JP2017114889A - 再構成後の精製第ｖｉｉｉ因子の安定性を改善するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】精製、凍結乾燥及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法の提供。【解決手段】出血性障害の処置又は予防における使用のための、安定化単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤であって、安定化単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、その単鎖のＡｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ因子分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化された改変ＦＶＩＩＩ因子分子からなり、ここで、前記不活性化によって安定化単鎖第ＶＩＩＩ因子分子のインビトロ及びインビボ安定性がヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して増加されていることを特徴とする上記医薬製剤。【選択図】なし

Description

本発明は、精製、凍結乾燥、及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、該方法は、第ＶＩＩＩ因子分子の製造全体を通して、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。本発明はさらに、静脈内及び非静脈内注射後の第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティを改善するための方法に関する。

発明の背景
古典的血友病又は血友病Ａは遺伝性の出血性障害である。これは染色体Ｘ連鎖性血液凝固第ＶＩＩＩ因子欠損から生じ、そして１０，０００人あたり１人と２人との間の発生率でほとんど男性のみに影響を及ぼす。Ｘ染色体欠損は、それら自体血友病ではない女性キャリアにより伝達される。血友病Ａの臨床症状は増加した出血傾向である。第ＶＩＩＩ因子濃縮物での処置が導入される以前は、重篤な血友病を有する人物の平均寿命は２０年未満であった。血漿由来の第ＶＩＩＩ因子濃縮物の使用は、平均寿命を広く増加させて血友病患者の状況をかなり改善し、かれらの大部分に事実上通常の生活を送る可能性を与えてきた。しかし、血漿由来濃縮物及びそれらの使用に伴う特定の問題があり、それらのうち最も深刻なものはウイルスの伝染であった。これまでに、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、及び非Ａ型非Ｂ型肝炎を引き起こすウイルスがその集団に深刻な被害を与えた。それ以来、近年、様々なウイルス不活化方法及び新しい高度に精製された第ＶＩＩＩ因子濃縮物が開発され、それにより血漿由来第ＶＩＩＩ因子に関して非常に高い安全基準も確立されてきた。

いくつかの組み換え及び血漿由来の治療用ポリペプチド、例えば血液凝固因子がヒトにおける治療的及び予防的使用のために市販されている。ＦＶＩＩＩは、哺乳動物の肝臓において産生される、分子量約２８０ｋＤａの血漿糖タンパク質である。これは、血液凝固に至る凝固反応カスケードの重要な構成要素である。このカスケード内には、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）が、活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）と連動して、第Ｘ因子（ＦＸ）を活性化形態ＦＸａへと変換する段階がある。ＦＶＩＩＩａはこの段階において補因子として作用し、カルシウムイオン及びリン脂質と共に、ＦＩＸａの活性を最大化するために必要とされる。

血友病Ａの処置における重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩの完全２，３５１アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡクローンの単離（特許文献１）並びにヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列及びその産生のための組み換え方法の提供であった。

第ＶＩＩＩ因子は、約２８０ｋＤａの分子量を有する単一ポリペプチド鎖として合成される。アミノ末端シグナルペプチドは第ＶＩＩＩ因子の小胞体へのトランスロケーションの際に除去され、次いで成熟（すなわち、シグナルペプチドの切断後）天然第ＶＩＩＩ因子分子は、その分泌の過程でアミノ酸残基１３１３及び１６４８の後でタンパク質分解的に切断される。これにより、約１６０〜２００ｋＤａのＮ末端重鎖フラグメントと金属イオン依存性会合している約８０ｋＤａのＣ末端軽鎖からなるヘテロダイマーの放出が生じる（Ｋａｕｆｍａｎによる概説、非特許文献１を参照のこと）。

このヘテロダイマーの生理的活性化は、トロンビンによるタンパク質鎖のタンパク質分解切断により起こる。トロンビンは重鎖を切断して９０ｋＤａのタンパク質にし、次いで５４ｋＤａ及び４４ｋＤａのフラグメントにする。トロンビンはまた、８０ｋＤａ軽鎖を
切断して７２ｋＤａのタンパク質にする。活性ＦＶＩＩＩを構成するのは、カルシウムイオンにより一緒に結合される、後者のタンパク質、及び２つの重鎖フラグメント（上記の５４ｋＤａ及び４４ｋＤａ）である。不活化は、４４ｋＤａ Ａ２重鎖フラグメントが分子から解離した場合、又は７２ｋＤａ及び５４ｋＤａのタンパク質がトロンビン、活性化タンパク質Ｃ若しくはＦＸａによりさらに切断された場合に起こる。血漿中では、ＦＶＩＩＩは５０倍モル過剰のＶＷＦタンパク質（「ＶＷＦ」）との会合により安定化され、これが上記のようなＦＶＩＩＩのタンパク質分解的破壊を阻害するようである。

ＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、３つの構造ドメイン：３３０アミノ酸の三つ組のＡドメイン、９８０アミノ酸の単一のＢドメイン、及び１５０アミノ酸の二つ組のＣドメインに体系付けられる。Ｂドメインは他のタンパク質に対する相同性を有しておらず、そしてこのタンパク質の２５の可能性のあるアスパラギン（Ｎ）−連結グリコシル化部位のうちの１８を提供する。Ｂドメインは凝固において機能を有していないようであり、なお凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒｙ）活性を有するＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子を用いて除去され得る。

販売されている第ＶＩＩＩ因子製品は、現在は組み換え技術により製造されるか又はプールされた血漿から精製された第ＶＩＩＩ因子の凍結乾燥製剤として提供される。凍結乾燥製品は投与の前に再構成される。一旦再構成されると、第ＶＩＩＩ因子の貯蔵寿命は比較的短い。第ＶＩＩＩ因子は特に水溶液中で比較的不安定なタンパク質である。他の血漿タンパク質、特にフォン・ビルブランド因子（ｖＷＦ）及びアルブミンとの複合体化による製造及び貯蔵の間の安定化が記載さている。例えば、特許文献２を参照のこと。特許文献３は、アミノ酸若しくはその塩のうちの１つ又はホモログ及び界面活性剤又はポリエチレングリコールのような有機ポリマーを含む第ＶＩＩＩ因子の安定化製剤を開示する。特許文献４は、塩化カルシウム及び高濃度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムの存在下でのヒスチジン緩衝液に基づく高イオン強度媒体中の第ＶＩＩＩ因子の安定化製剤を開示する。このような組成物は、再構成後の水性形態での第ＶＩＩＩ因子の安定性を有意に改善することが示された。第ＶＩＩＩ因子の製剤におけるカルシウムイオンの重要性は一般的に認識されている。特許文献５によれば、場合によりＣａ²⁺イオン又はＭｎ²⁺イオンの存在下での他の二価カチオン、すなわちＣｕ²⁺及びＺｎ²⁺の存在は、第ＶＩＩＩ因子の安定性を改善する。また、特許文献６は、様々な添加剤を含む安定な水性第ＶＩＩＩ因子組成物を記載する。

米国特許第４，７５７，００６号 米国特許第６，２２８，６１３号 米国特許第５，５６５，４２７号 米国特許第５，６０５，８８４号 米国特許第６，５９９，７２４号 ＷＯ ２０１１／０２７１５２ Ａ１

Ｋａｕｆｍａｎ，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄ．Ｒｅｖｓ．６：２３５ （１９９２）

凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）の再構成後の第ＶＩＩＩ因子の短い貯蔵寿命を考慮すると、水溶液で再構成された第ＶＩＩＩ因子の安定性を増大させるための方法の
必要性がある。液相で増大した安定性を有する精製ＦＶＩＩＩ製剤を提供することが様々な理由のために望ましい。まず第一に、精製ＦＶＩＩＩ製品を周囲温度にて製造することを支持するために、周囲温度で十分な期間を有することは有利である。特に、充填工程は、製造における柔軟性を増大させるために液体バルクのいくらかの貯蔵を必要とする。第二に、液体の精製ＦＶＩＩＩの増大した安定性は、その製品が再構成後にそのまま適用できない場合に医師及び患者にとって有益だろう。そして最後に、持続注入条件下での、例えば、入院患者における手術の際の、ＦＶＩＩＩの使用は、再構成後の好ましくは高い製品安定性に依存している（Ｔａｋｅｄａｎｉ Ｈ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２０１０，１６：７４０−７４６）。増大した安定性を有するＦＶＩＩＩ分子はまた、液体条件下での長期貯蔵に適したＦＶＩＩＩ製剤の開発のために有利だろう。

本出願の発明者らは、驚くべきことに、凍結乾燥物の再構成後の精製第ＶＩＩＩ因子の安定性が、単鎖第ＶＩＩＩ因子構築物において大幅に増強されるということを見出した。このような構築物は、第ＶＩＩＩ因子の分泌の前にゴルジ体領域において典型的に生じるタンパク質分解切断を防止することにより得ることができる。単鎖構築物は、精製後の溶液でのより良い安定性、及び／又は皮下投与の際のより良いバイオアベイラビリティを示す。

発明の要旨
第一の局面において、本発明は、精製、凍結乾燥及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、この方法は、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント、並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。

第一の局面は、精製、凍結乾燥、及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させる方法を包含し、この方法は、第ＶＩＩＩ因子分子の製造全体を通して、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント、並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。

第一の局面はさらに、精製、凍結乾燥、及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させる方法を包含し、この方法は、第ＶＩＩＩ因子分子の精製の前に、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント、並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。

本発明に従うこれらの方法に関して、用語「第ＶＩＩＩ因子分子の製造全体を通して」及び「第ＶＩＩＩ因子分子の精製の前に」は、本発明の方法が、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子の切断を防止するが、本発明の方法は、再構成された第ＶＩＩＩ因子分子の投与の後に起こり得る第ＶＩＩＩ因子の活性化切断を防止しないということを意味することを意図される。本発明の方法により生成された第ＶＩＩＩ因子分子は、Ａｒｇ３７２、Ａｒｇ７４０及びＡｒｇ１６８９の後ろで第ＶＩＩＩ因子分子を切断するトロンビンによりなお活性化され得る。

第二の局面において、本発明は、精製、凍結乾燥及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、該方法は、該第ＶＩＩＩ因子分子の分泌の間に、シグナル配列と成熟第ＶＩＩＩ因子との間の切断部位を除く第ＶＩＩＩ因子分子を発現
する宿主細胞により切断されるタンパク質分解切断を不活化することを含む。典型的には、宿主細胞により発現されそして分泌される第ＶＩＩＩ因子分子の少なくとも５０％が単鎖第ＶＩＩＩ因子分子である。好ましくは、宿主細胞により発現され、そして分泌される第ＶＩＩＩ因子分子の少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が単鎖第ＶＩＩＩ因子分子である。

好ましくは、本方法は、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む。タンパク質分解切断部位の不活化は、プロテアーゼ認識配列の１つ又はそれ以上の残基を除去することにより達成され得る。例えば、不活化工程は、第ＶＩＩＩ因子配列から少なくともＡｒｇ１６４８を除去することを含み得る。一実施態様において、不活化工程は、少なくともＡｒｇ１３１３〜Ａｒｇ１６４８のアミノ酸配列を第ＶＩＩＩ因子配列から除去することを含む。

本発明の第一の局面の別の実施態様において、タンパク質分解切断部位の不活化は、プロテアーゼ認識配列を形成する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基を置き換えることにより達成される。

さらに別の実施態様において（Ａｒｇ１３１３を含むＢドメインの部分を保持しているＦＶＩＩＩ変異形に関して）、本方法は、Ａｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を、プロテアーゼ認識配列を形成する１つ又はそれ以上のの残基の除去又は置換により不活化することをさらに含む。特に好ましい実施態様において、本方法は、残基Ａｒｇ１３１３及びＡｒｇ１６４８の後ろの両方のプロテアーゼ切断部位を含む第ＶＩＩＩ因子アミノ酸配列からの少なくとも一部を除去することを含む。

第ＶＩＩＩ因子配列の位置７４１〜１６４７におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子配列の位置１６４９〜１６９０におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸に融合されており、それによりＡｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位が不活化されることがさらに好ましい。

別の好ましい実施態様において、本発明の第一又は第二の局面に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、水溶液において増大した安定性を示す。２５℃で７日間の貯蔵後の、水溶液中の改変された第ＶＩＩＩ因子分子の活性の損失は、好ましくは１５％未満である。

別の好ましい実施態様において、本発明の第一又は第二の局面に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、再構成後に水溶液中で増大した安定性を示す。

さらに別の好ましい実施態様において、本発明の第一又は第二の局面に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティと比較して、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、非静脈内注射後に増加したバイオアベイラビリティを示す。さらに別の好ましい実施態様において、本発明の第一又は第二の局面に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、同じ用量及び同じ方法で投与された、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティと比較して、非静脈内注射後に増加したバイオアベイラビリティを示す。改変されたＦＶＩＩＩのバイオアベイラビリティは、好ましくは、それぞれ同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティ、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分
子のバイオアベイラビリティと比較して、少なくとも２５％増加する。別の好ましい実施態様において、非静脈内注射は皮下、経皮又は筋内注射である。

別の好ましい実施態様は、（ｉ）第ＶＩＩＩ因子が、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して静脈内投与後に改善された血漿半減期を示し；好ましくはこの血漿半減期はヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも４０％改善され、又は（ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子は、血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合に、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、トロンビンピークレベルが静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでより長い期間を示し；好ましくはこの期間はヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも１０時間延長され、又は（ｉｉｉ）第ＶＩＩＩ因子は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後に一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合により高い活性を保持し；好ましくは第ＶＩＩＩ因子のこの保持された活性は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後にヒト野生型第ＶＩＩＩ因子の活性と比較して少なくとも１０％高い、方法である。

本方法はさらに、
（ｉ）Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位が不活化されている改変第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を提供する工程、
（ｉｉ）宿主細胞を該核酸で形質転換する工程、
（ｉｉｉ）形質転換された宿主細胞を、改変第ＶＩＩＩ因子分子が発現されるような条件下で培養する工程、
（ｉｖ）宿主細胞から、又は細胞培養培地から、改変第ＶＩＩＩ因子分子を回収する工程
を含み得る。

別の局面において、本発明は、非静脈内投与後の第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティを改善するための方法に関し、この方法は、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む。好ましくは、非静脈内注射は皮下注射である。皮下注射後のバイオアベイラビリティは、それぞれ同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティ、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティと比較して、少なくとも２５％増加する。

別の局面において、本発明は、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、静脈内投与後の第ＶＩＩＩ因子分子の血漿半減期を改善するための方法に関し、この方法は、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む。

別の局面において、本発明は、血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合のトロンビンピークレベルが、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、第ＶＩＩＩ因子分子の静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでの期間を延長するための方法に関し、この方法は、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む。

別の局面において、本発明は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後
のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後の一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合に第ＶＩＩＩ因子分子についてより高い活性を保持するための方法に関し、この方法は、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む。

上記の本方法の好ましい実施態様は、第ＶＩＩＩ因子配列の位置７４１〜１６４７におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子配列の位置１６４９〜１６９０におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸と融合され、それにより、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位が不活化される方法である。

異なる局面の好ましい実施態様は、変更すべきところは変更して適用可能である。

さらに別の局面において、本発明は、出血性障害、好ましくは血友病Ａの処置又は予防における使用のための、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤に関し、該処置又は予防は、（ｉ）一方では、非静脈内投与、［ここで
該単鎖第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティは、同じ用量及び同じ方法で投与される、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、少なくとも２５％増加する］又は（ｉｉ）他方では、静脈内投与、［ここで（ａ）該単鎖第ＶＩＩＩ因子分子の静脈内投与後の血漿半減期は、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも４０％増加するか、又は（ｂ）単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定されたトロンビンピークレベルが、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでに、少なくとも１０時間延長された期間を示す］によるものである。

さらに別の局面において、本発明は、出血性障害、好ましくは血友病Ａの処置又は予防における使用のための、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤に関し、ここで単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後に、一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合に少なくとも１０％高い活性を保持する。

さらに別の局面において、本発明は、非静脈内投与による、出血性障害、好ましくは血友病Ａの処置又は予防における使用のための、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬液剤に関し、ここで同じ用量及び同じ方法で投与された、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子の用量と比較して、血液における同じ止血活性を達成するために、該ＦＶＩＩＩ分子の用量は少なくとも２５％減少され得る。

別の局面において、本発明は、出血性障害を処置するための医薬製剤の再構成後の増大した安定性又はより長い貯蔵寿命を達成するための単鎖第ＶＩＩＩ因子分子の使用に関し、ここで（ｉ）再構成及び再構成後７日間室温での貯蔵の後の、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤の第ＶＩＩＩ因子活性は、同じ量の、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤の第ＶＩＩＩ因子活性と比較して少なくとも１０％高いか、又は（ｉｉ）単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、ヒト血漿中で３７℃にて同じ濃度で４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた場合に一段階ＦＶＩＩＩ：
Ｃアッセイにより決定された場合少なくとも１０％高い活性を保持する。

図１は実施例１の結果を示す。様々な第ＶＩＩＩ因子分子が水溶液として提供され、そしてそれらの安定性を７日間の期間にわたってモニタリングした。７日間の貯蔵後の活性の損失は、ヘテロダイマー（二本鎖）全長第ＶＩＩＩ因子分子（Ｂｅｒｉａｔｅ^(R)及びＨｅｌｉｘａｔｅ^(R)）と、及びヘテロダイマー（二本鎖）Ｂドメイン欠失構築物（ＲｅＦａｃｔｏ^(R)）と比較して、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子についてかなり少なかった。 図２は実施例２の結果を示す。様々な凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子製剤を水溶液に再構成し、そしてそれらの安定性を７日間の期間にわたってモニタリングした。７日間の貯蔵後の活性の損失は、ヘテロダイマー（二本鎖）全長第ＶＩＩＩ因子分子（Ａｄｖａｔｅ^(R)）と、及びヘテロダイマー（二本鎖）かつＢドメイン欠失の構築物（ＲｅＦａｃｔｏ^(R)）と比較して、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子についてかなり少なかった。 図３は実施例３の結果を示す。３つの異なる第ＶＩＩＩ因子分子をマウスにおいて皮下注射し、そしてそれらのバイオアベイラビリティを実施例２に記載されるように決定した。単鎖第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティは、二本鎖でかつ全長の第ＶＩＩＩ因子（Ａｄｖａｔｅ^(R)）又はヘテロダイマー（二本鎖）Ｂドメイン欠失構築物（ＲｅＦａｃｔｏ^(R)）のバイオアベイラビリティより実質的に高かった。 図４は実施例４の結果を示す。本発明の第ＶＩＩＩ因子分子及び２つの市販のＦＶＩＩＩ製剤を、精製、凍結乾燥及び再構成の後に３７℃でインキュベートした。ＦＶＩＩＩサンプルを様々な期間（０、０．２５、１、２、４及び８日）の間３７℃にてインキュベートし、そしてＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を一段階凝固アッセイにより決定した。示される値は２つのサンプルの平均及び標準偏差を示す（０．２５日の１つのサンプルのみは除く）。 図５は実施例５の結果の一部を示す。ｓｃＦＶＩＩＩ及び全長ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の薬物動態（ＰＫ）プロフィールを、カニクイザルへの２５０ＩＵ／ｋｇの用量での単回静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射後に決定した。 図６は実施例５の結果の一部を示す。全長ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の薬物動態（ＰＫ）プロフィールを、血友病Ａマウスへの１００ＩＵ／ｋｇの用量での単回静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射後に決定した。 図７は実施例６の結果の一部を示す。１〜８日目からの平均ピークトロンビンレベルを、ｓｃＦＶＩＩＩ又は全長ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を血友病Ａマウスに２５０ＩＵ／ｋｇで投与した後に決定した。 図８は実施例７の結果を示す。全長ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＲｅＦａｃｔｏ^(R)、Ｐｆｉｚｅｒ）の薬物動態（ＰＫ）プロフィールを、ＶＷＦ欠失マウスへの１００ＩＵ／ｋｇの用量での単回静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射後に決定した。

詳細な説明
本発明は、精製、凍結乾燥、及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、この方法は、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント、及び本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。

本発明はさらに、精製、凍結乾燥及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法に関し、この方法は、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位を不活化すること、及び第ＶＩＩＩ因子分子中に存在する場合は、Ａｒ
ｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を場合により不活化することを含む。

第ＶＩＩＩ因子
用語「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」は本明細書において交換可能に使用される。成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子は、以下のドメイン構造で配置された２３３２のアミノ酸からなる：

さらに、３つの酸性領域ａ１（３３７〜３７２）、ａ２（７１１〜７４０）、及びａ３（１６４９〜１６８９）がある。酸性領域ａ３は、血液凝固において重要な役割を果たすフォン・ビルブランド因子（ｖＷＦ）への第ＶＩＩＩ因子分子の結合に関与することが知られている。分泌の間に、ＦＶＩＩＩはＢドメインとａ３酸性領域との間で切断され、ヘテロダイマーポリペプチドを生じる。第ＶＩＩＩ因子ヘテロダイマーは、軽鎖（Ａ３、Ｃ１及びＣ２を含む）及びサイズ可変重鎖（Ａ１、Ａ２及びＢを含む）からなる。後者はＢドメイン内の限定されたタンパク質分解に起因して異質である。ヘテロダイマーＢドメイン欠失構築物の場合、「重鎖」はＡ１及びＡ２を含むがＢドメインの一部又は全てを欠いている。

ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の成熟野生型形態のアミノ酸配列を配列番号２に示す。特定の配列のアミノ酸位置への言及は、ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質におけるそのアミノ酸の位置を意味し、かつ言及される配列における他の位置での変異、例えば欠失、挿入及び／又は置換の存在を排除しない。例えば、配列番号２に言及して「Ｇｌｕ２００４」における変異は、改変されたホモログにおいて配列番号２の位置１から２３３２までの１つ又はそれ以上のアミノ酸が欠失していることを排除しない。配列番号２をコードするＤＮＡ配列を配列番号１に示す。

「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」は、野生型血液凝固第ＶＩＩＩ因子、さらには野生型血液凝固第ＶＩＩＩ因子の凝固促進（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性を有する野生型血液凝固第ＶＩＩＩ因子の誘導体も含む。誘導体は、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列と比較して、欠失、挿入及び／又は付加を有し得る。好ましい誘導体は、Ｂドメインの全て又は一部が除去されているＦＶＩＩＩ分子である。この出願全体を通して示されるアミノ酸位置は、常に全長成熟（すなわち、シグナルペプチド切断後）野生型ＦＶＩＩＩにおけるそれぞれのアミノ酸の位置を指す。

用語「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性の少なくとも１０％
、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を有するいずれかの第ＶＩＩＩ因子変異形（ｖａｒｉａｎｔｓ）又は変異体（ｍｕｔａｎｔｓ）を含む。第ＶＩＩＩ因子の生物学的活性を決定するための適切な試験は、一段階若しくは二段階凝固アッセイ（Ｒｉｚｚａ ｅｔ ａｌ．１９８２．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｏｆ ＦＶＩＩＩ：Ｃ ａｎｄ ＦＩＸａ ｉｎ Ｂｌｏｏｍ ｅｄ．Ｔｈｅ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｓ．ＮＹ Ｃｈｕｒｃｈｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ １９９２）又は発色性基質ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ（Ｓ．Ｒｏｓｅｎ，１９８４．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ３３：１３９−１４５，ｓｕｐｐｌ．）である。これらの参考文献の内容は参照により本明細書に加入される。

非限定的な例として、第ＶＩＩＩ因子分子は、ＡＰＣ切断を防止若しくは減少させる第ＶＩＩＩ因子変異体（Ａｍａｎｏ １９９８．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：５５７−５６３）、アルブミン融合ＦＶＩＩＩ分子（ＷＯ ２０１１／０２０８６６ Ａ２）、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合分子（ＷＯ０４／１０１７４０Ａ）、Ａ２ドメインをさらに安定化する第ＶＩＩＩ因子変異体（ＷＯ ９７／４０１４５）、増加した発現を生じるＦＶＩＩＩ変異体（Ｓｗａｒｏｏｐ ｅｔ ａｌ．１９９７．ＪＢＣ ２７２：２４１２１−２４１２４）、減少した免疫原性を有する第ＶＩＩＩ因子変異体（Ｌｏｌｌａｒ １９９９．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２：５０５−５０８），異なって発現された重鎖及び軽鎖から再構成されたＦＶＩＩＩ（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．１９９９．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．３１：９５−１００）、ＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）及び／若しくはＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質）のようなＦＶＩＩＩの異化をもたらす受容体への結合を減少させるＦＶＩＩＩ変異体（Ａｎａｎｙｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００１．ＴＣＭ，１１：２５１−２５７）、ジスルフィド結合安定化ＦＶＩＩＩ変異形（Ｇａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．４：１３１５−１３２２）、改善された分泌特性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｂｌｏｏｄ １０３：３４１２−３４１９）、増加した補因子特異的活性を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４：１０２９８−３０４）、改善された生合成及び分泌、減少したＥＲシャペロン相互作用、改善されたＥＲ−ゴルジ輸送、増加した活性化若しくは不活化への抵抗性及び改善された半減期を有するＦＶＩＩＩ変異体（Ｐｉｐｅ ２００４．Ｓｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．３０：２２７−２３７により要約される）、並びにＢドメインの全て又は一部の欠失を有するＦＶＩＩＩ変異体（例えば、ＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１、ＷＯ０２／１０２８５０Ａ２、ＷＯ００／２４７５９Ａ１及び米国特許第４，８６８，１１２号を参照のこと）を含む。これらの第ＶＩＩＩ因子変異体及び変異形は参照によりそれら全体として本明細書に加入される。

用語「単鎖第ＶＩＩＩ因子」は、そのＦＶＩＩＩ分子を発現する細胞からの分泌の間に２つの鎖（例えば、重鎖及び軽鎖）にタンパク質分解的に切断されておらず、かつ従って単一ポリペプチド鎖として存在する第ＶＩＩＩ因子分子を指す。

切断の防止
本発明の方法は、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む。用語「タンパク質分解切断を防止すること」は、部分的にタンパク質分解切断を防止すること、及び完全にタンパク質分解切断を防止することを含む。これはさらに、実施態様「タンパク質分解切断を減少させること」を含む。換言すると、「第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止すること」は、宿主細胞により発現及び分泌される第ＶＩＩＩ因子分子の実質的に１００％が単鎖分子であるように完全にいずれのタンパク質分解切断も廃止すること（この実施態様は本発明の方法により包含されるが）を必要としない。通常は、第ＶＩＩＩ因子
分子のタンパク質分解切断は、宿主細胞により発現及び分泌された第ＶＩＩＩ因子分子の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が単鎖分子であるような方法で防止される。切断の不完全な防止は、たとえ主な切断部位（Ｒ１３１３及びＲ１６４８におけるもの）が存在しなくとも、第ＶＩＩＩ因子分子のごく一部のタンパク質分解切断をもたらし得るＢドメイン内のいくつかの少数の切断部位が存在し得るという事実に少なくとも部分的に起因し得る。この少数の切断は本発明に従って防止されるかもしれないし、されないかもしれない。

第一のフラグメントは、本質的に第ＶＩＩＩ因子のＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む。第一のフラグメントはＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含み得、各ドメインは厳密に、上に示されるアミノ酸配列を有する。例えば、第一のフラグメントは配列番号２のアミノ酸配列の少なくともアミノ酸１〜７４０を含み得る。あるいは、第一のフラグメントは、第ＶＩＩＩ因子活性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸の欠失、置換及び／又は挿入を有するこの配列の変異形を含み得る。第一のフラグメントは、第ＶＩＩＩ因子のＢドメインのＮ末端部分をさらに含み得る。

第二のフラグメントは、本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む。第二のフラグメントはＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含み得、各ドメインは厳密に、上に示されるアミノ酸配列を有する。例えば、第二のフラグメントは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくともアミノ酸１６９０〜２３３２を含み得る。あるいは、第二のフラグメントは、第ＶＩＩＩ因子活性に実質的に影響を及ぼさないアミノ酸の欠失、置換及び／又は挿入を有するこの配列の変異形を含み得る。第二のフラグメントは、酸性ａ３領域のＣ末端部分をさらに含み得る。

本発明の方法は、組み換えにより発現されたＦＶＩＩＩ分子の分泌の間の、ヘテロダイマー（二本鎖）ポリペプチドを生じるであろうタンパク質分解切断を防止することを含む。すなわち、この方法は単鎖第ＶＩＩＩＩ因子分子を得ることを含む。これは様々な方法で、例えば、最終的に宿主細胞により分泌されるヘテロダイマーＦＶＩＩＩへの成熟一本鎖ＦＶＩＩＩの細胞内プロセシングに関与するタンパク質分解切断部位を不活化することにより達成され得る。

一実施態様において、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位を不活化する工程は、プロテアーゼ認識配列を形成する１つ又はそれ以上のアミノ酸を除去することを含む。残基１６４８の後ろの切断部位はフューリン型切断部位である。第ＶＩＩＩ因子配列におけるプロテアーゼの認識配列はＬＫＲＨＱＲである。好ましくは、不活化工程は、認識配列を形成するこれらのアミノ酸残基の１、２、３、４、５又はそれ以上を除去することを含む。好ましくは、不活化工程は、認識配列内の少なくとも１つの塩基性アミノ酸を除去することを含み、より好ましくは、不活化工程は少なくとも、位置１６４８におけるアルギニンを除去することを含む。なおより好ましくは、不活化工程は、第ＶＩＩＩ因子配列の少なくともアミノ酸１６４３〜１６４８を除去することを含む。それぞれのＦＶＩＩＩ誘導体がＡｒｇ１３１３を含む場合、不活化工程はまた、少なくとも位置Ａｒｇ１３１３におけるアルギニンを除去することも含む。第ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸１３１３〜１６４８を少なくとも除去して１３１３及び１６４８の後ろの両方の切断部位をそれぞれ不活化することはなお好ましい。

最も好ましくは、不活化工程は、第ＶＩＩＩ因子配列から残基８００〜１６４８からのアミノ酸配列、例えば第ＶＩＩＩ因子配列から残基７４１〜１６４８からのアミノ酸配列を少なくとも除去することを含む。別の好ましい実施態様において、第ＶＩＩＩ因子配列の位置７４１〜１６４７におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸は、第ＶＩＩＩ
因子配列の位置１６４９〜１６９０におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸と融合され、それにより分泌の間のタンパク質分解切断が防止される。好ましい除去は以下のとおりである：
− アミノ酸７４０がアミノ酸１６５０に融合され、それによりアミノ酸７４１〜１６４９が除去される；
− アミノ酸７４０がアミノ酸１６９０に融合され、それによりアミノ酸７４１〜１６８９が除去される；
− アミノ酸７４０がアミノ酸１６６９に融合され、それによりアミノ酸７４１〜１６６８が除去される；
− アミノ酸７４３がアミノ酸１６５０に融合され、それによりアミノ酸７４４〜１６４９が除去される；
− アミノ酸７６４がアミノ酸１６５０に融合され、それによりアミノ酸７６５〜１６４９が除去される；
− アミノ酸７６４がアミノ酸１６５３に融合され、それによりアミノ酸７６５〜１６５２が除去される；
− アミノ酸７６４がアミノ酸１６５６に融合され、それによりアミノ酸７６５〜１６５５が除去される；
− アミノ酸７４５がアミノ酸１６５０に融合され、それによりアミノ酸７４６〜１６４９が除去される；
− アミノ酸７４５がアミノ酸１６５３に融合され、それによりアミノ酸７４６〜１６５２が除去される；
− アミノ酸７４５がアミノ酸１６５６に融合され、それによりアミノ酸７４６〜１６５５が除去される；
− アミノ酸７５７がアミノ酸１６５０に融合され、それによりアミノ酸７５８〜１６４９が除去される；
− アミノ酸７５７がアミノ酸１６５３に融合され、それによりアミノ酸７５８〜１６５２が除去される；
− アミノ酸７５７がアミノ酸１６５６に融合され、それによりアミノ酸７５８〜１６５５が除去される；
− アミノ酸７９３がアミノ酸１６４９に融合され、それによりアミノ酸７９４〜１６４８が除去される；
− アミノ酸７９３がアミノ酸１６９０に融合され、それによりアミノ酸７９４〜１６８９が除去される；
− アミノ酸７４７がアミノ酸１６４９に融合され、それによりアミノ酸７４８〜１６４８が除去される；
− アミノ酸７５１がアミノ酸１６４９に融合され、それによりアミノ酸７５２〜１６４８が除去される；
− アミノ酸７７６がアミノ酸１６４９に融合され、それによりアミノ酸７７７〜１６４８が除去される；
− アミノ酸７７０がアミノ酸１６６７に融合され、それによりアミノ酸７７１〜１６６６が除去される。

除去により生じた分子は通常、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子の形態で得られる。

好ましい単鎖ＦＶＩＩＩ分子は、Ａｒｇ１６４８における切断部位（これは通常、分泌の間に切断される）が除去されるように、Ｂドメインの全て又は一部の欠失、及び酸性ａ３領域の全て又は一部の欠失を有する。単鎖ＦＶＩＩＩ分子は、例えばＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１；ＵＳ２００２／１３２３０６ Ａ１；Ｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌ．１９５，ｎｏ．３，ｐａｇｅｓ ６３７−６４４；Ｈｅｒｌｉｔｓｃｈｋａ ｅ
ｔ ａｌ．（１９９８） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６１，ｎｏ．３，ｐａｇｅｓ １６５−１７３；Ｄｏｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，ｖｏｌ．３１２，ｐａｇｅｓ ４９−５５において開示される。これらの参考文献に記載されるこれらの単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は本明細書に参照により加入される。

上で言及される融合は、直接的融合でも間接的融合でもよい。後者の場合、除去されたアミノ酸は異種スペーサーにより置き換えられる。この実施態様は本明細書以後でより詳細に記載される。除去されたアミノ酸は、約１〜約５００アミノ酸、又は約２〜２５０アミノ酸、又は約３〜約１００アミノ酸、又は約４〜約５０アミノ酸、又は約５〜約１０アミノ酸からなるペプチドリンカーで置き換えられることが可能である。ペプチドリンカーは、可撓性で、かつ非免疫原性であるべきである（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．；ＰＮＡＳ （１９９８），Ｖｏｌ ９５，ｐ５９２９）。ペプチドリンカーは、Ｇｌｙと、そのＧｌｙに対してＮ末端側に先行するアミノ酸配列ＧｌｙＧｌｙＳｅｒ若しくはＧｌｙＧｌｙＳｅｒＳｅｒ又はそれらの組み合わせのマルチマーとからなるものであり得、特定の実施態様ではペプチドリンカーは８０〜１２０のアミノ酸からなる。

代替の実施態様において、残基１３１３及び１６４８においてプロテアーゼ認識部位を形成する１つ又はそれ以上のアミノ酸は、切断が起きないように別のアミノ酸と置換され得る。例えば、塩基性アミノ酸は疎水性アミノ酸で置き換えられ得る。

単鎖第ＶＩＩＩ因子の製造
「タンパク質分解切断を防止する」工程又は「タンパク質分解切断部位を不活化する」工程は、第ＶＩＩＩ因子の精製、凍結乾燥及び再構成の前に行われる。「タンパク質分解切断を防止する」工程又は「タンパク質分解切断部位を不活化する」工程は、典型的には第ＶＩＩＩ因子分子の製造の間に行われる。本発明の方法は、（宿主細胞における）第ＶＩＩＩ因子分子の発現の間にタンパク質分解切断を防止すること、又は第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸の製造の間にＡｒｇ１３１３及び／若しくはＡｒｇ１６４８におけるタンパク質分解切断部位を不活化することを含み得る。

「タンパク質分解切断を防止する」又は「タンパク質分解切断部位を不活化する」これらの工程は、上記の実施態様に従って、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸から、Ａｒｇ１３１３及び／又はＡｒｇ１６４８におけるタンパク質分解切断部位をコードする部分を除去することを含み得る。これは典型的には、単鎖第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を生じる。一般に、本発明の方法は、例えば発現プラスミド又はベクターで、単鎖第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を提供することをさらに含み得る。

次いで、核酸、発現ベクター又は発現プラスミドは、宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞中に発現のために導入され得る。本発明の方法は、改変第ＶＩＩＩ因子分子、例えば、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子が発現されるように適切な条件下で宿主細胞を培養すること；及び場合によりその改変第ＶＩＩＩ因子分子を宿主細胞から又は培養培地から回収する（例えば精製する）ことをさらに含み得る。一般に、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を操作する技術、第ＶＩＩＩ因子の発現を可能にするように哺乳動物細胞を培養する技術、及び細胞培養培地から第ＶＩＩＩ因子を精製する技術は当該分野で公知である。

単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を８０％以上の純度、より好ましくは９５％以上の純度に精製することが好ましく、そして夾雑高分子、特に他のタンパク質又は／及び核酸に関して９９．９％より高い純度であり、かつ感染性及び発熱性物質を含まない薬学的に純粋な状態であることが特に好ましい。好ましくは、単離又は精製された改変第ＶＩＩＩ因子分子は実質的に他のポリペプチドを含まない。

本発明の方法は、単鎖第ＶＩＩＩ因子を精製する工程、凍結乾燥する工程及び再構成する工程をさらに含み得る。再構成は好ましくは水、例えば「注射用水」を使用することにより行われる。

安定性
本発明に従って製造された第ＶＩＩＩ因子分子は、全長第ＶＩＩＩ因子と比較して、及び／又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）と比較して、増強された安定性を示す。

本明細書で使用される用語「安定性」は、水溶液での安定性、好ましくは例えば凍結乾燥された第ＶＩＩＩ因子製剤へ水を加えることによる凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子製剤の再構成後の水溶液での安定性を指す。典型的には、凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子製剤は「注射用水」を用いて再構成される。

水溶液での安定性は、第ＶＩＩＩ因子分子を水溶液で提供し、そしてそれを特定の期間インキュベートすることにより決定され得る。好ましい実施態様において、第ＶＩＩＩ因子分子の貯蔵安定性を決定するための条件は以下のとおりである：

第ＶＩＩＩ因子分子を以下の組成を有する水溶液で提供する：
Ｌ−ヒスチジン ２５ｍＭ
ＮａＣｌ ２２５ｍＭ
塩化カルシウム ４ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ^(R)８０ ０．０３％（質量／質量）
スクロース ２％（質量／質量）
Ｄ−マンニトール ８％（質量／質量）
ｐＨ７．０。

この溶液を本明細書以後では「緩衝液Ａ」と呼ぶ。水溶液中における初期第ＶＩＩＩ因子活性は好ましくは１００ＩＵ／ｍｌと１，５００ＩＵ／ｍｌとの間であり、好ましくは１００ＩＵ／ｍｌである。

このようにして調製された第ＶＩＩＩ因子溶液を次いで２５℃にて少なくとも２４時間、好ましくは少なくとも２日間、より好ましくは少なくとも５日間、最も好ましくは７又は８日間インキュベートする。インキュベーション期間の後、好ましくは発色性基質アッセイ（例えばＣｏａｍａｔｉｃ^(R)第ＶＩＩＩ因子、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を使用し
て、その溶液中の第ＶＩＩＩ因子活性を測定することにより安定性を決定する。初期活性と比較して活性の損失が少ないほど第ＶＩＩＩ因子分子の安定性は高い。最も好ましくは、安定性は以下の実施例１又は２のように決定される。

本発明によれば、上で確認された条件下での７日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩ因子活性の損失は、１５％未満、好ましくは１２％未満、最も好ましくは１０％である。

典型的には、インキュベーション期間の開始時（ｔ＝０）における初期第ＶＩＩＩ因子活性は１００％に正規化される。緩衝液Ａ中２５℃での２４時間の貯蔵後の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、好ましくは初期第ＶＩＩＩ因子活性の少なくとも９５％である。緩衝液Ａ中２５℃での４８時間の貯蔵後の残存第ＶＩＩＩ因子活性は好ましくは初期第ＶＩＩＩ因子活性の少なくとも９５％である。緩衝液Ａ中２５℃での４日間の貯蔵後の残存第ＶＩＩ
Ｉ因子活性は、初期第ＶＩＩＩ因子活性の好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％である。緩衝液Ａ中２５℃での７日間の貯蔵後の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、初期第ＶＩＩＩ因子活性の好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。緩衝液Ａ中２５℃での８日間の貯蔵後の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、初期第ＶＩＩＩ因子活性の好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。

単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、通常、二本鎖第ＶＩＩＩ因子分子の残存第ＶＩＩＩ因子活性より高い（両方の分子が同一の条件下で同じ期間の間インキュベートされたことを仮定して）。

用語「ヒト全長二本鎖第ＶＩＩＩ因子」は本明細書において用語「ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子」と交換可能に使用される。

一実施態様において、単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、ヒト全長二本鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性より高い。別の実施態様において、単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されたＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）の残存第ＶＩＩＩ因子活性より高い。

好ましくは、緩衝液Ａ中２５℃にて４８時間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、ヒト全長二本鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも４パーセント分（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｐｏｉｎｔｓ）超える。緩衝液Ａ中２５℃にて４８時間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも４パーセント分超えることもまた好ましい。

別の実施態様において、緩衝液Ａ中２５℃にて４日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、ヒト全長二本鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも５パーセント分超える。緩衝液Ａ中２５℃にて４日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性が、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも５パーセント分超えることもまた好ましい。

別の実施態様において、緩衝液Ａ中２５℃にて７日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、ヒト全長二本鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性を、少なくとも５パーセント分、好ましくは少なくとも１０パーセント分超える。緩衝液Ａ中２５℃にて７日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性が、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも５パーセント分、好ましくは少なくとも１０パーセント分超えることもまた好ましい。

別の実施態様において、緩衝液Ａ中２５℃にて８日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性は、ヒト全長二本鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも５パーセント分、好ましくは少なくとも１０パーセント分超える。緩衝液Ａ中
２５℃での８日間の貯蔵後の単鎖第ＶＩＩＩ因子の残存第ＶＩＩＩ因子活性が、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）の残存第ＶＩＩＩ因子活性を少なくとも５パーセント分、好ましくは少なくとも１０パーセント分超えることもまた好ましい。

緩衝液Ａの代わりに、例えば本発明の実施例２において使用される緩衝液のような他の緩衝液も使用され得る。

本発明の緩衝液に好ましいｐＨ範囲は、５．５〜９．０のｐＨ範囲、好ましくは６．０〜８．５のｐＨ範囲、そして特に好ましくは６．５〜８．０のｐＨ範囲である。

第ＶＩＩＩ因子の活性は、発色若しくは凝固アッセイ、又はいずれかの他のバイオアッセイにより決定され得る。好ましくは、第ＶＩＩＩ因子活性は以下の実施例１に示されるように決定される。

バイオアベイラビリティ
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、二本鎖ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、又は二本鎖ヒトＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子と比較して、非静脈内注射後に改善されたバイオアベイラビリティを示す。非静脈内注射は、好ましくは皮下、経皮又は筋内注射である。最も好ましくは、非静脈内注射は皮下注射である。

本明細書で使用される用語「バイオアベイラビリティ」は、第ＶＩＩＩ因子又はＦＶＩＩＩ関連製剤の投与された用量のうち、皮下、静脈内又は皮内投与後の最終時点までの所定の時点において血漿中で検出され得る比率を指す。典型的には、バイオアベイラビリティは、試験動物において、１０ＩＵ／ｋｇと１０００ＩＵ／ｋｇとの間の用量（例えば、４００ＩＵ／体重ｋｇ）の製剤を投与し；投与後の所定の時点で血漿サンプルを採取し；そして１つ又はそれ以上の発色若しくは凝固アッセイ（又はいずれかのバイオアッセイ）、イムノアッセイ、又はそれらと等価なものを使用してサンプル中の第ＶＩＩＩ因子又は第ＶＩＩＩ因子関連ポリペプチドの含有量を決定することにより測定される。バイオアベイラビリティは、投与後の所定の最終時点までの、ｙ軸上に血漿中の凝固因子の濃度又は活性、そしてｘ軸上に投与後の時間の曲線下面積（ＡＵＣ）として表される。好ましくは、この所定の時間は投与後７２時間又は４８時間である。最も好ましくは、バイオアベイラビリティは本明細書以下の実施例３に示されるように決定される。試験製剤の相対的バイオアベイラビリティは、試験製剤（本明細書では：単鎖第ＶＩＩＩ因子）のＡＵＣと、試験製剤と同じ用量及び方法（例えば静脈内、皮下、又は皮内）で投与された参照製剤（例えば、全長組み換え二本鎖第ＶＩＩＩ因子又は二本鎖Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子）のＡＵＣとの間の比を指す。

本発明によれば、皮下注射後の単鎖第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティは、二本鎖ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子又は二本鎖ヒトＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子のバイオアベイラビリティよりも高い。好ましくは、バイオアベイラビリティ（皮下注射後７２時間にわたるＡＵＣ）は、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％増加する。別の実施態様において、バイオアベイラビリティ（皮下注射後７２時間にわたるＡＵＣ）は、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子（すなわち、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜７４５及び１６４０〜２３３２からなるＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子）と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも
４０％増加する。

血漿半減期（インビボ）の改善
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は増加した薬物動態（ＰＫ）パラメータを示す。

本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、血友病Ａマウス又はカニクイザルのような異なる種に、例えばそれぞれ１００ＩＵ／ｋｇ又は２５０ＩＵ／ｋｇの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）注射され、例えば発色アッセイにおいて決定することにより試験され得る。血液サンプルを、例えば血友病Ａマウスにおいて７２時間（ｈｒｓ）まで、及び例えばカニクイザルにおいて２４ｈｒｓまでの、投与後の様々な時点で抜き取る。直ちにクエン酸血漿（Ｃｉｔｒａｔｅ ｐｌａｓｍａ）を調製し、そして例えば発色アッセイ系（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）によりＦＶＩＩＩ：Ｃの定量に使用する。

血漿中ＦＶＩＩＩレベルのＡＵＣを、ＡＵＣ_last：（ｔ＝０から最後の観察まで）を計算するために線形台形規則を使用して計算する。終末相半減期（ｔ_1/2β）を、調整済み
（ａｄｊｕｓｔｅｄ）Ｒ２基準により選択された終末相の点を使用して対数−線形回帰により決定した。ＡＵＣ：（ｔ＝０から無限大）（終末相の回帰モデルを使用することにより外挿された）。

本発明に従う単鎖ＦＶＩＩＩ分子は、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第ＶＩＩＩ因子の終末相半減期と比較して、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、なおより好ましくは少なくとも６０％増加した終末相半減期を示す。

好ましくは、血漿半減期は実施例５に示されるように決定される。

トロンビン生成アッセイ（インビボ）において決定された有効性の延長
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合に、トロンビンピークレベルがヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでにより長い期間を示す。この試験は、ＦＶＩＩＩの機能性が本発明に従う分子において安定化されるということも示す。

本発明に従うＦＶＩＩＩ分子は、最初に本発明のＦＶＩＩＩ分子を当モル用量で（例えば２５０ＩＵ／ｋｇで）血友病Ａマウスに静脈内投与することにより試験され得る。様々な時点で（例えば１〜８日目まで毎日）クエン酸血を集め、そしてトロンビン生成アッセイ（ＴＧＡ）を、例えばリン脂質（例えばＲｏｓｓｉｘ、Ｍｏｅｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）／Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ^(R)ＳＬ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１：３０）の存在下で内因性活性化後に較正トロンビノグラフィー（ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｇｒａｐｈｙ）（ＣＡＴ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により行う。トロンビンピークレベルを記録する。１〜８日目のピークトロンビンレベルの平均ＡＵＣを線形台形規則により計算する。２つの第ＶＩＩＩ因子製品のＡＵＣを、時点及び処置群ごとの可変分散（ｖａｒｉａｂｌｅ ｖａｒｉａｎｃｅｓ）を用いて線形モデルにおいてＡＵＣの差について近似Ｆ検定を使用して、トロンビンのピークレベルが５０ｎＭの基底限界範囲を下回るまでの推定時間を得て比較する。

好ましくは、トロンビン生成アッセイにおける有効性は実施例６に示されるに決定される。

血友病Ａマウスにおいて、ｓｃＦＶＩＩＩはヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して好ましい止血活性を示す。このことは、全長ｒＦＶＩＩＩに対するｓｃＦＶＩＩＩについてのトロンビンピークレベルが５０ｎＭのレベルを下回るまでに平均して少なくとも１０ｈｒｓ長い、好ましくは少なくとも１５時間長い、そしてなおより好ましくは少なくとも２０時間長いトロンビン生成活性値で理解される。

血漿中でより高いＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を保持する（エクスビボ）
別の実施態様において、本発明に従って安定化された第ＶＩＩＩ因子分子は、ヒト血漿中３７℃にて４日間インキュベートされた後に一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合に、ヒト血漿中３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、より高い活性を保持し；好ましくはここで、第ＶＩＩＩ因子の保持された活性は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも１０％高い。

本発明に従う第ＶＩＩＩ因子分子を含むサンプルは、それらをＦＶＩＩＩ欠損血漿（例えばＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓより）を用いて１ＩＵ／ｍＬ ＦＶＩＩＩ：Ｃ（発色性基質アッセイにより決定された値に基づく）まで希釈することにより試験され得る。次いでＦＶＩＩＩ−サンプルを３７℃にて様々な期間（例えば、０、０．２５、１、２、４及び８日）の間、０．０５％Ｎａ−アジドの存在下にてインキュベートする。各インキュベート期間の後、次いでＦＶＩＩＩ：Ｃを一段階凝固アッセイにより、例えばＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ−ＳＬ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を活性化因子として使用することにより決定し、ｔ＝０での値に対して正規化し（％ＦＶＩＩＩ：Ｃ）、そしてインキュベーション時間に対してプロットする。

３７℃で４日間インキュベートした後、本発明の第ＶＩＩＩ因子分子は、少なくとも１０％高いＦＶＩＩＩ：Ｃ活性、好ましくは少なくとも１５％高いＦＶＩＩＩ：Ｃ活性、好ましくは少なくとも２０％高いＦＶＩＩＩ：Ｃ活性、好ましくは少なくとも２５％高いＦＶＩＩＩ：Ｃ活性、好ましくは少なくとも３０％高いＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を保持していた。

好ましくは、血漿中の活性は実施例４に示されるように決定される。

処置及び予防
再構成後の増大した安定性を有する本発明に従う単鎖第ＶＩＩＩ因子構築物は、出血性障害の処置又は予防において投与され得る。

本明細書において使用される用語「出血性障害」は、家族性及び後天性の血友病Ａ及びＢ、家族性又は後天性のフォン・ビルブランド病、家族性又は後天性のいずれかの凝固因子の欠損、単一の器官、骨断片（ｂｏｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）又は多発性外傷（ｐｏｌｙｔｒａｕｍａ）のいずれかからの重篤な出血をもたららす全ての種類の外傷、鈍的外傷又は穿通性外傷、周術期又は術後の出血、小児心臓手術において体外循環及び血液希釈を受けている患者を含む心臓手術に起因する出血を含む外科手技の間の出血、脳内出血、くも膜下出血、硬膜下又は硬膜外出血、失血及び血液希釈に起因する出血、罹患した患者における凝固因子の減少したレベルをもたらす非血漿量置換（ｎｏｎ−ｐｌａｓｍａｔｉｃ
ｖｏｌｕｍｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によるもの、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）及び消費性凝固障害に起因する出血、血小板機能不全、欠乏及び凝固障害、肝硬変、肝機能不全及び劇症肝不全に起因する出血、肝疾患を有する患者における肝生検、肝臓及び他の器官の移植後の出血、胃静脈瘤からの出血及び消化性潰瘍出血、不正子宮出血（
ＤＵＢ）、胎盤の早期剥離のような婦人科出血、低出生体重児における脳室周囲出血、分娩後出血、新生児仮死（ｆａｔａｌ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎｓ）、熱傷に伴う出血、アミロイドーシスに伴う出血、血小板障害に伴う造血幹細胞移植、悪性病変に伴う出血、出血性ウイルスの感染症、膵炎に伴う出血が挙げられる。

医薬製剤の成分は従来の生理学的に適合性の水性緩衝液中に溶解され得、その溶液中には、医薬製剤を提供するための医薬添加剤が場合により加えられ得る。医薬製剤の成分は全ての必要な薬学的生理学的に適合性の添加剤を既に含有し得、そして医薬製剤を提供するために注射用水中に溶解され得る。

このような医薬担体及び添加剤、さらには適切な医薬製剤の製造は当該分野で周知である（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｆｒｏｋｊａｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（２０００）又は「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，３^rd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ （２０００）を参照のこと）。特定の実施態様において、医薬組成物は増量剤、緩衝液又は安定剤のような少なくとも１つの添加物を含み得る。標準的な医薬製剤化技術は当業者に周知である（例えば、２００５ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ^(R)，
Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２０００を参照のこと）。適切な医薬添加物としては、例えば、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、又はその他のような糖類、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、又はその他のようなアミノ酸、塩化ナトリウム又はその他の塩のような等張条件を達成するための添加物、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、塩化カルシウム又はその他のような安定剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンのような生理的ｐＨ緩衝化剤などが挙げられる。特定の実施態様において、医薬組成物はｐＨ緩衝化試薬及び湿潤剤又は乳化剤を含有し得る。さらなる実施態様において、組成物は保存料又は安定剤を含有し得る。特に、血液凝固因子を含む医薬製剤は、凍結乾燥形態又は安定な可溶性形態で製剤化され得る。血液凝固因子は当該分野で公知の様々な手順により凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水又は適切な緩衝液のような１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤を加えることにより使用前に再構成される。

本発明の医薬製剤中に含有される組成物は、いずれかの薬学的に適切な手段により個体に送達され得る。様々な送達系が公知であり、そして組成物をいずれかの都合の良い経路により投与するために使用され得る。好ましくは、本発明の医薬製剤中に含まれる組成物は、非静脈内注射により個体に送達される。より好ましくは、本発明の組成物は、皮下、筋内、腹腔内、脳内、肺内、鼻腔内、皮内又は経皮投与用に、最も好ましくは皮下、筋内又は経皮投与用に、従来の方法に従って製剤化される。製剤は注入により又はボーラス注射により継続的に投与され得る。いくつかの製剤は徐放系を包含し得る。

本発明の医薬製剤の組成物は、治療有効用量で患者に投与され、これは、過度の有害な副作用を生じる用量に達することなく、処置される状態又は適応症の重症度又は伝播を防止するか又は低減する所望の効果を生じるために十分な用量を意味する。正確な用量は、例えば、適応症、製剤、投与様式のような多くの因子に依存し、そしてそれぞれの適応症
について前臨床試験及び臨床試験において決定されなければならない。

本発明の一実施態様において、処置される被験体における凝固因子の血漿レベルは、注射後５時間から非静脈内注射の８時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における凝固因子の標準血漿レベルの２％より高く、好ましくは５％より高く、より好ましくは８％より高く、最も好ましくは１０％より高い。血漿レベルは、本明細書以後の実施例３において示されるように決定されるべきである。

本発明の一実施態様において、処置される被験体における凝固因子の血漿レベルは、注射の４時間後から非静脈内注射の１６時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における凝固因子の標準血漿レベルの２％より高く、好ましくは５％より高く、より好ましくは８％より高く、最も好ましくは１０％より高い。

本発明の別の実施態様において、処置される被験体における凝固因子の血漿レベルは、注射の３時間後から非静脈内注射の２４時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における凝固因子の標準血漿レベルの２％より高く、好ましくは４％より高く、より好ましくは６％より高く、最も好ましくは８％より高い。

本発明の別の実施態様において、処置される被験体における凝固因子の血漿レベルは、注射の２時間後から非静脈内注射の３２時間後までの期間の間、継続的に、健常被験体における凝固因子の標準血漿レベルの２％より高く、好ましくは３％より高く、より好ましくは４％より高く、最も好ましくは５％より高い。

好ましくは、１回の非静脈内注射についての単鎖第ＶＩＩＩ因子の用量は、１，０００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は８００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は６００ＩＵ／体重ｋｇ未満、又は４００ＩＵ／体重ｋｇ未満、例えば約１０ＩＵ／体重ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約２０ＩＵ／体重ｋｇ〜約８００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約３０ＩＵ／体重ｋｇ〜約７００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約４０ＩＵ／体重ｋｇ〜約６００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約５００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約７５ＩＵ／体重ｋｇ〜約４００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約１００ＩＵ／体重ｋｇ〜約３００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約１，０００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約８００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約７００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約６００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約５００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約４００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約３００ＩＵ／体重ｋｇ、又は約５０ＩＵ／体重ｋｇ〜約２００ＩＵ／体重ｋｇの用量である。ＦＶＩＩＩはそれ自体で投与されても、ＶＷＦとの複合体として投与されてもよい。

本発明の医薬組成物は、単独で、又は他の治療剤と併せて投与され得る。これらの薬剤は同じ医薬の一部として組み込まれてもよい。

実施例１：再構成後の精製第ＶＩＩＩ因子分子の安定性
以下の第ＶＩＩＩ因子製剤をこの実施例において使用した：
Ｂｅｒｉａｔｅ^(R)、凍結乾燥ヒト凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮物をＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ ＧｍｂＨから入手した。Ｂｅｒｉａｔｅ^(R)は血漿由来第ＶＩＩＩ因子をヘテロダイ
マー形態で含む。

Ｈｅｌｉｘａｔｅ^(R)、凍結乾燥組み換え凝固第ＶＩＩＩ因子をＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎ
ｇ ＧｍｂＨから入手した。Ｈｅｌｉｘａｔｅ^(R)は組み換えにより産生されたヘテロダ
イマー第ＶＩＩＩ因子を含有する。

ＲｅＦａｃｔｏ^(R)は、組み換え技術により産生されたヘテロダイマーＢドメイン欠失
第ＶＩＩＩ因子を含有する凍結乾燥第ＶＩＩＩ因子製剤である。これは例えばＰｆｉｚｅｒ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。

Ｂｅｒｉａｔｅ^(R)、Ｈｅｌｉｘａｔｅ^(R)、及びＲｅＦａｃｔｏ^(R)は主にヘテロダイ
マー二本鎖ポリペプチドである。

「ｓｃＦＶＩＩＩ」と呼ばれる構築物は、哺乳動物細胞培養細胞において組み換え発現により産生された単鎖第ＶＩＩＩ因子である。この実施例において使用される単鎖第ＶＩＩＩ因子は、Ａｓｎ７６４をＴｈｒ１６５３に直接融合させることにより得られ、そして精製後に凍結乾燥形態で提供された。すなわち、「ｓｃＦＶＩＩＩ」は実質的に配列番号２のアミノ酸１〜７６４及び１６５３〜２３３２からなる単鎖ポリペプチドである。

Ｂｅｒｉａｔｅ^(R)、Ｈｅｌｉｘａｔｅ^(R)、及びＲｅＦａｃｔｏ^(R)を、添付文書に示
されるように製造者の支持に従って再構成した。「ｓｃＦＶＩＩＩ」を、精製及び凍結乾燥されたＦＶＩＩＩ製剤を注射用水に溶解し、２５ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、２２５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０、２％スクロース、８％Ｄ−
マンニトールを含有する組成物（ｐＨ７．０）を生じることにより再構成した。

再構成されたＦＶＩＩＩ生成物を２５℃でインキュベートした。生成物のＦＶＩＩＩ活性を、発色性基質アッセイ（Ｃｏａｍａｔｉｃ^(R)第ＶＩＩＩ因子、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ
ｉｘ）により以下の時点で二重に決定した：０時間、６時間、１日、２日、４日、７日。活性値を時点０に対して正規化した。

結果を以下の表及び図１に示す。

示されるように、「ｓｃＦＶＩＩＩ」は活性の最も低い損失を示し、そしてその結果として、最も安定な第ＶＩＩＩ因子分子である。

実施例２：再構成後の精製第ＶＩＩＩ因子分子の安定性
以下の第ＶＩＩＩ因子製剤をこの実施例において使用した：
ＲｅＦａｃｔｏ^(R)及び「ｓｃＦＶＩＩＩ」は、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ ＧｍｂＨに
より提供された「ｓｃＦＶＩＩＩ」が異なる添加剤を含有する製剤で適用されたことは異なるが、実施例１において使用されたものと同じであった。Ａｄｖａｔｅ^(R)は、凍結乾
燥形態でＢａｘｔｅｒから購入された全長ヘテロダイマー組み換え第ＶＩＩＩ因子製剤である。

Ａｄｖａｔｅ^(R)及びＲｅＦａｃｔｏ^(R)を添付文書に示されるとおり製造者の指示に従
って再構成した。「ｓｃＦＶＩＩＩ」を、注射用水で再構成し、２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＣａＣｌ₂、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０、０．
６％スクロースを含有する組成物（ｐＨ７．０）を得た。サンプル「ｓｃＦＶＩＩＩ ００１」は１００ＩＵ／ｍｌの初期ＦＶＩＩＩ活性を有しており、サンプル「ｓｃＦＶＩＩＩ ０００６」は４００ＩＵ／ｍｌの初期ＦＶＩＩＩ活性を有していた。再構成されたＦＶＩＩＩ生成物を２５℃でインキュベートした。生成物のＦＶＩＩＩ活性を、発色性基質アッセイ（Ｃｏａｍａｔｉｃ^(R)第ＶＩＩＩ因子、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）により以下
の時点で二重に決定した：０時間、６時間、１日、２日、４日、８日。活性値は時点０に対して正規化した。

結果を以下の表及び図２に示す。

示されるように、「ｓｃＦＶＩＩＩ」は活性の最も低い損失を示し、そしてその結果として、最も安定な第ＶＩＩＩ因子分子である。

実施例３：第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティ
Ａｄｖａｔｅ^(R)、ＲｅＦａｃｔｏ^(R)及び「ｓｃＦＶＩＩＩ」は実施例２において使用されたものと同じであり、そして実施例２に記載されるように再構成された。

第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスを血友病Ａの動物モデルとして使用した。これらのマウスはエキソン１６及び１７を欠いており、従ってＦＶＩＩＩを発現しない（Ｂｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，Ｖｏｌ １０（１），１１９−１２１；Ｂｉ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，Ｖｏｌ ８８（９），３４４６−３４５０）。これにより、ノックアウト（ｋｏ）マウスの血漿におけるＦＶＩＩＩ活性の定量による処置後のＦＶＩＩＩレベルの分析が可能となる。

血管外注射がヒトＦＶＩＩＩを用いた改善された治療のための選択肢となり得るかどうかを評価するために皮下注射を選択した。行われた非臨床薬物動態研究の設計の詳細を以下の表３に示す。第ＶＩＩＩ因子活性の血漿レベルをそれぞれのＦＶＩＩＩ製剤（詳細な処置グループは表３）の血友病Ａモデルへの単回皮下注射後に決定した。

対応するグループを同じ用量のＦＶＩＩＩ：色素原活性を用いて処置した。単回適用について、第ＶＩＩＩ因子は体積２００μＬ（全てのグループについて同一の体積）で皮下適用前に体重約２５ｇのＦＶＩＩＩノックアウト（ｋｏ）マウスに提供された。処置グループを表３にまとめる。

短期間の麻酔下で、血液サンプルを引き抜き、クエン酸ナトリウムを使用して１０％ク
エン酸血として抗凝固処理し、処理して血漿とし、そして−７０℃でＦＶＩＩＩ活性の測定のために保存した。サンプリング時点の詳細を表３に示す。血漿におけるＦＶＩＩＩ活性の定量を標準的なａＰＴＴベースのアプローチ（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅｒ）により行った。動物を標準的な飼育条件下で維持した。

結果
結果を表４及び図３にまとめる。

４００ＩＵ／ｋｇの単鎖ＦＶＩＩＩ（「ｓｃＦＶＩＩＩ」）のＦＶＩＩＩ ｋｏマウスへの皮下注射は、ヘテロダイマー全長ＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)）又はヘテロダイマ
ーＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ＲｅＦａｃｔｏ^(R)）の投与と比較して、血漿レベルでＦ
ＶＩＩＩ活性の有意な増加を生じた。すなわち、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、マウスへの皮下注射後に最も高いインビボバイオアベイラビリティを示す。二本鎖全長構築物Ａｄｖａｔｅ^(R)、さらには二本鎖Ｂドメイン欠失製剤ＲｅＦａｃｔｏ^(R)は実質的により低いバイオアベイラビリティを示した。

実施例４：血漿における第ＶＩＩＩ因子分子の安定性（インビトロ）
異なるＦＶＩＩＩ製品（Ａｄｖａｔｅ^(R)、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ^(R)及び実施例２で使用されたｓｃＦＶＩＩＩの２つのロット）を、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて１ＩＵ／ｍＬ ＦＶＩＩＩ：Ｃ（発色性基質アッセイにより決定された値に基づく）に希釈した。ＦＶＩＩＩサンプルを、３７℃で様々な期間（０、０．２５、１、２、４及び８日）０．０５％ Ｎａ−アジドの存在下でインキュベートした。各インキュベーション期間の後、ＦＶＩＩＩ：Ｃを一段階凝固アッセイによりＰａｔｈｒｏｍｔｉｎ−ＳＬ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を活性化因子として使用して測定し、ｔ＝０での値に対して正規化し（％ ＦＶＩＩＩ：Ｃ）、そしてインキュベーション時間に対してプロットした。示された値は２つのサンプルの平均及び標準偏差を表す（１つのサンプルのみの０．２５日を除く）。

実施例５：血漿における第ＶＩＩＩ因子分子の安定性（インビボ）
ｓｃＦＶＩＩＩ及び全長ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔ
ｈｃａｒｅ）の薬物動態（ＰＫ）プロフィールを、カニクイザル（図５及び表６）及び血友病Ａマウス（図６及び表７）へのそれぞれ２５０ＩＵ／ｋｇ及び１００ＩＵ／ｋｇの用量での単回静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射後に決定した。試験品をＡｄｖａｔｅ^(R)について表
示されている活性及びｓｃＦＶＩＩＩについて発色活性（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）に従って投薬した。血液サンプルを投薬前（サルのみ）そして血友病Ａマウスにおいて投与後７２時間（ｈｒｓ）まで、及びカニクイザルにおいて２４ｈｒｓまでの様々な時点で抜き取った。クエン酸血漿を直ちに調製し、そして発色アッセイ系（ＦＶＩＩＩ：Ｃ）（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）によるＦＶＩＩＩ：Ｃの定量のために使用した。

血漿中ＦＶＩＩＩレベルのＡＵＣを、線形台形規則を使用してＡＵＣ_last：（ｔ＝０から最後の観察まで）を計算することにより計算した。終末相半減期（ｔ_1/2β）を調整済
みＲ２基準により選択された終末相の点を使用して対数−線形回帰により決定した。ＡＵＣ：（ｔ＝０から無限大）（終末相の回帰モデルを使用することにより外挿された）。

カニクイザルにおいて、ｓｃＦＶＩＩＩはそれに応じて約２倍低いクリアランス（ＣＬ）と共に約１．６倍増強されたＡＵＣ_0-tlast又はｔ_1/2βを示したが、ＦＶＩＩＩ活性ピークレベル（Ｃ_max）、インビボ回収（ＩＶＲ）の代表（ｒｅｐｒｅｓｎｔａｔｉｖｅ）
、及び定常状態（Ｖ_ss）での分布体積は、全長ｒＦＶＩＩＩに対してより類似しているようであった。これらのＰＫパラメータ結果は、２５０ＩＵ／ｋｇのｓｃＦＶＩＩＩを用い
たＧＬＰ−毒性研究の間に投薬された場合の８匹の追加のサルからの毒物動態データを含めた後、ｎ＝１０の動物から得られた（表６及び図５）。

血友病Ａマウスにおいて、ＡＵＣ_0-tlast、平均滞留時間（ＭＲＴ）、５％ ＦＶＩＩ
Ｉ活性トラフレベルまでの時間、終末相半減期の増強、及びそれに応じたＣＬの低下は、ｓｃＦＶＩＩＩについて１．６〜２倍の間の範囲に及んだが、Ｃ_max、ＩＶＲの代表、及
びＶ_ssは全長ｒＦＶＩＩＩに対して類似しているようであった。ｒＶＩＩＩ−単鎖処置後に得られたＡＵＣ_0-tlast及びｔ_1/2βの結果は、１．９７のＡＵＣ_0-tlast比（９０％信
頼区間（ＣＩ）：１．７〜２．３；ｐ値（比＝１）：＜０．０００１）、及び１．６５のｔ_1/2β比（９０％ＣＩ：１．１１〜２．７０；ｐ値（比＝１）：０．０３６と共に全長
ｒＦＶＩＩＩよりも有意に良好なものであった（表７及び図６）。

両方の組のＰＫパラメータが、精製、凍結乾燥、再構成後のインビボで血漿において、試験した２つの動物種への投与後の増加したｓｃＦＶＩＩＩの安定性を反映している。

実施例６：血友病Ａマウスにおけるトロンビン生成アッセイ（エクスビボ）
ｓｃＦＶＩＩＩ又は全長ｒＦＶＩＩＩ（Ａｄｖａｔｅ^(R)）を２５０ＩＵ／ｋｇのレベ
ルで投薬した場合に、クエン酸−（１０％体積／体積）血友病Ａマウス血液を深麻酔下で異なる時点に（１〜８日）最後に集めた。リン脂質（Ｒｏｓｓｉｘ，Ｍｏｅｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）／Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ^(R)ＳＬ（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒ
ｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（１：３０）の存在下で内因性活性化後に較正トロンビノグラフィー（ＣＡＴ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によりＴＧＡを行った。トロンビンピークレベルを記録した。１〜８日目からのピークトロンビンレベルの平均ＡＵＣを、線形台形規則により計算した。２つの第ＶＩＩＩ因子製品のＡＵＣを、時点及び処置群ごとの可変分散を用いて線形モデルにおいてＡＵＣの差について近似Ｆ検定を使用して、トロンビンのピークレベルが５０〜２５０ｎＭの間の基底限界範囲を下回るまでの推定時間を得て比較した。

血友病Ａマウスにおいて、ｓｃＦＶＩＩＩは、トロンビンのピークレベルが５０〜２５０ｎｍのピークレベルの規定限界範囲を下回るまでの推定時間により示されるように、全長ｒＦＶＩＩＩと比較して有利な止血活性を示した（図８及び表８）。これにより、５０と２５０ｎＭとの間のトロンビンピークレベル間隔について全長ｒＦＶＩＩＩに対してｓｃＦＶＩＩＩについて平均して２０ｈｒｓ長いトロンビン生成活性値となった。１〜８日の間のピーク曲線下面積を評価する場合、ｓｃＦＶＩＩＩのトロンビン生成活性は、全長ＦＶＩＩＩと比較してｐ（ＡＵＣ_{TGA Peak}−比＝１）＝０．０００２（推定比１．２６、９０％ ＣＩ：１．１４−１．３９）と有意に良好であり、又は換言すると、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子Ａｄｖａｔｅ^(R)についてよりもｓｃＦＶＩＩＩについて、投与後にトロ
ンビンピークレベルが５０ｎｍを下回るまで有意に長い時間がかかった。

これらの結果は再び、精製、凍結乾燥及び再構成後のｓｃＦＶＩＩＩの増加した機能的安定性を裏付けた。

実施例６：ｖＷＦ欠失血漿における第ＶＩＩＩ因子分子の安定性（インビボ）
ｓｃＦＶＩＩＩを２．５ｍＬ注射用水中で再構成した。ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ^(R)及び
Ａｄｖａｔｅ^(R)を添付文書の記載に従って再構成した。全ての試験品を等分して約−７
０℃で直ちに凍結させて保存した。投与前に、試験品をＣＳＬ ６２７について製剤化緩衝液で希釈して、信頼性のある投与を確実にする最小実用体積を得た。

グループあたり１２匹のＶＷＦ ｋｏマウス（雌性６／雄性６）に、発色性ＦＶＩＩＩ活性に基づくｓｃＦＶＩＩＩ、及び標識ＦＶＩＩＩ活性に基づくＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ^(R)又はＡｄｖａｔｅ^(R)のいずれか１００ＩＵ／ｋｇの単回静脈内注射を側方尾静脈（ｌａｔｅｒａｌ ｔａｉｌ ｖｅｉｎ）中に投与した。異なる試験品の投与後に、時点あたりｎ＝２〜３のマウスから０．０８３、０．５、１、２、４、７、１６及び２４時間の時点でＦＶＩＩＩ血漿レベルの測定のために血液サンプルを抜き取った。血液サンプルを処理して１０％クエン酸（３．１３％質量／体積）血漿とし、そしてその後、発色アッセイ系を使用するＦＶＩＩＩ血漿レベル分析にかけた。発色ＦＶＩＩＩ活性を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，ＩｔａｌｙからのＣＯＡＭＡＴＩＣ^(R) ＦＶＩＩＩ試験キットを使用して決
定した。

血漿中のＦＶＩＩＩレベルのＡＵＣを、ＡＵＣｌａｓｔ：（ｔ＝０から最後の観察まで）を計算するために線形台形規則を使用して計算した。

ＦＶＩＩＩ ｋｏマウス及び正常サルへの静脈内投与、さらにはＦＶＩＩＩ ｋｏマウスへの皮下投与後に得られた結果分析と同様に、ＣＳＬ６２７の曝露はＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ^(R)及びＡｄｖａｔｅ^(R)と比較して高かった。なぜなら、全身曝露についての最も関連性のある代表的なＰＫパラメータであるＡＵＣの分析により、ＣＳＬ６２７の投与後に
ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ^(R)及びＡｄｖａｔｅ^(R)の両方と比較して３０％高いＡＵＣ値が得られたからである。この場合もやはり、これらの所見は、全身の循環ＶＷＦを欠失しており、それ故、全身循環ＦＶＩＩＩについての遮蔽及び保護効果がないマウスへの投与後の血漿におけるインビボでの精製、凍結乾燥、再構成後のｓｃＦＶＩＩＩの増加した固有の安定性を反映する。

Claims (23)

1. 精製、凍結乾燥及び再構成の後の第ＶＩＩＩ因子分子の安定性を増大させるための方法であって、第ＶＩＩＩ因子分子の製造全体を通して、本質的にＡ１ドメイン及びＡ２ドメインを含む第一のフラグメント並びに本質的にＡ３ドメイン、Ｃ１ドメイン及びＣ２ドメインを含む第二のフラグメントへの第ＶＩＩＩ因子分子のタンパク質分解切断を防止することを含む、上記方法。
2. Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 不活化工程が、少なくともＡｒｇ１６４８を第ＶＩＩＩ因子配列から除去することを含む、請求項２に記載の方法。
4. 不活化工程が、少なくともＡｒｇ１３１３〜Ａｒｇ１６４８のアミノ酸配列を第ＶＩＩＩ因子配列から除去することを含む、請求項３に記載の方法。
5. 第ＶＩＩＩ因子配列の位置７４１〜１６４７におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子配列の位置１６４９〜１６９０におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸と融合され、それによりＡｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位が不活化される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 除去されたアミノ酸が、１〜５０アミノ酸長を有するペプチドスペーサーで置き換えられる、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 不活化工程が、Ａｒｇ１６４８、及び第ＶＩＩＩ因子分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３を異なるアミノ酸と置き換えることを含む、請求項２に記載の方法。
8. 水溶液での再構成及び７日間２５℃での貯蔵後の、第ＶＩＩＩ因子分子の活性の損失が１５％未満である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 水溶液での再構成後の第ＶＩＩＩ因子のインビトロ安定性が、前記切断部位の不活化により増大する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、第ＶＩＩＩ因子が非静脈内注射後に改善されたバイオアベイラビリティを示し；好ましくは非静脈内注射後のバイオアベイラビリティが、同じ用量及び同じ方法で投与された、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、少なくとも２５％増加する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記非静脈内注射が、皮下、経皮又は筋内注射である、請求項１０に記載の方法。
12. （ｉ）第ＶＩＩＩ因子が、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、静脈内投与後に改善された血漿半減期を示し；好ましくは該血漿半減期は、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも４０％改善され、
    又は
    （ｉｉ）第ＶＩＩＩ因子が、血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合に、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、トロンビンピークレベルが静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでにより長い期間を示し；好ましくは、この期間はヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも１０時間延長され、
    又は
    （ｉｉｉ）第ＶＩＩＩ因子が、一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合に、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後により高い活性を保持し；好ましくは、第ＶＩＩＩ因子の保持された活性は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子の活性と比較して少なくとも１０％高い、
    請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
13. （ｉ）Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位が不活化されている改変第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を提供する工程、
    （ｉｉ）宿主細胞を該核酸で形質転換する工程、
    （ｉｉｉ）形質転換された宿主細胞を、改変第ＶＩＩＩ因子分子が発現されるような条件下で培養する工程、
    （ｉｖ）宿主細胞から、又は細胞培養培地から、改変第ＶＩＩＩ因子分子を回収する工程
    を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、非静脈内投与後の第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティを改善するための方法であって、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
15. 前記非静脈内投与が皮下、経皮又は筋内注射である、請求項１４に記載の方法。
16. ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、静脈内投与後の第ＶＩＩＩ因子分子の血漿半減期を改善するための方法であって、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
17. 血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定された場合のトロンビンピークレベルが、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、第ＶＩＩＩ因子分子の静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでの期間を延長するための方法であって、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
18. ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後の一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合に第ＶＩＩＩ因子分子についてより高い活性を保持するための方法であって、Ａｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタン
    パク質分解切断部位を不活化することを含む、上記方法。
19. 第ＶＩＩＩ因子配列の位置７４１〜１６４７におけるアミノ酸から選択される第一のアミノ酸が、第ＶＩＩＩ因子配列の位置１６４９〜１６９０におけるアミノ酸から選択される第二のアミノ酸に融合され、それによりＡｒｇ１６４８とＧｌｕ１６４９との間のタンパク質分解切断部位、及びＦＶＩＩＩ分子中に存在する場合はＡｒｇ１３１３とＡｌａ１３１４との間のタンパク質分解切断部位が不活化される、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 出血性障害、好ましくは血友病Ａの処置又は予防における使用のための、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤であって、該処置又は予防が、
    （ｉ）非静脈内投与、［ここで
    該単鎖第ＶＩＩＩ因子分子のバイオアベイラビリティは、同じ用量及び同じ方法で投与される、ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、又はＡｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子分子と比較して、少なくとも２５％増加する］
    又は
    （ｉｉ）静脈内投与、［ここで
    （ａ）該単鎖第ＶＩＩＩ因子分子の静脈内投与後の血漿半減期は、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して少なくとも４０％増加するか、
    又は
    （ｂ）単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、血友病Ａマウスにおいて経時的にトロンビン生成アッセイにおいて決定されたトロンビンピークレベルが、同じ用量及び同じ方法で投与されたヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して静脈内投与後に５０ｎＭを下回るまでに、少なくとも１０時間延長された期間を示す］
    によるものである、上記医薬製剤。
21. 出血性障害、好ましくは血友病Ａの処置又は予防における使用のための、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤であって、ここで単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた後に、一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合に少なくとも１０％高い活性を保持する、上記医薬製剤。
22. 非静脈内投与による、出血性障害、好ましくは血友病Ａの処置又は予防における使用のための、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬液剤であって、ここで同じ用量及び同じ方法で投与された、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子の用量と比較して、血液における同じ止血活性を達成するために、該ＦＶＩＩＩ分子の用量は少なくとも２５％減少され得る、上記医薬液剤。
23. 出血性障害を処置するための医薬製剤の再構成後の増大した安定性又はより長い貯蔵寿命を達成するための単鎖第ＶＩＩＩ因子分子の使用であって、ここで
    （ｉ）再構成及び再構成後７日間室温での貯蔵の後の、単鎖第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤の第ＶＩＩＩ因子活性は、同じ量の、Ａｓｎ７４５がＰｒｏ１６４０に融合されているＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子を含む医薬製剤の第ＶＩＩＩ因子活性と比較して少なくとも１０％高いか、又は
    （ｉｉ）単鎖第ＶＩＩＩ因子分子は、ヒト血漿中で３７℃にて同じ濃度で４日間インキュベートされた後のヒト野生型第ＶＩＩＩ因子と比較して、ヒト血漿中で３７℃にて４日間インキュベートされた場合に一段階ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイにより決定された場合少なくとも１０％高い活性を保持する、
    上記使用。

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