BRPI0109494B1 - Muteína de fator viii, sequência de dna, vetor, processo para produção da muteína de fator viii, composição farmacêutica e uso da muteína do fator viii - Google Patents

Abstract

produção de fatores recombinantes de coagulação do sangue em linhas celulares humanas. a presente invenção refere-se a um processo melhorado para a produção de fatores recombinantes de coagulação do sangue humano, em particular do fator viii e fator ix, utilizando uma linhagem celular humana imortalizada expressando estavelmente proteínas ativadoras de transcrição viral e carregando um vetor tendo um promotor funcionalmente ligado a uma seqüência de dna codificando para um fator de coagulação do sangue, desde que o dito promotor não seja um promotor viral que seja estimulado pelas ditas proteínas ativadoras de transcrição viral; e linhagem celular humana imortalizada carregando o dito vetor; muteínas do fator viii particularmente adequadas para o processo de produção acima; composições farmacêuticas compreendendo tais muteínas do fator viii e a utilização de tais muteínas do fator viii para a preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia.

Description

Introdução

A presente invenção refere-se a um processo melhorado para a produção de fatores recombinantes de coagulação do sangue humano, em particular, o fator VIII e o fator IX, utilizando uma linha celular humana imortalizada expressando estavelmente proteínas ativadoras de transcrição viral e carregando um vetor tendo um promotor funcionalmente ligado a uma sequência de DNA codificando para o fator de coagulação do sangue, desde que o dito promotor não seja um promotor viral estimulado pelas ditas proteínas ativadoras de transcrição viral; uma linhagem celular humana imortalizada carregando o dito fator; muteínas do fator VIII particularmente adequadas para o processo de produção acima; composições farmacêuticas compreendendo tais muteínas do fator VIII e a utilização de muteínas do fator VIII para a preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia.

Sumário da Técnica Relacionada

Os hemofílicos sofrem de morbidez hemorrágica causada pela função perturbada de componentes proteícos da cascata de coagulação do sangue. Dependendo do fator de coagulação afetado, podem ser distinguidos dois tipos de hemofilia. Ambos têm em comum a conversão inibida de um brinogênio solúvel a um fibrina-coágulo insolúvel. As mesmas são doenças recessivas genéticas cromosomicamente X ligadas afetando a população masculina.

A hemofilia A afeta 1 a 2 indivíduos por 10.000 indivíduos do sexo masculino. É ocasionada pela deficiência ou ausência do fator VIII, uma glicoproteína muito grande (Mr de aproximadamente 330 kDa (Furie B., Furie B. C., Cell (1988) 53, 505 a 518)), que representa um elemento importante da cascata de coagulação do sangue. A sequência polipetídica pode ser subdivida em três regiões, uma região terminal N consistindo nos assim chamados domínios A1 e A2, uma região de domínio central B e uma região terminal C composta dos domínios A3, Cl e C2. No fator VIII de coagulação ■t do sangue ele ocorre como um precursor inativo. Ele é fortemente ligado, e não covalentemente, ao Fator Willebrand (vWF), que atua como uma proteína portadora estabilizadora. A clivagem proteolítica do fator VIII por trombina em três posições específicas (740, 372, 1689) conduz à sua dissociação do 5 vWF e libera a função pró-coagulante dentro da cascata. Em sua forma ativa, o fator VIII funciona como um co-fator para o fator IXa, desse modo acelerando a ativação proteolítica do fator X por diversas ordens de grandeza.

A hemofilia B ocorre em cerca de 1 em 25.000 indivíduos do sexo masculino. A mesma é caracterizada pela deficiência da serine protea- 10 se do fator IX (fator Christmas). Esse polipeptídeo aminoácido 415 é sintetizado no fígado como uma glicoproteína de 56 kDa. Com a finalidade de obter sua própria função, é requerida uma etapa de carboxilação pós- translacional que ocorre somente na presença de vitamina K.

O tratamento de ambos os tipos de distúrbio do sangramento 15 envolve tradicionalmente infusões de concentrados proteínicos do fator VIII ou do fator IX derivados de plasma humano. Conquanto esse processo represente uma terapia eficiente para os hemofílicos, o mesmo carrega o risco de transmissão de diversos agentes infecciosos, tais como vírus causadores de hepatite ou AIDS, ou fatores tromboembólicos. Alternativamente, foram 20 descritas diversas técnicas de DNA recombinante para a produção de fatores de coagulação. Para essa finalidade os correspondentes cDNAs do tipo silvestre do fator VIII e fator IX foram isolados e clonados em vetores de expressão adequados (EP-A-160457; WO A-86/01961, Patentes Norte- Americanas N9s 4.770.999, 5.521.070 e 5.521.070).

No caso da expressão recombinante do fator VIII de subunida- des para a produção de complexos apresentando atividade coagulante é conhecida na técnica (por exemplo, das EP-A-150735, EP-A-232112, EP- A0500734, WO 91/07490, WO 95/13300, Patentes norte-americanas N9s 5.045.455 e 5.789.203). Além do mais, foram descritas as expressões de 30 versões truncadas de cDNA com falta parcial ou total da sequência de codificação para o domínio B altamente glicosilado (por exemplo, em WO 86/06101, WO 87/04187, WO 87/07144, WO 88/00381. EP-A-251843, EP-A- 253455, EP-A-254076, Patentes Norte-Americanas Nes 4.868.112 e 4.980,456, EP-A-294910, EP-A-265778, EP-A-303540 e WO 91/09122). Mais recentemente, foi introduzida uma variedade de mutações pontuais selecionadas para inibir a desativação proteolítica do fator VIII por proteína C 5 ativada ou para reduzir a imunogenicidade resultante da formação de anticorpos inibitórios pelos pacientes tratados (por exemplo, Patentes Norte- Americanas Nss 5.859.204, 5.422.260 e 5.451.521, WO 97/49725 E WO 99/29848).

Os fatores recombinantes de coagulação eram usualmente iso- 10 lados do meio de linhagens celulares eucarióticas estavelmente transfecta- das e preferivelmente de mamíferos. Entretanto, era prática geral anterior utilizar linhagens celulares não humanas nos processos de produção descritos nas referências aqui mencionadas com a finalidade de excluir o risco de co-purificar alguns agentes infecciosos que podem se alojar e ser expres- 15 sos por células humanas.

Entretanto, especialmente para o fator VIII, a utilização de linhagens celulares não humanas encontrou algumas desvantagens. Por exemplo, foram registrados níveis não satisfatórios de secreção da proteína expressa no meio. Isso pode ser devido a ligeiras diferenças com diferentes 20 tipos de células de mamíferos concernentes a percursos intracelulares para translação e modificação de proteína, que também podem ter um efeito sobre a atividade biológica do polipeptídio expresso. Afora isso, havia preocupações de que as proteínas terapêuticas purificadas a partir de sistemas de expressão não humanos sejam contaminadas com componentes celulares 25 que podem dar lugar a reações antigênicas nos pacientes.

Além do mais, as proteínas expressas por sistemas de expressão não humanos podem ter modelos de glicosilação não humanos dando lugar a reações antigênicas no paciente. Entretanto, a estabilidade e eficácia biológica de fatores de coagulação é substancialmente influenciada por seu 30 modelo de N-glicosilação. Especialmente, monossacarídeos periféricos e terminais são importantes, devido ao fato de serem detectados por receptores específicos de células que são responsáveis por sua degradação. Os fatores de coagulação podem carregar resíduos de ácido siálico como mo- nossacarídeos terminais. A modificação na composição de ácidos siálicos nas antenas das glicoproteínas como, por exemplo, os fatores de coagulação, podem resultar em modelos heterogêneos de glicosilação. Portanto, a 5 estabilidade e eficácia biológica é crucialmente envolvida quando ocorre I modificação. Portanto, constitui uma consideração importante na produção de fatores recombinantes de coagulação para avaliar a influência da glicosilação a partir da produção de linhagens celulares não humanas versus linhagens celulares humanas. Falando de um modo geral, parece plausível θ 10 que as linhagens celulares humanas sejam mais qualificadas para a produção de fatores recombinantes de coagulação do que as não humanas. A razão para essa suposição é a de que provavelmente não serão incorporados ■ oligossacarídeos estranhos na parte de oligossacarídeo durante a síntese dos fatores recombinantes.

Por outro lado, os processos gerais para a expressão de proteí- , nas em alto nível de um gene desejado compreendendo linhagens celulares I de mamíferos estavelmente transfectadas, imortalizadas expressando pro-teínas ativadoras de transcrição virai tornaram-se disponíveis já há algum tempo (por exemplo, Patente norte-americana Ns 5.712.119). Além disso, 20 essas linhagens celulares são transformadas com um vetor construção em que um promotor de transcrição virai adequado é operativamente associado I com uma sequência de DNA definindo um gene de interesse, as proteínas ativadoras de transcrição ativam o promotor de transcrição virai e, portanto, iniciam a expressão do gene de interesse. Novamente, havia preocupações 25 de que as proteínas ativadoras de transcrição expressas por essas linhagens celulares possam dar lugar a contaminações na proteína terapêutica alvo.

Em vista do acima mencionado, continua havendo necessidade de um processo efetivo de produção para fatores de coagulação de sangue 30 humano.

Surpreendentemente, foi descoberto que pode ser obtido um fator não contaminado de coagulação de sangue com as linhagens celulares humanas imortalizadas acima mencionadas. Em particular, as células imor-talizadas - se carregando um vetor tendo um promotor funcionalmente ligado a uma seqüência de DNA codificando para o fator de coagulação de sangue e apesar do fato de que o promotor não é um promotor virai que é estimula- do pelas ditas proteínas ativadoras de transcrição virai - são capazes de ex-pressar o fator de coagulação de sangue. Em combinação com purificação adequada de proteína e protocolos de desativação de vírus, esse processo proporciona um sistema efetivo para produzir fatores recombinantes de coa-gulação de sangue altamente ativos para aplicações terapêuticas em seres 10 humanos. Além do mais, foram encontradas muteínas particulares do fator VIII que são excepcionalmente estáveis contra a desativação proteolítica e permitem, assim, serem submetidas a vigorosos protocolos de desativação de vírus.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona: (1) um processo para a produção de fator recombinante de coagu-lação de sangue humano que compreende: (a) cultivo de uma linhagem celular humana imortalizada ex-pressando pelo menos uma proteína ativadora de transcri- ção virai e carregando um vetor tendo um promotor funci onalmente ligado a uma seqüência de DNA codificando para o fator de coagulação de sangue humano, desde que o dito promotor não seja um promotor virai estimulado pelo dito pelo menos uma proteína ativadora de transcrição vi- ral, e (b) isolamento do fator de coagulação de sangue do caldo de cultura; (2) um concretização preferido do processo definido em (1) acima, em que o fator de coagulação de sangue humano é o fator VIII ou uma muteína do mesmo; (3) uma concretização preferida do processo definido em (2) acima, em que o fator VIII é uma muteína tendo pelo menos uma das seguintes mutações: (a) Vai na posição 162 substituído por outro resíduo de ami- noácido neutro, (b) Ser na posição 2011 substituído por outro resíduo de ami- 5 noácido hidrofílico, (c) Vai na posição 2223 substituído por um resíduo de amino- ácido, e (d) o domínio B entre as posições Arg740 e Glu1649 substi-tuído por um peptídio ligante rico em Arg compreendendo 10 10 a 25, preferivelmente 14 a 20 resíduos de aminoácidos, em que a dita numeração do fator VIII é relativa à sequência do fator VIII do tipo silvestre mostrado na SEQ ID NO: 2; (4) uma concretização preferida do processo definido em (1) acima, 15 em que o fator de coagulação de sangue humano é o fator IX ou uma muteína do mesmo; (5) uma linhagem celular humana imortalizada carregando um vetor codificando para um fator de coagulação de sangue humano como definido em (1) a (4) acima; (6) uma muteína do fator VIII como definida em (3) acima; (7) uma seqüência de DNA codificando para a muteína do fator VIII como definido em (6) acima; (8) um vetor compreendendo o DNA como definido em (7) acima; (9) um vetor como definido em (8) acima que é um vetor de transfe- rência de gene; (10) uma célula hospedeira sendo transformada com um vetor como definido em (8) acima e/ou compreendendo uma seqüência de DNA como definida em (7) acima; (11) uma composição farmacêutica compreendendo a muteína do fator VIII como definido em (6) acima ou um vetor de transferên cia de gene como definido em (9) acima; (12) a utilização da muteína do fator VIII como definido em (6) acima

ou um vetor de transferência de gene como definido em (9) acima para a preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia; e (13) um processo para o tratamento de hemofilia que compreende a 5 administração a hemofílicos humanos de uma muteína do fator VIII como definido em (6) acima ou um vetor de transferência de gene como definido em (9) acima.

Descrição das figuras A Figura 1 mostra os fragmentos utilizados para a construção do 10 fator VIII com um domínio B deletado (Exemplo 1). A Figura 2 mostra o vetor DNA circular pTGF8-1, 8720 bps, cuja sequência exata de DNA do mesmo é dada na SEQ ID NO: 3 (para a proteína do fator VIII codificada pela dita seqüência de DNA, ver SEQ ID NO: 4). A Figura 3 mostra o vetor DNA circular pTGFG36, 5753 bps, 15 cuja seqüência exata de DNA do mesmo é dada na SEQ ID NO: 6 (bases 689-2071 dentro da SEQ ID NO: 6 codificando para a proteína do fator IX). A Figura 4 mostra o vetor DNA circular pTG36hyg, 8124 bps. A Figura 5A apresenta uma seqüência ligadora preferida da presente invenção (SEQ ID NO: 9). A Figura 5B mostra o tempo de coagulação do hFVIII recombi- nante como determinado no Exemplo 6. A Figura 6 mostra a estrutura molecular comum do DNA circular pTGF8-2hyg-s e pTGF8-3, 10698 bps, cujas seqüências exatas de DNA do mesmo são dadas nas SEQ ID NOs: 12 e 14 (para a proteína do fator VIII 25 codificada pela dita seqüência de DNA ver SEQ ID NOs: 13 e 15). A Figura 7A mostra a curva de calibração para ELISA FVIII como descrito no Exemplo 5. A Figura 7B mostra os resultados da determinação de concen-trações de FVIII recombinante em diferentes filtrados de culturas como des- 30 crito no Exemplo 5. A Figura 8 mostra os resultados de uma análise de imunofluo- rescência específica do fator VIII como descrito no exemplo 9. Fileira superi- or: células 293T estavelmente transfectadas com pTGF8-3, clone 49/19. Fileira inferior: Controle negativo: Células 293T não transfectadas. A e C; luz branca, sem filtro; B e D: Detecção do fator VIII por fluorescência, filtro 550 nm. A Figura 9 mostra a influência do tratamento térmico na ativida de de FIX em filtrado de cultura como descrito no exemplo 10. A Figura 10 mostra a dependência da expressão do fator IX re-combinante ativo na suplementação da vitamina K no meio de cultura. Descrição Detalhada da Invenção

"Funcionalmente ligado" refere-se a configurações do vetor em que o promotor está localizado dentro do vetor de maneira tal que possa estimular a transcrição da seqüência de DNA codificando para o fator de coagulação de sangue humano. "Não ligado funcionalmente" refere-se a uma configuração em que o promotor está tão remotamente localizado na se- qüência do gene expresso do fator de coagulação de sangue que o mesmo não pode estimular a transcrição.

"Gene" refere-se a uma seqüência de DNA codificando um poli- peptídeo incluindo opcionalmente seqüências líder (leader) e reboque (trailer) e introns e exons.

"Vetor" refere-se a qualquer construção genética, tal como plas- mídeo, fago, cosmídeo, etc., capaz de replicação quando associada com os elementos apropriados de controle. O termo inclui veículos de clonagem e expressão. "Carregando um vetor" inclui ambos a incorporação estável e transiente de segmentos funcionais de DNA na célula hospedeira. Entretan- to, a incorporação estável é a preferida.

“Vetor de transferência de gene" de acordo com a presente in-venção inclui um vetor adequado para terapia genética. Um tal vetor com-preende seqüências funcionais para as desejadas finalidades, como é co-nhecido na técnica.

O termo "maduro" refere-se à estrutura molecular de uma dada proteína diretamente após sua secreção celular (isto é, faltando seu terminal N de sinal de exportação do polipeptídeo ).

"Promotor" refere-se a uma região de sequências reguladoras de DNA para o controle de transcrição de urn gene ao qual se ligam as RNA polimerases.

"Dose terapeuticamente efetiva" da composição farmacêutica da 5 invenção refere-se a uma dose efetiva para o tratamento ou profilaxia, por exemplo, uma dose que forneça um tratamento efetivo ou redução dos sintomas de hemofilia. A determinação de uma dose terapeuticamente efetiva faz parte da aptidão de alguém versado na técnica.

"Codificar" ou "codificando" refere-se a uma propriedade da se- 10 qüência do ácido nucléico sendo transcrito (no caso de DNA) ou traduzido (no caso de mRNA) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocado sob o controle de uma seqüência reguladora apropriada.

Para a finalidade deste pedido, "expressar", "expressando" ou "expressão" refere-se à transcrição e tradução de um gene codificando uma 15 proteína.

A presente invenção como descrita em (1) a (13) acima é des-crita daqui em diante com maior detalhe. De acordo com a concretização (1) da invenção do presente pedido, o promotor funcionalmente ligado à seqüência de DNA codificando para o fator de coagulação de sangue humano 20 não é um promotor virai que é estimulado por pelo menos uma proteína ati- vadora de transcrição virai expressa pela linhagem celular humana imortalizada.

A linhagem celular humana imortalizada é preferivelmente uma célula imortalizada de rim, bexiga, fígado, pulmão, músculo cardíaco, mús- 25 culo liso, ovário ou gastrointestinal. Mais preferivelmente a linhagem celular humana imortalizada é derivada de uma célula embriônica de rim humano e mais preferivelmente é uma linhagem celular 293 T (ECACC: tsa201, ref. 96121229; DSM ACC2494).

A pelo menos uma proteína ativadora de transcrição expressa 30 pela linhagem celular imortalizada inclui antígeno Simiano de T de vírus, adenovirus E1A ou proteínas E1B, uma proteína codificada pela região ante-cipada de seqüência de DNA de vírus de papiloma bovino e proteínas de vírus IE de herpes. Preferivelmente, a célula imortalizada expressa pelo menos duas proteínas ativadoras de transcrição virai, por exemplo, um antígeno SV40 T sensível à temperatura e proteína de adenovirus E1A (tal como a linhagem celular 293 T acima).

O promotor funcionalmente ligado à seqüência de DNA codifi-cando para o fator de coagulação de sangue humano preferivelmente inclui: (i) promotores virais que não são estimulados pela proteína ativa- dora expressa pela célula imortalizada como definido acima (tal como SV40 e CMV); (ii) promotores de limpeza de hospedeiros (albumina); e (iii) promotores tecido específicos (tal como a-antitripsina para fígado). O promotor mais preferível de acordo com a invenção é um promotor CMV (enquanto a proteína ativadora de transcrição expressa pela célula imortalizada não estiver estimulando o dito promotor).

De acordo com a invenção, o vetor pode carregar promotores virais adicionais que são estimulados pelas ditas proteínas ativadoras de transcrição viral, mas que não estão ligados funcionalmente ao fator de coagulação do sangue. Tais promotores virais são selecionados entre promotores derivados de adenovirus, vírus de sarcoma Rous e citomegalovírus. O vetor pode compreender adicionalmente uma ou mais das seguintes sequências: marcadores de seleção, sequências reguladoras (por exemplo, PRE), etc.

O fator de coagulação de sangue humano de acordo com a concretização (1) da invenção inclui, mas não é limitado a, fator IX, fator VIII, fator VII, fator V, fator von Willebrand (vWF) e semelhantes.

Em uma concretização preferida (2) da invenção, o vetor com-preende uma seqüência de DNA codificando para o fator VIII ou uma muteí- na do mesmo. Conquanto o fator IX recombinante é de um modo geral estruturalmente idêntico à proteína do tipo silvestre isolada do plasma sangüí- neo, diversas construções modificadas de expressão do fator VIII foram designadas para expressão recombinante. Considerando a estrutura de domí- nio para o polipeptídeo funcional do fator VIII, importantes sítios de interação com vWF estão localizados no domínio A3 (aminoácido 1680-1689) e no domínio C2 (Kaufman & Pipe, Haemophilia (1998) 4, 370 a 379). A clivagem após 1689 foi proposta para liberar o fator VIII do vWF e permitir a interação 5 do fator VIII com fosfolipídeos carregados. Foi mostrado que construções do fator VIII recombinante faltando o sítio de ligação vWF eram extremamente sujeitas a digestão proteolítica quando injetadas em camundongos deficientes em fator VIII. A expressão recombinante de construções truncadas do fator VIII em culturas de células de mamíferos demonstrou que a deleção 10 completa do domínio B não alterou a atividade biológica da correspondente proteína semelhante a fator VIII (Eaton et al., Biochemistry (1986) 25, 8343 a 8347). Adicionalmente, as taxas de expressão observadas de construções de domínio B deletado eram significativamente maiores em comparação com o fator VIII do tipo silvestre devido a um aumento no nível de mRNA nas cé- 15 lulas (Pittman et al., Blood (1993) 81, 2925 a 2935). Encontram-se correntemente no mercado quatro produtos de fator VIII recombinante (Recombinate® Baxter HelathCare; Kogenate® e Kogenate FS® Bayer Corporation e Re- facto® Wyeth, Genetics Institute).

Em uma concretização preferida (3) da invenção, a muteína do 20 fator VIII apresenta pelo menos uma das seguintes mutações (a) a (d): (a) Vai na posição 162 foi substituído por outro resíduo de aminoá-cido neutro; (b) Ser na posição 2011 foi substituído por outro resíduo de amino-ácido hidrofílico; (c) Vai na posição 2223 foi substituído por um resíduo de aminoáci do de natureza ácida; e (d) o domínio B entre as posições Arg740 e Glu1649 foi substituído por um peptídeo ligante rico em Arg compreendendo 10 a 25, preferivelmente 14 a 20 resíduos de aminoácido, em que a dita numeração do fator VIII é relativa à seqüência de aminoácido do fator VIII do tipo silvestre mostrado na SEQ ID NO: 2 (sendo a seqüência do aminoácido do peptídeo maduro não incluindo o peptídeo de sinal de aminoácido 19, mas incluindo todo o domínio B (WO 99/29848)).

"Outro resíduo de aminoácido neutro" de acordo com a presente invenção inclui Gly, Ala, Leu, lie, Met e Pro e preferivelmente é Ala. O "outro aminoácido hidrofílico" inclui Asn, Thr e Gin e preferivelmente é Asn. O resí- duo de aminoácido de natureza ácida é selecionado entre Glu e Asp e é preferivelmente Glu.

Entre as muteínas do fator VIII da concretização (3), é preferido que a muteína do fator Víll tenha pelo menos uma das mutações (a), (b) e (c), mais preferivelmente pelo menos uma das mutações (a) e (b), e mais 10 preferivelmente todas as três mutações (a) a (c), como definido acima. É particularmente preferido que a muteína compreenda todas as três mutações V162A, S2011N e V2223E.

Na mesma consideração, a seqüência de DNA compreendida pelo vetor da concretização (4) da invenção tem as mutações T485C, 15 G6032A e T6668A em relação à seqüência do DNA do fator VIII tipo silvestre maduro mostrado na SEQ ID NO: 1. Em uma concretização preferida, a seqüência do DNA também contém a mutação T6816C quieta (isto é, silenciosa) (novamente a dita numeração sendo em relação à seqüência do DNA do fator VIII tipo silvestre maduro).

Entre as muteínas do fator VIII da concretização (3), é alternati vamente preferido que a muteína do fator VIII tenha a mutação (d) como definida acima.

Um sistema preferido de expressão da invenção utiliza uma úni ca muteína do fator VIII que - além da mutação pontual (a) a (c), como aqui 25 já definido - tem falta parcial ou integral de seu domínio B, preferivelmente uma muteína onde o domínio B entre a posição R740 e E1649 é substituída por um espaçador aminoácido rico em Arg característico como definido em (d) acima. "Rico em Arg", de acordo com a presente invenção, significa que o dito espaçado compreende pelo menos 3, preferivelmente a 4 resíduos 30 Arg. Em uma concretização mais preferida o dito espaçador consiste em oito aminoácidos do domínio B do tipo silvestre seguido por oito aminoácidos de um domínio variável (ver Figura 5A, SEQ ID NO: 9). Em uma tal construção I tendo as modificações do domínio B acima discutidas em relação ao pro-posto sítio de ligação com vWF permanece inalterado para evitar uma digestão proteolítica imediata de fator VIII secretado no meio de cultura celular I ou mais tarde no sangue dos pacientes tratados. Somente após a ativação específica por divagem de trombina, o fator VIII irá se soltar do vWF. O I cDNA para o fator VIII preferido foi construído pela montagem de quatro fragmentos de DNA, por exemplo, como descrito no Exemplo 1.

A proteína da concretização (3) da invenção pode compreender seqüências terminais N ou C incluindo, mas não limitado a, o sinal de ex- 10 portação de peptídeo natural (correspondente aos resíduos de aminoácidos - 19 a -1 das proteínas mostradas na SEQ ID Nδs: 4, 13 e 15) ou um fragmento ou análogo do mesmo, peptídeos artificiais (por exemplo, oligo- rótulos-His para a purificação por afinidade) e semelhantes.

O vetor mais preferido para a expressão do fator VIII é o vetor pTGF8-1 mostrado na Figura 2. A seqüência do DNA do dito vetor é mostra-do na SEQ ID NO: 3, e abarca todas as cinco mutações aqui antes mencio-nadas (as muteínas T485C, G6032A, T6668A e T6816C (aqui: T1217C, G4088A, T4724A e T4872C) e uma seqüência de DNA codificando para o ligante do domínio B da SEQ ID NO: 9) e codifica a muteína do fator VIII 20 apresentado na SEQ ID NO: 4. θ Adicionalmente, os vetores mais preferidos são pTGF8-2hyg-s e pTGF8-3, a estrutura molecular comum da qual está mostrada na Figura 6. , pTGF8-2hyg-s mostrado na SEQ ID NO: 12 contém somente a । mutação silenciosa T6816C, resultando em uma muteína do fator VIII tendo a substituição do domínio B pelo peptídeo ligante SEQ ID NO: 9, mas ne-nhuma alteração adicional na estrutura primária da proteína referindo-se à ! SEQ ID NO: 2 do tipo silvestre. ' pTGF8-3 mostrado na SEQ ID NO: 14 contém mutações T485C, ' T6668A e T6816C, resultando em uma muteína do fator VIII mostrando substituições de aminoácidos V162A e V2223E referentes à SEQ ID NO: 2 adicionalmente à substituição do domínio B como descrito acima.

No caso da produção do fator VIII, a cultura é realizada na pre- sença do fator von Willebrand. O fator von Willebrand é utilizado preferivelmente em uma quantidade de 10 a 100, mais preferivelmente de 50 a 60 moles de vWF por mol do fator VIII (no caldo de cultura e/ou na solução do fator VIII durante o procedimento de purificação (ver abaixo).

Em uma concretização preferida (4) da presente invenção, o fa tor de coagulação de sangue humano é o fator IX ou uma muteína do mesmo, preferivelmente é o fator IX do tipo silvestre mostrado na SEQ ID NO: 5. Muteínas adequadas do fator IX incluem formas mutadas pontualmente e truncadas do fator IX. Os vetores mais preferidos para a expressão do fator 10 IX são os vetores pTGFG36 e pTG36hyg mostrados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.

No caso da produção do fator IX, a cultura é realizada preferivelmente na presença de vitamina K que pode estar presente em uma quantidade de 0,1 a 100 μg/mL de caldo de cultura, mais preferivelmente 1 a 20 15 μg/mL de caldo de cultura.

O processo de acordo com a concretização (1) da invenção compreende adicionalmente as etapas: (c) purificação do fator de coagulação do sangue isolado na etapa (b) e/ou (d) submeter o fator de coagulação do sangue isolado na etapa (b) ou purificado na etapa (c) a um tratamento de desativação de vírus.

Etapas adequadas de purificação incluem processos conhecidos na técnica para maximizar o rendimento de um produto puro, estável e alta- 25 mente ativo e são selecionadas entre cromatografia de imunoafinidade, cro- matografia de troca aniônica, cromatografia de exclusão de tamanho, etc., e combinações dos mesmos. Em particular, protocolos detalhados de purificação para fatores de coagulação para plasma de sangue humano são, por exemplo, descritos em WO 93/15105, EP 0813597, WO 96/40883 e WO 30 96/15140/50. As mesmas podem ser facilmente adaptadas a requisitos es pecíficos necessários para isolar fatores VIII e IX recombinantes. Para o fator IX, um protocolo eficaz foi introduzido contendo uma etapa de precipita- • s's"í ção de sulfato de amónio seguido por DEAE e cromatografia de tentáculo HIC assim como cromatografia de afinidade de heparina (Patente norte- americana Ne 5.919.909). A quantidade e atividade da proteína purificada durante e após o procedimento de purificação podem ser monitorados por | , 5 ELISA e análises de coagulação. । Para contornar os problemas de possíveis contaminações infec- i ’ ciosas nas amostras de proteína purificada ou no produto obtido diretamente ! do sobrenadante da cultura celular contendo a proteína recombinante se- cretada selecionada, as amostras e/ou o sobrenadante da cultura podem ser 1 —. 10 tratados com procedimentos para desativação de vírus incluindo tratamento 1 U por calor (seco ou no estado líquido, com ou sem a adição de substâncias químicas incluindo inibidores de protease). Após a desativação de vírus, pode ser necessária uma etapa adicional de purificação para remoção de

I substâncias químicas. Em particular, para o fator VIII isolado do plasma san- güíneo, foi descrita recuperação de uma proteína de vírus desativado, de alta pureza, por cromatografia de troca aniônica (WO 93/15105). Adicional- i " mente, foram relatados diversos processos para a produção de fatores de coagulação não infecciosos, de alta pureza, a partir de plasma sanguíneo ou outras fontes biológicas. Vírus revestidos com lipídeo são efetivamente de- 20 sativados por tratamento do material potencialmente infeccioso com uma fase hidrofóbica formando um sistema de duas fases, do qual a parte insolúvel em água é subsequentemente removida. Uma vantagem adicional foi । provada complementar o tratamento de fases hidrofóbicas simultaneamente ! ou seqüencialmente com um tratamento com detergentes biocompatíveis não-iônicos e fosfatos dialquílicos ou trialquílicos (WO 9636369, EP i । 0131740, Patente norte-americana N9 6.007.979).Vírus não revestidos por । lipídio requerem protocolos de desativação consistindo no tratamento com

I detergentes não-iônicos seguido por uma etapa de aquecimento (60 a 65 °C) i por diversas horas (WO 94/17834). Em visto dos resultados acima, acredita-se que a combinação de um sistema eficaz de expressão de proteína baseado em uma linhagem celular humana juntamente com processos aprovados para a desativação de ; tβ PIO 109 I agentes potencialmente perigosos servem como um sistema seguro e fácil de ser usado para a produção de fatores de coagulação recombinantes.

Além disso, de acordo com a concretização (6) da invenção, é proporcionado um mutante superior do fator VIII. O dito mutante do fator VIII 5 pode fazer parte de composições farmacêuticas, pode ser utilizado para a preparação de medicamentos para o tratamento de hemofilia e pode ser I ' aplicado em processos para o tratamento de hemofilia (concretizações (11) a 1 (13) da invenção). As composições farmacêuticas acima e os medicamentos acima podem compreender o fator VIII em uma dose terapeuticamente efi- । 10 caz, por exemplo, de 50 a 500 μg (com 200 ng de fator VIII correspondendo a uma Unidade Internacional (IU)). Dependendo do tipo de hemofilia, um paciente recebe uma dose anual de fator VIII de até 200.000 UI, que é usualmente administrada em doses semanais ou duas vezes por semana.

I As composições, medicamentos ou preparações farmacêuticas aplicadas em processos para tratamento de hemofilia das concretizações (11) a (13) contêm uma dose terapeuticamente eficaz da muteína do fator í " VIII da concretização (6) ou o vetor de transferência de gene da concretiza ção (9). No caso do primeiro, o mesmo pode compreender adicionalmente aditivos farmaceuticamente aceitáveis incluindo soro albumina humano (HSA; preferivelmente cerca de 1 mg/mL de solução); sais inorgânicos tais I como CaCI2 (preferivelmente 2 a 5 mM), aminoácidos tais como glicina, lisi- i na e histidina (preferivelmente 0,1 a 1 M por aminoácido); dissacarídeos tais , como sacarose e/ou trehalose (preferivelmente 0,4 a 1 M); sais orgânicos l I । tais como citrato de Na (preferivelmente até 50 mM); etc. As preparações I I 25 podem ser aquosas ou não aquosas. No último caso, o componente maior é । glicerol e/ou polietifeno gltcol (por exemplo, PEG-300). A preparação tarn- I । bém pode estar na forma seca (para ser dissolvida no desejado solvente 1 antes da administração). I ‘ Como apresentado acima, o vetor de transferência de gene de 30 acordo com a concretização (9) da invenção também pode ser parte de composições farmacêuticas, pode ser utilizado para a preparação de medicamentos para o tratamento de hemofilia e pode ser aplicado em processos para o tratamento de hemofilia (concretizações (11) a (13) da invenção). As ditas composições e medicamentos farmacêuticos podem compreender adicionalmente formulações adequadas de matriz, por exemplo, lipídios ou hormônios como discutido em WO 00/49147 (a descrição da mesma sendo aqui incorporada para fins de referência). A composição ou medicamento farmacêutico compreendendo o vetor de transferência ou o vetor de transferência de gene da presente invenção pode ser administrado oralmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutaneamente, topicalmente, através da mucosa (incluindo spray bucal, nasal) ou por pistola de gene. A ad- 10 ministração oral (por exemplo, em uma dispersão de hormônio micronizado) é a preferida.

A muteína do fator VIII da concretização (6) da invenção é preferivelmente como definido com referência à concretização (3) acima. A dita muteína do FVIII pode ser adicionalmente preparada por técnicas padrões 15 recombinantes, por exemplo, um processo compreendendo: (a) cultura de uma célula hospedeira transformada com o vetor da concretização (8) e/ou compreendendo o DNA da concretização (7) (que também inclui a cultura de uma célula humana imortalizada expressando estavelmente pelo menos uma proteína ati- 20 vadora de transcrição virai e carregando um vetor tendo um promotor de transcrição virai ligado funcionalmente a uma seqüência de DNA codificando para o fator de coagulação de sangue humano, em que o dito promotor virai é estimulado pela dita | pelo menos uma proteína ativadora de transcrição virai); e (b) isolamento do fator de coagulação de sangue do caldo de cultu ra. Linhagens celulares humanas imortalizadas adequadas, । proteínas ativadoras de transcrição e promotores virais são aqueles aqui mencionados anteriormente. A linhagem celular humana imortalizada no dito processo preferivelmente expressa j duas proteínas ativadoras de transcrição virai, mais preferível- । mente o antígeno SV40T sensível à temperatura e a proteína de l adenovirus E1A. O processo pode compreender adicionalmente i as etapas de purificação e de desativação de virus (c) e (d) aqui descritos anteriormente.

A linhagem celular comercialmente disponível 293 T (ECACC: tsa201, ref. 96121229) foi depositada com o DMSZ (Deutsche Sammlung 5 von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemanha) em 20 de fevereiro de 2001 sob o número de depósito DSM ACC2494.

A invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos que se seguem. Exemplos Exemplo 1 - Clonagem do fator VIII: A seqüência para o fator VIII recombinante foi obtida por transcrição reversa de um agrupamento de RNA hepatocelular humano completo. Em seguida, quatro fragmentos (1/2, 3/4, 5/6, 7/8) foram amplificados por PCR padrão utilizando iniciadores designa- 15 dos para conter sítios de restrição. Para ajustar entre si os fragmentos 3/4 e 5/6, o fragmento Smal/Sall do plasmídeo pBSFVIII3/4 foi inserido cego no sítio Sall de pBSFVII5/6 para obter pBSFVIII3/6. Em seguida, o fragmento 3/6 foi obtido por digestão de pBSFVIII3/6 com Xhol/BspHI e parcialmente com Alw44l. Esse fragmento e o fragmento Pstl/Alw441 de pBSFVIII1/2 fo- 20 ram ligados em uma etapa na estrutura principal do vetor de pBSFVIII1/2 digerido com Pstl e Xhol, por esse meio obtendo pBSFVIII1/6. O fragmento 7/8 foi obtido pela digestão de pBSFVIII7/8 com Smal e parcialmente com Mva1269l e ligado em pBSFVIII1/6 cortado com Xhol e Mva1269l, dando lugar ao pBSFVIII1/8. Finalmente, o fragmento Smal/Xhol de pBSFII11/8 foi 25 inserido cego no sítio Sall do Vetor Octagene pTGFG67 (a produção do dito vetor estando descrita em PCT/EP 00/01368) resultando no vetor eucariótico de expressão para o fator VIII humano pTGF8-1 (ver Figuras 1 e 2). O vetor resultante codifica uma muteína do fator VIII tendo as mutações V162A, S2011N e V2223E. Exemplo 2 - Clonagem do fator IX: O vetor pUC19 (MBI Fer mentas) foi digerido com Xbal, tratado com enzima Klenow e religado. Esse vetor com Xbal deletado foi então digerido com EcoRI, tratado com enzima Klenow e religado com a finalidade de deletar o sítio EcoRI. Para inserção de um sítio Xbal no sítio Saci desse vetor, o mesmo foi digerido com Saci, tratado com polimerase T4-DNA, desfosforilado com fosfatase alcalina e ligada com o ligante Xbal CTCTAGAG (Biolabs Ns 1032). Outro sítio Xbal foi 5 inserido pela digestão do vetor novo produzido com HindiII, tratando-o com Klenow, desfosforilando o mesmo com fosfatse alcalina e ligando o mesmo com o ligante Xbal CTCTAGAG (Biolabs Ne 1032). Esse vetor foi chamado de pUC19/X.

Com a finalidade de destruir o sítio Xbal presente no vetor phGFP-S65T (Clontech), esse vetor foi digerido com Xbal, tratado com enzima Klenow e religado resultando no vetor pGFP/O. Um fragmento de 2,3 kb contendo o Gene GFP foi isolado após digestão do pGFP/O com Mlul, tratando-o com enzima Klenow e digerindo-o com BamHI. Esse fragmento foi inserido no sítio de clonagem múltipla do vetor pUC19/X que foi digerido com Sail, tratado com enzima Klenow e digerido com BamHI. O vetor resultante foi denominado pTGFGI.

Os oligonucleotídeos (Metabion) PRE-S (5’-GGG GTA CCA GCT TCG TAG CTA GAA CAT CAT GTT CTG GGA TAT CAG CTT CGT AGC TAG AAC ATC ATG TTC TGG TAC CCC-3’; SEQ ID NO: 10) e PRE-AS (5’- 20 GGG GTA CCA GAA CAT GAT GTT CTA GCT ACG AAG CTG ATA TCC CAG AAC ATG ATG TTC TAG CTA CG A AGC TGG TAC CCC-3’; SEQ ID NO: 11) foram hibridizados e fosforilados por reação cinase, resultando no inserto PRE(ds).

O vetor pTGFGI foi Digerido com EcoO1091, tratado com enzi- ma Klenow e desfosforilado com fosfatase alcalina. O mesmo foi então ligado com o inserto PRE(ds), resultando no vetor pTGFG5.

O vetor pUC19 (MBI Fermentas) foi digerido com Sail, tratado com enzima Klenow e desfosforilado com fosfatase alcalina. O mesmo foi ligado ao ligante Notl GCGGCCGC (Biolabs N2 1045), resultando no vetor PUC19/N.

O cDNA do fator IX foi amplificado a partir de cDNA de fígado humano (Clontech) utilizando dois iniciadores sobrepondo-se ao códon de início e de terminação do modelo de leitura aberta do fator IX resultando em um fragmento de 1387 bp contendo todo o modelo de leitura aberta. Foram incluídos sítios de restrição para EcoRI (a montante) e BamHI (a jusante) no final de cada iniciador para facilitar a clonagem. A amplificação foi realizada 5 com Pwo DNA-polimerase (Boehringer Mannheim) em 50 μL de volume de reação [10 mM Tris HCl, pH 8,85, 25 mM de KCI, 5 mM de (NFU^SCU, 2 mM de MgSO4] com 30 ciclos de incubação a 96 °C, por 1 minuto, 60 °C por 1 minuto, 72 °C por 2 minutos, seguido por uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos.

Os produtos de reação foram ligados nos sítios EcoRI e BamHI de pUC19 e transformados em E. coli DH5-a. Foram selecionados clones positivos. Seqüências foram confirmadas por seqüenciamento de ciclo (Amersham) de ambas as extremidades com iniciadores rotulados (IR-700) e análise automatizada no sistema de seqüenciamento LiCor (MWG, Biotech). Foram utilizados os seguintes iniciadores: GGAATTCCGCAAAGGTTATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGC (a montante; SEQ ID NO: 16) CGCGGATCCATTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAATCC (a juzante; SEQ ID NO: 17).

Um fragmento de 1,4 kb contendo o modelo de leitura aberta do fator IX de coagulação humana, isolado de uma biblioteca de cDNA humano, foi inserido no sítio Pstl do vetor acima reparado pUC19/N que foi digerido com Pstl, tratado com T4-polimerase e desfosforilado com fosfatase alcalina. Do vetor resultante, foi retirado por corte o pUC19/N-FIX, um fragmento de 1,4 kb 25 contendo o modelo de leitura aberta do fator IX de coagulação humano, por dupla digestão com Hind III e Notl. Esse fragmento foi ligado ao fragmento de 4,3 kb do vetor HindiII e Notl duplamente digerido pTGFG5 resultando no vetor pTGFG36 mostrado na Figura 3. Esse vetor é um preferido para o fornecimento de um cassete de expressão codificando para o fator IX na célula, e sua 30 seqüência de DNA é proporcionada na SEQ ID NO: 6.

Exemplo 3 - Linhagem celular humana para expressão de pro teína: Uma linhagem celular preferida é tsA201 (ECACC Ref,: 96121229) que é uma linhagem celular de rim humano embrionário transformada (293, ECACC Número 85120602) expressando estavelmente um antígeno T SV40 sensível a temperatura (J. Membrane Biol., 1996; 152:39; Gene 1995; 156:235; PNAS USA 1994; 91:12785; Pflügers Arch. 1994; 427:136; J. Gen. I # 5 Physiol. 1994; 104:507; BioTechniques 1993; 15:906). Outros nomes para ' ' essa linhagem celular incluem 293tsA1609neo (Mol. Cell. Biol., 1987, 7:379) e 293T. Essa linhagem celular semelhante a epitélio foi utilizada em uma variedade de análises de expressão funcional e relatada como produzindo , elevados níveis de proteínas recombinantes. Podem ser cultivadas em ' Q 10 DMEM suplementado com glutamina 2 mM e 10 % de FCS. Para produção eficiente do fator IX, o meio pode ser modificado peia adição de até 100 μg/ml de vitamina K (US4770999).

Para simplificar a purificação de um polipeptídeo expresso, cé- । - lulas podem ser cultivadas em meio isento de soro ou isentos de proteína contendo suplementos adequados. Por razões de estabilidade o fator VIII secretado requer a presença de vWF no meio (US5198349). Também foram 1 ' relatadas a adição de lipoproteínas, fosfolipídios, poliglicóis, traços de me tais, heparina, tensoativos não-iônicos ou ciclodextrina (EP 0254076, US 5679549, US 5198349, US 5250421, US 5576194, EP 0872487, WO 20 94/11525, US 5378612).

O Exemplo 4 - Transfecção de fosfato de cálcio em células 293T para a produção transiente de fatores VIII e IX: Células confluentes 293T i , foram plaqueadas em baixa densidade em placas de 10 cm em 6 ml_ de । DMEM/10 % de FCS (10 μg/mL de vitamina K para FIX) no dia antes da 1 25 transfecção. A transfecção foi realizada grosseiramente de acordo com Chen 1 e Okayama (Mol. Cell Biol., 7:2745 (1987)). 12 μg de plasmideo pTGF8-1 foram transfectados para a produção do fator VIII e pTGFG36 para a produção do fator IX. Seis horas após a transfecção, o meio foi substituído por um novo e o sobrenadante foi colhido três dias após transfecção e quer adicio- 30 nalmente purificado ou quer analisado sem purificação adicional por ELISA ou coagulometria (ver Exemplos 5 e 6). Exemplo 5 - Determinação da concentração de FIX e FVIII por ELISA:

Fator IX: Os níveis de fator IX humano recombinante em sobre- nadante de células 293T transfectadas foi determinado por ELISA utilizando 5 urn FIX policlonal anti-humano de cabra (Enzyme Research Laboratories) como anticorpo de captura. Todas as incubações foram realizadas por duas horas em uma câmara úmida a 22 °C. Placas (Dynex, lmmulon-4) foram revestidas com 100 μL de 8,8 μg de anticorpo/mL de tampão de revestimento. O bloqueio não é requerido sob as condições descritas. A lavagem da placa 10 quatro vezes (Encore 2000, Merck) com PBS-Tween® (0,1 % v/v) é suficiente para bloquear interações não específicas.

Após cada etapa adicional, foi requerida lavagem para eliminar proteínas não ligadas. 100 μL de sobrenadante tratados com 10 μL de PMSF e 10 μL de solução de citrato de sódio 0,11 M foram adicionados a 15 cada depressão. Foram realizadas diluições para amostras e padrão (fator IX humano, padrão próprio, Octapharma) em tampão de diluição (HBS-BSA- EDTA-Tween®) e incubadas a 100 μL por depressão. O anticorpo de detecção foi um antiFix policlonal de cabra peroxidase rotulado (Enzyme Research Laboratories) em uma concentração de 1 μg de anticorpo /mL de tam- 20 pão de diluição e incubado a 100 pL/depressão. Foram adicionados 150 μL de ABTS (Roche) a cada depressão como substrato, e uma reação colori- métrica foi detectada a 405 nm após 1-2 horas. Os resultados foram calculados por regressão linear de concentração padrão versus absorbância padrão e estão sumarizados na tabela que se segue:

Plasma normal: 37 - 39 s Plasma deficiente em fator IX: 137 -140 s Fator VIII: Os níveis de fator VIII humano recombinante em filtrado de cultura de células 293T transfectadas foram determinados por ELISA • • * ∑ 4> «> £ ♦ \ •*4 •**-■» utilizando uma preparação antiFVIII:C policlonal de ovelha, purificada por afinidade (F8C-EIA-C, Affinity Biologicals), como anticorpo de captura. O revestimento foi realizado por duas horas em uma câmara úmida a 22 °C.

Placas (Dynex, lmmulon-4) foram revestidas com 100 μL de uma diluição de 5 100 vezes de anticorpo em tampão de diluição (solução de carbonato de । ' sódio 50 mM, pH 9,6). A lavagem da placa quatro vezes (Encore 2000, Merck) com PBS-Tween® (0,1 % v/v) foi suficiente para bloquear interações não-específicas. Após cada etapa adicional, foi necessário lavagem para eliminar θ 10 proteínas não ligadas. Amostras de filtrado de cultura de 100 μL cada retiradas de clones diferentes 293T estavelmente transfectados com pTGF8-3 após 48 h de incubação foram adicionados a cada depressão. Diluições de padrão FVIII (padrão próprio, Octapharma) foram preparadas em tampão de diluição (HBS-BSA-EDTA-Tween®) e incubados a 100 μL por depressão.

Para detecção, uma diluição pronta para uso de antiFVlll policlonal peroxidase rotulado (F8C-EIA-D, Affinity Biologicals) foi incubada por 60 minutos a 100 μL por depressão. Para reação colorimétrica, um comprimido de 5 mg de O-fenilenodiamina (P-6912, Sigma) foi dissolvido em 12 mL de substrato de tampão imediatamente antes de ser utilizado e completado com 12 μL de H2O2 a 30 %. 150 μL dessa solução de substrato foram adicionados a cada θ depressão e foi realizado o registro colorimétrico em um MRX Reader (Dynex) a 490 nm após 10 minutos de incubação à temperatura ambiente, no escuro, e interrompendo a reação pela adição de 50 μL de solução de i H2SO4 2,5 M a cada depressão. Os resultados foram calculados por regres- são linear de concentrações padrões versus absorbâncias padrão (Figura 7 A) e estão sumarizados na Figura 7 B. । Exemplo 6: Detecção de Fator VIII de Coagulação Humana e Atividade de Fator IX: I A atividade de coagulação do fator VIII humano recombinante em sobrenadantes de cultura de células 293T (transfectadas por precipitação de fosfato de cálcio com pTGF8-1 como descrito no Exemplo 4) foi determinada como segue:

A atividade de coagulação foi analisada com base em uma análise de tempo parcial de tromboplastina utilizando ativação por Cephalin (fosfatidil etanolamina) com um instrumento de coagulação manual (ML-2, Instrumentation Laboratories). Para o estudo, 100 μ.L de sobrenadante não 5 diluído de células 293T transfectadas, 100 pL de plasma deficiente (Progen) e 100 pL de Cephalin (Instrumentation Laboratories) foram incubados por 5 minutos a 37 °C. A coagulação foi iniciada pela adição de 100 pL de CaCI2. O tempo de coagulação de amostra foi comparado ao plasma normal. Os resultados estão sumarizados na Figura 5B. Como pode ser visto da Figura 10 5B, o sobrenadante de células transfectadas com pTGF8-1 mostra uma ati vidade de coagulação comparável ao plasma normal enquanto que células não transfectadas dão um valor equivalente ao plasma com falta do fator VIII.

Uma análise similar foi realizada em relação ao fator IX. Os re- 15 sultados estão mostrados na Tabela do Exemplo 5. Para a dependência de expressão quanto à presença de vitamina K ver Figura 10. Exemplo 7 - Desativação virai: Foi realizada uma desativação virai de acordo com o processo da Patente norte-americana Ne 6.007.979. A saber, a uma solução de pro- 20 teína potencialmente infecciosa foram adicionados os seguintes compostos subsequentemente, com agitação: 1. 0,2 mL de Tween® 80 e 0,06 mL de TNBP foram adicionados a 19,74 mL da solução ou 2. 0,2 mL de Triton® X-100 e 0,2 mL de TNBP foram adicionados a 25 19,6 mL da solução. 1 mL de óleo de rícino foi adicionado às preparações 1 e 2 que foram então intensamente extraídas à temperatura ambiente, por uma hora. Foi realizada centrifugação em cada caso para separação de fases. Para controle de infecciosidade, amostras de 1 mL cada foram repeti- 30 damente tomadas da fração aquosa.

Exemplo 8 - Estabelecimento de linhagens celulares expressando estavelmente o fator VIII e o fator IX: Os vetores preferidos pTGF8-1 e A/ I TP pTGF36 compreendem construções para expressão transiente do fator VII! e fator IX, respectivamente, em células de mamífero. Para permitir um processo de seleção para um clone celular estavelmente transfectado, um cassete para a higromicina - B-fosfotransferase (fragmento Hindlll-Mva 12601 de TK- 5 Hyg, Clontech) foi subclonado no sítio Smal presente em ambos os vetores.

As construções resultantes (pTGF8-1-hyg e pTG36hyg) compreendem então em cis os cassetes de expressão para o fator VIII humano ou fator IX huma- ! no com um promotor CMV e um sinal de poliadenilação SV40 e um cassete I de expressão higromicina - B-fosfotransferase com o promotor timidina HSV cinase e sinal de poliadenilação HSV timidina cinase (ver Figura 4). I

Os vetores pTGF8-2hyg-s e pTGF8-3 (Figura 5, SEQ ID Nes: 12 e 14) são derivados de pTGF8-1hyg, pelo fato de mutações pontuais V162A, S2011N e V2223E (pTGF8-2hyg-s) e S2011N (pTGF8-3) serem revertidos a uma seqüência do tipo silvestre por um processo dependente de PCR utili- 15 zando protocolo QuikChange® (Stratagene).

A seqüência de codificação para os fatores de coagulação pode ser substituído por qualquer outra seqüência escolhida. Essas construções permitem o estabelecimento de linhagens celulares expressando estavelmente por transfecção de fosfato de cálcio e subseqüente seleção para re- 20 sistência a higromicina. Adicionalmente, os plasmídeos contêm um elemento susceptível a progesterona (PRE). Em experimentos de transfecção transiente com pTG36hyg, a produção de cerca de 40 ng de fator IX ativo por mL de meio cultura pode ser mostrado por ELISA e análise coagulométrica (ver Exemplos 5 e 6).

Para a produção do fator IX, células 293T foram cultivadas em DMEM suplementado com 10 % de FCS e 10 μg/mL de vitamina K (Patente norte-americana N9 4.770.999; ver também Figura 10). Primeiramente, foi necessário estabelecer a concentração crítica de antibióticos para uma seleção eficaz de células 293T estavelmente transfectadas. Para essa finalidade, 30 as células foram plaqueadas em baixa diluição e cultivadas na presença de a 800 μg/mL de higromicina B. Após duas semanas a 200 μg/mL ou mais não havia células em crescimento, de modo que essa concentração foi es- colhida para a seleção de células estavelmente transfectadas.

Uma ransfecção típica foi realizada em placas de 10 cm com células 293T clivadas no dia anterior, em uma proporção de 1:15. Utilizando o processo de precipitação de fosfaato de cálcio (Biotechniques 1988 6:7 I 5 632 a 638), 12 μg de plasmídeo por placa foram transfectados e dois dias mais tarde o meio foi substituído com um novo contendo 200 μg/mL de hi- gromicina B. Após 2 a 3 semanas de seleção, o meio foi testado por ELISA (ver Exemplo 5) para a presença do fator VIII ou IX. Clones positivos foram isolados e transferidos a uma placa de 24 depressões. θ 10 Após triagem por ELISA e determinação da atividade, os clones positivos foram submetidos a dois outros rounds de subclonagem e então expandidos e alíquotas das mesmas foram então congeladas para utilização I e caracterização posterior. Exemplo 9: Prova de Uniformidade Fenotípica de células estavelmente 15 transfectadas por Detecção Imunofluorescente In situ da Expressão do Fator yni: I , * Cada 5 x 107 células 293T estavelmente transfectadas com pTGF8-3 (clone 49/19) e células 293T não transfectadas (controle negativo) de culturas de adesão em DMEM + 9,1 % de FBS foram destacadas das 20 placas de cultura portripsinação, lavadas diversas vezes e ressuspensas em 5 mL de tampão PBS. I । 2 μL dessas suspensões de células foram transferidos para lâ- i minas de vidro de microscopia estéreis e incubados à temperatura ambiente I até que todo o líquido se evaporou. As células foram fixadas em 70 % de etanol por 10 minutos e secadas por 5 minutos à temperatura ambiente. As I lâminas foram bloqueadas contra detecção não específica por incubação em । uma diluição a 10 % de FBS em tampão PBS. Anticorpos primários (sh anti- i FVIII:C F8C-EIA-C, Affinity Biologicals) foram diluídos 100 vezes com tam-

I pão PBS contendo 10 % de FBS e 0,1 % de saponina e incubados por 60 minutos à temperatura ambiente em uma câmara úmida de incubação. Após intensa lavagem com PBS, uma diluição de 100 vezes do anticorpo secundário (conjugado rb anti sh CY3 313-165-003, Jackson ImmunoResearch) foi preparada e incubada da maneira descrita acima. Subsequentemente, a preparação microscópica foi intensamente lavada e coberta com uma camada de 50 % de glicerol e um vidro de cobertura. As células foram visualizadas por luz branca e por microscopia de fluorescência (emissão a 570 nm).

Os resultados estão apresentados na Figura 8. Exemplo 10: Teste de estabilidade térmica em fator IX recombinante em filtrado de cultura: Filtrado de cultura colhido de células 293T 48 horas após transfecção transiente com pTGFG36 na presença de 100 μg/mL de vitamina K e armazenado a -80 °C por 7 dias foi rapidamente descongelado, distribuído em alíquotas de 7500 μL que foram então subseqüentemente submetidas às seguintes incubações térmicas:

Amostras foram resfriadas em gelo e a atividade de FIX foi determinada como delineado no Exemplo 6 (determinações duplas). Os resultados estão apresentados na Figura 9. A atividade permaneceu praticamente constante dentro das condições de incubação até 240 minutos a 37 °C.

Claims (20)

1. MUTEÍNA DE FATOR VIII, caracterizado pelo domínio B entre as posições Arg740 e Glu1649 ser substituído por um ligante compreendendo a sequência de aminoácido SFSQNSRH e/ou a sequência de aminoácido QAYRYRRG, em que a numeração do dito fator VIII é relativa à sequência do fator VIII humano mostrado na SEQ ID NO: 2

2. MUTEÍNA DE FATOR VIII, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ao menos uma das seguintes mutações adicionais (a), (b) e (c): (a) Val na posição 162 foi substituído por um resíduo de aminoácido neutro selecionado entre Gly, Ala, Leu, Ile, Met e Pro; (b) estando na posição 2011 é substituído por um resíduo de aminoácido hidrofílico selecionado a partir de Asn, Thr e Gln; (c) Val na posição 2223 foi substituído por um resíduo de aminoácido de natureza ácida selecionado entre Glu e Asp.

3. MUTEÍNA DE FATOR VIII, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por possuir pelo menos uma das mutações (a) e (b).

4. MUTEÍNA DE FATOR VIII, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por possuir todas as três mutações (a), (b) e (c).

5. MUTEÍNA DE FATOR VIII, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado por na mutação (a) Val na posição 162 ter sido substituído por Ala, na mutação (b) Ser na posição 2011 tenha sido substituído por Asn e/ou na mutação (c) Val na posição 2223 tenha sido substituído por Glu.

6. MUTEÍNA DE FATOR VIII, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ligante possuir a sequência SFSQNSRHQAYRYRRG.

7. MUTEÍNA DE FATOR VIII, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender aminoácidos 1 a 1440 de SEQ ID NOs: 4, 13 ou 15.

8. SEQUÊNCIA DE DNA, caracterizado por consistir em nucleotídeos 733 a 5052 de SEQ ID NOs: 3, 12 ou 14.

9. SEQUÊNCIA DE DNA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por possuir pelo menos uma das mutações T485C, G6032A e T6668A em relação à sequência do DNA do fator VIII do tipo selvagem maduro mostrado na SEQ ID NO: 1, preferivelmente a sequência do DNA compreende todas as três mutações.

10. VETOR, caracterizado por ser pTGF8-1, pTGF8- 2hyg-s ou pTGF8-3, conforme apresentado na SEQ ID NOs: 3, 12 e 14, respectivamente.

11. VETOR, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ser um vetor de transferência de gene.

12. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DA MUTEÍNA DE FATOR VIII, a partir da muteína finalizada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por incluir: (a) cultivo de uma célula hospedeira que é transformada com um vetor, conforme definido na reivindicação 10, e (b) isolar a muteína do fator VIII do caldo de cultura.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender a muteína do fator VIII, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou um vetor de transferência de gene, como definido na reivindicação 11.

14. USO DA MUTEÍNA DO FATOR VIII, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou um vetor de transferência de gene, conforme definido na reivindicação 10, caracterizada por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de hemofilia, preferivelmente tratamento de hemofilia A.

15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por compreender: (a) a cultura de uma linhagem celular humana imortalizada expressando antígeno Simiano de vírus T e carregando um vetor tendo um promotor CMV funcionalmente ligado a uma sequência de DNA codificando para a muteína de fator VIII.

16. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela linhagem celular humana imortalizada ser uma célula imortalizada de rim, bexiga, fígado, pulmão, músculo cardíaco, músculo liso, ovário ou gastrointestinal.

17. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela linhagem celular humana imortalizada ser derivada de uma célula de rim humano e preferivelmente ser uma linhagem celular 293T (DSM ACC2494).

18. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo vetor compreender adicionalmente um marcador de seleção e/ou sequências reguladoras.

19. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pela cultura ser realizada na presença do Fator von Willebrand (vWF).

20. PROCESSO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizado por compreender adicionalmente: (c) purificar o fator de coagulação do sangue isolado 5 na etapa (b), e/ou (d) submeter o fator de coagulação do sangue isolado na etapa (b) ou purificado na etapa (c) a um tratamento de desativação de vírus.

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