BRPI0107679B1

BRPI0107679B1 - Composição compreendendo vesículas de membrana externa do grupo sérico b de neisseria meningitidis e um componente inorgânico e uso da mesma

Info

Publication number: BRPI0107679B1
Application number: BRPI0107679-5A
Authority: BR
Inventors: Pizza Mariagrazia; Rappuoli Rino; Giuliani Marzia
Original assignee: Chiron S.P.A.
Priority date: 2000-01-17
Filing date: 2001-01-17
Publication date: 2018-03-13
Also published as: EP1248647A1; AU2009200692B2; AU2009200692A1; EP2289545A2; BRPI0107679B8; EP1897555B1; EP2281570A3; CA2397508C; JP2003520248A; EP1897555A3; ATE476988T1; EP1897555A2; JP5823446B2; MXPA02006962A; ES2507100T3; CN102172398A; US20160082098A1; CA2871789C; EP2289545B1; EP2281571A2

Abstract

"vacina de vesícula de membrana externa (omv) compreendendo proteínas de membrana externa do grupo sérico b de neisseria meningitidis". uma composição compreendendo (a) vesículas de membrana externa (omvs) do grupo sérico b de neisseria meningitidis e (b) um componente imunogênico selecionado ou dentre outras proteínas de neisseria ou fragmentos imunogênicos seus. o componente (b) inclui, de preferência, uma proteína proveniente de uma cepa nmb diferente daquela da qual derivam os omv do componente (a). os omvs são, de preferência, obtidos por extração de desoxicolato. opcionalmente, a composição pode também compreender um antígeno protetor contra outros patógenos.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DO GRUPO SÉRICO B DE NEISSERIA MENINGITIDIS E UM COMPONENTE INORGÂNICO E USO DA MESMA (51) Int.CI.: A61K 39/095; A61K 39/116; A61K 39/295; A61P 31/00 (30) Prioridade Unionista: 09/03/2000 GB 0005699.4, 17/01/2000 GB 0001067.8 (73) Titular(es): CHIRON S.P.A.

(72) Inventor(es): MARIAGRAZIA PIZZA; RINO RAPPUOLI; MARZIA GIULIANI

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COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA DO GRUPO SÉRICO B DE NEISSERIA MENINGITIDIS E UM COMPONENTE INORGÂNICO E USO DA MESMA

Todos os documentos citados no presente são incorpora5 dos a título de referência integralmente.

Campo Técnico

A presente invenção se refere a vacinas contra Neíssería meníngítídís, grupo sérico B (NmB).

Fundamentos da Técnica

A Neisseria meníngítídís é um diplococo Gram-negativo sem motilidade e patógeno humano. Ele coloniza a faringe, causando meningite e, ocasionalmente, septicemia na ausência de meningite. Nos Estados Unidos a taxa de ataque é de 0,6-1 por 100.000 pessoas por ano, e ela pode ser muito su15 perior durante surtos (veja Lieberman e cols. (1996) JAMA

275 (19):1499-1503; Schuchat e cols. (1997) N. Eng. J. Med.

337 (14):970-976). Nos países em desenvolvimento, as taxas de doenças endêmicas são muito maiores e durante epidemias as taxas de incidência podem atingir 500 casos por 100.000 pessoas por ano. A mortalidade é extremamente alta, a 1020% nos Estados Unidos, e muito maior nos países em desenvolvimento. Depois da introdução da vacina conjugada contra Haemophílus ínfluenzae, N. meníngítídís é a principal causa de meningite bacteriana em todas as idades nos Estados Uni25 dos (Schuchat e cols. (1997) supra).

Com base no polissacarídeo capsular do organismo foram identificados 12 grupos séricos de N. meníngítídís. A vacina meningocócica atualmente empregada é uma vacina polissacarídica tetravalente composta pelos grupos séricos A, C, Y e W 135. Depois do sucesso da vacinação contra H. ínfluenPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 6/109

2/100 zae, no entanto, foram desenvolvidas vacinas contra os grupos séricos A e C.

O grupo sérico B continua a ser um problema, e é atualmente responsável por aproximadamente 50% do total de me5 ningite nos Estados Unidos, Europa e América do Sul. A abordagem polissacarídica não pode ser usada pois o polissacarídeo capsular menB é um polímero de ácido N-acetil neuramínico α(2-8)-ligado que se encontra também presente em tecidos de mamíferos. Isto resulta na tolerância ao an10 tígeno; na verdade, se uma resposta fosse obtida, ela seria de anti-própria, e portanto indesejável. A fim de impedir a indução de auto-imunidade e para induzir uma resposta imune protetora, o polissacarídeo capsular tem, por exemplo, sido quimicamente modificado substituindo-se os grupamentos N15 acetila por grupamentos N-propionila, deixando a antigenicidade específica inalterada (Romero & Outschoorn (1994) Clin. Microbiol. Rev. 7(4):559-575).

Uma vacina eficaz de vesícula de membrana externa (OMV) contra o grupo sérico B foi produzida pelo Instituto

Nacional de Saúde Pública da Noruega [Bjune e cols. (1991)

Lancet 338(8775):1093-96]. Embora esta vacina seja segura e previna doenças por NmB, a sua eficácia é limitada à cepa empregada para preparar a vacina. Outras vacinas à base de preparados de membrana externa foram também relatadas. Um objetivo da presente invenção consiste em ampliar a eficácia destas vacinas contra outras cepas.

Descrição da Invenção

Foi constatado com surpresa que a adição de componentes definidos mais abaixo a vacinas de OMV ampliava de modo significativo a sua eficácia.

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3/100

Portanto, a presente invenção propõe uma composição que compreende (a) um preparado de membrana externa de NmB e (b) um componente imunogênico selecionado de um ou mais do grupo que consiste nos seguintes:

• uma proteína descrita em WO99/57280, ou um fragmento imunogênico seu;

• uma proteína descrita em WO99/36544, ou um fragmento imunogênico seu;

• uma proteína descrita em WO99/24578, ou um fragmento imunogênico seu;

• uma proteína descrita em WO00/66791, ou um fragmento imunogênico seu;

• uma proteína descrita em Tettelin e cols. [Science (2000) 287:1809-1815], ou um fragmento imunogênico seu;

• uma proteína descrita em Parkhill e cols. [Nature (2000) 404:502-506], ou um fragmento imunogê20 nico seu;

•	uma proteína descrita em	WO97/28273,	ou	um	frag-
•	mento imunogênico seu; uma proteína descrita em	WO96/29412,	ou	um	frag-
•	mento imunogênico seu; uma proteína descrita em	WO95/03413,	ou	um	frag-
•	mento imunogênico seu; uma proteína descrita em	WO99/31132,	ou	um	frag-
•	mento imunogênico seu; uma proteína descrita em	WO99/58683,	ou	um	frag-
•	mento imunogênico seu; uma proteína descrita em	WO99/55873,	ou	um	frag-
	mento imunogênico seu;	e/ou

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4/100 • proteína PorA, TbpA, TbpB, PilC, OpA, ou Omp85 de Neíssería meníngítídís.

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO99/24578, a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que con-

	siste em	ID DE	SEQs	2, 4	, 6, 8, 10, 12,	14,	16, 18	, 20,	22,
	24,	26, 28, 30,	32,	34,	36, 38	, 40	, 42,	44,	46, 48	, 50,	52,
	54,	56, 58, 60,	62,	64,	66, 68	, 70	, 72,	74,	76, 78	, 80,	82,
	84,	86, 88, 90	, 92,	94,	96,	98,	100,	102,	104,	106,	108,
10	110,	112,	114,	116,	118,	l20,	122,	l24,	126,	128,	130,	132,
	134,	136,	138,	140,	142,	144,	146,	148,	150,	l52,	154,	156,
	158,	160,	162,	164,	166,	168,	l70,	172,	l74,	176,	178,	180,
	182,	l84,	l86,	188,	190,	192,	194,	196,	198,	200,	202,	204,
	206,	208,	210,	212,	214,	216,	218,	220,	222,	224,	226,	228,
15	230,	232,	234,	236,	238,	240,	242,	244,	246,	248,	250,	252,
	254,	256,	258,	260,	262,	264,	266,	268,	270,	272,	274,	276,
	278,	280,	282,	284,	286,	288,	290,	292,	294,	296,	298,	300,
	302,	304,	306,	308,	310,	312,	314,	216,	318,	320,	322,	324,
	326,	328,	330,	332,	334,	336,	338,	340,	342,	344,	346,	348,
20	350,	352,	354,	356,	358,	360,	362,	364,	366,	368,	370,	372,
	374,	376,	378,	380,	382,	384,	386,	388,	390,	392,	394,	396,
	398,	400,	402,	404,	406,	408,	410,	412,	414,	416,	418,	420,
	422,	424,	426,	428,	430,	432,	434,	436,	438,	440,	442,	444,
	446,	448,	450,	452,	454,	456,	458,	460,	462,	464,	466,	468,
25	470,	472,	474,	476,	478,	480,	482,	484,	486,	488,	490,	492,
	494,	496,	498,	500,	502,	504,	506,	508,	510,	512,	514,	516,
	518,	520,	522,	524,	526,	528,	530,	532,	534,	536,	538,	540,
	542,	544,	546,	548,	550,	552,	554,	556,	558,	560,	562,	564,
	566,	568,	570,	572,	574,	576,	578,	580,	582,	584,	586,	588,
30	590,	592,	594,	596,	598,	600,	602,	604,	606,	608,	610,	612,

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614,	616,	618,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632,	634,	636,
638,	640,	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656,	658,	660,
662,	664,	666,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680,	682,	684,
686,	688,	690,	692,	694,	696,	698,	700,	702,	704,	706,	708,
7l0,	712,	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728,	730,	732,
734,	736,	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752,	754,	756,
758,	760,	762,	764,	766,	768,	770,	772,	774,	776,	778,	780,
782,	784,	786,	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800,	802,	804,
806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824,	826,	828,
830,	832,	834,	836,	838,	840,	842,	844,	846,	848,	850,	852,
854,	856,	858,	860,	862,	864,	866,	868,	870,	872,	874,	876,
878,	880,	882,	884,	886,	888,	890,	& 892	, conforme	descrito

em WO99/24578 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico de uma ou mais destas ID DE SEQS, ou uma prote15 ína que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo, 60%, 70%, 80 %, 90%, 95%, 99% ou mais) com uma destas SEQ. IDs).

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO99/36544, a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo constituído pelas ID DE SEQs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,

22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50,

52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80,

82, 84, 86, 88 & 90, conforme descrito em WO99/36544 (ou uma proteína compreendendo um fragmento imunogênico de uma ou mais destes SEQ. IDs, ou uma proteína compreendendo uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,

99% ou mais) com uma destas ID DE SEQs).

Se a composição compreender uma proteína descrita em

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Tettelin e cols. (isto é, uma proteína codificada por um dos genes descritos no presente), a citada proteína compreenderá, de preferência uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em NMB0001 a NMB2160 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico de um ou mais destes 2160 genes, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,

99% ou mais) com um destes 2160 genes).

Se a composição compreender uma proteína descrita em

Parkhill e cols., a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas 2121 seqüências de codificação descritas ali (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogêni15 co de uma ou mais destas 2121 seqüências, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com uma destas 2121 seqüências).

Se a composição compreender uma proteína descrita em

WO99/57280, a citada proteína compreenderá, de preferência,

	uma	seqüência	de aminoácidos selecionada do	grupo	que	con-
	siste nas ID DE SEQs 2, 4, 6, 8, 10, 11, 14, 16,	18,	20,
	22,	24, 26, 28	, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,	44, 46	, 48,	50,
25	52,	54, 56, 58	, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 71,	74, 76	, 78,	80,
	82,	84, 86, 8	8, 90, 92, 94, 96, 98, 100,	102, 1	04,	106,
	108,	110, 112,	114, 116, 117, 120, 121, 124,	126,	127,	130,
	132,	134, 136,	138, 140, 142, 144, 146, 148,	150,	152,	154,
	156,	158, 160,	162, 164, 166, 168, l70, 171,	l74,	l76,	178,
30	180,	181, 184,	186, 188, 190, 192, 194, 196,	198,	200,	202,

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204,	206,	208,	210,	211,	214,	216,	218,	220,	222,	224
228,	230,	232,	234,	236,	238,	240,	242,	244,	246,	248
252,	254,	256,	258,	260,	262,	264,	266,	261,	270,	272
276,	278,	280,	282,	284,	286,	288,	290,	292,	294,	296
300,	302,	304,	306,	308,	310,	312,	314,	316,	318,	320
324,	326,	328,	330,	332,	334,	336,	338,	340,	342,	344
348,	350,	352,	354,	356,	358,	360,	362,	364,	366,	368
372,	374,	376,	378,	380,	382,	384,	386,	388,	390,	392
396,	398,	400,	402,	404,	406,	408,	410,	412,	414,	416
420,	422,	424,	426,	428,	430,	432,	434,	436,	438,	440
444,	446,	448,	450,	452,	454,	456,	458,	460,	462,	464
468,	470,	472,	474,	476,	478,	480,	482,	484,	486,	488
492,	494,	496,	498,	500,	502,	504,	506,	508,	510,	512
516,	518,	520,	522,	524,	526,	528,	530,	532,	534,	536
540,	542,	544,	546,	548,	550,	552,	554,	556,	558,	560
564,	566,	568,	570,	572,	574,	576,	578,	580,	582,	584
588,	590,	592,	594,	596,	598,	600,	602,	604,	606,	608
612,	614,	616,	618,	620,	622,	624,	626,	628,	630,	632
636,	638,	640,	642,	644,	646,	648,	650,	652,	654,	656
660,	662,	664,	6 6 6,	668,	670,	672,	674,	676,	678,	680
684,	686,	688,	690,	692,	694,	69 6,	698,	700,	702,	704
708,	710,	711,	714,	716,	718,	720,	722,	724,	726,	728
732,	734,	736,	738,	740,	742,	744,	746,	748,	750,	752
756,	758,	760,	762,	764,	766,	768,	770,	772,	774,	776
780,	782,	784,	786,	788,	790,	792,	794,	796,	798,	800
804,	806,	808,	810,	812,	814,	816,	818,	820,	822,	824
828,	830,	832,	834,	83b,	838,	840,	842,	844,	846,	848
852,	854,	856,	858,	860,	862,	864,	866,	868,	870,	872
876,	878,	880,	882,	884,	886,	888,	890,	892,	894,	896
900,	902,	904,	906,	908,	910,	912,	914,	916,	918,	920

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	924,	926, 928, 930, 932, 934,	936, 938, 940, 942, 944,	946,
	948,	950, 952, 954, 956, 958,	960, 962, 964, 966, 968,	970,
	972,	974, 976, 978, 980, 982,	984, 986, 988, 990, 992,	994,
	99 6,	998, 1000, 1002, 1004,	1006, 1008, 1010, 1012,	1014,
5	1016,	1018, 1020, 1022, 1024,	1026, 1028, 1030, 1032,	1034,
	1036,	1038, 1040, 1042, 1044,	1046, 1048, 1050, 1052,	1054,
	1056,	1058, 1060, 1062, 1064,	1066, 1068, 1070, 1072,	1074,
	1076,	1078, 1080, 1082, 1084,	1086, 1088, 1090, 1092,	1094,
	1096,	1098, l100, 1102, l104,	l106, l108, ll10, 1112,	ll14,
10	ll16,	1118, l120, l122, l124,	l126, l128, l130, l132,	l134,
	1136,	l138, l140, l142, l144,	l146, l148, l150, l152,	l154,
	l156,	1158, l160, 1162, l164,	1166, 1168, 1170, 1172,	ll74,
	1176,	1178, ll80, 1182, ll84,	1186, 1188, l190, l192,	l194,
	l196,	l198, 1200, 1202, 1204,	1206, 1208, 1210, 1212,	1214,
15	1216,	1218, 1220, 1222, 1224,	1226, 1228, 1230, 1232,	1234,
	1236,	1238, 1240, 1242, 1244,	1246, 1248, 1250, 1252,	1254,
	1256,	1258, 1260, 1262, 1264,	1266, 1268, 1270, 1272,	1274,
	1276,	1278, 1280, 1282, 1284,	1286, 1288, 1290, 1292,	1294,
	1296,	1298, 1300, 1302, 1304,	1306, 1308, 1310, 1312,	1314,
20	1316,	1318, 1320, 1322, 1324,	1326, 1328, 1330, 1332,	1334,
	1336,	1338, 1340, 1342, 1344,	1346, 1348, 1350, 1352,	1354,
	1356,	135S, 1360, 1362, 1364,	1366, 1368, 1370, 1372,	1374,
	1376,	1378, 1380, 1382, 1384,	1386, 1388, 1390, 1392,	1394,
	1396,	1398, 1400, 1402, 1404,	1406, 1408, 1410, 1412,	1414,
25	1416,	1418, 1420, 1422, 1424,	1426, 1428, 1430, 1432,	1434,
	1436,	1438, 1440, 1442, 1444,	1446, 1448, 1450, 1452,	1454,
	1456,	1458, 1460, 1462, 1464,	1466, 1468, 1470, 1472,	1474,
	1476,	1478, 1480, 1482, 1484,	1486, 1488, 1490, 1492,	1494,
	1496,	1498, 1500, 1502, 1504,	1506, 1508, 1510, 1512,	1514,
30	1516,	1518, 1520, 1522, 1524,	1526, 1528, 1530, 1532,	1534,

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 13/109

9/100

1536,	1538,	1540,	1542,	1544,	1546,	1548,	1550,	1552,	1554
1556,	1558,	1560,	1562,	1564,	1566,	1568,	1570,	1572,	1574
1576,	1578,	1580,	1582,	1584,	1586,	1588,	1590,	1592,	1594
1596,	1598,	1600,	1602,	1604,	1606,	1608,	1610,	1612,	1614
1616,	1618,	1620,	1622,	1624,	1626,	1628,	1630,	1632,	1634
1636,	1638,	1640,	1642,	1644,	1646,	1648,	1650,	1652,	1654
1656,	1658,	1660,	1662,	1664,	1666,	1668,	1670,	1672,	1674
1676,	1678,	1680,	1682,	1684,	1686,	1688,	1690,	1692,	1694
1696,	1698,	1700,	1702,	1704,	1706,	1708,	1710,	1712,	1714
1716,	1718,	1720,	1722,	1724,	1726,	1728,	1730,	1732,	1734
1736,	1738,	1740,	1742,	1744,	1746,	1748,	1750,	1752,	1754
1756,	1758,	1760,	1762,	1764,	1766,	1768,	1770,	1772,	1774
1776,	1778,	1780,	1782,	1784,	1786,	1788,	1790,	1792,	1794
1796,	1798,	1800,	1802,	1804,	1806,	1808,	1810,	1812,	1814
1816,	1818,	1820,	1822,	1824,	1826,	1828,	1830,	1832,	1834
1836,	1838,	1840,	1842,	1844,	1846,	1848,	1850,	1852,	1854
1856,	1858,	1860,	1862,	1864,	1866,	1868,	1870,	1872,	1874
1876,	1878,	1880,	1882,	1884,	1886,	1888,	1890,	1892,	1894
1896,	1898,	1900,	1902,	1904,	1906,	1908,	1910,	1912,	1914
1916,	1918,	1920,	1922,	1924,	1926,	1928,	1930,	1932,	1934
1936,	1938,	1940,	1942,	1944,	1946,	1948,	1950,	1952,	1954
1956,	1958,	1960,	1962,	1964,	1966,	1968,	1970,	1972,	1974
1976,	1978,	1980,	1982,	1984,	1986,	1988,	1990,	1992,	1994
1996,	1998,	2000,	2002,	2004,	2006,	2008,	2010,	2012,	2014
2016,	2018,	2020,	2022,	2024,	2026,	2028,	2030,	2032,	2034
2036,	2038,	2040,	2042,	2044,	2046,	2048,	2050,	2052,	2054
2056,	2058,	2060,	2062,	2064,	2066,	2068,	2070,	2072,	2074
2076,	2078,	2080,	2082,	2084,	2086,	2088,	2090,	2092,	2094
2096,	2098,	2100,	2102,	2104,	2106,	2108,	2110,	2112,	2114
2116,	2118,	2120,	2122,	2124,	2126,	2128,	2130,	2132,	2134

de 01/11/2017, pág. 14/109

10/100

	2136,	2138,	2140,	2142,	2144,	2146,	2148,	2150,	2152,	2154
	2156,	2158,	2160,	2162,	2164,	2166,	2168,	2170,	2172,	2174
	2176,	2178,	2180,	2182,	2184,	2186,	2188,	2190,	2192,	2194
	2196,	2198,	2200,	2202,	2204,	2206,	2208,	2210,	2212,	2214
5	2216,	2218,	2220,	2222,	2224,	2226,	2228,	2230,	2232,	2234
	2236,	2238,	2240,	2242,	2244,	2246,	2248,	2250,	2252,	2254
	2256,	2258,	2260,	2262,	2264,	2266,	2268,	2270,	2272,	2274
	2276,	2278,	2280,	2282,	2284,	2286,	2288,	2290,	2292,	2294
	2296,	2298,	2300,	2302,	2304,	2306,	2308,	2310,	2312,	2314
10	2316,	2318,	2320,	2322,	2324,	2326,	2328,	2330,	2332,	2334
	2336,	2338,	2340,	2342,	2344,	2346,	2348,	2350,	2352,	2354
	2356,	2358,	2360,	2362,	2364,	2366,	2368,	2370,	2372,	2374
	2376,	2378,	2380,	2382,	2384,	2386,	2388,	2390,	2392,	2394
	2396,	2398,	2400,	2402,	2404,	2406,	2408,	2410,	2412,	2414
15	1416,	2418,	2420,	2422,	2424,	2426,	2428,	2430,	2432,	2434
	2436,	2438,	2440,	2442,	2444,	2446,	2448,	2450,	2452,	2454
	2456,	2458,	2460,	2462,	2464,	2466,	2468,	2470,	2472,	2474
	2476,	2478,	2480,	2482,	2484,	2486,	2488,	2490,	2492,	2494
	2496,	2498,	2500,	2502,	2504,	2506,	2508,	2510,	2512,	2514
20	2516,	2518,	2520,	2522,	2524,	2526,	2528,	2530,	2532,	2534
	2536,	2538,	2540,	2542,	2544,	2546,	2548,	2550,	2552,	2554
	2556,	2558,	2560,	2562,	2564,	2566,	2568,	2570,	2572,	2574
	2576,	2578,	2580,	2582,	2584,	2586,	2588,	2590,	2592,	2594
	2596,	2598,	2600,	2602,	2604,	2606,	2608,	2610,	2612,	2614
25	2616,	2618,	2620,	2622,	2624,	2626,	2628,	2630,	2632,	2634
	2636,	2638,	2640,	2642,	2644,	2646,	2648,	2650,	2652,	2654
	2656,	2658,	2660,	2662,	2664,	2666,	2668,	2670,	2672,	2674
	2676,	2678,	2680,	2682,	2684,	2686,	2688,	2690,	2692,	2694
	2696,	2698,	2700,	2702,	2704,	2706,	2708,	2710,	2712,	2714
30	2716,	2718,	2720,	2722,	2724,	2726,	2728,	2730,	2732,	2734

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 15/109

11/100

	2736,	2738,	2740,	2742,	2744,	2746,	2748,	2750,	2752,	2754,
	2756,	2758,	2760,	2762,	2764,	2766,	2768,	2770,	2772,	2774,
	2776,	2778,	2780,	2782,	2784,	2786,	2788,	2790,	2792,	2794,
	2796,	2798,	2800,	2802,	2804,	2806,	2808,	2810,	28l2,	2814,
5	2816,	28l8,	2820,	2822,	2824,	2826,	2828,	2830,	2832,	2834,
	2836,	2838,	2840,	2842,	2844,	2846,	2848,	2850,	2852,	2854,
	2856,	2858,	2860,	2862,	l864,	2866,	2868,	2870,	2872,	2874,
	2876,	2878,	2880,	2882,	2884,	2886,	2888,	2890,	2892,	2894,
	2896,	2898,	2900,	2902,	2904,	2906,	2908,	2910,	2912,	2914,
10	2916,	2918,	2920,	2922,	2924,	2926,	2928,	2930,	2932,	2934,
	2936,	2938,	2940,	2942,	2944,	2946,	2948,	2950,	2952,	2954,
	2956,	2958,	2960,	2962,	2964,	2966,	2968,	2970,	2972,	2974,
	2976,	2978,	2980,	2982,	2984,	2986,	2988,	2990,	2992,	2994,
	2996,	2998,	3000,	3002,	3004,	3006,	3008,	3010,	3012,	3014,
15	3016,	3018	& 3020	, conf	orme descrit	o em	WO99/57280 (	ou uma

proteína que compreende um fragmento imunogênico de uma ou mais destas ID DE SEQS, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%,

99% ou mais) com uma destas SEQ. IDs).

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO99/28273, a citada proteína será de preferência a proteína descrita na Figura 4 ou na Figura 13 de WO97/28273.

Se a composição compreender uma proteína descrita em 25 WO96/29412, a citada proteína compreende, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em ID DE SEQs 1-8 descritas em WO96/29412 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico de uma ou mais destas SEQ. IDs, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferênPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 16/109

12/100 cia acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com uma destas ID DE SEQs).

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO95/03413, a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas ID DE SEQs 1-23 descritas em WO95/03413 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico de uma ou mais destas SEQ. IDs, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com uma destas SEQ. IDs).

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO99/31132, a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na ID DE SEQ 2 descrita em WO99/31132 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico da SEQ. ID 2, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a ID DE SEQ 2).

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO99/58683, a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na ID DE SEQ 2 ou na ID DE SEQ 4 descritas em WO99/56863 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico da SEQ. ID 2 ou da ID DE SEQ 4, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a ID DE SEQ 2 ou a ID

DE SEQ 4).

de 01/11/2017, pág. 17/109

13/100

Se a composição compreender uma proteína descrita em WO99/55873, a citada proteína compreenderá, de preferência, uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste na ID DE SEQ 2 ou na ID DE SEQ 4 descritas em WO99/55873 (ou uma proteína que compreende um fragmento imunogênico da SEQ. ID 2 ou da ID DE SEQ 4, ou uma proteína que compreende uma seqüência que tem uma identidade de seqüência (de preferência acima de 50%, por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais) com a ID DE SEQ 2 ou a ID

DE SEQ 4).

Detalhes sobre Opa e PorA podem ser encontrados em Wiertz e cols. [Infect. Immun. (1996) 61:298-304]. O PilC é descrito em Nassif e cols. [PNAS USA (1994) 91:3769-73]. O

Omp85 é descrito em Manning e cols. [Microb. Pathog. (1998)

25:11-21]. O TbpA e TbpB são descritos em Ala'Aldeen & Borriello [Vaccine (1996) 14:49-53] e também em Legrain e cols. [Prorein Expr Purif (1995) 6:570-578].

As proteínas preferidas para o componente (b) são:

• proteína '919', tipificada pelas ID DE SEQs 30693074 e 3207-3241 de WO99/57280 (veja também a Figura 23 e o Exemplo 15 neste documento) • proteína '235', tipificada pelas ID DE SEQs 869874 e 3149-3178 de WO99/57280 (veja também a Figura 20 e o Exemplo 12 neste documento).

• proteína '519', tipificada pelas ID DE SEQs 30453056 e 3185-3206 de WO99/57280 (veja também a Figura 22 e o Exemplo 14 neste documento).

• proteína '225', tipificada pelas ID DE SEQs 793804 e 3115-3148 de WO99/57280 (veja também a

Figura 19 e o Exemplo 11 neste documento).

de 01/11/2017, pág. 18/109

14/100 • proteína 'ORF40', tipificada pelo exemplo 1 (ID

DE SEQs 1-6) de WO99/36544 (veja também a Figura 1 de WO00/66741; veja também WO99/31132 e WO99/58683).

• proteína '287', tipificada pelo exemplo 9 de

WO99/57280 (veja ID DE SEQs 1199-1204, 31033108 e 3179-3184 neste documento).

• proteína 'ORF1', tipificada pelo exemplo 77 (ID

DE SEQs 647-654) de WO99/24578 (veja também WO99/55873 e número de acesso AJ242535).

• proteína 'ORF4', tipificada pelo exemplo 26 (ID

DE SEQs 215-226) de WO99/24578 (veja também a Figura 2 de WO00/66741).

• proteína 'ORF46', tipificada pelo exemplo 55 (ID de SEQ 457-466) de WO99/24578 (veja também a Figura 12 de WO00/66741).

O componente (b) da composição é de preferência uma proteína de NmB. É preferível que esse componente (b) inclua uma proteína de uma cepa de NmB diferente daquela da qual é derivado o OMV do componente (a), isto é, o OMV no componente (a) é de preferência suplementado pelo componente imunogênico (b) proveniente de uma cepa de NmB diferente.

Um ou mais dos componentes (ou todos eles) podem ser adsorvidos sobre Al(OH)3.

O Componente do Preparado de Membrana Externa

As composições da presente invenção incluem um preparado de membrana externa de NmB como o componente(a). Esta se encontra de preferência na forma de vesículas de membrana externa (OMVs).

de 01/11/2017, pág. 19/109

15/100

A preparação de OMVs a partir de NmB é bem conhecida na técnica. Os processos para a obtenção de preparados adequados são descritos, por exemplo, em: Claassen e cols. [Vaccine (1996) 14:1001-1008]; Cartwright e cols. [Vaccine (1999) 17:2612-2619]; Peeters e cols. [Vaccine (1996)

14:	1009-l 015]	; Fu	e	cols.	[Biotechnology NY	(1995
12:	170-74] ;	Davies	e	cols.	[J.Immunol.Meth.	(1990
134	:215-225];	Saunders	e	cols.	[Infect. Immun.	(1999

67:113-119]; Draabick e cols. [Vaccine (2000) 18:160-172] ;

Moreno e cols. [Infect. Immun. (1985) 47:527-533] ; Milagres e cols. [Infect. Immun. (1994) 62:4419-4424]; Naess e cols. [Infect. Immun. (1998) 66:959-965]; Rosenqvist e cols. [Dev.Biol.Stand. (1998) 92:323-333]; Haneberg e cols.

[Infect. Immunn. (1998) 66:1334-41]; Andersen e cols. [Vac15 cine (1997) 15:1225-34] ; Bjune e cols. [Lancet (1991)

338:1093-96] etc.

As OMVs consistem, de preferência, em um extrato de desoxicolato proveniente de NmB (isto é, obtido de NmB por extração de desoxicolato). O protocolo de extração preferi20 do é aquele descrito por Fredriksen e cols. [Production, characterization and control of MenB-vaccine Folkehelsa: an outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease (1991) HIPH Ann. 13(2):67-80].

Uma cepa preferida da qual se extraem OMVs é a cepa

44/76 (B:15: P1.7, 16:P5.5:L3,7,9) de N. meningitidis

Detalhes adicionais do componente de OMV podem ser encontrados em Bjune e cols. [Lancet (1991) 338(8775):109396], ou Fredriksen e cols. [Characterization of high molecular weight component in MenB-vaccine 'Folkehelsa', an out30 er membrane vesicle vaccine against group B meningococcal

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 20/109

16/100 disease. Páginas 818-824 of Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae (eds. Conde-Glez e cols.) ISBN 968-650213-0].

O componente de OMV pode ser adsorvido sobre adjuvante de hidróxido de alumínio. Uma relação proteína:adjuvante preferida é 1:67 (peso/peso).

Uma dose típica de vacina para um ser humano contém 25 qg de proteína, 2 qg de LPS e 1,67 mg de Al(OH)3, e pode ser injetada em volumes de 0,5 ml no músculo deltóide.

O componente de OMV (tal como aquele obtido por extração de desoxicolato) pode ser tratado para remover determinados componentes. Os pirógenos ou componentes tóxicos, por exemplo, podem ser removidos (LPS, por exemplo).

É preferível que o componente de OMV retenha o componente antigênico de 80 kDa, descrito por Fredriksen e cols. [páginas 818-824 de Pathobiology and immunobiology of Neisseriaceae].

É mais preferível que o componente de OMV retenha uma proteína que compreende uma ou mais das seqüências de aminoácidos seguintes: ID DE SEQ 3, ID DE SEQ 5, ID DE SEQ 7, ID DE SEQ 9, ID DE SEQ 11, ID DE SEQ 13 [ou (i) uma proteína que tenha identidade de seqüência com ID DE SEQ 3, ID DE SEQ 5, ID DE SEQ 7, ID DE SEQ 9, ID DE SEQ 11, ou ID DE SEQ 13 - dependendo da ID DE SEQ específica, o grau de identidade de seqüência é de preferência superior a 50% (por exemplo de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais), o que inclui mutantes e variantes alélicas, ou (ii) uma proteína que compreende um fragmento imunogênico de ID DE SEQ 1, ID DE SEQ 3, ID DE SEQ 5, ID DE SEQ 7, ID DE SEQ 9, ID DE SEQ 11, ou ID DE SEQ 13- o fragmento deve compreender pelo mede 01/11/2017, pág. 21/109

17/100 nos n aminoácidos consecutivos provenientes da seqüência e, dependendo da seqüência específica, n é 7 ou mais (tal como 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ou mais).]

Combinação de Componentes (a) e (b)

Os componentes (a) e (b) podem ser combinados por simples mistura do componente (a) com um preparado de membrana externa (por mistura de ORF4 com OMVs noruegueses).

Como uma alternativa, eles podem ser combinados pela manipulação de uma bactéria tal que ela produza (de preferência hiperproduza) o componente (a) na sua membrana externa - um preparado de membrana externa proveniente de uma tal bactéria recombinante compreenderá tanto o componente (a) como o componente (b).

Bactérias adequadas para a manipulação deste modo incluem Neíssería meníngítídís (de qualquer grupo sérico ou cepa), Neíssería lactamíca, Neíssería cínerea ou qualquer outra Neíssería não tipificada. Outras bactérias gramnegativas podem b ser usadas, tais como E.colí, Salmonella, Shígella, Bordetella, Yersínía, Helícobacter etc. Os processos de transformação são conhecidos na técnica.

Vacinas Multivalentes

Opcionalmente a composição da presente invenção pode também compreender um ou mais dos seguintes componentes:

•	um	antígeno protetor contra Neíssería meníngítídís;	o	grupo	sérico	A	de
•	um	antígeno protetor contra Neíssería meníngítídís;	o	grupo	sérico	C	de
•	um	antígeno protetor contra Neíssería meníngítídís;	o	grupo	sérico	Y	de
•	um	antígeno protetor contra	o	grupo	sérico	W	de

de 01/11/2017, pág. 22/109

18/100

Neisseria meningitidis ;

•	um	antígeno zae;	protetor	contra	Haemophilus influen-
•	um	antígeno	protetor	contra	pneumococcus;
•	um	antígeno	protetor	contra	difteria;
•	um	antígeno	protetor	contra	tétano;
•	um	antígeno	protetor	contra	coqueluche;
•	um	antígeno	protetor	contra	Helicobacter pylori ;
•	um	antígeno	protetor	contra	pólio; e/ou
•	um	antígeno	protetor	contra	o vírus da hepatite

B.

Exemplos preferidos deste componentes opcionais são:

• um antígeno polissacarídico contra o grupo sérico

A de Neisseria meningitidis;

• um antígeno polissacarídico contra o grupo sérico

C de Neisseria meningitidis, tal como o descrito em Costantino e cols. (1992) Vaccine

10:691-698;

• um antígeno polissacarídico contra o grupo sérico

Y de Neisseria meningitidis ;

• um antígeno polissacarídico contra o grupo sérico

W de Neisseria meningitidis ;

• um antígeno polissacarídico contra Haemophilis influenzae;

• um antígeno polissacarídico contra pneumococos;

• um antígeno protetor contra difteria, consistindo em um toxóide de difteria tal como o mutante CRM197 [Del Giudice e cols. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70, por exemplo].

• um antígeno protetor contra o tétano, consistindo de 01/11/2017, pág. 23/109

19/100 em um toxóide de tétano. [Wassilak & Orenstein, Capítulo 4 de Vaccines (eds. Plotkin & Mortimer), 1988, por exemplo] • antígeno protetor contra coqueluche, compreendendo a holotoxina de pertussis (PT) e a hemoaglutinina filamentosa (FHA); opcionalmente compreendendo ainda pertactina e/ou os aglutinógenos 2 e 3 [Gustafsson e cols. (1996) N. Engl. J. Med. 334:34 9-355; Rappuoli e cols. (1991) TIBTECH 9:232-238].

• um antígeno protetor contra H.pylori, compreende um ou mais de CagA (WO93/18150, por exemplo), VacA (WO93/18150, por exemplo), NAP (WO99/53310, por exemplo), HopX (WO98/04702, por exemplo), HopY (WO98/04702, por exemplo), urease.

• um antígeno protetor contra o vírus da hepatite

B, consistindo em um antígeno da superfície de HBV e/ou um antígeno do núcleo de HBV

Nos casos em que a composição compreende um antígeno contra difteria, ela compreende ainda, de preferência, antígenos contra pólio e tétano. Nos casos em que a composição compreende um antígeno contra o tétano ela compreende também, de preferência, antígenos contra a difteria e o pólio. Nos casos em que a composição compreender um antígeno contra pólio, ela também compreenderá, de preferência, antígenos contra difteria e tétano.

A toxina da coqueluche é uma proteína tóxica que, quando presente na composição, é de preferência destoxificada. A destoxificação pode ser por meios químicos e/ou gede 01/11/2017, pág. 24/109

20/100 néticos. Um mutante destoxificado preferido é o mutante duplo 9K/129G [conforme Rappuoli (1997) Nature Medicine 3:374-376].

Nos casos em a composição inclui uma proteína que existe em formas diferentes nascente e madura, é preferível se empregar a forma madura da proteína. Nos casos em que é incluída NspA, por exemplo (WO96/29412; veja também Martin e cols. (1997) J. Exp. Med 185 1173-1183) é preferível se usar a forma madura da proteína não contendo o peptídeo de sinal.

Nos casos em que a composição inclui um antígeno polissacarídico, o polissacarídeo é de preferência conjugado a uma proteína portadora.

Terapia, profilaxia, diagnóstico

A composição da invenção é de preferência uma vacina. As vacinas, de acordo com a invenção, podem ou ser profiláticas (isto é, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (isto é, para tratar a doença depois da infecção).

A invenção também propõe as composições da invenção para emprego como medicamentos (de preferência em forma de vacinas) ou como reagentes para diagnósticos. Ela também propõe o emprego de uma composição de acordo com a invenção na fabricação de (i) um medicamento para o tratamento ou prevenção de infecção devida a bactérias neisseriais; (ii) um reagente para diagnóstico para detectar a presença de bactérias neisseriais ou de anticorpos lançados contra bactérias neisseriais; e/ou (iii) um reagente que pode lançar anticorpos contra bactérias neisseriais. As citadas bactérias neisseriais podem consistir em qualquer espécie ou cepa (tal como N. gonorrhoeae) mas consistem, de preferência, de 01/11/2017, pág. 25/109

21/100 em N. meningitidis, especialmente do grupo sérico B (NmB).

A invenção também propõe um processo de tratamento de um paciente, que consiste na administração ao paciente de uma quantidade efetiva do ponto de vista terapêutico de uma composição de acordo com a invenção. O processo consiste de preferência, em imunização.

Processos

De acordo com outros aspectos, a invenção propõe diversos processos.

É proposto um processo para a produção de uma composição da invenção, compreendendo a etapa de extração (extração de desoxicolato, por exemplo) de OMVs de N. meningitidis.

Lista de Seqüências

As seqüências na lista de seqüências são:

ID DE SEQ	DESCRIÇÃO
1	Seqüência de terminal N da proteína do grupo séri- co B de N.meningitidis
2	Gene completo proveniente do grupo sérico B de N.meningitidis
3	Proteína codificada de ID DE SEQ 2
4	Proteína do peptídeo de sinal de ID DE SEQ 3
5	Proteína madura de ID DE SEQ 3
6	Gene completo de N.gonorrhoeae, homóloga à ID DE SEQ 2
7	Proteína codificada de ID DE SEQ 6
8	Proteína de peptídeo de sinal de ID DE SEQ 7
9	Proteína madura de ID DE SEQ 7
10	Gene completo do grupo sérico A de N.meníngítídís,

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 26/109

22/100

	homólogo à ID DE SEQ 2
11	Proteína codificada de ID DE SEQ 10
12	Proteína de peptídeo de sinal de ID DE SEQ 11
13	Proteína madura de ID DE SEQ 11
14	Proteína '919' da cepa de nmb 2996

Modos para Executar a Invenção

Um sumário de técnicas e procedimentos padrão que podem ser empregados a fim de conduzir a invenção (para utilizar as seqüências descritas para os fins de vacinação ou diagnóstico, por exemplo). Este sumário não é uma limitação da invenção, dando, pelo contrário, exemplos que podem ser usados, mas que não são obrigatórios.

Generalidades

A colocação em prática da presente invenção empregará, 10 a não ser que seja indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que se encontram dentro dos conhecimentos dos peritos na técnica. Tais técnicas são explicadas integralmente na literatura, citemos por exemplo: Sambrook

Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989); DNA Cloning, Volumes I e II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (m. J. Gait ed., 194); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.j. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S. J. Higgins eds, 19840; Animal Cell Culture (R. I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); a série The Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.), especialmente os volumes 154-15; Gene Transfer Vectors for Mammalian

Cells (J. H. Miller e M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 27/109

23/100

Harbor Laboratory); Mayer e Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purífícatíon: Principles and Practice, Segunda Edição (Springer-v/erlag N. Y.), e Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir e C.C. Blackwell eds. 1986).

As abreviaturas padrão para nucleotídeos e aminoácidos são usadas nesta especificação.

As proteínas empregadas com a invenção podem ser preparadas de diversos modos (por expressão recombinante, purificação a partir de cultura celular, síntese química, por exemplo etc.) e de diversas formas (nativa, fusões, por exemplo etc.). É preferível se prepará-las em forma substancialmente pura (isto é, substancialmente isenta tanto de outras proteínas de Neisseria como de proteínas de células hospedeiras).

O ácido nucléico empregado com a invenção pode ser preparado de muitos modos (por síntese química, a partir de bibliotecas genômicas ou de cDNA, a partir do organismo em si etc.) e podem assumir diversas formas (de um filamento, de dois filamentos, vetores, sondas etc., por exemplo). O termo ácido nucléico inclui DNA e RNA e também seus análogos, tais como os que contêm estruturas modificadas e também ácidos nucléicos peptídicos (PNA) etc.

Definições

Uma composição contendo X é substancialmente isenta de Y quando pelo menos 85% do peso do total de S + Y na composição é constituído por X. É preferível que X constitua pelo menos aproximadamente 90% em peso do total de X +

Y na composição, sendo mais preferível de pelo menos aprode 01/11/2017, pág. 28/109

24/100 ximadamente 95% ou até mesmo 99 % em peso.

O termo constituído por significa incluir assim como consistir em, isto é, uma composição constituída por X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional a X, tal como X + Y.

O termo heterólogo se refere a dois componentes biológicos que não se encontram juntos na natureza. Os componentes podem ser células hospedeiras, genes, ou regiões reguladoras, tais como promotores. Embora os componentes heterólogos não sejam encontrados juntos na natureza, eles podem funcionar em conjunto, como quando um promotor heterólogo a um gene é ligado de modo operativo ao gene. Um outro exemplo é quando uma seqüência neisserial é heteróloga a uma célula hospedeira murina. Um outro exemplos seria constituído por dois epitopos provenientes da mesma proteína ou de proteínas diferentes que tenham sido montadas em uma única proteína em um arranjo não encontrado na natureza.

Uma origem de replicação consiste em uma seqüência de polinucleotídeos que inicia e regula a replicação de polinucleotídeos no interior de uma célula, capaz de replicação sob o seu próprio controle. Uma origem de replicação pode ser necessária para que um vetor se replique em uma célula hospedeira específica. Com determinadas origens de replicação, um vetor de expressão pode ser reproduzido com um número de cópias grande na presença de proteínas adequadas no interior da célula. Exemplos de origens são as seqüências de replicação autônoma, que são efetivas em levedura; e o antígeno T viral, efetivo em células COS-7.

A identidade entre proteínas é de preferência determide 01/11/2017, pág. 29/109

25/100 nada pelo algoritmo de busca de homologia Smith-Waterman conforme implementado no programa MPSRCH (Oxford Molecular) empregando-se uma busca de intervalo affine com os parâmetros penalidade aberta de intervalo = 12 e penalidade de extensão de intervalo = 1. Tipicamente 50% de identidade ou mais entre duas proteínas são considerados como sendo uma indicação de equivalência funcional.

Conforme empregado no presente, uma variante alélica de uma molécula, ou região, de ácido nucléico para o qual a seqüência de ácidos nucléicos é fornecida no presente, consiste em uma molécula ou região de ácidos nucléicos que ocorre essencial no mesmo locus no genoma de um outro isolado ou segundo isolado e que, devido à variação natural causada por mutação ou recombinação, por exemplo, tem uma seqüência de ácidos nucléicos análoga mas não idêntica. Uma variante alélica de região de codificação codifica tipicamente uma proteína que tem uma atividade análoga à da proteína codificada pelo gene ao qual ela está sendo comparada. Uma variante alélica pode também compreender uma alteração nas região não traduzidas 5' ou 3' do gene, tais como em regiões de controle regulador (veja patente U.S. 5.753.235, por exemplo).

Sistemas de expressão

As seqüências de nucleotídeos Neisserial podem ser expressas em uma variedade de diferentes sistemas de expressão; aqueles usados com células de mamíferos, baculovírus, plantas, bactérias e leveduras, por exemplo.

i. Sistemas de Mamíferos

Os sistemas de expressão de mamíferos são conhecidos na técnica. Um promotor de mamífero é qualquer seqüência de de 01/11/2017, pág. 30/109

26/100

DNA capaz de se ligar a RNA polimerase de mamífero e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma seqüência de codificação (de gene estrutura, por exemplo) no mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição, que é geralmente localizada proximal à extremidade 5' da seqüência de codificação e uma caixa TATA, geralmente localizada a 25-30 pares base (bp) a montante do sítio de iniciação de transcrição. A caixa TATA é considerada como dirigindo a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no sítio correto. Um promotor de mamíferos também conterá um elemento promotor a montante, geralmente localizado dentro de 100 a 200 bp a montante da caixa TATA. Um elemento promotor a montante determina a velocidade à qual a transcrição é iniciada e pode agir em qualquer orientação [Sambrook e cols. (1989) Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells. Em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.]

Os genes virais de mamíferos são freqüentemente de expressão muito elevada e tem uma faixa ampla de hospedeiros; portanto as seqüências que codificam os genes virais de mamíferos provêm seqüências de promotores especialmente úteis. Os exemplos incluem o promotor precoce SV40, o promotor de LTR do vírus de tumor mamário murino, o promotor tardio principal do adenovírus (Ad MLP) e promotor do vírus de herpes simplex. Além disso, as seqüências derivadas de genes não virais, tais como o gene metaloteioneína murina, também proporciona seqüências de promotores úteis. A expressão pode, ou ser constitutiva ou regulada (induzível), dependendo do promotor pode ser induzida como glicocorticóide em células que respondem a hormônio.

A presença de um elemento intensificador (intensificade 01/11/2017, pág. 31/109

27/100 dor) combinada com os elementos promotores descritos acima, geralmente aumente os níveis de expressão. Um acentuador é uma seqüência de DNA reguladora que pode estimular a transcrição de até 1000 vezes quando ligada a promotores homólogos ou heterólogos, com síntese começando no sítio de partida de RNA normal. Intensificadores são também ativos quando eles são colocados a montante ou a jusante do sítio de iniciação de transcrição, tanto na orientação normal como a invertida ou a uma distância de mais de 1000 nucleotídeos a partir do promotor (Maniatis e cols. 1987) Science 236-1237; Alberts e cols. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2a ed.]. Os elementos intensificadores derivados de vírus podem ser especialmente úteis, pois eles têm geralmente uma faixa mais ampla de hospedeiros. Os exemplos incluem o intensificador de gene precoce SV40 (Dijketa e cols. (1985) EMBO J. 4:761] e o intensificador/promotores derivados da repetição terminal longa (LTR) do Vírus de Sarcoma de Rous (Gorman e cols. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79:6777] e de citomegalovírus humano (Boshart e cols. (1985) Cell 41:621]. Além disso, alguns intensificadores são reguláveis e se tornam ativos somente na presença de um indutor, tal como um hormônio ou íon metálico [SassoneCorsi e Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis e cols. (1987) Science 236:1237].

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente em células de mamíferos. Uma seqüência promotora pode ser diretamente ligada à molécula de DNA, sendo neste caso o primeiro aminoácido no terminal N da proteína recombinante sempre uma metionina, que é codificada pelo códon inicial ATG. Se for desejado o terminal N pode ser clivado da de 01/11/2017, pág. 32/109

28/100 proteína por incubação in vitro com brometo de cianogênio.

Alternativamente, proteínas estranhas podem também ser secretadas da célula para o meio de crescimento por criação de moléculas de DNA quiméricas que codificam uma proteína de fusão constituída por um fragmento de seqüência líder que proporciona a secreção da proteína estranha em células de mamíferos. É preferível que haja sítios de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene estranho que pode ser clivado ou in vidro ou in vitro. O fragmento da seqüência líder geralmente codifica um peptídeo de sinal que é constituído por aminoácidos hidrófobos que dirigem a secreção da proteína da célula. O líder tripartite do adenovírus é um exemplo de uma seqüência líder que proporciona a secreção de uma proteína estranha em células de mamíferos.

Geralmente as seqüências de terminação de transcrição e de poliadenilação reconhecidas pelas células de mamíferos são regiões reguladoras localizadas a 3' do códon de interrupção de tradução e portanto, juntamente com os elementos promotores flanqueiam a seqüência de codificação. O terminal 3' do mRNA maduro é formado por clivagem de pós transcrição específica a sítio e poliadenilação (Birnstiel e cols. (1985) Cell 41:349; Proudfoot e Whitelaw (1988) Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. Em Transcription and splicing (ed. B. D. Hames e D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Estas seqüências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipeptídeo codificado pelo DNA. Exemplos de terminador de transcrição/ sinais de poliadenilação incluem aqueles derivados de SV40 [Sambrook e cols. (1989) Expresde 01/11/2017, pág. 33/109

29/100 sion of cloned genes in cultured mammalian cells. Em Molecular Cloning: A Laboratory Manual]

Geralmente, os componentes descritos acima, que compreendem um promotor, sinal de poliadenilação e seqüência de terminação de transcrição são colocados em conjunto nas construções de expressão. Intensificadores, íntrons com sítios de doador e aceitador funcionais de junção, e as seqüências líder podem também ser incluídas em uma construção de expressão, se for desejado. As construções de expressão são freqüentemente mantidas em um réplicon, tal como um elemento extracromossômico (tal como plasmídeos, por exemplo) capaz de uma manutenção estável em um hospedeiro tal como células de mamíferos ou bactérias. Os sistemas de replicação de mamíferos incluem os derivados de vírus de animais, que exigem a replicação de fatores de trans-atuação. Os plasmídeos que contêm os sistemas de replicação do papovavírus, por exemplo, tais como SV 40 (Gluzmman (1981) Cell 23:175] ou polioma vírus replicam até um número extremamente alto de cópias na presença do antígeno T viral adequado. Exemplos adicionais de réplicons de mamíferos incluem os derivados do papilomavírus bovino e do vírus Epstein-Barr. Além disso, o réplicon pode ter dois sistemas de replicação, permitindo assim que ele seja mantido em células de mamíferos para a expressão e em um hospedeiro procariótico para a clonagem e amplificação, por exemplo. Exemplos de tais vetores recíprocos de mamíferos-bactérias incluem pMT 2 [Kaufman e cols. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] e pHEBO [Shimizu e cols. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074]

O procedimento de transformação empregado depende do hospedeiro a ser transformado. Os processos de introdução de 01/11/2017, pág. 34/109

30/100 de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são conhecidos na técnica e incluem transfecção mediada por dextrana, precipitação por fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão dos protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo (s) em lipossomas e microinjeção direta do DNA nos núcleos.

As linhagens de células de mamíferos disponíveis como hospedeiras para a expressão são conhecidas na técnica e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponível do American Type Culture Collection (ATCC) incluindo, sem limitação, células ovarianas de hamster chinês (CH0), células HeLa, células renais de hamster bebê (BHK), células renais de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (Hep G2, por exemplo) e uma série de outras linhagens celulares.

ii. Sistemas de Baculovírus

O polinucleotídeo que codifica a proteína pode também ser inserido em um vetor de expressão de inseto adequado, e é ligado de modo operável aos elementos de controle no interior daquele vetor. A construção do vetor emprega técnicas que são conhecidas na técnica. Geralmente os componentes do sistema de expressão incluem um vetor de transferência, geralmente uma plasmídeo bacteriano, que contêm tanto um fragmento do genoma do baculovírus, como um sítio de restrição conveniente para a inserção do gene ou genes heterólogos a ser (em) expresso(s); um baculovírus do tipo selvagem com uma seqüência homóloga à do fragmento específico a baculovírus no vetor de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovírus); e células hospedeiras de insetos adequadas e de 01/11/2017, pág. 35/109

31/100 meio de cultura.

Depois da inserção da seqüência de DNA que codifica a proteína no vetor de transferência, o vetor e o genoma viral do tipo selvagem são transfeccionados em uma célula hospedeira de inseto onde se permite que o vetor e o genoma viral se recombinem. O vírus recombinante acondicionado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para os sistemas de expressão para baculovírus/célula de inseto são disponíveis no comércio em forma de kit, dentre outros, de San Diego CA (kit MaxBax) Estas técnicas são geralmente conhecidas dos peritos na técnica e são descritos na íntegra em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Statíon Bulletin No. 1555 (1987) (doravante Summers e Smith).

Antes de se inserir a seqüência de DNA que codifica a proteína no genoma do baculovírus, os componentes descritos acima, compreendendo um promotor, líder, (se desejado), seqüência de codificação de interesse, e a seqüência de terminação de transcrição, são geralmente montados em uma construção intermediária de translocalização (vetor de transferência). Esta construção pode conter um único gene e elementos reguladores ligados de modo operável; genes múltiplos, cada um com o seu conjunto próprio de elementos reguladores ligados de modo operável; ou genes múltiplos, regulados pelo mesmo conjunto de elementos reguladores. As construções de translocalização intermediárias são freqüentemente mantidas em um réplicon, tal como um elemento extra-cromossômico (em plasmídeos, por exemplo) capaz de manter de modo estável um hospedeiro, tal como uma bactéria. O réplicon terá um sistema de replicação, permitindo assim de 01/11/2017, pág. 36/109

32/100 que ele seja mantido em um hospedeiro adequado para fins de clonagem e amplificação.

Atualmente o vetor de transferência mais habitualmente empregado para a introdução de genes estranhos no AcNPV é pAc373. Muitos outros vetores, conhecidos dos peritos na técnica, já foram projetados. Estes incluem, por exemplo, pVL985 (que altera o códon de início de poli-hedrina de ATG a ATT, e que introduz um sítio de clonagem de BamHI 32 pares base a jusante do ATT; veja LUcko2 e Summers, Virology (1989) 17:31.

O plasmídeo geralmente também contém um sinal de poliadenilação de poli-hedrina (Miller e cols. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) e um gene procariótico de resistência a ampicilina (amp) e origem de replicação para a seleção e propagação em E. coli .

Os vetores de transferência de baculovírus geralmente contêm um promotor de baculovírus. Um promotor de baculovírus é qualquer seqüência de DNA capaz de se ligar a uma RNA polimerase de baculovírus e de iniciar a transcrição a jusante (5' a 3') de uma seqüência de codificação (de um gene estrutural, por exemplo) no mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que é geralmente localizada proximal à extremidade 5' da seqüência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição geralmente inclui um sítio de ligação de RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um vetor de transferência de baculovírus pode também ter um segundo domínio denominado um intensificador, que, se estiver presente, é geralmente distal ao gene estrutural. A expressão pode ou ser regulada ou constitutiva.

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Os genes estruturais, com transcrição abundante em períodos tardios em um ciclo de infecção viral, proporcionam seqüências de promotor especialmente úteis. Exemplos incluem seqüências derivadas do gene que codifica a proteína viral de poli-hedron, Fiersen e cols., (1989) The Regulation of BaculoVírus Gene Expression em; The Molecular Biology of BaculoVíruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. No. 127 839 e 155 476; e o gene que codifica a proteína p10, Vlak e cols., (1988), J. Gen. Virol. 69:765.

As seqüências de sinal de codificação de DNA adequadas podem ser derivadas de genes para as proteínas secretadas de insetos ou de baculovírus, tais como o gene de polihedrina de baculovírus (Carbonell e cols. (1988) Gene, 73:409). Alternativamente, como os sinais para as modificações pós tradução de células de mamíferos (tais como sinal de clivagem de peptídeo, de clivagem proteolítica e de fosforilação) parecem ser reconhecidos por células de insetos, e os sinais necessários para a secreção e acumulação nuclear parecem ser conservados entre as células de invertebrados e as células de vertebrados, os líderes de origem não de insetos, tais como os derivados dos genes que codificam a α-interferona humana, Maeda e cols., (1985), Nature 315:592; peptídeo humano liberador de gastrina, LebacqVerheyden e cols., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humana, Smith e cols., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 murina, (Miyajima e cols., (1987) Gene 58:273; e glicocerebrosidase humana, Martin e cols. (1988) DNA, 7:99, podem também ser usados para prover a secreção em insetos.

Um polipeptídeo ou poliproteína recombinante pode ser de 01/11/2017, pág. 38/109

34/100 expressa intracelularmente ou, se for expressa com as seqüências reguladoras adequadas, ela pode ser secretada. Uma boa expressão intracelular de proteínas estranhas não fundidas geralmente exige genes heterólogos que tem de modo ideal uma seqüência líder curta contendo sinais de iniciação de tradução adequados precedendo um sinal de início de ATG. Se for desejado a metionina no terminal N pode ser clivada da proteína madura por incubação in vitro com brometo de cianogênio.

Alternativamente, as poliproteínas recombinantes ou as proteínas que não são naturalmente secretadas, podem ser secretadas da célula de inseto por criação de moléculas de DNA quiméricas que codificam uma proteína de fusão constituída por um fragmento de seqüência líder que fornece a secreção da proteína estranha em insetos. O fragmento de seqüência líder geralmente codifica um peptídeo de sinal que é constituído por aminoácidos hidrófobos que dirigem a translocalização da proteína para o retículo endoplasmático.

Depois da inserção da seqüência de DNA e/ou do gene que codifica o produto de expressão precursor da proteína, uma célula hospedeira de inseto é co-transformada com o DNA heterólogo do vetor de transferência e o DNA genômico do baculovírus do tipo selvagem - geralmente por cotransfecção. O promotor e a seqüência de terminação de transcrição da construção geralmente é constituída por uma seção de 2-5 kb do genoma do baculovírus. Os processos para a introdução do DNA heterólogo no sítio desejado no baculovírus são conhecidos na técnica (Veja Summers e Smith, acima; Ju e cols. (1987); Smith e cols., Mol. Cell. Biol.

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35/100 (1983) 3:2156; e Luckow e Summers (1989)). A inserção, por exemplo, pode ser em um gene tal como o gene de polihedrina, por recombinação de crossover duplo homólogo; a inserção também pode ser em um sítio de enzima de restrição construída no gene de baculovírus desejado. Miller e cols., (1989), Bioessays 4:91. A seqüência de DNA quando clonada no lugar do gene de poli-hedrina no vetor de expressão, é flanqueada tanto em 5' como em 31 pelas seqüências específicas a poli-hedrina e é posicionada a jusante do promotor de poli-hedrina.

O vetor de expressão do baculovírus recém-formado é subseqüentemente acondicionado em um baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre a baixa freqüência (entre aproximadamente 1% e aproximadamente 5%), portanto, a maioria do vírus produzido depois da cotransfecção ainda é do tipo selvagem. Portanto, é necessário um processo para se identificar os vírus recombinantes. Uma vantagem do sistema de expressão é uma seleção visual que permite que se distinguem os vírus recombinantes. A proteína de poli-hedrina que é produzida pelo vírus nativo, é produzida a níveis muito altos nos núcleos de células infectadas em períodos tardios após a infecção viral. A proteína de poli-hedrina acumulada forma corpos de oclusão que também contêm partículas engastadas. Estes corpos de oclusão tendo até 15 qm de tamanho, são extremamente refráteis, o que lhes dá uma aparência brilhante que é facilmente visualizada ao microscópio luminoso. As células infectadas com os vírus recombinante não têm corpos de oclusão. Para se distinguir o vírus recombinante do tipo selvagem, o sobrenadante da transfecção é disposto em placas sobre uma de 01/11/2017, pág. 40/109

36/100 camada de células de inseto por técnicas conhecidas dos peritos na técnica. Mais exatamente, as placas são examinadas ao microscópio luminoso para a constatação da presença (indicadora do vírus do tipo selvagem) ou ausência (indicadora de vírus recombinantes) de corpos de oclusão. Current Protocols in Microbiology Vol. 2 (Ausubel e cols. eds) em 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers e Smith, acima; Miller e cols. (1989).

Os vetores de expressão de baculovírus recombinante já foram desenvolvidos para infecção em diversas células de insetos. Os baculovírus recombinantes, por exemplo, foram desenvolvidos, dentre outros, para: Aedes aegypti, Autographa califronica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni WO 98/046699; Carbonell e cols., (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 3221:718; Smith e cols., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:156; e veja para as generalidades, Fraser e cols. (1989) In vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

As células e os meios de cultura celular são disponíveis no comércio tanto para a expressão direta como de fusão de polipeptídeos heterólogos em um sistema de baculovírus/expressão a tecnologia de cultura celular é em geral conhecida pelos peritos na técnica, veja, Summers e Smith, acima, por exemplo.

As células de insetos modificadas podem então ser cultivadas em meio nutritivo adequado, o que permite a manutenção estável do(s) plasmídeo(s) presente(s) no hospedeiro modificado de inseto. Nos casos em que o gene do produto de expressão estiver sob controle induzível, a hospedeira pode ser cultivada até atingir uma alta densidade, e a expressão de 01/11/2017, pág. 41/109

37/100 induzida. Alternativamente, nos casos em que a expressão for constitutiva, o produto será continuamente expresso no meio e deve-se fazer continuamente circular o meio nutritivo, removendo-se neste ínterim o produto de interesse e aumentando-se o teor de nutrientes a medida que eles são utilizados. O produto pode ser purificado por técnicas tais como cromatografia, HPLC, por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia por troca de íons, etc.; eletroforese; centrifugação com gradiente de densidade; extração com solvente, ou semelhantes. Onde for apropriado, o produto pode ser ainda mais purificado, conforme a necessidade, de modo a remover substancialmente quaisquer proteínas de insetos que tenham também sido secretadas no meio ou que resultam da lise de células de insetos, de modo a prover um produto que seja pelo menos substancialmente isento de resíduos da hospedeira, tais como proteínas, lipídios, e polissacarídeos.

A fim de se obter a expressão da proteína, as células hospedeiras recombinantes derivadas dos transformantes são incubadas em condições que permitem a expressão da proteína recombinante codificada pela seqüência. Estas condições irão variar, dependendo da célula hospedeira selecionada. No entanto, as condições são fáceis de serem determinadas pelos peritos na técnica, com base no que é conhecido na técnica.

iii. Sistemas em plantas

Existem muitas culturas de células vegetais e sistemas integrais de expressão genética de plantas conhecidos na técnica. Os sistemas de expressão genética de células vegetais exemplares incluem aqueles descritos em patentes, tais de 01/11/2017, pág. 42/109

38/100 como: patente U.S. 5.693.506; patente U.S. 5.659.122; e patente U.S. 5.608.143. Exemplos adicionais de expressão genética em cultura de células vegetais já foram descritos por Zenk, Phytochemistry 30:3861-3863 (1991). Descrições de peptídeos de sinal de proteína vegetais podem ser encontrados além das referências descritas acima em Vaulcombe e cols., Mol. Gen. Genet. 209:33-40 (1987); Chandler e cols., Plant Molecular Biology 3:407-418 (1984); Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985); Rothstein e cols. Gene 55:353356 (1987); Whittier e cols., Nucleic Acids Research 15:2515-2535 (1987); Wirsel e cols., Molecular Microbiology 3:3-14 (1989); Yu e cols., Gene 122:247-253 (1992). Uma descrição da regulação da expressão do gene vegetal pelo fito-hormônio, ácido giberélico e enzimas secretadas induzidas pelo ácido giberélico pode ser encontrado em R. L. Jones e J. MacMillin, Gebberellins: em Advanced Plant Physiology, Malcolm B. Wilkins, ed., 1984 Pitman Publishing Limited, London, pp. 21-52. As referências que descrevem outros genes metabolicamente regulados: Sheen, Plant Cell, 2:1027-1038 (1990); Maas e cols. EMBO J. 9:3447-3452 (1990); Benkel e Hickey, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:13371339 (1987)

Tipicamente, empregando-se técnicas conhecidas na técnica, uma seqüência de polinucleotídeos desejada é inserida em uma cassete de expressão compreendendo elementos reguladores genéticos projetados para operação em plantas. A cassete de expressão é inserida em um vetor de expressão desejado com seqüências companheiras a jusante e a montante da cassete de expressão adequadas para expressão em uma hospedeira vegetal. As seqüências companheiras serão de origem de 01/11/2017, pág. 43/109

39/100 de plasmídeos ou viral e proporcionam características necessárias ao vetor para permitir que os vetores desloquem o DNA de uma hospedeira de clonagem original, tal como de bactérias, para a hospedeira vegetal desejada. A construção básica bacteriana/vegetal proporcionará, de preferência, uma origem de replicação procariótica de uma ampla faixa de hospedeiras; um marcador procariótico selecionável; e, para as transformações de Agrobacterium, seqüências de DNA T para a transferência mediada por Agrobacterium para cromossomas vegetais. Nos casos em que o gene heterólogo não é fácil de se levado a detecção a construção de preferência também será um gene marcador selecionável adequado para determinar se uma célula vegetal foi transformada. Uma resenha geral de marcadores adequados, para os membros da família das gramíneas, por exemplo, é encontrada em Wilmink e Eons, 1992, Plant Mol. Biol. Reptr, 11(2):165-185.

As seqüências adequadas para permitir a integração da seqüência heteróloga no genoma vegetal são também recomendadas. Estas podem incluir seqüências de transpóson e análogas para a recombinação homóloga assim como seqüências Ti que permitem a inserção aleatória de uma cassete de expressão heteróloga em um genoma vegetal. Marcadores selecionáveis procarióticos incluem resistência contra antibióticos tais como a ampicilina ou a tetraciclina. Outras seqüências de DNA que codificam funções adicionais podem também se encontrar presentes no vetor, conforme é conhecido na técnica.

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem ser incluídas em uma cassete de expressão para a expressão da proteína(s) de interesse. Geralmente haverá sode 01/11/2017, pág. 44/109

40/100 mente uma cassete de expressão, embora duas ou mais também sejam viáveis. A cassete de expressão recombinante conterá além da proteína heteróloga que codifica a seqüência os seguintes elementos, uma região de promotor, seqüências não traduzidas 5' vegetais, códon de iniciação dependendo do gene estrutural vir ou não equipado com um, e uma seqüência de terminação de transcrição e de tradução. Sítios específicos de enzima de restrição nas extremidades 5' e 3' da cassete permitem a inserção fácil em um vetor préexistente.

Uma seqüência de codificação heteróloga pode ser para qualquer proteína associada com a presente invenção. A seqüência que codifica a proteína de interesse codificará um peptídeo de sinal que permite o processamento e translocalização da proteína, conforme adequado, e geralmente não terá nenhuma seqüência que possa resultar na ligação da proteína desejada da invenção a uma membrana. Como, na maior parte dos casos, a região de iniciação transcricional será para um gene que é expresso e translocalizado durante a germinação, empregando-se o peptídeo de sinal que proporciona a translocalização pode-se também proporcionar a translocalização da proteína de interesse. Deste modo a(s) proteína(s) de interesse será(serão) translocalizada(s) das células em que elas são expressas e pode(m) ser eficientemente coletada(s). Tipicamente a secreção em sementes se dá através da aleurona ou da camada de epitélio escutelar para dentro do endosperma da semente. Embora não seja necessário que a proteína seja secretada das células em que a proteína é produzida, isto facilita o isolamento e a purificação da proteína recombinante.

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Como a expressão final do produto de gene desejado será em uma célula eucariótica, é desejável se determinar se qualquer porção do gene clonado contém seqüências que serão processadas como íntrons pela maquinaria do soma de junção da hospedeira. Se tal ocorrer, pode ser conduzida a mutagênese dirigida a sítio da região do íntron para impedir a perda de uma porção da mensagem genética como um código falso de íntron, Reed e Maniatis, Cell 41:95-105, 1958.

O vetor pode ser micro-injetado diretamente nas células vegetais com o emprego de micro-pipetas para transferir mecanicamente o DNA recombinante. Crossway, Mol. Gen. Genet., 202:179-185, 1985. O material genético pode também ser transferido para a célula vegetal empregando-se polietileno glicol, Krens, e cols., Nature, 296:72-74, 1982. Um outro processo de introdução de segmentos de ácido nucléico é a penetração balística a alta velocidade por partículas pequenas com o ácido nucléico quer no interior da matriz de pequenas contas o partículas, ou na superfície, Klein e cols., Nature, 327, 70-73, 1987 e Knudsen e Muller, 1991,

Planta, 185:330-336, instruindo sobre o bombardeio do endosperma de cevada com partículas para a criação de cevada transgênica. Um outro processo de introdução ainda seria a fusão de protoplastos com outras entidades, quer minicélulas, quer células, lisossomas ou outros corpos fusíveis cobertos de lipídios, Fraley e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863, 1982.

O vetor pode também ser introduzido nas células vegetais por eletroporação. (Fromm e cols., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 82:5824, 1985). Nesta técnica, os protoplastos vegetais são eletroporados na presença de plasmídeos contendo de 01/11/2017, pág. 46/109

42/100 a construção genética. Os impulsos elétricos de alta resistência de campo permeabilizam de modo reversível as biomembranas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos vegetais eletroporados reformar a parede celular, dividem e formam o callus vegetal.

Todas as plantas a partir das quais podem ser isolados e cultivados protoplastos para resultar em plantas regeneradas integrais podem ser transformadas pela presente invenção de modo que a plantas integrais são recuperadas que contêm o gene transferido. É fato conhecido que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir de células ou tecidos cultivados, inclusive, sem limitação todas as espécies especiais de cana de açúcar, beterraba açucareira, algodão, árvores frutíferas e outras, leguminosas e folhosos. Algumas plantas adequadas incluem, por exemplo, espécies dos gêneros Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum , Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyosciamus, Lycopersion, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Panniseum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum e Datura.

Os meios para a regeneração variam de uma espécie a outra de plantas, mas geralmente uma suspensão de protoplastos transformados contendo cópias do gene heterólogo é primeiro provida. O tecido do callus é formado e os brotos podem ser induzidos do callus, sendo subseqüentemente enraizados. Alternativamente, a formação do embrião pode ser de 01/11/2017, pág. 47/109

43/100 induzida da suspensão de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões naturais para formar plantas. O meio de cultura geralmente conterá diversos aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citoquininas. É também vantajoso se acrescentar o ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para tais espécies como milho e alfafa. Os brotos e as raízes normalmente se desenvolvem simultaneamente. Uma regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo e do histórico da cultura. Se estas três variáveis são controladas, então a regeneração é plenamente reproduzível e repetível.

Em determinados sistemas de cultura de células vegetais, a proteína desejada da invenção pode ser excretada ou alternativamente, a proteína pode ser extraída da planta integral. Nos casos em que a proteína desejada da invenção é secretada no meio, ela pode ser coletada. Alternativamente, os embriões e as meias-sementes desprovidas de embriões ou outro tecido vegetal pode ser mecanicamente destruído para liberar qualquer proteína secretada entre as células e tecidos. A mistura pode ser suspensa em uma solução tampão para se recuperar as proteínas solúveis. Processos convencionais de isolamento e purificação da proteína serão então usados para purificar a proteína recombinante. Os parâmetros de tempo, temperaturas, pH, oxigênio, e volumes serão ajustados por processos rotineiros para otimizar a expressão e a recuperação da proteína heteróloga.

iv. Sistemas Bacterianos

As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas na técnica. Um promotor bacteriano é qualquer seqüência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e de iniciar de 01/11/2017, pág. 48/109

44/100 a transcrição a jusante (3') de uma seqüência de codificação (de gene estrutural, por exemplo) no mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que é geralmente localizado proximal à extremidade 5' da seqüência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição geralmente inclui um sítio de ligação de RNA polimerase e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor bacteriano pode também ter um segundo domínio denominado um operador, que pode se sobrepor ao sítio de ligação de RNA polimerase adjacente no qual começa a síntese de RNA. O operador permite a transcrição negativa regulada (induzível) uma vez que a proteína repressora de gene pode se ligar ao operador e deste modo inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, tais como o operador. Além disso, a regulação positiva pode ser obtida por uma seqüência de ligação de proteína ativadora de gene, que, se estiver presente se encontra geralmente proximal (5') à seqüência de ligação de RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína ativadora de gene é a proteína ativadora de catabólitos (CAP) que ajuda a iniciar a transcrição do óperon de lac em Escherichia coli (E. coli ) [Raibaud e cols. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. A expressão regulada pode portanto ou ser positiva ou negativa, deste modo ou intensificando ou reduzindo a transcrição.

A seqüência que codifica as enzimas de trajeto metabólico proporcionam seqüências de promotor especialmente úteis. Exemplos incluem seqüências de promotor derivadas de enzimas que metabolizam açúcares, tais como galactose, lactose (lac) [Chang e cols. (1977) Nature 198:1056], e maltode 01/11/2017, pág. 49/109

45/100 se. Exemplos adicionais incluem seqüências de promotor derivadas de enzimas bio-sintéticas tais como triptofano (trp) [Goeddel e cols. (1980) Nuc. Acids. Res. 8:4057; Yelverton e cols. (1981) Nucl. Acids. Res. 9:731; patente U.S. No. 4.738.921; EP-A-0036776 e EP-A-0121775] O sistema de promotor g-laotamase (bla) [Weissmann (1981) The cloning of interferon and other mistakes. em Interferon 3 (ed. I. Gresser)], os sistemas de promotor bacteriófago lambda PL [Shimatake e cols., (1981) Nature 292:128] e de T5 [patente U.S. 4.689.406] também propõe seqüências de promotores úteis.

Além disso, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. As seqüências de ativação de transcrição, por exemplo, de um promotor bacteriano ou de bacteriófago podem ser ligados com as seqüências de óperon de outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético (patente U.S. 4.551.433]. O promotor tac, por exemplo, é um promotor híbrido trp-lac constituído tanto por seqüências de promotor de trp como de óperon de lac que é regulado pelo repressor de lac [Amman e cols. (1983) Gene 25:167; de Boer e cols. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores que ocorrer na natureza de origem não bacteriana e que têm a capacidade de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Um promotor que ocorre na natureza de origem não bacteriana pode também ser acoplado com uma RNA polimerase compatível para produzir níveis altos de expressão de alguns genes em procariontes. O sistema RNA polimerase T7 de bacteriófago/promotor é um exemplo de um sistema de 01/11/2017, pág. 50/109

46/100 de promotor acoplado [Studier e cols. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor e cols. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:1074]. Além disso um promotor híbrido pode também compreender um promotor de bacteriófago e uma região de operador de E. coli (EPO-A-0 267 851).

Além de uma seqüência de promotor funcional, um sítio de ligação eficiente de ribossoma é também útil para a expressão de genes estranhos em procariontes. Em E. coli, o sítio de ligação de ribossomas é chamado de seqüência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um códon de iniciação (ATG) e uma seqüência de 3-9 nucleotídeos de comprimento localizada 3-11 nucleotídeos a montante do códon de iniciação [Shine e cols. (1975) Nature 254:34]. Pensa-se que a seqüência SD e a extremidade 3' de 16S mRNA de E. coli [Steitz e cols. (1979) Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. em Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para expressar os genes eucarióticos e os genes procarióticos com sítio fraco de ligação a ribossoma [Sambrook e cols. (1989) Expression of cloned genes in Escherichia coli. em Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente. Uma seqüência de promotor pode ser diretamente ligada com a molécula de DNA, sendo que neste caso o primeiro aminoácido no terminal N será sempre uma metionina, que é codificada pelo códon de partida ATG. Se for desejado a metionina no terminal N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogênio ou por incubação in vitro ou in vivo com uma peptidase de terminal N de metionina bacteriana (EPO-A-0 219 237).

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As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão direta. Geralmente, uma seqüência de DNA que codifica a porção de terminal N de uma proteína bacteriana endógena, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' das seqüências de codificação heterólogas. Depois da expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas seqüências de aminoácidos. O gene da célula lambda do bacteriófago pode ser ligado no terminal 5' de um gene estranho e ser expressa em bactérias. A proteína de fusão resultante conserva, de preferência, um sítio para uma enzima de processamento (fator Xa) para clivar a proteína de bacteriófago a partir do gene estranho [Nagai e cols. (1984) Nature 309:810]. As proteínas de fusão podem também ser produzidas com seqüências provenientes de genes de lacZ [jia e cols. (1987) Gene 60:197], trpE [Allen e cols. (1987) J. Biotechnol. 5:39; Makoff e cols. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11], e Chey [EP-A-0 324 647]. A seqüência de DNA da junção de duas seqüências de aminoácidos pode ou não codificar um sítio clivável. Um outro exemplo é uma proteína de fusão de ubiquitina. Tal proteína de fusão é produzida com a região de ubiquitina que conserva, de preferência, um sítio para uma enzima de processamento (tal como a protease de processamento específica a ubiquitina, por exemplo) para clivar a ubiquitina da proteína estranha. Através deste processo, a proteína estranha nativa pode ser isolada [Miller e cols. (1989) Bío/Technology 7:698].

Alternativamente, proteínas estranhas podem também ser secretadas da célula por criação de moléculas de DNA quiméricas que codificam uma proteína de fusão constituída por um fragmento de seqüência de peptídeo de sinal que provê a de 01/11/2017, pág. 52/109

48/100 secreção da proteína estranha em bactérias [patente U.S. 4.336.336]. O fragmento de seqüência de sinal geralmente codifica um peptídeo de sinal que é constituído por aminoácidos hidrófobos que dirigem a secreção da proteína da célula. A proteína ou é secretada no meio de cultura (bactérias gram-positivas) ou no espaço periplasmático, localizado entre a membrana interna e a externa da célula (bactérias gram-negativas). É preferível que haja sítios de processamento que possam ser clivados ou in vivo ou in vitro codificados entre o fragmento de peptídeo de sinal e o gene estranho.

As seqüências de sinal adequadas que codificam DNA podem ser derivadas de genes para proteínas bacterianas secretadas, tais como o gene de proteína de membrana externa de E. coli (ompA) [Masui e cols. (1983), em: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb e cols. (1984) EMBO J. 3:2437] e a seqüência de sinal de fosfatase alcalina de E. coli (phoA) [Oka e cols. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7212]. Como um exemplo adicional, a seqüência de sinal do gene de alfa-amilase proveniente de diversas cepas de Bacillus pode ser usada para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis [Palva e cols. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0 244 042].

Geralmente as seqüências de terminação de transcrição reconhecidas pelas bactérias são regiões reguladoras localizadas a 3' de distância do códon de interrupção de tradução, e assim juntamente com o promotor flanqueiam a seqüência de codificação. Estas seqüências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipeptídeo codificado pelo DNA. As seqüências de terminação de transcrição de 01/11/2017, pág. 53/109

49/100 freqüentemente incluem seqüências de DNA tendo aproximadamente 50 nucleotídeos capazes de formar estruturas de alça de haste que ajudam a terminar a transcrição. Os exemplos incluem seqüências de terminação de transcrição derivadas de genes com promotores fortes, tais como o gene trp de E. coli assim como outros genes biossintéticos.

Geralmente, os componentes descritos acima, compreendendo um promotor, seqüência de sinal (se for desejado), seqüência de codificação de interesse e seqüência de terminação de transcrição, são colocados juntos em construções de expressão. As construções de expressão são freqüentemente mantidas em um réplicon, tal como um elemento extracromossômico (plasmídeos, por exemplo) capaz de conservarse estável em uma hospedeira, tal como uma bactéria. O réplicon terá um sistema de replicação, que permite que ele seja mantido em uma hospedeira procariótica ou para expressão ou para a clonagem e amplificação. Além disso, um réplicon pode ou ser um plasmídeo de alto número de cópias ou de baixo número de cópias. Um plasmídeo de alto número de cópias geralmente terá um numero de cópias que varia entre aproximadamente 5 e aproximadamente 200, e geralmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Uma hospedeira que contém um plasmídeo de alto número de cópias conterá de preferência pelo menos aproximadamente 10 e sendo mais preferível aproximadamente 20 plasmídeos. Tanto um vetor de número alto de cópias como de um número baixo de cópias pode ser selecionado, dependendo do efeito do vetor e da proteína estranha sobre a hospedeira.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas ao genoma bacteriano com um vetor de intede 01/11/2017, pág. 54/109

50/100 gração. Os vetores de integração geralmente contêm pelo menos uma seqüência homóloga ao cromossoma bacteriano, o que permite ao vetor de se integrar. As integrações parecem resultar de recombinações entre DNA homólogo no vetor e o cromossoma bacteriano. Os vetores de integração construídos com DNA proveniente de diversas cepas de Bacillus, por exemplo se integram ao cromossoma de Bacillus (EP-A- 0 127 328). Os vetores de integração podem também ser constituídos por seqüências de bacteriófagos ou de transpóson.

Geralmente as construções extra-cromossômicas e de expressão de integração podem conter marcadores selecionáveis para permitir que se produza a seleção de cepas bacterianas que foram transformadas. Os marcadores selecionáveis podem ser expressos na hospedeira bacteriana e podem incluir genes que tornam as bactérias resistentes a medicamentos tais como ampicilina, cloramfenicol, eritromicina, canamicina (neomicina) e tetraciclina [Davies e cols. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469). Marcadores selecionáveis podem também incluir genes biossintéticos, tais como aqueles nos trajetos biossintéticos de histidina, triptofano e leucina.

Alternativamente, alguns dos componentes descritos acima podem ser agrupados em vetores de transformação. Os vetores de transformação geralmente são constituídos por um marcador selecionável que ou é mantido em um réplicon ou é desenvolvido em um vetor de integração, conforme foi descrito acima.

Os vetores de expressão e de transformação, quer sejam réplicons extra-cromossômicos quer vetores de integração, foram desenvolvidos para transformação em muitas bactérias.

Os vetores de expressão foram desenvolvidos, dentre outros, de 01/11/2017, pág. 55/109

51/100 para as seguintes bactérias: Bacillus subtilis [Palva e cols. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0 036

259 e EP-A-0 063 953; WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake e cols. (1981) Nature 291:128; Amann e cols. (1985)

Gene 40:183; Studier e cols. (1986) J. Mol. Biol. 189:113;

EP-A-0 036 776, EP-A-0 136 829 e EP-A-0 136 907], Streptococcus cremoris [Powell e cols. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell e cols.

(1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces li10 vidans (patente U.S. No. 4.745.056]

Os processos de introdução de DNA exógeno em hospedeiras bacterianas são bem conhecidos na técnica, e geralmente incluem ou a transformação da bactérias tratadas com CaCl2 ou outros agentes, tais como cátions divalentes e DMSO. O

DNA pode também ser introduzido nas células bacterianas por eletroporação. Os procedimentos de transformação geralmente variam com a espécie bacteriana a ser transformada. Veja, por exemplo, [Masson e cols. (1989) FEMS Microbiol. Lett.

60:273; Palva e cols. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

79:582; EP-A-0 036 259 e EP-A-0 063 953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller e cols. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci.

85:856; Wang e cols. (1990) J. Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen e cols. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci.

69:2110; Dower e cols. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127;

Kushner (1978) An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids em Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel e cols. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Bio30 chem. Biophys. Act 949:318; Escherichia], {Chassy e cols.

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 56/109

52/100 (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler e cols. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin e cols. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus]. [Barany e cols. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, em: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti e R. Curtiss III); Perry e cols. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell e cols. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti e cols. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechology I:412, Streptococcus].

v. Expressão de Leveduras

Os sistemas de expressão de leveduras são também conhecidos dos peritos na técnica. Um promotor de levedura é qualquer seqüência de DNA capaz de se ligar a RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma seqüência de codificação (de gene estrutural, por exemplo) no mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação de transcrição que é geralmente localizada proximal à extremidade 5' da seqüência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição geralmente inclui um sítio de ligação de RNA polimerase (a Caixa TATA) e um sítio de iniciação de transcrição. Um promotor de levedura pode também ter um segundo domínio denominado uma seqüência de ativador a montante (UAS) que, se estiver presente, se encontra geralmente distal ao gene estrutural. A UAS permite uma expressão regulada (induzível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada pode ser ou positiva ou negativa, portanto intensificando ou reduzindo a transcrição.

A levedura é um organismo de fermentação com um trajede 01/11/2017, pág. 57/109

53/100 to metabólico ativo, conseqüentemente as seqüências que codificam as enzimas no trajeto metabólico proporcionam seqüências de promotor especialmente úteis. Os exemplos incluem álcool desidrogenase (ADH) (EP-A-0284 044), enolase, glicoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofructoquinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvato quinase (PyK) (EPO-A-0 329 203). O gene de PHO5 de levedura que codifica a ácido fosfatase, também proporciona seqüências de promotor úteis [Myanohara e cols. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1].

Além disso, promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores de levedura. As seqüências UAS de um promotor de levedura, por exemplo, po15 dem ser ligadas com a região de ativação de transcrição de um outro promotor de levedura, criando um promotor híbrido sintético. Exemplos de tais promotores híbridos incluem a seqüência reguladora de ADH ligada à região de ativação de transcrição de GAP (patentes U.S. 4.876.197 e 4.880.734).

Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que consistem em seqüências reguladoras ou de genes de ADH2, GAL4, GAL10 ou PHO5, combinados com a região de ativação transcricional de um gene de enzima glicolítica tal como GAP ou PyK (EP-A-0164 556). Além disso, o promotor de levedura pode incluir promotores que ocorrem na natureza de origem não levedura que têm a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição. Exemplos de tais promotores incluem, entre outros, [Cohen e cols. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77-1078; Henikoff e cols.

(1981) Nature 283:835; Hollenberg e cols. (1981) Curr. ToPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 58/109

54/100 pics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg e cols. (1979) The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance GEnes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae em: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K. N. Timmis e A. Puhler); Mercerau-Puigalon e cols. (1980) Gene 11:163; Panthier e cols. (1980) Curr. Genet. 2:10].

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente em levedura. Uma seqüência de promotor pode ser diretamente ligada com a molécula de DNA sendo neste caso o primeiro aminoácido no terminal N da proteína recombinante sempre uma metionina, que é codificada pelo códon de início ATG. Se for desejado, a metionina no terminal N pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogênio.

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa para os sistemas de expressão de levedura, assim como para os sistemas de expressão de mamíferos, baculovírus e bacteriana. Geralmente, uma seqüência de DNA que codifica a porção de terminal N de uma proteína de levedura endógena ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' das seqüências de codificação heterólogas. Depois da expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas seqüências de aminoácidos. O gene de superóxido dismutase (SOD) de levedura ou humana, pode ser ligada ao terminal 5' de um gene estranho e ser expressa na levedura. A seqüência de DNA na junção das duas seqüências de aminoácidos pode codificar ou não um sítio clivável. Veja EP-A-0 196 056, por exemplo. Um outro exemplo é a proteína de fusão de ubiquitina. Tal proteína de fusão é preparada com a região de ubiquitina que conserva, de preferência, um sítio para a enzima de procesde 01/11/2017, pág. 59/109

55/100 samento (protease de processamento específica a ubiquitina, por exemplo) para clivar a ubiquitina da proteína estranha. Através deste processo, portanto, a proteína estranha nativa pode ser isolada (WO88/024066, por exemplo).

Alternativamente, as proteínas estranhas podem também ser secretadas da célula no meio de cultura por criação de moléculas de DNA quiméricas que codificam uma proteína de fusão constituída por um fragmento de seqüência de líder que proporciona a secreção em levedura da proteína estranha. É preferível que haja sítios de processamento codificados entre o fragmento de líder e o gene estranho que possam ser clivados quer in vivo quer in vitro. O fragmento de seqüência de líder geralmente codifica um peptídeo de sinal constituído por aminoácidos hidrófobos que dirigem a secreção da proteína da célula.

O DNA que codifica seqüências de sinal adequadas pode ser derivado de genes para as proteínas de levedura secretadas, tais como o gene de invertase de levedura (EP-A-0 012 873; JPO. 62.096.086) e o gene de fator A (patente U.S. 4.588.684). Alternativamente, existem também líderes de origem que não de levedura, tais como um líder de interferona, que proporcionam a secreção em levedura (EP-A-0 060 057).

Uma classe preferida de líderes de secreção são aqueles que empregam um fragmento do gene do fator α de levedura, que contém tanto uma seqüência de sinal pre como uma região pro. Os tipos de fragmentos de fator α que podem ser empregados incluem o líder de fator α pre-pro de comprimento integral (tendo aproximadamente 83 resíduos de aminoácidos) assim como líderes truncados de fator α (gede 01/11/2017, pág. 60/109

56/100 ralmente tendo de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 resíduos de aminoácidos) (Patentes U.S. 4.546.083 e 4.870.008; EP-A-0 324 274). Líderes adicionais que empregam um fragmento de líder de fator α que proporciona a secreção incluem líderes híbridos de fator α produzidos com uma préseqüência de uma primeira levedura, mas uma pro-região proveniente de um segundo fator α de levedura (veja WO 89/o2463, por exemplo).

Geralmente, as seqüências de terminação de transcrição reconhecidas pela levedura são regiões reguladoras localizadas a 3' do códon de interrupção de tradução, e assim juntamente com o promotor flanqueiam a seqüência de codificação. Estas seqüências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipeptídeo codificado pela DNA. Exemplos de seqüência de terminador de transcrição e outras seqüências de terminação reconhecidas por levedura, tais como aquelas que codificam para enzimas glicolíticas.

Geralmente os componentes descritos acima, compreendendo um promotor, líder (se for desejado), seqüência de codificação que interessa, e seqüência de terminação de transcrição, são colocados juntos em construções de expressão. As construções de expressão são freqüentemente mantidas em um replicon, tal como um elemento extra-cromossômico (plasmídeos, por exemplo) capaz de se manter estável em uma hospedeira, tal como levedura ou bactérias. O replicon pode ter dois sistemas de replicação, permitindo ele seja mantido, por exemplo em levedura para expressão e em uma hospedeira procariótica para clonagem e amplificação. Exemplos de tais vetores recíprocos de levedura-bactérias, incluem YEp24 [Botstein e cols. (1979) Gene 8:17-24], pCl/1 [Brake de 01/11/2017, pág. 61/109

57/100 e cols. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:4642-4646], e YRp17 [Stinchcomb e cols. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Além disso, um réplicon pode ser ou um plasmídeo de alto número de cópias ou um de baixo número de cópias. Um plasmídeo de alto número de cópias geralmente terá um número de cópias que varia de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, e geralmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Uma hospedeira contendo um plasmídeo de alto número de cópias terá, de preferência, pelo menos aproximadamente 10, e sendo mais preferível de pelo menos aproximadamente 20. Tanto um vetor de número alto como de baixo de cópias pode ser selecionado, dependendo do efeito do vetor e da proteína estranha sobre a hospedeira. Veja Brake e cols., acima, por exemplo.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas ao genoma de levedura com um vetor de integração. Os vetores de integração geralmente contêm pelo menos uma seqüência homóloga a um cromossoma de levedura que permite que o vetor se integre e contêm de preferência, duas seqüências homólogas flanqueando a construção de expressão. As integrações parecem resultar de recombinações entre DNA homólogos no vetor e no cromossoma de levedura [OrrWeaver e cols. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Um vetor de integração pode ser dirigido a um lócus específico na levedura, selecionando-se a seqüência homóloga adequada para inclusão no vetor. Veja Orr-Weaver e cols., acima. Uma ou mais construções de expressão podem integrar, afetando possivelmente os níveis de proteína recombinante produzida [Rine e cols. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. As seqüências cromossômicas incluídas no vetor podem ocorde 01/11/2017, pág. 62/109

58/100 rer em forma de um segmento único no vetor, o que resulta na integração do vetor inteiro, ou em forma de dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanqueando a construção de expressão no vetor, o que pode resultar na integração estável da construção de expressão somente.

Geralmente as construções de expressão extracromossômicas e de integração podem conter marcadores selecionáveis para permitir a seleção das cepas de levedura que foram transformadas. Os marcadores selecionáveis podem incluir genes biossintéticos que podem ser expressos na hospedeira da levedura, tais como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 e ALG7, e o gene de resistência a g418, que confere resistência em células de levedura a tunicamicina e a G418, respectivamente. Além disso, um marcador selecionável adequado também pode dotar a levedura com a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, tais como metal. A presença de CUP1, por exemplo, permite que a levedura cresça na presença de íons de cobre [Butt e cols. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Alternativamente, alguns dos componentes descritos acima podem ser colocados juntos nos vetores de transformação. Os vetores de transformação geralmente são constituídos por um marcador selecionável que ou é mantido em um réplicon ou é desenvolvido em um vetor de integração, conforme descrito acima.

Os vetores de expressão e de transformação, quer réplicons extra-cromossômicos quer vetores de integração, foram desenvolvidos para a transformação em muitas leveduras.

Os vetores de expressão, por exemplo, foram desenvolvidos de 01/11/2017, pág. 63/109

59/100 para, dentre outros, as seguintes leveduras: Candida albicans [Kurtz e cols. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, e cols. (1985) J. Basic. Microbiol.

25:1411]. Hansenula polymorpha [Gleeson e cols. (1986) J.

Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp e cols. (1986) Mol.

Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das e cols.

(1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De

Louvencourt e cols. (1983/ J. Bacteriol. 154:737; Van den

Berg e cols. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze e cols. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141],

Pichia pastoris [Cregg e cols. (1985) Mol. cell. Biol.

5:3376; patentes U.S. 4.837.148 e 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen e cols. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 75:1929; Ito e cols. (1983) J. Bacteriol. 153-1630, Schizosaccharomyces pombe [Beach e Nurse (1981) Nature 300:706], e Yarrowia lipolytica [Davidow e cols. (1985)

Curr. Genet. 10:38047; Gaillardin e cols. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Processos de introdução de DNA exógeno em hospedeiras de levedura são bem conhecidos na técnica e geralmente incluem ou a transformação de esferoplastos ou de células de levedura intactas tratadas com cátions alcalinos. Os procedimentos de transformação geralmente variam dependendo da espécie de levedura a ser transformada. Veja, por exemplo [Kurtz e cols. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze e cols. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson e cols. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp e cols. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das e cols. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt e cols. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg e cols.

de 01/11/2017, pág. 64/109

60/100 (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg e cols. (1985) Mol Cell. Biol. 5:3376; Kunze e cols. (1985) J.

Basic Microbiol. 25:141; Patentes U.S. 4.837.148 e 4.929.555; Pichia]; [Hinnen e cols. (1978) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito e cols. (1983) J. Bacteriol.

153:163, Saccharomyces]; [Beach e Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow e cols. (1985)

Curr. GEnet. 10:39; Gaillardin e cols. (1985) Curr. Genet.

10:49; Yarrowia].

Anticorpos

Conforme empregado no presente, o termo anticorpo se refere A1 polipeptídeo ou a um grupo de polipeptídeos composto de pelo menos um sítio de combinação de anticorpo. Um sítio de combinação de anticorpo é o espaço tridimensio15 nal de ligação com um formato superficial interno e distribuição de carga complementar às características de um epitopo de um antígeno, o que permite uma ligação do anticorpo com o antígeno. Anticorpo inclui, por exemplo anticorpos de vertebrados, anticorpos híbridos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos alterados, anticorpos univalentes, proteínas Fab, e anticorpos de domínio único.

Os anticorpos contra as proteínas da presente invenção são úteis para cromatografia por afinidade, imuno-ensaios, e para distinguir/identificar proteínas neisseriais.

Os anticorpos às proteínas da invenção, tanto policlonais como os monoclonais, podem ser preparados por processos convencionais. A proteína é em geral usada primeiro para imunizar um animal adequado, de preferência, um camundongo, rato, coelho ou cabra. Os coelhos e cabras são os preferidos para a preparação de soros policlonais devido ao

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 65/109

61/100 volume de soro que pode ser obtido, e a disponibilidade de anticorpos anti-coelhos e anti-caprinos rotulados. A imunização é geralmente conduzida por mistura ou emulsificação da proteína em solução salina, de preferência em um adju5 vante tal como o adjuvante completo de Freund e por injeção da mistura ou emulsão por via parenteral (geralmente por via subcutânea ou intramuscular). Uma dose de 50-200 qg/injeção é tipicamente suficiente. A imunização é geralmente intensificada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injeções da proteína em solução salina, de preferência, usando-se o adjuvante incompleto de Freund. Pode-se alternativamente gerar anticorpos por imunização in vitro empregando-se processos conhecidos na técnica, que para os fins da presente invenção é considerada equivalente à imunização in vivo. Os anti-soros policlonais são obtidos por sangria do animal imunizado em um recipiente de vidro ou plástico, incubando-se o sangue a 25°C durante uma hora, seguindo-se de incubação a 4°C durante 2-18 horas. O soro é recuperado por centrifugação (1.000 g durante 10 minutos, por exem20 plo). Aproximadamente 20-50 ml por sangria podem ser obtidos de coelhos.

Os anticorpos monoclonais são preparados empregando-se o processo padrão de Kohler & Milstein [Nature (1975) 256:495-96], ou uma modificação dele. Tipicamente, um ca25 mundongo ou rato é imunizado do modo descrito acima. No entanto, em vez de se sangrar o animal para extrair o soro, remove-se o baço (e opcionalmente diversos nódulos linfáticos grandes) e dissociam-se em células individuais. Se for desejado, as células do baço podem ser triadas (depois da remoção de células aderentes não especificamente) por apliPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 66/109

62/100 cação de uma suspensão celular a uma placa ou cavidade revestia com o antígeno protéico. As células B que expressam a imunoglobulina ligada por membrana específica ao antígeno se ligam à placa e não são lavados fora com o resto da suspensão. As células B resultantes, ou todas as células esplênicas dissociadas, são então induzidas a se fundir com células de mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas em um meio seletivo (meio de hipoxantina, aminopterina, timidina, por exemplo, HAT). Os hibridomas resultantes são dispostos em placas por diluição limitante, e são testados para a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno imunizante (e que não se liga a antígenos não relacionados). Os hibridomas selecionados que secretam MAb são então cultivados ou in vitro (em garrafas de cultura tecidual ou em reatores ocos de fira) ou in vivo (em forma de ascites em camundongos).

Se for desejado, os anticorpos (tanto policlonais como monoclonais) podem ser rotulados empregando-se técnicas convencionais. Rótulos convenientes incluem fluoróforos, cromóforos, átomos radioativos (especialmente ³²P e ¹²⁵I), reagentes densos de elétrons, enzimas, e ligantes que têm parceiros de ligação específicos. As enzimas são tipicamente detectadas pela sua atividade. A peroxidase de raiz forte, por exemplo, é geralmente detectada pela sua capacidade de converter 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) em um pigmento azul, quantificável com um espectrofotômetro. Parceiro de ligação específico se refere a uma proteína capaz de se ligar a uma molécula de ligante com um alto grau de especificidade, tal como por exemplo no caso de um antígeno e de um anticorpo monoclonal específico a ele. Oude 01/11/2017, pág. 67/109

63/100 tros parceiros de ligação específicos incluem biotina e avidina ou estreptavidina, IgG e proteína A, e os pares numerosos de receptor-ligante conhecidos na técnica. Deve ficar subentendido que a descrição acima não visa categorizar os diversos rótulos em classes distintas, uma vez que o mesmo rótulo pode servir em modos diferentes diversos. O ¹²⁵I, por exemplo, pode servir como um rótulo radioativo ou como um reagente denso de elétrons. O HRP pode servir como uma enzima ou como antígeno para um MAb. Além disso, podese combinar diversos rótulos para o efeito desejado. O MAbs e avidina, por exemplo, também exigem rótulos na colocação em prática da presente invenção; portanto pode-se rotular um MAb com biotina e detectar a sua presença com avidina rotulada com ¹²⁵I, ou com um MAb anti-biotina rotulado com HRP. Outras permutações e possibilidades se tornarão facilmente evidentes aos peritos na técnica, e são consideradas como sendo equivalente dentro do âmbito da presente invenção.

Composições Farmacêuticas

As composições farmacêuticas podem ser constituídas quer por polipeptídeos, anticorpos, ou por ácidos nucléicos da invenção. As composições farmacêuticas compreenderão uma quantidade efetiva do ponto de vista terapêutico ou dos polipeptídeos, anticorpos, ou dos polinucleotídeos da invenção reivindicada.

O termo quantidade efetiva do ponto de vista terapêutico, conforme empregado no presente, se refere a uma quantidade de um agente terapêutico para tratar, melhorar ou prevenir uma doença o condição desejada, ou para apresentar um efeito detectável terapêutico ou preventivo. O de 01/11/2017, pág. 68/109

64/100 efeito pode ser detectado por marcadores químicos, por exemplo, ou por níveis de antígenos. Os efeitos terapêuticos também incluem a redução dos sintomas físicos, tais como redução da temperatura corporal. A quantidade efetiva precisa para um indivíduo dependerá das dimensões e saúde do paciente, da natureza e extensão da sua condição e dos produtos terapêuticos ou combinação de produtos terapêuticos selecionados para a administração. Portanto, não é útil se especificar previamente uma quantidade efetiva exata. No entanto, a quantidade efetiva para uma situação dada pode ser determinada por experimentação de rotina e se encontra dentro do critério do clínico.

Para os fins da presente invenção, uma dose efetiva variará de aproximadamente 0,01 mg/kg até 50 mg/kg ou de 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg das construções de DNA no indivíduo ao qual ela é administrada

Uma composição farmacêutica pode também conter um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. O termo veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico se refere a um veículo para a administração de um agente terapêutico, tal como anticorpos ou um polipeptídeo, genes ou outros agentes terapêuticos. O termo se refere a qualquer veículo farmacêutico que não induz em si a produção de anticorpos nocivos ao indivíduo que recebe a composição, e que pode ser administrado sem uma toxicidade indesejável. Os veículos adequados podem ser macromoléculas grandes lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, e partículas de vírus inativo. Tais veículos são conhecidos dos peritos na técnica.

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Os sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico podem ser usados neles, por exemplo, sais ácidos minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos e semelhante; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos e semelhantes. uma discussão exaustiva de excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico é disponível no Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

Os veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico em composições terapêuticas podem conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Além disso, substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substância tampão de pH, e semelhantes, podem se encontrar presentes em tais veículos. Tipicamente, as composições terapêuticas são preparadas em forma de injetáveis, quer em soluções ou suspensões líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção podem também ser preparadas. Lipossomas são incluídos na definição de um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico.

Processos de Fornecimento

Uma vez preparadas, as composições da invenção podem ser administradas diretamente ao paciente. Os pacientes a serem tratados podem ser animais; especialmente podem ser tratados pacientes humanos.

O fornecimento direto das composições geralmente será efetuado por injeção, quer por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular ou fornecido ao espaço intersticial de um tecido. As composições podem também ser administrada para dentro de uma lesão. Outros modos de adde 01/11/2017, pág. 70/109

66/100 ministração incluem administração oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas ou transcutâneas (veja WO98/20734), agulhas e pistolas de genes ou hipo-sprays. O tratamento de dosagem pode ser em um regime de dose única ou um regime de doses múltiplas.

Vacinas

As vacinas compreendem o(s) antígeno(s), imunógeno(s), polipeptídeo (s), proteína(s) ou ácido nucléico imunizante(s), geralmente em combinação com veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico que incluem qualquer veículo que não induzam em si a produção de anticorpo nocivos ao indivíduo que recebe a composição. Veículos adequados são tipicamente macromoléculas lentamente metabolizadas grandes tais como proteínas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lipídios (tais com gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas de vírus inativo. Tais veículos são bem conhecidos dos peritos na técnica. Além disso estes veículos podem funcionar como agentes imunoestimulantes (adjuvantes). Além disso, o antígeno ou imunógeno pode ser conjugado a um toxóide bacteriano, tal como um toxóide de patógenos de difteria, tétano, cólera, H. pylori etc.

Os adjuvantes preferidos para intensificar a efetividade da composição incluem, sem limitação: (1) sais de alumínio (alume) tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio etc.; (2) preparados em emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como muramil peptídeos (veja abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), tais de 01/11/2017, pág. 71/109

67/100 como por exemplo (a) MF59^TM (WO 90/14837; Capítulo 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995), contendo 5% de Squalene, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo diversas quantidades de MTP-PE (veja abaixo), embora não necessário) preparados em partículas submicrônicas empregando-se um microfluidificante tal como o microfluidificante modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% de Squalane, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado por plurônico, e thr-MDP (veja abaixo, ou microfluidificadso em uma emulsão submicrõnica ou submetido a ciclone para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior e (c) sistema de adjuvante de Ribi^TM (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de Squalene, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo que consiste de mono fosforilipídio A (MPL), trehalose dimicolato (TDM) e esqueleto de paredes celulares (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox^TM); (3) adjuvantes de saponina, tais como Stimulon TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) podem ser usados ou partículas podem ser geradas deles, tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes); (4) Adjuvante Completo de Freund (CFA) e Adjuvante Incompleto de Freund (IFA); (5) citoquinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL12, por exemplo etc.), interferonas (γ interferona, por exemplo), fator estimulador de formação de colônias de macrófagos (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF) etc.; e (6) outras substâncias que agem como agentes imunoestimulantes para intensificar a efetividade da composição. São preferidos alume e MF59^TM.

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Conforme foi mencionado acima, os muramil peptídeos incluem, sem limitação, N-acetil-muramil-L-treonil-Disoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-Disoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-Disoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3hidróxi fosforilóxi)-etilamina (MTP-PE) etc.

As composições imunogênicas (o antígeno/imunógeno/polipeptídeo/proteína/ácido nucléico imunizante, veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico e adjuvante, por exemplo) conterão tipicamente diluentes, tais como água, solução salina, glicerol, etanol etc. Além disso podem se encontrar presentes em tais veículos substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH e análogas.

Tipicamente, as composições imunogênicas são preparadas em forma de injetáveis, quer em forma de soluções ou suspensão líquidas; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas para um efeito adjuvante intensificado, conforme discutido acima no tocante aos veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

As composições imunogênicas usadas como vacina compreendem uma quantidade efetiva do ponto de vista imunológico dos polipeptídeos antigênicos ou imunogênicos, assim como qualquer outro dos componentes mencionados acima, conforme a necessidade. Quantidade efetiva do ponto de vista imunológico, significa que a administração daquela quantidade a um indivíduo, quer em uma dose única ou como parte de uma série, é efetiva para o tratamento ou prevenção. Esta quande 01/11/2017, pág. 73/109

69/100 tidade varia, dependendo do estado de saúde ou da condição física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico a que pertence o indivíduo a ser tratado (primata não-humano, primata etc., por exemplo), da capacidade do sistema imuno5 lógico do indivíduo de sintetizar anticorpos, do grau de proteção desejado, da composição da vacina e da avaliação pelo clínico responsável da situação médica, e de outros fatores relevantes. É de se esperar que a quantidade incidirá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determi10 nada por testes de rotina.

As composições imunogênicas são convencionalmente administradas por via parenteral, por injeção, por exemplo, quer por via subcutânea, intramuscular ou transdérmica/transcutânea (WO 98/20734, por exemplo). Preparados adi15 cionais adequados para outros modos de administração incluem preparados orais e pulmonares, supositórios e aplicações transdérmicas. O tratamento de dosagem pode ser em regime de dose única ou em regime de doses múltiplas. A vacina pode ser administrada em conjunto com outros agentes imuno20 reguladores.

Como uma alternativa a vacinas à base de proteínas, pode ser empregada a vacinação de DNA [Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly e cols. (1997) Annu. Rev.. Immunol. 15;:617-648; veja mais abaixo no presente documento].

Veículos de Fornecimento Gênico

Os veículos de terapia gênica para fornecimento de construções que incluem uma seqüência de codificação de uma substância terapêutica da invenção, a serem fornecidos ao mamífero para expressão no mamífero, podem ser administraPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 74/109

70/100 dos quer localmente quer sistemicamente. Estas construções podem utilizar abordagens de vetor viral ou não viral em montagem in vivo ou ex vivo. A expressão de tal seqüência de codificação pode ser induzida usando-se promotores endó5 genos de mamíferos ou heterólogos. A expressão da seqüência de codificação in vivo pode ser quer constitutiva quer regulada.

A invenção inclui veículos de fornecimento genético capazes de expressar as seqüências do ácido nucléico visa10 do. O veículo de fornecimento genético é de preferência um vetor viral, sendo mais preferível que seja retroviral, adenoviral, viral associado com adeno (AAV) herpes viral, ou de alfavírus. O vetor viral pode também ser um vetor viral de astrovírus, coronavírus, ortomixovírus, papovavírus, paramixovírus, parvovírus, picornavírus, poxvírus, ou togavírus. Veja para as generalidades Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Kimura (1994) Human gene Therapy 5:845852; Connelly (1995) Human gene Therapy 6:185-193; e Kaplitt (1994) Nature Genetics 6:148-153.

Os vetores retrovirais são bem conhecidos na técnica e contemplamos que qualquer vetor retroviral de terapia gênica pode ser empregado na invenção, incluindo retrovírus do tipo B, C e D, retrovírus xenotrópicos (NZB-X1, NZB-X2 e NZB9-1, por exemplo (veja O'Neill (1985) J. Virol. 53:160) retrovírus politrópicos MCF e MCF-MLV, por exemplo (veja Kelly (1983) J. Virol. 45:291), espumavírus e lentivírus. Veja RNA Tumor Víruses, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985.

Porções do vetor retroviral de terapia gênica pode ser derivado de diferentes retrovírus. O retrovetor LTRs, por

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71/100 exemplo, pode ser derivado de um Vírus de Sarcoma Murina, um sítio de ligação de tRNA de um Vírus de Sarcoma de Rous, um sinal de acondicionamento de um Vírus de Leucemia Murina, e uma origem de síntese de segundo filamento de um Vírus de Leucose Aviária.

Estes vetores retrovirais recombinantes podem ser usados para gerar partículas de vetor retroviral competentes para a transdução, por introdução delas nas linhagens celulares de acondicionamento adequado (veja patente U.S. 5.591.624). Os vetores de retrovírus podem ser construídos para integração específica a sítio no DNA celular da hospedeira por incorporação de uma enzima quimérica integrase na partícula retroviral (veja WO 96/37626). É preferível que o vetor viral recombinante seja um vírus recombinante deficiente em replicação.

As linhagens celulares de acondicionamento adequadas para serem usadas com os vetores de retrovírus descrito acima são bem conhecidas na técnica, são de fácil preparação (veja WO 95/30763 e WO 92/05266) e podem ser usadas para criar linhagens celulares produtoras (também denominadas linhagens celulares de vetor ou VCLs) para a produção de partículas de vetor recombinante. É preferível que as linhagem celular de condicionamento sejam preparadas de células genitoras humanas (células HT1080, por exemplo) ou linhagens celulares genitoras de arminho que elimina a inativação em soro humano.

Os retrovírus preferidos para a construção dos vetores retrovirais de terapia gênica incluem Vírus de Leucose Aviária, Vírus de Leucemia Bovina, Vírus de Leucemia Murina,

Vírus indutor de foco em células de Arminho, Vírus de Sarde 01/11/2017, pág. 76/109

72/100 coma Murino, Vírus de Reticulo-endoteliose e Vírus de Sarcoma de Rous. Os vírus de leucemia Murina, especialmente preferidos incluem 4070A e 1504A (Hartley e Rowe (1976) J. virology 19;19-25), Abelson (ATCC No. VR-590), Friend (ATCC

No. VR-245), Graffi, Gross (ATCC No. VR-999), Kirsten, Vírus de Sarcoma de Harvey e Rauscher (ATCC No. VR-998), e Vírus da leucemia Murina de Moloney (ATCC No. VR-190). Tasi retrovírus podem ser obtidos de depósitos ou coleções tais como a American Type Culture Collection (ATCC) em

Rockville, Maryland ou isolados de fontes conhecidas empregando-se técnicas disponíveis habitualmente.

Os vetores retrovirais de terapia gênica exemplares conhecidos empregáveis na presente invenção incluem aqueles descritos nos pedidos de patente GB2200651, EP0415731,

EP0345242, EP0334301, WO89/O2468; WO89/O5349; WO89/O9271;

WO90/O2806; WO90/O7936; WO94/O3622; WO93/25698; WO93/25234; WO93/11230; WO93/10218; WO91/02805; WO91/O2825; WO95/O7994; US 5.219.740, US 4.405.712, US 4.861.719, US 4.980.289, US 4.777.127, US 5.591.624. Veja também Vile (1993) Cancer

Res. 53:3860-3864; Vile (1993) Câncer Res. 53:962-967; Ram (1993) Cancer Res. 53 (1993) 83-88; Takamiya (1992) J. Neurosci. Res. 33:493-503; Baba (1993) J. Neurosurg 79:729735; Mann (1983) Cell 33:153; Cane (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6349; e Miller (1990) Human Gene Therapy 1.

Os vetores adenovirais humanos para a terapia gênica são também conhecidos na técnica e podem ser empregados na presente invenção. Veja, por exemplo Berkner (1988) Biotechniques 6:616 e Rosenfeld (1991) Science 252:431; e WO93/07283, WO93/06223 e WO93/07282. Vetores adenovirais exemplares conhecidos para a terapia gênica que podem ser

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73/100 empregados nesta invenção incluem os descritos nos documentos referenciados acima e em WO94/12649, WO93/03769,

WO93/19191, WO94/28938, WO95/11984, WO95/00655, WO95/27071,

WO95/29993, WO95/34671, WO96/05320, WO94/08026, WO94/11506,

WO93/06223, WO94/24299, WO95/14102, WO95/24297, WO95/02697,

WO94/28152, WO94/24299, WO95/09241, WO95/25807, WO95/05835,

WO94/18922 e WO95/09654. Alternativamente, a administração de DNA ligado a adenovírus morto conforme descrito em Curiel (1992) Hum. Gene Ther. 3:147-154 pode ser empregada. Os veículos de fornecimento de genes da invenção também incluem vetores de vírus associados com adenovírus (AAV). Exemplos principais e preferidos de tais vetores para emprego na presente invenção são os vetores à base de AAV-2 descritos em Srivastava, WO93/09239. Os vetores AAV mais preferi15 dos compreendem as duas repetições terminais invertidas de AAV em que as seqüências D nativas são modificadas por substituição de nucleotídeos, de modo que pelo menos 5 nucleotídeos nativos e até 18 nucleotídeos nativos, de preferência pelo menos 10 nucleotídeos nativos e até 18 nucleo20 tídeos nativos, sendo o mais preferível que 10 nucleotídeos nativos sejam conservados e os nucleotídeos restantes da seqüência D sejam deletados ou substituídos por nucleotídeos não nativos. As seqüências D nativas das repetições de terminal invertidas de AAV são seqüências de 20 nucleotí25 deos consecutivos em cada repetição terminal invertida de AAV (isto é, há uma seqüência em cada extremidade) que não estão implicadas na formação de HP. O nucleotídeo de substituição não nativo pode ser qualquer nucleotídeos diferente do nucleotídeo encontrado na seqüência D nativa na mesma posição. Outros vetores AAV exemplares que podem ser emprePetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 78/109

74/100 gados são pWP-19, pWN-1, ambos descritos em Nahreini (1993) Gene 124:257-262. Um outro exemplo de tal vetor AAV é psub201 (veja Samulski (1987) J. Virol. 61:3096). Um outro vetor AAV exemplar é o vetor ITR Duplo D. A construção do vetor ITR Duplo D é descrita na patente U.S. 5.478.745. Outros vetores ainda são os descritos na patente U.S. 4.797.368 concedida a Carter e na patente U.S. 5.139.941 concedida a Muzyczka, na patente U.S. 5.474.935 concedida a Chartejee e WO 94/288157 concedida a Kotin. um outro exem10 plo ainda de um vetor AAV que pode ser empregado nesta invenção é o SSV9AFABTKneo, que contém o intensificador AFP e o promotor de albumina e dirige a expressão predominantemente no fígado. Sua estrutura e construção são descritas em Su (1996) Human Gene Therapy 7:463-470. Vetores adicio15 nais AAV para a terapia gênica são descritos em patente U.S. 5.354.678, 5.173.414, 5.139.941 e 5.252.479.

Os vetores para a terapia gênica da invenção também incluem vetores de herpes. Os exemplos principais e preferidos são vetores do vírus de herpes simplex contendo uma seqüência que codifica um polipeptídeo de timidina quinase tal como os descritos na patente U.S. 5.288.641 e em EP0176170 (Roizman). Vetores adicionais exemplares de vírus de herpes simplex incluem HFEM/ICP6-LacZ descrito em WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac descrito em Geller (1988) Science 241:1667-1669 e em WO 92/07945, HSV

Us3::pgC-lacZ descrito em Fink (1992) Human Gene Therapy 3:11-19 e HSV 7134, 2 RH 105 e GAL4 descrito em EP 0453242 (Breakefield) e os depositados com o ATCC como números de acesso ATCC VR-977 e ATCC VR-260.

Também contemplados são vetores do vírus alfa para a

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75/100 terapia gênica que podem ser empregados na presente invenção. Os vetores de alfa vírus preferidos são os vetores de vírus Sindbis. Togavírus, o vírus de Floresta de Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus de Middleberg (ATCC VR370), o vírus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246), o vírus da encefalite eqüina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249, ATCC VR-532) e os descritos nas patentes U.S. 5.091.309, 5.217.879 e na WO 92/10578. Mais especificamente, os vetores de alfa vírus descritos no pedido de patente U.S. 08/405.627, depositado em 15 de março de 1995, WO 94/21792, WO 92/10578, WO 95/07994, patente U.S. 5.091.309 e 5.217.879, podem ser empregados. Tais vírus alfa podem ser obtidos de depósitos ou de coleções tais como a ATCC em Rockville, Maryland ou isolados de fontes conhecidas, empregando técnicas disponíveis habitualmente. É preferível que sejam usados os vetores de alfa vírus com citotoxicidade reduzida (veja USSN 08/679640).

Os sistemas de vetor de DNA tais como os sistemas de expressão eucariótica em camadas são também úteis para a expressão de ácidos nucléicos da invenção. Veja WO 95/07994 para uma descrição detalhada de sistemas eucarióticos de expressão em camadas. É preferível que os sistemas eucarióticos de expressão em camadas da invenção sejam derivados de vetores de alfa vírus, sendo o mais preferível que sejam de vetores virais Sindbis.

Outros vetores virais adequados para emprego na presente invenção incluem os derivados do vírus da poliomielite, ATCCVR-58, por exemplo, e os descritos em Evans, Nature

339 (1989) 385 e Sabin (1973) J. Biol. Standardization

1:115; rinovírus ATCC VR-1110, por exemplo, e os descritos de 01/11/2017, pág. 80/109

76/100 em Arnold (1990) J. Cell Biochem. L401; vírus tais como o poxvírus de canário ou vírus de vaccinia, o ATCC VR-111 e ATCC VR-201, por exemplo e os descritos em Fisher-Hoch (1989) Proc. Natl. Acad. Sci 86:317; Flexner (1989) Ann NY

Acad Sci 569:86, Flexner (1990) Vaccine 8:17; em patente U.S. 4.603.112 e 4.769.330 e em WO 89/01973; vírus SV40, ATCC VR-305, por exemplo e os descritos em Mulligan (1979) Nature 277:108 e Madzak (1992) J. Gen. Virol. 73:1533; vírus da influenza, ATCC VR-797, por exemplo e os vírus de influenza recombinantes preparados empregando-se técnicas genéticas reversas conforme descrito na patente U.S. 5.166.057 e em Enami (1990) Proc. Natl. Acad. Sci 87:38023805; Enami & Palese (1991) J. Virol. 65:2711-2713 e

Luytjes (1989) Cell 59:110, (veja também McMichael (1983)

NEJ Med 309:13, e Yap (1978) Nature 273:238 e Nature (1979) 277:108); vírus de imunodeficiência humana conforme descrito em EP-0386882 e em Buchschacher (1992) J. Virol. 66:2731; vírus do sarampo, ATCC VR-67 e VR-1247, por exemplo, e os descritos em EP-0440219; Aura vírus, ATCC VR-368, por exemplo; Bebaru vírus, ATCC VR-600 e ATCC VR-1240, por exemplo; Cabassou vírus, ATCC VR-I22, por exemplo; Chikungunya vírus, ATCC VR-64, e ATCC VR-1241, por exemplo; Vírus de Fort Morgan, ATCC VR-924, por exemplo; Getah vírus, ATCC VR-369 e ATCC VR-1243, por exemplo; Kyzylagach vírus, ATCC

VR-927, por exemplo; Mayaro vírus ATCC VR-66, por exemplo;

Mucambo Vírus, ATCC VR-58 e ATCC VR-1244, por exemplo; Ndumu vírus, ATCC VR-371, por exemplo; Pixuna vírus, ATCC VR—372 e ATCC VR-1245, por exemplo; Tonate vírus, ATCC VR925, por exemplo; Triniti vírus, ATCC VR- 469, por exemplo;

Una vírus, ATCC VR-374, por exemplo; Whataroa vírus, ATCC

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 81/109

77/100

VR-926, por exemplo; Y-62-33 vírus, ATCC VR-375, por exemplo; O'nyong vírus, vírus da encefalite Oriental, ATCC VR65 e ATCC VR-1242, por exemplo; vírus da encefalite Ocidental, ATCC VR-70, ATCC VR-1251 ATCC VR-622 e ATCC VR-1252, por exemplo; e coronavírus, ATCC VR-740, por exemplo e os descritos em Hamre (1966) Proc. Soc. Exp. Biol. Med.

121:190.

O fornecimento das composições da presente invenção a células não é limitado aos vetores virais mencionados acima. Outros processos e meios de fornecimento podem ser empregados, tais como, por exemplo, vetores de expressão de ácidos nucléicos, DNA policatiônico condensado ligado ou não a adenovírus morto somente, veja, por exemplo, o pedido de patente U.S. No. de Série 08/366.787, depositado em 30 de dezembro de 1994 e Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:147-154 DNA ligado por ligante, veja, por exemplo, Wu (1989) J. Biol. Chem. 264:16985-16987, células de veículos de fornecimento a células eucarióticas, veja pedido de patente U.S. No. Série 08/240.030, depositado em 9 de maio de 1994, e pedido de patente U.S. No. Série 08/404.796, deposição de materiais de hidrogel fotopolimerizados, pistola manual de partículas de transferência de genes, conforme descrito na patente U.S. No. 5.149.655, radiação de ionização conforme descrito na patente U.S. No. 5.206.152 e em WO92/11033, neutralização de carga nucléica ou fusão com membranas celulares. Abordagens adicionais são descritas em Philip (1994) Mol. Cell. Biol. 14:2411-2418 e em Woffendi (1994) Proc. Natl Acad. Sci 91:1581-1585.

A transferência de genes mediada por partículas pode ser empregada, veja pedido de patente U.S. 60/023.867, por de 01/11/2017, pág. 82/109

78/100 exemplo. Resumindo, a seqüência pode ser inserida em vetores convencionais que contem seqüências de controle convencionais para uma expressão de alto nível, e incubando-se em seguida com moléculas de transferência de genes sintéticas, tais como cátions poliméricos que se ligam a DNA como polilisina, protamina e albumina, ligada aos ligantes dirigidos a célula tais como asialoorosomucóide, conforme descrito em Wu & Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432, insulina conforme descrita em Hucked (1990) Biochem. Pharmacol. 40:253263, galactose conforme descrito em Plank (1992) Bioconjugate Chem. 3:533-539, lactose ou transferrina.

O DNA nu pode também ser empregado. Os processos de introdução exemplares de DNA nu são descritos em WO 90/11092 e na patente U.S. 5.580.859. A eficiência de absorção pode ser melhorada empregando-se contas de látex biodegradável. Contas de látex revestidas com DNA são eficientemente transportadas para células depois do início de endocitose pelas contas. O processo pode ser melhorado ainda mais por tratamento das contas para aumentar o caráter hidrófobo e facilitar deste modo a destruição do endossoma e a liberação do DNA no citoplasma.

Os lipossomas que podem agir como veículos de fornecimento de genes são descritos na patente U.S. 5.422.120, WO 95/13796, WO 94/23697, WO 91/14445 e EP-524.968. Conforme descrito em USSN. 60/023.867, sobre o fornecimento não viral, as seqüências de ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo podem ser inseridas em vetores convencionais que contém seqüências convencionais de controle para uma expressão de alto nível, e em seguida incubadas com moléculas de transferência de gene sintéticas, tais como os cátions de 01/11/2017, pág. 83/109

79/100 de ligação de DNA polimérico, como polilisina, protamina e albumina ligados a ligantes de direcionamento a célula tais como asialoorosomucóide, insulina, galactose, lactose ou transferrina. Outros sistemas de fornecimento incluem o uso de lipossoma para encapsular DNA compreendendo o gene sob o controle de uma variedade de promotores específicos a tecido ou ativos de modo ubiquito. Outro fornecimento não viral adequado para emprego inclui sistemas de fornecimento mecânicos tais como a abordagem descrita em Woffendin e cols.

(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24): 11581-11585.

Além disso, a seqüência de codificação e o produto de expressão de tal pode ser fornecido por deposição de materiais de hidrogel fotopolimerizados. Outros processos convencionais para o fornecimento do gene que podem ser usados par o fornecimento da seqüência de codificação incluem por exemplo, o emprego de pistola manual de partícula de transferência de gene, conforme descrito em patente U.S. 5.149.655; emprego de radiação de ionização para ativar o gene transferido, conforme descrito em patente U.S.

5.206.152 e WO 92/11033.

Os veículos de fornecimento de gene policatiônicos e lipossomas exemplares são os descritos na patente U.S. 5.422.120 e 4.762.915; em WO 95/13796; WO94/23697; e WO

91/14445; em EP-0524968; e em Stryer, Biochmistry, páginas

236-240 (1975) W. H. Freeman, São Francisco; Szoka (1980)

Biochem. Biophys. Acta 600:1; Bayer (1979) Biochem. Biophys. Acta 550:464; Rivnay (1987) Meth. Enzymol. 149:119;

Wang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci 84:7851; Plant (1989) Anal. Biochem. 176:420.

Uma composição de polinucleotídeos pode compreender

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 84/109

80/100 uma quantidade efetiva do ponto de vista terapêutico de um veículo de terapia gênica, conforme o termo é definido acima. Para os fins da presente invenção, uma dose efetiva se encontrará entre aproximadamente 0,01 mg/kg e 50 mg/kg ou 0,05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de construções de DNA no indivíduo ao qual é administrada.

Processos de Fornecimento

Uma vez preparadas, as composições de polinucleotídeos da presente invenção podem ser administradas (1) diretamente ao paciente; (2) fornecidas ex vivo, a células derivadas do paciente; ou (3) in vitro para a expressão de proteínas recombinantes. Os pacientes a serem tratados podem ser mamíferos ou aves. Pacientes humanos podem também ser tratados.

O fornecimento direto das composições será geralmente efetuado por injeção, quer por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular ou fornecido ao espaço intersticial de um tecido. As composições podem também ser administradas para dentro de uma lesão. Outros modos de administração incluem administração oral e pulmonar, supositórios, e aplicações transdérmica ou transcutânea (veja WO 98/20734, por exemplo), agulhas, e pistolas de genes ou hiposprays. O tratamento de dosagem pode ser de regime de dose única ou regime de doses múltiplas.

Processos para o fornecimento ex vivo e a reimplantação das células transformadas em um paciente são conhecidos na técnica e descritos em WO 93/14778, por exemplo. Exemplos de células úteis nas aplicações ex vivo incluem, por exemplo, células tronco, especialmente hematopoiéticas, células linfáticas, macrófagos, células dendríticas ou célude 01/11/2017, pág. 85/109

81/100 las tumorais.

Em linhas gerais, o fornecimento de ácidos nucléicos tanto para aplicações ex vivo como ín vitro pode ser conduzido pelos procedimento abaixo, transfecção mediada por dextrana, por precipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, por fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas e por micro-injeção direta do DNA nos núcleos, por exemplo, todos conhecidos na técnica.

Composições farmacêuticas de polinucleotídeos e polipeptídeos

Além dos veículos e sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico descritos acima, os seguintes agentes adicionais podem ser usados com as composições de polinucleotídeos e/ou polipeptídeos.

A. Polipeptídeos

Um exemplo são polipeptídeos que incluem, sem limitação: asioloorosomucóides (ASOR); transferrina; asiologlicoproteínas; anticorpos; fragmentos de anticorpos; ferritina; interleucinas; interferonas; fator estimulador de formação de colônia de granulócitos, macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de formação de colônia de granulócitos (G-CSF) fator estimulador de formação de colônia de macrófagos (MCSF), fator de células tronco e eritropoietina. Os antígenos virais, tais como as proteínas de invólucro, podem também ser usados. Além disso proteínas provenientes de outros organismos invasivos, tais como o peptídeo de 17 aminoácidos da proteína circumesporozóide do plasmídeo falciparum conhecido como RII.

B. Hormônios, Vitaminas etc.

de 01/11/2017, pág. 86/109

82/100

Outros grupos que podem ser incluídos são, por exemplo: hormônios, esteróides, andrógenos, estrógenos, hormônio da tiróide, ou vitaminas, ácido fólico.

C. Polialquilenos, Polissacarídeos etc.

Além disso pode ser incluído polialquileno glicol com os polinucleotídeos/polipeptídeos desejados. Em uma montagem preferida, o polialquileno glicol é polietileno glicol. Além disso podem ser incluídos mono, di ou polissacarídeos. Em uma montagem preferida deste aspecto, o polissacarídeo é dextrana ou DEAE-dextrana. Além disso, quitosan e poli(lactídeo-co-glicolídeo).

D. Lipídios e Lipossomas

O polinucleotídeo/polipeptídeo desejado pode também ser encapsulado em lipídios ou acondicionado em lipossomas antes do fornecimento ao paciente ou a célula derivadas dele.

O encapsulamento é geralmente efetuado empregando-se lipossomas que são capazes de se ligar de modo estável ou aprisionar e reter ácido nucléico. A relação de polinucleo20 tídeo condensado para o preparado lipídio pode variar mas se encontrará geralmente a aproximadamente 1:1 (mg de DNA: micromoles de lipídio), ou mais de lipídio. Para uma resenha do emprego de lipossomas como veículos para o fornecimento de ácidos nucléicos, veja Hug e Sleight (1991) Bio25 chem. Biophys. Acta 1097;1-17; Straubinger (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527.

Os preparados lipossômicos para serem empregados na presente invenção incluem preparados catiônicos (com carga positiva), aniônicos (com carga negativa) e neutros. Os li30 possomas catiônicos mostraram mediar o fornecimento intraPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 87/109

83/100

celular do	DNA	de	plasmídeo (	^Felgner (1987)	Proc	Natl.
Acad. Sci.	USA	84:	7413-7416);	mRNA (Malone (	1989)	Proc.
Natl Acad.	Sci.	USA	86:607-6081	; e fatores de	transcrição

purificados (Debs (1990) J. Biol. Chem. 265:10189-10192) em forma funcional.

Os lipossomas catiônicos são facilmente disponíveis. Os lipossomas N[1,2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trietil amônio (DOTMA) são disponíveis sob a marca registrada Lipofectin, de GIBCO BRL, Grand Island, NY. (Veja também Felgner acima). Outros lipossomas disponíveis no comércio incluem transfectace (DDAB/DOPE) e DOTAP/DOPE (Boerhinger). Outros lipossomas catiônicos podem ser preparados a partir de materiais de fácil disponibilidade empregando-se técnicas co-

nhecidas	na	técnica. Veja	Szoka (	1978)	Proc	. Natl. Aca.
Sci. USA	75:	:4194-4198, WO	90/11092	para	uma	descrição da
síntese	de	lipossomas de	DOTAP	(1,2-	bis(	oleoilóxi)-3-

(trimetil amônio)propano).

De modo análogo os lipossomas aniônicos e neutros são facilmente disponíveis, tal como de Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) ou podem ser facilmente preparados empregando materiais disponíveis facilmente. Tais materiais incluem fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoil fosfatidil colina (DOPC), dioleoil fosfatidil glicerol (DOPG), dioleoil fosfatidil etanolamina (DOPE), dentre outros. Estes materiais podem também ser misturados com materiais de partida DOTMA e DOTAP em relações adequadas. Os processos para a preparação de lipossomas empregando-se estes materiais são bem conhecidos na técnica.

Os lipossomas podem ser constituídos por vesículas multilamelares (MLVs), vesículas unilamelares pequenas de 01/11/2017, pág. 88/109

84/100 (SUVs) ou grandes vesículas unilamelares (LUVs). Os diversos complexos lipossoma-ácido nucléico são preparados empregando-se processos conhecidos na técnica. Veja Straubinger (1983) Meth. Immunol. 101:512-527; Szoka (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:4194-4198; Papahadjopoulos (1975) Biochim. Biophys. Acta 394:483 Wilson (1979) Cell 17:77);

)1976) Biochim. Biophys. Acta Biochem. Biophys. Res. Commun.

Deamer & Bangham 443:629;;Ostro (1977)

76:836; Fraley (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3348); Enoch e Strittmatter (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:145; Fraley (1980) J. Biol. Chem. (1980) 255:10431; Szoka & Papahadjopoulos (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75:145; e Schaefer-Ridder (1982) Science 215:166.

E. Lipoproteínas

USA

Além disso, podem ser incluídas lipoproteínas com o polinucleotídeo/polipeptídeo a ser fornecido. Exemplos de lipoproteínas a serem utilizadas incluem: quilomícrons, HDL, IDL e VLDL. Mutantes, fragmentos ou fusões destas proteínas podem também ser usados. Além disso modificações de lipoproteínas que ocorrem na natureza podem ser usadas, tais como LDL acetiladas. Estas lipoproteínas podem direcionar o fornecimento de polinucleotídeos a células que expressam receptores para lipoproteínas. É preferível, se forem incluídas lipoproteínas com o polinucleotídeo a ser fornecidas, que não seja incluído na composição nenhum outro ligante de direcionamento.

As lipoproteínas que ocorrem na natureza compreendem uma porção lipídica e uma porção protéica. A porção protéica é conhecida como apoproteína. Atualmente, já foram isoladas e identificadas as apoproteínas A, B, C, D e E. Pelo de 01/11/2017, pág. 89/109

85/100 menos duas destas contêm diversas proteínas, designadas por numerais romanos, AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.

Uma lipoproteína pode compreender mais de uma apoproteína. Os quilomícrons que ocorrem na natureza, por exemplo, são constituídos por A, B, C e E e com o decorrer do tempo estas lipoproteínas perdem a apoproteína A e adquirem as C e E. O VLDL compreende as apoproteínas A, B, C e E, LDL compreende a apoproteína B; e HDL compreende as apoproteínas A, C e E.

Os aminoácidos destas apoproteínas são conhecidos e são descritos, por exemplo, em Breslow (1985) Annu Rev. Biochem. 54:699; Law (1986) Adv. Exp. Med. Biol. 151:162; Chen (1986) J. Biol. Chem. 261:12918; Kane (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2465; e Utermann (1984) Hum Genet

65:232.

As lipoproteínas contêm uma variedade de lipídios, incluindo triglicerídeos, colesterol (livre e em forma de ésteres) e fosfolipídios. A composição dos lipídios varia em lipoproteínas que ocorrem na natureza. Os quilomícrons, por exemplo, são constituídos principalmente de triglicerídeos. Uma descrição mais detalhada do teor de lipídios das lipoproteínas que ocorrem na natureza pode ser encontrado, por exemplo em Meth. Enzymol. 128 (1986). A composição dos lipídios são escolhidas para ajudar na conformação da apoproteína para a atividade de ligação a receptores. A composição dos lipídios pode também ser escolhida para facilitar a interação e associação hidrófoba com uma molécula de ligação a polinucleotídeo.

As lipoproteínas que ocorrem na natureza podem ser isoladas do soro por ultracentrifugação, por exemplo. Tais de 01/11/2017, pág. 90/109

86/100 processos são descritos em Meth Enzymol. (acima); Pitas (1980) J. Biochem. 255:5454-5460 e Mahey (1979) J. Clin. Invest. 64:743-750. As lipoproteínas podem também ser produzidas por processos recombinantes ou in vitro por expressão dos genes da apoproteína em uma célula hospedeira desejada. Veja, por exemplo, Atkinson (1986) Annu Rev. Biophys Chem. 15:403 e Radding (1958) Biochim. Biophys. Acta 30:443. As lipoproteínas pode também ser adquiridas de fornecedores comerciais tais como Biomedical Techniologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA. Uma descrição mais detalhada de lipoproteínas pode ser encontrada em Zuckermann e cols. WO 98/06437.

F. Agentes Policatiônicos

Os agentes policatiônicos podem ser incluídos, com ou sem lipoproteína, em uma composição com o polinucleotídeo/polipeptídeo desejado a ser fornecido.

Os agentes policatiônicos, tipicamente apresentam uma carga líquida positiva a um pH fisiológico relevante e são capazes de neutralizar a carga elétrica dos ácidos nucléicos para facilitar o fornecimento a uma localização desejada. Estes agentes tem aplicações tanto in vitro, com em ex vivo e em in vivo. Os agentes policatiônicos podem ser usados para fornecer ácidos nucléicos a um paciente vivo quer por via intramuscular, subcutânea etc.

Os peptídeos abaixo são exemplos de polipeptídeos úteis como agentes policatiônicos: polilisina, poliarginina, poliornitina e protamina. Outros exemplos incluem histonas, protamina, albumina sérica humana proteínas que se ligam a DNA, proteínas cromossômicas não histonas, proteínas de revestimento de vírus de DNA, tais como (X174, fatode 01/11/2017, pág. 91/109

87/100 res transcripcionais também contêm domínios que se ligam a DNA e portanto podem ser úteis como agentes de condensação de ácidos nucléicos. Resumindo, os fatores transcripcionais tais como C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, A-2, AP-3, CPF, Prot1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP e TFIID contêm domínios básicos que se ligam a seqüências de DNA.

Os agentes policatiônicos orgânicos incluem: espermina, espermidina e putrescina.

As dimensões e propriedades físicas de um agente policatiônico podem ser extrapolados a partir da lista acima, para construir outros agentes policatiônicos polipeptídicos ou para produzir agentes policatiônicos sintéticos.

Os agentes policatiônicos sintéticos que são úteis incluem, por exemplo, DEAE-dextrana, polibreno. Lipofectin^TMe lipofectAMINE^TM são monômeros que formam complexos policatiônicos quando combinados com polinucleotídeos/polipeptídeos.

Ensaios de Imunodiagnóstico

Os antígenos neisseriais da invenção podem ser usados em imuno-ensaios para detectar níveis de anticorpos (ou por outro lado, os anticorpos anti-neisseriais podem ser usados para detectar os níveis de anticorpos). Os imuno-ensaios à base de antígenos recombinantes bem definidos podem ser desenvolvidos para substituir processos de diagnóstico invasivo. Os anticorpos de proteínas neisseriais no interior de amostras biológicas, incluindo, por exemplo amostras de sangue ou de soro, podem ser detectados. O projeto dos imuno-ensaios é sujeito a uma grande quantidade de variações, e uma variedade destes são conhecidos na técnica. Os protocolos para o imuno-ensaio podem ser baseados, por exemplo, de 01/11/2017, pág. 92/109

88/100 na competição ou reação direta, ou em ensaios do tipo sanduíche. Os protocolos podem também usar, por exemplo, suportes sólidos ou podem ser por imuno-precipitação. A maior parte dos ensaios abrange o emprego de anticorpo ou de polipeptídeo rotulado; os rótulos podem ser moléculas fluorescentes, quimioluminescentes, radioativas ou moléculas de corantes, por exemplo. Os ensaios que amplificam os sinais provenientes da sonda são também conhecidos; exemplos deles são ensaios que utilizam a biotina e a avidina, e imunoensaios rotulados e mediados por enzimas, tais como os ensaios ELISA.

Kits adequados para o imunodiagnóstico e contendo os reagentes rotulados adequados são construídos por acondicionamento de materiais adequados, incluindo as composições da invenção, em recipientes adequados, juntamente com os demais reagentes e materiais (tampões adequados, soluções salinas, etc., por exemplo) necessários para a condução do ensaio, assim como um conjunto adequado de instruções para o ensaio.

Hibridização de Ácidos Nucléicos

A Hibridização se refere à associação de duas seqüências de ácidos nucléicos entre si por ligação de hidrogênio. Tipicamente, uma seqüência será fixada a um suporte sólido ao passo que a outra estará livre em solução. Em seguida, colocam-se as duas seqüência em contato entre si em condições que predispõem à ligação por hidrogênio. Os fatores que afetam esta ligação incluem: o tipo e volume do solvente; a temperatura de reação, o tempo de hibridização; agitação; agentes para bloquear a ligação não específica da seqüência em fase líquida ao suporte sólido (reagente de de 01/11/2017, pág. 93/109

89/100

Denhardt ou BLOTTO); concentração das seqüências; emprego de compostos para aumentar a velocidade de associação de seqüências (sulfato de dextrana ou polietileno glicol) e a drasticidade das condições de lavagem após a hibridização. Veja Sambrook e cols. [acima] Volume 2, capítulo 9, páginas

9, 47 e 9.57.

A Drasticidade se refere às condições em uma reação de hibridização que favorecem a associação de seqüências muito semelhantes de preferência a seqüências que diferem entre si. A combinação de temperatura e concentração salina, por exemplo, deve ser escolhida de tal modo que seja de aproximadamente 120 a 200°C abaixo do temperatura de fusão calculada do híbrido sendo estudado. A temperatura e as condições salinas podem ser determinadas freqüentemente empiricamente em experimentos preliminares em que amostras de DNA genômico imobilizadas sobre filtros são hibridizadas com a seqüência que interessa, sendo então lavadas em condições de drasticidades diferentes. Veja Sambrook e cols. na página 9.50.

As variáveis a se considerar, durante a condução de um manchamento Southern, por exemplo são (1) a complexidade do DNA que está sendo estudado e (2) a homologia entre a sonda e as seqüências sendo detectadas. A quantidade total do(s) fragmento(s) a serem estudados pode variar em magnitude de

10, de 0,1 a 1 qg para um plasmídeo ou digestor de fagos até 10^-9 a 10^-8 g para um gene de cópia única em um genoma eucariótico extremamente complexo. Para polinucleotídeos de complexidade inferior, podem ser usados manchamentos, hibridização e tempos de exposição substancialmente mais curtos, uma quantidade menor de polinucleotídeos de partida e de 01/11/2017, pág. 94/109

90/100 uma atividade específica mais baixa das sondas. Um gene de levedura de uma única cópia, por exemplo, pode ser detectado com um tempo de exposição de somente 1 hora partindo de 1 pg de DNA de levedura, manchamento de duas horas e hibri5 dização durante 4-8 horas com uma sonda de 10⁸ cpm/pg. Para um gene de mamífero de uma única cópia uma abordagem conservadora começaria com 10 pg de DNA, um manchamento de um dia para o outro, e hibridização de um dia para o outro na presença de 10% de sulfato de dextrana empregando-se uma sonda acima de 10⁸ cpm/pg, resultando em um tempo de exposição de ~24 horas.

Diversos fatores podem afetar a temperatura de fusão (Tm) de um híbrido de DNA-DNA entre a sonda e o fragmento que interessa, e conseqüentemente, as condições adequadas para a hibridização e lavagem. Em muitos casos, a sonda não tem uma homologia de 100% com o fragmento. Outras variáveis que se encontram habitualmente incluem o comprimento e o teor de G + C total das seqüências de hibridização e a resistência iônica e o teor de formamida do tampão de hibri20 dização. Os efeitos de todos estes fatores podem ser aproximados por uma única equação:

Tm = 81 + 16,6 (logoCi) + 0,4 [% (G + C)] - 0,6 (% de formamida) = 600/n - 1,5 (% de discrepância)

Na qual Ci é a concentração salina (íons monovalentes) e n é o comprimento do híbrido em pares base (ligeiramente modificado de Meinkoth & Wahl (1984) Anal. Biochem.

138:267-284).

Quando se projeta um experimento de hibridização, alguns fatores que afetam a hibridização de ácidos nucléicos podem ser convenientemente alterados. A temperatura da hiPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 95/109

91/100 bridização e as lavagens e a concentração salina durante as lavagens são as mais simples de serem ajustadas. À medida que a temperatura da hibridização aumenta (isto é, a drasticidade), torna-se menos provável que a hibridização ocorra entre filamentos que não sejam homólogos, e resulta disso, a redução do fundo. Se a sonda rádio-rotulado não for completamente homóloga com o fragmento imobilizado (conforme é freqüentemente o caso de experimentos genéticos de hibridização entre espécies e famílias), a temperatura de hibridização deve ser reduzida e o fundo será aumentado. A temperatura das lavagens afeta a intensidade da faixa de hibridização e o grau de fundo de modo análogo. A drasticidade das lavagens é também aumentada à medida que cai a concentração salina.

Em geral, as temperaturas de hibridização convenientes na presença de 50% de formamida são 42°C para uma sonda que tem 95% a 100% de homologia com o fragmento alvo 37°C para uma homologia de 90% a 95%, e 32°C para uma homologia de 85% a 90%. Para homologias mais baixas, o teor de formamida deve ser reduzido e a temperatura ajustada proporcionalmente, empregando-se a equação acima. Se a homologia entre a sonda e o fragmento alvo não forem conhecidas, a abordagem mais simples consiste em se iniciar com condições tanto de hibridização como de lavagem que não sejam drásticas. Se faixas não específicas ou alto fundo forem observados depois da auto-radiografia, o filtro pode ser lavado com alta drasticidade e re-exposto. Se o tempo necessário para a exposição tornar tal abordagem impraticável, diversas drasticidades de hibridização e/ou lavagem devem ser testadas paralelamente.

de 01/11/2017, pág. 96/109

92/100

Identificação da proteína meningocócica de 80-85kDa.

Foi observado que diversos preparados de vesícula de membrana externa do grupo sérico B de N. meníngítídís continham um componente de aproximadamente 80-85kDa. Esta pro5 teína foi purificada de géis de SDS-PAGE e seqüenciada com terminal N (ID DE SEQ 1).

Os anticorpos lançados contra a proteína purificada por SDS-PAGE inter-reagiram com proteínas equivalentes em mais de 50 cepas de N. meníngítídís de diversos grupos sé10 ricos e tipos séricos. A inter-reatividade com N. gonorrhoeae, N. polysaccharía e N. lactamíca foi também observada. Os soros pós imunes provenientes de pacientes vacinados também reagiram com a proteína.

O gene completo foi clonado a partir do grupo sérico B de N. meníngítídís (ID DE SEQ 2) e a proteína codificada foi inferida (ID DE SEQ 3). Por comparação com o seqüenciamento de terminal N descrito acima, um peptídeo de sinal (ID DE SEQ 4) e uma seqüência madura (ID DE SEQ 5) são inferidas.

Identificação de genes correspondentes no grupo sérico A de N. meningitidis e N. gonorrhoeae

Com base na seqüência do grupo sérico B de N. meníngítídís os genes correspondentes provenientes do grupo sérico A de N. meníngítídís e de N. gonorrhoeae foram clonados e seqüenciados.

O gene completo proveniente do grupo sérico A de N. meníngítídís é mostrado em ID DE SEQ 6, com a proteína codificada em ID DE SEQ 7. O peptídeo de sinal e a seqüência madura são ID DE SEQs 8 e 9.

O gene completo proveniente de N. gonorrhoeae é mosPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 97/109

93/100 trado em ID DE SEQ 10 e a proteína codificada em ID DE SEQ

11. O peptídeo de sinal e a seqüência madura são ID DE SEQs e 13.

Comparações das seqüências

As seqüências de proteínas foram comparadas e tem alto grau de homologia.

A seqüência do grupo sérico B de N. meníngítídís e a seqüência de N. gonorrhoeae mostra uma identidade de 95,4% em sobreposição de 797 aa:

□rfíi-pep

Orf21n.g.pep prf2l.pep qíf2lng.pap orf21.pep orf 21ng.pep &rf2].pep or f 2 Lng.pep or f2 1.pep orf21ng.pep or f2 L.pep orf2 LAg.pep orf21.pep orf 21ng.pep orf2i.pep orf2Ing-pep orf21.pep orf2Lng .pep or£21.pep orf2Lng.pep orf21.pep

20 30 40 £0 60

HKLKQTflSALHtJLGIiSPLjALADFTlOPIEVEÜLÇiRTEPSTI.fFIfjXPVXVGDTYWrHfiSA

ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙII

MKLKQ lASALMMLGI S Pb AFADFTIOD ΙΚνΒΰυς-ΙΤΕ PSTVFWYliPVKVGtmrHDTfiG Sft 10 2Π 30 40 50 60

ÍÜ 90 100 110 120

K£L YATTSFFDOVRVETftDSQLbLrVI ERPTIG3LH ΙΤΗ1ΑΚΜ1^ΐπ3ΑΙΚΡΖ'ΙΕΕ3Γΰ1Λη lllllllllllll IIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIII

II KSLYATGFFDtJVRVETADGQLbLTVI ERPT IG3LJ4ITHlAKffljQ!NIlATKKHLE3FGLAQ

SO 90 100 110 120

130 140 150 160 170 130

SÜYFHQArLMQAVftfiLKEEYLSRGKLHIQITPKVTKLAENHVDZDiriDEGKSAKrTDIE llllllllllílllllllllllllllllllllllllll llilllllllllllllllll II SQY PNQArLHQAVAGLKEEYLGRGKLN IQirPHVTKLAHHRVDIDITI DEGEÍSAKITDIE

130 140 150 160 170 130

190 200 210 220 230 240

FEGNQVYSWK f.HRÇMSÍiTBGG IWlWbTRSMQFHEQKFAQEMEKVrDFYQHNGYFDFRI L

II11111II1111111II1111II111111l· ^:l 1111111 Η 1111IIIII111111

FEGMOVYSOflXLMRÇMSLTEEG IWTObTyRSDHFDRQKFAQEMEKVTDFYlQMHGYFDFRI L

190 200 210 220 230 240

250 260 270 230 290 300

DTDI QTHEDKTKCZÜl KIT VH SG&RFRW&KVSIEÜOTHEVPKAErEKLLTMKPGKWY ERQQ

ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΜΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙίΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙ llilllllllllllllllll II

DTDICTNEDKTRCMIKITVHEGGHFRWGKVSTEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQ

250 260 270 230 290 300

310 320 330 340 350 360

MTAVIGEIQHRHGEAGYA YS EISVQPL PHAETKT TOF VLHZ EPGRKIYVNE1HITGHNKT

III H11111111 11111111111111111 1111111 111111111 111II1111111 11

KTAVLGE iqHFLMGBAGYAYE ETEVQPb PHAGTKTVDF VLE] IEPGRKIYVHEIHITGHNKT

310 320 330 340 330 360

370 330 390 400 410 420

RDEWRRELEÜMESAPYDTSKLOREKERVELLGYFDHVQFDAVPLAGTPDKVOIUIHSLTE 1111111111111 111II111111111111; III1111 111111111111J111111III RDEWHRELRÜMESAPYDTSKLORSKERVELLGYFDHVQFDAVPLAGTPDKVDLHHSLTE

370 330 390 400 410 420

430 44D 450 460 470 430

RSTGSLDLgAGWl/QürGLl^SAiJirEQDKLFGTGKSAALRASRSKTTLHGSLSFTDPYFTA lllllllllllll ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙΙΙΙΙΙΪΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΗΙΙΙΙ II

Α3Τ(;5Τ,ΐ>Ε3ΛαίΜνςθΤ5ϋνΚΞΑ5υ50ΠΗΕΡ&ΤΰΚΒ*ΑυίΑΞΡ5Ε?ΤΤ11ΗσΞΰ3ηθΡΎΓΤΑ

130 440 150 160 470 130

490 500 510 520 530 540

DGVSLGVBVYÜKAFD PREÍAÉT3 I ROYKTTTAÜ AGlRHS VF VTEY DRVHFG2. VAEfJLTUHT

1111111I-111111111111l^:11111111 h II I 11111111111 D 11111111

DSvSir-YDlYC-KAFDFftftASTSVKQYKTTTÍtóeeVBMeiPvrtíYDRVHFGLAAÉifciLTVHT

190 500 510 520 530 540

550 560 570 530 590 600 ^HKAPKHYADFIKKYQKTfieTDGSFKOWLYKQTVGWGKSKTDSALWPTRGYLTGVHAEIA :11111± 1111II111111:111111 llllllllllllllll lllllllllllllll

ΥΗΚήΡΚΕ1ΥΑΙ?ΓΙΕΚΥ&ΚΤΙ>ΰΑ]Χ33ΓΚΰ1ϋΥΚΰΓνα»άΚΗΚΤ03ή3ΜΡΤ:ΕΕΥΐΓΤ0νΐ1ΑΕΙΑ

550 5E0 570 530 59Q 600

610 620 630 640 650 660

94/100 oi f 2 Ing . pep L PGSKLQYYEATHHÇTTWFF PLSKTFTLltLGGFVGIAGGYGRTKEIPFPENPYGGGLGSVR

	610	620	630	640	650	660
	670	660	690	700	7L0	720
oif2í.pep	GYSSC-TLC-PKVYDEYGEKISYGGNKKAJTVSAFL	LFPKPGAKEABTVRLSLFADAG SVUDG
	lllllllllllll	IIIIIHII	ihiiiiiiii	IIIIIHII	lllllllllll	Illllll
orf2íng.pep	GYZSGTLCPEVYÍlEYG EKI SYGGNKKAHVSAELLFPHPGftKDARTVRLSLFAHAG SVWBG
	670	6BJ	690	700	710	720

orf2í□ pep oxf2ing.pep

730 740 75Ü 760 770 ?&0

KTYDEHS SSATGGRVGNIYGAGNTHKSTFTtJELaYSAfiGAVTTdL 5 PLG PHKFSYAYFLKK :|| ::| H =l· 1: 111111111111111111111111111111111111

ΚΓΫ- - --TAAENGHWKSVYSE-UAHKSTPTfJELRYSAGGAVTWL SPLG PMEÍFSYAYPLKK

730 740 730 750 770 orf21, pep

730

KPEDFTQRFQFQLGTPF orÉZlny-pep

K ΡΕ3ΈΊ QRFQFQLiGTTFX 7âD 740

As seqüências do grupo sérico A e B de N meningi tidis mostram uma identidade de 99,9% em sobreposição de 797aa orf21 , pep ortsia-pee orf21 , pep orf21a _pep orf21 . pmp orfíle-pep orf21 .pep orfíla.pep crf21 ,pep

Orf21a . £jSí>

orf21.pep <rÍ2La.pep

Ot f 21. pep or t2 ía . pep

20 30 40 SO 60

KKLKQ1ASALMHLGIS ?L AL ADFTIy Dl RVEGLQRTEPSTVFNYL PVK VGDTYNDTEIGS A

Illllll IIIl·111111111111111111111 í 11111111111111111111111111

KKLKQTÃEftLtfVLGI SFLALADPTIDOIRVEG LQR TE PSTVFMYL PVKVGDT ΥΕΐΖΐΉΰ S A

20 30 40 50 60 ao ao loo no 120

LI K£ LY ήΤ6Ε·Ί·βθνΗνΕΤή[ΚΟΪ.Ι.ΕΤ VIBRPTIGSLITI rGftKMLQNBAI KKNLESFG1AC I,Η 1111111111111111II1111111111111111II111IIII11111111111II

K£ LY ATGFFDDVKVETADGQLLLT VIER PTIGSI J« TSAKMl^HDAI KKJLE&FGLAQ

Θ0 ao 100 lio 120

130 140 ISO 160 170 180

SQYFNQ MLNQAVAGLKEEYLCRaKLinQ ΙΤΡΚνΤΚΙΑΕΝΚΥΓίΙΟ ΕΠ’IDSGKSAKITDIE

1111111111II11111111II1111II1111111IIIIIII111 H........Illll

5ΐ¥ FNQ ATLNQAVAGLKEEYIjGRGKLNI Q LTFKVTKLARHRVDlDIT iriEGKSAKITDIE

130 140 150 160 170 180

ISO 200 210 220 230 240 fBGKÜVYâÜfiiiLMHQMSLTEGGIWTHLTElSKÍFNEOKFAQDMEKVTDFYQHNGrFDrRIL· Illll Illll IllllIllllIlllllllllllllllllllllllllllllllll IIMII fsgnqvysdrklmrqmslteggiwtultrsnqpneokfaqchekvtijfygjingyfofril

ISO 200 210 220 230 240

350 260 270 200 290 300

DTDIQTUEDfCTKQTTKITVHEGGRFRWGKVSIEGCTHEVPKAELElCLLTMKPGKWYERaO llllll IIIHIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

PTDIQTHEDfTTKQTIKTTVHEHGRFRWGKVSIEGDTHEVPKAELEKLLTMKPGKVJYERQÜ

350 260 270 200 290 300

310 320 330 340 350 360

MTAVLGETQNRMGSAGYAY£E1£VÜPL2NAETKTVDFVLH1EFÜE1KIYVWEIE1ITGHHKT lllllllllllll lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll

MTAVLGEIOHTLHG SAGYAYSE1ÍVÚ PLPNAETKTVDFVLHI EP^RKI YVNEIEJITGHHRT

310 220 33 Cl 340 350 360

370 380 330 400 410 420

EtDEWERELHOHESAPYDTSK.LOKSKEEVELLGYFIlHVlOFnAVPLAGTPDKVDLHMSúrE llllllll Illll II llllllllllllllllllllllllllll lllllllllllllllll

RDBVVREELRQMEÊAPYDTSKLÍSSKERUELLC-YFnHVQFIlAVPLÃGTPDKVrLNMSLrE

370 380 330 400 410 420 de 01/11/2017, pág. 99/109

95/100 orf21,pep or£21a,p6t or£2l-pep orf21a.ρβρ ôrE21,pep or£2 li., C'élj orr!1.pep orfSls.pep

Dr£21. pS£>

ozf2lo.pep or£21.pep orfílSnpÇp orf21.pep orf21a.pep

O alto

430 440 45Ü 460 420 480

RSTGELDLSAGWVQDTGLVKSAGVEÜDNLFGTGKEAACRASRSKTTLIIGSLSFTDPYFTA

I llll IIIII llll llll IIIHIII1111111 llll IIII111111 llllll IIIIIII

HSTG$LDLSAQWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAAGRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTA

430 4(10 450 460 420 480

490 500 510 520 530 540 dçvêuüyd vygkafofííkastsikqyctttagagirmsvpvteydrvnfglvaehltvnt I I III I llllIllllIIIIIIIIIllllllIIIIIIIIllll I I III llllll llllll I

DGVSLGYDVYGKAFDPHKA ΞΤ5Ϊ F.QYKTTTAüAü ÍRMSV PVTEYDR VNFGLVAEHLTVNT

490 500 510 520 530 540

550 560 520 5S0 590 600

YNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDC-SPKGWLYKGrVGWGKNTCTDSALWPTRGÍYLTGVNABIA

IIIIIIllllIllllllllIIIIIIIIlllllllllllI lllll III Nllll lllllll

YWftA PKHY ADP1KRYGKTKTI3GS FKGWLYKGlOGWGFLNETDSALWPTRGIYLrGVWAEIA

550 560 570 530 590 6 00

610 620 630 640 650 660

LPG EKLCYYSATHHIQTWFF PLSKTPTLML&G EVG lAGGYGBTKET PFF έΗΓΥΟΟΰυΰ 5 VP.

IIIIII lllll I Ml llll IIIHIII llll III Mil I lllll llll llllll IIIIII

LPGSKLQYYSATHNQTWFFFLSKTFTLMLGGEVGIAJGGYGRTKEIPFFEHFYSGGLGΞVR

610 620 630 640 650 660

620 6E0 690 200 710 220

G YFSGTIJj PKWDEYGE1ÍISYGílNK KAHVSAELLF PMPG AKDARTVRLELFADAGSVHDG

111111111111111111IH 11111111111 Η 111111111111111Η 111111111

C YEEGTLG PKVYDEYG ETC I SYGGNKKAlTVSAELLF PMFÜAKDARTVRLELFADAGSVHDG

670 6E0 690 700 710 720

730 740 750 760 770 730

KTYDDNS Ξ EATGGRVONI YGAGhTTHKSTPTNELHYEAGG AVTWLS PLC-PHKP SYAY PL KK

1111111111111111111111111111111111111111 U1111II1111111111111

KTYDDNSSSATGGRVQNlYGAGHTElKSrFTHELHYEAGGAVTWLSFLGPMKFSYflYPLKK

730 740 750 760 770 730

790

K PEDE IQRFQFQI/3TTF

1111111111II111111

KPEDEIQRFQFQLGTTFX

730 grau de conservação sugere que uma única proteína pode ser capaz de induzir respostas imunes contra uma variedade de espécies de Meisseria.

Vacinas

As três proteínas identificadas acima foram expressas e usadas para imunização. Boas respostas imunes foram observadas contra as proteínas.

Vacinas de combinação

Além disso, cada uma das proteínas foi combinada com antígenos contra outros organismos patogênicos (a vacina de polissacarídeo de Chiron contra o grupo sérico C de meningite) e usada para imunização. Foram observadas boas respostas imunes.

de 01/11/2017, pág. 100/109

96/100

Outros componentes de NmB

Embora ela seja eficaz, a proteção obtida pela vacina de OMV norueguesa é restrita à cepa usada para preparar a vacina. Os testes clínicos da vacina obtiveram somente

57,2% de eficácia depois de 29 meses em adolescentes, embora as respostas de IgG tivessem sido observadas em quase 100% de pacientes [Rosenqvist e cols. (1995) Infect. Immun.

63:4642-4652, por exemplo].

Constatou-se com surpresa que a adição de outros com10 ponentes definidos à vacina de OMV norueguesa amplia consideravelmente a sua eficácia.

A vacina norueguesa não obteve proteção contra a cepa 2996 de Nmb. Proteínas definidas da cepa 2996 foram acrescentadas à vacina norueguesa, e foi mostrado que a eficácia da vacina aumentou até um grau surpreendente. Além disso adição de um antígeno conjugado de polissacarídeo de NmC [Costantino e cols. (1992) Vaccine 10:691-698, por exemplo] apresentou excelentes resultados.

As atividades bactericidas das combinações são apre20 sentadas na seguinte tabela:

Grupo	OMV norueguês	antígeno de NmB*	antígeno de NmC	Atividade bactericida contra a cepa 2996 de NmB
1	+	-	-	<4
2	+	#1	-	512
3	+	#2	-	>2048
4	+	#3	-	1024
5	+	#3	+	256
6	-	#3	-	2048
7	-	#3	+	2048

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 101/109

97/100 *Três diferentes antígenos de NmB foram usados:

#1: ORF1- 77 de WO 99/24578, por exemplo (veja também WO 99/55873) #2: proteína '287' - A figura 21 de WO 99/57280, por exemplo (veja ID DE SEQs: 3103-3108) #3: uma mistura em Al(OH)3 de #1, #2 e proteína '191' (ID DE SEQ 14 da presente invenção; veja também WO 99/57280 Figura 23 e ID DE SEQs 3069-3074 naquele documento)

Pode ser facilmente observado que a ineficácia da va10 cina de OMV norueguesa contra a cepa 2996 (grupo 1) pode ser superada por acréscimo de antígenos definidos da cepa 2996. Os resultados empregando-se a proteína '287' de NmB são especialmente bons. A vacina norueguesa pode portanto ser melhorada sem haver necessidade de se preparar OMVs a partir de um número de cepas diferentes.

Esta vacina também oferece proteção contra cepas MenB heterólogas. As mesmas vacinas, preparadas empregando-se proteínas de cepa 2996, foi testada contra cinco outras cepas. Os títulos foram os seguintes:

Grupo	2996	BZ133	BZ232	1000	MC58	NGH3 8
1	<4	1024	<4	>2048	>2048	32
2	512	512	<4	>2048	>2048	256
3	4096	4096	256	1024	>2048	1024
4	1024	2048	<4	2048	>2048	64
5	256	>32000	<4	>2048	>2048	128
6	2048	2048	4	<4	64	4
7	2048	>32000	4	128	1024	128
Controle	32768	4096	8192	16384	16384	8192

*Controles: cepas 2996, BZ133 & 1000 = OMVs preparadas a partir da cepa homóloga; cepa BZ232 = OMVs preparadas a

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 102/109

98/100 partir de 12996; MC58 & NGH38 = SEAM3

Um segundo estudo suplementou as OMVs norueguesas com proteínas provenientes da cepa 2996 de NmB:

- proteína 919, expressa em E. coli sem qualquer 5 componente de fusão

- ORF1, expressa em E. coli como uma fusão marcada com His

- Proteína 287, expressa em E. coli como uma fusão de GST

- Uma mistura destas três proteínas, opcionalmente com o conjugado de NmC.

Os preparados receberam como adjuvantes Al(OH)3 e foram testados contra a cepa homóloga empregando-se o ensaio bactericida. Os resultados foram os seguintes:

	NmB	NmC
Antígeno	2996	NGH3 8	394/98	C11	BZ133
OMVs	<4	32	1024*	<4	1024
+ 919	<4	<4	4	<4	512
+ ORF1	512	256	2048	4096	512
+ 287	4096	1024	1024	512	4096
+mixtura	1024	6	4	64	2048
+mixtura	256	128	2048	64000	>32000
+NmC

* os anticorpos eram bacteriostáticos, não bactericidas.

Trabalho adicional com antígeno 287

As combinações de OMV s norueguesas com antígeno 287 foram investigadas ainda mais. 20 μg de antígeno 287 foram combinados com a vacina OMP norueguesa (15 μg de OMP +

Al(OH)3) e usadas para imunizar camundongos. Os anticorpos foram testados no ensaio bactericida e foram efetivos conPetição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 103/109

99/100 tra todas as cepas testadas. Os resultados foram os seguintes:

	NmB	NmA	NmC
Antí- geno	2996	BZ133	BZ232	1000	MC58	NGH3 8	NZ	F6124	C11
OMVs	<4	1024	<4	>2048	32768	32	<4	-	-
287	8000	4096	256	<4	512	2048	1024	1024	2048
OMV + 287	4096	4096	256	1024	4096	1024	1024	-	-

Em praticamente todos os casos, portanto, a combinação de OMVs + proteína 287 com surpresa teve melhores resulta5 dos do que as OMVs sozinhas.

OMVs recombinantes

O E. coli foram transformadas para expressar ORF1, ORF40 e ORF46. As OMVs preparadas de E. coli recombinantes foram capazes de induzir anticorpos bactericidas contra N.

meningitidis.

OFR1, ORF40 e ORF46 (cepa 2996) foram expressos como fusões marcadas com His em E. coli e foram preparadas ou na forma de proteínas puras ou na forma de OMVs. Os títulos bactericidas contra as dois preparados foram testados em15 pregando-se como desafio a cepa 2996:

Antígeno	ORF1	ORF4 0	ORF4 6
Purificado	64	2048	16000
OMV	1024	256	128000

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 104/109

Os títulos bactericidas empregando-se as cepas de desafio heterólogas foram também medidos. ORF46 resultou em um título contra a cepa MC58 de 4096 na forma pura, mas este sobe para 32 000 quando se encontra na forma de OMVs.

100/100

ORF1 resultou em um título contra a cepa F6124 de NmA de 128 na forma pura, mas esta sobe para 512 quando ela se encontra na forma de OMVs. ORF40 resulta em um título contra a cepa MC58 de 512 na forma pura, mas este dobra de valor 5 quando ela se encontra na forma de OMVs.

Estes dados mostram que os antígenos de NmB conservam a imunogenicidade quando preparados em E. coli em forma de OMVs e além disso, que a imunogenicidade pode ainda ser intensificada.

Deve ficar subentendido que este pedido descreve a invenção somente a título de exemplo e que podem ser introduzidas modificações que continuam incidindo dentro do âmbito e espírito da invenção.

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 105/109

1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreender (a) vesículas de membrana externa do grupo sérico B de Neíssería meníngítídís e (b) um componente imunogênico compreendendo (i) um aminoácido selecionado do grupo que consiste em

MFKRSVIAMACIFPLSACGGGGGGSPDVKSADTPSKPAAPVVAENAGEGVLPKEKKDEE

AAGGAPQADTQDATAGEGSQDMAAVSAENTGNGGAATTDNPKNEDAGAQNDMPQNAAES

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MFKRSVIAMACIVALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPVVTEDVGEEVLPKEKKDEE

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RYLTYGAEKLSGGSYALSVQGEPAKGEMLAGTAVYNGEVLHFHMENGRPSPSGGRFAAK de 01/11/2017, pág. 106/109
2/3

VDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAVIDGNGFKGTWTENGGGDVSGRFYGPAGEEVA GKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD, e/ou (ii) um fragmento de 10 ou mais aminoácidos de (i).

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente (b) inclui uma proteína de uma cepa do grupo sérico B de N. meníngítídís diferente da qual o componente (a) é derivado.
3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, CARACTERIZADA pelo fato de que as vesículas da membrana externa (OMVs) são um extrato de desoxicolato de NmB.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que um ou mais dos seus componentes é adsorvido sobre Al(OH)3.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o componente (a) é adsorvido sobre Al(OH)3.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende um ou mais dos seguintes componentes:

• um antígeno protetor contra o grupo sérico A de Neíssería meníngítídís; • um antígeno protetor contra o grupo sérico C de Neíssería meníngítídís; • um antígeno protetor contra o grupo sérico Y de Neíssería meníngítídís; • um antígeno protetor contra o grupo sérico W de Neíssería meníngítídís;

• um antígeno protetor contra Haemophílus de 01/11/2017, pág. 107/109

3/3 influenzae;

• • • um um um antígeno antígeno antígeno protetor protetor protetor contra contra contra pneumococcus ; difteria; tétano; 5 • um antígeno protetor contra coqueluche; • um antígeno protetor contra Helicoba pylori; • um antígeno protetor contra pólio; e/ou

• um antígeno protetor contra o vírus da 10 hepatite B.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é uma vacina.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das 15 reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que é empregada como um medicamento.
9. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de um

20 paciente.

Petição 870170084372, de 01/11/2017, pág. 108/109