US Nr 5,928,913 (wektory do dostarczania genów) jak i w innych dokumentach tu cytowanych. Korzystnie mogą być stosowane wektory wirusowe wybrane z świńskich herpeswirusów, takich jak wirus choroby Aujeszky'ego, adenowirus świni, wirusy ospy, szczególnie wirus krowianki, wirus ospy ptasiej, wirus ospy kanarków, wirus świńskiej ospy jak i wektory DNA (plazmidy DNA).
Produkt ekspresji z genu (genów) PCV-2 lub ich części może być pożyteczny do wytwarzania przeciwciał takich jak przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, które są użyteczne dla celów diagnostycznych. Podobnie produkt(y) ekspresji genu (genów) PCV-2 lub ich części mogą być pożyteczne w zastosowaniach diagnostycznych.
Co więcej, specjalista może określić interesujący epitop w immunogenie PCV-2 lub w immunogenie innego patogenu świni bez nadmiernego eksperymentowania z obecnego ujawnienia i znajomoś ci dziedziny, patrz dla ogólnej informacji dotyczą cej okreś lenia interesują cego epitopu lub epitopowego regionu białka przykładowo między innymi WO 98/40500.
Tak jak przedstawiono korzystne kompozycje immunogenne lub szczepionkowe to przykładowo kompozycje tu wskazane. Przykładowo będzie to kompozycja immunogenna lub szczepionkowa zebrana z hodowli komórek in vitro, która była zakażona oczyszczonym preparatem PCV-2 takim jak oczyszczony preparat świńskiego cirkowirusa wybranego z grupy złożonej z preparatów zdeponowanych w ECACC (European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, UK) pod następującymi numerami referencyjnymi: Nr dostępu V97100219 (szczep Imp. 1008), Nr V97100218 (szczep Imp. 1010) i Nr dostępu V97100217 (szczep Imp.999) zdeponowane 2 października, 1997, Nr dostępu V98011608 (szczep Imp. 1011-48285) i Nr V98011609 (szczep Imp.1011-48121) zdeponowane 16 stycznia 1998, Nr dostępu 00012710 (szczep 1103) i Nr 00012709 (szczep 1121) zdeponowane 2 lutego, 2000 lub kompozycja immunogenna lub szczepionkowa obejmująca cirkowirusa świni wyhodowanego na i wyizolowanego z hodowli komórek in vitro. Komórki te był y zakaż one cirkowirusem ś wini, który może być izolowany z próbki fizjologicznej lub próbki tkanki, szczególnie uszkodzeń, ze świni, u której wystą pił zespół PMWS. Przykł adowo bę dzie to taka kompozycja, która będzie obejmować cirkowirus świni wytwarzany i wyizolowany z linii nerki świni, na przykład, wytwarzany z i wyizolowany z komórek PK/15 wolnych od zanieczyszczenia PCV-1. Lub będzie to kompozycja zawierająca lub przygotowana z ekstraktu lub supernatantu hodowli, zebranego z hodowli komórek in vitro, która była zakażona takim cirkowirusem. Tak więc, świński cirkowirus może być immunogenem. Na przykład, kompozycja szczepionkowa lub immunogenna może obejmować cały atenuowany żywy immungen (np. wirus), korzystnie w nośniku lub rozcieńczalniku dopuszczalnym farmaceutycznie lub w weterynarii i ewentualnie adiuwant dopuszczalny farmaceutycznie lub w weterynarii jak i ewentualnie stabilizator dla liofilizacji. Immunogen (np. wirus) moż e być inaktywowany, a szczepionka lub kompozycja immunogenna może dodatkowo i/lub ewentualnie zawierać nośnik lub rozcieńczalnik dopuszczalny farmaceutycznie lub w weterynarii oraz ewentualnie adiuwant dopuszczalny farmaceutycznie lub w weterynarii. Kompozycja szczepionkowa lub immunogenna może obejmować immunogeny PCV-2 i/lub immunogeny kilku świńskich cirkowirusów (włączając PCV-2 lub kilka szczepów PCV-2 i włączając w to PVC-1) jak i ewentualnie dodatkowe immunogeny z innego patogenu świni np. PRRS, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, E. coli, pseudowścieklizna, świńska cholera, Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, świńska grypa i PPV (patrz też WO-A-00 01409).
W celu wytwarzania preparatów antygenowych cirkowirusa, cirkowirusy mogą być uzyskane po pasażu na komórkach w szczególności na liniach komórkowych np. komórkach PK/15. Stosowane mogą być supernatanty lub ekstrakty z hodowli, ewentualnie oczyszczane za pomocą standardowych
PL 205 130 B1 technik. Co się tyczy atenuowanego PCV, atenuacja może być przeprowadzona standardowymi metodami np. przez pasażowanie na komórkach, korzystnie przez pasaż na komórkach świni, korzystnie liniach komórkowych, szczególnie takich jak komórki PK/15 (przykładowo od 20 do 150 pasaży, szczególnie zalecane jest 40 do 100 pasaży).
Jeśli chodzi o inaktywowaną szczepionkę, PCV z frakcjami, które mogą być obecne jest inaktywowany zgodnie z technikami znanymi specjalistom w dziedzinie. Inaktywacja będzie korzystnie przeprowadzona drogą chemiczną, np. przez eksponowanie antygenu na czynnik chemiczny taki jak formaldehyd (formalina), paraformaldehyd, β-propiolakton lub etylenoimina lub jej pochodne, i/lub przez obróbkę fizyczną. Korzystnym sposobem inaktywacji będzie ekspozycja na czynnik chemiczny, a w szczególności na etlylenoiminę lub na β-propiolakton.
Immunogen w kompozycji immunogennej lub szczepionkowej może być wyrażany z fragmentu DNA zawierającego sekwencję nukleotydową PCV-2 lub jej fragment (korzystnie kodujący przynajmniej jeden epitop) np. wybrany z grupy złożonej z sekwencji określanych przez odnośniki SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4 jak i SEQ ID No:6 i SEQ ID No:7 (Figury 1-4 i 6-7). Immunogen w kompozycji szczepionkowej lub immunogennej może być wyrażany z fragmentu DNA zawierającego ORF wybrany z grupy złożonej z ORF 1 do 13 takich jak ORF 4, 7, 10 i 13, korzystnie ORF 4 i/lub 13 szczepu PCV-2, w szczególności jednego z powyżej zidentyfikowanych szczepów (jak określono w WO-A-99 18214 - patrz też Tabela 1 dalej). Tak, więc immunogen lub jego część taka jak interesujący epitop może być uzyskany przez jego ekspresję in vitro z rekombinanta lub wektora. Immunogen może być dalej oczyszczany i/lub zatężany konwencjonalnymi metodami.
Immunogen w kompozycji szczepionkowej lub immunogennej może być wyrażany in vivo przez wektor ekspresyjny zawierający fragment DNA zawierający sekwencję nukleotydową PCV-2 lub jej fragment (korzystnie kodujący przynajmniej jeden epitop) np. wybrany z grupy złożonej z sekwencji określanych przez odnośniki SEQ ID No:1, SEQ ID No:2, SEQ ID No:3, SEQ ID No:4, SEQ ID No:6 jak i SEQ ID No:6 oraz SEQ ID No:7 (Figury 1-4 i 6-7). Podobnie immunogen w szczepionce lub kompozycji immunogennej lub immunologicznej może być wyrażany in vivo przez wektor ekspresyjny obejmujący fragment DNA zawierający ORF wybrany z grupy złożonej z ORF 1 do 13 takich jak ORF 4, 7, 10 i 13, korzystnie ORF 4 i/lub 13 szczepu PCV-2, w szczególności jednego z powyżej zidentyfikowanych szczepów. Tak, więc szczepionka lub kompozycja immunogenna może obejmować wektor ekspresyjny, który wyraża in vivo immunogen lub jego część np. interesujący epitop.
Wektor ekspresyjny może być między innymi dowolnym odpowiednim wektorem wybranym z plazmidów DNA, bakterii takich jak E. coli, wirusów takich jak bakulowirusy, herpeswirusa (wirus opryszczki) takiego jak wirus choroby Aujeszky'ego, adenowirusa w tym adenowirusa świni, wirus ospy, szczególnie wirusa krowianki, wirus ospy ptasiej, wirusa ospy kanarków i wirusa ospy świń (specjalista może też odnieść się do zgłoszeń amerykańskich Audonnet i wsp. i Bublot i wsp., o numerach odpowiednio 60/138,352 i 60.138,478, oba złożone 10 czerwca 1999, zwłaszcza do szczegółów przedstawionych w opisie zgłoszenia, a w szczególności do przykładów („Szczepionka DNA-PCV i „Szczepionka rekombinowana przeciw cirkowirusom świni oparta na wirusach ospy, które odpowiednio zostały tu załączone i włączone w treść niniejszego opisu).
Przedstawione w wynalazku rozwiązania mogą również wykorzystywać cząsteczki kwasu nukleinowego oraz wektory je zawierające, jak i produkty ich ekspresji, kompozycje obejmujące takie cząsteczki kwasu nukleinowego i/lub wektory i/lub produkty ekspresji jak i sposoby wytwarzania i zastosowania dowolnego lub wszystkich tych wskazanych wykonań. W rozwiązaniach według wynalazku, w szczególności mogą zostać wykorzystane ORF i/lub fragmenty kodujące immunogen lub epitop jak i cząsteczki kwasów nukleinowych szczepów 1103 i/lub 1121, w szczególności ich ORF 4, 7, 10 i 13, korzystnie ORF 4 i/lub 13, i ich fragmenty, jak i wektory obejmujące te cząsteczki kwasu nukleinowego, kompozycje obejmujące te cząsteczki kwasu nukleinowego, wektory lub ich produkty ekspresji, kompozycje obejmujące takie produkty ekspresji, startery lub sondy dla takich cząsteczek kwasu nukleinowego, i zastosowania lub sposoby obejmujące te wykonania np. do detekcji, diagnozowania, oznaczania PCV-2, w celu wywołania odpowiedzi immunogenej lub ochronnej, lub tym podobne.
Jak wspomniano wcześniej, opisane są również przeciwciała, które mogą być wykorzystane w rozwiązaniach opisanych w wynalazku. Takie przeciwciała mogą być przeciwciałami poliklonalnymi lub monoklonalnymi na przykład wytworzonymi na podstawie wymienionego uprzednio cirkowirusa, lub na podstawie polipeptydu kodowanego przez fragment DNA zawierający sekwencję PCV-2, na
PL 205 130 B1 przykład, wybraną z grupy złożonej z SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 6 i 7 (Fig. 1-4 i 6-7) lub na podstawie polipeptydu wyrażanego przez wektor obejmujący sekwencję PCV-2, na przykład, wybraną z grupy złożonej z SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 6 i 7, lub na podstawie polipeptydu wyrażanego przez wektor obejmujący DNA zawierający ORF wybrany z grupy złożonej z ORF 1 do 13. Specjalista może zastosować techniki znane w dziedzinie, aby wywołać przeciwciała i wytworzyć przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne. Przeciwciała i antygeny mogą być stosowane w diagnostyce.
Ujawnienie przedstawione w wynalazku pozwala również wytworzyć sondy łub startery ze szczepów PCV-2 1103 i/lub 1121, które mogą być pożyteczne na przykład w wykrywaniu DNA PCV-2, w szczególności pod kątem występowania zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub zakażenia wewnątrzmacicznego jak i do amplifikacji DNA PCV-2 np. do przygotowania wektora ekspresyjnego. Sondą lub starterem może być dowolny odcinek przynajmniej 8, korzystnie przynajmniej 10, bardziej korzystnie przynajmniej 12, 13, 14 lub 15, takich jak przynajmniej 20, np. przynajmniej 23 lub 25, na przykład przynajmniej 27 lub 30 nukleotydów z genomu PCV-2 lub genów PCV-2, które są unikalne dla PCV-2 i ewentualnie dla tych szczepów lub, które występują w PCV-2 i są przynajmniej konserwowane wśród PCV lub rodziny cirkowirusów. Jeśli chodzi o wybór optymalnej długości starterów oraz sond do PCR lub hybrydyzacji referencje można znaleźć w Kajimura i wsp., GATA 7(4):71-79. (1990). Hybrydyzacja jest korzystnie prowadzona w warunkach o wysokiej ostrości, czyli tak jak określenie „wysoka ostrość byłoby rozumiane przez specjalistów w dziedzinie (patrz, na przykład Sambrook i wsp., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. i Hames i Higgins, red. 1985, Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK). Przez hybrydyzację należy rozumieć zastosowanie dobrze znanych technik, obejmujących, ale nie ograniczonych do, hybrydyzacji metodą Southerna, hybrydyzacji typu Northern, hybrydyzacji in situ i korzystnie hybrydyzacji Southerna z użyciem fragmentów DNA amplifikowanych PCR.
Tak jak sondy lub startery, peptydy, które nie są białkami PCV-2 o pełnej długości mogą również być wykorzystane w rozwiązaniach według wynalazku i mogą być dowolnym odcinkiem przynajmniej 8, korzystnie przynajmniej 10, bardziej korzystnie przynajmniej 12, 13, 14 lub 15, takich jak przynajmniej 20, np. przynajmniej 23 lub 25, przykładowo przynajmniej 27 lub 30 aminokwasów w PCV-2, które są unikalne dla PCV-2 oraz możliwie dla wskazanych szczepów, lub które występują w PCV-2 i są przynajmniej konserwowane wśród PCV lub rodziny cirkowirusów. Alternatywnie lub dodatkowo aminokwasy opisane w wynalazku, które nie są pełnej długości białkami PCV-2 mogą być regionem epitopowym białka PCV-2.
Sekwencje PCV-2 są również ujawnione w Meehan i wsp., 1998 (szczepy Imp.1010; ORF1 nukleotydy 398-1342; ORF2 nukleotydy 1381-314; i odpowiadają odpowiednio ORF4 i ORT13 w terminologii wynalazku (patrz Tabela 1) w zgłoszeniu US Nr serii 09/161,092 z 25 września 1998 oraz COL4 i COL13 w WO-A-9918214). Kilka szczepów PCV-2 i ich sekwencji jest tu ujawnione i zostały one nazwane Imp1008, Imp999, Imp1011-48285, Imp1011-48121, 1103 i 1121. Inne szczepy są ujawnione w A.L. Hamel i wsp. J. Virol. Czerwiec 1998, tom 72, 6:5262-5267 (GenBank AF027217) i w I. Morozov i wsp. J. Clinical Microb. Wrzesień 1998 tom 36, 9:2535-2541, jak i w GenBank jako AF086834, AF086835 i AF086836. Te sekwencje, lub ORF z nich pochodzące, lub ich regiony kodujące antygen lub immunogen lub interesujący epitop też mogą być stosowane w rozwiązaniach według niniejszego wynalazku.
W rozwiązaniach według wynalazku mogą być również wykorzystane sekwencje ekwiwalentne do tutaj wskazanych lub wymienionych jak i w do sekwencji w cytowanych dokumentach, na przykład sekwencje, które są zdolne do hybrydyzacji z sekwencją nukleotydową w warunkach wysokiej ostrości (patrz np. Sambrook i wsp. (1989). Wśród ekwiwalentnych sekwencji można także wymienić fragmenty genów zachowujące immunogenność całkowitej sekwencji np. interesujący epitop.
Homologia między całym genomem PCV typów 1 i 2 wynosi około 75%. Ale w obrębie typu 2 homologia wynosi ogólnie ponad 95%. Tak, więc w wykonaniu rozwiązań według wynalazku możliwe jest zastosowanie dowolnego szczepu PCV-2, co jest równoważne. Stosowane mogą być następujące kryteria, że szczep jest typu 2, np. że homologia na poziomie nukleotydowym całego genomu jest równa lub większa niż 85%, korzystnie 90% lub większa, bardziej korzystnie 95% lub większa, korzystnie 97, 98 lub 99% lub większa, ze szczepami tu ujawnionymi, np. szczepem Imp1010.
PL 205 130 B1
Granice dla ORF-ów szczepu Imp1010 są podane w następującej tabeli 1:
Nazwa Początek Koniec Nić Wielkość ORF (nukleotydy (nt)) Wielkość białka (aminokwasy (aa))
ORF1 103 210 Sensowna 108 nt 35 aa
ORF2 1180 1317 Sensowna 138 nt 45 aa
ORF3 1363 1524 Sensowna 162 nt 53 aa
ORF4 398 1342 Sensowna 945 nt 314 aa
ORF5 900 1079 Sensowna 180 nt 59 aa
ORF6 1254 1334 Sensowna 81 nt 26 aa
ORF7 1018 704 Antysensowna 315 nt 104 aa
ORF8 439 311 Antysensowna 129 nt 42 aa
ORF9 190 101 Antysensowna 90 nt 29 aa
ORF10 912 733 Antysensowna 180 nt 59 aa
ORF11 645 565 Antysensowna 81 nt 26 aa
ORF12 1100 1035 Antysensowna 66 nt 21 aa
ORF13 314 1381 Antysensowna 702 nt 213 aa
Poszczególne ORF są definiowane w odniesieniu do szczepu Imp1010. Możliwe jest również zastosowanie odpowiednich ORF z dowolnego innego szczepu PCV-2 jak i dowolnych szczepów PCV-2 jak zostały tutaj zdefiniowane lub w cytowanych dokumentach. Jest działaniem rutynowym w dziedzinie określenie ORF na podstawie sekwencji genomowej wykorzystując w tym celu standardowe oprogramowanie takie jak MacVector®. Także porównanie genomów ze szczepem 1010 i porównanie z ORF-ami szczepu 1010 pozwala specjaliś cie na ł atwe okreś lenie ORF w genomie innego szczepu (np. tych ujawnionych w WO-A-99 18214 na przykład Imp1008, Imp1011-48121, Imp1011-48285, Imp999 jak i nowych szczepów 1103 i 1121). Stosowanie programów lub prowadzenie porównań nie jest nadmiernym eksperymentowaniem i zapewnia bezpośredni dostęp do tych ORF.
Na przykład odnosząc się do Figur 6 i 7 odpowiednie ORF szczepów 1103 i 1121 są podane w nastę pują cej Tabeli 2:
Nazwa Początek Koniec Nić Wielkość ORF (nukleotydy (nt)) Wielkość białka (aminokwasy (aa))
1 2 3 4 5 6
ORF1 1524 1631 Sensowna 108 nt 35 aa
ORF2 833 970 Sensowna 138 nt 45 aa
ORF3 1016 1177 Sensowna 162 nt 53 aa
ORF4 51 995 Sensowna 945 nt 314aa
ORF5 553 732 Sensowna 180 nt 59 aa
ORF6 907 987 Sensowna 81 nt 26 aa
ORF7 671 354 Antysensowna 315 nt 104 aa
PL 205 130 B1 cd. tabeli 2
1 2 3 4 5 6
ORF8 92 1732 Antysensowna 129 nt 42 aa
ORF9 1611 1522 Antysensowna 90 nt 29 aa
ORF10 565 386 Antysensowna 180 nt 59 aa
ORF11 298 218 Antysensowna 81 nt 26 aa
ORF12 753 688 Antysensowna 66 nt 21 aa
ORF13 1735 1037 Antysensowna 702 nt 213 aa
Także ekwiwalentne i pożyteczne w praktyce wynalazku będą sekwencje nukleotydowe, które nie zmieniają ani funkcjonalności ani specyficzności szczepu (np. szczepu 2) względem rozważanego genu lub kodowanych przez gen polipeptydów. Sekwencje różniące się ze względu na degenerację kodu są oczywiście włączone w ten zakres.
Dla ORF4 homologia pomiędzy PCV-1 i PCV-2 wynosi około 86%, a dla ORF13 homologia między PCV-1 i PCV-2 wynosi około 66%. Tak więc, do ekwiwalentnych sekwencji dla ORF4 użytecznych w zastosowaniach według wynalazku należy zaliczyć te sekwencje, które mają homologię równą lub większą niż 88%, korzystnie 90% lub większą, korzystnie 92% lub 95% lub większą homologię z ORF4 szczepu Imp1010, a dla ORF13, te sekwencje, które mają homologię równą lub większą od 80%, korzystnie 85% lub większą, korzystnie 90% lub 95% lub większą z ORF13 szczepu Imp1010 (Stosując terminologię Tabeli 1).
Odnośnie homologii dotyczącej pozostałych ORF można określić te sekwencje, które pochodzą ze szczepu PCV mającego ORF4 i/lub ORF13, które mają homologię do odpowiedniego ORF szczepu 1010. Dla ORF7, sekwencje, które mogą być wykorzystane w rozwiązaniach według wynalazku obejmują te sekwencje, które mają homologię, która jest korzystnie równa lub większa od 80%, bardziej korzystnie 85% lub większa, korzystnie 90% lub 95% lub większa z ORF7 szczepu Imp1010. Dla ORF10, sekwencje, które mogą być wykorzystane w rozwiązaniach według wynalazku obejmują sekwencje o homologii, która jest korzystnie równa lub większa od 86%, bardziej korzystnie 90% lub większa, korzystnie 95% lub większa do ORF10 szczepu Imp1010 (Stosując terminologię Tabeli 1).
Sekwencje ekwiwalentne dla ORF4 użyteczne w praktyce tego wynalazku będą to te sekwencje, które wykazują homologię, korzystnie równą lub większą od 88%, bardziej korzystnie 90% lub większą, korzystnie 92% lub 95% lub większą z ORF4 szczepu Imp1010. Natomiast dla ORF13 będą to te sekwencje, których homologia jest korzystnie równa lub większa od 80%, bardziej korzystnie 85% lub większa, korzystnie 90% lub 95% lub większa z ORF13 szczepu Imp1010.
ORF4 i ORF13 potencjalnie kodują a białka o przewidywanej masie cząsteczkowej odpowiednio 37,7 kD i 27,8 kD. ORF7 i ORF10 (odpowiadają ORF3 i ORF4 w Meehan i wsp. 1998) potencjalnie kodują białka o przewidywanych masach cząsteczkowych odpowiednio 11,9 i 6,5 kD. Sekwencje tych ORF są dostępne w GenBank AF 055392. Wskazane sekwencje mogą być również włączone do plazmidów i stosowane same lub w kombinacji np. z ORF4 i/lub ORF13.
Inne ORF 1-3 i 5, 6, 8-9, 11-12 ujawnione w powyższej tabeli (COL 1-3 i 5, 6, 8-9, 11-12 w WO-A-9918214) lub ich region(y) kodujące interesujący antygen lub epitop mogą być zastosowane w rozwiązaniach według wynalazku np. same lub w kombinacji lub inaczej ze sobą lub z ORF 4 i/lub 13 lub ich regionami kodującymi antygen(y) lub epitop(y). Podobnie ze względu na homologię można określić, że są ekwiwalentne sekwencje, które pochodzą ze szczepu PCV, którego ORF13 i/lub ORF4 mają homologię jak zdefiniowano powyżej z odpowiadającym ORF szczepu 1010 jak zdefiniowano tu, lub w Meehan i wsp. 1998. Dla ORF7 ekwiwalentna sekwencja ma do niego homologię, która jest korzystnie przykładowo większa lub równa 80%, na przykład 85% lub większa, korzystnie 90% lub 95% lub większa z ORF7 szczepu Imp1010. Natomiast dla ORF10 korzystna ekwiwalentna sekwencja ma homologię, która jest korzystnie na przykład większa lub równa 86%, korzystnie 90% lub więcej, korzystnie większa niż 95% lub większa z ORF10 szczepu Imp1010.
Homologię sekwencji nukleotydowej można ustalić stosując program „Align Myers i Miller, („Optimal Alignments in Linear Space, CABIOS 4, 11-17, 1988, który można uzyskać z NCBI). Alternatywnie albo dodatkowo, termin „homologia lub „identyczność przykładowo w odniesieniu do se18
PL 205 130 B1 kwencji nukleotydowej albo aminokwasowej może wskazywać ilościową miarę homologii między dwoma sekwencjami. Procentową homologię sekwencji można obliczyć jako (Nref - Ndif)*100/Nref, gdzie Ndif jest całkowitą liczbą nie identycznych reszt w dwóch przyrównanych sekwencjach, i w którym Nref jest liczbą reszt w jednej z sekwencji. Stad, sekwencja DNA AGTCAGTC będzie miała podobieństwo sekwencji wynoszące 75% z sekwencją AATCAATC (Nref = 8, Ndif = 2).
Alternatywnie lub dodatkowo, „homologia lub „identyczność w kontekście sekwencji może odnosić się do liczby pozycji o identycznych nukleotydach lub aminokwasach podzielonej przez liczbę nukleotydów lub aminokwasów w krótszej z dwóch sekwencji, w których przyrównanie dwóch sekwencji można ustalić w odniesieniu do algorytmu Wilbur i Lipman (Wilbur i Lipman, 1983 PNAS USA 80:726). Przykładowo stosując okno o rozmiarze 20 nukleotydów, długość słowa jako 4 nukleotydy i karę za przerwę 4 oraz analizę wspomaganą komputerem i interpretację danych sekwencyjnych włączając w nią przyrównanie można wygodnie przeprowadzić stosując handlowo dostępne programy (np. Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Jeśli stwierdza się, że sekwencje RNA są podobne lub posiadają stopień identyczności sekwencji lub homologię z sekwencjami DNA, tymidyna (T) w sekwencji DNA jest rozważana jako równa uracylowi (U) w sekwencji RNA.
Dodatkowo lub alternatywnie podobieństwo lub identyczność lub homologia sekwencji aminokwasowej może być ustalona stosując program BlastP (Altschul i wsp. Nuci. Acids Res. 25, 3389-3402), który jest dostępny w NCBI. Następujące odniesienia dostarczają algorytmów do porównywania względnej identyczności lub homologii reszt aminokwasowych obu białek. Ponadto dodatkowo lub alternatywnie zgodnie z informacjami przedstawionymi w tych odniesieniach można je wykorzystać do ustalenia procentowej homologii lub identyczności: Needleman SB i Wunsch CD „A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins, J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970); Smith TF i Waterman MS, „Comparison of Biosequencers, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981); Smith TF, Waterman MS i Sadler JR, „Statistical characterization of nucleic acid sequence funcitonal domains, Nucleic Acids Res. 11:2205-2220 (1983); Feng DF i Dolittle RF, Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees, J. of Molec. Evol. 25:351-360 (1987); Higgins DG i Sharp PM, „Fast and sensitive multiple sequence alignment on a microcomputer, CABIOS, 5: 151-153 (1989); Thompson JD, Higgins DG i Gibson TJ, „ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acid Res., 22: 4673-480 (1994); i Devereux J, Haberlie P i Smithies O „A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX, Nucl. Acids Res. 12:387-395 (1984).
W rozwiązaniach według wynalazku możliwe jest stosowanie immunogenu PCV-2, albo samego albo w dalszej kombinacji z immunogenem innego patogenu świni, aby wytworzyć opisane kompozycje np. mieszając składniki. Możliwe jest również wytworzenie zestawów, w których składniki są indywidualnie opakowane i ewentualnie pojemniki są opakowane razem w celu ich zmieszania i/lub podania. Zestaw może również ewentualnie zawierać instrukcje opisującą sposób zmieszania i/lub podania.
Rozwiązania zostały opisane ze względu na możliwość podawania samicom świń kompozycji immunogennych lub szczepionkowych zawierających immunogen PCV-2, możliwe jest również podawanie takich kompozycji maciorze lub losze i/lub knurowi, tak jak zostało to opisane. Zarówno matka i potomstwo (np. maciora, loszka) i knur mogą otrzymać opisane w wynalazku kompozycje i/lub mogą być obiektem wykonania wskazanych zastosowań. Zatem, populacjom świń można podawać leki wytworzone z opisanych kompozycji i/lub mogą być one przedmiotem prowadzenia sposobów, w których są one wykorzystywane.
Zastosowane kompozycje immunogenne i szczepionkowe mogą zawierać immunogeny z więcej niż jednego szczepu PCV-2. Na przykład, jest możliwe łączenie immunogenów ze szczepów 1121 i 1103, z jednego lub obu tych szczepów z przynajmniej jednym innym szczepem tu ujawnionym lub dowolną inną ich kombinacją.
Ujawnione są również sposoby pozwalające specjaliście na ocenę skuteczności szczepionek przeciwko PCV-2. Pierwszym sposobem jest test ELISA, również z seroneutralizacją. Drugi sposób to szczepienie, a następnie prowokacja wirulentnym szczepem PCV-2, przykładowo jednym z ujawnio-nych szczepów. Przedstawione dane pozwalają na sprawdzanie immunogenów PCV, w tym immunogenów PCV-1, zdolnych do wywołania odpowiedzi immunogennej lub ochronnej przeciwko PCV-2. Takie immunogeny PCV są wówczas pożyteczne do zapobiegania lub leczenia świń, w szczególności zapalenia mięśnia sercowego i/lub poronienia i/lub wewnątrzmacicznych
PL 205 130 B1 zakażeń związanych z PCV-2 jak i przeciwko PMWS i/lub innym patologicznym konsekwencjom z tym związanym.
Stąd ujawnione są immunogenne lub szczepionkowe kompozycje obejmujące immunogen PCV i zdolne do wywołania odpowiedzi immunogennej lub ochronnej przeciwko PCV-2. Ponadto przedstawione są sposoby immunizacji lub szczepienia z zastosowaniem takich immunogenów, jak i zastosowanie takiego immunogenu do wytwarzania kompozycji immunogennej lub szczepionkowej, jak również zastosowania kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku.
Zgłaszający ponadto stwierdził, że konstrukty plazmidów kodujące i wyrażające immunogeny PCV-2 mogą być stosowane do immunizacji świń przeciwko zespołowi PMWS.
Immunogeny PCV-2 mogą być stosowane w kombinacji z immunogenami PCV-1 tak, aby również immunizować zwierzęta przeciwko PCV-2.
Jest mniej korzystne stosowanie samych immunogenów z PCV-1. Do immunizacji świń mogą być stosowane konstrukty plazmidów kodujące i wyrażające immunogen PCV-1 lub PCV-2, w szczególności obejmujące otwarte ramki odczytu (ORF) 1 i/lub 2 z PCV-1 i ORF 1 i/lub 2 z PVC-2.
Jest oczywiste, że w rozwiązaniach według wynalazku mogą być również wykorzystywane plazmidy kodujące i wyrażające ekwiwalentne sekwencje nukleotydowe to znaczy sekwencje, które nie zmieniają, ani funkcjonalności, ani specyficzności szczepu ze względu na rozważany gen lub polipeptydy kodowane przez ten gen. Będzie to również dotyczyło sekwencji różniących się ze względu na degenerację kodu.
Sekwencje PCV-2 stosowane w przykładach pochodzą z Meehan i wsp. powyżej (nukleotydy ORF1 389-1342; nukleotydy ORF2 1381-314; i odpowiadają odpowiednio ORF4 i ORF13 w US 09/161,092 z 25 września 1998 oraz COL4 i COL13 w WO-A-9918214). Inne sekwencje PCV-2 zostały opublikowane w WO-A-9918214 i są nazwane Imp1008, Imp999, Imp1011-48285 i Imp1011-48121 jak i w A.L. Hamel i wsp. J. Virol., czerwiec 1998, tom 72, 6: 5262-5267 (GenBank AF027217) oraz w I. Morozov i wsp. J. Clinical Microb. wrzesień 1998 tom 36, 9: 2535-2541 jak i GenBank jako AF086834, AF086835 i AF086836, co daje dostęp do ekwiwalentnych sekwencji ORF.
Rozwiązania opisane w wynalazku mogą również wykorzystywać ekwiwalentne sekwencje, w tym znaczeniu, że są one zdolne do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej rozważanego genu w warunkach o wysokiej ostrości. Wśród ekwiwalentnych sekwencji mogą być także wymienione fragmenty genów zachowujące immunogenność całej sekwencji. Inne ORF 1-3 i 5-11 ujawnione w US 09/161,092 z 25 września 1998 (COL 1-3 i 5-12 w WO-A-9918214) w szczególności ORF 7 i 10 mogą być stosowane w warunkach tu opisanych w kombinacjach lub inaczej ze sobą lub z ORF1 i ORF2 jak tu zdefiniowano. Termin plazmid ma w użytym tu znaczeniu obejmować dowolną jednostkę transkrypcyjną DNA w postaci sekwencji polinukleotydowej obejmującej sekwencję PCV, która ma być wyrażana oraz elementy potrzebne do jej ekspresji in vivo. Korzystna jest kolista forma plazmidu, superskręcona, lub inna np. plazmid w formie liniowej.
W opisie wynalazku przedstawione są bardziej szczegółowo plazmidy nazwane pJP109 (zawierający gen ORF2 z PCV-2, figura 1.1), pJP111 (zawierający gen ORF1 z PCV-2, figura 1.2), pJP120 (zawierający gen ORF2 z PCV-1, figura 1.3) i pJP121 (zawierający gen ORF1 z PCV-1, figura 1.4).
Każdy plazmid obejmuje promotor zdolny do zapewnienia w komórkach gospodarza ekspresji genu wstawionego pod jego kontrolą. Będzie to zwykle silny promotor eukariotyczny, taki jak w szczególności wczesny promotor cytomegalowirusa CMV-IE, pochodzenia ludzkiego lub mysiego, lub dowolnie innego pochodzenia takiego jak ze szczura lub świnki morskiej. Bardziej ogólnie promotor jest albo pochodzenia wirusowego albo komórkowego. Jako promotor wirusowy inny niż CMV-IE można wymienić wczesny lub późny promotor wirusa SV40 lub promotor LTR wirusa mięsaka Rousa. Takim promotorem może być również promotor z wirusa, z którego pochodzi gen, na przykład promotor specyficzny dla genu. Jako promotor komórkowy można wymienić promotor genu cytoszkieletu taki jak, na przykład, promotor desminy lub ewentualnie promotor aktyny. Jeżeli kilka genów jest obecnych na tym samym plazmidzie, mogą się znajdować w tej samej jednostce transkrypcji lub w dwóch różnych jednostkach.
Plazmidy mogą też zawierać inne elementy regulujące transkrypcję takie jak na przykład sekwencje stabilizujące typu intron, korzystnie intron II genu β-globiny królika (van Ooyen i wsp. Science 1979, 206: 337-344), sekwencji sygnałowej białka kodowanego przez gen tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA; Montgomery i wsp. Cell. Mol. Biol. 1997, 43: 285-292) i sygnał po20
PL 205 130 B1 liadenylacji (poliA) w szczególności genu bydlęcego hormonu wzrostu (bGH) (US-A-5,122,458) lub genu β-globiny królika.
Opisane są również preparaty immunogenne i szczepionki DNA obejmujące przynajmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający jeden z immunogenów PCV-1 i PCV-2, korzystnie jeden z wymienionych powyżej ORF, a dodatkowo zaróbkę lub rozcieńczalnik dopuszczalny w weterynarii, ewentualnie z dodatkiem dopuszczalnego w weterynarii adiuwanta.
Bardziej szczegółowo opisane zostały immunogenne preparaty i szczepionki zawierające przynajmniej jeden plazmid kodujący i wyrażający jeden z immunogenów PCV-1 lub PCV-2, kompozycje formułowane z adiuwantem, w szczególności kationowym lipidem zawierającym czwartorzędową sól amonową np. korzystnie DMRIE (N-(2-hydroksyetylo)-N,N-dimetylo-2,3-bis-tetradecyloksy)-1-propanoamon; WO-A-9634109), korzystnie połączone z obojętnym lipidem, w szczególności DOPE (dioleilofosfatydyloetanoloaminą), tak aby wytworzyć DMRIE-DOPE. Korzystnie mieszaninę plazmidów z tym adiuwantem przygotowuje się bezpośrednio przed użyciem. Ponadto korzystne jeśli przed podaniem jej zwierzęciu, w przygotowanej mieszaninie umożliwi się wytworzenie kompleksu, przez odstawienie jej na pewien czas, przykładowo na okres od 10 do 60 minut, w szczególności zalecane jest 30 minut.
O ile DOPE jest obecny stosunek molarny DMRIE: DOPE jest korzystnie od 95:5 do 5:95, bardziej korzystnie 1:1.
Stosunek wagowy plazmid:DMRIE lub DMRIE-DOPE może w szczególności mieścić się w zakresie od 50:1 do 1:10, szczególnie od 10:1 do 1:5, a korzystniej od 1:1 do 1:2.
Jako adiuwant można stosować związki adiuwanta wybrane z polimerów kwasu akrylowego lub metakrylowego i kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej. Korzystne są polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego, usieciowane w szczególności eterami polialkenylowymi cukrów lub polialkoholi. Te związki są znane jako karbomer (Pharmeuropa tom 8, nr 2, czerwiec 1996). Specjaliści w dziedzinie mogą się również odnieść do amerykańskiego patentu US-A-2,909,462 (włączonego jako referencje), w którym opisano takie polimery akrylowe usieciowane związkiem polihydroksylowanym zawierającym przynajmniej 3 grupy hydroksylowe, korzystnie nie więcej niż 8, przy czym atomy wodoru przynajmniej trzech grup hydroksowych są zastąpione przez nienasycone reszty alifatyczne o przynajmniej dwóch atomach węgla. Korzystne reszty zawierają 2 do 4 atomów węgla, np. grup winylowych, allilowych i innych nienasycone grup etylenowych. Reszty nienasycone mogą same zawierać inne podstawniki, takie jak metyl. Produkty sprzedawane pod nazwą Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, USA) są szczególnie odpowiednie. Są one usieciowane alillo-sacharozą lub za pomocą allilo-pentaerytiritolem. Wśród nich można wymienić Carbopol® 974P, 934P i 971P.
Wśród kopolimerów bezwodnika maleinowego i pochodnej alkenylowej, korzystne są kopolimery EMA® (Monsanto), które są kopolimerami bezwodnika maleinowego i etylenu, liniowymi lub usieciowanymi, przykładowo usieciowanymi przez eter diwinylowy. W tej kwestii można się odnieść do publikacji J. Fields i wsp., Nature 186 : 778-780, 4 czerwca 1960, włączone tu jako referencje.
Z punktu widzenia budowy polimery kwasu akrylowego lub metakrylowego oraz kopolimery
EMA® są korzystnie utworzone z podstawowych jednostek o następującym wzorze:
Ri R2
----C-(CH2) x-C-(CH2) y
COOH COOH w którym:
-R1 i R2, które są takie same lub różne, oznaczają H lub CH3
- x = 0 albo 1, korzystnie x = 1
- y = 1 albo 2, przy czym x + y = 2.
Dla kopolimerów EMA® x = 0 i y = 2. Dla karbomerów x = y = 1.
PL 205 130 B1
Rozpuszczanie tych polimerów w wodzie daje roztwór kwaśny, który należy zneutralizować, korzystnie do pH fizjologicznego, w celu otrzymania roztworu adiuwanta, do którego włączona będzie szczepionka właściwa. Grupy karboksylowe polimeru są wówczas częściowo w postaci COO-.
Dla tego typu adiuwanta jest korzystne przygotowanie roztworu adiuwanta, w szczególności karbomeru w wodzie destylowanej, korzystnie w obecności chlorku sodu. Otrzymany roztwór ma kwaśny pH. Taki roztwór wyjściowy rozcieńcza się dodając go do pożądanej ilości (dla uzyskania odpowiedniego stężenia końcowego) lub istotnej części tej ilości, do wody z dodatkiem NaCl, korzystnie soli fizjologicznej (NaCl 9 g/l) w całości albo partiami z równoczesnym lub późniejszym zobojętnianiem (pH 7,3 do 7,4), korzystnie przy użyciu NaOH. Roztwór ten o fizjologicznym pH stosuje się jako taki do mieszania ze plazmidem, w szczególności przechowywanym w postaci liofilizowanej, ciekłej albo zamrożonej.
Stężenie polimeru w końcowej kompozycji szczepionki będzie wynosiło od 0,01% do 2% wag./obj., bardziej szczególnie 0,06 do 1% wag./obj., korzystniej od 0,1 do 0,6% wag./obj.
W specyficznym wykonaniu preparat immunogenny lub szczepionka zawiera plazmid lub mieszaninę plazmidów kodujących i wyrażających ORF1 i ORF2 z PCV-2.
Możliwe są również prowadzenie kombinowanego szczepienia przeciwko cirkowirusom świń ze szczepieniem przeciwko innym patogenom świń w szczególności tym, które mogą być związane z zespołem PMWS.
Rozwiązania takie będą dotyczyły mieszanin plazmidów zawierających przynajmniej jeden ujawniony tu plazmid i przynajmniej jeden inny plazmid kodujący i wyrażający świński immunogen wybrany, na przykład, z grupy złożonej z glikoprotein gB i gD, wirusa choroby Aujeszky'ego (wirus pseudowścieklizny lub PRV), hemaglutyniny i nukleoproteiny wirusa świńskiej grypy HIN1, hemaglutyniny i nukleoproteiny wirusa świńskiej grypy H3N2, genów ORF5 i ORF3 wirusa PRRS szczepów Lelystad i USA, białka VP2 parwowirusa świń, białek E1 i E2 wirusa świńskiej cholery (HCV), wydeletowanych genów apxl, apxll i apxIII z Actinobacillus pleuropenumoniae (plazmidy patrz na przykład WOA-9803658).
Te mieszaniny plazmidów są podnoszone w nośniku lub rozpuszczalniku dopuszczalnym w weterynarii, ewentualnie dodatkowo z dowolnym dopuszczalnym w weterynarii adiuwantem jak opisano powyżej, w ten sposób tworząc preparaty immungenne lub wielowartościowe szczepionki DNA. Te preparaty lub wielowartościowe szczepionki mogą być szczególnie korzystnie fomułowane z DMRIE, i korzystnie łączone z obojętnym lipidem, np. DOPE aby wytworzyć DMRIE-DOPE.
Preparaty lub jednowartościowe lub wielowartościowe szczepionki DNA według wynalazku formułowane lub nie z adiuwantem jak opisano powyżej, mogą być również korzystnie uzupełnione cytokiną, korzystnie pochodzącą ze świń, korzystnie GM-CSF świń. Dodanie GM-CSF świń (czynnik stymulujący kolonie granulocytów i makrofagów; Clark S.C. i wsp. Science 1987, 230: 1229; Grant S.M. i wsp. Drugs, 1992, 53:516) może być przeprowadzone przez włączenie do szczepionki lub preparatu albo białka świńskiej GM-CSF albo plazmidu kodującego i wyrażającego gen dla GM-CSF świń (Inumaru D. i Takamatsu H. Immunol. Cell. Biol. 1995, 73: 474-476). Korzystnie gen GM-CSF świni jest wstawiony do plazmidu innego od tych kodujących immunogeny PCV lub inne świńskie immunogeny.
W szczególności plazmidem kodującym i wyrażającym świńską GM-CSF może być plazmid pJP058 (Figura 1.5).
Immunogenne preparaty i jedno wartościowe lub wielowartościowe szczepionki DNA mogą być formułowane z przynajmniej jedną konwencjonalną szczepionką (atenuowaną żywą, inaktywowaną lub podjednostkową) lub rekombinowaną szczepionką (wektor wirusowy) skierowaną przeciw przynajmniej jednemu patogenowi świni, przy czym patogenem, przeciwko któremu kierowana jest szczepionka jest ten sam lub inny patogen. Możliwe są również kombinacje z zawierającymi adiuwant konwencjonalnymi szczepionkami (atenuowane żywe, inaktywowane lub podjednostkowe). Z szczepionek inaktywowanych lub podjednostkowych można wymienić te, zawierające w szczególności żel glinowy, sam lub zmieszany z saponiną jako adiuwantem, lub te formułowane w postaci emulsji olej-w-wodzie.
Rozwiązania według wynalazku pozwalają na prowadzenie sposobu immunizacji, który umożliwia indukcję odpowiedzi immunologicznej u świń w stosunku do cirkowirusów. W szczególności możliwe jest przeprowadzenie sposobu szczepienia, który jest skuteczny u świń. Sposoby immunizacji lub szczepienia będą obejmować podanie jednego z preparatów lub jednej z jednowartościowych lub wielowartościowych szczepionek DNA jak opisano powyżej. Te sposoby immunizacji i szczepienia obejmują podanie jednej lub większej liczby kolejnych dawek preparatu lub szczepionki DNA. Prepa22
PL 205 130 B1 raty i szczepionki DNA mogą być podane w ramach tego sposobu immunizacji lub szczepienia za pomocą różnych dróg podawania przedstawionych w stanie techniki dla szczepień polinukleotydami. W szczególności będą one podawane drogą domięśniową i śródskórną za pomocą znanych technik podawania, w szczególności strzykawką zaopatrzoną w igłę, strumieniem cieczy (Furth i wsp. Analytical Bioch, 1992, 205: 365-368) lub przez strzelanie cząsteczkami złota powleczonymi DNA (Tang i wsp. Nature, 1992, 356: 152-154).
Ten sposób nie tylko pozwala na podawanie dorosłym świniom, ale także młodym i ciężarnym samicom, w tym ostatnim przypadku umożliwia to w szczególności nadanie biernej odporności noworodkom (przez przeciwciała matczyne).
Ilość DNA stosowana w opisanych szczepionkach mieści się w zakresie około 10 μg i około 2000 μg, a korzystnie między około 50 μg i około 1000 μg. Specjaliści będą posiadać niezbędne kompetencje, by dokładnie określić skuteczną dawkę DNA do zastosowania w każdym protokole immunizacji lub szczepienia.
Objętości dawki mogą wynosić między 0,5 i 5 ml, a korzystnie między 2 i 3 ml.
Korzystny sposób immunizacji lub szczepienia polega na podawaniu szczepionek DNA drogą domięśniową.
Ponadto opisane zostały tutaj antygenowe, immunologiczne lub szczepionkowe kompozycje lub kompozycje terapeutyczne przeznaczone do indukcji odpowiedzi antygenowej lub immunologicznej u zwierzęcia gospodarza zaszczepionego kompozycją. Taka szczepionka zawiera nośnik i zmodyfikowany zrekombinowany wirus, w którym inaktywowano nieistotne kodowane przez niego funkcje genetyczne, co prowadzi do tego, że rekombinowany wirus posiada osłabioną wirulencję i wzmocnione bezpieczeństwo. Wirus wykorzystywany w takich kompozycjach będzie w szczególności wirusem ospy, zwłaszcza wirusem krowianki lub wirusem ospy ptasiej takim jak wirus ospy drobiu lub wirus ospy kanarków, a bardziej korzystnie ALVAC. Modyfikowany rekombinowany wirus może zawierać np. w obrębie nieistotnego obszaru genomu wirusa, heterologiczną sekwencję DNA kodującą białko antygenowe, np. pochodzące z ORF PCV2, np. ORF1 i/lub 2 PCV2.
Opisano również immunogenne kompozycje zawierające rekombinowane wirusy posiadające inaktywowane nieistotne, kodowane przez wirusa funkcje genetyczne takie, że rekombinowany wirus będzie posiadał osłabioną wirulencję i wzmocnione bezpieczeństwo. Modyfikowany, rekombinowany wirus zawiera np. w obrębie nieistotnego obszaru genomu wirusa, heterologiczną sekwencję DNA kodującą białko antygenowe (np. pochodzące z ORF PCV2, np. ORF1 i/lub 2 PCV2), przy czym kompozycja, po podaniu gospodarzowi będzie zdolna do indukowania odpowiedzi immunologicznej specyficznej względem antygenu.
Opisane są również modyfikowane rekombinowane wirusy, w których nieistotne kodowane przez wirusa funkcje genetyczne zostały inaktywowane tak, że wirus posiada osłabioną wirulencję. Taki modyfikowany rekombinowany wirus ponadto zawiera heterologiczny DNA, np. w nieistotnym obszarze genomu wirusa. DNA może kodować geny PCV2 takie jak jakikolwiek lub wszystkie z ORF1, ORF2, ORF3, ORF4 z PCV2 (Meeham i wsp., 1998). Funkcje genetyczne można inaktywować przez usunięcie otwartej ramki odczytu kodującej czynnik wirulencji lub przez wykorzystanie wirusów o naturalnym ograniczeniu względem gospodarza.
Takim wirusem będzie korzystnie wirus ospy, szczególnie wirus ospy krowianki lub wirus ospy ptaków taki jak wirus ospy drobiu lub wirus ospy kanarków. Korzystnie otwarta ramka odczytu jest wybrana z grupy złożonej z J2R, B13R + B14R, A26L. A56R, C7L-K1L i 14L (według terminologii podanej w Goebel i wsp., 1990) i ich kombinacji. Zgodnie z tym otwarta ramka odczytu obejmuje gen kinazy tymidynowej, gen obszaru krwotocznego, obszar ciałek inkluzyjnych typu A, gen hemaglutyniny, obszar genów specyficzności względem gospodarza lub dużą podjednostkę reduktazy rybonukleotydów, albo ich kombinację. Odpowiedni zmodyfikowany kopenhaski szczep wirusa krowianki określany jest jako NYVAC (Tartaglia i wsp., 1992) lub wirus krowianki, z którego wydeletowano J2R, B13R + B14R, A26L, A56R, C7L-K1L i 14L lub gen kinazy tymidyny, gen obszaru krwotocznego, obszar ciałek inkluzyjnych typu A, gen hemaglutyniny, obszar genów specyficzności względem gospodarza lub dużą podjednostkę reduktazy rybonukleotydów (patrz też Patent US Nr 5,364,773). Korzystnym wirusem ospy jest ALVAC albo wirus ospy kanarków (szczep szczepionkowy Rentschler), który był atenuowany, na przykład przez ponad 200 seryjnych pasaży na fibroblastach zarodka kurzego i który to tak uzyskany wzorcowy posiew poddano czterem następującym po sobie oczyszczaniom łysinek pod agarem. Oczyszczone klony łysinek namnażano następnie przez pięć kolejnych pasaży.
PL 205 130 B1
Rozwiązania według wynalazku mogą również odnosić się do produktów ekspresji wytworzonych z rekombinowanych wirusów ospy i ich zastosowań tak, aby stworzyć kompozycje antygenowe, immunologiczne lub szczepionkowe do leczenia, zapobiegania diagnostyki lub testowania. Ponadto DNA z rekombinowanego wirusa ospy może być wykorzystane do konstruowania sond do DNA jak i starterów do reakcji PCR.
Taki rekombinowny wirus ospy zawierający sekwencję DNA z PCV2 w nieistotnym obszarze genomu wirusa ospy. Wirus ospy jest korzystnie wirusem ptasiej ospy, takim jak wirus ospy drobiu, szczególnie atenuowanym wirusem ospy drobiu, lub wirusem ospy kanarków, szczególnie atenuowanym wirusem ospy kanarków, takim jak ALVAC.
Taki zrekombinowany wirus ospy wyraża produkty obcego genu PCV2. Specyficzne ORF PCV2 są wstawiane do wirusa ospy, a uzyskany zrekombinowany wirus wykorzystuje się do zakażania zwierzęcia. Ekspresja produktów genu PCV2 w zwierzęciu prowadzi do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia na PCV2. Dlatego rekombinowany wirus ospy opisany w niniejszym wynalazku można wykorzystać w kompozycji immunologicznej lub szczepionce, tak aby dostarczyć środków do indukcji odpowiedzi immunologicznej, która może, ale nie musi, być ochronna.
Procedura podawania rekombinowanego wirusa ospy-PCV2 albo ekspresja jego produktu, w kompozycjach takich jak kompozycje immunologiczne, antygenowe lub szczepionkowe albo kompozycjach terapeutycznych może być prowadzona drogą pozajelitową (doskórnie, domięśniowo, podskórnie). Takie podawanie umożliwia wytworzenie układowej odpowiedzi immunologicznej, albo humoralnej albo komórkowej.
Bardziej ogólnie rekombinowane wirusy PCV2, kompozycje wirusa ospy -PCV2 antygenowe, immunogenne lub szczepionkowe, albo kompozycje terapeutyczne można przygotować zgodnie ze standardowymi technikami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie farmacji lub weterynarii. Takie kompozycje mogą być podawane w dawkach i technikami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie medycyny lub weterynarii z uwzględnieniem takich czynników jak wiek, płeć, waga, gatunek i stan konkretnego pacjenta oraz drogi podania. Kompozycje mogą być podawane same lub mogą być podawane razem lub kolejno z kompozycjami np. z „innymi kompozycjami immunologicznymi, antygenowymi lub szczepionkowymi lub terapeutycznymi w ten sposób dając kompozycje wielowartościowe, lub „koktailowe albo kombinowane kompozycje opisane w wynalazku, oraz sposoby ich zastosowania. Ponownie składniki i sposób podawania (podawanie kolejno lub razem) jak i dawki mogą być ustalone uwzględniając takie czynniki jak wiek, płeć, waga, gatunek i stan konkretnego pacjenta oraz drogę podania. W tym względzie referencje dotyczą patentu U.S. nr 5 843 456, niniejszym włączonego jako odniesienie i dotyczą kompozycji przeciw wściekliźnie i kombinacji kompozycji oraz ich zastosowań. Przykłady takich kompozycji obejmują preparaty płynne do podawania dootworowego np. ustnego, nosowego, doodbytniczego, dopochwowego, doustnego, dożołądkowego itd., podawane jako roztwory, syropy albo eliksiry; oraz preparaty do podawania pozajelitowego, podskórnego, doskórnego, domięśniowego lub dożylnego (np. podawanie przez wstrzykiwane), takie jak sterylne roztwory lub emulsje. W takich kompozycjach rekombinowane wirusy ospy albo antygeny mogą być domieszkowane odpowiednim nośnikiem, rozcieńczalnikiem lub zaróbką taką jak sterylna woda, sól fizjologiczna, glukoza lub podobne. Kompozycje mogą także być liofilizowane. Kompozycje mogą zawierać substancje pomocnicze takie jak czynniki zwilżające lub emulgujące, czynniki buforujące pH, adiuwanty, dodatki wzmacniające żelatynowanie lub lepkość, konserwanty, czynniki smakowe, barwniki i podobne zależnie od drogi podawania i pożądanego preparatu. W celu przygotowania odpowiednich preparatów, bez niepotrzebnych eksperymentów, odpowiednie do tego wskazówki znajdują się w typowej publikacji takiej jak „Remington's Pharmaceutical Science, wydanie 17, 1985 niniejszym włączonej jako odniesienie. Odpowiednie dawki można również wyznaczyć na podstawie poniższych przykładów.
Kompozycje mogą zawierać przynajmniej jeden składnik adiuwantowy jak zostało to opisane powyżej.
Kompozycje immunologiczne mogą być związane z przynajmniej jedną żywą atenuowaną, inaktywowaną lub podjednostkową szczepionką lub rekombinowaną szczepionką (przykładowo wirusem ospy jako wektorem lub plazmidem DNA) wyrażającą przynajmniej jeden immunogen z przynajmniej jednego innego patogenu świni.
Opisane rozwiązania dotyczą również zrekombinowanych wirusów ospy zawierających sekwencję DNA z PCV2 w regionie, który nie jest konieczny dla genomu wirusów ospy. Zrekombinowane wirusy ospy wyrażają produkty z obcego genu PCV2. W szczególności, wyizolowano dwa geny,
PL 205 130 B1
ORF1 i ORF2, kodujące białka PCV2, scharakteryzowano je i wprowadzono do rekombinantów ALVAC (wektor oparty na wirusie ospy kanarków). Zastosowane techniki biologii molekularnej opisane są w Sambrook i wsp. (1989).
Linie komórkowe i szczepy wirusowe. Szczep PCV2 oznaczony jako Imp.1010-Stoon opisano wcześniej (Meehan i wsp., 1998). Szczep ten został wyizolowany z tkanek krezkowych węzłów chłonnych chorej świni pochodzącej z Kanady. Klonowanie genomu PCV2 opisano w Meehan i wsp. (1998). Plazmid pGem7Z-Imp.1010-Stoon-EcoRI nr 14 zawiera genom PCV2 jako fragment EcoRI wprowadzony w miejsce EcoRI plazmidu pGem-7Z (Promega, Madison, WI). Całkowita sekwencja nukleotydowa szczepu Imp.1010-Stoon PCV2 została ustalona w Meehan i wsp. (1998) i jest dostępna w bazie danych GenBank pod numerem dostępu AF055392.
Wyjściowy szczep wirusa ospy kanarków (szczep Rentschler) jest szczepem szczepionkowym dla kanarków. Szczep szczepionkowy uzyskano z dzikiego izolatu i osłabiano/atenuowano przez ponad 200 seryjnych pasaży na fibroblastach zarodka kurzego. Wzorcowy posiew wirusa poddano czterem następującym po sobie izolacjom z łysinek pod agarem i jeden klon z łysinki namnażano przez pięć kolejnych pasaży, po których zapas wirusa używano jako wyjściowego wirusa w testach rekombinacji in vitro. Izolat wirusa ospy kanarków oczyszczony przez łysinki oznaczono jako ALVAC. ALVAC został zdeponowany 14 listopada 1996 zgodnie z warunkami Traktatu Budapesztańskiego w American Type Culture Collection pod numerem dostępu ATCC VR-2547.
Wytwarzanie rekombinantów wirusów ospy obejmuje różne etapy: (1) konstrukcja plazmidu insercyjnego zawierającego sekwencje („ramiona) otaczające locus insercyjne w genomie wirusa ospy oraz miejsce do wielokrotnego klonowania (polilinker) (MCS) zlokalizowane pomiędzy dwoma otaczającymi ramionami (np. patrz przykład 2.1); (2) konstrukcja plazmidów dawców składających się z plazmidu insercyjnego, do którego w miejsce MCS wstawiono kasetę ekspresyjną dla obcego genu (np. patrz przykłady 2.2 do 2.5); (3) rekombinacja in vitro w hodowli komórkowej między ramionami plazmidu dawcy i genomem wyjściowego wirusa ospy pozwalająca na wstawienie kasety ekspresyjnej dla obcego genu w odpowiednie locus genomu wirusa ospy, i oczyszczanie przez łysinki rekombinowanych wirusów (np. patrz przykład 2.6). Rekombinowane immunogeny PCV2 można stosować w połączeniu z immunogenami PCV2 do immunizacji zwierząt przeciw PMWS. W najmniej korzystnym podejściu, immunogeny PCV1 można stosować bez immunogenów PCV2.
Wynalazek będzie obecnie poniżej opisany bardziej szczegółowo za pomocą nieograniczających przykładowych wykonań z odniesieniem do rysunku, na których:
Figura 1 przedstawia SEQ ID No:1, sekwencję DNA PCV genomu szczepu Imp 1011-48121.
Figura 2 przedstawia SEQ ID No:2, sekwencję DNA genomu szczepu Imp 1011-48285.
Figura 3 przedstawia SEQ ID No:3, sekwencję DNA genomu szczepu Imp 999.
Figura 4 przedstawia SEQ ID No:4, sekwencję DNA genomu szczepu Imp 1010.
Figura 5 przedstawia SEQ ID No:5, sekwencję DNA genomu szczepu PK715.
Figura 6 przedstawia SEQ ID No:6, sekwencję DNA genomu szczepu 1103, wyizolowanego w Alberta, Kanada., k oznacza g(G) lub t(T), y oznacza c(C) lub t(T). Te warianty sekwencji obserwowano w populacji wirusów.
Figura 7 przedstawia SEQ ID No:7, sekwencję DNA genomu szczepu 1121 wyizolowanego w Saskatoon, Kanada.
Figura. 1.1 przedstawia plazmid pJP109.
Figura 1.2 przedstawia plazmid pJP111.
Figura 1.3 przedstawia plazmid pJP120.
Figura 1.4 przedstawia plazmid pJP121.
Figura 1.5 przedstawia plazmid pJP058.
Figura 2.1 (2.1. A do C) (SEQ ID NO: 16) przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu DNA ALVAC o wielkości 3,7 kb, zawierającego otwartą ramkę odczytu C6.
Figura 2.2 przedstawia mapę plazmidu donorowego pJP102.
Figura 2.3 (SEQ ID NO: 8) przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu o wielkości 2,5 kb z plazmidu donorowego pJP102, od miejsca restrykcyjnego KpnI (pozycja 653) do pozycji 1680.
Figura 2.4 przedstawia mapę plazmidu donorowego pJP105.
Figura 2.5 przedstawia mapę plazmidu donorowego pJP107.
Figura 2.6 (2.6 A do C) (SEQ ID NO: 11) przedstawia sekwencję nukleotydową fragmentu o wielkości 3,6 kb z plazmidu donorowego pJP107, od miejsca restrykcyjnego KpnI (pozycja 653) do miejsca restrykcyjnego SacI (pozycja 4255).
PL 205 130 B1
Wynalazek będzie dalej opisany za pomocą następujących przykładów oraz wyników, dostarczonych jedynie w celu zobrazowania wykonań wynalazku i nie mających być uważane za jakiekolwiek jego ograniczenie.
P r z y k ł a d y i w y n i k i
P r z y k ł a d/w y n i k 1 Zapalenie mięśnia sercowego, poronienia i zakażenie wewnątrzmaciczne związane z PCV-2
Późne poronienia i prosienia z zarówno martwo urodzonymi i zmumifikowanymi prosiakami wystąpiły w nowej hodowli dla 450 samic świń, w okresie wprowadzenia jej do produkcji. U kilku loch obserwowano także ciążę rzekomą. Przed rozmnażaniem lochy otrzymały dwie dawki inaktywowanej szczepionki zawierającej parwowirus i immunogeny leptospirum.
Otrzymany do badania pośmiertnego miot składał się z 9 płodów, które obumarły w różnych stadiach ciąży. Były 2 zmumifikowane, 2 zmacerowane, 3 autolizowane i 2 świeże martwo urodzone świnie. Przy całkowitej obserwacji patologicznej zauważono uszkodzenia tylko w jednym częściowo autolizowanym płodzie. U tego płodu obie komory serca były rozszerzone, wątroba była powiększona i sztywna i wystąpiły zarówno puchlina opłucnej jak i wodobrzusze. Histopatologicznie obserwowano rozległe obszary degeneracji mięśnia sercowego lub nekrozy z obrzękiem i łagodnym zwłóknieniem oraz rozproszonym umiarkowanym naciekiem limfocytów i makrofagów. Wystąpiło wyraźne uogólnione przekrwienie wątroby i utrata komórek wątroby. Śledziona i nerki także były przekrwione. Nie wykryto znacznych uszkodzeń histologicznych u pozostałych płodów.
Immunohistochemiczne barwienie na PCV-2 przeprowadzono jak opisano uprzednio na skrawkach utrwalonych w formalinie rutynowo obrabianych i zatapianych tkanek stosując poliklonalną surowicę królika i monoklonalne przeciwciało, które uzyskano przeciw PCV-2 (Ellis i wsp., 1998; Ellis i wsp., 1999). U płodu z rozszerzoną kardiomiopatią wystąpiło rozległe barwienie dla antygenu PCV-2 w całym dotkniętym mięśniu serca. Barwienie było najbardziej rozległe w obszarach nekrozy i wydawało się przede wszystkim dotyczyć miocytów. Wystąpiło zarówno barwienie cytoplazmy jak i jąder. U wielu płodów widoczne było rozległe barwienie w wątrobie. W niektórych skrawkach wydawało się obejmować przede wszystkim nabłonek sinusoidalny i komórki Kupfera, podczas gdy u innych płodów, w tym w płodzie z zapaleniem mięśnia sercowego, wystąpiło też barwienie jądrowe i cytoplazmatyczne hepatocytów. Dodatnio barwione komórki były rozproszone w płucu i wieloogniskowo w nerce. Reakcję łańcuchową polimerazy dla PCV-2 przeprowadzono jak opisano uprzednio stosując zamarzniętą tkankę (Ellis i wsp. 1999). Produkt PCR o wielkości oczekiwanej dla PCV-2 zamplifikowano z tkanki płodowej. PCV-2 izolowano z płodu z zapaleniem mięśnia sercowego i puli tkanki od innych płodów w miocie przez zaszczepianie homogenatów tkankowych na komórkach PK-15 wolnych od PCV.
Tkanki płodowe były badane również pod kątem występowania innych patogenów wirusowych, które były kojarzone z uszkodzeniami płodów i poronieniami u świń, włączając w to parwowirus świń (PPV), wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV), wirus zapalenia mózgu i mięśnia sercowego (EMCV) i enterowirusy. Nie wykryto antygenu PPV za pomocą testowania fluorescencyjnym przeciwciałem (FAT) na zamrożonych skrawkach płuca, wątroby i śledziony z zmumifikowanych i martwo urodzonych płodów. Homogenaty wątroby, płuc i śledziony z poronionych płodów również zaszczepiono do hodowli wolnych od PCV komórek PK-15, pierwotnych świńskich komórek jajowodu i komórek Vero. Nie wykryto wirusów cytopatycznych po trzech pasażach. Tkanki były negatywne dla PPV przy zastosowaniu PCR. Nie wykryto antygenu PRRSV przy pomocy barwienia immunohistochemicznego.
Stąd obecne uszkodzenia płodów i poronienia były bezpośrednio związane z PCV-2. Uzyskane wyniki wskazują również na pionowe przenoszenie wirusa.
W poprzednich badaniach PCV-1 wyizolowano u 2 ze 160 zbadanych płodów świń sugerując, że ta grupa wirusów może być przenoszona pionowo, jednak nie wykryto związku antygenu PCV-1 z jakimikolwiek uszkodzeniami w tkance (Allan i wsp., 1995). Wykluczenie innych czynników, które były związane z uszkodzeniami płodów i poronieniami u świń, w tym PPV (Boit i wsp., 1997; Molitor i wsp., 1991), PRRSV (Lager i wsp., 1996), EMCV (Kim i wsp., 1989) i enterowirusa (Molitor i wsp., 1991) wskazują, że PCV-2 może powodować znaczną patologię płodu i następnie poronienia.
Jednak immunogeny PCV-1 (zgodnie z ogólnymi definicjami podanymi na początku) mogą wywołać odpowiedź immunogenną lub ochronną przeciwko zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniom i /lub zakażeniom wewnątrzmacicznym jak i poodsadzeniowemu wielonarządowemu
PL 205 130 B1 zespołowi wyniszczającemu. Stąd immunogeny PCV-1 mogą być stosowane w praktyce niniejszego wynalazku (np. w sposobach, kompozycjach, zastosowaniach itd.) albo same albo w połączeniu z immuno-genami PCV-2 (wektor może zawierać i wyrażać DNA kodujący zarówno immunogen i/lub epitop PCV-1 i immunogen i/lub epitop PCV-2) i/lub same lub w połączeniu z immunogenem i/lub epitopem innego patogenu świni (jeśli jest stosowany wektor, wektor może zawierać i wyrażać DNA kodujący zarówno immunogen i/lub epitop PCV-1 i immunogen i/lub epitop innego patogenu świni, lub immunogen i/lub epitop PCV-1 i immunogen i/lub epitop PCV-2 i immunogen i/lub epitop innego patogenu świni). Tak, więc specjalista może alternatywnie lub dodatkowo stosować immunogen i/lub epitop PCV-1 i/lub wektor kodujący taki immunogen i/lub epitop w opisanych rozwiązaniach bez nadmiernego eksperymentowania. Aby to wykonać wystarczy zapoznać się z przestawionymi tu wskazówkami oraz wnioskami płynącymi z niniejszych przykładów i podstawić PCV-1 w miejsce „PCV-2 z ewentualnymi niewielkimi modyfikacjami opartymi na podanych tu wskazaniach.
Zespół wyniszczenia związany z zakażeniami PCV-2 najczęściej występuje u świń w wieku 5-12 tygodni (Allan i wsp., 1998; Ellis i wsp., 1998) Eksperymentalne zakażenie nowonarodzonych świń wskazuje na względnie długi okres zapowiadający między zakażeniem, a rozwojem klinicznych objawów związanych z PCV-2 (Allan i wsp., 1999; Ellis i wsp., 1999). Wyniki tu podane pokazują, że wirus jest przenoszony pionowo lub w okresie okołoporodowym. Pionowe przeniesienie wewnątrzmaciczne PCV-2 może spowodować, nie tylko poronienie, ale jest możliwe, że zakażone w macicy dawką subletalną prosiaki mogą być tymi zwierzętami, u których następnie rozwinie się PMWS.
Co więcej, wyniki te wykazują, że zaszczepienie samic świń kompozycją obejmującą immunogen PCV-2 (która to kompozycja może także zwierać immunogen z innego patogenu świni, np. parwowirus świni) przed rozmnażaniem lub pokrywaniem, lub przed okresem okołoporodowym i/lub w czasie ciąży może zapobiegać zapaleniu mięśnia sercowego i/lub poronieniom i/lub zakażeniu wewnątrzmacicznemu związanemu z cirkowirusem świni-2 jak i poodsadzeniowemu wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu i innym patologicznym konsekwencjom związanym z PCV-2, przez wywołanie odpowiedzi immunologicznej lub przeciwciał przeciw PCV-2.
Oczywiście kompozycje, sposoby i inne aspekty opisane w wynalazku mogą być stosowane lub praktykowane u zwierząt innych niż świnie np. owce, bizony, bydło, dziki, na przykład, jeśli PCV-2 zakaża takie inne zwierzęta.
P r z y k ł a d/w y n i k 2 Zapalenie mięśnia sercowego, poronienia i zakażenie wewnątrzmaciczne związane z PCV-2
Obecność PCV-2 u nowonarodzonych świń sugeruje, że pionowa transmisja może być ważnym sposobem przekazywania wirusów. Ten sposób transmisji może być związany nie tylko z niepowodzeniem rozmnażania, ale także z rozwojem wieloukładowego zespołu chorobowego w późniejszym okresie życia. Jest interesujące określenie, czy uprzednio niewykryty PCV-2 (i PCV-1) był przekazywany pionowo w regionach wytwarzających wieprzowinę, gdzie występował endemicznie PMWS, a przez to zakażenie PCV-2 było endemiczne przez przynajmniej kilka lat.
Oceniono trzydzieści osiem zgłoszeń dotyczących niepowodzenia rozmnażania otrzymanych w laboratorium diagnostycznym w Western College of Veterinary Medicine (WCVM), University of Saskatchewan, Saskatoon, Kanada przez okres czterech lat od łącznie 30 stad o dobrym stanie zdrowia. W pięciu z gospodarstw, z których otrzymano próbki zdiagnozowano przypadki PMWS. Dwadzieścia siedem z trzydziestu ośmiu zgłoszeń (71%) zaklasyfikowano jako poronienia, pięć z nich (13%) także obejmowały przynajmniej jeden zmumifikowany płód. Z pozostałych 10 przypadków: 5 dotyczyło martwo urodzonych prosiaków razem z nieżywotnymi prosiakami (13%); 2 z martwo urodzonymi i jednym lub więcej zmumifikowanymi płodami (5%); 2 tylko z martwo urodzonymi prosiakami (5%) i jeden z tylko zmumifikowanymi płodami (2,5%). Rutynowa diagnostyka przeprowadzona w kierunku wykrycia innych patogenów niż cirkowirusy wykryła 4 przypadki (11%), w których stwierdzono, że etiologią był parwowirus świń i 2 przypadki (5%), w których etiologia była pochodzenia bakteryjnego. Przeprowadzono całkowite autopsje. Zebrano i utrwalono tkanki w buforowanej formalinie (czas utrwalania 24-72 godzin) oraz w większości przypadków poddano również świeże tkanki rutynowej ocenie mikrobiologicznej. Żadnego z tych przypadków nie badano uprzednio pod kątem PCV-2.
Technika PCR została zastosowana do wykrycia PCV-1 i PCV-2 i reakcje przeprowadzano jak opisano uprzednio (Tischer i wsp. 1974). PCV-1 nie wykryto za pomocą PCR w żadnych zgłoszeniach obejmujących niepowodzenia rozmnażania z okresu czteroletniego. PCV-2 wykryto za pomocą PCR
PL 205 130 B1 w dwóch różnych zgłoszeniach, które pochodziły z tej samej wieloośrodkowej jednostki produkcyjnej, z dwóch różnych zdarzeń, które miały miejsce wiosną ostatniego roku czteroletniego okresu. Pierwsze z tych zgłoszeń obejmowało miot prosiąt ze zgrubnymi wskazaniami zapalenia mięśnia sercowego, przerostu serca i przewlekłego biernego przekrwienia.
Immunohistochemiczną identyfikację PCV-2 w tkankach przeprowadzono jak opisano uprzednio (Tischer i wsp. 1974). Barwienie immunohistochemiczne (IHC) na PCV-2 było dodatnie w sercach wszystkich sześciu ze zgłoszonych prosiąt, podczas gdy 4 z 6 były dodatnie w badaniu PCR na PCV-2 (patrz następująca Tabela).
Tabela: Wykrywanie PCV-2 w utrwalonych w formalinie sercach świń z zapaleniem mięśnia sercowego za pomocą PCR, IHC i izolację wirusów z hodowli komórkowej
Tkanki PCV-2 dodatnie PCR IHC Izolacja wirusa
Utrwalone 5/6 6/6 brak danych
Zamrożone 4/4 brak danych 2/4
Drugie zgłoszenie z tego samego gospodarstwa było złożone z miotu czterech prosiaków, z których dwa były martwo urodzone i 2 pozostałe zmarły tuż po urodzeniu. U wszystkich czterech prosiaków wystąpiły ogólne dowody ostrego, rozproszonego zapalenia mięśnia sercowego, przerostu serca i przewlekłego biernego przekrwienia. Analizie poddano tylko świeże mrożone serca i połączone tkanki płuc/śledziony. Wynik reakcji PCR na PCV-2 był dodatni dla serc 2 z 4 prosiąt, a w połączonych tkankach płuc i śledziony dla 4 z 4 prosiąt. Izolacja PCV-2 z dotkniętych serc i/lub połączonej tkanki płuc i śledziony była dodatnia w 2 z 4 przypadków, które były PCV-2 dodatnie na podstawie PCR. W oparciu o serologię i/lub PCR inne czynniki związane z niepowodzeniem rozmnażania u świni, w tym wirus zespołu rozrodczo-oddechowego świń i parwowirus świń, wydawały się krążyć w obrębie rozmnażającego się stada.
Jednak nie udało się wykazać, aby czynniki te były związane z ostrymi uszkodzeniami serca (czy innymi) u dotkniętych prosiaków, ale mogą one mieć wpływ na PMWS.
Wirusa PCV-2 nie wykryto za pomocą PCR ani IHC w jakimkolwiek reprezentatywnym przypadku niepowodzenia rozmnażania zgłoszonych w czasie pierwszych trzech lat czteroletniego okresu (był wykryty w przypadkach niepowodzenia rozmnażania zgłoszonych w ciągu ostatniego roku czteroletniego okresu obserwacji). Aby wykluczyć uszkodzenia DNA w czasie utrwalania w formalinie, jako możliwy niekorzystny czynnik ograniczający zdolność do wykrywania PCV-2 za pomocą PCR, przeprowadzono PCR na tkankach zebranych z 4 odstawionych od piersi prosiaków z PMWS. DNA PCV-2 uległo amplifikacji we wszystkich badanych tkankach, w tym były to: płuca, wątroba, nerka i węzeł chłonny płuc, ze wszystkich czterech osobników. Co więcej, czułość PCR na PCV-2 była niezależna od okresu utrwalania każdej tkanki w formalinie.
Uzyskane wyniki potwierdzają i rozszerzają uprzednie obserwacje (West i wsp. 1999), że PCV-2 może być przenoszony pionowo i może być obecny w dużych ilościach w uszkodzeniach z prosiąt zakażonych w macicy. Pionowe przenoszenie PCV-2 i wynikające z tego uszkodzenia płodów, takie jak zapalenie mięśnia sercowego, są dodatkowym przejawem chorobowym PCV-2. Co więcej, niemożliwość wykrycia PCV-2 w przypadkach niepowodzenia rozmnażania zgłoszonych przed ostatnim rokiem czteroletniego okresu obserwacji, z obszaru endemicznego dla zakażenia PCV-2, może wskazywać, że przenoszenie pionowe nie było pierwotnym mechanizmem odpowiedzialnym za pierwotne rozprzestrzenianie zakażenia wirusem. Płciowe jak i pionowe sposoby przekazywania mogą być związane z rozprzestrzenianiem zakażenia PCV-2 u świń.
P r z y k ł a d/w y n i k 3 Hodowla i izolacja szczepów cirkowirusa świń
Wirusy 1103 oraz 1021 zostały wyizolowane odpowiednio w Alberta, lub odpowiednio Saskatoon, Kanada, z przypadków poronień sposobem opisanym przez J. Ellis i wsp. Can. J. Vet. 1998, tom 39, 44-51.
Hodowlę wirusa przeprowadza się na komórkach PK/15, o których wiadomo, że nie są zanieczyszczone cirkowirusami świń (PCV), pestiwirusami, adenowirusami świń i parwowirusami świń (Allan G. i wsp. Pathogenesis of porcine circovirus experimental infections of colostrum-deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet. Microbiol. 1995, 44, 49-64).
PL 205 130 B1
Pojedyncze warstwy komórek PK/15 rozbijano za pomocą trypsynizacji (mieszaniną trypsyna-wersen) z konfluentnych hodowli, i podnoszono w podłożu MEM-SA zawierającym 15% płodową surowicę cielęcą nie skażoną przez pestiwirus (=podłoże MEM-G), w końcowym stężeniu około 400000 komórek na ml. 10 ml frakcje tej zawiesiny komórek następnie zmieszano z frakcjami próbek po 2 ml inokulum opisanych powyżej, i końcową mieszaninę rozporcjowano w objętościach 6 ml do dwóch kolb Falcon 25 cm2. Te hodowle następnie inkubowano w +37°C przez 18 godzin pod atmosferą zawierającą 10% CO2.
Po inkubacji podłoże hodowlane w połowie konfluentnych warstw pojedynczych poddano działaniu 300 mM D-glukozoaminy (Nr kat. G48175, Sigma-Aldrich Company, Limited, Poole, UK) (Tischr I. i wsp. Arch. Virol. 1987, 96 39-57), a następnie kontynuowano inkubację przez dodatkowy okres 48-72 godzin w +37°C. Po tej ostatniej inkubacji poddano jeden z dwóch Falconów każdego z inoculum 3 kolejnym cyklom zamrażania/rozmrażania. Komórki PK/15 z pozostałego Falcona poddano działaniu roztworu trypsyna-weresen, ponownie zawieszono w 20 ml podłoża MEM-G i następnie zaszczepiono w Falconach 75 cm2 w stężeniu 400000 komórek/ml. Świeżo zaszczepione kolby następnie „nadkażano przez dodanie 5 ml odpowiedniego lizatu otrzymanego po cyklach zamrażania/rozmrażania.
P r z y k ł a d/w y n i k 4 Technika wykrywania PCV za pomocą immunofluorescencji
Wstępne badania przesiewowe wszystkich preparatów hodowli komórkowych utrwalanych acetonem przeprowadzono za pomocą techniki pośredniej immunofluorescencji (IIF) stosując rozcieńczenie 1/100 puli surowic dojrzałych świń. Ta pula surowic zawiera surowice z 25 dojrzałych macior z Północnej Irlandii i wiadomo, że zawiera przeciwciała przeciwko szerokiemu zakresowi wirusów świń, w tym PCV, parwowirusa świń, adenowirusa świń i wirusa PRRS. Technikę IIF przeprowadzono przez kontaktowanie surowicy (rozcieńczonej w PBS) z hodowlami komórek przez jedną godzinę w +37°C, po czym płukano dwa razy PBS. Hodowle komórek barwiono przez jedną godzinę rozcieńczeniem 1/80 w PBS przeciwciała królika anty-immunoglobulina świni skoniugowanego z izotiocyjanianem fluoresceiny a następnie płukano PBS i umiejscawiano w buforze glicerolowym przed obserwowaniem pod mikroskopem w świetle ultrafioletowym.
P r z y k ł a d/w y n i k 5 Wytwarzanie antygenów PCV przez hodowlę in vitro
Hodowlę niezakażonych komórek PK715 i namnożenia wirusa przeprowadzono według tych samych metod jak opisane w Przykładzie 1.
Zakażone komórki zebrano po trypsynizacji po 4 dniach hodowli w 37°C i policzono. Następny pasaż zaszczepiono 400000 zakażonymi komórkami na ml.
W ten sposób hoduje się różne ujawnione tu szczepy PCV-2 np. szczepy 1103 i 1121.
P r z y k ł a d/w y n i k 6 Miareczkowanie PCV-2
Miareczkowanie przeprowadzono w 96-studzienkowych mikropłytkach.
Najpierw wprowadzono zawiesinę komórek PK/15 (150000 komórek/ml) (100 μl na studzienkę). Następnie przeprowadzono rozcieńczenia hodowli wirusa i wprowadzono je do studzienek po 100 gl. Inkubację przeprowadzono w 37°C z CO2. Po 24 godzinach przeprowadzano traktowanie glukozoaminą przez pół godziny w 37°C (co do warunków - patrz przykład 3). Następnie usunięto podłoże hodowlane i wprowadzono świeże podłoże. Przeprowadzono inkubację przez 72 godzin w 37°C. Ogniska wykazano wykorzystując przeciwciało monoklonalne anty-PCV-2 i koniugat mysi znakowany FITC.
Wskazana metoda może być stosowana do mianowania w celu przygotowania inaktywowanego jak i żywego atenuowanego PCV-2.
P r z y k ł a d/w y n i k 7 Inaktywacja antygenów wirusowych
Pod koniec hodowli wirusa zbiera się zakażone komórki i lizuje stosując ultradźwięki (sonikator Branson) lub za pomocą młyna koloidalnego typu rotor-stator (UltraTurrax, IKA). Zawiesinę następnie wirowano w 3700 g przez 30 minut. Zawiesinę wirusa inaktywowano 0,1% etylenoiminą przez 18 godzin w +37°C lub 0,5% betapropiolaktonem przez 24 godziny w +28°C. Jeśli miano wirusa przed inaktywacją jest nieodpowiednie, zawiesinę wirusa zatęża się przez ultrasączenie stosując membranę z odcięciem 300 kDa (Millipore PTMK300). Inaktywowaną mieszaninę wirusa przechowywano w +5°C.
P r z y k ł a d/w y n i k 8 Wytwarzanie szczepionki w postaci emulsji opartej na oleju mineralnym
Szczepionkę przygotowano według następującej formuły:
- zawiesina inaktywowanego cirkowirusa świń: 250 ml
- Montanide® ISA 70 (SEPPIC): 750 ml
PL 205 130 B1
Fazę wodną i fazę olejową sterylizowano oddzielnie za pomocą sączenia. Emulsję przygotowano przez mieszanie i homogenizowanie składników za pomocą emulgatora turbinowego Silverson.
Jedna dawka szczepionki zawiera około 107,5 TCID50. Objętość jednej dawki szczepionki wynosi 0,5 ml dla podawania drogą śródskórną i 2 ml dla podawania drogą domięśniową.
Szczepionka jest stosowana w programie szczepienia przeciwko wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu w kombinacji ze szczepionką Parvovax®.
P r z y k ł a d/w y n i k 9 Wytworzenie szczepionki w postaci metabolizowanej emulsji opartej na oleju
Szczepionkę przygotowano według następującej formuły:
- zawiesina inaktywowanego cirkowirusa świń: 200 ml
- Dehymuls HRE 7 (Henkel): 60 ml
- Radia 7204 (Oleofina): 740 ml
Fazę wodną i fazę olejową sterylizowano oddzielnie za pomocą sączenia. Emulsję przygotowano przez mieszanie i homogenizowanie składników za pomocą emulgatora turbinowego Silverson.
Jedna dawka szczepionki zawiera około 107,5 TCID50. Objętość jednej dawki szczepionki wynosi 2 ml dla podawania drogą domięśniową.
Szczepionka jest stosowana w programie szczepienia przeciwko wielonarządowemu zespołowi wyniszczającemu w kombinacji ze szczepionką Parvovax®.
P r z y k ł a d/w y n i k 10 Szczepienie prosiąt wektorem DNA (plazmidowym)
Grupy 3 lub 4 prosiąt urodzonych przez cesarskie ciecie w dniu 0 umieszczono w izolatorach. Prosięta szczepiono w dniu 2 albo (A) plazmidem zawierającym ORF13 albo (B) mieszaniną tego plazmidu i innego plazmidu zawierającego ORF4, a roztworem soli fizjologicznej dla grupy kontrolnej. Każdy plazmid rozcieńcza się w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) do końcowego stężenia 250 μg/ml. Wstrzykuje się objętość 2 ml domięśniowo w 2 punkty każdy po 1 ml (1 punkt z każdej strony szyi). Podaje się drugi zastrzyk szczepionki lub placebo w dniu 14. Szczepienie DNA jest dobrze tolerowane przez prosięta i nie ma żadnych obserwacji dotyczących niekorzystnego efektu szczepienia. Prosięta poddano prowokacji w dniu 21 przez podanie ustno-donosowe zawiesiny wirusa PCV-2, 1 ml do każdego nozdrza. Po prowokacji prosiaki ważono raz w tygodniu. Mierzono temperatury w odbycie w dniach 17, 21, 22, 24, 27, 29, 31, 34, 37, 41, 44. Zebrano wymazy kałowe w dniu 44 od każdego prosiaka w celu sprawdzenia wydalania PCV-2. Wirus wykrywano i oznaczano ilościowo za pomocą ilościowego PCR. W dniu 45 przeprowadzano autopsje i zebrano próbki do izolacji wirusa.
• Objawy kliniczne:
Nie ma znaczącej różnicy w średnich przyrostach masy ciała lub średnich temperaturach między grupami.
• Uszkodzenia zaobserwowane przy autopsji:
Jedyna zaobserwowana ogólna zmiana u prosiaków pod koniec to limfadenopatia oskrzeli (uogólnione powiększenie węzłów chłonnych oskrzelowych). Uszkodzenia określa się na podstawie następujących kryteriów:
= brak widocznego powiększenia węzłów chłonnych = łagodne powiększenie węzłów chłonnych, ograniczone do węzłów chłonnych oskrzelowych = umiarkowane powiększenie węzłów chłonnych, ograniczone do węzłów chłonnych oskrzelowych = silne powiększenie węzłów chłonnych, rozszerzone do węzłów chłonnych oskrzelowych, podżuchwowych, podłopatkowych i pachwinowych std jest skrótem dla odchylenia standardowego
Grupy średnia std Wyniki limfadenopatii N
(A) 1,2 1,3 4
(B) 2,0 1,7 3
kontrole 3,0 0,0 3
N = liczba prosiąt w każdej grupie
Zaobserwowano zmniejszenie uszkodzeń węzłów chłonnych (limfatycznych) u 3 z 4 prosiąt immunizowanych (A) i u 1 z 3 prosiąt immunizowanych mieszaniną (B). Różnica ta nie jest znacząca (p>0,05) ze względu na wysokie wartości odchyleń standardowych (std).
PL 205 130 B1 • Obciążenie wirusem tkanek węzłów chłonnych
Ilościowa reizolacja wirusów jest przeprowadzana na homogenatach tkankowych przygotowanych z oskrzelowych i krezkowych węzłów chłonnych.
Przedstawione dane odpowiadają mianom wirusa w homogenatach tkankowych po przekształceniu w log10.
Miana PCV-2
Grupy węzły chłonne oskrzelowe węzły chłonne krezkowe
średnia std średnia std N
(A) 0,9 0,8 0,9 0,8 4
(B) 0,7 0,6 0,2 0,2 3
kontole 2,0 1,1 1,8 1,1 4
Węzły chłonne oskrzelowe wydają się zawierać najbardziej zakaźne wirusy. Obserwuje się obciążenie wirusem w oskrzelowych i krezkowych węzłach chłonnych u prosiąt immunizowanych mieszaniną zarówno (A) jak i (B). Zmniejszenie jest znaczące (p < 0,05 dla mieszaniny plazmidów).
• Wydalanie wirusa:
Oceniano wymazy z kału od prosiąt po prowokacji pod kątem uwalniania PCV-2 stosując PCR w oparciu o amplifikację ORF13 z PCV-2. Każde oznaczenie przeprowadzono w trzech powtórzeniach na 2 ml próbki. Nieszczepione kontrole dają wynik ujemny przed prowokacją PCV-2 i dodatni po prowokacji, potwierdzając odpowiedniość oznaczenia PCR.
Wartości są wyrażone jako logio (liczba cząsteczek DNA PCV-2 w 2 μl próbce).
Log10 liczby cząsteczek DNA PCV-2
Grupy średnia std N
(A) 3,3 0,3 4
(A) 2,9 0,7 3
kontrole 3,6 0,6 4
Różnice pomiędzy grupami nie są znaczące (p>0,05).
P r z y k ł a d/w y n i k 11 Szczepienie prosiąt żywym wektorem ospy kanarka i wyniki Grupy 3 lub 4 prosiąt urodzonych przez cesarskie ciecie w dniu 0 umieszczono w izolatorach.
Prosięta w dniu 2 szczepiono 108 pfu (C) wirusa ospy kanarków obejmującym ORF13 lub (D) wirusa ospy kanarka obejmującym ORF13 i ORF4, lub wyjściowym wirusem ospy kanarków w 1 ml PBS domięśniowo z boku szyi. W 14 dniu podawano drugą iniekcję szczepionki lub placebo. Szczepienie wirusem ospy kanarków jest dobrze tolerowane przez prosiaki i nie zaobserwowano żadnego niekorzystnego efektu szczepienia. Prosięta poddano prowokacji w dniu 21 przez podanie ustno-nosowe zawiesiny wirusa PCV-2, po 1 ml do każdego nozdrza. W dniu 45 przeprowadzono autopsje i zebrano próbki tkanek do izolacji wirusa.
Wyniki autopsji:
PWMS jest ogólnie charakteryzowany przez limfadenopatie i rzadziej przez zapalenie wątroby lub zapalenie nerek. Stąd określono otrzymane wyniki dla węzłów chłonnych u każdego prosięcia w następujący sposób: 0 = brak widocznego powiększenia węzłów chłonnych; 1 = łagodne powiększenie węzłów chłonnych, ograniczone do węzłów chłonnych oskrzelowych; 2 = umiarkowane powiększenie węzłów chłonnych, ograniczone do węzłów chłonnych oskrzelowych; 3 = silne powiększenie węzłów chłonnych, rozszerzone do węzłów chłonnych oskrzelowych, podżuchowych, podłopatkowych i pachwinowych.
Grupa wyniki (C) 0,5
0,0 0,0 1,0 0,38 średnia
PL 205 130 B1 odchylenie standardowe (D) średnia odchylenie standardowe kontrole średnia odchylenie standardowe
0,48
0,0
0,5
0,5
1,0
0,5
0,41
2,0
2,5
2,5
2,5
2,38
0,25
Oskrzelowe uogólnione powiększenie węzłów chłonnych (limfadenopatia oskrzelowa) jest przeważającym i wyróżniającym się objawem dla PCV2. Znaczące obniżenie uszkodzeń węzłów chłonnych w odniesieniu do grupy kontrolnej obserwuje się po immunizacji (C) i (D) (p<0,05). Choć przedstawiono powyżej szczegółowo opisane korzystne przykładowe wykonania wynalazku, należy rozumieć, że wynalazek określony przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do poszczególnych sposobów wykonania wskazanych w powyższym opisie, ale obejmuje inne warianty, które nie wykraczają poza zakres jego ujawnienia.
P r z y k ł a d 1.1 Konstrukcja plazmidu pJP109
Plazmid pGEM7Z-Imp1010 Snoon-EcoRI Nr 14 zawierający genom wirusa PCV-2 w postaci fragmentu EcoRJ (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1998. 79 2171-2179) strawiono EcoRI, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment EcoRI-EcoRI o długości 1768 par zasad (bp). Ten fragment zligowano sam ze sobą.
Gen ORF2 wirusa PCV-2 szczepu 1010-Stoon (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1998. 79. 2171-2179; sekwencja GenBank nr dostępu AF055392) zamplifikowano stosując matrycę złożoną z samozligowanego fragmentu EcoRI-EcoRI za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) stosując następujące oligonukleotydy:
JP779 (SEQ ID NO:27) (35 mer):
5'CATCATCATGTCGACATGACGTATCCAAGGAGGCG3' i
JP780 (SEQ ID NO:28) (36 mer):
5' TACTACTAC AG ATCTTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC3' tak aby wytworzyć fragment PCR 730 bp. Ten fragment strawiono Sall i Bglll i wyizolowano, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment restrykcyjny 715 bp Sall-BgIII. Uzyskany fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Hartikka J. i wsp. Human Gene Therapy. 1996. 7. 1205-1217), uprzednio strawionym Sall i Bglll i w ten sposób otrzymano plazmid pJP109 (5567 bp) (Figura 1.1).
P r z y k ł a d 1.2 Konstrukcja plazmidu pJP111
Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy stosując plazmid pGem7Z-Imp1010-Stoon (patrz Przykład 1.1) (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1998. 79. 2171-2179) i następujące oligonukleotydy:
JP781 (SEQ ID NO:29) (35 mer):
5' CATCATCATGTCGACATGCCCAGCAAGAAGAATGG3' i
JP782 (SEQ ID NO:30) (36 mer):
5' TACTACTAC AGATCTTC AGTAATTTATTTC ATATGG3' tak aby wytworzyć fragment PCR 970 bp zawierający gen ORF1 wirusa PCV-2. Uzyskany fragment strawiono Sall i Bglll, aby po elektroforezie w żelu agarozowym, wyizolować fragment restrykcyjny 955 bp Sall-BgIII. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Przykład 1.1) i uzyskano plazmid pJP111 (5810 bp) (Figura 1. 2).
P r z y k ł a d 1.3 Konstrukcja plazmidu pJP120 (PCV-1 ORF2)
Przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy z plazmidem pPCV1 (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227) i następującymi oligonukleotydami:
PL 205 130 B1
JP783 (SEQ ID NO:31) (35 mer):
5' CATC ATC ATGTCG AC ATGACGTGGCC AAGGAGGCG3' i
JP784 (SEQ ID NO:32) (40 mer):
'TACTACTAC AGATCTTTATTTATTTAGAGGGTCTTTTAGG3' tak, aby wytworzyć fragment PCR o długości 730 bp zawierający gen ORF2 wirusa PCV-1 (szczep PK-15, numer dostępu dla sekwencji w GenBank U49186). Uzyskany fragment strawiono Sall i Bglll, aby wyizolować, po elektroforezie w żelu agarozowym, fragment restrykcyjny 715 bp Sall-BgIII. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Przykład 1.1) i uzyskano plazmid pJP120 (5565 bp) (Figura 1. 3).
P r z y k ł a d 1.4 Konstrukcja plazmidu pJP121 (PCV-1 ORF1)
Plazmid pPCV1 zawierający genom wirusa PCV1 w postaci fragmentu Pstl (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1997, 78, 221-227) strawiono Pstl, aby, po elektroforezie w żelu agarozowym, wyizolować fragment Pstl-Pstl o długości 1759 par zasad (bp). Ten fragment zligowano sam ze sobą.
Gen ORF1 wirusa PCV-1 szczep PK-15 (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1997. 78, 221-227; sekwencja w GenBank nr dostępu U49186) zamplifikowano stosując matrycę złożoną z samozligowanego fragmentu Pstl-Pstl za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z następującymi oligonukleotydami:
JP785 (SEQ ID NO:33) (35 mer):
5' CATCATCATGTCGACATGCCAAGCAAGAAAAGCGG3' i
JP786 (SEQ ID NO:34) (36 mer):
5' TACTACTAC AGATCTTC AGTAATTTATTTTATATGG3' w celu wytworzenia fragmentu PCR o 965 bp zawierającego gen ORF1 wirusa PCV-1 (szczep PK-15). Ten fragment strawiono Sall i Bglll, aby, po elektroforezie w żelu agarozowym, wyizolować fragment restrykcyjny 946 bp Sall-BgIII. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Przykład 1.1), i uzyskano plazmid pJP121 (5804 bp) (Figura 1. 4).
P r z y k ł a d 1.5 Konstrukcja plazmidu pJP058 (wyrażającego GM-CSF świń)
Krew świni zebrano w probówce zawierającej EDTA za pomocą pobrania krwi z żyły szyjnej. Komórki jednojądrzaste zebrano wirując na gradiencie Ficollu, a następnie umieszczono je w hodowli in vitro w podłożu RPMI 1640 (Gibco BRL) i stymulowano przez podanie konkanawaliny A (conA) (Sigma) w stężeniu końcowym około 5 μg/ml w podłożu hodowlanym. Po 72 godzinach stymulacji te limfoblasty zebrano, a całkowity RNA z tych komórek ekstrahowano stosując zestaw do ekstrakcji „Micro-Scale Total RNA Separation Kit (Clontech) według zaleceń producenta. Na całkowitym RNA wyekstrahowanym z świńskich limfoblastów przeprowadzono reakcję odwrotnej transkrypcji przy pomocy zestawu „1st Strand cDNA synthesis Kit (Perkin Elmer), a następnie przeprowadzono reakcję łańcuchową polimerazy z następującymi oligonukleotydami:
RG972 (33 mer) (SEQ ID NO:35)
5' TATGCGGCCGCC ACC ATGTGGCTGC AGAACCTG3' i RG973 (34 mer) (SEQ ID NO:36)
5'TATGCGGCCGCTACGTATCACTTCTGGGCTGGTT3' w celu wytworzenia fragmentu PCR o długości około 450 par zasad (bp). Ten fragment strawiono Notl, aby po elektroforezie w żelu agarozowym, wyizolować fragment Notl 450 bp. Ten fragment następnie zligowano z plazmidem pVR1012 (Przykład 1.1), korzystnie strawionym Notl i defosforylowanym i uzyskano plazmid pJP058 (5405 bp) (Figura 1.5). Sprawdzono sekwencję genu pGM-CSF sklonowanego w plazmidzie pJP058 i stwierdzono, że jest identyczny z dostępną w bazie danych GenBank (numer dostępu D21074).
P r z y k ł a d 1.6 Wytworzenie oczyszczonych plazmidów do szczepienia świń
Bakterie Escherichia coli K12 (szczepy DH10B lub SCS1) transformowano plazmidami pJP109, pJP111, pJP058, pJP120 i pJP121 z Przykładów 1.1 do 1.5 powyżej. Pięć odpowiednio otrzymanych transformowanych klonów z tymi pięcioma plazmidami następnie hodowano oddzielnie z wytrząsaniem w +37°C w podłożu pełnym (LB). Hodowle bakterii zebrano pod koniec fazy wykładniczej i plazmidy ekstrahowano techniką lizy alkalicznej. Wyekstrahowane plazmidy następnie oczyszczono na gradiencie chlorku cezu według metody opisanej przez Sambrook i wsp. (Molecular Biology: A Laboratory Manual, wyd. 2, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
PL 205 130 B1
Spring Harbor, NY). Po ostatecznej ekstrakcji bromku etydyny i strąceniu w obecności alkoholu absolutnego oczyszczone plazmidy ponownie zawieszono w buforze TE (1 mM Tris/EDTA, pH 8,0) aby uzyskać roztwory podstawowe zawierające 2 mg plazmidu na ml. Te roztwory podstawowe przechowywano w -20°C przed użyciem.
P r z y k ł a d 1.7 Kontrola ekspresji ORF 1 i 2 wirusa PCV-2
W celu sprawdzenia produktów ekspresji genów PCV-2 ORF2 i PCV-2 ORF1 sklonowanych odpowiednio w plazmidach pJP109 i pJP111, plazmidy te transfekowano do komórek CHO-K1 (Jajnik chomika chińskiego) (ATCC Nr CCL-61) stosując zestaw do transfekcji Lipofectamine Plus® (GibcoBRL Nr Katalogu 10964-013), według zaleceń producenta. 48 godzin po transfekcji transfekowane komórki płukano i utrwalano roztworem 95% lodowatego kwasu octowego przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Zastosowano pięć przeciwciał monoklonalnych, specyficznych dla białek PCV-2 ORF1 (F199 1D3GA i F210 7G5GD) i białek ORF2 (F190 4C7CF, F190 2B1BC i F190 3A8BC) jako pierwsze przeciwciała. Do ujawnienia specyficznego znakowania stosowano koniugat anty-mysi IgG znakowany Cy3. Zaobserwowano fluorescencję specyficzną w stosunku do PCV-2 dla trzech monoklonalnych przeciwciał dla ORF2 w komórkach transfekowanych plazmidem pJP109, ale nie w tych transfekowanych plazmidem pJP111. Przeciwnie, fluorescencję specyficzną dla PCV-2 zaobserwowano dla dwóch przeciwciał monoklonalnych dla PCV-2 ORF1 w komórkach transfekowanych plazmidem pJP111, ale nie w tych transfekowanych plazmidem pJP109. Nie wykryto fluorescencji z monoklonalnymi przeciwciałami PCV-2 w komórkach CHO transfekowanych samym plazmidem pVR1012, ani w nietransfekowanych komórkach CHO.
Ten sam wynik ekspresji uzyskano z surowicą poliklonalną specyficzną dla wirusa PCV-2. W tym przypadku znakowany fluoresceiną koniugat anty-IgG świni był zastosowany do detekcji specyficznej fluorescencji. Nie wykryto fluorescencji z tą surowicą poliklonalną w komórkach CHO transfekowanych samym plazmidem pVR1012 ani w nietransfekowanych komórkach CHO.
P r z y k ł a d 1.8 Szczepienie świń nagim DNA
1.8.1 Jednodniowe prosiaki
Grupy prosiaków otrzymanych za pomocą cięcia cesarskiego w dniu 0 protokołu umieszczono w jednostce izolacyjnej. Prosięta szczepiono w wieku 2 dni drogą domięśniową różnymi roztworami szczepionkowymi plazmidu. Przygotowano roztwory szczepionki przez rozcieńczenie roztworów podstawowych w sterylnej soli fizjologicznej (0,9% NaCl).
Prosięta były szczepione:
albo samym plazmidem pJP109 albo mieszaniną plazmidów pJP109 i pJP111, albo mieszaniną plazmidów pJP109 i pJP058, albo mieszaniną plazmidów pJP109, pJP111 i pJP058.
Roztwory szczepionkowe zawierają 500 μg każdego plazmidu.
Objętość: Roztwory szczepionkowe wstrzykiwano drogą domięśniową w całkowitej objętości 2 ml. W praktyce ze względu na wiek prosiąt przy szczepieniu (1-2 dni) podaje się 1 ml zastrzyk z każdej strony szyi (=2x1 ml).
Przeprowadzano dwa zastrzyki szczepionki w odstępie dwóch tygodni, to znaczy w dniach D2 i D14 protokołu.
Przeprowadzano prowokację w D21 protokołu przez ustno-nosowe podanie wirusowej zawiesiny wirulentnego szczepu PCV-2. Prosięta następnie monitorowano przez 3 tygodnie pod kątem pojawienia się specyficznych objawów klinicznych dla poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego.
Monitorowane objawy to:
Temperatura w odbycie: codzienny pomiar przez pierwsze 14 dni, a następnie dwa pomiary w czasie 3 tygodnia po prowokacji.
Waga: ważenie prosiaków tuż przed prowokacją, a następnie raz na tydzień przez 3 tygodnie po prowokacji.
Pobieranie próbek krwi do testowania wiremii i przeciwciał: próbki krwi pobierano w D2, D14, D21, D28, D35 i D42.
Autopsja: w D42 przeżywające świnie humanitarnie zabijano i poddawano autopsji, w celu znalezienia uszkodzeń anatomopatologicznych i przygotowania preparatów histologicznych z wątroby, węzłów chłonnych, śledziony, nerki i grasicy, aby móc szukać uszkodzeń w tych tkankach.
PL 205 130 B1
1.8.2. 5-7 tygodniowe prosięta
5- do 7-tygodniowe prosiaki już nie posiadające matczynych przeciwciał na wirus PCV-2 szczepiono drogą domięśniową:
albo samym plazmidem pJP109, albo mieszaniną plazmidów pJP109 i pJP111, albo mieszaniną plazmidów pJP109 i pJP058, albo mieszaniną plazmidów pJP109, pJP111 i pJP058.
Dawki szczepionki są takie same jak wskazane w Przykładzie 1.8.1 (500 μg na plazmid). Szczepionkowe roztwory wstrzykiwano drogą domięśniową w objętości 2 ml (pojedyncze podanie 2 ml do mięśni szyi).
Przeprowadzano dwa szczepienia w odstępnie 21 dni (D0 i D21). Przeprowadzono prowokację 14 dni po ostatnim szczepieniu (D35) przez domięśniowe podanie wirusowej zawiesiny wirulentnego szczepu PCV-2.
Świnie następnie monitorowano przez 8 dni pod kątem występowania specyficznych klinicznych objawów poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego u prosiąt. Kliniczne śledzenie prosiaków po prowokacji było identyczne z tym opisanym w Przykładzie 1.8.1 poza tym, że całkowity czas obserwacji tym razem wynosił 8 tygodni.
P r z y k ł a d 1.9 Szczepienie świń DNA formułowanym z DMRIE-DOPE
Możliwe jest zastosowanie zamiast roztworów nagiego plazmidowego DNA opisanych w Przykładzie 1.8, roztworów plazmidowego DNA formułowanych z DMRIE-DOPE. Roztwór DNA (zawierający jeden lub więcej plazmidów według Przykładu 1.6) w 1 mg/ml przygotowuje się w 0,9% NaCl. Roztwór DMRIE-DOPE o stężeniu 0,75 mM przygotowuje się przez zawieszenie liofilizatu DMRIE-DOPE w odpowiedniej objętości sterylnej wody destylowanej.
Tworzenie kompleksów DNA plazmidowy-lipid kationowy przeprowadza się przez rozcieńczenie w równych częściach 0,75 mM roztworu DMRIE-DOPE roztworem DNA 1 mg/ml w 0,9% NaCl. Roztwór DNA wprowadza się stopniowo za pomocą sterylnej igły 26G wzdłuż ściany fiolki zawierającej roztwór kationowego lipidu, aby uniknąć wytwarzania piany. Następnie miesza się łagodnie do momentu zmieszania się dwóch roztworów. W ten sposób uzyskuje się końcową kompozycję zawierającą 0,375 mM DMRIE-DOPE i 500 pg/ml DNA.
Jest wskazane, aby wszystkie stosowane roztwory były w temperaturze pokojowej dla wszystkich operacji opisanych powyżej. Tworzenie kompleksu DNA/ DMRIE-DOPE przeprowadza się w temperaturze pokojowej przez 30 min przed immunizacją świń.
Następnie szczepi się świnie zgodnie z wskazaniami opisanymi w Przykładach 1.8.1 i 1.8.2.
P r z y k ł a d 2.1 Konstrukcja plazmidu insercyjnego w locus C6 wirusa ospy kanarków
Na figurze 2.1 (SEQ ID NO: 16) przedstawiona jest sekwencja segmentu o wielkości 3,7 kb DNA wirusa ospy kanarków. Analiza sekwencji ujawniła ORF, oznaczony jako C6L, rozpoczynający się w pozycji 377 i kończący się w pozycji 2254. Poniżej opisano plazmid insercyjny C6 skonstruowany przez delecję ORF C6 i zastąpienie jej polilinkerem (MCS) otoczonym przez sygnały dla transkrypcji i terminacji translacji. Fragment PCR o wielkości 380 bp zamplifikowano na matrycy genomowego DNA wirusa ospy kanarków z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych C6A1 (SEQ ID NO: 21) i C6B1 (SEQ ID NO: 22). Fragment PCR o wielkości 1155 bp zamplifikowano na matrycy genomowego DNA wirusa ospy kanarków stosując startery oligonukleotydowe C6C1 (SEQ ID NO: 23) i C6D1 (SEQ ID NO: 24). Fragmenty 380 bp i 1155 bp poddano fuzji przez dodanie ich razem jako matrycy i namnożenie metodą PCR fragmentu o długości 1613 bp stosując startery oligonukleotydowe C6A1 (SEQ ID NO 21) i C6D1 (SEQ ID NO 24). Fragment ten trawiono SacI i KpnI i ligowano w pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA, USA) trawiony uprzednio SacI/KpnI. Uzyskany plazmid, pC6L potwierdzono przez analizę sekwencji DNA. Składa się on z 370 bp z DNA wirusa ospy kanarków powyżej C6 („lewe ramię C6), wczesnego sygnału terminacyjnego wirusa krowianki, kodonów stop dla translacji w sześciu ramkach odczytu oraz MCS zawierającego miejsca Smal, Pstl, XhoI i EcoRI, wczesnego sygnału terminacyjnego wirusa krowianki, kodonów stop dla translacji w sześciu ramkach odczytu oraz leżącej poniżej sekwencji wirusa ospy kanarków o wielkości 1156 bp („prawe ramię C6).
Plazmid pJP099 wyprowadzono z pC6L przez ligację kasety zawierającej promotor H6 wirusa krowianki (opisany przez Taylor i wsp. (1988c), Guo i wsp. (1989) i Perkus i wsp. (1989)) przyłączony do obcego genu w miejscach Smal/EcoRI z pC6L. Plazmid pJP099 zawiera unikalne miejsce EcoRV
PL 205 130 B1 i unikalne miejsce Nrul położone na końcu 3' promotora H6 oraz unikalne miejsce Sall położone pomiędzy kodonem stop obcego genu i lewym ramieniem C6. Fragment o wielkości ~ 4,5 kb EcoRI/Sall lub Nrul/Sall z pJP099 zawiera, zatem sekwencję plazmidu (pBluescript SK+; Stratagene, La Jolla, CA, USA), 2 ramiona C6 oraz koniec 5' promotora H6 aż do miejsca EcoRY lub Nrul.
Sekwencje starterów:
Starter C6A1 (SEQ ID NO: 21)
ATCATCGAGCTCGCGGCCGCCTATCAAAAGTCTTAATGAGTT Starter C6B1 (SEQ ID NO: 22)
GAATTCCTCGAGCTGCAGCCCGGGTTTTTATAGCTAATTAGTCATTTTT
TCGTAAGTAAGTATTTTTATTTAA
Starter C6C1 (SEQ ID NO: 23)
CCCGGGCTGCAGCTCGAGGAATTCTTTTTATTGATTAACTAGTCAAATG
AGTATATATAATTGAAAAAGTAA
Starter C6D1 (SEQ ID NO: 24)
GATGATGGTACCTTCATAAATACAAGTTTGATTAAACTTAAGTTG P r z y k ł a d 2.2 Konstrukcja plazmidu donorowego ALVAC dla ORF2 PCV2 Plazmid pGem7Z-Imp 1010-Stoon-EcoRI nr 14 zawierający genom PCV2 w postaci fragmentu EcoRI w plazmidzie pGem-7Z strawiono EcoRI, a fragment o wielkości 1768 bp wyizolowano i zligowano.
W celu wprowadzenia ORF2 z PCV2 do właściwego wektora insercyjnego
ALVAC do zamplifikowania ORF2 PCV2 ze zligowanego fragmentu EcoRI o wielkości 1768 bp (patrz powyżej) użyto starterów JP760 (SEQ ID NO: 25) i JP773 (SEQ ID NO: 26) i uzyskano produkt PCR J1304. Starter JP760 (SEQ ID NO: 25) zawiera koniec 3' promotora H6 od EcoRV i koniec 5' z ORF2 PCV2. Starter JP773 (SEQ ID NO: 26) zawiera koniec 3' z ORF2 PCV2, za którym występuje miejsce Sall. Następnie produkt PCR J1304 strawiono EcoRV/Sall i sklonowano jako fragment o wielkości ~ 750 bp we fragmencie EcoRV/Sall o wielkości ~ 4,5 kb z pJP099 (patrz powyżej Przykład 2.1). Uzyskany plazmid potwierdzono przez analizę sekwencji i oznaczono jako pJP102 (patrz mapa pJP102 przedstawiona na Figurze 2.2 oraz sekwencja (SEQ ID NO: 8) na Figurze 2.3). Sekwencja ORF2 odpowiada sekwencji dostępnej w bazie danych GenBank, numer dostępu AF055392. Plazmid donorowy pJP102 (linearyzowany Notl) użyto w teście rekombinacji in vitro (IVR) w celu wytworzenia rekombinanta ALVAC vCP1614 (patrz Przykład 2.6).
Sekwencje starterów:
JP760 (SEQ ID NO: 25)
CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TAT-CCA-AGG-AGG-GG JP760 (SEQ ID NO: 26)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-GGG-TTT-AAG-TGG-GGG-GTC P r z y k ł a d 2.3 Konstrukcja plazmidu donorowego ALVAC dla ORF2 i ORF1 z PCV2 ORF1 PCV2 amplifikowano techniką PCR stosując startery JP774 (SEQ ID NO: 9) i JP775 (SEQ ID NO: 10) na plazmidzie pGem7Z-Imp1010-Stoon-EcoRI nr 14 uzyskując produkt PCR J1311. Starter JP774 (SEQ ID NO: 9) zawiera koniec 3' promotora H6 od miejsca Nrul i koniec 5' z ORF1 PCV2. Starter JP775 (SEQ ID NO: 10) zawiera koniec 3' z ORF1 PCV2, za którym występuje miejsce Sall. Produkt PCR J1311 (~ 1 kb) sklonowano w pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uzyskany plazmid potwierdzono przez analizę sekwencji i oznaczono jako pJP104. Sekwencja ORF1 odpowiada sekwencji dostępnej w bazie danych GenBank, numer dostępu AF055392. Fragment Nrul/Sall o wielkości ~ 970 bp wyizolowano z pJP104 i sklonowano we fragmencie Nrul/Sall o wielkości ~ 4,5 kb z pJP099 (patrz powyżej Przykład 2.1). Uzyskany plazmid potwierdzono przez analizę restrykcyjną i oznaczono jako pJP105 (patrz Figura 2.4). Plazmid donorowy pJP105 można użyć w teście rekombinacji in vitro (opisanym w Przykładzie 2.6) w celu wytworzenia rekombinanta ALVAC wyrażającego ORF1 PCV2.
Fragment BamHI/Sall o wielkości ~ 838 bp z pJP102 (patrz Przykład 2.2) tępiono używając fragmentu Klenowa polimerazy DNA i klonowano w wytępione za pomocą fragmentu Klenowa miejsce
EcoRI z PJP105. Klony badano pod względem orientacji wstawki za pomocą analizy restrykcyjnej i wybrano orientację głowa do głowy. Plazmid potwierdzono przez analizę sekwencji i oznaczono jako pJP107 (patrz mapa pJP107 na Figurze 2.5 oraz sekwencja (SEQ ID NO: 11) przedstawiona na Figu36
PL 205 130 B1 rze 2.6). Plazmid donorowy pJP107 (zlinearyzowany Notl) użyto w teście rekombinacji in vitro 5 (IVR) w celu wytworzenia rekombinanta ALVAC vCP1615 (patrz Przykład 2.6).
Sekwencje starterów:
JP774 (SEQ ID NO:9)
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-CAG-CAA-GAA-GAA-TGG
JP775 (SEQ ID NO: 10)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTC-ATA-TGG
P r z y k ł a d 2.4 Konstrukcja plazmidu donorowego ALVAC dla ORF2 z PCV1
Plazmid pPCV1 (B. Meehan i wsp. J. Gen. Virol. 1997. 78. 221-227), zawierający genom PCV1 jako fragment Pstl w plazmidzie pGem-7Z, wykorzystano jako matrycę do namnożenia ORF2 PCV1.
W celu wprowadzenia ORF2 PCV2 do właściwego wektora insercyjnego ALVAC do amplifikowania ORF2 PCV1 z plazmidu pPCV1 (patrz powyżej) użyto starterów JP787 (SEQ ID NO: 12) i JP788 (SEQ ID NO: 13) i uzyskano produkt PCR J1315. Starter JP787 (SEQ ID NO: 12) zawiera koniec 3' promotora H6 od EcoRV i ORF2, za którym występuje miejsce Sall. Następnie produkt PCR J1315 strawiono EcoRV/Sall i sklonowano jako fragment o wielkości -750 bp we fragmencie EcoRV/Sall o wielkości ~ 4,5 kb z pJP099 (patrz powyżej Przykład 2.1). Konstrukcję otrzymanego plazmidu potwierdzono przez analizę sekwencji i oznaczono jako pJP113. Sekwencja ORF2 odpowiada sekwencji dostępnej w bazie danych GenBank, pod numerem dostępu U49186. Plazmid donorowy pJP113 (zlinearyzowany Notl) użyto w teście rekombinacji in vitro (IVR) w celu wytworzenia rekombinanta ALVAC vCP1621 (patrz Przykład 2.7).
Sekwencje starterów:
JP787 (SEQ ID NO: 12)
CAT-CAT-CAT-GAT-ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-ACG-TGG-CCA-AGG-AGG-CG
JP788 (SEQ ID NO: 13)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TTA-TTT-ATT-TAG-AGG-GTC-TTT-TAG-G
P r z y k ł a d 2.5 Konstrukcja plazmidu donorowego ALVAC dla ORF2 i ORF1 z PCV1
Plazmid pPCV1 (patrz Przykład 2.4, powyżej), zawierający genom PCV1 w postaci fragmentu Pstl w plazmidzie pGem-7Z strawiono Pstl, a uzyskany fragment o wielkości 1759 bp wyizolowano i zligowano.
Do zamplifikowania ORF1 PCV1 ze zligowanego fragmentu Pstl o wielkości 1759 bp (patrz powyżej) użyto starterów JP789 (SEQ ID NO: 14) i JP790 (SEQ ID NO:15) i uzyskano produkt PCR J1316. Starter JP789 (SEQ ID NO: 14) zawiera koniec 3' promotora H6 od miejsca Nrul i koniec 5' z ORF1 PCV1. Starter JP790 (SEQ ID NO: 15) zawiera koniec 3' z ORF1 PCV1, za którym występuje miejsce Sall. Produkt PCR J1316 (~ 1 kb) sklonowano w pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uzyskany plazmid potwierdzono przez analizę sekwencji i oznaczono jako pJP114. Sekwencja ORF1 odpowiada sekwencji dostępnej w bazie danych GenBank, pod numerem dostępu U49186. Fragment Nrul/Sall o wielkości ~ 970 bp wyizolowano z pJP114 i sklonowano we fragmencie Nrul/Sall o wielkości ~ 4,5 kb z pJP099 (patrz Przykład 2.1). Uzyskany plazmid potwierdzono przez analizę restrykcyjną i oznaczono jako pJP115. Plazmid donorowy pJP115 można użyć w teście rekombinacji in vitro (opisanym w Przykładzie 2.7) w celu wytworzenia rekombinanta ALVAC wyrażającego ORF1 PCV1.
Fragment BamHI/Sall o wielkości ~ 838 bp z pJP113 (patrz Przykład 2.4) tępiono przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy DNA i sklonowano w wytępionym za pomocą fragmentu Klenowa miejscu EcoRI z PJP115. Klony badano pod względem orientacji wstawki za pomocą analizy restrykcyjnej i wybrano orientację głowa do głowy. Wytworzony plazmid potwierdzono przez analizę sekwencji i oznaczono jako pJP117. Plazmid donorowy pJP117 (zlinearyzowany Notl) użyto w teście rekombinacji in vitro (IVR) w celu wytworzenia rekombinanta ALVAC vCP1622 (patrz Przykład 2.7).
Sekwencje starterów:
JP789 (SEQ ID NO: 14)
CAT-CAT-CAT-TCG-CGA-TAT-CCG-TTA-AGT-TTG-TAT-CGT-AAT-GCC-AAG-CAA-GAAAAG-CGG
PL 205 130 B1
JP790 (SEQ ID NO: 15)
TAC-TAC-TAC-GTC-GAC-TCA-GTA-ATT-TAT-TTT-ATA-TGG
P r z y k ł a d 2.6 Wytworzenie rekombinantów ALVAC-PCV2
Plazmidy pJP102 (patrz Przykład 2.2 i Figura 2.2) oraz pJP107 (patrz Przykład 2.3 i Figura 2.5) zlinearyzowano za pomocą Notl i transfekowano nimi pierwotne komórki CEF zainfekowane ALVAC przy użyciu opisanej wcześniej metody precypitacji z fosforanem wapnia (Panicali i Paoletti, 1982; Piccini i wsp., 1987). Pozytywne łysinki selekcjonowano na podstawie hybrydyzacji do specyficznych sond PCV2 wyznakowanych radioaktywnie i poddawano czterem kolejnym rundom oczyszczania łysinek aż do uzyskania czystej populacji. Następnie zamplifikowano jedną reprezentatywną łysinkę z każdego IVR a uzyskane rekombinanty ALVAC oznaczono jako vCP1614 i vCP1615. Wirus vCP1614 powstał w wyniku rekombinacji pomiędzy ALVAC i plazmidem donorowym pJP102 i zawiera ORF2 PCV2 wprowadzony w locus C6 ALVAC. Wirus vCP1615 powstał w wyniku rekombinacji pomiędzy ALVAC i plazmidem donorowym pJP107 i zawiera ORF2 i ORF1 PCV2 wprowadzone w locus C6 ALVAC w orientacji głowa do głowy.
W podobny sposób można wytworzyć rekombinanta ALVAC wyrażającego wyłącznie ORF1 PCV2 wykorzystując w tym celu plazmid pJP105 opisany w Przykładzie 2.3.
Immunofluorescencja.
W celu ustalenia czy białka PCV2 były wyrażane w komórkach Vero zainfekowanych zrekombinowanym ALVAC przeprowadzono analizę immunofluorescencji (IF). Zainfekowane komórki Vero płukano PBS 24 godz. po infekcji (m.o.i. około 10) i utrwalano 95% zimnym acetonem przez 3 min w temperaturze pokojowej. Przeciwciała monoklonalne (MAb) z pięciu preparatów (nadsącz hybrydomy) specyficzne dla ORF1 PCV2 (PCV2 199 1D3GA i PCV2 210 7G5GD) lub ORF2 PCV2 (PCV2 190 4C7CF, PCV2 190 2B1BC i PCV2 190 3A8BC) zastosowano jako pierwsze przeciwciało. Swoiste przeciwciała monoklonalne otrzymano z Merial-Lyon. Przeciwciała monoklonalne można także otrzymać postępując zgodnie z wiedzą przekazaną w cytowanych niniejszym dokumentach np. U.S. nr 09/082,358 i 09/161,092. Reakcję IF prowadzono jak została opisana w publikacji Taylor i wsp. (1990).
Immunofluorescencję swoistą dla PCV2 z trzema przeciwciałami swoistymi dla ORF2 można było wykryć w komórkach zainfekowanych vCP1614 oraz komórkach zainfekowanych vCP1615. Immunofluorescencję swoistą dla PCV1 z dwoma przeciwciałami swoistymi dla ORF1 można było wykryć w komórkach zainfekowanych tylko vCP1614. Wyniki te pokazują, że tak jak się spodziewano, vCP1614 wyraża tylko ORF2, podczas gdy vCP1615 wyraża zarówno ORF1 jak ORF2. Nie obserwowano fluorescencji w komórkach Vero zainfekowanych rodzicielskim ALVAC, ani w nie zainfekowanych komórkach Vero.
P r z y k ł a d 2.7 Wytworzenie rekombinantów ALVAC-PCV1
Plazmidy pJP113 (patrz Przykład 2.4) oraz pJP117 (patrz Przykład 2.5) zlinearyzowano za pomocą Notl i stransfekowano nimi pierwotne komórki CEF zainfekowane ALVAC przy użyciu metody precypitacji z fosforanem wapnia opisanej wcześniej (Panicali i Paoletti, 1982; Piccini i wsp., 1987). Pozytywne łysinki selekcjonowano na podstawie hybrydyzacji do specyficznych sond PCV1 wyznakowanych radioaktywnie i poddano czterem kolejnym rundom oczyszczania łysinek aż do uzyskania czystej populacji. Następnie zamplifikowano jedną reprezentatywną łysinkę z każdego IVR, a uzyskane rekombinanty ALVAC oznaczono jako vCP1621 i vCP1622. Wirus vCP1621 powstał w wyniku rekombinacji pomiędzy ALVAC a plazmidem donorowym pJP113 i zawiera ORF2 PCV1 wprowadzony w locus C6 ALVAC. Wirus vCP1622 powstał w wyniku rekombinacji pomiędzy ALVAC a plazmidem donorowym pJP117 i zawiera ORF2 i ORF1 PCV1 wprowadzony w locus C6 ALVAC w orientacji głowa do głowy.
W podobny sposób można wytworzyć rekombinant ALVAC wyrażającego ORF1 PCV1 przy użyciu plazmidu donorowego pJP115 opisanego w Przykładzie 2.5.
Immunofluorescencja. W celu ustalenia czy białka PCV1 były wyrażane w komórkach Vero zainfekowanych zrekombinowanym ALVAC przeprowadzono analizę immunofluorescencji (IF). Zainfekowane komórki Vero płukano PBS 24 godziny po infekcji (m.o.i. około 10) i utrwalano 95% zimnym acetonem przez 3 min w temp. pokojowej. Jako pierwsze przeciwciało zastosowano świńską surowicę poliklonalną swoistą dla PCV1 (Allan G. i wsp. Vet. Microbiol. 1999, 66: 115-123). Reakcję IF prowadzono według opisu w Taylor i wsp. (1990).
PL 205 130 B1
Immunofluorescencję swoistą dla PCV1 można było wykryć w komórkach zainfekowanych vCP1621 oraz komórkach zainfekowanych vCP1622. Wyniki te pokazują, że tak jak się spodziewano, vCP1621 i vCP1622 wyraża produkty swoiste dla PCV1. Nie obserwowano fluorescencji dla świńskiej surowicy poliklonalnej swoistej dla PCV2 w komórkach zainfekowanych vCP1621 i w komórkach zainfekowanych vCP1622. Nie obserwowano fluorescencji w komórkach Vero zainfekowanych rodzicielskim ALVAC ani w nie zainfekowanych komórkach Vero.
P r z y k ł a d 2.8 Wytwarzanie zrekombinowanych wirusów ospy kanarków z Carbopolem™974P
W celu wytworzenia szczepionki zrekombinowane wirusy ospy kanarków vCP1614 i vCP1615 (Przykład 2.6) można zmieszać z roztworami karbomeru. W ten sam sposób zrekombinowane wirusy ospy kanarków vCP1621 i vCP1622 (Przykład 2.7) można zmieszać z roztworem karbomeru. Składnikiem karbomeru stosowanym do szczepienia świń w opisany sposób jest Carbopol™974P produkowany przez firmę BF Goodrich (masa cząsteczkowa #3,000,000). Najpierw wytwarzany jest roztwór podstawowy 1,5% Carbopolu™974P w wodzie destylowanej zawierającej 1 g/l chlorku sodu. Taki roztwór podstawowy jest następnie używany do wytworzenia roztworu Carbopolu™974P o stężeniu 4 mg/ml w wodzie fizjologicznej. Roztwór podstawowy jest mieszany z odpowiednią objętością wody fizjologicznej w jednym etapie lub w kilku kolejnych etapach, z ustawianiem wartości pH na każdym etapie przy użyciu 1N (lub bardziej stężonego) roztworu wodorotlenku sodu, do osiągnięcia końcowej wartości pH 7,3 - 7,4. Taki roztwór końcowy Carbopol™974P jest roztworem gotowym do użycia do rekonstytucji rekombinowanych wirusów w postaci liofilizowanej lub do rozcieńczenia stężonego roztworu podstawowego rekombinowanych wirusów. Przykładowo, aby wytworzyć zawiesinę wirusową zawierającą 10e8 pfu na 2 ml dawkę można rozpuścić 0,1 ml roztworu podstawowego o 10e9 pfu/ml w 1,9 ml gotowego do użycia roztworu 4 mg/ml Carbopolu™974P. W podobny sposób można także przygotować gotowe do użycia roztwory Carbopol™974P 2 mg/ml.
P r z y k ł a d 2.9 Immunizacja świń i następująca po niej prowokacja
2.9.1 Immunizacja jednodniowych prosiąt
Grupy prosiąt urodzonych przy pomocy cesarskiego cięcia w dniu 0 przenoszono do izolatorów. Prosięta szczepiono dnia 2 drogą domięśniową stosując różne roztwory szczepionkowe. Zawiesiny szczepionki wirusowej przygotowywano przez rozcieńczenie roztworów podstawowych zrekombinowanych wirusów w sterylnej soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Odpowiednie zakresy zawiesin wirusowych można określić doświadczalnie, lecz będą się one zasadniczo mieścić w zakresie 106 do 1010, a korzystnie około 1010 pfu/dawkę. Roztwory szczepionki można także przygotować przez mieszanie zawiesiny zrekombinowanego wirusa z Carbopolem™974P, jak opisano w Przykładzie 2.8.
Prosięta szczepiono:
Zrekombinowanym wirusem vCP1614 (Przykład 2.2)
Zrekombinowanym wirusem vCP1615 (Przykład 2.3)
Zrekombinowanym wirusem vCP1614 zmieszanym z Carbopolem™974P (roztwór 4 mg/ml)
Zrekombinowanym wirusem vCP1615 zmieszanym z Carbopolem™974P (roztwór 4 mg/ml).
Zawiesiny wirusowe zawierają 10e8 jednostek tworzących łysinki (pfu) na dawkę. Każda zawiesina wirusowa była wstrzykiwana domięśniowo w objętości 1 ml. Domięśniowy zastrzyk podawany jest do mięśni na karku. Dwa zastrzyki zawiesin wirusowych podawano dnia 2 i dnia 14 doświadczenia. Prowokacja była prowadzona w dniu 21 przez ustno-nosowo podanie zawiesiny wirusowej przygotowanej z hodowli wirulentnego szczepu PCV-2. Po prowokacji prosięta monitorowano przez 3 tygodnie pod względem wystąpienia klinicznych objawów swoistych dla poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego.
Badano następujące objawy:
Temperatura w odbycie: codzienny pomiar przez 2 tygodnie po prowokacji, następnie dwa pomiary temperatury w odbycie w czasie 3 tygodnia.
Waga: prosięta ważono tuż przed prowokacją, a następnie raz w tygodniu podczas 3 pierwszych tygodni po prowokacji.
Próbki krwi pobierano dnia 2, dnia 14, dnia 21, dnia 28, dnia 35 i dnia 42 doświadczenia, w celu monitorowania poziomu wiremii i mian swoistych przeciwciał przeciwko PCV-2.
Sekcja: dnia 42 wszystkie prosięta, które przeżyły humanitarnie usypiano i przeprowadzano sekcję w celu zaobserwowania specyficznych zmian makroskopowych dla PWMS. Próbki tkanek pobierano z wątroby, węzłów chłonnych, śledziony, nerek i grasicy w celu zaobserwowania specyficznych zmian histologicznych.
PL 205 130 B1
9.2 Immunizacja 5-7 tygodniowych prosiąt
Prosięta w wieku 5-7 tygodni, wolne od matczynych swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko PCV-2 szczepiono domięśniowo różnymi roztworami szczepionki. Zawiesiny wirusowej szczepionki przygotowywano przez rozcieńczenie roztworów podstawowych zrekombinowanych wirusów w sterylnej soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Roztwory szczepionki można także przygotować przez mieszanie zawiesiny zrekombinowanego wirusa z Carbopolem™974P, jak opisano w Przykładzie 2.8.
Prosięta szczepiono:
Zrekombinowanym wirusem vCP1614 (Przykład 2.2)
Zrekombinowanym wirusem vCP1615 (Przykład 2.3)
Zrekombinowanym wirusem vCP1614 zmieszanym z Carbopolem™974P (roztwór 4 mg/ml)
Zrekombinowanym wirusem vCP1615 zmieszanym z Carbopolem™974P (roztwór 4 mg/ml).
Zawiesiny wirusowe zawierają 10e8 jednostek tworzących łysinki (pfu) na dawkę. Każda zawiesina wirusowa jest wstrzykiwana domięśniowo w objętości 2 ml. Domięśniowy zastrzyk podawany jest do mięśni na karku. Dwa zastrzyki zawiesin komórkowych podawano dnia 0 i dnia 21 doświadczenia. Prowokacja jest wykonywana dnia 35 przez podanie ustno-nosowo zawiesiny wirusowej przygotowanej z hodowli wirulentnego szczepu PCV-2. Po prowokacji prosięta monitorowano przez 8 tygodni pod względem klinicznych objawów swoistych dla poodsadzeniowego wielonarządowego zespołu wyniszczającego. Monitorowanie kliniczne jest identyczne jak to opisane w Przykładzie 2.9.1 z wyjątkiem tego, że czas trwania monitorowania wynosił 8 tygodni zamiast 3 tygodni. Przeprowadzano sekcje w czasie trwania doświadczenia na prosiętach padłych po prowokacji i na końcu doświadczenia (dzień 97) na wszystkich prosiętach, które przeżyły. Próbki tkanek są takie same jak opisano w Przykładzie 2.9.1.
Należy rozumieć, że wynalazek zdefiniowany przez załączone zastrzeżenia nie jest ograniczony do szczególnych wykonań wskazanych w opisie, powyżej, ale obejmuje jego warianty, które nie wykraczają poza zakres ujawnienia oraz koncepcję niniejszego wynalazku.
Informacja o sekwencjach:
SEQ ID NO:1 sekwencja DNA PCV genomu szczepu Imp. 1011-48121.
SEQ ID NO:2 sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1011-48285.
SEQ ID NO:3 sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 999.
SEQ ID NO:4 sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1010.
SEQ ID NO:5 sekwencja DNA genomu szczepu PK/15.
SEQ ID NO:6 sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1103.
SEQ ID NO:7 sekwencja DNA genomu szczepu Imp. 1121.
SEQ ID NO:8 sekwencja nukleotydowa 1,68 kb frgmentu z donorowego plazmidu pJP102 od miejsca restrykcyjnego KpnI (pozycja 653) do pozycji 1680.
SEQ ID NO:9 oligonukleotydowy starter JP774.
SEQ ID NO:10 oligonukleotydowy starter JP775.
SEQ ID NO:11 sekwencja nukleotydowa fragmentu 3,6 kb z donorowego plazmidu pJP107 od miejsca restrykcyjnego KpnI (pozycja 653) do miejsca restrykcyjnego SacI (pozycja 4255).
SEQ ID NO:12 oligonukleotydowy starter JP787.
SEQ ID NO:13 oligonukleotydowy starter JP788.
SEQ ID NO:14 oligonukleotydowy starter JP789.
SEQ ID NO:15 oligonukleotydowy starter JP790.
SEQ ID NO:16 sekwencja nukleotydowa fragmentu 3,7 kb DNA z ALVAC (wirus ospy kanarków) zawierająca otwartą ramkę odczytu C6.
SEQ ID NO:17 sekwencja polipeptydowa wyprowadzona z sekwencji polinukleotydowej SEQ ID NO: 16.
SEQ ID NO:18 sekwencja polipeptydowa wyprowadzona z sekwencji polinukleotydowej SEQ ID
NO:8.
SEQ ID NO:19 sekwencja polipeptydowa wyprowadzona z sekwencji polinukleotydowej SEQ ID NO:11.
SEQ ID NO:20 sekwencja polipeptydowa wyprowadzona z sekwencji polinukleotydowej SEQ ID NO:11.
SEQ ID NO:21 oligonukleotydowy starter C6A1.
PL 205 130 B1
SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:25 o SEQ ID NO:26 o SEQ ID NO:27 o SEQ ID NO:28 o SEQ ID NO:29 o SEQ ID NO:30 o SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:32 o SEQ ID NO:33 o SEQ ID NO:34 o SEQ ID NO:35 o SEQ ID NO:36 o ligonukleotydowy starter C6B1. ligonukleotydowy starter C6C1. ligonukleotydowy starter C6D1. ligonukleotydowy starter JP760. ligonukleotydowy starter JP773. ligonukleotydowy starter JP779. ligonukleotydowy starter JP780. ligonukleotydowy starter JP781. ligonukleotydowy starter JP782. ligonukleotydowy starter JP783. ligonukleotydowy starter JP784. ligonukleotydowy starter JP785. ligonukleotydowy starter JP786. ligonukleotydowy starter RG972. ligonukleotydowy starter RG973.
Referencje:
1. Allan GM, McNeilly F, Cassady JP, et al.: 1995, Pathogenesis of porcine circovirus; experimental infections of colostrum deprived piglets and examination of pig foetal material. Vet Microbiol 44:49-641.
2. Allan GM, McNeilly F, Kennedy S, et al.: 1998, Isolation of porcine circovirus-like viruses from piglets with a wasting disease in the United States of America and Europe. J Vet Diag Invest 10:3-10.
3. Allan GM, Kennedy S, McNeilly F, et al.: 1999, Experimental reproduction of wasting disease and death by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus, J Comp Path 121:1-11 (July 1999).
4. Bolt DM, Hani H, Muller E, and Waldvogel AS: 1997, Nonsuppurative myocarditis in piglets associated with porcine parvovirus infection. J Comp Path 117:107-118.
5. Clark, E.G. Proc. Amer. Assoc. Swine Pract, pp. 499-501 (1997).
6. Edbauer, C, R. Weinberg, J. Taylor, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, P. Desmettre and
E. Paoletti, Virology 179, 901-904 (1998).
7. Ellis, J., L. Hassard, E. Clark, J. Harding, G. Allan, P. Willson, J. Strakappe, K. Martin,
F. McNeilly, B. Meehan, D. Todd, D. Haines, Isolation of circovirus from lesions of piglets with postweaning multisystemic wasting syndrome Can. Vet. J. 39, 44-51(1998).
8. Ellis JA, Krakowka S, Lairmore M, et al.: 1999, Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. J Vet Diag Invest 11:3-14.
9. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, E. Paoletti, Virology 179, 247-266, 517-563 (1990).
10. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).
11. Hamel, A.L., L.L. Lin and G.P.S. Nayar, J. Virol. 72, 5262-5267 (1998).
12. Harding J.C., Proc. Am. Assoc. Swine Pract. 28, 503 (1997).
13. Kim HS, Jo HS and Bergeland ME: 1989, Serologic, virologic, and histopathologic observations of encephalomyocarditis virus infection in mummified and stillborn pigs- J Vet Diag Invest 1:101-104.
14. Lager KM and Halbur PG: 1996, Gross and microscopic lesions in porcine fetuses infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Vet Diag Invest 8:275-282.
15. Mankertz, A., J. Mankertz, K. Wolf, H.-J. Buhk, Gen. Virol. 79, 381-384 (1998a).
16. Mankertz, J., H.-J. Bunk, G. Blaess, A. Mankertz, Virus Gene 16, 267-276 (1998b).
17. Matthews, R.E.F., Intervirology 17, 42-44 (1982).
18. Meehan BM, McNeilly F. Todd D, S. Kennedy, V.A. Jewhurst, J.A. Ellis, L.E. Hassard, E.G. Clark, D.M. Haines, G.M. Allan, J.: 1998, Characterization of novel circovirus DNA's associated wasting disease syndromes in pigs. J Gen Virol 79:2171-2179.
19. Meehan, B.M., J.L. Creelan, M.S. McNulty, D. Todd, J. Gen. Virol. 78, 221-227 (1997).
20. Mengeling WL 1992, Porcine parvovirus. In: Diseases of swine, ed. Leman AD, 7th ed-, pp.299-31 1. Iowa State University Press, Ames, IA.
PL 205 130 B1
21. Molitor TW, Orveerakul K, Zhang ZZ, et al.: 1991, Polymerase chain reaction (PRC) amplification for detection of porcine parvovirus. J Virol Meth 32:201-211.
22. Nayar, G.P.S., A. Hamel and L. Lin. Can. Vet. J. 38, 385-386 (1997).
23. Panicali, D. and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).
24. Paoletti, E., B.R. Lipinskaks, C. Samsonoff, S. Mercer, and D. Panicali, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 193-197 (1984).
25. Pensaert M and DeMeurichy W: 1973, A porcine enterovirus causing fetal death and mummification. Experimental infection of pregnant female pigs. Zentralbl Veterinaermed Beih 11:2025.
26. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 3829-3836 (1989).
27. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987).
28. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, In Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edition, (Cold Spring Harbor Press, NY) (1989).
29. Tartaglia, J., J. Winslow, S. Goebel, G.P. Johnson, J. Taylor, and E. Paoletti, J. Gen. Virol.
71,1517-1524 (1990).
30. Tartaglia, J., Perkus ME, Taylor J, Norton EK, Audonnet JC, Cox WI, Davis SW, van der Hoeven J, Meignier B, Riviere M, and E. Paoletti, Virology 188, 217-32 (1992).
31. Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, Ph. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988a).
32. Taylor, J. and E. Paoletti, Vaccine 6, 466-468 (1988b).
33. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. Webster and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988c).
34. Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre and E. Paoletti, J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).
35. Taylor, J., C. Trimarchi, R. Weinberg, B. Languet, F. Guillemin, P. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 9, 190-193 (1991).
36. Taylor J, Weinberg R, Tartaglia J, Richardson C, Alkhatib G, Briedis D, Appel M, Norton E, Paoletti E., Virology 187, 321-328 (1992).
37. Tischer 1, Rasch R and Tochtermann G: 1974, Characterization of papovavirus- and picomavirus-like particles -in permanent piglet kidney cell lines. Zentralbl-Bakertiol-Org-A 226:153-167.
38. Todd, D., F.D. Niagro, B.W. Ritchie, W. Curran, G.M. Allan, P.D. Lukert. K.S. Latimer, W.L. Steffens, M.S. McNulty, Arch. Virol. 117, 129-135 (1991).
39. West KH, Bystrom, JM, Wojnarowicz C, et al.: 1999, Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus-2. J Vet Diag Invest 1.
PL 205 130 B1
WYKAZ SEKWENCJI <110> Merial, University of Saskatchewan oraz The Queen's University of Belfast.
<120> Zapobieganie zapaleniu mięśnia sercowego, poronieniom i zakażeniom wewnątrzmacicznym związanym z świńskim cirkowirusem 2 (PCV-2) <130> P020090EP <140> PCT/EP00/08781 <141> 2000-08-28 <150> US 60/151,564 <151> 1999-08-31 <150> US 09/583,350 <151> 2000-05-31 <160> 36 <170> Patentln wersja 3.3 <210> 1 <211> 1767 <212> DNA <213> Świński cirkowirus <400> 1
aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60
ccccctcctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120
ggcgttctga ctgtggttcg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180
aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240
cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc 300
cttggatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360
ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg ccgagcaaga agaatggaag 420
aagcggaccc caaccccata aaaggtgggt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480
gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540
gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600
gacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 660
PL 205 130 B1
aacagatcag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc aacttactga tggagtgtgg 720
agctcctaga tctcagggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780
gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840
cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagactaa 900
tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960
agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020
tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccctgggatg atctactgag 1080
actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140
ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200
cccagctgta gaagctcttt atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260
agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320
tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380
taagggttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca 1440
cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacgtgg 1500
tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc cacagctggt ttcttttgtt gtttggttgg 1560
aagtaatcaa tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag 1620
aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggtgagggct 1680
gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac tcccctgtca 1740
ccctgggtga tcggggagca gggccag 1767
<210> 2 <211> 1767
<212> DNA <213> Świński cirkowirus
<400> 2 aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60
ccccctcctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120
ggcgttttga ctgtggttcg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180
aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240
cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc 300
cttggatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360
PL 205 130 B1
ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420
aagcggaccc caaccccata aaaggtgggt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480
gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540
gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg taaagaagga 600
gacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 660
aacagatcag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc aacttactga tggagtgtgg 720
agctcctaga tctcagggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780
gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840
cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagactaa 900
tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960
agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020
tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccctgggatg atctactgag 1080
actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140
ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200
cccagctgta gaagctcttt atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260
agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320
tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380
taagggttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca 1440
cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacgtgg 1500
tctacatttc cagtagtttg tagtctcagc cacagctgat ttcttttgtt gtttggttgg 1560
aagtaatcaa tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag 1620
aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggtgagggct 1680
gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac tcccctgtca 1740
ccctgggtga tcggggagca gggccag 1767
<210> 3 <211> 1768
<212> DNA
<213> Świński cirkowirus
<400> 3 aattcaacct taaccttttt tattctgtag tattcaaagg gtatagagat tttgttggtc 60
ccccctcccg ggggaacaaa gtcgtcaata ttaaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120
PL 205 130 B1
ggcgttctga ctgtggtagc cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180
aagatgccat ttttccttct ccaacggtag cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240
cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctgcg gtaacgcctc 300
cttggatacg tcatagctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360
ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420
aagcggaccc caaccacata aaaggtgggt gttcacgctg aataatcctt ccgaagacga 480
gcgcaagaaa atacgggagc tcccaatctc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540
gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600
aacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagccaaagg 660
aactgatcag cagaataaag aatattgcag taaagaaggc aacttactta ttgaatgtgg 720
agctcctcaa tctcaaggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780
gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840
cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagaccaa 900
tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960
agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020
tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccgtgggatg atctactgag 1080
actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttgtc 1140
ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200
cccagctata gaagctctct atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260
agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320
tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380
ttagggttta agtggggggt ctttaagatt aaattctctg aattgtacat acatggttac 1440
acggatattg tagtcctggt cgtatatact gttttcgaac gcagtgccga ggcctacgtg 1500
gtccacattt ctagaggttt gtagcctcag ccaaagctga ttccttttgt tatttggttg 1560
gaagtaatca atagtggagt caagaacagg tttgggtgtg aagtaacggg agtggtagga 1620
gaagggttgg gggattgtat ggcgggagga gtagtttaca tatgggtcat aggttagggc 1680
tgtggccttt gttacaaagt tatcatctag aataacagca gtggagccca ctcccctatc 1740
accctgggtg atgggggagc agggccag 1768
PL 205 130 B1 <210> 4 <211> 1768 <212> DNA <213> Świński cirkowirus <400> 4
aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gtatagagat tttgttggtc 60
ccccctcccg ggggaacaaa gtcgtcaatt ttaaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120
ggcgttgtga ctgtggtacg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180
aagatgccat ttttccttct ccaacggtag cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240
cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctgcg gtaacgcctc 300
cttggatacg tcatagctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360
ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420
aagcggaccc caaccacata aaaggtgggt gttcacgctg aataatcctt ccgaagacga 480
gcgcaagaaa atacgggagc tcccaatctc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540
gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600
aacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagccaaagg 660
aactgatcag cagaataaag aatattgcag taaagaaggc aacttactta ttgaatgtgg 720
agctcctcga tctcaaggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780
gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840
cgggctggct gaacttttga aagtgaccgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagaccaa 900
tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960
agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020
tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccgtgggatg atctactgag 1080
actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140
ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200
cccagctgta gaagctctct atcggagtat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260
agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320
tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380
ttagggttta agtggggggt ctttaagatt aaattctctg aattgtacat acatggttac 1440
acggatattg tagtcctggt cgtatttact gttttcgaac gcagcgccga ggcctacgtg 1500
PL 205 130 B1
gtccacattt ccagaggttt gtagtctcag ccaaagctga ttccttttgt tatttggttg 1560
gaagtaatca atagtggagt caagaacagg tttgggtgtg aagtaacggg agtggtagga 1620
gaagggttgg gggattgtat ggcgggagga gtagtttaca tatgggtcat aggttagggc 1680
tgtggccttt gttacaaagt tatcatctag aataacagca gtggagccca ctcccctatc 1740
accctgggtg ataggggagc agggccag 1768
<210> 5 <211> 1759
<212> DNA <213> Świński cirkowirus
<400> 5 aattcatatt tagcctttct aatacggtag tattggaaag gtaggggtag ggggttggtg 60
ccgcctgagg gggggaggaa ctggccgatg ttgaatttga ggtagttaac attccaagat 120
ggctgcgagt atcctccttt tatggtgagt acaaattctg tagaaaggcg ggaattgaag 180
atacccgtct ttcggcgcca tctgtaacgg tttctgaagg cggggtgtgc caaatatggt 240
cttctccgga ggatgtttcc aagaaggctg cgggggcggg tccttcttct gcggtaacgc 300
ctccttggcc acgtcatcct ataaaagtga aagaagtccg ctgctgtagt attaccagcg 360
cacttcggca gcggcagcac ctcggcagcg tcagtgaaaa tgccaagcaa gaaaagcggc 420
ccgcaacccc ataagaggtg ggtgttcacc cttaataatc cttccgagga ggagaaaaac 480
aaaatacggg agcttccaat ctcccttttt gattattttg tttgcggaga ggaaggtttg 540
gaagagggta gaactcctca cctccagggg tttgcgaatt ttgctaagaa gcagactttt 600
aacaaggtga agtggtattt tggtgcccgc tgccacatcg agaaagcgaa aggaaccgac 660
cagcagaata aagaatactg cagtaaagaa ggccacatac ttatcgagtg tggagctccg 720
cggaaccagg ggaagcgcag cgacctgtct actgctgtga gtaccctttt ggagacgggg 780
tctttggtga ctgtagccga gcagttccct gtaacgtatg tgagaaattt ccgcgggctg 840
gctgaacttt tgaaagtgag cgggaagatg cagcagcgtg attggaagac agctgtacac 900
gtcatagtgg gcccgcccgg ttgtgggaag agccagtggg cccgtaattt tgctgagcct 960
agggacacct actggaagcc tagtagaaat aagtggtggg atggatatca tggagaagaa 1020
gttgttgttt tggatgattt ttatggctgg ttaccttggg atgatctact gagactgtgt 1080
gaccggtatc cattgactgt agagactaaa gggggtactg ttcctttttt ggcccgcagt 1140
attttgatta ccagcaatca ggccccccag gaatggtact cctcaactgc tgtcccagct 1200
gtagaagctc tctatcggag gattactact ttgcaatttt ggaagactgc tggagaacaa 1260
PL 205 130 B1
tccacggagg tacccgaagg ccgatttgaa gcagtggacc caccctgtgc ccttttccca 1320
tataaaataa attactgagt cttttttttt atcacatcgt aatggttttt atttttattt 1380
atttagaggg tcttttagga taaattctct gaattgtaca taaatagtca gccttaccac 1440
ataattttgg gctgtggctg cattttggag cgcatagccg aagcctgtgt gctcgacatt 1500
ggtgtgggta tttaaatgga gccacagctg gtttctttta ttatttgggt ggaaccaatc 1560
aattgtttgg tccagctcag gtttgggggt gaagtacctg gagtggtagg taaagggctg 1620
ccttatggtg tggtggaagg agtagttaat ataggggtca taggccaagt tggtggaggg 1680
ggttacaaag ttggcatcca agataacaac agtggaccca acacctcttt gattagaggt 1740
gattggttct ctggggtaa 1759
<210> 6 <211> 1768
<212> DNA <213> Świński cirkowirus
<400> 6 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
ttgtgaagaa kcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300
agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360
ttattgaatg tggagctcct cgagctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420
gtaccttgtt ggagaacggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480
tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540
attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaattgg 600
ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660
atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg cttccggggg 720
atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780
tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840
cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900
ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagagggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960
PL 205 130 B1
catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtcyt ttttatcact tcgtaatggt 1020
ttttattatt catttagggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattcc ctgaattgta 1080
catacagggt tacacggata ttttagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140
cgaggcctac gtggtccaca tttctagagg tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200
tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260
gggagtggta ggagaagggt tgggggattg tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320
catatgtttg ggctgtggcc tttggtacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc 1380
ccactcccct atcaccctgg gtgatggggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440
ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500
agtcgtcaat tttaaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtac 1560
gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620
tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680
gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatat gtcatagctg 1740
aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
<210> 7 <211> 1768
<212> DNA <213> Świński cirkowirus
<400> 7 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300
agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360
ttattgaatg tggagctcct cgatcgcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420
gtaccttgtt ggagaacggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480
tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540
attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaattgg 600
ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660
atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720
PL 205 130 B1
atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780
tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840
cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900
ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960
catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020
ttttattatt catttagggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta 1080
catacatggt tacacggata ttgtactcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140
cgaggcctac gtggtccaca tttctagagg tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200
tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260
gggagtggta ggagaagggt tgggggattg tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320
cataggttag ggctgtggcc tttggtacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc 1380
ccactcccct atcaccctgg gtgatggggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttt 1440
ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500
agtcgtcaat tttaaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtagtac 1560
gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620
tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680
gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740
aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
<210> 8 <211> 1680
<212> DNA <213> Sztuczna <220> <223> Konstrukt plazmidowy <400> 8 ggtaccttca taaatacaag tttgattaaa cttaagttgt tctaaagttc tttcctccga 60
aggtatagaa caaagtattt cttctacatc cttactattt attgcagctt ttaacagcct 120
atcacgtatc ctatttttag tattggtaga acgttttagt tctaaagtta aaatattaga 180
cataattggc atattgctta ttccttgcat agttgagtct gtagatcgtt tcagtatatc 240
actgattaat gtactactgt tatgatgaaa tatagaatcg atattggcat ttaactgttt 300
tgttatacta agtctagatt ttaaatcttc tagtaatatg ctatttaata taaaagcttc 360
PL 205 130 B1
cacgtttttg tatacatttc tttccatatt agtagctact actaaatgat tatcttcttt 420
catatcttgt agataagata gactatcttt atctttatta gtagaaaata cttctggcca 480
tacatcgtta aatttttttg ttgttgttag atataatatt aaatatctag aggatcctat 540
tatttgtggt aaaatgttta tagagtaaaa tgatctggct attaaacata ggccagttac 600
catagaatgc tgcttcccgt tacagtgttt taccataacc atagatctgc ctgtattgtt 660
gatacatata acagctgtaa atcctaaaaa attcctatca taattattaa tattaggtaa 720
ttcatttcca tgtgaaagat agactaattt tatatccttt acctccaaat aattatttac 780
atctcttaaa caatctattt taatatcatt aactggtatt ttataatatc cagaaaggtt 840
tgaaggggtt gatggaataa gtctattaac atcgttaagt aaattattaa tatcatgaat 900
ctttattata ttatagcgat aagttaaatt tatatttact ttctcatcat ctgacttagt 960
tagtttgtaa taaggtgtgt ctgaaagaat taaaaggtaa ttcgttgaat gaagctgtat 1020
ttgctgtatc atttttatct aattttggag atttagcagt acttacttca ttagaagaag 1080
aatctgccag ttcctgtcta ttactgatat ttcgtttcat tattatatga tttatatttt 1140
actttttcaa ttatatatac tcatttgact agttaatcaa taaaaagaat tcctgcagcc 1200
ctgcagctaa ttaattaagc tacaaatagt ttcgttttca ccttgtctaa taactaatta 1260
attaaggatc ccccagcttc tttattctat acttaaaaag tgaaaataaa tacaaaggtt 1320
cttgagggtt gtgttaaatt gaaagcgaga aataatcata aattacttca ttatcgcgat 1380
atccgttaag tttgtatcgt aatgacgtat ccaaggaggc gttaccgcag aagaagacac 1440
cgcccccgca gccatcttgg ccagatcctc cgccgccgcc cctggctcgt ccacccccgc 1500
caccgctacc gttggagaag gaaaaatggc atcttcaaca cccgcctctc ccgcaccttc 1560
ggatatactg tcaagcgtac cacagtcaca acgccctcct gggcggtgga catgatgaga 1620
tttaaaattg acgactttgt tcccccggga ggggggacca acaaaatctc tatacccttt 1680
<210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> Sztuczna
<220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 9 catcatcatt cgcgatatcc gttaagtttg tatcgtaatg cccagcaaga agaatgg 57
PL 205 130 B1 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 10 tactactacg tcgactcagt aatttatttc atatgg 36
<210> 11 <211> 3609 <212> DNA <213> Sztuczna <220> <223> Konstrukt plazmidowy <400> 11 ggtaccttca taaatacaag tttgattaaa cttaagttgt tctaaagttc tttcctccga 60
aggtatagaa caaagtattt cttctacatc cttactattt attgcagctt ttaacagcct 120
atcacgtatc ctatttttag tattggtaga acgttttagt tctaaagtta aaatattaga 180
cataattggc atattgctta ttccttgcat agttgagtct gtagatcgtt tcagtatatc 240
actgattaat gtactactgt tatgatgaaa tatagaatcg atattggcat ttaactgttt 300
tgttatacta agtctagatt ttaaatcttc tagtaatatg ctatttaata taaaagcttc 360
cacgtttttg tatacatttc tttccatatt agtagctact actaaatgat tatcttcttt 420
catatcttgt agataagata gactatcttt atctttatta gtagaaaata cttctggcca 480
tacatcgtta aatttttttg ttgttgttag atataatatt aaatatctag aggatcctat 540
tatttgtggt aaaatgttta tagagtaaaa tgatctggct attaaacata ggccagttac 600
catagaatgc tgcttcccgt tacagtgttt taccataacc atagatctgc ctgtattgtt 660
gatacatata acagctgtaa atcctaaaaa attcctatca taattattaa tattaggtaa 720
ttcatttcca tgtgaaagat agactaattt tatatccttt acctccaaat aattatttac 780
atctcttaaa caatctattt taatatcatt aactggtatt ttataatatc cagaaaggtt 840
tgaaggggtt gatggaataa gtctattaac atcgttaagt aaattattaa tatgatgaat 900
ctttattata ttatacccat aagttaaatt tatatttact ttctcatcat ctgacttagt 960
tagtttgtaa taaggtgtgt ctgaaaaaat taaaaggtaa ttcgttgaat gaagctgtat 1020
ttgctgtatc atttttatct aattttggag atttagcagt acttacttca ttagaagaag 1080
aatctgccag ttcctgtcta ttactgatat ttcgtttcat tattatatga tttatatttt 1140
PL 205 130 B1
actttttcaa ttatatatac tcatttgact agttaatcaa taaaaagaat ttcgacttag 1200
ggtttaagtg gggggtcttt aagattaaat tctctgaatt gtacatacat ggttacacgg 1260
atattgtagt cctggtcgta tttactgttt tcgaacgcag cgccgaggcc tacgtggtcc 1320
acatttccag aggtttgtag tctcagccaa agctgattcc ttttgttatt tggttggaag 1380
taatcaatag tggagtcaag aacaggtttg ggtgtgaagt aacgggagtg gtaggagaag 1440
ggttggggga ttgtatggcg ggaggagtag tttacatatg ggtcataggt tagggctgtg 1500
gcctttgtta caaagttatc atctagaata acagcagtgg agcccactcc cctatcaccc 1560
tgggtgatgg gggagcaggg ccagaattca accttaacct ttcttattct gtagtattca 1620
aagggtatag agattttgtt ggtcccccct cccgggggaa caaagtcgtc aattttaaat 1680
ctcatcatgt ccaccgccca ggagggcgtt gtgactgtgg tacgcttgac agtatatccg 1740
aaggtgcggg agaggcgggt gttgaagatg ccatttttcc ttctccaacg gtagcggtgg 1800
cgggggtgga cgagccaggg gcggcggcgg aggatctggc caagatggct gcgggggcgg 1860
tgtcttcttc tgcggtaacg cctccttgga tacgtcatta cgatacaaac ttaacggata 1920
tcgcgataat gaaataattt atgattattt ctcgctttca atttaacaca accctcaaga 1980
acctttgtat ttattttcac tttttaagta tagaataaag aagctggggg atcaattcct 2040
gcagccctgc agctaattaa ttaagctaca aatagtttcg ttttcacctt gtctaataac 2100
taattaatta aggatccccc agcttcttta ttctatactt aaaaagtgaa aataaataca 2160
aaggttcttg agggttgtgt taaattgaaa gcgagaaata atcataaatt atttcattat 2220
cgcgatatcc gttaagtttg tatcgtaatg cccagcaaga agaatggaag aagcggaccc 2280
caaccacata aaaggtgggt gttcacgctg aataatcctt ccgaagacga gcgcaagaaa 2340
atacgggagc tcccaatctc cctatttgat tattttattg ttggcgagga gggtaatgag 2400
gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca aacttttaat 2460
aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagccaaagg aactgatcag 2520
cagaataaag aatattgcag taaagaaggc aacttactta ttgaatgtgg agctcctcga 2580
tctcaaggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga gagcgggagt 2640
ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg cgggctggct 2700
gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagaccaa tgtacacgtc 2760
attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc agacccggaa 2820
PL 205 130 B1
accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg tgaagaagtg 2880
gttgttattg atgactttta tggctggctg ccgtgggatg atctactgag actgtgtgat 2940
cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc ccgcagtatt 3000
ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt cccagctgta 3060
gaagctctct atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac agaacaatcc 3120
acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt tccatatgaa 3180
ataaattact gagtcgaccc cgggttttta tagctaatta gtcatttttt cgtaagtaag 3240
tatttttatt taatactttt tattgtactt atgttaaata taactgatga taacaaaatc 3300
cattatgtat tatttataac tgtaatttct ttagcgtagt tagatgtcca atctctctca 3360
aatacatcgg ctatcttttt agtgagattt tgatctatgc agttgaaact tatgaacgcg 3420
tgatgattaa aatgtgaacc gtccaaattt gcagtcatta tatgagcgta tctattatct 3480
actatcatca tctttgagtt attaatatca tctactttag aattgatagg aaatatgaat 3540
acctttgtag taatatctat actatctaca cctaactcat taagactttt gataggcggc 3600
cgcgagctc 3609 <210> 12 <211> 53 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 12 catcatcatg atatccgtta agtttgtatc gtaatgacgt ggccaaggag gcg 53 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter
<400> 13
tactactacg tcgacttatt tatttagagg gtcttttagg 40
<210> 14
<211> 57
<212> DNA
<213> Sztuczna
<220>
<223> Oligonukleotydowy starter
PL 205 130 B1
<400> 14
catcatcatt cgcgatatcc gttaagtttg tatcgtaatg ccaagcaaga aaagcgg 57
<210> 15
<211> 36
<212> DNA
<213> Sztuczna
<220>
<223> Oligonukleotydowy starter
<400> 15
tactactacg tcgactcagt aatttatttt atatgg 36
<210> 16 <211> 3701 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 16
aagcttctat caaaagtctt aatgagttag gtgtagatag tatagatatt actacaaagg 60
tattcatatt tcctatcaat tctaaagtag atgatattaa taactcaaag atgatgatag 120
tagataatag atacgctcat ataatgactg caaatttgga cggttcacat tttaatcatc 180
acgcgttcat aagtttcaac tgcatagatc aaaatctcac taaaaagata gccgatgtat 240
ttgagagaga ttggacatct aactacgcta aagaaattac agttataaat aatacataat 300
ggattttgtt atcatcagtt atatttaaca taagtacaat aaaaagtatt aaataaaaat 360
acttacttac gaaaaaatgt cattattaca aaaactatat tttacagaac aatctatagt 420
agagtccttt aagagttata atttaaaaga taaccataat gtaatattta ccacatcaga 480
tgatgatact gttgtagtaa taaatgaaga taatgtactg ttatctacaa gattattatc 540
atttgataaa attctgtttt ttaactcctt taataacggt ttatcaaaat acgaaactat 600
tagtgataca atattagata tagatactca taattattat atacctagtt cttcttcttt 660
gttagatatt ctaaaaaaaa gagcgtgtga tttagaatta gaagatctaa attatgcgtt 720
aataggagac aatagtaaat tatattataa agatatgact tacatgaata attggttatt 780
tactaaagga ttattagatt acaagtttgt attattgcgc gatgtagata aatgttacaa 840
acagtataat aaaaagaata ctataataga tataatacat cgcgataaca gacagtataa 900
catatgggtt aaaaatgtta tagaatactg ttctcctggc tatatattat ggttacatga 960
tctaaaagcc gctgctgaag atgattggtt aagatacgat aaccgtataa acgaattatc 1020
PL 205 130 B1
tgcggataaa ttatacactt tcgagttcat agttatatta gaaaataata taaaacattt 1080
acgagtaggt acaataattg tacatccaaa caagataata gctaatggta catctaataa 1140
tatacttact gattttctat cttacgtaga agaactaata tatcatcata attcatctat 1200
aatattggcc ggatattttt tagaattctt tgagaccact attttatcag aatttatttc 1260
ttcatcttct gaatgggtaa tgaatagtaa ctgtttagta cacctgaaaa cagggtatga 1320
agctatactc tttgatgcta gtttattttt ccaactctct actaaaagca attatgtaaa 1380
atattggaca aagaaaactt tgcagtataa gaactttttt aaagacggta aacagttagc 1440
aaaatatata attaagaaag atagtcaggt gatagataga gtatgttatt tacacgcagc 1500
tgtatataat cacgtaactt acttaatgga taactttaaa attcctggtt ttaattttaa 1560
attctccgga atgatagata tactactgtt tggaatattg cataaggata atgagaatat 1620
attttatccg aaacgtgttt ctgtaactaa tataatatca gaatctatct atgcagattt 1680
ttactttata tcagatgtta ataaattcag taaaaggata gaatataaaa ctatgtttcc 1740
tatactcgca gaaaactact atccaaaagg aaggccctat tttacacata catctaacga 1800
agatcttctg tctatctgtt tatgcgaagt aacagtttgt aaagatataa aaaatccatt 1860
attatattct aaaaaggata tatcagcaaa acgattcata ggtttattta catctgtcga 1920
tataaatacg gctgttgagt taagaggata taaaataaga gtaataggat gtttagaatg 1980
gcctgaaaag ataaaaatat ttaattctaa tcctacatac attagattat tactaacaga 2040
aagacgttta gatattctac attcctatct gcttaaattt aatataacag aggatatagc 2100
taccagagat ggagtcagaa ataatttacc tataatttct tttatcgtca gttattgtag 2160
atcgtatact tataaattac taaattgcca tatgtacaat tcgtgtaaga taacaaagtg 2220
taaatataat caggtaatat ataatcctat ataggagtat atataattga aaaagtaaaa 2280
tataaatcat ataataatga aacgaaatat cagtaataga caggaactgg cagattcttc 2340
ttctaatgaa gtaagtactg ctaaatctcc aaaattagat aaaaatgata cagcaaatac 2400
agcttcattc aacgaattac cttttaattt tttcagacac accttattac aaactaacta 2460
agtcagatga tgagaaagta aatataaatt taacttatgg gtataatata ataaagattc 2520
atgatattaa taatttactt aacgatgtta atagacttat tccatcaacc ccttcaaacc 2580
tttctggata ttataaaata ccagttaatg atattaaaat agattgttta agagatgtaa 2640
ataattattt ggaggtaaag gatataaaat tagtctatct ttcacatgga aatgaattac 2700
PL 205 130 B1
ctaatattaa taattatgat aggaattttt taggatttac agctgttata tgtatcaaca 2760
atacaggcag atctatggtt atggtaaaac actgtaacgg gaagcagcat tctatggtaa 2820
ctggcctatg tttaatagcc agatcatttt actctataaa cattttacca caaataatag 2880
gatcctctag atatttaata ttatatctaa caacaacaaa aaaatttaac gatgtatggc 2940
cagaagtatt ttctactaat aaagataaag atagtctatc ttatctacaa gatatgaaag 3000
aagataatca tttagtagta gctactaata tggaaagaaa tgtatacaaa aacgtggaag 3060
cttttatatt aaatagcata ttactagaag atttaaaatc tagacttagt ataacaaaac 3120
agttaaatgc caatatcgat tctatatttc atcataacag tagtacatta atcagtgata 3180
tactgaaacg atctacagac tcaactatgc aaggaataag caatatgcca attatgtcta 3240
atattttaac tttagaacta aaacgttcta ccaatactaa aaataggata cgtgataggc 3300
tgttaaaagc tgcaataaat agtaaggatg tagaagaaat actttgttct ataccttcgg 3360
aggaaagaac tttagaacaa cttaagttta atcaaacttg tatttatgaa cactataaaa 3420
aaattatgga agatacaagt aaaagaatgg atgttgaatg tcgtagttta gaacataact 3480
atacggctaa cttatataaa gtgtacggac aaaacgaata tatgattact tatatactag 3540
ctctcataag taggattaat aatattatag aaactttaaa atataatctg gtggggctag 3600
acgaatctac aatacgtaat ataaattata taatttcaca aagaacaaaa aaaaatcaag 3660
tttctaatac cttatagata aactatattt tttaccactg a 3701
<210> 17 <211> 625 <212> PRT <213> Sztuczna <220>
<223> Konstrukt plazmidowy <400> 17
Met 1 Ser Leu Leu Gin 5 Lys Leu Tyr Phe Thr 10 Glu Gin Ser Ile Val 15 Glu
Ser Phe Lys Ser 20 Tyr Asn Leu Lys Asp 25 Asn His Asn Val Ile 30 Phe Thr
Thr Ser Asp 35 Asp Asp Thr Val Val 40 Val Ile Asn Glu Asp 45 Asn Val Leu
Leu Ser 50 Thr Arg Leu Leu Ser 55 Phe Asp Lys Ile Leu 60 Phe Phe Asn Ser
Phe Asn Asn Gly Leu Ser Lys Tyr Glu Thr Ile Ser Asp Thr Ile Leu
PL 205 130 B1
70
Asp Ile Asp Thr His Asn 85
Asp Ile Leu Lys Lys Arg 100
Tyr Ala Leu Ile Gly Asp 115
Tyr Met Asn Asn Trp Leu 130
Val Leu Leu Arg Asp Val 145 150
Asn Thr Ile Ile Asp Ile 165
Trp Val Lys Asn Val Ile 180
Leu His Asp Leu Lys Ala 195
Asn Arg Ile Asn Glu Leu 210
Ile Val Ile Leu Glu Asn 225 230
Ile Val His Pro Asn Lys 245
Leu Thr Asp Phe Leu Ser 260
Ser Ser Ile Ile Leu Ala 275
Ile Leu Ser Glu Phe Ile 290
Asn Cys Leu Val His Leu 305 310
Ala Ser Leu Phe Phe Gin 325
Trp Thr Lys Lys Thr Leu 340
Gin Leu Ala Lys Tyr Ile 355
Val Cys Tyr Leu His Ala
Tyr Tyr
Ala Cys
Asn Ser 120
Phe Thr 135
Asp Lys
Ile His
Glu Tyr
Ala Ala 200
Ser Ala 215
Asn Ile
Ile Ile
Tyr Val
Gly Tyr 280
Ser Ser 295
Lys Thr
Leu Ser
Gin Tyr
Ile Lys 360
Ala Val
Ile Pro 90
Asp Leu 105
Lys Leu
Lys Gly
Cys Tyr
Arg Asp 170
Cys Ser 185
Glu Asp
Asp Lys
Lys His
Ala Asn 250
Glu Glu 265
Phe Leu
Ser Ser
Gly Tyr
Thr Lys 330
Lys Asn 345
Lys Asp
Tyr Asn
Ser Ser Ser Ser Leu 95
Glu Leu Glu Asp Leu 110
Tyr Tyr Lys Asp Met 125
Leu Leu Asp Tyr Lys 140
Lys Gin Tyr Asn Lys 155
Asn Arg Gin Tyr Asn 175
Pro Gly Tyr Ile Leu 190
Asp Trp Leu Arg Tyr 205
Leu Tyr Thr Phe Glu 220
Leu Arg Val Gly Thr 235
Gly Thr Ser Asn Asn 255
Leu Ile Tyr His His 270
Glu Phe,Phe Glu Thr 285
Glu Trp Val Met Asn 300
Glu Ala Ile Leu Phe 315
Ser Asn Tyr Val Lys 335
Phe Phe Lys Asp Gly 350
Ser Gin Val Ile Asp 365
His Val Thr Tyr Leu
Leu
Asn
Thr
Phe
Lys
160
Ile
Trp
Asp
Phe
Ile
240
Ile
Asn
Thr
Ser
Asp
320
Tyr
Lys
Arg
Met
PL 205 130 B1
370
375
380
Asp Asn Phe Lys Ile Pro Gly Phe Asn Phe Lys Phe 385 390 395
Ser Gly Met Ile 400
Asp Ile Leu Leu Phe Gly Ile Leu His Lys Asp Asn 405 410
Glu Asn Ile Phe 415
Tyr Pro Lys Arg Val Ser Val Thr Asn 420 425
Ile Ile Ser
Glu Ser Ile Tyr 430
Ala Asp Phe Tyr Phe Ile Ser Asp Val Asn Lys Phe 435 440
Ser Lys Arg Ile 445
Glu Tyr Lys Thr Met Phe Pro Ile Leu Ala Glu Asn 450 455 460
Tyr Tyr Pro Lys
Gly Arg Pro Tyr Phe Thr His Thr Ser Asn Glu Asp 465 470 475
Leu Leu Ser Ile 480
Cys Leu Cys Glu Val Thr Val Cys Lys Asp Ile Lys 485 490
Asn Pro Leu Leu 495
Tyr Ser Lys Lys Asp Ile Ser Ala Lys: Arg Phe Ile 500 505
Ser Val Asp Ile Asn Thr Ala Val Glu Leu Arg Gly 515 520 Gly Leu Phe Thr 510
Tyr Lys Ile Arg 525
Val Ile Gly Cys Leu Glu Trp Pro Glu Lys Ile Lys 530 535 540
Ile Phe Asn Ser
Asn Pro Thr Tyr Ile Arg Leu Leu Leu Thr Glu Arg 545 550 555
Arg Leu Asp Ile 560
Leu His Ser Tyr Leu Leu Lys Phe Asn 565
Ile Thr Glu 570
Asp Ile Ala Thr 575
Arg Asp Gly Val Arg Asn Asn 580
Leu Pro 585
Ile Ile Ser
Phe Ile Val Ser 590
Tyr Cys Arg Ser Tyr Thr Tyr 595
Ser Cys Lys Ile Thr Lys Cys 610 615
Lys Leu 600
Leu Asn Cys His Met Tyr Asn 605
Lys Tyr Asn Gin Val Ile Tyr Asn Pro 620
Ile 625
<210> 18
<211> 93
<212> PRT
<213> Sztuczna
<220>
<223> Konstruk
PL 205 130 B1 <400> 18
Met 1 Thr Tyr Pro Arg 5 Arg Arg Tyr Arg Arg 10 Arg Arg His Arg Pro 15 Arg
Ser His Leu Gly Gin Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe
90 <210> 19 <211> 233 <212> PRT <213> Sztuczna <220>
<223> Konstrukt : plazmidowy
<400> 19
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gin Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Thr Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Lys Ile Asp Asp Phe Val
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
PL 205 130 B1
Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gin Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Ala Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp
195 200 205
Gin Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro
225 230 <210> 20 <211> 314 <212> PRT <213> Sztuczna <220>
<223> Konstrukt : plazmidowy
<400> : 20
Met Pro Ser Lys Lys Asn Gly Arg Ser Gly Pro Gin Pro His Lys Arg
1 5 10 15
Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile
20 25 30
Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu
35 40 45
Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gin Gly Phe Ala Asn Phe
50 55 60
Val Lys Lys Gin Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Leu Gly Ala Arg
65 70 75 80
Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gin Gin Asn Lys Glu Tyr
85 90 95
Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser
100 105 110
Gin Gly Gin Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu
115 120 125
Ser Gly Ser Leu Val Thr Val Ala Glu Gin His Pro Val Thr Phe Val
130 135 140
Arg Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met
PL 205 130 B1
145 150 155 160
Gin Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Val Ile Val Gly Pro Pro
165 170 175
Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asp Pro Glu Thr
180 185 190
Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Arg Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly
195 200 205
Glu Glu Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Glu Thr Lys
225 230 235 240
Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn
245 250 255
Gin Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu
260 265 270
Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Ala Thr
275 280 285
Glu Gin Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gin Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro
290 295 300
Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr
305 310
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> Sztuczna
<220>
<223> Oligonukleotydowy starter
<400> 21
atcatcgagc · tcgcggccgc ctatcaaaag tcttaatgag tt 42
<210> 22 <211> 73 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 22 gaattcctcg agctgcagcc cgggttttta tagctaatta gtcatttttt cgtaagtaag 60 tatttttatt taa 73
PL 205 130 B1 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 23 cccgggctgc agctcgagga attcttttta ttgattaact agtcaaatga gtatatataa 60 ttgaaaaagt aa 72 <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 24 gatgatggta ccttcataaa tacaagtttg attaaactta agttg <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 25 catcatcatg atatccgtta agtttgtatc gtaatgacgt atccaaggag gcg <210>
<211>
<212>
<213>
DNA
Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 26 tactactacg tcgacttagg gtttaagtgg ggggtc <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Sztuczna <220>
<223> Oligonukleotydowy starter <400> 27 catcatcatg tcgacatgac gtatccaagg aggcg
PL 205 130 B1
PL 205 130 B1

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zastosowanie kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych świń, znamienne tym, że kompozycja szczepionkowa obejmuje farmaceutycznie lub weterynaryjnie dopuszczalny nośnik i/lub podłoże i/lub zaróbkę i/lub adiuwant, i immunogen PCV-2, przy czym immunogenem PCV-2 jest inaktywowany PCV-2, lub immunogenem PCV-2 jest atenuowany PCV-2, lub immunogen PCV-2 może być wyrażany z wektora obejmującego fragment DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą ORF4 i/lub ORF13 z PCV-2.
  2. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że wektorem jest wektor ekspresyjny i jest wybrany z grupy składającej się z plazmidowego DNA, E.coli, bakulowirusów, wirusów herpes, wirusa choroby Aujeszkiego, świńskich adenowirusów, wirusów ospy, wirusa krowianki, wirusa ospy ptasiej, wirusa ospy kanarków i wirusa ospy świń.
    PL 205 130 B1
  3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wektorem jest plazmidowy wektor DNA.
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienne tym, że wektor zawiera i wyraża ORF13 z PCV-2 lub ORF4 i ORF13 z PCV-2.
    Rysunki
    FIGURA 1
    SEQ ID No. 1 aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60 ccccctcctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttctga ctgtggttcg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg ccgagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccccata aaaggtgggt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 gacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 660 aacagatcag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc aacttactga tggagtgtgg 720 agctcctaga tctcagggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagactaa 900 tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccctgggatg atctactgag 1080 actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140 ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200 cccagctgta gaagctcttt atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380 taagggttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca 1440 cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacgtgg 1500 tctacatttc cagcagtttg tagtctcagc cacagctggt ttcttttgtt gtttggttgg 1560 aagtaatcaa tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag 1620 aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggtgagggct 1680 gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac tcccctgtca 1740 ccctgggtga tcggggagca gggccag 1767
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2
    SEQ ID No. 2 aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gcacagagcg ggggtttgag 60 ccccctcctg ggggaagaaa gtcattaata ttgaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttttga ctgtggttcg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccagcggtaa cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatatctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccccata aaaggtgggt gttcactctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggatc ttccaatatc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg taaagaagga 600 gacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagcgaaagg 660 aacagatcag cagaataaag aatactgcag taaagaaggc aacttactga tggagtgtgg 720 agctcctaga tctcagggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagactaa 900 tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccctgggatg atctactgag 1080 actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttggc 1140 ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200 cccagctgta gaagctcttt atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380 taagggttaa gtggggggtc tttaagatta aattctctga attgtacata catggttaca 1440 cggatattgt attcctggtc gtatatactg ttttcgaacg cagtgccgag gcctacgtgg 1500 tctacatttc cagtagtttg tagtctcagc cacagctgat ttcttttgtt gtttggttgg 1560 aagtaatcaa tagtggaatc taggacaggt ttgggggtaa agtagcggga gtggtaggag 1620 aagggctggg ttatggtatg gcgggaggag tagtttacat aggggtcata ggtgagggct 1680 gtggcctttg ttacaaagtt atcatctaga ataacagcac tggagcccac tcccctgtca 1740 ccctgggtga tcggggagca gggccag 1767
    PL 205 130 B1
    FIGURA 3
    SEQ ID No. 3 aattcaacct taaccttttt tattctgtag tattcaaagg gtatagagat tttgttggtc 60 ccccctcccg ggggaacaaa gtcgtcaata ttaaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttctga ctgtggtagc cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccaacggtag cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctgeg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatagctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccacata aaaggtgggt gttcacgctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggagc tcccaatctc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 aacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagccaaagg 660 aactgatcag cagaataaag aatattgcag taaagaaggc aacttactta ttgaatgtgg 720 agctcctcaa tctcaaggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagaccaa 900 tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccgtgggatg atctactgag 1080 actgtgtgat cgatatccat tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cttttttgtc 1140 ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200 cccagctata gaagctctct atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380 ttagggttta agtggggggt ctttaagatt aaattctctg aattgtacat acatggttac 1440 acggatattg tagtcctggt cgtatatact gttttcgaac gcagtgccga ggcctacgtg 1500 gtccacattt ctagaggttt gtagcctcag ccaaagctga ttccttttgt tatttggttg 1560 gaagtaatca atagtggagt caagaacagg tttgggtgtg aagtaacggg agtggtagga 1620 gaagggttgg gggattgtat ggcgggagga gtagtttaca tatgggtcat aggttagggc 1680 tgtggccttt gttacaaagt tatcatctag aataacagca gtggagccca ctcccctatc 1740 accctgggtg atgggggagc agggccag 1768
    PL 205 130 B1
    FIGURA 4
    SEQ ID No. 4 aattcaacct taacctttct tattctgtag tattcaaagg gtatagagat tttgttggtc 60 ccccctcccg ggggaacaaa gtcgtcaatt ttaaatctca tcatgtccac cgcccaggag 120 ggcgttgtga ctgtggtacg cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcgggtgttg 180 aagatgccat ttttccttct ccaacggtag cggtggcggg ggtggacgag ccaggggcgg 240 cggcggagga tctggccaag atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctgcg gtaacgcctc 300 cttggatacg tcatagctga aaacgaaaga agtgcgctgt aagtattacc agcgcacttc 360 ggcagcggca gcacctcggc agcacctcag cagcaacatg cccagcaaga agaatggaag 420 aagcggaccc caaccacata aaaggtgggt gttcacgctg aataatcctt ccgaagacga 480 gcgcaagaaa atacgggagc tcccaatctc cctatttgat tattttattg ttggcgagga 540 gggtaatgag gaaggacgaa cacctcacct ccaggggttc gctaattttg tgaagaagca 600 aacttttaat aaagtgaagt ggtatttggg tgcccgctgc cacatcgaga aagccaaagg 660 aactgatcag cagaataaag aatattgcag taaagaaggc aacttactta ttgaatgtgg 720 agctcctcga tctcaaggac aacggagtga cctgtctact gctgtgagta ccttgttgga 780 gagcgggagt ctggtgaccg ttgcagagca gcaccctgta acgtttgtca gaaatttccg 840 cgggctggct gaacttttga aagtgagcgg gaaaatgcag aagcgtgatt ggaagaccaa 900 tgtacacgtc attgtggggc cacctgggtg tggtaaaagc aaatgggctg ctaattttgc 960 agacccggaa accacatact ggaaaccacc tagaaacaag tggtgggatg gttaccatgg 1020 tgaagaagtg gttgttattg atgactttta tggctggctg ccgtgggatg atctactgag 1080 actgtgtgat cgatatccat. tgactgtaga gactaaaggt ggaactgtac cctttttggc 1140 ccgcagtatt ctgattacca gcaatcagac cccgttggaa tggtactcct caactgctgt 1200 cccagctgta gaagctctct atcggaggat tacttccttg gtattttgga agaatgctac 1260 agaacaatcc acggaggaag ggggccagtt cgtcaccctt tcccccccat gccctgaatt 1320 tccatatgaa ataaattact gagtcttttt tatcacttcg taatggtttt tattattcat 1380 ttagggttta agtggggggt ctttaagatt aaattctctg aattgtacat acatggttac 1440 acggatattg tagtcctggt cgtatttact gttttcgaac gcagcgccga ggcctacgtg 1500 gtccacattt ccagaggttt gtagtctcag ccaaagctga ttccttttgt tatttggttg 1560 gaagtaatca atagtggagt caagaacagg tttgggtgtg aagtaacggg agtggtagga 1620 gaagggttgg gggattgtat ggcgggagga gtagtttaca tatgggtcat aggttagggc 1680 tgtggccttt gttacaaagt tatcatctag aataacagca gtggagccca ctcccctatc 1740 accctgggtg atgggggagc agggccag 1768
    PL 205 130 B1
    FIGURA 5
    SEQ ID No. 5 aattcatatt tagcctttct aatacggtag tattggaaag gtaggggtag ggggttggtg 60 ccgcctgagg gggggaggaa ctggccgatg ttgaatttga ggtagttaac attccaagat 120 ggctgcgagt atcctccttt tatggtgagt acaaattctg tagaaaggcg ggaattgaag 180 atacccgtct ttcggcgcca tctgtaacgg tttctgaagg cggggtgtgc caaatatggt 240 cttctccgga ggatgtttcc aagatggctg cgggggcggg tccttcttct gcggtaacgc 300 ctccttggcc acgtcatcct ataaaagtga aagaagtgcg ctgctgtagt attaccagcg 360 cacttcggca gcggcagcac ctcggcagcg tcagtgaaaa tgcoaagcaa gaaaagcggc 420 ccgcaacccc ataagaggtg ggtgttcacc cttaataatc cttccgagga ggagaaaaac 480 aaaatacggg agcttccaat cteccttttt gattattttg tttgcggaga ggaaggtttg 540 gaagagggta gaactcctca cctccagggg tttgcgaatt ttgctaagaa gcagactttt 600 aacaaggtga agtggtattt tggtgcccgc tgccacatcg agaaagcgaa aggaacogac 660 cagcagaata aagaatactg cagtaaagaa ggccacatac ttatcgagtg tggagctccg 720 cggaaccagg ggaagcgcag cgacctgtct actgctgtga gtaccctttt ggagacgggg 780 tctttggtga ctgtagccga gcagttccct gtaacgtatg tgagaaattt ccgcgggccg 840 gctgaacttt tgaaagtgag cgggaagatg cagcagcgtg attggaagac agctgtacac 900 gtcatagtgg gcccgcccgg ttgtgggaag agccagtggg cccgtaattt tgctgagcct 960 agggacacct actggaagcc tagtagaaat aagtggtggg atggatatca tggagaagaa 1020 gttgttgttt tggatgattt ttatggctgg ttaccttggg atgatctact gagactgtgt 1080 gaccggtatc cattgactgt agagactaaa gggggtactg ttcctttttt ggcccgcagt 1140 attttgatta ccagcaatca ggccccccag gaatggtact cctcaactgc tgtcccagct 1200 gtagaagctc tctatcggag gattactact ttgcaatttt ggaagactgc tggagaacaa 1260 tccacggagg tacccgaagg ccgatttgaa gcagtggacc caccctgtgo ccttttccca 1320 tataaaataa attactgagt cttttttgtt atcacatcgt aatggttttt atttttattt 1380 atttagaggg tcttttagga taaattctct gaattgtaca taaatagtca gccttaccac 1440 ataattttgg gctgtggctg cattttggag cgcatagccg aggcctgtgt gctcgacatt 1500 ggtgtgggta tttaaatgga gccacagctg gtttcfttta ttatttgggt ggaaccaatc 1560 aattgtttgg tccagctcag gtttgggggt gaagtacctg gagtggtagg taaagggctg 1620 ccttatggtg tggcgggagg agtagttaat ataggggtca fcaggccaagt tggtggaggg 1680 ggttacaaag ttggcatcca agataacaac agtggaccca acacctcttt gattagaggt 1740 gatggggtct ctggggtaa 1759
    PL 205 130 B1
    FIGURA 6
    SEQ ID No. 6 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60 agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120 cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180 ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240 ttgtgaagaa kcaaactttt aataaagtga agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300 agaaagccaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360 ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420 gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480 tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540 attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600 ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660 atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720 atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780 tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840 cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900 ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960 catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtcyt ttttatcact tcgtaatggt 1020 ttttattatt catttagggg ttaagtgggg ggtctttaag attaaattcc ctgaattgta 1080 catacagggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140 cgaggcctac gtggtccaca tttctagagg tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200 tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260 gggagtggta ggagaagggt tgggggattg tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320 catatgtttg ggctgtggcc tttggtacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc 1380 ccactcccct atcaccctgg gtgatggggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440 ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500 agtcgtcaat tttaaatctc atcatgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtac 1560 gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620 tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680 gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc ggtaacgcct ccttggatat gtcatagctg 1740 aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
    PL 205 130 B1
    FIGURA 7
    SEQ ID No. 7 accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agaaagccaa aggaactgat cagcagaata ttattgaatg tggagctcct cgatctcaag gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga tcagaaattt ccgcgggctg gctgaacttt attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ctgctaattt tgcagacccg gaaaccacat atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta atgatctact gagactgtgt gatcgatatc tacctttttt ggcccgcagt attctgatta cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc ggaagaatgc tacagaacaa tccacggagg catgccctga atttccatat gaaataaatt ttttattatt catttagggg ttaagtgggg catacatggt tacacggata ttgtagtcct cgaggcctac gtggtccaca tttctagagg tgttatttgg ttggaagtaa tcaatagtgg gggagtggta ggagaagggt tgggggattg cataggttag ggctgtggcc tttggtacaa ccactcccct atcaccctgg gtgatggggg ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga agtcgtcaat tttaaatctc atcatgtcca gcttgacagt atatccgaag gtgcgggaga tccaacggta gcggtggcgg gggtggacga gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctgc aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60 ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120 agctcccaat ctccctattt gattatttta 180 gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240 agtggtattt gggtgcccgc tgccacatcg 300 aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360 gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420 ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480 tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540 ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600 actggaaacc acctagaaac aagtggtggg 660 ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720 cattgactgt agagactaaa ggtggaactg 780 ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840 tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900 aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960 actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020 ggtctttaag attaaattct ctgaattgta 1080 ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140 tttgtagcct cagccaaagc tgattccttt 1200 agtcaagaac aggtttgggt gtgaagtaac 1260 tatggcggga ggagtagttt acatatgggt 1320 agttatcatc tagaataaca gcagtggagc 1380 agcagggcca gaattcaacc ttaacctttt 1440 ttttgttggt cccccctccc gggggaacaa 1500 ccgcccagga gggcgttgtg actgtagtac 1560_ ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc 1620 gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680 ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740
    1768
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.1A
    Hindlll (1)
    1. AAGCTTCTATCAAAAGTCTTAATGAGTTAGGTGTAGATAGTATAGATATTACTACAAAGGTA.TTCATATT
    71 TCCTATCAATTCTAAAGTAGATGATATTAATAACTCAAAGATGATGATAGTAGATAATAGATACGCTCAT
    1 4 ATAATGACTGCAAATTTGGACGGTTCACATTTTAATCATCACGCGTTCATAAGTTTCAACTGCATAGATC
    211 AAAATCTCACTAAAAAGATAGCCGATGTATTTGAGAGAGATTGGACATCTAACTACGCTAAAGAAATTAC
    2 Β1 AGTTATAAATAATACATAATGGATTTTGTTATCATCAGTTATATTTAACATAAETACAATAAAAAGTATT
    351 AAArAAAAATACTTACTTACGAAAAAATGTCATTATTACAAAAACTAIATnTACAGAACAATCTATAGT l'Met Ser LeuLeuGI nLysLeuTy rPheThr Gl uGI nSer 11 eVa
    421 AGAGTCCTTTAAGAGTTATAATTTAAAAGATAACCATAATGTAATATTTACCACATCAGATGATGATACT 15> I Gl uSer PheLysSer TyrAsnLeuLysAspAsnHi sAsnVal 11 ePheThi Thr SerAspAspAspThr
    491 GTTGTAGTAATAAATGAAGATAATGTACrGTTATCTA.CAAGATTATTATCATTTGATAAAATTCTGTTTT 39' Val Val Val I I eAsnGI uAspAsnVal LeuleuSerThf ArgLeuLeuSer PheAspLysI 1 eLeuPheP
    561 TTAACTCCTTTAATAACGGTrTATCAAAATACGAAACTATTAGTGATACAiłTASTAGATATAGATAOTCA 62► heAsnSer PheAsnAsnGI yLeuSer LysTy rGI uThr 11 eSerAspThr 11 eLeuAsp 11 eAspThr Hi
    631 TAATTATTATATACCTAGTTGTTCTTCTTTGTTA.GATATTCTAAAAAAAAGAGCGTGTGATTTAGAATrA 85' sAsnTy rTy r I I eProSer Ser Ser Ser LeuLeuAspl I eLeuLysLysArgAl aCysAspLeuGI uLeu
    701 GAAGAT-CIAAATTATGCGTTAATAGGAGACAATAGTAACTTA.TATTATAAAGATATGACTTACATGAATA 109' Gl uAspLeuAsnTyr Al aLeul I eGI yAspAsnSerAsnLeuTy rT yrlysAspMetThr TyrMetAsnA
    771. ATTGGTTATTTACTAAAGGATTATTAGArrACAAGTTTGTATTATTGCGCGATGTAGATAAATGTTACAA 132' snT rpLeuPheThr LysGI yLeuLeuAspTy rLysPheVal LeuLeuArgAspValAspLysCysTyrLy
    Nrut (880) - Ndel (901)
    841. ACAGTATAATAAAAAGAATA.CTATAATAGATATAATACATCGCGATAACAGACAGTATAACATATGGGTT 155' sGI nTyrAsnLysLysAsnThr 11 el I eAsp 11 el I eHi sArgAspAsnArgGI nTyrAsnl I eT rpVal
    913 AAAAATGTTATAG^JACTGTTCTCCTGGCTATATATTATGGTTACATGATCTAAAAGCCGCTGCrGAAG 179 ► LysAsnVa I 11 eGI uTyrCysSer ProGI yTy r 11 eleuT rpLeuHi sAspLeuLysAl aAI a Al aGl uA
    9 81 ATGATTGGrTAAGATACGATAACCGTATAAACGAATTATCTGCGGATAAATTATACACTTTCGAGlTCAT 202' spAspT rpLeuArgTyrAspAsnArg 11 eAsnGI uLeuSer Al aAspLysLeuTyrThr PheGI uPhel I
    1051 AGTTATATTAGAAAATAATA.TAAAACATTTACGAGTAGGTACAATAATTGTACATCCAAACAAGATAATA 225' eVa I 11 eLeuGI uAsnAsnl I eLysHi sLeuArgVal Gl yThr 11 el I eVat Hi sProAsnLysI I el I e
    1121 GCTAATGGTACJ^rCTAATAATATACTTACTGArTTTCTATCTTACGTAGAAGAACTAATATATCATCATA 249'Al aAsnGl yThr SerAsnAsnl l eLeuThrAspPheLeuSer T yrVa I Gl uGI uLeul I eTy rHi sHi sA
    EcoRI (1223)
    1191 ATTCATCTATAATATTGGCCGGATATTTTTTAGAMlTCTTTGAGACCACTATTTTATCASAATTTAnTC 272' snSer Serl leli eLeuAl aGlyTyrPneLeuGl uPhePheGI uThrThr 11 eLeuSer Gl uPhel I eSe
    1261 TTGATCTTCTGAATGGGTAATGAATAGTAACTGTTTAGTACACCTGAAAACAG33TA.TGAA&CTATACTC 295' r Ser Ser Ser Gl uT rpVa IMelAsnSer AsnCysLeuVa 1 Hi sLeuLysThr Gl yTyrGI uAl al I eLeu
    1331 TTTGATGGTAGTTTA.TTmCCAACTCTGTACTAAAAGCAAlTA.TGTAAAATATTGGACAAAGAAAACTr 319' PheAspAI aSer LeuPhePheGI nLeuSer Thr LysSerAsnTyrVa I LysTy rT rpThr LysLysThr L
    1401 TGCAGTATAAGAACITrTTTAAAGACGGTAAACAGTrAGCAAAATATATAATTAAGAAAGATAGTCAGGT 342' euGI nT yrLysAsnPhePheLysAspGI y LysGI nLeuAlalysTy r I leli eLysLysAspSer Gl nVa
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.1B
    1473 GATAGATAGAGTATGTTATTTACACGCAGCTGTATATAATCACGTAACTTACTTAATGGATACGTTTAAA 365> I 11 eAspArg Va I CysTy rLeuHi sAl aAI aVa 1 Tyr AsnHi sVa I Thr Ty rLeuMetAspThr Phelys
    1541 attcctggttttgattttaaattctccggaatgatagatatactactgtttggaata^gcataaggata
    389» I I eProGI yPheAspPhelysPheSer Gl yMet 11 eAsp I I eLeuLeuPheGI y 11 eLeuHi sLysAspA
    1611 ATGAGAATATATTTTATCCGAAACGTGTTTCTGTAACTAATATAATATCAGAATCTATCTATGCAGAITr 412» snGI uAsnl I ePheT y rP roLys ArgVal Ser Va I Thr Asn I leli eSer Gl uSer 11 eTyr Al aAspPb
    1681 TTACTrTATATCAGATGTTAATAAATTCAGTAAAAAGATAGAATATAAAACTATCTrrCCTPTACTCGCA 435» eT y rPhe 11 eSer AspVa I AsnLysPheSer LysLys 11 eGI uTyrLysThr Met PheProŃ eLeuAI a
    1751 GAAAAOTACTATCCAAAAGGAAGGCCCTATTTTACACATACATCTAACGAAGATCTTCTGTCTATCTGTT 459» Gl uAsnTy rTy rProlysGI yA rgProTyrPheThr Hi sThr SerAsnGI uAspLeuLeuSer I I eCysL
    1821 TATGCGAAGTAACAGTTTGTAAAGATAIAAAAAATCCATTATTATATTCTAAAAAGGATATOTCAGCAAA 482» euCysGI uValThr Val CysLysAspl I eLysAsnProLeuLeuTyrSer LysLysAspl I eSer Al aLy
    1893 ACGATTCATAGGTTTATTTACATCTCTCGATATAAATACGGCTGTTGAGTTAAGAGGATATAAAATAAGA 505» sArgPhe I I eGI yLeuPheThr Ser ValAspl I eAsnThr Al aVal Gl uLeuArgGi yTy rLys 11 eArg
    1961 gtaataggatgtttagaatggcctgaaaagataaaaatatttaattctaatcctacatacattagattat
    529» Va I 11 eGI yCysLeuGl uT rpProGi uLys 11 eLys 11 ePheAsnSerAsnProThr Tyrl I eArgleuL
    2031 TACTAACAGAAAGACGTTTAGATArrCTACATTCCTATCTGCrTAAATrTAATATAACAGAGGATATAGC 552 euLeuThr Gl uArgArgLeuAspl I eLeuHi sSer TyrLeuleuLysPheAsnl I eThr Gl uAspl I eAI
    2101 TACCAGAGAIGGAGTCAGAAATAAOTACCTATAATITCITTTATCGTCAGTTAffTGTAGArCGTATacr 575» aThrArgAspGI yVaiA rgAsnAsnLeuProl leli eSer Phel I eVal Ser TyrCysArgSer TyrThr
    Ndel (2169)
    2171 TATAAATTACTAAATrGCCATATCTAĆAATTCGTGTAAGATAACAAAGTGTAAAlATAATCAGGTAATAT 599 TyrLysLeuLeuAsnCysHi sMelTyrAsnSer CysLys 11 eThr LysCysLysTyrAsnGI nVal 11 eT
    2241 ATAATCCTATATAGGAGTATATATAiJTGAAAAAGTAAAATATAAATCAIATAATAAIGAAACGAAATAT 622»yrAsnProl I e* · ·
    2311 CAGTAATAGACAGGAACTGGCAGATTCTTOTCTAATGAAGTAAGTACTGCTAAATCTCCAAAATTAGAr 2381 AA&AATGATACAGCAAATACAGCTTCATTCAACGAArTACCTTTTAATTTTTTCAGACACACCTTATrAC 245.1 AAACTAACTAAGTCAGATGATGAGAAAGTAAATATAAATTTAACTTATGGGTAZAATATAATAAAGATTC 2521 ATGATATTAATAATTTACTTAACGATGTTAATAGACTTATTCCATCAACCCCTTCAAACCTTTCTGGATA 2591 ITATAAAATACCAGTTAATGATATTAAAATAGATTGTTTAAGAGATGTAAATAArTATTTGGAGGTAAAG 2661 <»TATAAAOTAGTCTATCTTTCACATGGAAATGAATTACCTAATArrAATAAlTATGATAGGAATmT 2731 TAGGATTTACAGCTGTOATATGTATCAACAATACAGGCAGATCTATGGTTATGGTAAAACACTGTAACGG 2801 GAAGCAGCAITCTATGGTAACTGGGCTATGITrAATAGCa^GATCAlTTTACTCTAJAAACATTTTACCA
    BamHI (2880)
    2871 CAAATAAIAGGATCCTCTAGATATTTAArATTATATCTAACAACAACAAAAAAAITTAACGATGTATGGC 2941 CAGAAGTATTTTCTACTAATAAAGATAAAGATAGTCTA.TCTTATCTACAAGATATGAAAGAAGATAATCA 301. TTTAGTACTAGOTACTAATATGGAAAGAAATGTATACAAAAACGTGGAAGCmTATATTAAATAGCATA 2 081 TTACTAGAAGATTTAAAATCTAGACTTAGTATAACAAAACAGTTAAATGCCAATATCGATTCTATATTTC
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.1C
    3153 ATCATAACAGTAGTACATTAATCAGTGATATACTGAAACGATCTACAGACTCAACTATGCAAGGAATAAG 322:. CAATATGCCAATTATGTCTAATATTTTAACTTTAGAACTAAAACGTTCTACCAATACTAAAAATAGGATA 3291 CGTGATAGGCTGTTAAAAGCTGCAATAAATAGTAAGGATGTAGAAGAAATACTTrGTTCTATACCTTCGG 3361 AGGAAAGAACTTTAGAACAACTTAAGTTTAATCAAACTTGTATTrATGAACACTATAAAAAAATrATGGA 3433. AGATACAAGTAAAAGAATGGATGTTGAATGTCGTAGTTTAGAACATAACTATACGGCTAAOTTATAIAAA 3503. GTGTACGGACAAAACGAATATATGATTACTTATATACTAGCTCTCATAAGTAGGATTAATAATA1TATAG 3573 AAACTTTAAAATATAATCTGGTGGGGCTAGACGAATCTACAATACGTAATiiTAAATTATATAATTTCACA 3643 AAGAACAAAAAAAAATCAAGTTTCTAATACCTTAIAGATAAACTArATTTlTTACCACTGA
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.3
    Kpnl (l)
    1 GGTACCTrCATAAATACAAGTITGATTAAACTTAAGTTGTTCTAAAGTTCTTTCCTCCGAAGGTATAGAA 71 CAAAGTATTTCTTCTACATCCTTACTATTTATTGCAGCTTTTAACAGCCTATCACGTATCCTATTTITAG 141 TATTGGTAGAACGTTTTAGTTOTAAAGTTAAAATATTAGACATAATTGGCATA1TGCTTA.TTCCTTGCAT 211 agttgagtctgtagatcgtttcagtatatcactgattaatgtactaotgttatgatgaaatatagaatcg 281 atattggcatttaactgttttgttatactaagtctagattttaaatcttctagtaatatgctatttaata
    351 TAAAAGL-iuCCACGlTnu-uTATAGAli-icinnCCATATTAGTAGCTACTACTAAATGATTATCTTCTrr
    421. CATATCTTGTAGATAAGATAGACTATCTTTATCTTTATTAGTAGAAAATACTTCTGGCCATACATCGTTA _ BamHI (532)
    491.---------------561 TAGAGTAAAATGATCTGGCTATTAAACATAGGCCAGTTACCATAGAATGCrGCTrCCCGTTACAGTGTrT 631 TACCATAACCATAGATCTGCCTGTATTG7TGATACATATAACAGCTGTAAATCCTAAAAAATTCCTATCA 702 TAATTATIAATAITAGGTAATTCATTTCCATGTGAAAGATAGACTAATmATArCCTTTACCTCCAAAT 772 ^ITATTTACATCTCTTAAAaiArCTATTrrAATATCATTAACTGGTAaTrrAIAATATCCAGAAAGGTT 841 TGAAGGGG7TGATGGAATAAGTCTA2TAACATCGTTAAGTAAATTATTAATATCATGAA.TCTTTATTATA 911 TTATACCCArAAGTTAAATTTATATTTACTTTCTCATCATCTGACTTAGTOAGTTTGTAATAAGGTGTGT 981 CTGmAAAAATTAAAAGGTAATTCGTTGAATGAAGCTGTATTTGCTGTA.TCATTITTATCTAATTTTGGAG 1051 ATTTAGCAGTACTTACTTCATrAGAAGAAGAATCTGCCAGTTCCTGTCTATTACTGATATTTCGTTTCAT _ _ EcoRl (1
    1121. TATTATATGATTTATATTTTACTTTTTCAATTATATAIACTCATTTGACTAGTTAATCAATAAAAAGAAT 1191 TCCTGCAGCCCTGCAGCTAAITAATTAAGCTACAAATAGTTiCGmTCACCTTGTCTAATAACTAAraA
    BamHI (1266)
    12 61 ATTAAGGATCCCCCAGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTdTGAGGGTT EcoRV (1378) . Nrul (1374)
    1331 GTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTrCATTATCGCGATATCOGTTAAGTTTGTATCGT
    1401 AATGACG1ATCCAAGGAGGCGTTACCGCAGAAGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTC 1> Met Thr Ty rProArgArgArgTyrArgArgArgArgHi sArgProArgSer Hi sLeuGI yGI ni I eLeu
    1471 CGCCGCCCCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACA 24> ArgArgArgProT rpLeuVal Hi sProArgHi sArgTyrArgT rpArgArgLysAsnGI y I i ePheAsnT
    1541 CCCGCC7CTCCCGGACCTTCGGATATA.CTGTCAAGCGTACCACAGTCACAACGCCCTCCTGGGCGGTGGA 471» hr ArgLeuSerArgThr PheGI yTyrThrVa I LysArgThrThr VaIThrThr ProSerTrpAi aValAs
    Smal (1644)
    1611 CATGATGAGATT?AAAATTGACGACmGTTCCCCCGGGAGGGGGGACCAACAAAATCTCTA.TACCCm 701 pMetMetArgPheLys I1 eAspAspPheVa I ProProGl yGI yGI yThrAsnlys I I eSer 11 eProPhe
    PL 205 130 B1
    EeoRV (274 B) Ncol (2671)
    FIGURA 2.4 pnl (653)
    PES-SK+ lamHI (1184) pJP105 (5619 bp)
    Prawe ramie C6
    EcoRI (1839) BamHI (1916)
    Nrul (2026) EcoRV (2030) Sacl (2153)
    Bell (2320) Sacl (2376)
    Sacl (3410)· Notl (3402)·
    Smal (3005) Sali (2999) Ndel (2979)
    PL 205 130 B1
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.6A
    Kpnl (1)
    1 ggtaccttcataaatacaagtttgattaaacttaagttgttctaaagttctttcctccgaaggtatagaa 71 CAAAGTArrTCTTCTACATCCTTJO-ArrrArrGCAGCTTlTAACAGCCTATCACGTATCCTAITTrrAG 141 TATTGGTAGAACGTrrTAGTTCTAAAGTTAAAATATTAGACATAATTGGCATATrGCTTATTCCTTGCAT
    211 AGTTGAGTCTGTAGATCGTTTCAGTATATCACTGATTAATGTACTACTGTrATGKTGAAATATAGAATCG 281 ATATTGGCATTTAACTGTTOTGTTATACTAAGTCTAGATmAAATCTTCTAGTAAIATGCTATTTAATA 351 AAAAGCTTCCACGTTTTTGTATACATTTCTTTCCATATTAGTAGCTACTACTAAATGATTATCTTCTTT 421 CATATCTTGTAGATAAGATAGACTATCTTTATCTTTATTAGTAGAAAATACTTCTGGCCATACATCGTTA _ BamHI (532)
    491 AATrTTTTTGTTGTTGTTAGATATAATATTAAATATCTAGAGGATCCTATTATTTGTGGTAAAATGTTTA 562 TAGAGTAAAATGATCTGGCTAOTAAACATAGGCCAGTTACCATAGAATGCTGCTTCCCGTTACAGTGTTT 631 TACa^AACCATAGATCTGCCTGTATTGTTGATACATAIAACAGCTGTAAATCCTAAAAAAITCCTATCA 703 TAATTATIAATA2TAGG33WOTC3OTTCCAIGTGAAAaA3AGACTAATTTiaTKrCCrrTACCTCCAA»r 772 AATTA.TTTACA.TCTCTTAAACAATCTAUTnTAArATCATTAACTGGTATnTATAAirATCCAGAAAGGTT 841 TGAAGGGGTTGATGGAATAAGTCTAOTAACATCGlTAAGTAAATTATTAATATCATGAATCTTTATTArA 911 TTA.TACCCATAAG7TAAATTTATA.TTTACITTCTCATCATCTGACTTAGrXAGTTTGTAATAAGGTGTGT 981 CTGAAAAiA.TTAAAAGGTAATTCGTIGAATGAAGCTGTATITGCTGTATCATTTTTATCTAArTTTGGAG
    1121 TArTArATGArTTATATrrTACrrrTrCAATTATATArACTCATTrGACTAGTTAATCAATAAAAAGAAT
    1191 TTCGACTTAGGGTrrAAGTGGGGGGTCTTTAAGATTAAATTCTCTGAATrGTACATACATGGTTACACGG 223< P roLysLeuProProAspLysLeuAsnPheGI uArgPneGl nValTyrMetThr ValA rg I
    Stut (1306)
    1261 ATATTGTAGTCCTGGTCGTATTTACTGTrrrCGAACGCAGCGCCGAGGCCTACGTGGTCCACATTTCCAG
    212 < I eAsnTyrAspGl nAspT yrlysSerAsnGI uPheAl aAI aGI yLeuGI yVal Hi sAspYalAsnGI ySe ” 1894 r Thr Gl nLeuArgLeuT rpLeuGI nAsnArgLysAsnAsnProGI nPheTyrAspl l eThr SerAspLeu
    1401 aacaggtitgggtgtgaagtaacgggagtggtaggagaagggttgggggattgtatggcgggaggagtag
    166< Val ProLysProTnr PheTyrArgSer Hi sTyrSer PheProGI nProli eThr Hi sArgSer Ser Tyr A Ndel (1475)
    1471 TTTACATATGGGTCATAGGTTAGGGCTGTGGCCTTTGTTACAAAGTTATCA3GTAGAATAACAGCAGTGG 142 < snVat Ty rProAspTyrThr LeuAI aThr Al aLysThr Val PheAsnAspAspLeu l I eVal At aThr Se
    EcoRI (1584)
    1541 AGCCCAerCCCCTATCACCCTGGGTGATGGGGGAGCAGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTrCTTATTCT 1194 t Gl yVa I Gl yA rgAspGI yGI nThr 11 eProSer CysProT rpPheGl uVal LysVa I Lys Arg 11 eArg
    Smal (1651)
    1611 gtagtattcaaagggtatagagattttgttggtcccccctcccgggggaacaaagtcgtcaattttaaat
    964TyrTyrGluPheProi leSer 11 eLysAsnThr Gl yGI yGIyProProVaI PheAspAspI I eLysPheA
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.6B
    16 8 _ CTCA.TCATGTCCACCGCCCAGGAGGGCGTTGTGACTGTGGTACGCTTGACAGTATATCCGAAGGTGCGGG 72<r gMelMetAspValAI aT rpSer PtoThr Thr Val Thr Thr ArglysVal Thr Ty rGI yPheThr ArgSe
    1751 agaggcgggtgttgaagatgccatttttccttctccaacggtagcggtggcgggggtggacgagccaggg
    4?« r LeuArgThrAsnPhel I eGI yAsnLysArgArgT rpArgTyrArgHi sArgP roHi sVa I LeuT rpPro
    1821 gcggcggcggaggatctggccaagatggctgcgggggcggtgtcttcttotgcggtaacgcctccttgga
    24 A rgArgArgLeu I I eGI nGI yLeuHi sSer A rgProArgHi sArgArgArgArgTyrArgArgArgProT
    Nrul (1821)
    EcoRV (1917)
    1893 TACGTCATrACGATACAAACTTAACGGATATCGCGATAATGAAATAATTTATGATTATTTCTCGCTTOCA y rThrMet
    1961 ATTTAACACAACCCTCAAGAACCTTTGTA3TOATTTTCACTTTTTAAGTATAGAATAAAGAAGCTGGGGG 2031
    BamHI (2112)
    2101 TAATTAATTAAGGATCCCCCAGCTrCTTTATTCTATACTTAAAAAGTSAAAATAAArACAAAGGTTCTTG
    EcoRV (2224)
    Nrul (2220)
    2171 AGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGAIATCCGTrAACTTTG
    2241 TATCGTAATGCCCAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGACCCCAACCKCATAAAAGGTGGGTGTTCACGCTG l>Me1 ProSer LysLysAsnGI yArgSer GlyProGI nProHi sLysArgT rpVal PheThrLeu
    Sacl (2347)
    2311 AATAATCCTTCCGAAGACGAGCGCAAGAAAATACGGGAGCTCCCAATCTCCCTA.TTTGATTA.TTTTATTG 21 > AsnAsnProSer Gl uAspGI uArgLysLys I I eArgGI uLeuProl I eSer LeuPheAspTyrPhel I eV
    2383 TTGGCGAGGAGGGTAATGAGGAAGGACGAACACCTCACCTCCAGGGGTTCGCTAATTTTGTGAAGAAGCA 45» al Gl yGI uGl uGI yAsnGI uG! uGI yA rgThr ProHi sLeuGI nGI yPheAl aAsnPheVal LysLysGI _ Bell (2514)
    2453 aacttttaataaagtgaagtggtatttgggtgcccgctgccacatcgagaaagccaaaggaactgatcag
    68> nThr PheAsnLysValLysT rpTyrLeuGlyAI a Arg CysHisI I eGI uLysAl aLysGI yThrAspGI n
    Sacl (2570)
    2523 CAGAATAAAGAATArTGGAGTAAAGAAGGCAACTTACTTATTGAATGTGGAGCTCCTCGATCTCAAGGAC 92» Gl nAsnLysGl uTyrCysSer LysGI uGI yAsnLeuLeul 1 eGI uCysGI yAl aProArgSer Gl nGI yG
    2591 AACGGAGTGACCTGTCTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGAGAGCGGGAGTCTGGTGACCGTTGCAGAGCA 115»InArgSerAspLeuSer Thr AlaVal Ser Thr LeuLeuGl uSer Gl ySer LauVa I Thr Va I AlaGI uGI
    2661 GCACCCTGTAACGTTTGTCAGAAATTrCCGCGGGCTGGCTGAACmTGAAAGTGAGCGGGAAAATGCAG 138» nHisProValThr PheValArgAsnPheArgGlyLeuAI aGI uLeuLeuLysVal Ser Gl yLysMetGI n
    2731 AAGCGTGATTGGAAGACCAATCTACACGTCATTGTGGGGCCACCTGGGTGTGGTAAAAGCAAATGGGCTG 152» LysArgAspT rpLysThrAsnVal Hi sVal I I eVal Gl y P roP roGI yCysGI yLysSer LysTrpAI aA _ Ncol (2865
    2801 CTAAITrTGCAGACGCGGAAACCACATACTGaAAACCACCTAGAAACAAGTGGTGGGATGGTTACCATGG
    185» laAsnPheAl aAspProGI uThrThrTyrT rpLysProProArgAsntysT rpT rpAspGI yTyrHi sGI
    2871 TGAAGAAGTGGTTGTTATTGATGACTTTTA.TGGCTGGCrGCCGTGGGATGATCTACTGAGACTGTGTGAT 208» yGI uGI uVal Val Val I I eAspAspPheT y rGI yT rpLeuProT rpAspAspLeuLeuArgLeuCysAsp
    EcoRV (2942)
    2941 CGATATCCATTGACTGTAGAGACTAAAGGTGGAACTGTACCTTTTTTGGCCCGCAGTA.TTCTGATTACCA 232» A rgTy rP roleuThr Va I Gl uThr LysGI yGIyThr Va I ProPheLeuAI aArgSer I I eLeu 11 eThr S
    PL 205 130 B1
    FIGURA 2.6C
    3013. GCAATCAGACCCCGTrGGAATGGTACTCCTCAACTGCTGTCCCAGCTGTAGAAGCTCTCTATCGGAGGAT255 ► et AsnGI nThr P roLeuGI uT rpTy rSer Ser Thr Al aVa l ProAl aVa I Gl u Al aleuTyr Arg Arg I I
    3083. TACTTCCTTGGTA.TTTTGGAAGAATGCTACAGAACAATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTTCGTCACCCTT 27o> eThr Ser LeuVa I PheT rpLysAsnAl aThr Gl uGl nSer Thr Gl uGl uGI yGlyGI nPhe\Zal Thr Leu
    Smal (3399)
    Ndel (3173) Sali (3193)
    3151 TCCCCCCCATGCCCTGAATTTCCATATGAAATAAATrACTGAGTCGACCCCGGGTTTTTATAGCTAATTA 30S> Ser ProProCysProGI uPheProTyrGI ul I eAsnTyr
    3223 GTCATTTTTTCGTAAGTAAGTATTmATTTAATAOTTTTTATTGTACTTATGTTAAATATAACTGATGA
    3291. TAACAAAATCCATTATGTATTATTTATAACTGTAAITrCTTTAGCGTAGTTAGArGTCCAArCTCTCTCA
    3361 AATACATCGGCTATCTTTTTAGTGAGATTTTGATCTATGCAGTTGAAACTTATGAACGCGTGATGATTAA
    3433 AATCTGAACCGTCCAAATTTGCAGTCATTATATGAGCGTATCTATTA.TCTACTATCATCATCrrTGAGTT
    3503 AOTAArATCATCTACTTTAGAATTGATAGGAAATATGAATACCTTTGTAGIAAIATCTATACTATCTACA
    Sact (3604)
    Notl (3596)
    3573 CCTAACTCATTAAGACmTGATAGGCGGCCGCGAGCTC
PL353068A 1999-08-31 2000-08-28 Zastosowanie kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych świń PL205130B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15156499P 1999-08-31 1999-08-31
US09/583,350 US6517843B1 (en) 1999-08-31 2000-05-31 Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353068A1 PL353068A1 (pl) 2003-10-06
PL205130B1 true PL205130B1 (pl) 2010-03-31

Family

ID=26848763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353068A PL205130B1 (pl) 1999-08-31 2000-08-28 Zastosowanie kompozycji szczepionkowej do wytwarzania leku do obniżenia obciążenia świńskim cirkowirusem typu 2 (PCV-2) w węzłach oskrzelowych i krezkowych świń

Country Status (16)

Country Link
US (1) US6517843B1 (pl)
EP (1) EP1246920B1 (pl)
JP (1) JP2003513617A (pl)
KR (1) KR20020068325A (pl)
CN (2) CN102416173B (pl)
AT (1) ATE527361T1 (pl)
AU (2) AU782418B2 (pl)
BR (2) BRPI0014155B1 (pl)
CA (1) CA2383367C (pl)
DK (1) DK1246920T3 (pl)
ES (1) ES2376817T3 (pl)
HU (1) HU229195B1 (pl)
MX (1) MXPA02002208A (pl)
PL (1) PL205130B1 (pl)
PT (1) PT1246920E (pl)
WO (1) WO2001016330A2 (pl)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE39494E1 (en) * 1992-02-27 2007-02-27 Intervet Inc. Inactivated mycoplasma hyopneumoniae and uses therefor
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
AU769539B2 (en) * 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
WO2001014047A1 (en) * 1999-08-20 2001-03-01 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Filter membranes for physiologically active substances
ES2170622B1 (es) * 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
US7018638B2 (en) * 2000-12-19 2006-03-28 Wyeth Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine
CN1309836C (zh) * 2001-03-27 2007-04-11 萨斯喀彻温大学 培养环状病毒的方法
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
WO2005007223A2 (en) * 2003-07-16 2005-01-27 Sasha John Programmable medical drug delivery systems and methods for delivery of multiple fluids and concentrations
WO2005049794A2 (en) 2003-11-13 2005-06-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Methods of characterizing infectious bursal disease virus
HUE025537T2 (en) * 2004-12-30 2016-05-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc PCV2-immunogenic compositions and methods for preparing such compositions
UA95602C2 (ru) * 2004-12-30 2011-08-25 Берингер Ингельхейм Ветмедика, Инк. Иммуногенная композиция цвс2 и способы приготовления такой композиции
US7700285B1 (en) 2005-12-29 2010-04-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
US7566562B2 (en) 2005-02-03 2009-07-28 Universiteit Gent Culturing circular ssDNA viruses for the production of vaccines
US7300785B2 (en) 2005-02-03 2007-11-27 Universiteit Ghent Culturing circular ssDNA viruses for the production of vaccines
KR101347503B1 (ko) * 2005-09-09 2014-01-02 인터벳 인터내셔널 비.브이. Ｐｃｖ-2 백신
EP1968630B1 (en) 2005-12-29 2018-01-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Multivalent pcv2 immunogenic compositions
MX338626B (es) 2005-12-29 2016-04-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para producir los sintomas clinicos en cerdos.
US7862821B2 (en) 2006-06-01 2011-01-04 Merial Limited Recombinant vaccine against bluetongue virus
EP2859900A1 (en) * 2006-12-11 2015-04-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Effective method of treatment of porcine circovirus and lawsonia intracellularis infections
JP5200223B2 (ja) * 2006-12-15 2013-06-05 ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド Ｐｃｖ２抗原によるブタの処置
EP1941903A1 (en) 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
EP1958644A1 (en) 2007-02-13 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prevention and treatment of sub-clinical pcvd
US7829274B2 (en) 2007-09-04 2010-11-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Reduction of concomitant infections in pigs by the use of PCV2 antigen
WO2009088950A2 (en) * 2007-12-31 2009-07-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 virus like particle with foreign amino acid insertion
KR20100113582A (ko) * 2008-01-23 2010-10-21 베링거잉겔하임베트메디카인코퍼레이티드 Ｐｃｖ2 마이코플라즈마 히오뉴모니에 면역원성 조성물 및 당해 조성물의 생산 방법
US20110033495A1 (en) * 2008-02-15 2011-02-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods and compositions for reducing the impact of enteric diseases
CN102065890B (zh) * 2008-04-16 2014-04-02 弗吉尼亚科技知识产权公司 嵌合体猪圆环病毒PCV2Gen-1Rep及其用途
AR078253A1 (es) * 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
KR20110090711A (ko) * 2010-02-04 2011-08-10 녹십자수의약품(주) 신규한 돼지 써코바이러스 타입 2 및 그의 용도
KR101484469B1 (ko) * 2010-10-26 2015-01-21 주식회사 중앙백신연구소 돼지 써코바이러스 관련 질환을 예방하기 위한 ｐｃｖ-2의 전체 바이러스를 포함하는 혼합백신
TWI442935B (zh) 2010-12-22 2014-07-01 Sbc Virbac Ltd 豬第二型環狀病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２）、含彼之免疫組合物、檢測套組及其應用
EP3049106A1 (en) 2013-09-25 2016-08-03 Zoetis Services LLC Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use
US9505808B2 (en) 2013-10-02 2016-11-29 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. PCV2 ORF2 protein variant and virus like particles composed thereof
HK1252427A1 (zh) 2015-05-14 2019-05-24 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. 猪环状病毒生产方法和pcv2疫苗
JP7657287B2 (ja) 2020-07-24 2025-04-04 ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド 組合せブタワクチン
CN112655566B (zh) * 2020-12-18 2022-07-29 杭州惠通检测有限公司 一种在非洲猪瘟防控中应用的多层防御体系

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
EP0173552B1 (en) 1984-08-24 1991-10-09 The Upjohn Company Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
JPS63500636A (ja) 1985-08-23 1988-03-10 麒麟麦酒株式会社 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ
IE872748L (en) 1986-10-16 1988-04-16 Arjomari Europ Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0386185A1 (fr) 1988-07-29 1990-09-12 IntraCel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
CA2489769A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
KR920703114A (ko) 1989-07-14 1992-12-17 원본미기재 접합체 백신을 위한 시토킨 및 호르몬 운반체
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
JPH04183026A (ja) 1990-11-16 1992-06-30 Matsushita Electric Ind Co Ltd 表示付き選択呼出受信装置
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
DE69233158T2 (de) 1991-03-07 2004-05-13 Connaught Technology Corp., Greenville Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe
US5843456A (en) 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US6033904A (en) 1992-01-13 2000-03-07 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5382425A (en) 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5869312A (en) 1992-01-13 1999-02-09 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US5801029A (en) 1993-02-16 1998-09-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
EP0620277A1 (en) 1993-03-18 1994-10-19 Merck & Co. Inc. Nucleic acid pharmaceuticals
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
ATE475668T1 (de) 1994-01-27 2010-08-15 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch impfung von dns transkriptionseinheit
ATE298370T1 (de) 1994-04-29 2005-07-15 Baxter Healthcare Sa Rekombinante poxviren mit fremdenpolynukleotiden in wichtigen regionen
EP0871755A1 (en) 1995-03-23 1998-10-21 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Vectors for gene delivery
EP0979101B1 (en) 1996-07-03 2010-10-27 Merial, Inc. Recombinant canine adenovirus 2 (cav2) containing exogenous dna
FR2751224B1 (fr) 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US5990091A (en) 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
US6004777A (en) 1997-03-12 1999-12-21 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
JP3795751B2 (ja) 1997-12-11 2006-07-12 ユニバーシティ オブ サスカッチェワン ブタからの離乳後多全身系消耗症候群ウイルス
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6943152B1 (en) * 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
WO2006026552A1 (en) 2004-08-27 2006-03-09 University Of Washington Ultrasonic direct strain estimation using temporal and spatial correlation

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0203834A3 (en) 2004-07-28
US6517843B1 (en) 2003-02-11
AU2005220241B2 (en) 2009-12-10
AU782418B2 (en) 2005-07-28
PT1246920E (pt) 2011-10-24
PL353068A1 (pl) 2003-10-06
CA2383367A1 (en) 2001-03-08
ATE527361T1 (de) 2011-10-15
BRPI0014155B1 (pt) 2017-09-12
EP1246920A2 (en) 2002-10-09
ES2376817T3 (es) 2012-03-20
DK1246920T3 (da) 2011-10-31
CN102416173B (zh) 2016-08-03
EP1246920B1 (en) 2011-10-05
AU7285500A (en) 2001-03-26
WO2001016330A2 (en) 2001-03-08
MXPA02002208A (es) 2002-11-07
HUP0203834A2 (hu) 2003-03-28
WO2001016330A3 (en) 2002-08-08
BR0014155A (pt) 2002-05-07
CN1409765A (zh) 2003-04-09
KR20020068325A (ko) 2002-08-27
JP2003513617A (ja) 2003-04-15
AU2005220241A1 (en) 2005-12-01
CA2383367C (en) 2015-04-07
HU229195B1 (en) 2013-09-30
CN102416173A (zh) 2012-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2383367C (en) Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
KR100837724B1 (ko) 돼지 서코바이러스의 재조합 폭스바이러스 백신
US7211379B2 (en) Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
JP4824233B2 (ja) Ｐｃｖ−ｄｎａワクチン
CN101277717A (zh) Pcv-2疫苗
JP2003502303A5 (pl)
KR100805807B1 (ko) 고양이 칼리시바이러스 유전자 및 백신, 특히 재조합 백신
JP4426761B2 (ja) ウエストナイル熱ウイルスに対するワクチン
ES2348219T3 (es) Vacuna de virus pox recombinante contra el circovirus porcino.
HK1219412B (en) Vaccine against west nile fever