BRPI0113155B1

BRPI0113155B1 - métodos para produção de uma vacina para hpatite b e de antígeno de superfície para hepatite b.

Info

Publication number: BRPI0113155B1
Application number: BRPI0113155-9A
Authority: BR
Inventors: De Heyder Koen; Serantoni Michelle; Van-Opstal Omer; Schu Peter
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-08-07
Publication date: 2018-11-21
Also published as: CY1108789T1; SI1666487T1; HUP0302951A2; AU8207301A; UY26882A1; NZ524012A; AP2003002734A0; US20030235590A1; DE60116107D1; ES2254464T3; ES2314555T3; AR030325A1; BRPI0113155C1; SI1307473T1; ATE313558T1; CA2427475C; UA79735C2; ATE412665T1; PT1666487E; NO20030635L

Abstract

"métodos para produção de uma vacina para hepatite b e de um antígeno de superfície para hepatite b e para tratamento e/ou profilaxia de infeções pelo vírus da hepatite b, composição de vacina, uso de um antígeno de superfície para hepatite b, antígeno imunogênico de hepatite b e vacina". a presente invenção refere-se a um método para a produção de um antígeno para hepatite b adequado para uso em uma vacina, o método compreendendo a purificação do antígeno na presença de cisteína, para vacinas compreendendo tais antígenos.

Description

(54) Título: MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UMA VACINA PARA HPATITE B E DE ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE PARA HEPATITE B.

(73) Titular: GLAXOSMITHKLINE BIOLOGICALS S.A., Companhia Belga. Endereço: Rue De Llnstitut 89, B-1330 Rixensart, BÉLGICA(BE) (72) Inventor: KOEN DE HEYDER; PETER SCHU; MICHELLE SERANTONI; OMER VAN-OPSTAL.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados “métodos para produção de uma vacina para hepatite b

E DE UM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE PARA HEPATITE B”

Esta invenção refere-se a um novo processo para a manufatura de uma vacina para hepatite B para uso no tratamento ou na profilaxia de 5 infecções do vírus da hepatite B (HBV). Ela refere-se em adição a uma vacina para HBV obtenível pelo processo da invenção.

A infecção crônica do vírus da hepatite B (HBV), para a qual há tratamento correntemente limitado, constitui um problema de saúde pública global de dimensões enormes. Os hospedeiros crônicos de HBV, 10 estimados em totalizar mais do que 300 milhões em todo o mundo, estão sob o risco de desenvolvimento de hepatite ativa crônica, de cirrose e de carcinoma hepatocelular primário.

Muitas vacinas que estão correntemente disponíveis requerem um conservante para evitar a deterioração. Um conservante frequentemente 15 utilizado é tiomersal que é um composto contendo mercúrio. Algumas preocupações têm surgido sobre o uso de mercúrio em vacinas, embora os comentadores têm salientado que os perigos potenciais das vacinas contendo tiomersal não devem ser exagerados (Offit; P.A. JAMA Vol. 283; No. 16). Contudo seria vantajoso que se encontrasse métodos novos e potencialmente 20 mais seguros de preparação de vacinas para se substituir o uso de tiomersal no processo de manufatura. Há portanto uma necessidade de desenvolvimento de vacinas que estejam livres de tiomersal, em partículas de vacinas para hepatite B.

Em um primeiro aspecto a presente invenção proporciona um 25 método para produzir um antígeno para hepatite B adequado para emprego

Petição 870180124947, de 03/09/2018, pág. 6/10 i r* z. · tf · · · ♦ > I · ·· • · * ) · 9 · ' « * ··* ·» · * s * r * e

o em uma vacina, o método compreendendo a purificação do antígeno na presença de um agente redutor compreendendo um grupo -SH livre.

A presente invenção preferivelmente proporciona um método de produção de um antígeno estável para hepatite B sem o traço de tiomersal que compreende a purificação do antígeno na presença de um agente redutor possuindo um grupo -SH livre.

A preparação de antígeno é geralmente sem o traço de tiomersal quando tiomersal não for detectável no produto de antígeno purificado usando espectrofotometria de absorção de mercúrio, como aqui descrito.

A preparação de antígeno para hepatite preferivelmente compreende menos do que 0,025 pg de mercúrio por 20 pg de proteína, adequadamente medido por espectrofotometria de absorção.

Preferivelmente a purificação é realizada na ausência de tiomersal, e o antígeno purificado está completamente livre de tiomersal.

Preferivelmente o antígeno é estável, adequadamente substancialmente tão estável quanto um antígeno para hepatite purificado na presença de tiomersal, como descrito no Exemplo 1 aqui, por exemplo.

Preferivelmente o antígeno para hepatite é imunogênico.

Preferivelmente o agente redutor é adicionado durante o processo de purificação de antígeno, preferivelmente após o crescimento de células expressando o antígeno.

Preferivelmente o agente redutor é cisteína, ditiotreitol, βmercapto-etanol ou glutationa, com cisteína sendo a mais preferida.

Conseqüentemente a presente invenção preferivelmente proporciona um método de purificação de um antígeno estável imunogênico para hepatite B sem traço de tiomersal que compreende a purificação do antígeno na presença de cisteína.

Preferivelmente a purificação é realizada na presença de uma

solução de cisteína.

Preferivelmente, a cisteína, em solução ou na forma de pó, é adicionada durante o processo para uma concentração final entre 1 e 10 mM, preferivelmente 1 e 5 mM. Com maior preferência, a cisteína é adicionada 5 para uma concentração final de cerca de 2 mM.

Preferivelmente a cisteína é L-cisteína.

A invenção adicionalmente proporciona um método de produção de um antígeno estável para hepatite B sem traço de tiomersal na qual o antígeno bruto é submetido à cromatografia de permeação em gel, é 10 submetido à cromatografia de troca iônica e é misturado com um agente redutor possuindo grupo -SH livre.

Preferivelmente a cromatografia de troca iônica é cromatografia de troca aniônica.

A invenção adicionalmente proporciona um antígeno para 15 hepatite B livre de tiomersal obtenível pelo método de manufatura da presente invenção no qual o antígeno é pelo menos tão imunogênico quanto o antígeno para hepatite B manufaturado na presença de tiomersal.

A invenção adicionalmente proporciona um antígeno imunogênico para hepatite B possuindo uma razão média de proteína por φ 20 ELISA maior do que 1,5 e um conteúdo de RF1 com pelo menos um valor de IC₅₀ pelo menos 3 vezes menor do que aquele do antígeno de superfície para hepatite B manufaturado na presença de tiomersal.

Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a um método para a produção de um antígeno para hepatite B adequado para uso 25 em uma vacina, o método compreendendo a purificação do antígeno na presença de tiomersal e o subseqüente tratamento do antígeno na presença de um agente redutor compreendendo um grupo -SH livre.

Adequadamente o tratamento é seguido por uma etapa de purificação tal como uma etapa de diálise para remover tiomersal.

............. ?·· • · · ···· · · · · · * * · · · ·· ·· ·· ♦··· · ·· ·· • ···· ········ • · · ··· ··· · ·♦· · ·

Preferivelmente o agente redutor é cisteína, DTT, glutationa

ou 2-mercapto-etanol.

O antígeno para hepatite B da invenção pode ser usado quer para o tratamento quer para a profílaxia de infecções de hepatite B, 5 especialmente para o tratamento ou a profílaxia, por exemplo, de infecções crônicas de hepatite B.

A presente invenção adicionalmente proporciona uma formulação de vacina compreendendo um antígeno para hepatite B da presente invenção conjuntamente com um adjuvante. Preferivelmente o 10 adjuvante é um sal de alumínio ou um estimulador preferencial de resposta à célula TH1.

Preferivelmente o antígeno é um antígeno de superfície para hepatite B.

A preparação de antígeno de superfície para hepatite está bem 15 documentada. Veja por exemplo, Harford et. al. em Develop. Biol. Standard 54, páguna 125 (1983), Gregg et. al. em Biotechnology, 5, página 479 (1987), EP-A-0.226.846, EP-A-0-299.108 e suas referências.

Como aqui usada a expressão 'antígeno de superfície para hepatite' ou 'HBsAg' inclui qualquer antígeno HBsAg ou seu fragmento 20 mostrando a antigenicidade do antígeno de superfície para HBV. Será entendido que em adição à seqüência de 226 aminoácidos do antígeno HBsAg S (veja Tiollais et. al. Nature, 317, 489 (1985) e suas referências) HBsAg como aqui descrito pode, se desejado, conter toda ou parte de uma seqüência pré-S como descrita nas referências acima e em EP-A-0.278.940. 25 HBsAg como aqui descrito também pode se referir às variantes, por exemplo o 'mutante escape' descrito em WO 91/14703.

HBsAg também pode se referir aos polipeptídeos descritos em EP 0.198.474 ou em EP 0.304.578.

Normalmente o HBsAg estará na forma de partícula. Em uma • · · · · · • · • · · · • ·

modalidade particularmente preferida o HBsAg consistirá essencialmente do antígeno HBsAg S mencionado aqui acima.

A vacina pode vantajosamente incluir um excipiente farmaceuticamente aceitável tal como um adjuvante adequado. Adjuvantes 5 apropriados estão comercialmente disponíveis tais como, por exemplo, Adjuvante Completo ou Adjuvante Incompleto de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, MJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sais de alumínio tais como gel de hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de 10 alumínio; sais de cálcio, de ferro ou de zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcares acilados, polissacarídeos cationicamente ou anionicamente derivados; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil-lipídio A e quil A. Citocinas, tais como GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12, também podem ser usadas como adjuvantes.

Nas formulações da invenção é preferido que a composição de adjuvante induza uma resposta imune predominantemente do tipo TH1. Altos níveis de citocinas do tipo Thl (por exemplo, IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula para um antígeno administrado. Dentro de uma modalidade preferida, na qual uma 20 resposta é predominantemente do tipo Th-1, o nível de citocina do tipo Th-1 aumentará em uma extensão maior do que o nível de citocinas de tipo Th-2. Os níveis destas citocinas pode ser prontamente avaliado usando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas veja Mosmann e Coffrnan,

Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Conseqüentemente, os adjuvantes adequados para uso na geração de uma resposta predominantemente do tipo Th-1 incluem, por exemplo uma combinação de monofosforil-lipídio A, preferivelmente monofosforil-lipídio A 3-de-O-acilado (3D-MPL) juntamente com um sal de alumínio. Outros adjuvantes conhecidos que preferivelmente induzem uma ··· ♦

• · · · · · resposta imune do tipo Th-1 incluem oligonucleotídeos contendo CpG. Os oligonucleotídeos são caracterizados pelo fato de que o dinucleotídeo CpG está não metilado. Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e estão descritos, por exemplo, em WO 96/02555. Seqüências de DNA imunoestimulantes também são descritas, por exemplo, por Sato et. al., Science 273:352, 1996. Outro adjuvante preferido é uma saponina, preferivelmente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que pode ser usado sozinho ou em combinação com outros adjuvantes. Por exemplo, um sistema intensificado envolve a combinação de um 10 monofosforil-lipídio A e derivado de saponina, tal como a combinação de

QS21 e 3D-MPL como descrita em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica na qual a QS21 é reprimida com colesterol, como descrito em WO 96/33739. Outras formulações preferidas compreendem uma emulsão de óleo-em-água de tocoferol. Uma formulação de adjuvante particularmente 15 potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo-emágua está descrita em WO 95/17210.

Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL & tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água está descrita em WO 95/17210 e é uma formulação preferida.

Conseqüentemente em uma modalidade da presente invenção é proporcionada uma vacina compreendendo um antígeno de superfície para hepatite da presente invenção, que adicionalmente compreende um adjuvante indutor de TH-1. Uma modalidade preferida é uma vacina na qual o adjuvante indutor de TH-1 é selecionado do grupo de adjuvantes 25 compreendendo: 3D-MPL, QS21, uma mistura de QS21 e colesterol, e um oligonucleotídeo CpG. Outra modalidade preferida é uma vacina compreendendo um antígeno de superfície para hepatite e os adjuvantes monofosforil-lipídio A ou um seu derivado, QS21 e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água.

saponina, com maior preferência QS21. Outra formulação de adjuvante particular adequada incluindo CpG e uma saponina está descrita em WO 00/09159 e é uma formulação preferida. Mais preferivelmente a saponina 5 naquela formulação particular é QS21. Preferivelmente a formulação adicionalmente compreende uma emulsão de óleo-em-água e tocoferol.

A presente invenção adicionalmente proporciona uma formulação de vacina compreendendo um antígeno de superfície para hepatite da presente invenção conjuntamente com um adjuvante e 10 adicionalmente compreendendo um ou mais antígenos selecionados do grupo consistindo de: toxóide da difteria (D), toxóide do tétano (T), antígenos de pertussis acelular (Pa), vírus da pólio inativado (IPV), antígeno da influenza hemófila (Hib), antígeno da hepatite A, vírus do herpes simples (HSV), clamídia, GSB, HPV, antígenos para streptococcus pneumoniae e para 15 neisseria. Os antígenos que conferem proteção para outras doenças também podem ser combinados na formulação de vacina da presente invenção.

Em uma modalidade particular, a formulação de vacina compreende um antígeno de superfície para hepatite obtenível pelo método de manufatura da presente invenção conjuntamente com um adjuvante e um 20 vírus da pólio inativado.

A presente invenção também proporciona um método de tratamento e/ou de profilaxia de infecções do vírus da hepatite B, que compreende a administração a um indivíduo humano ou animal, sofrendo de ou suscetível à infecção do vírus da hepatite B, de uma quantidade segura e 25 efetiva de uma vacina da presente invenção para a profilaxia e/ou o tratamento da infecção de hepatite B.

A invenção adicionalmente proporciona o uso de um antígeno de superfície para hepatite da presente invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento de pacientes sofrendo de uma infecção do

vírus da hepatite B, tal como infecção crônica do vírus da hepatite B.

A vacina da presente invenção conterá uma quantidade imunoprotetora do antígeno e pode ser preparada por técnicas convencionais.

A preparação da vacina está em geral descrita em

Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design - the subunid and adjuvant approach, editado por Powell and Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et. al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. Encapsulação dentro de lipossomas é descrita, por exemplo, por Fulleron, Patente U.S.

4.235.877. Conjugação de proteínas em macromoléculas é descrita, por exemplo, por Likhite, Patente U.S. 4.372.945 e por Armor et. al., Patente U.S. 4.474.757. Uso de Quil A é descrito por Dalsgaard et. al., Acta Vet Scand, 18:349 (1977). 3D-MPL está disponível na Ribi Immunochem, USA, e é descrito no Pedido de Patente Britânica 2220211 e na Patente U.S. 4912094.

QS21 é descrita na Patente U.S. 5057540.

A presente invenção é ilustrada mas não limitada pelos seguintes exemplos, nos quais:

A Figura 1 ilustra o processo de produção livre de tiomersal para Engerix B™;

• 20 A Figura 2 ilustra a análise por SDS-PAGE de lotes de carga de antígenos (bulk antigen)', e

A Figura 3 ilustra proteínas de levedura residuais em lotes de carga de antígenos (bulk antigen) produzidos pelo processo livre de tiomersal.

Exemplo 1:

Produção de antígeno de superfície para hepatite B na presença de tiomersal

O antígeno de superfície para hepatite (HBsAg) da vacina monovalente para hepatite B da SB Biologicals (Engerix B™) é expressado como uma proteína recombinante em Saccharomyces cerevisiae (veja

Harford et. al. loc. cit.). A proteína de 24 kD é produzida intracelularmente e acumulada nas células de levedura recombinantes. No final da fermentação as células de levedura são coletadas e rompidas na presença de um surfatante suave tal como Tween 20 para liberar a proteína desejada. Subseqüentemente 5 o homogeneizado celular, contendo as partículas de antígeno de superfície solúveis, é pré-purificado em uma série de precipitações e depois é concentrado via ultrafiltração.

Purificação adicional do antígeno recombinante é realizada em separações cromatográficas subseqüentes. Em uma primeira etapa o 10 concentrado de antígeno bruto é submetido à cromatografia de permeação em gel sobre meio Sepharose 4B. Tiomersal está presente no tampão de eluição na etapa de cromatografia de permeação em gel 4B. O tampão de eluição possui a seguinte composição: Tris 10 mM, 5% de etileno-glicol, pH 7,0, tiomersal 50 mg/ml. Tiomersal é incluído neste tampão para controlar a 15 biocarga. A maior parte deste tiomersal é removida durante as subseqüentes etapas de purificação incluindo cromatografia de troca iônica, ultracentrifugação e dessalinização (permeação em gel) de modo que as preparações de antígeno volumosas purificadas preparadas pelo processo original contenham cerca de 1,2 pg e menos do que 2 pg de tiomersal por 20 20 pg de proteína.

Uma etapa de cromatografia de troca iônica é realizada usando uma matriz de DEAE e este material reunido é então submetido a uma ultracentrifugação de gradiente de césio sobre 4 camadas pré-estabelecidas de diferentes concentrações de cloreto de césio. As partículas de antígeno são 25 separadas dos constituintes celulares contaminadores de acordo com sua densidade no gradiente e eluídas no final do processo de centrifugação. O cloreto de césio é então removido deste material reunido por uma segunda permeação em gel sobre gel Sepharose.

Quando HBsAg é preparado pelo processo contendo tiomersal no tampão de permeação em gel 4B, concentrações de proteína acima de 30 mg/ml são recuperadas nas frações contendo HBsAg reunidas do gradiente de CsCl, correspondendo a uma concentração equivalente de HBsAg como ensaiada pelo AUSZYME kit do Abbott Laboratories.

A etapa de ultracentrifugação de CsCl utilmente elimina lipídeos residuais, DNA e contaminantes de proteína menores da preparação de HBsAg. Ela é conduzida por centrifugação zonal em um rotor Ti 15 da Bechman Instruments, Fullerton, Califórnia em uma velocidade de 30.000 rpm por cerca de 40 a 60 horas. A amostra a ser purificada é aplicada em camadas de solução de CsCl com concentrações finais de 0,75, 1,5, 2,5 e 3,25 M de CsCl. No final da centrifugação o gradiente é eluído em frações. As frações contendo HBsAg podem ser identificadas por absorbância de UV a 280 nm ou pelo teste das diluições das frações com o AUSZYME kit. A banda de HBsAg está em uma densidade de 1,17 a 1,23 g/cm .

A solução contendo o HBsAg purificado é esterilmente filtrada antes de ser usada para preparar a formulação de vacina. A purificação do lisado de célula de levedura é complexa visto que o antígeno é produzido intracelularmente e uma série de técnicas de separação planejadas para se eliminarem os tipos diferentes de contaminantes (levedura) são Q 20 necessárias para se obter a carga de antígenos (bulk antigen) pura. As etapas de purificação são importantes, porque o produto a ser purificado é uma partícula de lipoproteína contendo múltiplas cópias de polipeptídeo de antígeno de superfície e esta estrutura tem que ser mantida durante todo o processo de purificação. É uma particularidade deste processo o fato de ele dar partículas de antígeno de superfície que são totalmente imunogênicas sem a necessidade de tratamento químico adicional para aumentar a imunogenicidade (comparar com EPO 135435).

Os detalhes do processo de produção são adicionalmente descritos na Patente Européia 0199698.

Exemplo 2

Produção e caracterização de HBsAg derivado de levedura por um processo livre de tiomersal.

1. Produção e purificação de HBsAg derivado de levedura

1.1 Esboço do processo de produção:

Antígeno de superfície para hepatite pode ser produzido por fermentação de uma cepa apropriada de Saccharomyces cerevisiae, por exemplo aquela descrita por Harford et. al. (loc. cit.).

No final da fermentação em grande escala da cepa de levedura 10 recombinante, as células são coletadas e rompidas na presença de um surfatante suave tal como Tween 20. O antígeno de superfície é então isolado por um procedimento de purificação e extração de múltiplas etapas exatamente descrito acima no Exemplo 1 até a etapa da primeira permeação em gel sobre Sepharose 4B.

1.2 Processo de purificação livre de tiomersal:

No processo livre de tiomersal as seguintes duas modificações têm sido introduzidas comparado com o processo descrito no Exemplo 1.

1. O tampão de eluição na etapa de cromatografia de permeação em gel 4B não mais contém tiomersal.

2. Cisteína (concentração final de 2 mM) é adicionada no eluato reunido da etapa de cromatografia de troca iônica.

Foi verificado que a omissão de tiomersal do tampão de permeação em gel 4B pode resultar na precipitação de partículas de HBsAg durante a etapa de centrifugação em gradiente de densidade de CsCl com 25 perda de produto e agregação ou agrupamento do antígeno recuperado.

A adição de cisteína na concentração final de 2 mM no eluato reunido da etapa de cromatografia de troca iônica precedente previne a precipitação e a perda de antígeno durante a centrifugação em densidade de CsCl.

porque ela é um aminoácido de ocorrência natural e pode ser removida na etapa de dessalinização subseqüente em uma coluna de permeação em gel usando Sepharose 4BCLFF como a matriz da coluna.

Não há outras modificações no processo de manufatura comparado com o processo descrito no Exemplo 1.

O processo livre de tiomersal dá carga de antígenos {bulk antigeri) de uma pureza e com propriedades comparáveis com o antígeno do processo do Exemplo 1.

1.2a

Considera-se que o tiomersal adicionado no tampão 4B a 50 pg/ml se decompõe e o etil-mercúrio resultante pode atacar covalentemente os grupos sulfidrila livres nos resíduos de cisteína da proteína. A proteína contém 14 resíduos de cisteína dos quais 7 estão localizados entre as posições 15 101 e 150.

Acredita-se que esta região da proteína está localizada na superfície da partícula e contém a maior região antigênica do HBsAg incluindo a região imunodominante a e o sítio de reconhecimento para o anticorpo monoclonal RF1 (Waters J et. al., Postgrad. Med. J., 1987: 63 4^ 20 (Suppl. 2): 51-56 e Ashton-Rickardt e Murray J. Med. Virology, 1989: 29: 196). Antígeno purificado com tiomersal presente no tampão de permeação em gel 4B contém cerca de 0,6-0,6 pg de mercúrio no final do processo de purificação. Este mercúrio não é totalmente removido por simples diálise.

Em um experimento, 0,56 pg de mercúrio por 20 pg de 25 proteína foi medido na preparação de carga de antígenos {bulk antigeri). Esta preparação foi dialisada por 16 horas na temperatura ambiente contra tampão de NaPO₄ [sic] 10 mM, NaCl 150 mM, pH 6,9. No final da diálise, uma concentração de 0,33 pg de Hg por 20 pg de proteína foi medida.

Em contraste, a diálise na presença de um agente redutor tal

0/.

• 20

como L-cisteína a 0,1 a 5,0 mg/ml, DTT a 50 mM ou 2-mercapto-etanol a 0,5 M, seguida por uma segunda diálise para remover o agente redutor, resulta na redução do conteúdo de mercúrio da preparação de antígeno para menos do que 0,025 pg de mercúrio por 20 pg de proteína. Este é o limite inferior de detecção do método.

O conteúdo de mercúrio foi determinado por espectrofotometria de absorção. O antígeno é diluído em uma solução contendo 0,01% p/v de bicromato de potássio (K₂Cr₂O₇) e 5% v/v de ácido nítrico. Soluções padrão são preparadas com o tiomersal como a fonte de mercúrio. A absorção atômica da amostra e das soluções padrão é medida após vaporização em um gerador de vapor, com um catodo mercúrioespecífico a 253,7 nm. Absorção atômica do líquido diluído é medida como branco. O conteúdo de mercúrio da amostra é calculado via curvas de calibração obtidas das soluções padrão. Os resultados são expressados como pg de mercúrio por 20 pg de proteína.

1.3 Produção de carga de antígenos (bulk antigetí) livre de tiomersal:

As etapas de processo para a purificação de carga de antígenos (bulk antigeri) são mostradas na Figura 1.

1.4 Composição da vacina formulada sem tiomersal:

Uma composição quantitativa típica para uma vacina para hepatite B sem conservante e formulada com o antígeno preparado pelo processo livre de tiomersal é proporcionada na Tabela 1.

Tabela 1

Constituinte	Quantidade por ml
Constituinte ativo-Proteína da qual pelo menos 95% é HBsAg	20 pg
Hidróxido de alumínio (adsorvente) (expressado como A1₂O₃)	0,95 g
Cloreto de sódio	9,0 mg (máximo)
Fosfato de dissódio di-hidratado	0,98 mg
Di-hidrogeno-fosfato de sódio di-hidratado	0,71 mg
Água para injeção q.s. ad	1,0 ml

A composição pode ser variada pela adição de 3D-MPL e/ou • ·· ·* ··*····«· · ·· ' · * 4 w · t « * « · · ·· · »·>·**« ♦·· f • * · « · ·£······ • <1 · 4»·«·· · ··· ·* de outros adjuvantes.

2. Caracterização da carga de antígenos (bulk antigen) e da vacina produzidas pelo processo livre de tiomersal

2.1 Testes e ensaios sobre a carga de antígenos (bulk antigen) purificada:

. 5 2.1.1 Base de comparação:

Três lotes de carga de antígenos (bulk antigen) foram preparados pelo processo livre de tiomersal de acordo com este exemplo (Exemplo 1.2) e são identificados como HEF001, HEF002 e HEF003.Estes foram comparados com um lote de carga de antígenos (bulk antigen) (HEP2055) preparado pelo processo anterior (como descrito no Exemplo 1) na presença de tiomersal.

2.1.2 Testes e ensaios sobre a carga de antígenos (bulk antigen)-.

Os três lotes de carga de antígenos (bulk antigen) produzidos pelo processo livre de tiomersal foram testados e os resultados são 15 sumariados na Tabela 2.

Conteúdo de proteína foi medido pelo método de Lowry et. al. (J. Biol. Chem. 1951: 193:265).

Conteúdo de endotoxina foi medido por uma técnica de coagulação em gel de Limulus usando um kit comercialmente disponível da W 20 Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. O reagente é padronizado contra US Pharm. Endotoxin Reference Standard.

Tween 20 foi medido pelo método de Huddleston e Allred (J. Amer. Oil Chemist Soc., 1965:42:983).

Conteúdo de HBsAg foi medido pelo AUSZYME kit comercialmente disponível da Abbott Laboratories, One Abbott Park Road,

IL 60064, USA. O procedimento de ensaio B do fabricante foi empregado.

Uma batelada de carga de antígenos (bulk antigen) purificada pelo processo contendo tiomersal foi usada como um padrão para estabelecer a curva de resposta de dose.

• ·

Polissacarídeos foram medidos pelo método de Dubois et. al.

(Anal. Chem. 1956:28:350).

Lipídeos foram medidos usando um kit comercialmente disponível (Mekotest Total Lipids 3321) da E. Merck, B. P. 4119, Darmstad 5 D-6100, Alemanha.

Conteúdo de DNA foi medido pelo método de Threshold usando aparelhagem e reagentes disponíveis comercialmente na Molecular Devices Corp., GutenbergerstraPe 10, Ismaning, Munique, Alemanha.

Os valores encontrados nos testes e ensaios estão dentro da faixa vista para os lotes de carga de antígenos (bulk antigen) fabricados usando tiomersal no tampão de eluição da etapa de permeação em gel de Sepharose 4B, com a exceção da atividade antigênica por ELISA. Os valores para esta medição para as três preparações de HEF são maiores (1,63-2,25) do que aqueles verificados para o lote de carga de antígenos (bulk antigen)

HEP2005 que possui uma razão de proteína por ELISA de 1,13. As razões de proteína por ELISA medidas pelo AUZYME kit para as bateladas de carga de antígenos (bulk antigen) contendo tiomersal são em geral de cerca de 1,0 dentro da faixa de 0,8-1,2 e muito raramente excedem 1,4.

2.1.3 Análise em gel SDS-PAGE:

As preparações de carga de antígenos (bulk antigen) foram ensaiadas pela análise em SDS-PAGE em condições redutoras e coloração com azul Coomassie. Todas as amostras mostraram uma banda maior a 24K com traços de uma proteína dimérica. As amostras foram julgadas como sendo de alta pureza (> 99% puras) devido à ausência de bandas visíveis de proteínas contaminantes.

Amostras (1 μg) de preparações de carga de antígenos (bulk antigen) foram ensaiadas por SDS-PAGE em condições redutoras e nãoredutoras e coloração de prata (Figura 2). Nas condições redutoras as amostras mostraram uma banda intensa migrando a 24K com traços de

daquele de HEP2055 como comparador. As amostras também foram corridas em condições não-redutoras. Nestas condições menos material migra a 24K e é aumentada a quantidade de polipeptídeo migrando em posições diméricas e _ 5 multiméricas. Os lotes de carga de antígenos (bulk antigen) livre de tiomersal parecem possuir um grau de polimerização um pouco maior do que o do lote de HEP2055 comparador.

A identidade do polipeptídeo 24K revelada por azul de comassa ou manchamento de prata foi confirmada por Western blotting com anticorpos policlonais de coelho produzido contra plasma HbsAg. As i preparações de carga de antígeno apresentaram uma banda principal a 24K junto com formas diméricas e triméricas. A técnica revela pequenos traços de produtos de ruptura da proteína de antígeno de superfície. Não há diferenças entre o antígeno de carga preparado pelo processo isento de tiomersal e o lote 15 deHEP2055.

A presença de proteínas de levedura residuais foi ensaiada pela análise em SDS-PAGE em condições redutoras e por Western blotting com anti-soro policlonal de coelho produzido contra proteínas de levedura (Figura 3). A técnica é qualitativa e não permite a quantificação das impurezas.

* 20 Um padrão de banda constante é mostrado sobre os três lotes de carga de antígenos (bulk antigen) preparados pelo processo livre de tiomersal e o lote HEP2055 com uma exceção.

Uma banda intensamente colorida a ± 23K na carga de antígenos (bulk antigen) HEP2055 está virtualmente ausente nas 3 25 preparações de HEP. O Western blotting mostra que o processo de purificação livre de tiomersal resulta em um produto de antígeno mais puro.

Tabela 2: Resultados dos testes e ensaios sobre carga de antígenos (bulk antigen) livre de tiomersal, purificada:

TESTE	resultado'	• ······ · ·
HEF001	HEF002	HEF003	HEP2055
PH	6,8	6,8	6,8	6,8
Conteúdo de proteína por Lowry	1312 pg/ml	888 pg/ml	913 pg/ml	995 pg/ml
Conteúdo de endotoxina	< 0,25 EU	< 0,25 EU	< 0,25 EU	< 0,25 EU
Conteúdo de Tween 20	7,1 g	6,6 pg	7,4 pg	5,8 pg
Atividade antigênica por ELISA	2957 pg/ml	1505 pg/ml	1486 pg/ml	1128 pg/ml
Razão de proteína por ELISA	2,25	1,69	1,63	1,13
Conteúdo de polissacarídeo	0,33 pg	0,35 pg	0,33 pg	0,34 pg
Conteúdo de lipídio	13,7 pg	12,8 pg	12,9 pg	11,8 pg
Conteúdo de DNA por Threshold	< 1 Pg	<ipg	< 1 Pg	< ipg

2.1.4 Outros ensaios e testes bioquímicos:

2.1.4.1 Conteúdo de DNA’.

O conteúdo de DNA dos 3 lotes de carga de antígenos (bulk antigen) foi medido pelo método de Threshold (Molecular Devices Corp.). As quantidades medidas foram menores do que 10 pg de DNA por 20 pg de proteína (Tabela 2); o mesmo nível de conteúdo de DNA visto com a carga de antígenos (bulk antigeri) produzida pelo corrente processo aprovado.

2.1.4.2 Composição de aminoácido’.

A composição de aminoácido dos três lotes de carga de antígenos (bulk antigen) HEF foi determinada, após hidrólise ácida com HC1 6 N, por cromatografia dos aminoácidos em uma coluna de troca iônica com detecção de pós-coluna com ninhidrina. Prolina e triptofado não foram determinados. Os resultados são dados na Tabela 3.

As composições encontradas concordam bem com aquela 15 determinada para HEP2005 e com a composição esperada derivada da seqüência de DNA. Embora o número de resíduos de glicina medido para HEP2055 esteja próximo do da composição esperada, um valor de 16 a 17 resíduos é mais normalmente medido para preparações de carga de antígenos (bulk antigen). O número médio de resíduos de cisteína encontrado é o 20 esperado 14, mostrando que não foram encontradas cisteínas extras na

• · · · · · partícula como um resultado do tratamento na etapa de gradiente de CsCl.

2.1.4.3 Quantificação de cisteína livre\

A quantidade de cisteína livre presente nas preparações de carga de antígenos (bulk antigen) obtida de acordo com o método descrito foi medida após oxidação das partículas com ácido perfórmico sem prévia hidrólise ácida. Resíduos de cisteína livre oxidada foram separados em uma coluna de troca iônica com detecção de pós-coluna com ninhidrina. O limite de detecção de cisteína por este método é de 1 pg por ml.

Cisteína livre não pode ser medida nas 3 preparações de antígeno HEF quando testadas nas concentrações de proteína iniciais dadas na Tabela 2.

A técnica mede tanto os resíduos de cisteína livre presentes no tampão quanto os resíduos de cisteína que estão ligados na proteína HBsAg por ligação de dissulfeto mas que não formam parte da seqüência do 15 polipeptídeo.

2.1.4.4 Análise da seqüência N-terminal'.

A presença de possíveis contaminantes protéicos e de produtos de degradação nos três lotes de carga de antígenos (bulk antigen) produzidos pelo processo modificado foi avaliada pela análise da seqüência 20 N-terminal baseada na degradação de Edman. A seqüência N-terminal MENITS... da proteína HBsAg foi detectada sem interferência de outras seqüências. Também foi confirmado que a metionina N-terminal está 60-75% bloqueada por acetilação, conforme observado previamente para o polipeptídeo HBsAg produzido pelo processo de rotina.

Tabela 3: Composição de aminoácidos de HBsAg:

Aminoácido	HEF001	HEF002	HEF003	Comp. média	HEP2055	Comp. esperada
Asp	11,3	11,3	11,3	11,3	11,5	10
Thr	17,5	17,4	17,2	17,4	17,8	17
Ser	21,4	21,6	21,4	21,5	20,9	23
Glu	11	11	11	11,0	10,5	9
Pro	nd	nd	nd		nd	24
Gly	17,1	16,8	16,7	16,9	14,6	14
Ala	7,5	7,4	7,4	7,4	7,2	6
Cys	12,3	14,95	14,9	14,1	13,2	14
Vai	10,9	11	10,9	10,9	10,7	11
Met	6,8	6,7	7,1	6,9	7,1	6
Ile	12,3	12,4	12,5	12,4	12,2	16
Leu	26,3	26,6	26,2	26,4	26,7	33
Tyr	6,8	6,8	6,8	6,8	7	6
Phe	13,8	13,9	13,8	13,8	13,9	15
His	3	2,8	3,3	3,0	3,3	1
Lys	4	4	3,9	4,0	4,2	3
Arg	5,7	5,8	5,7	5,7	6,1	5
Trp	nd	nd	nd		nd	13

2.1.4.5 Análise de espalhamento de luz laser.

Comparações de tamanho de partícula foram feitas por espalhamento de luz laser entre as partículas de HBsAg produzidas usando o processo modificado e o lote de referência HEP2055 (Tabela 4).

Os pesos moleculares médios determinados mostram boa consistência entre as preparações.

Tabela 4: Pesos moleculares da partícula de HBsAg por espalhamento de luz laser:

Lote de antígeno	PM (Daltons)
HEH001	3,07 x 10⁶
HEF002	2,76 χ 10⁶
HEF003	2,76 x 10⁶
HEP2055	3,34 x 10⁶

2.1.4.6 Microscopia eletrônica;

As preparações de carga de antígenos (bulk antigeri) foram examinadas por microscopia eletrônica após fixação e coloração com acetato de uranila.

• 20

As partículas observadas foram semelhantes em todas as amostras e conformaram-se com as partículas subesféricas ou arredondadas de ± 20 nm típicas de HBsAg. As partículas observadas nos 3 lotes de HEF foram indistinguíveis de HEP2055.

2.1.5 Análises imunológicas:

2.1.5.1 Reatividade com anticorpo monoclonal RF1:

As três preparações de carga de antígenos (bulk antigen) foram testadas para sua reatividade com o anticorpo monoclonal RF1 pelo ensaio de inibição ELISA. Tem sido mostrado que o anticorpo monoclonal RF1 protege chimpanzés contra infecção por HBV e é considerado em reconhecer um epitopo conformacional protetor sobre a partícula de HBsAg (Iwarson S. et. al., 1985, J. Med. Virol., 16: 89-96).

O hibridoma de RF1 pode ser propagado na cavidade peritoneal de camundongos BalbC ou em cultura de tecido.

Fluido ascítico diluído a 1/50000 em tampão de saturação (PBS contendo 1% BS A, 0,1% Tween 20) foi misturado 1:1 com várias diluições em PBS das amostras de HBsAg a serem testadas (concentrações finais variando entre 100 pg e 0,05 pg/ml).

Misturas foram incubadas em Nunc Immunoplates (96U) por 1 hora a 37°C antes de serem transferidas por 1 hora a 37°C para cima de placas revestidas com uma preparação padrão de HBsAg. A preparação padrão de HBsAg foi um lote de carga de antígenos (bulk antigeri) (Hep 286) purificado pelo processo contendo tiomersal. Após uma etapa de lavagem com PBS contendo 0,1% de Tween 20, IgG de ovelha biotina-conjugada anticamundongo diluída 1/1000 em tampão de saturação foi adicionada e incubada por 1 hora a 37°C. Após uma etapa de lavagem, complexo de peroxidase estreptavidina-biotinilada diluído 1/1000 em tampão saturado foi adicionado nos mesmos receptáculos e incubado por 30 min a 37°C. Placas foram lavadas e incubadas com uma solução de OPDA 0,04%, H₂O₂ 0,03%

em tampão de citrato 0,1 M pH 4,5 por 20 min na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com H₂SO₄ 2 N e as densidades ópticas (O.D.) foram medidas a 490/630 nm e plotadas graficamente.

A IC50, definida como a concentração de antígeno (concentração de inibidor) que inibe 50% da ligação do anticorpo em HBsAg revestido foi calculada usando uma equação de 4 parâmetros e expressada em ng/ml.

Uma série de lotes de antígeno HEP incluindo HEP2055 também foi testada, juntamente com o antígeno gD do herpes simples como controle negativo. O ensaio mede a capacidade de cada antígeno de teste de inibir a ligação de RF1 em uma preparação de antígeno padrão (HEP286) ligado em placas de microtítulo.

A Tabela 5 fornece as concentrações de cada antígeno que foram verificadas em inibir 50% da ligação de RF1 no antígeno afixado.Tabela 5: Inibição da ligação de anticorpo monoclonal RF1 em HBsAg:

Carga de antígenos (bulk antigeri)	IC₅₀ (ng/ml)*
HEP286	3834
HEP673	3437
HEP720	3150
HEP720	3150
HEP2055	2384
HEF001	468
HEF002	574
HEF003	540

* IC₅₀ = concentração de antígeno (ng/ml) inibidora de 50% da ligação de RF1 em antígeno fixado.

Os resultados mostram que 4 a 7 vezes menos de antígeno HEF é requerido para inibir a ligação de RF1 (Tabela 5). Isto mostra que o antígeno preparado pelo processo modificado possui uma apresentação aumentada de epitopo de REI comparada com a carga de antígenos (bulk antigeri) HEP.

humanos de vacinas Engerix B™ em vez de RF1 mAb e não revelou diferenças entre lotes de antígeno HEP e os antígenos HEF.

2.1.5.2 Afinidade de ligação em RF1 monoclonal·.

Os parâmetros cinéticos da ligação de anticorpo monoclonal RF1 nos 3 lotes de antígeno HEF e em HEP2055 foram medidos por ressonância superfície plásmica usando uma aparelhagem Biacore 2000 da Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Place, Little Chalfont, Bucks, U.K. Os parâmetros cinéticos medidos foram:

ka: a constante de velocidade de associação (M^S’¹) kd: a constante de velocidade de dissociação (S^_1)

Ka: a constante de equilíbrio ou de afinidade (M'¹) sendo que Ka = — kd

Os valores verificados são dados na Tabela 6.

Tabela 6: Constantes de afinidade da ligação de RF1 em HbsAg:

Carga de antígenos (bulk antigen)	ka (χ IO’³)	kd (χ 10⁵)	Ka (χ 10'⁷)
HEF001	6,81	3,21	21,97
HEF002	6,89	3,73	18,83
HEF003	7,39	4,67	15,80
HEP2055	3,31	6,30	5,31

Os três lotes de antígeno HEF deram valores de afinidade de ligação e de constantes de associação / dissociação semelhantes.

Em contraste HEP2055 possui uma afinidade mais fraca para ligação em RF1.

Isto está consistente com os resultados do ensaio de inibição ELISA que mostrou que o antígeno preparado pelo processo livre de tiomersal teve uma apresentação aumentada de epitopo de RF1.

2.2 Teste e ensaios sobre a vacina formulada com antígeno produzido pelo processo modificado:

Os três lotes de antígeno HEF foram absorvidos sobre hidróxido de alumínio e formulados como vacina de acordo com a • 20 composição mostrada na Tabela 1. A apresentação é a dose de adulto em frascos (20 pg de proteína de antígeno em 1 ml). Os lotes são identificados como DENS001A4, DENS002A4 e DENS003A4.

A potência da vacina foi medida por um ensaio de conteúdo de antígeno in vitro usando os AUSMYME ELISA kit do Abbott Laboratories e um lote clássico de vacina formulada com 50 pg/ml de tiomersal como padrão. A potência da vacina foi medida usando o método B como descrito em PharmaEuropa Special Issue Bio97-2 (Dezembro de 1997). Os três lotes de HEF dão altos valores de conteúdo de antígeno, quase o dobro do conteúdo enunciado de 20 pg de proteína de antígeno.

2.2.1 Reatividade da vacina DENS com anticorpo monoclonal RF1:

A antigenicidade da vacina absorvida foi adicionalmente testada em um ensaio de inibição com anticorpo monoclonal RF1. O ensaio mede a capacidade da amostra de vacina de inibir a ligação de RF1 em carga de antígenos (bulk antigeri) fixada (HEP286).

Ácido ascítico diluído a 1/50000 em tampão de saturação (PBS contendo 1% BSA, 0,1% Tween 20) foi misturado 1:1 com várias diluições em PBS das amostras de vacina a serem testadas (concentração variando entre 20 pg e 0,05 pg/ml).

Misturas foram incubadas em Nunc Immunoplates (96U) por 2 horas a 37°C com agitação antes de serem transferidas para cima de placas revestidas com HBsAg. A preparação de HBsAg usada para revestir foi um lote de carga de antígenos (bulk antigen) (Hep 286) purificada pelo processo contendo tiomersal. As três placas foram então incubadas por 2 horas a 37°C com agitação. Após uma etapa de lavagem com PBS contendo 0,1% de Tween 20, IgG de ovelha biotina-conjugada anti-camundongo diluída 1/1000 em tampão de saturação foi adicionada e incubada por 1 hora a 37°C. Após uma etapa de lavagem, complexo de peroxidase estreptavidina-biotinilada η

diluído 1/1000 em tampão de saturação foi adicionado nos receptáculos e incubado por 30 min a 37°C. Placas foram lavadas e incubadas por 20 min na temperatura ambiente com uma solução contendo OPDA 0,04%, H2O2 0,03% em tampão de citrato 0,1 M pH 4,5. A reação foi interrompida com H₂SO₄ 2

N e as densidades ópticas (O.D.) foram medidas a 490/630 nm e plotadas graficamente.

A vacina preparada com carga de antígenos (bulk antigeri) produzida pelo processo modificado foi comparada com a vacina Engerix B™ formulada com carga de antígenos (bulk antigeri) HEP clássica e sem tiomersal como conservante.

Os ensaios foram realizados em triplicada.

Os resultados são dados na Tabela 7 e mostram que metade da quantidade de vacina DENS é requerida para alcançar inibição de 50% da ligação de RF1 em comparação com a vacina Engerix B™ livre de conservante. Isto reflete uma apresentação aumentada de epitopo de RF1 20 sobre o antígeno HEF/DENS e está consistente com os testes feitos usando anticorpo RF1 sobre a carga de antígenos (bulk antigen) purificada.

Tabela 7: Inibição da ligação de REI pela vacina formulada:

Lote de vacina	IC-50 (ng/ml)⁽¹⁾
1	2	3	Média
DENS001A4	913	662	603	726
DENS002A4	888	715	521	708
DENS003A4	817	685	582	695
ENG5100A2	1606	1514	1481	1534
ENG3199B9	1329	1170	1286	1262
ENG3328A9	1417	1194	1334	1315

(1) Concentração de vacina inibidora de 50% da ligação de anticorpo REI em antígeno fixado.

2.2.2 Imunogenicidade de vacina DENS em camundongos:

Um estudo foi realizado em camundongos Balb/c com o propósito de comparar a imunogenicidade de três lotes de consistência de DENS com Engerix B™ produzida de acordo com o corrente processo de -. 5 produção de antígeno e formulada com tiomersal.

Os seguintes lotes foram testados:

#DENS001A4 #DENS002A4 # DENS003A4 # ENG2953A4/Q como referência.

Em resumo, grupos de 12 camundongos foram imunizados intramuscularmente duas vezes em intervalos de 2 semanas com doses de vacina correspondendo a 1/10 (2 μg) ou 1/50 (0,4 μg) da dose para humano adulto. Resposta de anticorpo para HbsAg e o perfil isotípico induzido pela 15 vacinação foram monitorados dos soros retirados no dia 28.

Planejamento experimental:

Grupos de 12 camundongos Balb/C foram imunizados intramuscularmente em ambas as pernas (2x5 Ομί) nos dias 0 e 15 com as seguintes doses de vacina:

W 20 Tabela 8: Grupos e dose de vacina:

Grupo	Vacina	Volume	Dose de antígeno
1 2	DENS001A4 ->Diluída 5X PO₄/NaCl	em	100 μΐ 100 μΐ	2 Pg 0,4 pg
3 4	DENS002A4 ->Diluída 5X PO₄/NaCl	em	100 μΐ 100 μΐ	2 pg 0,4 μg
5 6	DENS003A4 —>Diluída 5X PO₄/NaCl	em	100 μΐ 100 μΐ	2 pg 0,4 μβ
7 8	ENG2953A4/Q -^•Diluída 5X PO4/NaCl	em	100 μΐ 100 μΐ	2 pg 0,4 pg

Nos dias 15 (duas semanas após I) e 28 (2 semanas post II) sangue foi retirado do seio retroorbital.

Para o planejamento deste experimento (4 formulações x 2 doses com 12 camundongos por grupo), a potência foi estimada a priori com o programa estatístico PASS. O programa estatístico PASS (Power and .. 5 Sample Size) foi obtido na NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. Para as análises de variância bivariada, uma diferença de 2,5 vezes de GMT entre formulações com um erro alfa de 5% deve ser detectada com uma potência > 90%.

Resultados:

Serologia:

Respostas humorais (lg total e isótipos) foram medidas pelo ensaio ELISA usando HbsAg (Hep286) como antígeno revestido e anticorpos biotina-conjugados anti-camundongo para revelar a ligação de anticorpo antiHBS. Apenas foram analisados soros de post II.

A tabela 9 mostra a média e as respostas de GMT de anticorpo lg anti-HBs medidas em soros individuais em 2 semanas post II.

Respostas de anticorpo comparáveis são induzidas pelas formulações de DENS e formulação para hepatite B clássica: GMT variando entre 2304 e 3976 EU/ml para lotes de DENS comparado com 2882 EU/ml W 20 para vacina monovalente para hepatite B da SB Biologicals (Engerix B™) na dose de 2 pg, e GMT variando entre 696 e 1182 EU/ml para lotes de DFENS comparado com 627 EU/ml para vacina monovalente para hepatite B da SB Biologicals (Engerix B™) na dose de 0,4 pg.

• Como esperado um claro efeito de faixa de dose de 25 antígeno é observado para todas as formulações nas doses de 2 pg e de 0,4 pg com uma diferença de 3 a 6 vezes nos GMTs.

• 4 Camundongos não respondedores (títulos <50 EU/ml) foram observados sem claras ligações com os lotes ou as doses de antígeno usados(as) para a injeção (Grupos 1, 2, 3 e 8; um camundongo por grupo).

camundongos foram descartados de análise adicional.

Tabela 9: Resposta de anticorpo em camundongos no dia 28 (2 semanas post Π)

«	Grupo	Vacina	Dose	Número	TÍTULOS EL Média	-ISA (Ig) GMT
	1	DENS001A4	2pg	11	3466	2971
	2		0.4 pg	11	1283	1182
	3	DENS002A4	2pg	11	2436	2304
	4		0.4 pg	12	984	786
	5	DENS003A4	2pg	12	4583	3976
•	6		0.4 pg	12	997	696
	7	ENG2953A4/Q	2pg 0.4 pg	12 11	3999 737	2882 627

Análise estatística:

Uma análise de variância bivariada foi realizada nos títulos de anti-HBs depois de transformação log de dados de post II, usando as vacinas (4 lotes) e as doses de antígeno (2 pg e 0,4 pg) como fatores. Esta análise confirmou que uma diferença estatisticamente significativa foi observada 10 entre as duas doses de antígeno (valor de p < 0,001) e não mostrou qualquer diferença significativa entre os lotes de vacina (valor de p = 0,2674). Como mencionado previamente a potência foi estimada a priori e o planejamento do experimento foi tal que uma diferença de 2,5 vezes do GMT com um erro alfa de 5% pode ser detectada entre as formulações com uma potência > 90%.

Perfil isotípico:

A Tabela 10 mostra a repartição isotípica (IgGl, IgG2a e IgG2b) calculada de uma análise sobre os soros reunidos em post II.

• Como esperado, clara resposta de TH2 é induzida pelas mesmas vacinas baseadas em alume visto que principalmente anticorpos 20 IgGl são observados.

Nenhuma diferença é observada entre os lotes de DENS ou a vacina monovalente para hepatite B de SB Biologicals em termos de perfil isotípico.

Tabela 10: Repartição de isótipos de IgG em soros de dia 28 reunidos:

Grupo	Vacina	Dose	lgG1	Isotipo (%) lgG2a	lgG2b
1	DENS001A4	2gg	91	4	5
2		0.4 gg	87	8	5
3	DENS002A4	2gg	97	2	1
4		0.4 gg	87	6	7
5	DENS003A4	2gg	98	1	1
6		0.4 gg	93	4	3
7	ENG2953A4/Q	2gg	88	8	4
		0.4 gg	88	9	3

Exemplo 3: Formulação de vacinas combinadas:

A carga de antígenos {bulk antigen) da invenção é particularmente adequado para a formulação em uma vacina combinada compreendendo IPV.

Estudos de estabilidade realizados em lotes finais de uma 10 vacina combinada de DTPa-HBV-IPV indicaram um declínio na potência do componente IPV, particularmente de antígeno de poliomielite de tipo 1, quando se usa um imunoensaio in vitro (determinação de conteúdo de antígeno D por ELISA) e um teste da potência em rato in vivo. Não foi observada perda de potência para tipo 3. Para tipo 2, a perda de potência 15 esteve dentro da faixa esperada (perda não maior do que 10% por ano de armazenagem).

Estudos foram iniciados para determinar a causa desta perda de potência na vacina combinada de DTPa-HBV-IPV. Da observação de que a estabilidade de IPV na vacina DTPa-IPV da SB Biologicals é satisfatória 20 (perda de conteúdo não maior do que 10% por ano de armazenagem), foi

concluído que o componente HBV era provavelmente o responsável pela instabilidade de IPV na vacina DTPa-HBV-IPV.

O componente HBV usado na formulação DTPa-HBV-IPV inicial é o HBsAg derivado de levedura, r-DNA purificado também utilizado para a manufatura da vacina monovalente para hepatite B da SB Biologicals e preparada como descrita no Exemplo 1.

Como uma primeira tentativa para determinar qual elemento no componente HBV foi deletério para IPV, o bulk HBsAg foi analisado para a presença de tiomersal. Tem sido previamente verificado (Davisson et. al., 10 1956, J. Lab. Clin. Med. 47: 8-19) que tiomersal usado como conservante em vacinas DTP foi prejudicial para o vírus da poliomielite em uma combinação DTV-IPV. Esta observação foi considerada pelos fabricantes da vacina que substituíram o tiomersal por outros conservantes para formularem suas vacinas contendo IPV. Mais recentemente, o efeito do tiomersal sobre a 15 potência de IPV sob condições de armazenagem de longa duração a + 4°C foi reinvestigado. A perda de potência do antígeno para vírus da pólio do tipo 1 para níveis indetectáveis após 4-6 meses foi relatada (Sawyer, L. A. et. al. 1994, Vaccine 12: 851-856).

Usando-se espectroscopia de adsorção atômica, 9 20 aproximadamente 0,5 pg de mercúrio (Hg) por 20 pg de HBsAg foi detectado no antígeno purificado de acordo com o Exemplo 1.

Esta quantidade de mercúrio (como tiomersal e cloreto de etilmercúrio, o produto de degradação do tiomersal) pode reduzir para níveis indetectáveis a resposta por ELISA para o conteúdo de antígeno-D de tipo 1 25 em um concentrado bulk IPV incubado a 37°C por 7 dias.

Um método foi estabelecido para liberar mercúrio presente no bulk HBsAg. Foi postulado que mercúrio pode ser ligado em grupos tiol na partícula de HBsAg e pode portanto ser liberado na presença de agentes redutores. Após experimentação com outros agentes redutores, L-cisteína foi • · selecionada como o agente para liberar mercúrio da partícula de HBsAg.

Após diálise do bulk HBsAg contra solução salina contendo L-cisteína 5 mM, não foi detectado mercúrio no retentato (limite de detecção do método de teste: 25 ng Hg/20 pg HBsAg). O antígeno dialisado foi misturado com concentrado de bulk IPB e a estabilidade do vírus de tipo 1 foi avaliada pela medição do conteúdo de D-antígeno após incubação a 37°C por 7 dias. O concentrado de bulk IPV não misturado e o concentrado de bulk IPV misturado com HbsAg não tratado com cisteína foram usados como controles. O título por ELISA de referência foi obtido das amostras 10 armazenadas a +2°C a +8°C por 7 dias. Os resultados são resumidos na Tabela 11.

Tabela 11:

Amostra	Conteúdo de antígeno-D (tipo 1) ⁽¹⁾	Perda
	7 dias / 4°C	7 dias / 37°C
IPV (não misturado)	31,6	24,2	23%
IPV + HBsAg não tratado	31,1	18,1	42%
IPV + HBsAg cisteínatratado	31,4	27,6	12%
IPV + tiomersal (1 pg/ml)	30,5	11,0	74%

(1) expressado em unidades de antígeno D (DU).

Os dados obtidos das preparações de laboratório demonstram 15 claramente que a estabilidade do vírus da pólio de tipo 1 é significativamente melhorada se HBsAg for tratado com cisteína para remover o mercúrio residual antes da misturação com IPV.

Os dados apresentados acima também mostram uma perda de conteúdo de antígeno D de 23% para a preparação de IPV de referência após 20 7 dias de incubação a 37°C. Isto confirma a instabilidade inerente do vírus da pólio Mahoney de tipo 1, como previamente relatado (Sawyer, L. A. et. al. (1994), Vaccine: 12: 851-856).

Embora os lotes comerciais de vacinas DTPa-HBV-IPV e DTPa-HBV-IPV/Hib tenham sido preparados usando um processo de diálise 25 com L-cisteína 5,7 mM para remover mercúrio residual e preservar a

estabilidade do IPV, o processo de diálise não é adequado para a produção em grande escala e envolve uma série de etapas suplementares para preparar HBsAg livre de mercúrio ou de tiomersal. Em contraste, o HBsAg da presente invenção, preparado sem tiomersal, pode ser diretamente utilizado -, 5 em formulações de vacinas combinadas especialmente aquelas contendo IPV.

4. Sumário:

O processo previamente usado para a purificação de antígeno de superfície derivado de levedura contém uma etapa de permeação em gel na qual o composto antimicrobiano contendo mercúrio, tiomersal, é incluído no 10 tampão de eluição para controlar a biocarga. O tiomersal não é completamente eliminado durante as etapas subseqüentes do processo de modo que cerca de 1,2 pg de tiomersal por 20 pg de proteína estão presentes na carga de antígenos (bulk antigeri) purificada.

Com o propósito de produzir uma carga de antígenos (bulk 15 antigeri) completamente livre de tiomersal (mercúrio) o processo de purificação tem sido alterado em duas etapas:

• Tiomersal é omitido do tampão de eluição na etapa de permeação em gel 4B.

• Cisteína (concentração final de 2 mM) é adicionada no eluato reunido da etapa de cromatografia de troca iônica. Isto previne a precipitação do antígeno durante a centrifugação em gradiente de densidade de CsCl.

Não há outras mudanças no processo de produção.

A carga de antígenos (bulk antigeri) produzida pelo processo 25 modificado tem sido caracterizada. Ensaios e testes físico-químicos mostram que o antígeno livre de tiomersal é indistinguível em suas propriedades do antígeno produzido pelo processo previamente utilizado. As partículas de antígeno possuem os mesmos constituintes.

A identidade e a integridade do polipeptídeo HBsAg não são

• · · • · · ··· ··· · ··· · · afetadas pelo processo modificado quando julgado pela analise em SDS-

PAGE, por Western blotting usando anticorpos policlonais anti-HBsAg, análise de seqüência N-terminal e composição de aminoácidos. Microscopia eletrônica e análise de espalhamento de luz laser mostram que as partículas são da forma e do tamanho típicos esperados para HbsAg derivado de levedura. Análise por Western blotting com soro de proteína anti-levedura mostra que o antígeno produzido pelo processo livre de tiomersal possui um padrão semelhante ao das proteínas de levedura contaminantes. Contudo, a quantidade de uma banda de contaminante migrando em 23K está enormemente reduzida nos 3 lotes de HBsAg produzidos usando o processo modificado.

Análises imunológicas mostram que as partículas livres de tiomersal possuem uma antigenicidade aumentada. As partículas são mais reativas com o AUSZYME kit da Abbott (contendo uma mistura de 15 anticorpos monoclonais) dando razões de proteína por ELISA de 1,6 a 2,5.

Esta antigenicidade aumentada é também mostrada com o anticorpo monoclonal RF1 protetor. Cerca de 4 a 7 vezes menos anticorpo livre de tiomersal é requerido para inibir a ligação de RF1 em um antígeno fixado padrão. As curvas de inibição de ligação do antígeno clássico e livre de 20 tiomersal caem dentro de duas famílias distintas. Esta diferença também é mostrada pelas medições da constante de afinidade de ligação para RF1 usando ressonância de superfície plásmica. As afinidades de ligação das preparações livres de tiomersal são 3 a 4 vezes maiores comparadas com o lote de carga de antígenos (bulk antigen) clássica.

As preparações de carga de antígenos (bulk antigen) foram formuladas como vacina pela adsorção sobre hidróxido de alumínio e sem conservante.

Teste para a potência in vitro usando o AUSZYME ELISA kit da Abbott e vacina monovalente para hepatite B da SB Biologicals contendo

tiomersal como padrão mostrou que foram obtidos altos valores de potência in vitro. O conteúdo de antígeno por este teste foi quase o dobro do valor enunciado de 20 pg de proteína por ml.

Uma reatividade aumentada da vacina preparada a partir de * _> 5 antígeno livre de tiomersal também foi vista em um ensaio de inibição com anticorpo monoclonal RF1 para ligação em antígeno fixado. Cerca da metade da quantidade de vacina livre de tiomersal foi requerida para dar inibição de 50% da ligação de RF1 em antígeno fixado em comparação com o antígeno purificado pelo processo previamente usado e formulado sem conservante.

Esta antigenicidade aumentada da vacina livre de tiomersal com respeito a RF1 está consistente com os resultados do teste de potência in vitro (conteúdo de antígeno) e com os teste de anticorpo RF1 realizados nas preparações de carga de antígenos (bulk antigen).

Um teste de imunogenicidade em camundongo foi realizado usando vacinações iniciais e de reforço duas semanas à parte e doses de 2 e

0,4 pg de antígeno. Camundongos foram sangrados no dia 28, 14 dias após o reforço. Os soros foram analisados para título de anticorpo e composição de isótipo. Um claro efeito de dose de antígeno foi observado para as duas doses administradas mas não houve diferença estatisticamente significativa na ® 20 resposta em termos de títulos de anticorpo (GMT) entre as vacinas livres de tiomersal e livres de conservante. Não foram observadas diferenças substanciais nos perfis de isótipo.

reivindicações

1. Método para produção de uma vacina para hepatite B, a vacina compreendendo um antígeno para hepatite B purificado, o antígeno compreendendo menos de 0,025 pg de mercúrio por 20 pg de proteína, caracterizado pelo fato de que o antígeno é purificado na presença de um agente redutor possuindo grupo -SH livre e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vacina é desprovida de conservante.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o conservante é tiomersal.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-

3, caracterizado pelo fato de que o antígeno da hepatite é adsorvido sobre hidróxido de alumínio.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma preparação crua de hepatite B é:

(a) submetida a cromatografia de permeação em gel;

(b) submetida a cromatografia de troca iônica; e (c) misturada com um agente redutor possuindo um grupo -SH livre.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cisteína, glutationa, ditiotreitol ou β-mercapto-etanol.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cisteína.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a cisteína é adicionada em uma concentração final entre 1 e 10 mM.

Petição 870180124947, de 03/09/2018, pág. 7/10

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produção de uma vacina para hepatite B, a vacina compreendendo um antígeno para hepatite B purificado, o antígeno compreendendo menos de 0,025 μg de mercúrio por 20 μg de proteína, caracterizado pelo fato de que o antígeno é purificado na presença de um agente redutor possuindo grupo -SH livre e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vacina é desprovida de conservante.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o conservante é tiomersal.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13, caracterizado pelo fato de que o antígeno da hepatite é adsorvido sobre hidróxido de alumínio.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que uma preparação crua de hepatite B é:

(a) submetida a cromatografia de permeação em gel;

(b) submetida a cromatografia de troca iônica; e (c) misturada com um agente redutor possuindo um grupo -SH livre.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cisteína, glutationa, ditiotreitol ou β-mercapto-etanol.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cisteína.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a cisteína é adicionada em uma concentração final entre 1 e 10 mM.

Petição 870180124947, de 03/09/2018, pág. 8/10
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cisteína é adicionada em uma concentração final de cerca de 2 mM.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o antígeno é purificado na presença de tiomersal antes do tratamento com o agente redutor.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19, caracterizado pelo fato de que o antígeno purificado é completamente livre de tiomersal.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a vacina é uma vacina isenta de tiomersal.
13. Método para produção de um antígeno para hepatite B adequado para uso em uma vacina, caracterizado pelo fato de que compreende a purificação do antígeno na presença de um agente redutor possuindo um grupo -SH livre, em que o antígeno é purificado na presença de tiomersal antes do tratamento com o agente redutor.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o produto de antígeno purificado compreende menos do que 0,025 mg de mercúrio por 20 mg de proteína.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que uma preparação de antígeno para hepatite B bruta é:

(a) submetida à cromatografia de permeação em gel;

(b) submetida à cromatografia de troca iônica; e (c) misturada com um agente redutor possuindo um grupo -SH livre.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-15, caracterizado pelo fato de que o agente redutor é cisteína, glutationa, ditiotreitol ou b-mercapto-etanol.

Petição 870180124947, de 03/09/2018, pág. 9/10

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FIGURA 1: Fluxograma do processo de produção livre de tiomersal pana EngereixB™

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