BRPI0015582B1

BRPI0015582B1 - processo para quantificação de um rna alvo em um microarray

Info

Publication number: BRPI0015582B1
Application number: BRPI0015582A
Authority: BR
Inventors: T Lorincz Attila; M Strange Christina; R Williams Inna; G Lazar James; M Zakel Joan
Original assignee: Digene Corp; Qiagen Gaithersburg Inc
Priority date: 1999-11-15
Filing date: 2000-11-14
Publication date: 2017-02-14
Also published as: ATE307903T1; DE60023539D1; EP1230396B1; AU784821B2; EP1230396A2; US6686151B1; WO2001036681A3; WO2001036681A2; DE60023539T2; BR0015582A; AU1764601A; CA2391558A1

Abstract

"detecção imunológica de híbridos de rna:dna em microarrays". a presente invenção fornece um processo de hibridização e um kit para detecção e medida de moléculas biológicas. uma amostra teste que contém as moléculas biológicas de interesse é hibridizada com uma biomolécula complementar não marcada ou opcionalmente marcada de forma a ser detectada para formar um híbrido de duplo filamento imobilizado em uma fase sólida. o híbrido imobilizado pode ser detectado com uma entidade que reconhece especificamente um híbrido de rna:dna, seguido por análise e quantificação. portanto, a presente invenção fornece um processo e um kit para detecção e medida de moléculas biológicas que é simples de usar, altamente específico, sensível e preciso para seleção de uma pluralidade de moléculas biológicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA QUANTIFICAÇÃO DE UM RNA ALVO EM UM MICROARRAY".

Campo da Invenção A presente invenção está no campo geral de detecção de moléculas biológicas, incluindo D NA, RNA, proteína e similares, e especifica mente no campo da detecção de híbridos de RNA:DNA em uma fase sólida, como também descrito neste caso, usando um ensaio de hibridízação. Fundamentos da Invenção O RNA ou o DNA para muitos genes, incluindo aqueles associados com estados de doenças, e microrganistmos e vírus foram isolados e sequencíados. As sondas de ácido nudeico com base em tais sequências usualmente estão disponíveis para identificar um grande número de genes e infecções. As sondas de ácido nudeico são sequências de ácido nucleico que podem ser detectadas que híbridízam para sequências de RNA ou DNA complementares em uma amostra teste. A detecção da sonda indica a presença de uma sequenda de ácido nudeico particular na amostra teste para qual a sonda é específica, Além de ajudar a pesquisa científica, as sondas de ácido nucleico podem ser usadas para detectar a presença de vírus e micror-ganismos tais como bactérias, levedura e protozoários assim como mutações genéticas ligadas a distúrbios específicas em amostras de pacientes.

Grunstein, e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72: 3961 (1975) e Southern, J. Mol. Biol, 98: 503 (1975) descrevem técnicas de hibridízação usando sondas de ácido nudeico radiomarcadas. As sondas de hibridízação de ácido nucleico têm as vantagens de sensibilidade e especificidade altas em relação aos métodos de detecção e não requerem um organismo viável. As sondas de hibridízação são frequentemente marcadas com uma substância radioativa que pode ser facilmente detectada.

As técnicas de hibridízação que utilizam radioísótopos para marcar as sondas introduzem gastos adicionais causados pelos altos custos de rejeito de produtos de lixo radioativo e a necessidade para monitorar pessoal e o locai de trabalho em relação à contaminação. Além disto, a meia-vida de compostos radioativos tais como 32P requer que as sondas radioativas sejam produzidas frequentemente. A hibridização de ácido nucléico radioativo é portanto desencorajada em áreas comerciais tais como diagnóstico clínico.

As sondas vêm sendo marcadas indiretamente em uma tentativa de evitar os problemas associados com marcação radioativa direta. Um método comum de marcar de forma indireta é ligar biotina, uma vitamina pequena, à sonda de ácido nucléico usando uma técnica química ou enzimáti-ca. Após a hibridização ao ácido nucléico específico, a biotina é detectada por reação com estreptavidina, uma proteína que se liga fortemente à biotina e foi marcada com uma enzima ou fluorocromo. O complexo biotina- estreptavidina associado pode ser detectado com substratos que produzem cor e o fluorocromo pode ser visto quando reagido com luz incidente de comprimento de luz apropriado. No entanto, a marcação indireta de sondas de hibridização com biotina ou outros haptenos frequentemente aumenta a "hi-drofobicidade1' da sonda. A sonda tende a interagir não especificamente com materiais que não sejam o ácido nucléico complementar alvo, levando à alta interferência de fundo. A etiqueta^ de biotina aumenta a ligação não-específica, que leva à alta interferência de fundo, reduzindo deste modo a sensibilidade e aumentando a probabilidade de um resultado falso positivo. A marcação indireta é também menos sensível do que a marcação direta porque a densidade da marcação é limitada; apenas uma pequena fração das bases são marcadas fornecendo um número limitante de locais para geração de sinal. Um aumento na densidade da marcação de uma sonda leva à ligação não-específica aumentada, interferência de fundo mais alta e, por fim, faz com que a sonda não hibridize com seu alvo por causa da interferência do hapteno com a base de emparelhamento. As sondas marcadas indiretamente são portanto não adequadas para diagnóstico clínico por causa de sua imprecisão e dos resultados falso positivos. A hibridização de uma sonda às seqüências de ácido nucléico específico vem sendo detectada com o uso de um agente de intercalação tal como laranja de acridina ou brometo de etídio como descrito na Patente U.S. Ne 4.563.417 de Albarella e outros. O agente de intercalação se torna inserido entre os pares de base da sonda e os ácidos nucléicos da amostra e faz com que a estrutura terciária da hélice se desnovele. Um anticorpo específico para o determinante antigênico recém-formado criado pelo agente de in-tercalação e a hélice desnovelada é detectada por meios convencionais. Este método carece de seletividade para os híbridos alvo porque os agentes de intercalação não reconhecem as seqüências específicas. Além disto, os anticorpos reconhecem apenas o complexo agente de intercalação/ ácido nucléico, mas não detectam uma seqüência específica. Portanto, a seleção adiciona! ou as etapas de purificação são necessárias para prevenir um sinal não específico, fazendo com que esta abordagem que implica em grande perda de tempo e trabalho excessivo seja pouco adequada para o diagnóstico clínico. A hibridização da sonda às seqüências de ácido nucléico específico pode também ser detectada com a ajuda de um anticorpo específico para uma sonda marcada como descrito na Patente U.S. N2 4.743.535 de Carrico. A sonda é marcada com uma substância que pode ser detectada tal como dinucleotídeo adenina flavina (FAD) ou um agente fluorescente. Um anticorpo específico para a sonda marcada, após ela ser hibridizada à seqüência de ácido nucléico específico, é detectado por uma reação bioquímica. Este método de detecção também cria uma ligação não-específica e possibilita resultados falso positivos e não é bem adequada para seleção clínica.

Foram feitas tentativas de aumentar a sensibilidade de testes com ácido nucléico usando amplificação do alvo. Os métodos de amplificação das seqüências de ácido nucléico são comercial mente disponíveis. Estes métodos incluem a reação em cadeia de polimerase (PCR), a reação de amplificação de ligação (LCR) e a reação de amplificação com base na transcrição (TMA). A tecnologia de PCR é descrita em PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, de Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky and Thomas J. White, pp. 39-45 e 337-385 (Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, Publishers, 1990). A tecnologia de PCR é também descrita por Marx, J. L., Science 140: 1408-1410 (1988) e na Patente U.S. Ns 4.683.195 e 4.683.202, de Mullis. A reação de amplificação de liga- ção é descrita por Wu, D. Y e Wallace, R. B., Genomics 4: 560-569 (1989) e Barringer, K. J. e outros, Gene 89: 117:122 (1990). A reação de amplificação com base na transcrição é descrita por Kwoh, D. Y. e outros, Proc. Nati. Acad. Sei. USA 86: 1173-1177 (1989). Estes métodos têm as vantagens de ter sensibilidade alta, mas as desvantagens de ter uma preparação da amostra longa, entediante e cara, sendo propensa a resultados falso-positivos a partir da contaminação do produto de reação e tendo a incapacidade de quantificar precisamente a quantidade inicial dos ácidos nucléicos alvo. Os produtos de reação de amplificação são mais freqüentemente detectados por um ensaio de hibridização. O grau de sensibilidade obtido em ensaios para a detecção de moléculas de ácido nucléico, seja RNA ou DNA, em uma amostra geralmente é mais baixo para RNA do que para DNA porque o RNA está sujeito à degradação por RNAses endógenas na amostra, resultando em menos RNA disponível para a detecção. Além disto, a interferência de fundo causada por contaminantes na amostra é difícil de eliminar sem causar mais degradação do ácido nucléico alvo, tal como RNA.

Os ensaios de hibridização para a detecção de moléculas de ácido nucléico, isto é, de RNA, vem sendo desenvolvidos. Por exemplo, um ensaio de proteção de hibridização para RNA está comercialmente disponível pela Gen-Probe (San Diego, CA). O ensaio de proteção de hibridização emprega uma sonda de ácido nucléico de filamento simples ligada a um és-ter de acridínio, como descrito por Engleberg, N. C., ASM News 57: 183-186 (1991), Arnold e outros, Clin. Chem.. 35: 1588-1594 (1989) e a Patente U.S. NQ 4.851.330. A hibridização da sonda para uma molécula de RNA alvo protege a ligação de éster de acrinidínio da hidrólise a quente de modo que o sinal quimioluminescente detectado é proporcional à quantidade de RNA alvo na amostra. A sensibilidade deste ensaio de proteção é limitada por lu-minescência de fundo causada por sonda não-hibridizada.

Um outro ensaio para a detecção de RNA utiliza a transcriptase reversa (WO 99/40224; data da Publicação: 12 de agosto de 1999). Este ensaio especificamente induz a transcriptase reversa da molécula de RNA de interesse com uma transcriptase reversa que tem ausência da função RNAse Η. O ensaio descrito no WO 99/40224 é limitado ao uso de transcriptase reversa para detectar RNA.

Os métodos que não usam microarray para detecção de ácidos nucléicos são comuns. O WO 99/29909 (data da Publicação: 17 de junho de 1999) descreve a detecção de sequências de ácido nucléico viral, especificamente do vírus da Hepatite B, em que os híbridos de RNA;DNA são capturados por anticorpos direcionados contra os híbridos de RNA:DNA. Um ensaio e kit de hibridização não-radioativo preferivelmente usado nos tubos de teste é descrito no WO 93/10263 (data da Publicação: 27 de maio de 1993). Adicionalmente, a publicação de WO 00/60116 (data da Publicação: 12 de outubro de 2000) descreve um método de cultivar células e detectar ácidos nucléicos, em que um meio preferido é o uso de sondas de filamento simples anexadas a um suporte sólido, por exemplo, alfinetes. Geralmente, estes ensaios são limitados e não fornecem um meio rápido para detectar ácidos nucléicos.

Os anticorpos policlonais e monoclonais e outras entidades similares são comumente usadas para finalidades de detecção. Especificamente, os anticorpos policlonais reconhecem uma pluralidade de epitopos, enquanto os anticorpos monoclonais reconhecem apenas um epitopo específico. Os anticorpos monoclonais que detectam os híbridos de RNA:DNA são normalmente disponíveis. Vêm sendo preparados anticorpos policlonais que detectam os híbridos de RNA:DNA, embora, de maneira geral, eles não sejam tão específicos quanto os anticorpos monoclonais, que são concebidos para se ligarem a um epitopo específico.

Os anticorpos monoclonais para os híbridos de RNA:DNA estão disponíveis no momento. A Patente U.S. NQ 4.732.847 de Stuart e outros e a publicação de Stuart e outros, Proc. Natl.-Acad. Sei. USA 78: 3751 (1981) descreve um método de detecção de hibridização de sequências de ácido nucléico específico em uma superfície sólida que envolve um anticorpo monoclonal específico para um duplex poli (A)-poli (dT). Em Stuart, as seqüên-cias de DNA e RNA de anelamento complementares às seqüências de inte- resse formam híbridos de RNA:DNA. Stuart especificamente defende que os anticorpos policlonais não sejam usados, porque com os anticorpos policlo-nais não se pode impedir a ligação significativa dos ácidos nucléicos de filamento simples e duplo. Além disto, diferentemente da presente invenção descrita neste caso, Stuart não considera as vantagens dos anticorpos policlonais para os conjuntos de oligômeros muito curtos em "chips" de vidro ou silício. Além disto, Stuart não considera microarrays, especialmente conjuntos de densidade alta de lâminas de vidro ou "chips" de silício. Stuart também não divulga a ligação de uma sonda de ácido nucléico à superfície de uma fase sólida. Em vez disto, Stuart fixa um polinucleotídeo de amostra a uma superfície, enquanto a sonda {por exemplo, a sequência de nucleotídeo predeterminada) está presente na fase líquida. Tendo em vista do precedente, a presente invenção fornece benefícios e vantagens significativas na técnica.

Boguslawski e outros, J. Immunol. Methods 89: 123-130 (1986) desenvolveu um ensaio de hibridização usando contas de poliestireno revestidas com anti-híbrido isoladas em papel filtro em uma tentativa de reduzir a ligação não-específíca e evitar procedimentos de lavagens complicados. Um anticorpo monoclonal específico para híbridos de RNA:DNA secre-tados por hibridoma HB 8730 é divulgado na Patente U.S. N- 4.833.084 de Carrico e outros, Em Carrico, os híbridos de RNA:DNA formados por reane-lamento específicos de um polinucleotídeo de sonda e a sequência de interesse podem ser sensível e especificamente detectados por ligação aos anticorpos monoclonais.

Os microarrays se referem a um arranjo ordenado de moléculas biológicas diferentes, incluindo RNA, DNA, proteína ou similares, dispostos em conjunto ou imobilizados em um sólido substrato. Estes microarrays de agentes de ligação, tais como oligonucleotídeos e sondas, tornaram-se uma ferramenta crescentemente importante na indústria da biotecnologia e em campos relacionados. Os microarrays, que compreendem uma pluralidade de agentes de ligação ou elementos que é imobilizada na superfície de um suporte sólido de uma maneira ou com um padrão ordenados, têm uso em uma variedade de aplicações, incluindo seleção de drogas, seqüênciamento de ácido nucléico, análise de mutação e similares. Os elementos como usados neste caso em um contexto de microarray referem-se a seqüências de ácido nucléico que podem ser hibridizadas, oligonucleotídeos, iniciadores, sondas e/ou seqüências de aminoácido dispostas de uma maneira diferente e que pode ser identificada na superfície de um substrato. A detecção de moléculas biológicas por meio do uso de microarrays é benéfica para analisar várias amostras e moléculas biológicas, reduzindo a quantidade de amostra necessária para a análise, diminuindo a variabilidade experimental, diminuindo o tempo de preparação da amostra, confirmando os resultados e para diminuir os custos de tal análise. üsualmente, um dos usos primários de microarrays é medir expressão de gene em amostras biológicas. As medidas de expressão de gene incluem a detecção da presença ou da ausência de mRNA ou medir as concentrações aumentadas ou diminuídas de mRNA. De forma a detectar a hi-bridização e medir a expressão de gene por métodos convencionais, no entanto, a amostra deve primeiro ser purificada e marcada. Duas técnicas comuns para purificação e marcação das amostras são: 1) amplificação de RNA, marcação e hibridização e 2) marcação de cDNA e hibridização. A parte de amplificação da primeira técnica é descrita nas Patentes U.S. N-5.716.785 e 5.891.636 publicadas em 1998 e 1999, respectivamente, de Van Gelder e outros. É usado RNA ou mRNA total altamente purificado, que é um procedimento caro, entediante e que demanda muito tempo. Um inicia-dor de oligo-dT é também usado para impulsionar a transcrição reversa do mRNA de cauda poli A em um cDNA de filamento simples anti-sentido. O oligo-dT também contém a seqüência de polimerase T7 RNA na terminação de iniciação 5 das seqüências dT. Após a transcrição reversa, uma combinação de RNAse H, DNA ligase e DNA polimerase é usada para gerar um cDNA de duplo filamento. Como o iniciador RT original continha um promotor de polimerase T7 RNA, o cDNA de duplo filamento contém um promotor T7 RNA total. O cDNA de duplo filamento é então usado como um modelo para a polimerase T7 RNA. Aproximadamente 100-1000 cópias adicionais de RNA são produzidas a partir de cada cópia de cDNA. Durante o processo de transcrição, os nucleotídeos marcados são incorporados no RNA transcrito. O RNA marcado é então hibridizado ao microarray de DNA que forma os híbridos de RNA:DNA marcados. As etiquetas fluorescentes podem ser detectadas diretamente enquanto as etiquetas indiretas podem ser detectadas após a reação com um agente de ligação secundário.

Uma segunda técnica de preparação de amostra produz e mede cDNA marcado. Nesta técnica, RNA ou mRNA total é purificado a partir da amostra biológica. Um inicíador oligo-dT é usado para impulsionar a transcrição reversa do mRNA de cauda poli A em um cDNA de filamento simples anti-sentido. Durante a transcrição reversa, os nucleotídeos marcados são incorporados no filamento de DNA nascente. Após a síntese, o filamento de RNA é destruído. O filamento de cDNA é então hibridizado ao microarray. Se os nucleotídeos forem marcados com fluorescência, então os híbridos são visualizados diretamente com um scanner de sistema fluorescente. Se os nucleotídeos forem marcados com biotina, então o microarray é primeiro reagido com estreptavidina marcada e então submetidos à varredura.

As desvantagens de ambas as técnicas são várias. Em primeiro lugar, ambas requerem uma grande quantidade de ácidos nucléicos altamente purificados (isto é, RNA ou DNA). A purificação requer etapas adicionais que demandam tempo e trabalho intenso. Além disto, estas técnicas são imprecisas. A transcrição reversa ocorre em eficiência e velocidades cinéticas diferentes dependendo das sequências de ácido nucléico, mudando artificialmente a concentração de seqüências de ácido nucléico específico. O mRNA procariótico e algum mRNA eucariótíco não contém a seqüên-cia ou a cauda de poli A na terminação iniciada 3 ou a cauda poli A pode ser degradada durante a purificação e, portanto, não pode ser marcada ou detectada com as técnicas atuais, pois não há sequência para iniciar a etapa de transcriptase reversa. As técnicas atuais são portanto restritas aos tipos de amostras que podem ser usadas para detecção. Além disto, estas metodologias envolvem nucleotídeos marcados. A incorporação de nucleotídeos marcados nos ácidos nucléicos não marcados ocorre em uma eficiência mais baixa e a uma velocidade mais baixa do que os nucleotídeos naturais. Uma vez mais, as etiquetas podem ser incorporadas com eficiências diferentes dependendo da sequência. Portanto, a densidade da etiqueta pode se diferenciar entre sequências diferentes, mudando artificialmente a quantidade medida destes ácidos nucléicos. Portanto, a quantificação é apenas relativa. Os ácidos nucléicos marcados também apresentam cinética de hibridi-zação diferente em relação aos ácidos nucléicos naturais, usualmente tornando-os menos específicos. Além disto, os presentes métodos podem requerer condições de restrição mais altas do que os nucleotídeos não modificados para obter o mesmo nível de especificidade. No entanto, o uso de condições de restrição mais altas para obter especificidade aceitável irá diminuir a sensibilidade de detecção. Conseqüentemente, há necessidade de um ensaio para detecção e para análise quantitativa de moléculas biológicas, incluindo DNA, RNA, proteína e similares, que é preciso, tanto em relação ao tempo e eficiente no custo, e capaz de selecionar uma ou mais moléculas biológicas de amostra com grande sensibilidade e ligação não-específica mínima.

Portanto, pode ser útil ter um método para detectar e medir a quantidade de uma ou mais moléculas biológicas, incluindo, mas não [imitado a, RNA, DNA ou proteína, que é fácil de usar, aítamente específico, preciso e sensível para a seleção de moléculas biológicas.

Conseqüentemente, é um objetivo da invenção fornecer um ensaio para detectar a ausência ou a presença e quantificar moléculas biológicas, incluindo, mas não limitado a, RNA, DNA ou proteína. É também um objetivo da presente invenção fornecer um método para detectar um híbrido de RNAiDNA que compreende uma primeira molécula biológica alvo em uma amostra e uma segunda sonda biológica. É um objetivo da presente invenção fornecer um ensaio sensível e quantitativo que tem falso positivos mínimos. .....É também um objetivo da presente invenção fornecer um ensaio para a seleção paralela maciça.

Sumário da Invenção É divulgado um ensaio para detectar e medir uma molécula biológica de interesse, incluindo RNA, DNA, proteína e similares, em uma amostra por hibridização da biomolécula para uma sonda de biomolécula complementar que forma híbridos de duplo filamento, seguido por detecção imunobiológica destes híbridos de duplo filamento formados em uma fase sólida com um anticorpo ou outra entidade que reconhece especificamente híbridos de RNA:DNA e pode ser detectado. Este método pode ser usado para detectar a presença de uma ou mais moléculas biológicas específicas presentes em uma variedade de amostras.

Esta invenção fornece um método de monitorar simultaneamente a quantidade (por exemplo, detectar e quantificar a quantidade) de uma multiplicidade de moléculas biológicas. A presente invenção refere-se a um ensaio para detectar híbridos de RNA:DNA que usa entidades marcadas específicas para reconhecer os híbridos de RNA:DNA. Preferivelmente, a entidade é um anticorpo específico a híbrido de RNA:DNA marcado de forma que pode ser detectado ou um fragmento do mesmo. O anticorpo usado para detectar os híbridos de RNA:DNA podem ser monoclonais ou policlonais e preferivelmente policlo-nais para a detecção de sondas de molécula biológica curta que tem um comprimento de menos de 30 bases. A presente invenção também se refere a um ensaio que usa microarrays da invenção para determinar as respostas fisiológicas por expressão de gene, detecção de polimorfismo, análise de SNP ou similares. O método pode ser usado pará detectar qualquer e todas as variações genotí-picas, incluindo mutações de inserção ou retirada.

Além disto, a presente invenção refere-se a um ensaio que utiliza transcriptase reversa para estender moléculas biológicas curtas, melhorando deste modo a detecção dos híbridos de RNAtDNA. Preferivelmente, a transcriptase reversa é termoestável e tem ausência de função RNAse H. A presente invenção também se refere a um kit para a detecção e a quantificação de moléculas biológicas, em que o kit pode ser usado para selecionar amostras de grandes números de alvos descritos neste caso pela presente invenção.

Breve Descrição das Figuras As Figuras 1A-D são uma representação esquémática de uma modalidade preferida da detecção imunológica de anticorpo de híbridos de RNA:DNA em microarrays. A Figura 1A mostra a hibridização da amostra de RNA para a sequência de DNA complementar que está ligada à formação de microarray que fornja-um híbrido de RNA:DNA como representado na Figura 1B. Subseqüentemente, os anticorpos, sejam monoclonais ou policlonais, ligam-se aos híbridos de RNA:DNA, como visto na Figura 1C. A Figura 1D ilustra a detecção de etiquetas fluorescentes usando um scanner a laser fluorescente.

As Figuras 2A-D são uma representação esquemática de uma segunda modalidade da detecção imunológica de híbridos de RNA:DNA em microarrays em que o microarray compreende sequências de captura universal. A Figura 2A mostra a hibridização do conjunto universal com DNA de filamento simples e RNA da amostra. Cada híbrido se formou na microarray que compreende uma região de DNA:DNA e uma região de RNA:DNA, como representado na Figura 2B. Os anticorpos detectam e ligam os híbridos de RNA:DNA na Figura 2C. A Figura 2D ilustra um meio de detecção que compreende etiquetas de anticorpo fluorescente usando um scanner a laser fluorescente.

As Figuras 3A-E são uma representação esquemática de uma terceira modalidade da detecção imunológica de híbridos de RNA:DNA em microarrays em que o microarray compreende etiquetas de seqüêncías expressas (ESTs) para a quantificação de mRNA para cuja sequência de comprimento total é desconhecida. A Figura 3A mostra a hibridização do RNA da amostra para as ESTs curtas ligadas ao microarray. A formação de RNA e de híbridos de DNA curtos é representada na Figura 3B. O DNA é prolongado para o comprimento total do RNA com o uso de, por exemplo, transcriptase reversa (RT), como demonstrado na Figura 3C. As Figuras 3D e 3E ilustram o reconhecimento de anticorpo de híbridos de RNA:DNA e a detec- ção de etiquetas de anticorpo fluorescente com scanner a laser, respectivamente.

As Figuras 4A-D são uma representação esquemática de uma quarta modalidade da detecção imunológica de híbridos de RNA:DNA em microarrays em que a invenção é direcionada a um método de detecção de duas cores. A Figura 4A mostra cada sonda de DNA ligada ao microarray que contém uma região de seqüência idêntica e uma região de seqüência variável. O DNA marcado hibridiza com a seqüência comum e a amostra de RNA hibridiza com a seqüência variável. Os híbridos de RNA:DNA e os híbridos de DNA:DNA marcado são formados, como demonstrado na Figura 4B. Os anticorpos incitados contra os híbridos de RNA:DNA se ligam à região pertinente; o microarray é submetido à varredura com lasers fluorescentes de duas cores diferentes; e o sinal é normalizado como mostrado nas Figuras 4C-4D.

As Figuras 5A-D são uma representação esquemática de uma quarta modalidade da detecção imunológica de híbridos de RNA:DNA em microarrays em que a invenção compreende um DNA n-meros degenerado marcado e RNA de amostra, A Figura 5A mostra cada sonda de DNA ligada ao microarray simultaneamente ou seqüencialmente que hibridiza para a amostra de RNA e/ ou o DNA degenerado marcado. Os híbridos de RNA:DNA e os híbridos de DNA:DNA marcado são formados, como demonstrado na Figura 5B. Os anticorpos incitados contra os híbridos de RNA:DNA se ligam à região pertinente; o microarray é submetido à varredura com lasers fluorescentes de duas cores diferentes; e o sinal é normalizado como mostrado nas Figuras 5C-5D.

As Figuras 6A-B são gráficos que representam uma comparação de comprimento de oligonucleotídeo ligado à fase sólida usando detecção com um anticorpo monoclonal (Figura 6A) e um anticorpo policlonal (Figura 6B) como uma função de sinal para a razão de sinal do microarray.

Descrição Detalhada da Invenção Um ensaio e um kit são fornecidos para a detecção e a quantificação de uma ou mais moléculas biológicas alvo em uma ou mais amostras.

Em geral, uma amostra de teste que compreende moléculas biológicas, incluindo, mas não limitado a RNA, DNA, proteína ou similares, é coletada e é diretamente ou indiretamente hibridizada a uma sonda de ácido nucléico ligado à fase sólida específica à biomolécula alvo. As sequências de ácido nucléico não-hibridizados são removidas, preferivelmente por lavagem. A hibridização é então detectada por uma reação com um anticorpo de híbrido de RNA:DNA que é marcado diretamente ou indiretamente com uma etiqueta que pode ser detectada e/ou detectada por uma seqüência de ácido nucléico marcada que é complementar à seqüência sonda de ácido nucléico ligado.

Em uma modalidade da presente invenção, um ácido nucléico específico de uma amostra é hibridizado para uma sonda de ácido nucléico complementar, preferivelmente usando um oligonucleotídeo ou outro ácido nucléico, que é identificado ou sintetizado em uma fase sólida, formando deste modo um híbrido de RNA:DNA de duplo filamento. Qualquer entidade que reconhece especificamente os híbridos de RNA:DNA, preferivelmente um anticorpo específico a um híbrido de RNA:DNA ou fragmento do mesmo, pode ser usado para detecção e medida.

Além disto, a presente invenção utiliza moléculas biológicas curtas, preferivelmente iniciadores ou sondas, imobilizadas em uma fase sólida. Pode ser desejável estender os iniciadores com uma transcriptase reversa, preferivelmente uma com ausência de função RNAse H, permitindo que anticorpos específicos a híbrido de RNA:DNA, fragmentos de anticorpo de híbrido de RNA:DNA ou entidades que se associam especificamente com híbridos de RNA:DNA se liguem mais eficientemente e sejam detectados.

Uma outra modalidade da presente invenção abrange três moléculas biológicas todas as quais são preferivelmente ácidos nucléicos. Uma primeira biomolécula de amostra se hibridiza a uma segunda molécula biológica complementar, preferivelmente uma sonda, e seja simultaneamente ou seqüencialmente, hibridiza o segundo ácido nucléico a um terceiro ácido nucléico, em que um dos ácidos nucléicos é imobilizado a uma fase sólida, e os híbridos de RNA:DNA que são formados são detectados por uma entida- de específica para híbridos de RNA:DNA.

Em uma outra modalidade da presente invenção, uma molécula biológica imobilizada preferivelmente compreende uma proteína, pode se ligar a uma biomolécula da amostra, preferivelmente um ácido nucléico, tal que se o ácido nucléico é um híbrido de RNA:DNA então ele pode ser detectado por uma entidade específica para híbridos de RNA:DNA. Por exemplo, o DNA pode se ligar a um sítio de ligação de DNA da proteína imobilizada, em que a parte do DNA do complexo proteína-DNA pode ser hibridizado ao RNA. De uma maneira similar, a proteína imobilizada pode se ligar a RNA, em que a parte RNA do complexo proteína-RNA pode ser hibridizado ao DNA. Os híbridos de RNA:DNA resultantes podem ser detectados por uma entidade específica para híbridos de RNA:DNA, tal como um anticorpo específico a híbrido de RNA:DNA ou um fragmento do mesmo. A presente invenção fornece vantagens significativas na técnica e em seu uso de microarrays. Visto que tanto a amostra bruta como purificada pode ser usada, a invenção tem um processo de preparação da amostra simplificado, permitindo uma detecção e uma medida mais precisa das moléculas biológicas. Além disto, as moléculas biológicas não precisam ser diretamente marcadas para a detecção e a medida, evitando deste modo qualquer interferência atribuída à etiqueta. A presente invenção fornece um método extremamente sensível para detectar e medir moléculas biológicas, pois pode ser obtida uma densidade de marcação muito alta utilizando uma entidade que se liga a híbridos de RNA:DNA. Tal sensibilidade excelente reduz a quantidade de amostra necessária para análise. Diferentemente de outros métodos, a presente invenção pode medir mRNA procariótico e um pouco de mRNA que tem ausência de cauda poli A ou foi degradado após a purificação.

Uma outra vantagem da presente invenção é que a transcriptase reversa não é necessária, mas ela pode ser empregada se desejada para sensibilidade melhorada. Um dos aspectos mais vantajosos da presente invenção é a quantificação direta das moléculas biológicas. Diferentemente das técnicas comumente usadas que quantificam apenas relativamente RNA, por exemplo, métodos competitivo de 2 cores, a presente invenção utiliza uma abordagem direta para interpretar os resultados e uma análise simplificada de moléculas biológicas. Além disto, a presente invenção pode analisar simultaneamente uma pluralidade de moléculas biológicas por causa de seu processo de amostra simplificado. Portanto, a presente invenção permite uma interpretação muito mais objetiva e simplificação de resultados.

Na presente invenção, uma "sonda" ou uma "sonda de ácido nucléico", como usado neste caso, é definida como sendo uma coleção de um ou mais ácido nucléico ou fragmentos similares a ácido nucléico cuja hibridização a um segundo ácido nucléico pode ser detectada. A sonda pode ser não marcada ou marcada como descrito abaixo de modo que sua ligação ao segundo ácido nucléico pode ser detectada. A sonda pode ser produzida a partir de uma fonte de ácidos nucléicos a partir de uma ou mais partes particulares do genoma, que pode(m) ser conhecida(s) ou desconhecida(s), por exemplo, um ou mais clones, um cromossomo inteiro isolado ou um fragmento de cromossomo, uma coleção de produtos de amplificação de reação de cadeia de polimerase (PCR), ou um ácido nucléico sintético ou uma molécula de PNA. Alternativamente, uma sonda pode compreender uma sequência randômica, semi-randômica ou uma sequência que foi considerada alvo. A sonda pode ser processada de alguma maneira, por exem-pio, bloqueando ou removendo ácidos nucléicos repetitivos ou enriquecendo ácidos nucléicos únicos. Portanto, a palavra "sonda" pode ser usada neste caso para se referir não apenas aos ácidos nucléicos que podem ser detectados, mas aos ácidos nucléicos na forma em que eles são aplicados ao alvo, por exemplo, com os ácidos nucléicos de bloqueio. Os ácidos nucléicos de bloqueio também podem ser denominados separadamente. O que a "sonda" se refere especificamente é claro a partir do contexto em que a palavra é usada. A sonda pode também funcionar como um iniciador no contexto de seu uso como um ponto iniciador para a polimerização, isto é, para a transcrição ou para a replicação. A sonda também pode ser ácidos nucléicos isolados imobilizados em uma superfície sólida. Em algumas modalidades, a sonda pode ser um elemento de um microarray de ácidos nucléicos como descrito, por exemplo, em WO 96/17958. Técnicas capazes de produzir microarrays de alta densidade podem também ser usadas para esta finalidade (ver, por exemplo, Fodor e outros, Science 767-773 (1991) e a Pat. U.S. Ne 5.143.854 de Pirrung, M.C.). As sondas podem também ser depositadas como elementos sobre o substrato de reação examinando as moléculas alvo e podem ser tanto diretamente como indiretamente marcadas. O ensaio divulgado da presente invenção pode ser usado para detectar e quantificar qualquer molécula biológica, ou combinação de moléculas biológicas em uma amostra, em que o termo "molécula biológica" e "biomolécula" usados intercambiavelmente, como definido neste caso, referem-se a ácidos nucléicos, aminoácidos, análogos, peptídeos, anticorpos e similares. ''Ácido nucléico" refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucle-otídeos e polímeros do mesmo de qualquer fonte, incluindo, mas não limitado a sintéticos ou derivados de bactérias, levedura, vírus e as células ou os tecidos de organismos superiores tais como plantas ou animais, e, a não ser se de outro modo limitado, pode abranger análogos conhecidos de nucleotí-deos que podem funcionar de uma maneira similar que os nucleotídeos que ocorrem naturalmente. Os ácidos nucléicos de peptídeo (PNAs) são também abrangidos dentro do escopo do termo ácido nucléico.

Um "ácido nucléico" é também definido neste caso como um ácido nucléico de filamento simples ou duplo que está na faixa de comprimento de 2 até aproximadamente 10,000 bases. Como também usado neste caso, o termo "ácido nucléico" refere-se a oligonucleotídeos, cDNA, mRNA, amplicons, plasmídeos e similares. Um "oligonucleotídeo" é uma sonda de ácido nucléico preferida que compreende pelo menos 6 até aproximadamente 60 nucleotídeos, preferivelmente aproximadamente 15 a 30 nucleotídeos, e mais preferivelmente aproximadamente 20 a 25 nucleotídeos, que podem ser usados na amplificação por PCR ou um ensaio de hibridização ou um microarray. Como usado neste caso, o oligonucleotídeo é substancialmente equivalente aos termos "amplímeros" e "oligômeros", como comu-mente definido na técnica, e pode ser usado como "iniciadores" e "sondas" como descrito neste caso.

Além disto, a não ser se de outro modo limitado, o termo abrange ácidos nucléicos que contêm análogos conhecidos que têm propriedades de ligação similares como a referência e são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos que ocorrem naturalmente. Além disto, uma se-qüência de ácido nucléico particular também abrange implicitamente variantes modificadas conservativamente dos mesmos (por exemplo, substituições de códon degenerado) e seqüências complementares assim como a se-qüência explicitamente indicada.

As seqüências de ácido nucléico para a detecção, denominadas neste caso como moléculas de ácido nucléico de interesse, ou moléculas de ácido nucléico alvo, são selecionadas com base nas necessidades e na finalidade da detecção. Em geral, uma molécula de ácido nucléico de interesse pode ser escolhida com base em critérios conhecidos para selecionar uma sequência de ácido nucléico para a detecção. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico particular pode estar associada com um patógeno, um estado de doença ou uma pré-disposição a uma doença, e a detecção de uma tal molécula de ácido nucléico pode ter um valor de diagnóstico. Por exemplo, pode ser detectado o mRNA específico a células tumorais ou células normais. Além disto, o método divulgado também permite a detecção de uma molécula biológica que compreende, mas não está limitado a, proteína, peptídeos, iniciadores, e moléculas de DNA ou RNA, produzidas por outros métodos bioquímicos ou químicos tais como aqueles produzidos por CAR, NASBA etc. A detecção de ácidos nucléicos também inclui aqueles de mutações, retiradas, inserções ou polimorfismos de nucleotídeo simples e outros polimorfismos.

Uma "amostra" ou "amostra alvo" como usado intercambiavel-mente neste caso é definida em seu sentido mais amplo e inclui tanto material biológico como material sintético de moléculas biológicas, incluindo, mas não [imitado a, aminoácidos, proteínas, peptídeos e similares e refere-se a uma amostra que compreende DNA genômico total, RNA total, DNA genô-mico ou mRNA de, por exemplo, cromossomos, ou seqüências selecionadas (por exemplo, promotores particulares, genes, fragmentos de amplificação ou de restrição, cDNA etc.) dentro de amplicons particulares ou retiradas. Uma modalidade da presente invenção é detectar seja na presença ou na ausência da amostra de ácido nucléico alvo e medir a quantidade da amostra que deve ser quantificada. O termo "ácido nucléico alvo" pode se referir à subseqüência específica de um ácido nucléico maior ao qual a sonda é direcionada ou à seqüência total (por exemplo, gene ou mRNA) cujo nível se deseja detectar, quantificar e determinar a presença ou a ausência. A diferença no uso será evidente a partir do contexto. A amostra de biomolécula pode ser extraída de células ou tecidos particulares. A amostra de tecido a partir da qual a amostra de biomolécula é preparada é tipicamente retirada de um paciente que se suspeita ter a doença associada com a amplificação ou a retirada que está sendo detectada. Em alguns casos, as moléculas biológicas, por exemplo, ácidos nucléi-cos, podem ser amplificadas usando técnicas padrão tal como PCR, antes da hibridização. O uso particular do termo "amostra do ácido nucléico11 será facilmente evidente a um versado na técnica no contexto em que o termo é usado. Por exemplo, a amostra de ácido nucléico pode ser um tecido ou uma amostra de lisato de célula preparada por métodos conhecidos na técnica. A amostra é preparada de tal maneira que as moléculas biológicas de interesse são liberadas das células e estão disponíveis para hibridização.

Alternativamente, uma amostra para o método divulgado da invenção pode ser de qualquer fonte que contém ou se suspeita conter o ácido nucléico. A fonte de ácido nucléico pode estar na forma purificada ou não purificada. Tipos preferidos de amostras, ou fontes de amostras, que são adequadas para uso no método divulgado, são aquelas amostras já conhecidas ou identificadas como amostras adequadas para uso em outros métodos de detecção de ácido nucléico. Muitas de tais amostras são conhecidas. Por exemplo, a amostra pode ser de um produto agrícola ou alimentar ou pode ser uma amostra clínica humana ou veterinária. As amostras podem ser um fluido biológico tal como plasma, soro, sangue, urina, saliva, lisato de célula ou similares. A amostra pode conter bactérias, levedura, vírus e as células ou os tecidos de organismos superiores tais como plantas ou animais, suspeitos de abrigar uma molécula biológica de interesse. Métodos para a extração e/ou a purificação de ácidos nucléicos, por exemplo RNA, foram descritos por Maniatis e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nova York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982).

Visto que as amostras também podem estar em um estado bruto ou não purificado, a preparação da amostra ou o processamento é simplificado. Usando as amostras encontradas em um estado mais natural, obtêm-se a detecção de expressão e a quantificação precisas. Além disto, diferentemente de outras técnicas que requerem a presença de uma sequência poli A para iniciar a etapa de transcriptase reversa de forma a marcar e detectar a amostra, a presente invenção pode ser usada para medir mRNA procarió-tico e mRNA eucariótico que não tenha uma cauda poli A na extremidade 3.

As moléculas biológicas de interesse para uso no método divulgado pode vir de várias fontes, tanto naturais como sintéticas. Por exemplo, vários tipos de RNA incluem RNA mensageiro, RNA ribossomal, RNA nucle-olar, RNA de transferência, RNA viral e RNA nuclear heterogêneo, DNA ge-nômico, cDNA, proteínas, peptídeos ou similares. Além disto, podem ser usado entidades inteiras que ocorrem naturalmente ou fragmentos dos mesmos.

As fases sólidas ou os suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, aqueles feitos de plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica ou materiais à base de sílica, vidro funcionalizado, silício modificado, carbono, vidros inorgânicos, membranas, náilon, fibras naturais tal como seda, lã e algodão, e polímeros. As fases sólidas ou os suportes sólidos podem ser porosos ou não porosos. Em algumas modalidades, o material que compreende o suporte sólido tem grupos reativos tais como carbóxi, amino, hidróxi etc., que são usados para ligação covalente ou não covalente das sondas. Os polímeros adequados podem incluir, mas não estão limitados a, poliestireno, tereftalato de polietileno glicol, acetato de polivinila, cloreto de polivini-la, pirrolidona de polivinila, poliacrilonitrila, metacrilato de polimetila, polite-trafluoroetileno, borracha butílica, borracha de estirenobutadieno, borracha natural, polipropileno, (poli) tetrafluoroetileno, (poli) vinilidenofluoreto, poli-carbonato e polimetilpenteno. Polímeros preferidos incluem aqueles representados na Pat. U.S. N9 5.427.779 de Elsner, H. e outros, expressamente incorporados neste caso como referência. As fases sólidas ou os suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, qualquer material sólido ao qual as sondas, os iniciadores, os oligonucleotídeos, as proteínas, os peptídeos ou similares podem estar acoplados ou aderidos. As fases sólidas ou os suportes sólidos podem ter qualquer forma útil incluindo películas finas ou membranas, contas, garrafas, placas de microcavidade, placas, lâminas, fibras, fibras tecidas, polímeros formatados, partículas, "chips11 e micropartículas. As formas de substrato preferidas para uma fase sólida são placas de microtí-tulo, "chips" de silício, lâminas de vidro e contas marcadas.

Para a aplicação geral, em que a molécula deve estar conva-lentemente ligada à superfície do substrato sólido, a superfície pode ser ativada usando uma variedade de funcionalidades para reação, dependendo da natureza do componente ligado e na natureza da superfície do substrato sólido. Portanto, a superfície do substrato sólido, se necessário, pode ser modificada pela introdução de funcionalidades que podem então reagir com o componente ligado.

Os "microarrays" compreendem uma pluralidade de moléculas biológicas diferentes que incluem cDNA, amplicons, plasmídeos, proteínas, peptídeos e similares, em que a pluralidade abrange pelo menos duas moléculas biológicas diferentes, em que as biomoléculas são imobilizadas em uma fase sólida em uma matriz ou estrutura ordenada. Em teoria, é preciso haver apenas um componente, mas em uma modalidade preferida haverá pelo menos 10, mais usualmente pelo menos 20, frequentemente pelo menos 50, desejavelmente 100 ou mais, e ainda 1.000 ou mais, mas usualmente não mais do que aproximadamente 104, mais usualmente não mais do que aproximadamente 100.000, com desde aproximadamente 10 a 10.000 imobilizado a uma fase sólida ou um suporte sólido que está sendo preferido. Embora teoricamente o número de diferentes componentes possa exceder 105, por causa da capacidade de especificamente ter uma quanti- dade ou um volume pequenos em um sítio finito especificado, para a maior parte não há necessidade de exceder 100.000 e tais números grandes de diferentes componentes adicionam uma certa complexidade à preparação do microarray. Como o número de componentes imobilizados em uma fase sólida usualmente não excederá 105, o número de sítios aos quais potencialmente se pode dirigir pode ser substancialmente maior, dependendo da natureza do componente ligado, da fonte do sinal, da natureza do sinal que é detectado, da sensibilidade com a qual o sinal pode ser detectado, da natureza do microarray ligado, tal como o tamanho do microarray, da maneira pela qual o microarray é produzido e similares. Portanto, os microarrays são preferivelmente usados para "seleção maciça paralela", descrita neste caso como a seleção simultânea de pelo menos 10, preferivelmente aproximadamente 1.000, e mais preferivelmente aproximadamente 10.000, hibridizações de moléculas biológicas.

Uma forma preferida de um microarray compreende um sistema determinado ao qual 1-10, 10-100 ou mais preferivelmente mais de 100 ácidos nucléicos separados, preferivelmente oligonucleotídeos, iniciadores ou similares podem ser depositados, podem ser determinados ou sintetizados como um conjunto de pequenos pontos ou elementos, como descrito neste caso. Estes ácidos nucléicos, depositados, determinados ou sintetizados em uma fase sólida são denominados neste caso como "elementos". Tipicamente, um elemento terá menos do que aproximadamente 1 mm de diâmetro. Geral mente, os tamanhos do elemento são de 1 pm até aproximadamente 5 mm, preferivelmente entre aproximadamente 1 pm até aproximadamente 1 mm. Os iniciadores de ácido nucléico para uso no método divulgado pode ser sintetizado usando métodos de síntese de oligonucleotídeo estabelecidos. Tais métodos vão desde a digestão enzimática padrão seguida por isolamento de fragmento de nucleotídeo (ver, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. 2a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Capítulos 5,6) a métodos puramente sintéticos, por exemplo, pelo método de fosforamidita de cianoetila usando um sintetizador de DNA 1 Plus Sistema Milfigen ou Be- ckman (por exemplo, um sintetizador Modelo 8700 automatizado da Milligen-Biosearch, Burlington, Modelo 380B MA ou ABI). Os métodos sintéticos úteis para a obtenção de oligonucleotídeos são também descritos por líuka e outros ÍAnn. Rev. Bioch.. 53: 323-356 (1984), (métodos de fosfotriéster e fosfi-to-triéster) e Narang e outros (Methods Enzvmol.. 65; 610-620 (1980), método de fosfotriéster).

Uma outra forma de microarray é um sistema tridimensional, cujos exemplos incluem um conjunto de contas codificadas (Luminex; Austin, TX) e um conjunto de contas marcadas com radiofreqüência (PharmaSeq; Monmouth Junction, NJ). Um microarray tridimensional, como usado neste caso, é qualquer fase sólida que tem três dimensões, em que cada microarray compreende uma pluralidade de diferentes moléculas biológicas, preferivelmente iniciadores de ácido nucléico, ligadas à superfície. Portanto, a localização de cada iniciador no microarray de fase sólida permite a identificação de cada sequência iniciadora de ácido nucléico. Podem ser utilizadas manipulações do ensaio divulgado. Por exemplo, um microarray tridimensional que compreende uma pluralidade de iniciadores de ácidos nucléicos pode ser misturado com ácidos nucléicos alvo de interesse. Quando os iniciadores são curtos, pode ser desejável estender estas moléculas com polime-rases, tal como, por exemplo, transcriptase reversa, de modo a incorporar a capacidade de ligação da entidade específica a híbrido de RNA:DNA, como descrito neste caso, incluindo anticorpos e fragmentos dos mesmos. Por captura dos anticorpos em uma fase sólida, os iniciadores do microarray de fase sólida em que os híbridos de RNA:DNA se formaram podem ser separados dos iniciadores em que não se formou híbrido. As entidades específicas a híbridos de RNA:DNA podem então ser detectadas e as identidades dos iniciadores determinadas. Muitos outros esquemas de ensaio podem ser usados para o método divulgado. O microarray apareceu como um formato preferido para a mini-aturação de ensaios que detectam e medem RNA, DNA, proteínas e similares, para aplicação relacionada a, por exemplo, expressão de gene, mutação e análise de polimorfismo, SNPs, detecção de variações genéticas etc. Os microarrays permitem que o nível de dezenas a vários milhares de genes ou variações genéticas (por exemplo, SN Ps) seja medido a partir de uma única amostra em um único dispositivo. A debilidade dos métodos de microarray tradicionais é que a molécula biológica, preferivelmente ácido nucléico (seja RNA ou DNA), a ser medida deve ser primeiro marcada, frequentemente por meio da conversão de um tipo de ácido nucléico para um outro, por exemplo, RNA para DNA marcado, de modo que ele possa ser detectado e medido. A presente invenção preferivelmente utiliza um "microarray de ácido nucléico", como definido neste caso, compreende uma pluralidade de sequências de ácido nucléico, incluindo, mas não limitado a, DNA, RNA, amplicons, plasmídeos e similares, imobilizadas a um suporte sólido aos quais ácidos nucléicos alvo complementares são hibridizados. Os ácidos nucléicos do microarray podem, por exemplo, conter seqüência de genes ou clones específicos, sondas, iniciadores ou oligonucleotídeos, ligados a uma fase sólida porosa ou não porosa ou um suporte sólido. Os ácidos nucléicos de várias dimensões podem ser usados nos microarrays da invenção.

Os ácidos nucléicos podem estar acoplados ao suporte ou substrato sólido. Tal microarray é um suporte sólido ao qual múltiplos ácidos nucléicos diferentes foram acoplados ou aderidos em um sistema, uma tela ou um outro padrão organizado. Os "microarrays de ácido nucléico" preferivelmente compreendem sistemas de filamentos de seqüência de ácido nucléico em "chips" de silício, lâminas de vidro ou outro suporte sólido e são de amplo uso para a detecção e a medida de expressão de gene, mutação e análise de polimorfismo etc. São disponíveis vários métodos para a preparação de microarrays de ácido nucléico. Os filamentos de sequências de ácido nucléico podem estar covalentemente ou não covalentemente a um substrato sólido por meio de métodos de acoplamento passivos ou químicos. Outras abordagens utilizam métodos sintéticos para construir as moléculas de ácido nucléico diretamente na superfície do substrato. Um abordagem mais simples, mas mais limitada, é preparar as sequências de ácido nucléico e então ligar as seqüências de ácido nucléico marcadas a um substrato que foi revestido com um par de ligação.

Alternativamente, os elementos de proteínas e/ou peptídeos podem estar acoplados ao suporte sólido ou substrato em um padrão organizado. Os elementos de proteína imobilizados podem estar ligados por ácidos nucléicos, proteínas, peptídeos e/ou híbridos de ácido nucléico. A detecção é obtida usando entidades específicas para os híbridos de RNA:DNA, tais como anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Se a proteína ou o peptídeo se liga aos híbridos de RNA:DNA, então a parte híbrido de RNA:DNA do complexo proteína-híbrido pode ser detectado usando uma entidade específica aos híbridos de RNA:DNA. Se a proteína se liga ao DNA, então a parte do DNA do complexo proteína-DNA pode ser hibridizada ao RNA, resultando na formação de um híbrido de RNA:DNA. Se a proteína se liga ao RNA, então a parte RNA do complexo proteína-RNA pode ser hibridizada ao DNA, resultando na formação de um híbrido de RNA:DNA. Os híbridos de RNA:DNA podem ser detectados usando uma entidade específica aos híbridos de RNA-.DNA, tais como anticorpos específicos ao RNA:DNA ou seus fragmentos dos mesmos.

Um "híbrido" é ácido nucléico de duplo filamento que compreende RNA ou DNA. O dúplex pode ser DNA:DNA, RNA:RNA ou RNA:DNA ou pode compreender nucleotídeos artificiais. Um homoduplex de RNA é uma RNA de duplo filamento com base emparelhado. Um heteroduplex RNA:DNA compreende um filamento de RNA e um filamento que compreende monô-meros de nucleotídeo de DNA. Toda ou uma parte do duplex pode ser de duplo filamento. Tipicamente, pelo menos 10 bases de duplex serão de duplo filamento. As frases "para hibridizar especificamente" ou "hibridização específica" ou "hibridizar seletivamente" ou similares referem-se à ligação, tornar duplex ou hibridizar uma molécula de ácido nucléico preferencialmente para uma sequência de nucleotídeo particular sob condições de restrição quando aquela seqüência está presente em uma mistura complexa (por exemplo, celular total) de DNA ou RNA.

As sondas de ácido nucléico imobilizadas em um substrato sólido permite a formação de híbridos de RNA:DNA no substrato. Tal localização fornece um meio conveniente de lavar os componentes de reação que poderíam interferir com etapas de detecção subseqüentes e uma maneira conveniente de testar as múltiplas seqüências de ácido nuciéico alvo diferentes simultaneamente. Os híbridos de RNA;DNA podem ser independentemente formados em cada sítio em que um primeiro iniciador é aderido. Para a imobilização das sondas para formar um microarray de fase sólida de moléculas biológicas, podem ser usados métodos descritos neste caso.

Uma "entidade", como definida neste caso, refere-se a qualquer molécula que reconhece especificamente híbridos de RNA:DNA. Exemplos de entidades que podem reconhecer os híbridos de RNA:DNA podem incluir, mas não estão limitados a, anticorpos quiméricos, proteínas naturais ou geneticamente engenheiradas ou ácidos nucléicos que se ligam especificamente a híbridos de RNA:DNA.

Uma modalidade preferida de entidade é "anticorpo". Como usado neste caso, pretende-se que o anticorpo seja usado em seu sentido mais amplo e inclua anticorpos inteiros intactos, fragmentos de anticorpo, anticorpos recombinantes, anticorpos quiméricos, agregados de anticorpo polifun-cional ou em geral qualquer substância derivada de anticorpo que compreende pelo menos um anticorpo que combina o sítio que tem as características descritas neste caso ou outras entidades. Preferivelmente, na presente invenção, estas entidades detectam especificamente os híbridos de RNA:DNA. Os anticorpos de quaisquer classes e subclasses conhecidas de imunoglobulinas são consideradas, por exemplo, IgG, IgM etc., assim como fragmentos ativos tais como fragmentos de IgG convencionalmente conhecidos como Fab, F(ab') e F(ab')2. Os anticorpos podem compreender os anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e de neutralização) que se ligam a um epitopo específico e anticorpos monoclonais que têm sensibilidade poliepitópica ou outras entidades.

Quaisquer anticorpos ou entidades específicas para os híbridos de RNA:DNA de duplo filamento podem ser usados para detectar diretamente o híbrido da invenção. Na presente invenção, os anticorpos policlo-nais são preferidos na modalidade que os utiliza para detectar seqüências de ácido nuciéico curtas, preferivelmente aquelas menores do que 30 bases de comprimento.

Os anticorpos usados para detectar os híbridos de RNA;DNA podem ser tanto anticorpos monoclonais como policionais. Pode ser vantajoso usar uma mistura de anticorpos monoclonais e policionais. Além disto, a invenção inclui o uso de anticorpos monoclonais e policionais comumente usados que podem ser produzidos com propriedades de ligação específicas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais e policionais que se ligam especificamente a híbridos de RNA:DNA muito curtos (menos de 20 pares de base) podem ser produzidos e podem encontrar uso na detecção de híbridos de RNA:DNA muito curtos. Além disto, os anticorpos monoclonais e policionais podem ser produzidos de tal maneira que sejam mais ou menos sensíveis a desemparelhamentos dentro do híbrido de RNA:DNA. Os anticorpos que são mais sensíveis a desemparelhamentos dentro do híbrido de RNA:DNA irão encontrar uma utilidade extra na detecção de variação genética enquanto os anticorpos que são menos sensíveis a desemparelhamentos dentro do híbrido de RNA:DNA irão encontrar uso na detecção e na quantificação de classes específicas de ácido nucléico. Outros anticorpos podem também ser usados para detectar especificamente triplexes de ácido nucléico (DNA:RNA:DNA ou RNA:DNA:RNA) ou híbridos DNA:PNA ou RNAPNA, que PNA é definido neste caso como ácido nucléico de peptídeo.

Os anticorpos policionais direcionados contra os híbridos de RNA:DNA são preparados injetando um animal de laboratório com uma quantidade eficaz dos peptídeos ou componente antigênico, coletando soro do animal e isolando soros específicos por qualquer uma das técnicas imunoadsorventes conhecidas. Os animais que podem facilmente ser usados para a produção de anticorpos de híbrido RNA:DNA policionais incluem galinhas, camundongos, coelhos, ratos, cabras, cavalos e similares. Em uma modalidade preferida do presente ensaio, um anticorpo de híbrido de RNA:DNA policlonal é derivado de cabras imunizadas com um híbrido de RNA:DNA. O anticorpo específico ao híbrido é purificado a partir de soro de cabra por purificação por afinidade contra o híbrido de RNA:DNA imobilizado em um suporte sólido.

Os anticorpos monoclonais, preparados por técnicas padrão podem ser usados no lugar dos anticorpos policlonais. Uma variedade de técnicas pode ser usada para obter anticorpos específicos para híbridos de RNA:DNA. (Por exemplo, a Patente U.S. Número 4.833,084 de Carrico, a Patente U.S. Número 4.732,847, de Stuart e outros e Stuart e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 3751 (1981)). Um anticorpo monoclonal específico para híbridos de RNAiDNA, secretados por hibridoma HB 8730, é divulgado na Patente U.S. N2 4.833.084 de Carrico. Preferivelmente, de acordo com a presente invenção, os anticorpos monoclonais são usados para a detecção de ácidos nucíéicos maiores do que 30 bases de comprimento. O isolamento de híbridos anti-RNA:DNA melhorou o desenvolvimento de ensaios para mutações genéticas ligadas a defeitos específicos e a detecção de infecções bacterianas e virais. No entanto, os ensaios que utilizam estes anticorpos monoclonais específicos a híbrido de RNA:DNA freqüentemente sofrem de um alto nível de ligação não-específica causando resultados falso positivos. Boguslawski e outros, J. Immunol. Methods 89: 123-130 (1986) desenvolveu um ensaio de hibridização usando contas de poliestireno revestidas com anti-híbrido isoladas em papel filtro em uma tentativa de reduzir a ligação não-específica e evitar procedimentos de lavagem complicados. O anticorpo preferido para os híbridos de RNA:DNA ó preparado pelo método de Kitawaga, Y. e Stolfar, B. D., Mol. Immunoloav 19: 413-420 (1982) ou de acordo com o método apresentado na Patente U.S. N2 4.732.847, publicada em 22 de março de 1988, de Stuart e outros. A identificação da presença dos híbridos pode ser obtida empregando seja anticorpos monoclonais como policlonais ou outras entidades específicas para o complexo de híbrido de RNA:DNA. A detecção pode ser obtida por marcação seja do anticorpo específico para o complexo de híbrido de RNA:DNA ou empregando os anticorpos marcados que se ligam ao anti-complexo. Por exemplo, quando o anticorpo é derivado de um camundongo, os anticorpos para anticorpos de camundongo, por exemplo, IgG anticamun-dongo de coelho, podem ser marcados de modo a se ligar a qualquer anti- complexo ligado ao complexo ligado ao suporte sólido.

Uma ampla variedade de etiquetas foi usada em outros ambientes que podem ser aplicados neste caso. Uma das etiquetas mais comuns são radionucletos, que podem ser usados com auto-radiografia para visualizar as áreas de ligação. Uma outra etiqueta é um agente de fluorescência tal como fluoresceína, mercocianina ou rodamina que, por irradiação com luz de excitação, pode ser monitorada à presença de fluorescência. Alternativamente, pode ser usada uma enzima que resulta em um produto que pode ser detectado e localizado na área da enzima. Um grande número de corantes ou metais capazes de redução pode ser empregado para fornecer detecção. Enzimas comuns incluem peroxidase de rábano, oxidase de glicose, galactosidase, fosfatase alcalina ou similares. A etiqueta particular ou a maneira em que o sinal que pode ser detectado é observado não é fundamental nesta invenção. Empregando os anticorpos ao anticomplexo, o número de etiquetas associadas com uma ligação particular do anticomplexo pode ser muito amplificado.

Para facilitar a detecção da ligação resultante do anticorpo, ou outra entidade específica aos híbridos de duplo filamento, ao híbrido, o anticorpo irá normalmente ser marcado com um grupo químico que pode ser detectado. Exemplos de grupos químicos que podem ser detectados que podem servir como etiquetas são grupos enzimaticamente ativos, tais como co-enzimas, substratos de enzima, inibidores de enzima e as próprias enzimas, agentes fluorescentes, cromóforos, agentes luminescentes, ligando que podem ser ligados especificamente tal como biotina ou haptenos que podem ser detectados por ligação de anticorpos de avidina marcada ou hapteno marcado e radioisótopos.

De forma que a hibridização completa ocorra, são necessárias condições ótimas para a formação de híbridos de duplo filamento. O termo "condições de restrição" refere-se a condições nas quais uma sonda irá hi-bridizar preferivelmente a uma sequência complementar, e em uma menor extensão, ou não total mente, a outras sequências. A complementariedade entre duas moléculas de filamento simples pode ser "parcial", em que ape- nas parte dos ácidos nucléicos se ligam ou ela pode ser completa quando existe complementariedade total entre as moléculas de filamento simples. O grau de complementariedade entre filamentos de ácido nucléico tem efeitos significativos sobre a eficiência e a concentração da hibridização entre os filamentos de ácido nucléico. Isto é de importância particular nas reações de amplificação, que dependem da ligação entre os filamentos de ácidos nucléicos e na concepção e no uso de moléculas de PNA. Uma "hibridização de restrição" e "condições de lavagem de hibridização de restrição" no contexto dos experimentos de hibridização de ácido nucléico, tais como, por exemplo, hibridizações de Southern e de Northern dependem da sequência e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. Um guia amplo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Labora-torv Techniaues in Biochemistrv and Molecular Bioloqy-Hibridization with Nucleic Acid Probes. parte 1, capítulo 2. "OverView of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. "Ligação(Ões) substancial mente" refere(m)-se à hibridização complementar entre um ácido nucléico de sonda e um ácido nucléico alvo e abrange desemparelhamentos menores que podem ser acomodados por redução da restrição dos meios de hibridização para obter a detecção desejada da seqüência de polinucleotídeo alvo hibridizada à seqüência de oligo-nucleotídeo ligada, que inclui cDNA, amplicons, plasmídeos e similares. A hibridização do ácido nucléico da sonda à molécula de ácido nucléico de interesse pode ser realizada sob quaisquer condições adequadas e preferivelmente sob condições que favorecem a hibridização e formam híbridos de duplo filamento. Ver, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. 2a Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).

Por exemplo, em uma modalidade da presente invenção, é necessário um iniciador para iniciar a transcriptase reversa. Um "iniciador" é definido neste caso como uma molécula de ácido nucléico que pode se anelar a uma molécula modelo de DNA ou RNA e serve como o ponto de início para a síntese de ácido nucléico. Um iniciador usual geralmente é um oíigonucleotídeo sintético, incluindo cDNA, amplicons, piasmídeos e similares, mas nucleotídeos que ocorrem naturalmente atuam como iniciadores também, tanto in vitro como in vivo. Os usos in vitro dos iniciadores incluem, por exemplo, síntese de cDNA, seqüenciamento de didesóxi Sanger e PCR.

Esta modalidade particular requer um ''modelo" de ácido nucléi-co de interesse de forma a identificar o(s) ácido{s) nucléico(s) de interesse uma vez que a(s) amostra(s) de ácido nucléico alvo é(são) obtida(s). "Modelo de ácido nucléico" ou "modelo" como usado intercambeavefmente neste caso é definido como uma seqüência de polinucleotídeo a partir da qual a informação é lida para direcionar a síntese de uma outra macromolécula. Por exemplo, isto pode se referir a um filamento de DNA que está sendo copiado durante a síntese de DNA ou a transcrição de RNA a um filamento de RNA que está sendo copiado durante a tradução reversa, Um iniciador do método divulgado pode ser um oíigonucleotídeo, cDNA, amplicons, piasmídeos e similares, seja RNA ou DNA, que tem seqüência complementar a uma região de uma molécula de ácido nucléico de interesse. Como usado neste caso, a seqüência complementar do iniciador é denominada como a "parte complementar". Como usado neste caso, a região na molécula de ácido nucléico alvo de interesse complementar ao iniciador é denominado como a "região complementar iniciadora". A região complementar iniciadora de uma molécula de ácido nucléico alvo de interesse pode ser qualquer região da molécula alvo de interesse. Para a modalidade do presente ensaio que utiliza a transcriptase reversa, um modo preferido compreende a região complementar iniciadora de uma molécula de ácido nucléico alvo em uma certa distância da terminação primária 5 da molécula de ácido nucléico modelo. Isto fornece uma região mais comprida do modelo de ácido nucléico entre o sítio da hibridização iniciadora e o fim da molécula de ácido nucléico modelo, amplificando deste modo a quantidade de híbrido de RNA:DNA a ser detectada.

Em geral, a região complementar iniciadora de uma molécula de ácido nucléico de interesse é escolhida com base em critérios conhecidos para selecionar uma seqüência de ácido nucléico para a detecção. Por exemplo, para detectar uma molécula de ácido nucléico particular entre outras moléculas de ácido nucléico, prefere-se que a região complementar ini-ciadora seja característica, ou única, da molécula de ácido nucléico alvo de interesse. Se é desejado que qualquer classe de moléculas de RNA seja detectada, é preferido que seja escolhida a região complementar iniciadora que tenha uma seqüência que é a mesma ou substancialmente a mesma em todas as moléculas de ácido nucléico alvo de interesse. Uma vez que é selecionada uma seqüência iniciadora complementar, é concebida ou escolhida a seqüência iniciadora complementar à região complementar iniciadora escolhida da molécula de interesse. Qualquer molécula de ácido nucléico para a qual uma seqüência é conhecida ou para a qual uma seqüência pode ser derivada pode ser detectada usando o método divulgado.

No método da invenção, a porção complementar de um iniciador tem um comprimento que suporta hibridização específica e estável entre o iniciador e a região complementar iniciadora. Geralmente, um iniciador da presente invenção compreende 10 a 100 nucleotídeos, mas é preferivelmente 15 a 30 nucleotídeos. A capacidade de caracterizar um indivíduo por seu genoma é por causa da variabilidade inerente da informação genética. Embora as se-qüências de DNA que codificam para as proteínas necessárias sejam bem conservadas através das espécies, há regiões de DNA que são não codifi-cantes ou codificam para porções de proteínas que não têm funções fundamentais e, portanto, a preservação absoluta da seqüência de ácido nucléico não é fortemente selecionada. Estas regiões variáveis são identificadas por marcadores genéticos. Tipicamente, os marcadores genéticos são ligados por sondas tais como oligonucleotídeos ou amplicons que se ligam especificamente a regiões variáveis únicas do genoma. Em alguns casos, a presença ou a ausência da ligação a um marcador genético identifica indivíduos por sua seqüência de ácido nucléico única. Em outros casos, um marcador se liga a seqüências de ácido nucléico de todos os indivíduos mas o indivíduo é identificado pela posição no genoma ligado por uma sonda marcadora. As causas principais de variabilidade genética são mutações de adição, retirada ou pontuais, elementos de recombinação e transposons dentro do genoma de indivíduos em uma população de planta. A presente invenção pode ser aplicada para detectar e medir variação genotípica. Por exemplo, podem ser detectados polimorfismos, tais como SN Ps, que são representados por se-qüências diferentes.

Em geral, o ensaio da presente invenção envolve as seguintes etapas: 1. Preparar uma sonda de biomolécula ou um microarray de sondas ligadas a um substrato sólido (tal como, por exemplo, em chapas, lâminas, cavidades, placas, contas, partículas, cubas, filamentos, "chips11 e tiras, tanto porosos como não porosos) por determinação ou síntese da sonda de biomolécula em uma fase sólida através de técnicas químicas padrão; 2. Adicionar a amostra alvo que contém a primeira molécula biológica de interesse às segundas sondas de biomolécula imobilizadas e que permitem que os híbridos de RNA:DNA se formem; 3. Adicionar uma entidade que pode ser detectada específica aos híbridos de RNA:DNA (incluindo os anticorpos específicos a híbrido de RNA:DNA ou fragmentos dos mesmos); e 4. Detectar a entidade ligada aos híbridos de RNA:DNA imobilizados.

Uma outra modalidade da presente invenção envolve as seguintes etapas: 1. Preparar uma sonda de biomolécula ou um microarray de sondas ligadas a um substrato sólido (tal como, por exemplo, em chapas, lâminas, cavidades, placas, contas, partículas, cubas, filamentos, "chips" e tiras, tanto porosos como não porosos) por determinação ou síntese da sonda de biomolécula em uma fase sólida através de técnicas químicas padrão; 2. Adicionar a amostra alvo que contém a primeira molécula biológica de interesse às segundas sondas de biomolécula imobilizadas e que permitem que os híbridos de RNA:DNA se formem; 3. Adicionar transcriptase reversa, preferivelmente que tem ausência de função RNAse H e é termoestável. 4. Incubar sob condições que promovem a transcrição reversa que amplia a seqüência, formando, assim, um híbrido de RNA:DNA muito mais comprido e que melhora a detecção de anticorpo. 5. Adicionar uma entidade que pode ser detectada específica aos híbridos de RNA:DNA {incluindo os anticorpos específicos a híbrido de RNA:DNA ou fragmentos dos mesmos); e 6. Detectar a entidade ligada aos híbridos de RNA:DNA imobilizados.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui as seguintes etapas: 1. Preparar uma sonda de biomolécula ou um microarray de sondas ligadas a um substrato sólido (tal como, por exemplo, em chapas, lâminas, cavidades, placas, contas, partículas, cubas, filamentos, "chips" e tiras, tanto porosos como não porosos) por determinação ou síntese da sonda de biomolécula em uma fase sólida através de técnicas químicas padrão; 2. Adicionar a amostra alvo que contém a primeira molécula biológica de interesse a uma segunda sonda de biomolécula a um microarray e uma terceira segunda sonda de biomolécula não ligada; 3. Hibridizar a primeira molécula biológica aivo a uma região complementar da terceira sonda de biomolécula; 4. Hibridizar a sonda de biomolécula imobilizada a uma região complementar não-hibridizada da terceira sonda de biomolécula; 5. Adicionar uma entidade que pode ser detectada específica a híbridos de RNA:DNA (incluindo anticorpos específicos a híbrido de RNA:DNA ou fragmentos dos mesmos); e 6. Detectar a entidade ligada aos híbridos de RNA:DNA imobilizados.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui as seguintes etapas: 1. Preparar uma sonda de biomolécula ou um microarray de sondas ligadas a um substrato sólido (tal como, por exemplo, em chapas, lâminas, cavidades, placas, contas, partículas, cubas, filamentos, "chips" e tiras, tanto porosos como não porosos) por determinação ou síntese da sonda de biomolécula em uma fase sólida através de técnicas químicas padrão; 2. Adicionar a amostra alvo que contém a primeira molécula biológica de interesse a uma segunda sonda de biomolécula a um microarray e uma terceira segunda sonda de biomolécula marcada de maneira que pode ser detectada não ligada; 3. Hibridizar a primeira molécula biológica alvo a uma região complementar da segunda sonda de biomolécula ligada à fase sólida e formar um híbrido de RNA:DNA; 4. Hibridizar a segunda sonda de biomolécula ligada à fase sólida a uma região complementar da terceira sonda de biomolécula marcada de maneira que pode ser detectada; 5. Adicionar uma entidade específica que pode ser detectada para híbridos de RNA:DNA (incluindo anticorpos específicos a híbrido de RNA:DNA ou fragmentos dos mesmos); e 6. Detectar separadamente tanto a entidade específica de híbridos de RNA:DNA ligados aos híbridos de RNA:DNA imobilizados como a sonda de biomolécula marcada de maneira que pode ser detectada. O ensaio divulgado pode ser usado para detectar uma pluralidade de moléculas biológicas diferentes de interesse em uma amostra. Isto é preferivelmente realizado seja por seleção de uma sequência que está presente em cada uma das moléculas biológicas de interesse ou por seleção com sondas múltiplas que são coletivamente complementares a regiões nas moléculas biológicas de interesse. Prefere-se a última abordagem para uso na detecção, por exemplo, de algumas doenças ou pré-disposições que estão associadas a várias mutações diferentes em genes particulares, ou variações genéticas, incluindo, mas não limitadas a mutações de inserção ou retirada. A presente invenção também fornece um ensaio que pode ser aplicado a uma variedade de aplicações, incluindo, mas não limitadas a, expressão de gene, detecção molécula biológica (isto é, RNA, DNA, proteína) em microarrays, detecção de mutação e polimorfismo (isto é, SNP) e similares. Em uma modalidade particular, prefere-se selecionar as sequências que são complementares às regiões dos produtos de ácido nucléico mutante destes genes que são característicos de cada uma das mutações. Portanto, uma vantagem principal deste ensaio é a aplicação de alta produção, permitindo alta seleção de uma pluralidade de amostras e doenças potenciais. O método divulgado pode ser também usado para determinar a razão da expressão de diferentes tipos de moléculas biológicas de organismos individuais ou uma amostra individual. Para esta finalidade, o método é usado para detectar tipos múltiplos simultaneamente. A detecção em micro-array, como divulgado neste caso, é útil para esta finalidade. O método divulgado pode ser também útil para detectar seqüências de biomolécula similares ou relacionadas em que as moléculas biológicas relacionadas têm um motivo de sequência comum entre elas, mas que são de outra maneira diferentes. Por exemplo, as células podem conter tipos múltiplos de molécula biológica que têm sequência reguladoras similares, motivos estruturais similares ou outras seqüências em comum. Tais classes de moléculas de ácido nucléico podem ser detectadas com tipos de sonda simples por concepção da sonda para hibridizar a sequência comum.

No ensaio divulgado, uma entidade específica para híbridos de RNA:DNA, incluindo anticorpos específicos a híbrido de RNA:DNA e seus fragmentos, é utilizada para detectar moléculas biológicas que foram hibridi-zadas ao microarray da sonda tomando a marcação das biomoléculas alvo não mais necessária, mas, sim, opcional. Nesta abordagem, quanto maior o híbrido de RNA:DNA, maior o sinal, visto que um híbrido de RNA:DNA mais comprido pode se ligar mais ao anticorpo do que um híbrido de RNA:DNA curto. Portanto, quanto maiores os filamentos de sonda de ácido nucléico no microarray, mais sensível a detecção de ácidos nucléicos alvo ou alternativamente maior a intensidade do sinal para uma certa quantidade de ácidos nucléicos alvo híbridizados. Infelizmente, torna-se mais difícil e crescentemente caro sintetizar, preparar ou utilizar filamentos mais compridos de sondas na preparação destes microarrays.

Uma modalidade divulgada do presente ensaio descreve relativamente seqüências de sonda de ácido nucléico curtas ligadas a um subs- trato sólido, minimizando o tempo, o esforço e o custo necessário para criar 0 microarray. As sequências de ácido nucléico alvo na amostra são hibridi-zados nestas sondas criando um híbrido de RNA:DNA curto com uma cauda de ácido nucléico comprida. Este híbrido de RNA:DNA curto se liga apenas a 1 ou 2 anticorpos de RNA:DNA. Quando a transcriptase reversa é adicionada e as condições são tais que a transcriptase reversa ocorre, a parte da sonda de ácido nucléico do híbrido de RNA:DNA é ampliada no comprimento do filamento de ácido nucléico alvo, portanto aumentando muito o comprimento do híbrido de RNA:DNA. Se o filamento do ácido nucléico alvo tinha 1500 bases de comprimento, então o híbrido de RNA:DNA resultante se aproximaria de 1500 pares de base. Um híbrido de RNA:DNA deste comprimento se liga significativamente mais a anticorpos anticorpos de RNA:DNA, aumentando assim muito o sinal produzido e aumentando a sensibilidade da detecção de seqüências de ácido nucléico alvo específicas.

Uma modalidade divulgada é um método de detecção de seqüências de ácido nucléico alvo por transcrição reversa de toda ou parte da seqüência da sonda de ácido nucléico ligada com uma transcriptase reversa que tem ausente a função exonuclease dependente de híbrido de RNA:DNA (comumente denominado de função RNAse H ou componente) e detecção do híbrido de RNA:DNA resultante com um anticorpo específico para os híbridos de RNA:DNA. As sondas de ácido nucléico são imobilizadas em um suporte sólido de forma a associar o híbrido de RNA:DNA com o suporte sólido. Isto permite a separação fácil de híbridos da solução da amostra e a detecção específica de moléculas de ácido nucléico com base na posição do híbrido no suporte sólido.

Em um método da presente invenção, a transcripção reversa é realizada usando uma transcriptase reversa, preferivelmente uma transcriptase reversa que tem ausente a função RNAse Η. A mistura da reação que inclui a molécula de ácido nucléico de interesse, preferivelmente nesta modalidade, RNA; o iniciador de ácido nucléico imobilizado hibridizado; e a transcriptase reversa é então incubada sob condições para permitir a transcriptase reversa da molécula de RNA de interesse e a formação de híbridos de RNA:DNA. Exemplos de transe ri ptases reversas que podem ser usadas no método divulgado ou que podem ser adaptadas para uso no método divulgado são relacionadas na Tabela 1. A transcriptase reversa preferida para uso no presente método inclui transcriptases reversas, 18053-017, 18064-014 e 18064-071 da Life Technology; transcriptases reversas M5301 e M5302 da Promega; e transcriptase reversa 600085 da Strategene; cada uma divulgada na Tabela 1. A transcriptase reversa geralmente pode ser realizada em qualquer temperatura dentro da faixa de temperatura funcional da transcriptase reversa. Preferivelmente, a temperatura de incubação é qualquer temperatura em que a transcriptase reversa é funcional e o iniciador permanece hibri-dizado na molécula de ácido nucléico alvo. Para as transcriptases reversas não-termofílicas, as temperaturas preferidas são aquelas temperaturas que são a temperatura ótima para a transcriptase reversa ou próximo de tal temperatura. Para a maioria das transcriptases reversas não-termofílicas, esta temperatura será entre aproximadamente 25°C e 45°C.

Em uma modalidade preferida, a transcriptase reversa termofíli-ca é usada para aumentar seletivamente. A temperatura mais alta em que uma transcriptase reversa termofílica é funcional pode ser muito alta. Por esta razão, as faixas de temperatura preferidas para a transcrição reversa quando uma transcriptase reversa termofílica é usada são mais adequadamente descritas em termos da temperatura de fusão calculada de um híbrido entre a molécula de RNA de interesse e o iniciador. Tal temperatura de fusão é denominada neste caso como a temperatura de fusão RNA/iniciador (R/P Tm). As faixas preferidas incluem a temperatura de 20°C abaixo da temperatura de fusão de um híbrido entre a molécula de RNA de interesse e o iniciador e 5°C acima da temperatura de fusão de um híbrido entre a molécula de RNA de interesse e o iniciador. Outras faixas preferidas quando se usa uma transcriptase reversa termofílica incluem aquelas relacionadas na Tabela 2. Tabela 2 É especificamente observado que as faixas específicas mas não mencionadas dentro das faixas listadas acima são consideradas como uma faixa preferida alternativa. As temperaturas preferidas para a transcrição reversa incluem aproximadamente 20°C abaixo da R/P Tm, aproximadamente 15°C abaixo da R/P Tm, aproximadamente 12°C abaixo da R/P Tm, aproximadamente 10°C abaixo da R/P Tm, aproximadamente 7°C abaixo da R/P Tm, aproximadamente 5°C abaixo da R/P Tm, aproximadamente 3°C abaixo da R/P Tm, 20°C abaixo da R/P Tm, 15°C abaixo da R/P Tm, 12°C abaixo da R/P Tm, 10°C abaixo da R/P Tm, 7°C abaixo da R/P Tm, 5°C abaixo da R/P Tm e 3°C abaixo da R/P Tm. Em geral, quanto mais próxima a temperatura está da R/P Tm, maior o grau de discriminação que haverá entre os híbridos específicos e não específicos do RNA e do iniciador. Se a temperatura está próxima da R/P Tm, no entanto, a estabilidade reduzida de híbridos específicos pode fazer com que o escorvamento seja menos eficiente. A R/P Tm pode ser determinada seja por cálculo ou por medida empírica. Para calcular a R/P Tm, pode ser usada qualquer fórmula estabelecida para calcular a estabilidade de híbridos de ácido nucléico. Uma fórmula preferida para calcular a R/P Tm é que foi derivada de estudos sobre a estabilidade de híbridos de DNA:DNA perfeitamente emparelhados. Para os híbridos de RNA-.DNA, a incorporação da concentração de formamida na fórmula não se mantém porque a relação entre a concentração de formamida e a depressão de Tm não é linear. Em formamida a 80 %, os híbridos de RNA:DNA são mais estáveis do que os híbridos de DNA:DNA, aumentando a TM em aproximadamente 10 a 30°C dependendo da sequência (Hames & Higgins, Nucleic Acid Hvbridization: A Practical Approach (IRL Press Limited, Oxford, Inglaterra, 1985). A realização da formamida a 80 % pode, portanto, ser usada para suprimir a formação de duplexes DNAiDNA, para selecionar preferivelmente os híbridos de RNA:DNA e para estimar a temperatura de fusão para RNA/iniciador. Como as fórmulas empiricamente derivadas para a avaliação da temperatura de fusão do híbrido de RNA:DNA podem não ser tão precisas quanto para os iniciadores de ácido nucléico curtos, a temperatura de hibridização e preferivelmente determinada por avaliação da estabilidade do híbrido em cátion monovalente 0,1 - 0,4 M em temperaturas que estão na faixa de 40 a 60°C. A R/P Tm pode também ser determinada empiricamente (Lesnick e Freier, Biochemistrv 34: 10807-10815 (1995), McGraw e outros, Biotechniques 8: 674-678 (1990) e Rychlik e outros, Nucleic Acids Res. 18: 6409-6412 (1990)).

Como usado neste caso, uma transcriptase reversa termofílica é qualquer transcriptase reversa que retém pelo menos 5 % de sua atividade máxima em qualquer temperatura acima de 50°C ou que tem uma temperatura ótima de pelo menos 50°C. As transcriptases reversas preferidas são aquelas que têm uma temperatura ótima de pelo menos 50°C. Como usado neste caso, a atividade máxima de uma transcriptase reversa é definida como a atividade, conforme medido no ensaio descrito abaixo, que uma certa transcriptase reversa apresenta em sua temperatura ótima. Como usado neste caso, a temperatura ótima de uma transcriptase reversa é definida como a temperatura em que a atividade da transcriptase reversa é a maior, conforme medido no ensaio descrito abaixo. A temperatura ótima de uma certa transcriptase reversa pode ser determinada medindo sua atividade no ensaio a seguir em várias temperaturas. Em geral, uma temperatura ótima necessária pode ser determinada apenas dentro de uma faixa de modo que os ensaios necessitam ser realizados apenas em ensaio de 5 a 10 graus.

Os métodos para a imobilização das seqüências de ácido nucléico em substratos de fase sólida são bem estabelecidos. Os oligonucleo-tídeos, incluindo sondas pela metade e iniciadores de replicação em círculo de rotação, podem ser acoplados usando métodos de acoplamento estabelecidos. Por exemplo, os métodos de ligação são descritos por Pease e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91(11): 5022-5026 (1994) e Khrapko e outros, Mol. Biol, ÍMosk) ÍURSS1 25: 718-730 (1991). Um método para a imobilização de oiigonucleotídeos 3'-amina em lâminas revestidas com caseína é descrito por Stimpson e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 6379-6383 (1995). Um método preferido de ligação de oiigonucleotídeos a substratos em estado sólido é descrito por Guo e outros, Nucleic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994). A imobilização e a ordenação de ácidos nucléicos ou moléculas iniciadoras podem ser realizadas usando qualquer técnica adequada. Por exemplo, a imobilização pode ser realizada seja por síntese de ácido nucléi-co in situ (Maskos e Southern, Nucleics Acids Research. 20: 1679-1684 (1992); Pease e outros, Proc, Natl. Acad. Sei. USA 91: 5022-5026 (1994) ou por ligação covalente ou passiva de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (Guo e outros, Nucleic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994)), ou por ligação covalente ou passiva de outros ácidos nucléicos, amplicons, cDNAs e similares, em combinação com tecnologias de ordenação da robótica. Outras técnicas de imobilização são descritas na Patente U.S. Nfl 5.412.087 de McGall e outros, na Patente U.S. Na 5.429.807, de Matson e outros, e na Patente U.S. Nô 5.510.087, de Fodor e outros. Milhares de iniciadores diferentes podem ser dispostos em uma área pequena em um suporte sólido para examinar milhares de moléculas de ácido nucléico alvo. A densidade de ácidos nucléicos ou iniciadores deve ser emparelhada com o método de disposição e os meios de detecção.

Uma modalidade da presente invenção compreende a hibridiza-ção de seqüências de ácido nucléico alvo ao sistema universal que compreende sondas de ácido nucléico específico, em que um "sistema universal" ou "seqüências do sistema universal" neste caso definidos intercambeavel-mente como seqüências de ácido nucléico curtas de todas as combinações de base possíveis. As seqüências do sistema universal compreendem uma gama de 6 - 10 bases, preferivelmente 5-6 bases, em que o número de combinações possíveis (isto é, sondas diferentes ligadas à fase sólida) é 1024 e 4096, respectivamente, e permite a análise da expressão de ácido nucléico em que o resultado pode ser usado como uma "impressão digital", em que diferentes tecidos ou amostras fornecem diferentes "impressões digitais".

As modalidades que compreendem uma terceira sonda de ácido nucléico podem imobilizadas ao sistema de fase sólida usando "etiquetas de captura". Como usado neste caso, uma etiqueta de captura é qualquer composto que pode se ligar a um outro composto ou grupamento. O iniciador é, assim, imobilizado por meio de ligação de uma etiqueta de captura anexada a seu parceiro de ligação. Tais parceiros de ligação são denominados neste caso como "diques de captura". Uma etiqueta de captura é um composto, tal como um ligando ou um hapteno, que se liga ou interage com um outro composto tais como moléculas que se ligam ao ligando ou um anticorpo. É também preferido que tal interação entre a etiqueta de captura e o dique de captura seja uma interação específica, tal como entre um hapteno e um anticorpo ou um ligando e uma molécula que se liga ao ligando.

Uma outra modalidade deste ensaio compreende uma etiqueta de captura com duas regiões adjacentes: uma região específica ao ácido nucléico alvo e um "complemento de seqüência de captura". Como usado neste caso, um "complemento de seqüência de captura" compreende a seqüência de ácido nucléico que é complementar às “seqüências de captura universais" imobilizadas ao microarray de fase sólida, em que as "seqüências de captura universais" referem-se a seqüências de ácido nucléico curtas que são conhecidas e sua localização no microarray de fase sólida é predeterminada. A etiqueta de captura ou sonda que compreende um "complemento de seqüência de captura" pode ser imobilizada ao microarray de fase sólida por hibridização a sua "seqüência de captura universal".

Em uma outra modalidade da presente invenção, a "etiqueta de captura" refere-se a uma sonda de ácido nucléico marcada que hibridiza a seu "dique de captura" que está ligado ao microarray de fase sólida, em que o dique de captura é uma seqüência comum específica à sonda de ácido nucléico marcada.

As etiquetas de captura alternativas incluem moléculas de hapteno ou ligando que podem estar acopladas a oligonucleotídeos. As etiquetas de captura, descritas no contexto das sondas de ácido nucléico, foram descritas por Syvnen e outros, Nucleic Acids Res.. 14: 5037 (1986). As etiquetas de captura também incluem biotina, que pode ser incorporada nos ácidos nucléicos. A aderência ou o acoplamento de iniciadores a um substrato pode ser realizada(o) aderindo ou acoplando os diques de captura ao subs- trato. Os diques de captura mediam a aderência de um iniciador por ligação ou interação com uma etiqueta de captura no iniciador. Os diques de captura imobilizados em um substrato permitem a captura do iniciador no substrato. Ao anexar diques de captura diferentes a regiões diferentes de um substrato, as etiquetas de captura diferentes anexadas a iniciadores diferentes podem ser capturadas em localizações, e portanto diagnóstico, diferentes no substrato. Por exemplo, em um ensaio multiplex de placa de microtitulação, os diques de captura específicos a até 96 etiquetas de captura diferentes podem ser imobilizados em uma placa de microtitulação, cada um em uma cavidade diferente. A captura e a detecção irão ocorrer apenas naquelas cavidades que correspondem às etiquetas de captura para as quais as moléculas de ácido nucléico correspondentes estavam presentes em uma amostra.

Em uma modalidade, o dique de captura é um oligonucleotídeo. Os métodos para a imobilização e o acoplamento de oligonucleotídeos aos substratos são bem conhecidos. Por exemplo, os métodos de ligação são descritos por Pease e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91(11): 5022-5026 (1994) e Khrapko e outros, Mol. Biol. (Moskl ÍURSS1 25: 718-730 (1991). Um método para a imobilização de oligonucleotídeos 3'-amina em lâminas revestidas com caseína por Stimpson e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 6379-6383 (1995). Um outro método preferido de ligação de oligonucleotídeos a substratos em estado sólido é descrito por Guo e outros, Nucleic Acids Res. 22: 5456-5465 (1994).

Os métodos para a imobilização de proteínas em substratos são bem estabelecidos. A imobilização pode ser realizada anexando, por exemplo, a superfícies aminadas, superfícies carboxiladas ou superfícies hidroxi-ladas usando químicas de imobilização padrão. Exemplos de agentes de anexação são brometo de cianogênio, succinimida, aldeídos, cloreto de to-sila, avidina-biotina, agentes fotorreticuláveis, epóxidos, maleimidas e gluta-raldeído. Estes e outros agentes de anexação, assim como métodos de anexação anexação, são descritos em Protein immobilization: Fundamentais and Applications. Richard F., Taylos, ed. (M. Dekker, Nova York, 1991), Johnstone e Torpe, Immunochemistrv In Practice (Blackwell Scientific Publi- cations, Oxford, Inglaterra, 1987), páginas 209-216 e 241-242, e Immobilized Affinitv Liaands. Craig T. Hermanson e outros, eds. (Academic Press, Nova York, 1992). As proteínas podem ser anexadas a um substrato reticulando quimicamente um grupo amino livre no anticorpo para grupos laterais reativos presentes no substrato. Por exemplo, as proteínas podem ser quimicamente reticuladas a um substrato que contém o amino livre ou grupos cabo-xilas usando glutaraldeído ou carbodiimidas como agentes reticuladores. Neste método, as soluções aquosas que contêm proteínas livres são incubadas com o substrato em estado sólido na presença de glutaraldeído ou carbodiimida. As químicas de imobilização padrão são conhecidas pelo versado na técnica.

Em uma outra modalidade, a sensibilidade do método divulgado é aumentada por lavagem repetida da amostra de híbrido para remover ácidos nucléicos não-hibridizados livres presentes na amostra. É útil remover o ácido nucléico não-hibridizado não específico porque as estruturas secundárias no ácido nucléico podem ser reconhecidas por dispositivos de detecção, resultando em interferência de fundo elevada do ensaio.

Os kits para detecção de ácido nucléico da amostra de hibridiza-ção preferidos para uso com o método divulgado podem ser obtidos usando parte ou todos os componentes necessários para o método. O kit preferivelmente contém um iniciador imobilizado que é complementar a uma região de uma molécula de ácido nucléico de interesse e mais preferivelmente contém uma pluralidade de iniciadores imobilizados que são cada um complementar a uma região em uma molécula de ácido nucléico de interesse.

Preferivelmente, os kits contêm todos ou alguns dos seguintes componentes: um meio de transporte de amostra para a estabilização da amostra; uma fase sólida ligada ao microarray de biomoléculas específicas a uma segunda biomolécula a ser detectada; solução tampão de hibridização; entidade específica para híbridos de RNA:DNA; solução tampão de lavagem; solução tampão melhoradora; e os reagentes necessários para a detecção do anticorpo específico ao híbrido de RNA-.DNA. Além disto, alguns kits incluem uma função exonuclease dependente de híbrido de RNA:DNA que tem ausência de transcriptase reversa termoestável (RNAase H). Uma outra composição dos kits pode incluir uma sonda de ácido nucléico que compreende uma região complementar de seqüência de captura. Além disto, os kits podem também incluir uma sonda de biomolécula marcada que se hibridiza a uma seqüência comum da biomolécula ligada à fase sólida. Os kits também podem compreender, mas não estão limitados a, um sistema universal de moléculas biológicas para a detecção de uma biomolécula da amostra. Os kits podem compreender todos estes componentes ou uma parte dos mesmos.

Para a detecção de anticorpo amplificado, além dos reagentes incluídos nos kits de hibridização para a detecção direta descrita anteriormente, os seguintes reagentes que compreendem todo ou parte podem também ser incluídos nos kits: IgG anticamundongo marcada de forma a poder ser detectado; IgG anticamundongo biotinilada; estreptavidina anticamundongo marcada; antiestreptavidina biotinilada; ou solução de BSA ace-tilada.

Os kits devem conter um controle negativo e um controle positivo. Preferivelmente, as sondas para os controles negativos e positivos são incluídas na fase sólida com as sequências de ácido nucléico.

Os seguintes exemplos não-limitantes ilustram o uso do presente ensaio e kits.

Exemplos Deve ser observado que conforme usado neste caso e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "uma", "a" e "o" incluem a referência no plural a não ser que o contexto claramente afirme de maneira diferente. Portanto, por exemplo, a referência a "uma célula hospedeira" inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras, a referência "ao anticorpo" é uma referência a um ou mais anticorpos e equivalentes dos mesmos conhecidos pelos versados na técnica e assim por diante. A não ser se definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste caso têm os mesmos significados conforme co-mumente entendido por um versado na técnica a qual a invenção divulgada pertence.

Exemplo 1 Detecção de Híbridos de RNA:DNA em Microarravs de Sonda A seguir está um exemplo de um método preferido de realização de uma modalidade do método divulgado para a detecção de sequências de biomolécula alvo em uma amostra.

Em geral, o ensaio é preferivelmente usado para detectar um tamanho de amostra de 0,05 pg de ácidos nucléicos. Mais preferivelmente, detecta-se um total de 0,05 pg -10 pg de ácidos nucléicos usando o ensaio da presente invenção. A amostra de ácido nucléico alvo foi novamente suspensa em água isenta de nuclease e adicionada à solução tampão de hibridização. A solução de hibridização foi desnaturada a 95°C durante 2-5 minutos. A solução de hibridização contendo o ácido nucléico alvo foi adicionada à lâmina de vidro que tem um microarray de oligonucleotídeos colocados em pontos determinados. Hibridizar a 65°C durante 16-20 horas. Seguir de detecção direta ou detecção amplificada.

Para a detecção direta, a lâmina de vidro com um microarray de iniciadores ligados à superfície foi lavada 3 vezes durante 1-2 minutos com 1XPBS/Tween 20® a 0,05 % e agitada em uma batedora rotatória (1100 rpm). A solução de tingimento de anticorpo de RNA:DNA foi adicionada de modo que a concentração final fosse 0,144 pg/ pl. O microarray de lâmina de vidro foi incubado em solução durante 1 hora em agitação em temperatura ambiente (1100 rpm). A lâmina de vidro foi lavada com 1XPBS/Tween 20® a 0,05 % e agitada (1100 rpm) durante 15 minutos em temperatura ambiente. O microarray foi então incubado em um anticorpo para camundongo, especificamente direcionado contra Cy3 ou Cy5, solução de tingimento em temperatura ambiente e agitado durante 1 hora a 1100 rpm. Podem ser usados vários corantes fluorescentes, tais como, mas não limitados a, Cy3 ou Cy5. A concentração final do corante Cy era 0,04 pg/ pl em uma solução de soro de cabra a 10 % e 1XPBS/Tween 20® a 0,05 %. Usando meios praticamente precisos, a lâmina foi lavada quatro vezes durante aproximadamente 10 se- gundos cada em solução tampão de lavagem. A lâmina foi então incubada a 53°C durante 15 minutos em solução tampão melhoradora. A lâmina foi então lavada em solução tampão de lavagem quatro vezes durante aproximadamente 10 segundos cada, usando meios de precisão intermediária. O microarray ligado à lâmina de vidro foi seco por centrifugação a 2000 rpm durante 7-10 minutos ou até secar. Os resultados foram analisados por leitura da lâmina em um scanner de sistema (scanner de sistema Affymetrix 417 ou equivalente) com fotoexcitação a 532 nm e 635 nm, para varredura de lâminas desenvolvidas com anticorpos marcados com Cy3 e Cy5, respectivamente.

Para a detecção amplificada, a lâmina foi lavada 3 vezes durante 1-2 minutos em 1XPBS/Tween 20® a 0,05 %, agitadas em um batedora rotatória a 1100 rpm. A lâmina foi incubada em solução de tingimento de anticorpo específico a híbrido de RNA:DNA durante 1 hora agitando (1100 rpm) em temperatura ambiente. A concentração final da solução de tingimento de anticorpo de RNA:DNA foi 0,144 pg/ μΙ. A lâmina foi lavada em 1XPBS/Tween 20® a 0,05 % durante 15 minutos em agitação em temperatura ambiente (1100 rpm). A lâmina com os pontos determinados foi coberta com anticorpo IgG de camundongo biotinilado de solução de tingimento de cabra e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. O microarray foi lavado 2 vezes durante 1-2 minutos cada em 1XPBS/Tween 20® a 0,05 %. A lâmina com os pontos determinados foi coberta com solução de tingimento de estreptavidina R-ficoeritrina anticamundongo de cabra (0,01 pg/ μΙ; AS-PE) e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. Repetiu-se a lavagem como descrito anteriormente. A lâmina com os pontos determinados foi coberta com anticorpo de cabra biotinilado incitado contra solução de tingimento de estreptavidina (0,5 mg/ ml) e incubada durante 10 minutos em temperatura ambiente. A lâmina foi incubada novamente com solução de tingimento de estreptavidina R-ficoeritrina anticamundongo de cabra (0,01 pg/ μΙ; AS-PE) durante dez minutos em temperatura ambiente. A lâmina foi então lavada 3 vezes durante 1-2 minutos em 1XPBS/Tween 20® a 0,05 %. O microarray foi então seco por centrifugação a 2000 rpm durante 7-10 minutos ou até secar. Os resultados foram analisados por leitura da lâmina em um scanner de sistema ou equivalente (scanner de sistema Affymetrix 417), com fotoexcitação a 532 nm e 635 nm, para varredura de lâminas desenvolvidas com anticorpos marcados com Cy3 ou PE e Cy5, respectivamente.

Exemplo 2 Hibridizacão de Oliqonucleotídeo Marcado Antes da Hibridização da Amostra Um oligonucleotídeo n-meros marcado com Cy3 ou Cy5 foi adicionado à solução tampão de hibridização contendo SSC e SDS e foi des-naturada a 95°C durante 2-5. Podem ser usados vários corantes fluorescentes, tais como, mas não limitados a, Cy3 e Cy5, A lâmina de vidro que compreende os oligonucleotídeos colocados em pontos determinados foi coberta com a solução de hibridização e incubada em temperatura ambiente durante 20 segundos. A lamela de cobertura foi removida com embebimen-tos rigorosos em 2XSSC/ SDS a 0,2 %. Qualquer SDS residual foi lavado mergulhando a lâmina em XSSC a 0,05 durante 30 segundos. A lâmina foi seca por centrifugação a 2000 rpm durante 7-10 minutos ou até secar. A lâmina de vidro foi então lida em um scanner de sistema (scanner de sistema Affymetrix 417 ou equivalente), com fotoexcitação a 532 nm e 635 nm, para varredura de lâminas desenvolvidas com oligonucleotídeos marcados com Cy3 e Cy5, respectivamente, para análise. Seguiu-se de hibridização da amostra. Exemplo 3 Detecção de RNA Mediado por Transcriptase Reversa que Tem Ausente a Função RNAse H A seguir está um método de realizar uma modalidade do método divulgado para a detecção de sequências de ácido nucléico em uma amostra.

Os iniciadores de 20 a 30 nucleotídeos biotinilados de início 5 foram misturados com uma fase sólida revestida com estreptavidina e incubados durante 30 a 60 minutos a 20-27°C com agitação constante (1100 rpm). Uma amostra de ácidos nucléicos alvo foi adicionada à fase sólida. Foi então adicionada a solução tampão de hibridização/ extensão (100 mM de Tris-HCI, pH 8,3, 150 mM de KCI, 6 mM de MgCI2, 20 mM de DTT e 1 mM cada dNTP). O ácido nucléico alvo e o iniciadar foram anelados por aquecimento da mistura na temperatura de anelamento ótima, preferivelmente 60°C (a temperatura de anelamento ótima varia com o iniciador e o ácido nucléico utilizado), durante 20-30 minutos. A mistura foi então resfriada a 20-27°C durante 10 minutos. Adicionou-se a solução tampão de hibridização/ extensão adicional e a transcriptase reversa, preferivelmente termoestável e com ausência de RNAse Η. A reação foi incubada durante 30-60 minutos a 42°C. EDTA (0,5 M) foi adicionado e incubado durante 30 minutos a 37°C. A mistura de anticorpo conjugada com fosfatase alcalina específica de híbrido de RNA:DNA foi adicionada e incubada a 20-27°C durante 30-60 minutos. Qualquer anticorpo não-ligado foi lavado, seguido pela adição de um substrato quimioluminescente. A solução foi incubada durante 15-30 minutos a 20-27°C. O sinal que foi emitido foi lido com um luminômetro em comprimento de luz apropriado.

Exemplo 4 Ligação de Anticorpos Específicos a Híbrido de RNA:DNA

As amostras de RNA:DNA hibridizadas foram incubadas com os anticorpos por uma quantidade de tempo suficiente para permitir a conjugação dos híbridos. Os híbridos foram ligados aos anticorpos por incubação por 5 minutos a 24 horas a 15 a 65°C em uma batedora de plataforma com uma velocidade de agitação de 0 a 1500 rpm. Preferivelmente, o tempo de incubação foi de 30 a 120 minutos a 20 a 40°C, com agitação a 300 a 1200 rpm. Mais preferivelmente, a ligação ocorreu com incubação em uma hora em temperatura ambiente com agitação vigorosa em uma batedora de plataforma rotatória com uma velocidade de agitação rotatória entre aproximadamente 300 e 1000 rpm. Será entendido pelos versados na técnica que o tempo de incubação, a temperatura e a agitação podem ser variados para obter cinética de captura alternativas conforme desejado.

Exemplo 5 Comparação do Comprimento do Oliaonucleotídeo Detectado por Anticorpo Monoclonal e Policlonal Um oligonucleotídeo simples de comprimento variante foi colo- cado em pontos determinados em quatro diferentes concentrações em réplicas de dez. O oligonucleotídeo de 72 meros colocado em pontos determinados era parte do clone IMAGE Ns 259983 que corresponde à proteína Ri-bossomal 40S S11. Os oligonucleotídeos mais curtos eram truncamentos sequenciais de 72 meros de origem. Estes microarrays foram hibridizados em concentrações variantes de RNA complementar e foram visualizados usando o anticorpo de híbrido de RNA:DNA primário monoclonal. Em uma concentração alvo de 800 pM, foi observado sinal substancial em um comprimento de oligonucleotídeo de 30 bases, mas houve uma queda no sinal em 25 bases. A Figura 6A mostra os resultados do sinal na razão de ruído como uma função de comprimento de oligonucleotídeo em uma concentração de RNA de 800 pM com várias concentrações de oligonucleotídeos colocados em pontos determinados na detecção de anticorpo monoclonal específico a híbrido de RNA:DNA. O protocolo de detecção de anticorpo policlonal foi o mesmo que o descrito anteriormente para o anticorpo monoclonal, com a exceção de que o anticorpo secundário de cabra marcado com Cy3 foi usado no lugar do anticorpo de camundongo a partir de cabra. Os resultados (Figura 6B) com o anticorpo policlonal mostraram detecção significativamente melhorada se comparada com o anticorpo monoclonal para os oligonucleotídeos menores do que 30 bases de comprimento. Para os oligonucleotídeos maiores do que 30 bases, não houve diferença significativa no sinal. O anticorpo RNA:DNA policlonal forneceu um método significativamente mais sensível para a detecção de híbridos de RNA:DNA que são menores do que 30 pares de base de comprimento se comparados à detecção com o anticorpo monoclonal (ver Figs. 6A-B). O conteúdo de todas as patentes, os pedidos de patente, os pedidos de patente publicadas PCT e os artigos, os livros as referências, os manuais de referência e o resumos citados neste caso são por meio desta incorporados como referência em sua integridade para descrever mais completamente o estado da técnica ao qual a invenção pertence.

Visto que várias mudanças podem ser feitas na matéria em ques- tão anteriormente descrita sem sair do âmbito e do espírito da presente invenção, pretende-se que toda a matéria em questão contida na descrição anterior, ou definida nas reivindicações em anexo, seja interpretada como descritiva e ilustrativa da presente invenção. Muitas modificações e variações da presente invenção são possíveis a luz dos ensinamentos anteriores REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para quantificação de um RNA alvo em um microar-ray, caracterizado pelo fato de que compreende: a) hibridizar o RNA alvo a uma primeira porção de um DNA imobilizado, o referido alvo sendo complementar ao mesmo, formando um híbrido de RNA:DNA; b) hibridizar uma sonda DNA marcada a uma segunda porção do DNA imobilizado, a referida sonda sendo complementar ao mesmo, formando um complexo de DNA:DNA detectável, em que a marcação é um primeiro reagente; c) ligar uma entidade detectável específica para híbrido de RNA:DNA ao híbrido de RNA:DNA, em que a entidade detectável é marcada com um segundo reagente; d) medir o RNA alvo pela detecção do híbrido de RNA:DNA; e e) medir o DNA imobilizado pela detecção do complexo híbrido de DNA:DNA.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a entidade detectável é um anticorpo.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de ligação.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é monoclonal.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é policlonal.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microarray apresenta sítios de detecção de amostra que estão na faixa de 10 a 100.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microarray apresenta sítios de detecção de amostra que estão na faixa de 100 a 1000.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microarray apresenta sítios de detecção de amostra que estão na faixa de 1000 a 10.000.