ES2254464T3 - Purificacion de antigenos de hbv para uso en vacunas. - Google Patents

Purificacion de antigenos de hbv para uso en vacunas.

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ES2254464T3 ES01960630T ES01960630T ES2254464T3 ES 2254464 T3 ES2254464 T3 ES 2254464T3 ES 01960630 T ES01960630 T ES 01960630T ES 01960630 T ES01960630 T ES 01960630T ES 2254464 T3 ES2254464 T3 ES 2254464T3
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Abstract

Un procedimiento para producir una vacuna contra la hepatitis B, comprendiendo la vacuna un antígeno de superficie de hepatitis B purificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el antígeno menos de 0, 025 g de mercurio por 20 g de proteína, donde el antígeno está purificado en presencia de un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.

Description

Purificación de antígenos de HBV para su uso en vacunas.
Esta invención se refiere a un nuevo procedimiento de fabricación de una vacuna contra la hepatitis B para su uso en el tratamiento o profilaxis de infecciones con el virus de la hepatitis B (HBV).
La infección con virus de la hepatitis B (HBV) crónica, para la que hay un tratamiento actualmente limitado, constituye un problema de salud pública global de grandes dimensiones. Los portadores crónicos de HBV, que se estima que son más de 300 millones en el mundo, están en riesgo de desarrollar hepatitis crónica activa, cirrosis y carcinoma hepatocelular primario.
Muchas vacunas que están actualmente disponibles necesitan un conservante para evitar el deterioro. Un conservante frecuentemente usado es tiomersal que es un compuesto que contiene mercurio. Han surgido algunas dudas acerca del uso del mercurio en vacunas, aunque los comentaristas han puntualizado que los peligros potenciales de vacunas que contienen tiomersal no deben exagerarse (Offit; P.A. JAMA Vol.283; Nº 16). No obstante, sería ventajoso encontrar procedimientos nuevos y potencialmente más seguros para la preparación de vacunas para remplazar el uso de tiomersal en los procedimientos de fabricación. Por tanto, hay una necesidad de desarrollar vacunas que estén libres de tiomersal, en particular vacunas contra la hepatitis B.
Las vacunas contra la hepatitis B disponibles en el mercado con niveles reducidos de tiomersal incluyen Engerix-B™ y formulaciones pediátricas de Recombivax HB™; véase Morbidity and Mortality Weekly Report, vol. 4-9, 01-7-2000, página 442, 681.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una vacuna contra la hepatitis B, comprendiendo la vacuna un antígeno de superficie de hepatitis B purificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el antígeno menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína, donde el antígeno está purificado en presencia de un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.
La presente invención preferiblemente proporciona un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B estable sin trazas de tiomersal que comprende la purificación del antígeno en presencia de un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.
La preparación de antígeno generalmente se realiza sin trazas de tiomersal cuando no se detecta tiomersal en el producto antigénico purificado usando espectrofotometría de absorción de mercurio, como se describe en este documento.
La preparación de antígeno de la hepatitis, comprende menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína, adecuadamente como se mide por espectrofotometría de absorción.
Preferiblemente, la purificación se realiza en ausencia de tiomersal, y el antígeno purificado está completamente libre de tiomersal.
Preferiblemente, el antígeno es estable, de manera adecuada es sustancialmente tan estable como el antígeno de la hepatitis purificado en presencia de tiomersal, como se resume en el Ejemplo 1 en este documento, por ejem-
plo.
Preferiblemente, el antígeno de hepatitis es inmunogénico.
Preferiblemente, el agente reductor se añade durante el procedimiento de purificación del antígeno, preferiblemente después del crecimiento de células que expresan el antígeno.
Preferiblemente, el agente reductor es cisteína, ditiotreitol, \beta-mercaptoetanol o glutatión, siendo la cisteína el más preferido.
Por consiguiente, la presente invención proporciona preferiblemente un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B inmunogénico y estable sin trazas de tiomersal que comprende la purificación del antígeno en presencia de cisteína.
Preferiblemente, la purificación se realiza en presencia de una solución de cisteína.
Preferiblemente, la cisteína, en solución o forma de polvo, se añade durante el procedimiento a una concentración final entre 1 y 100 mM, preferiblemente 1 a 5 mM. Más preferiblemente, la cisteína se añade a una concentración final de aproximadamente 2 mM.
Preferiblemente, la cisteína es L-cisteína.
\newpage
La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B estable sin trazas de tiomersal donde el antígeno en bruto se somete a cromatografía de permeación en gel, se somete a cromatografía de intercambio iónico y se mezcla con un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.
Preferiblemente, la cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico.
La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para fabricar un antígeno de hepatitis B libre de tiomersal donde el antígeno es al menos tan inmunogénico y antigénico que el antígeno de hepatitis B fabricado en presencia de tiomersal.
La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para fabricar un antígeno de hepatitis B inmunogénico que tiene una proporción proteica en ELISA media superior a 1,5 y un contenido en RF1 con al menos un valor de CI50 tres veces inferior que el de el antígeno de superficie de hepatitis B fabricado en presencia de tiomer-
sal.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un antígeno de hepatitis adecuado para su uso en una vacuna, comprendiendo el procedimiento la purificación del antígeno en presencia de tiomersal y el tratamiento posterior del antígeno en presencia de un agente reductor que comprende un grupo -SH libre.
Adecuadamente, el tratamiento viene seguido por una etapa de purificación tal como una etapa de diálisis para retirar el tiomersal.
Preferiblemente, el agente reductor es cisteína, DTT, glutatión o 2-mercaptoetanol.
El antígeno de hepatitis B puede usarse para el tratamiento o profilaxis de infecciones de hepatitis B, especialmente para el tratamiento o profilaxis, por ejemplo, de infecciones de hepatitis B crónicas.
Se proporciona una formulación de vacuna que comprende un antígeno de hepatitis B y un adyuvante. Preferiblemente, el adyuvante es una sal de aluminio o un estimulador preferente de la respuesta de células TH1.
Preferiblemente, el antígeno es un antígeno de superficie de hepatitis B.
La preparación del antígeno de superficie de hepatitis B está bien documentada. Véase, por ejemplo, Harford y col. en Develop, Biol. Standard 54, página 125 (1983), Gregg y col. en Biotechnology, 5, página 479 (1987), documento EP-A-0 226 846, documento EP-A-0 299 108 y referencias de los mismos.
Como se usa en este documento, la expresión "antígeno de superficie de hepatitis B" o "HBsAg" incluye cualquier antígeno HBsAg o fragmento del mismo que presenta la antigenicidad del antígeno de superficie de HBV. Se entenderá que además de la secuencia de 226 aminoácidos del antígeno HBsAg S (véase, Tiollais y col. Nature, 317, 489 (1985) y referencias del mismo), HBsAg como se describe en este documento puede, si se desea, contener toda o parte de una secuencia pre-S como se describe en las referencias anteriores y en el documento EP-A-0 278 940. HBsAg, como se describe en este documento, también puede referirse a variantes, por ejemplo, el "mutante de escape" descrito en el documento WO 91/14703.
HBsAg también puede referirse a polipéptidos descritos en el documento EP 0 198 474 o EP 0 304 578.
Normalmente, el HBsAg estará en forma de partícula. En una realización particularmente preferida el HBsAg constará esencialmente de un antígeno HBsAg S mencionado anteriormente.
La vacuna puede incluir de manera ventajosa un excipiente farmacéuticamente aceptable tal como un adyuvante adecuado. Los adyuvantes adecuados están disponibles en el mercado tales como, por ejemplo, adyuvante incompleto y adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Ml); adyuvante 65 de Merck (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmitbKline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio; sales de calcio, hierro o zinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También pueden usarse como adyuvantes citoquitas, tales como GM-CSF o interleuquina-2, -7, o -12.
En las formulaciones de la invención se prefiere que la composición adyuvante induzca una respuesta inmune predominantemente del tipo TH1. Los altos niveles de citoquinas de tipo TH1 (por ejemplo, IFN\gamma, TNF\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunes mediadas por células frente a un antígeno administrado. En una realización preferida, en la que la respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 aumentará a un grado superior que el nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden evaluarse fácilmente usando ensayos convencionales. Para un análisis de las familias de citoquinas, véase Mosmann and Coffman, Ann. Rev, Immunol. 7:145-173,1989.
\newpage
Por consiguiente, los adyuvantes adecuados para su uso para provocar una respuesta de predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Otros adyuvantes conocidos que inducen preferentemente una respuesta inmune tipo TH1 incluyen oligonucleótidos que contienen CpG. Los oligonucleótido están caracterizados en que el dinucleótido CpG está sin metilar. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen en, por ejemplo, el documento WO 96/02555. Las secuencias de ADN inmunomoduladoras también se describen, por ejemplo, por Sato y col., Science 273:352, 1996. Otro adyuvante preferido es una saponina, preferiblemente QS21 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA), que puede usarse sola o en combinación con otros adyuvantes. Por ejemplo, un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y derivado de saponina, tal como la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica en la que QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento
WO 95/17210.
Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida.
Una vacuna que comprende un antígeno de superficie de hepatitis B puede comprender adicionalmente un adyuvante que induce TH1. Los adyuvantes que inducen TH1 se seleccionan entre el grupo de adyuvantes constituido por: 3D-MPL, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol, y un oligonucleótido CpG. Una vacuna que comprende un antígeno de superficie de hepatitis B puede tener como adyuvante monofosforil lípido A o un derivado del mismo, QS21 y tocoferol en una emulsión de aceite en agua.
Preferiblemente, la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21. Otra formulación adyuvante particularmente adecuada que incluye CpG y una saponina se describe en el documento WO 00/09159 y es una formulación preferida. Más preferiblemente, la saponina en esa formulación particular es QS21. Preferiblemente, la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol.
Una formulación de vacuna que comprende un antígeno de superficie de hepatitis B y un adyuvante puede comprender adicionalmente uno o más antígenos seleccionados entre el grupo constituido por: toxoide de la difteria (D), toxoide del tétanos (T), antígenos de pertussis acelular (Pa), poliovirus inactivado (IPV), antígeno de haemophilus influenzae (Hib), antígeno de la hepatitis A, virus del herpes simple (HSV), clamidia, GSB, HPV, antígenos de streptococcus pneumoniae y neisseria. Los antígenos que confieren protección para otras enfermedades también pueden combinarse en la formulación de vacuna.
La formulación de vacuna puede comprender un antígeno de superficie de hepatitis B junto con un adyuvante y un poliovirus inactivado.
Las vacunas contendrán una cantidad inmunoprotectora del antígeno y pueden prepararse por técnicas convencionales.
La preparación de vacuna se describe en líneas generales en Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61. Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, editado por Powell y Newman, Plenum Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. La encapsulación en liposomas se describe, por ejemplo, por Fullerton, Patente de Estados Unidos Nº 4.235.877. La conjugación de proteínas en macromoléculas se describe, por ejemplo, por Likhite, Patente de Estados Unidos Nº 4.372.945 y por Armor y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.474.757. El uso de Quil A se describe por Dalsqaard y col., Acta Vet Scand, 18:349(1977). Está disponible 3D-MPL de Ribi immunochem, USA, y se describe en la Solicitud de Patente Británica Nº 2220211 y la Patente de Estados Unidos 4912094. Se describe QS21 en la Patente de Estados Unidos Nº 5057540.
La presente invención se ilustra pero no se limita a los siguientes ejemplos, en los que:
La Figura 1 ilustra el procedimiento de producción libre para tiomersal para Engerix B™;
la Figura 2 ilustra un análisis en SDS-PAGE de lotes de antígenos a granel; y
la Figura 3 ilustra las proteínas de levadura residuales en lotes de antígenos a granel producidos por el procedimiento libre de tiomersal.
Ejemplo 1
Procedimiento de Producción de antígeno de superficie de Hepatitis B en presencia de tiomersal
El antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) de la vacuna monovalente de SB Biologicals (Engerix B™) se expresa como una proteína recombinante en Saccharomyces cerevisiae (véase, Harford y col. loc. cit.). La proteína de 24 kD se produce de manera intracelular y se acumula en las células de levadura recombinantes. Al final de la fermentación las células de levadura se recolectan y se alteran en presencia de un tensioactivo suave tal como Tween 20 para liberar la proteína deseada. Posteriormente, el homogeneizado celular, que contiene las partículas antigénicas de superficie solubles, se prepurifica en una serie de precipitaciones y después se concentra mediante
ultrafiltración.
Se realiza una purificación adicional del antígeno recombinante en separaciones cromatográficas posteriores. En una primera etapa, el concentrado de antígeno en bruto se somete a una cromatografía por permeación en gel en medio Sepharose 4B. El tiomersal está presente en el tampón de elución en la etapa de cromatografía por permeación en gel 4B. El tampón de elución tiene la siguiente composición: Tris 10 mM, etilenglicol al 5%, pH 7,0, 50 mg/l de tiomersal. El tiomersal se incluye en este tampón para controlar la bioacumulación. La mayoría de este tiomersal se retira durante las etapas de purificación posteriores incluyendo cromatografía de intercambio iónico, ultracentrifugación y desalado (permeación en gel) de modo que las preparaciones de antígeno a granel purificadas preparadas por el procedimiento original contienen aproximadamente 1,2 \mug y menos de 2 \mug de tiomersal por 20 \mug de
proteína.
Se realiza una etapa de cromatografía de intercambio iónico usando una matriz DEAE y esta combinación después se somete a una ultracentrifugación en gradiente de cesio en 4 capas preestablecidas de diferentes concentraciones de cloruro de cesio. Las partículas antigénicas se separan de los constituyentes celulares contaminantes de acuerdo con su densidad en el gradiente y se eluyen al final del procedimiento de centrifugación. Después se retira el cloruro de cesio de esta combinación por una segunda permeación en gel en gel de Sepharose.
Cuando se prepara HBsAg por el procedimiento que contiene tiomersal en el tampón de permeación en gel 4B, las concentraciones de proteína de más de 30 mg/ml se recuperan en el HBsAg combinado que contiene fracciones del gradiente de CsCl, correspondientes a una concentración equivalente de HBsAg ensayada por el kit AUSZYME de Abbott Laboratories.
La etapa de ultracentrifugación en CsCl habitualmente elimina los lípidos residuales, el ADN y los contaminantes proteicos minoritarios de la preparación de HBsAg. Se realiza por centrifugación zonal en un rotor Tl 15 de Beckman Instruments, Fullerton, California a una velocidad de 30.000 rpm durante aproximadamente 40 a 60 horas. La muestra a purificar se aplica a capas de solución de CsCl con concentraciones finales de 0,75, 1,5, 2,5 y 3,5 M de CsCl. Al final de la centrifugación se eluye el gradiente en fracciones. Las fracciones que contienen HBsAg pueden identificarse por absorbancia en UV a 280 nm o ensayando las diluciones de las fracciones con el kit AUSZYME. La banda de HBsAg está a una densidad de 1,17 a 1,23 g/cm^{3}.
La solución que contiene el HBsAg purificado se filtra hasta esterilidad antes de usarla para producir una formulación de vacuna.
La purificación del lisado celular de levaduras es complejo ya que el antígeno se produce de manera intracelular y es necesaria una serie de técnicas de separación diseñadas para eliminar diferentes tipos de contaminantes (levadura) para obtener el antígeno a granel puro. Las etapas de purificación son importantes, ya que el producto a purificar es una partícula lipoproteica que contiene múltiples copias del polipéptido antigénico de superficie y esta estructura debe mantenerse durante todo el procedimiento de purificación. Una particularidad de este procedimiento es que produce partículas antigénicas de superficie que son completamente inmunogénicas sin la necesidad de tratamiento químico adicional para potenciar la inmunogenicidad (compárese el documento EPO135435).
Los detalles del procedimiento de producción se describen adicionalmente en la Patente Europea 0199698.
Ejemplo 2
Producción y caracterización de HBsAg obtenido de levaduras mediante un procedimiento libre de tiomersal 1. Producción y purificación de HBsAg obtenido de levaduras 1.1 Resumen del procedimiento de producción
El antígeno de superficie de hepatitis B puede producirse por fermentación de una cepa apropiada de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, la descrita en Harford y col. (loc. cit.).
Al final de la fermentación a gran escala de la cepa de levadura recombinante, las células se recolectan y se degradan en presencia de un tensioactivo suave tal como Tween 20. El antígeno de superficie después se aísla mediante una extracción multi-etapa y procedimiento de purificación exactamente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, hasta la etapa de la primera permeación en gel en Sepharose 4B.
1.2 Procedimiento de purificación libre de tiomersal
En el procedimiento libre de tiomersal se han introducido los siguientes dos cambios en comparación con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
1. El tampón de elución en la etapa de cromatografía por permeación en gel 4B ya no contiene tiomersal.
2. Se añade cisteína (concentración final 2 mM) para a la combinación eluida de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico.
Se descubrió que la supresión de tiomersal del tampón de permeación en gel 4B puede provocar la precipitación de partículas HBsAg durante la etapa de centrifugación en gradiente de densidad de CsCl con pérdida del producto y agregación o agrupamiento del antígeno recuperado.
La adición de cisteína a una concentración final de 2 mM a la combinación eluida de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico precedente evita la precipitación y pérdida de antígeno durante la centrifugación en densidad de CsCl.
La cisteína es una sustancia preferida para este tratamiento ya que es un aminoácido de origen natural y puede retirarse en la etapa de desalado posterior en una columna de permeación en gel usando Sepharose 4BCLFF como matriz de columna.
No hay otros cambios en el procedimiento de fabricación en comparación con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
El procedimiento libre de tiomersal produce antígeno a granel de una pureza y con propiedades comparables al antígeno del procedimiento del Ejemplo 1.
1.2a
El tiomersal añadido al tampón 4B a 50 \mug/ml se cree que se descompone y el etilmercurio resultante puede unirse covalentemente a grupos sulfhidrilo libres en los restos de cisteína de la proteína. La proteína contiene 14 restos de cisteína de los que 7 están localizados entre las posiciones 101 y 150.
Esta región de la proteína se cree que está localizada en la superficie de la partícula y contiene la principal región antigénica de HBsAg incluyendo la región inmunodominante a y el sitio de reconocimiento para el anticuerpo monoclonal RF1 (Waters J y col, Postgrad. Med. J., 1987:63 (Supl. 2): 51-56 y Ashton-Rickardt and Murray J. Med. Virology, 1989: 29:196). El antígeno purificado con tiomersal presente en el tampón de permeación en gel 4B contiene aproximadamente 0,5-0,6 \mug de mercurio al final del procedimiento de purificación. Este mercurio no se retira completamente por diálisis simple.
En un experimento, se midieron 0,56 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína en preparación antigénica a granel. Esta preparación se dializó durante 16 horas a temperatura ambiente frente a NaCl 150 mM, tampón NaPO_{4} 10 mM, pH 6,9. Al final de la diálisis, se midió una concentración de 0,33 \mug de Hg por 20 \mug de proteína.
Por el contrario, la diálisis en presencia de agente reductor tal como L- cisteína de 0,1 a 5,0 mg/ml, DTT a 50 mM o 2-mercaptoetanol a 0,5 M, seguido de una segunda diálisis para retirar el agente reductor, provoca la reducción del contenido de mercurio de la preparación antigénica a menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína. Este es el límite inferior de detección del procedimiento.
El contenido de mercurio se determinó por espectrofotometría de absorción. El antígeno se diluye en una solución que contiene bicromato potásico (K_{2}Cr_{2}O_{7}) al 0,01% p/v y ácido nítrico al 5% v/v. Las soluciones patrón se preparan con tiomersal como fuente de mercurio. La absorción atómica de la muestra y las soluciones patrón se mide después de la vaporización en un generador de vapor, con un cátodo específico de mercurio a 253,7 nM. La absorción atómica del líquido de dilución se mide como blanco. El contenido de mercurio de la muestra se calcula mediante las curvas de calibración obtenidas de las soluciones patrón. Los resultados se expresan como \mug de mercurio por 20 \mug de
proteína.
1.3 Producción de antígeno a granel libre de tiomersal
Las etapas del procedimiento para la purificación de antígeno a granel se muestran en la Figura 1.
1.4 Composición de la vacuna formulada sin tiomersal
Se proporciona una composición cuantitativa típica para una vacuna contra la hepatitis B sin conservante y formulada a partir del antígeno preparado por el procedimiento libre de tiomersal en la Tabla 1.
TABLA 1
Constituyente Cantidad por ml
Constituyente activo - Proteína de la que al menos un 95% es HBsAg 20 \mul
Hidróxido de aluminio (adsorbente) (expresado como Al_{2}O_{3}) 0,95 mg
Cloruro sódico 9,0 mg (máximo)
Fosfato disódico dihidrato 0,98 mg
Dihidrogenofosfato sódico dihidrato 0,71 mg
Agua para inyección c.s. añadida 1,0 ml
La composición puede variarse por la adición de 3D-MPL y/u otros adyuvantes. 
\vskip1.000000\baselineskip
2. Caracterización del antígeno a granel y la vacuna producida por el procedimiento libre de tiomersal 2.1 Ensayos y pruebas sobre el antígeno a granel purificado 2.1.1 Base de la comparación
Se prepararon tres lotes de antígeno a granel por el procedimiento libre de tiomersal de acuerdo con este ejemplo (Ejemplo 1.2) y se identifican como HEF001, HEF002 y HEF003. Estos se comparan con un lote de antígeno a granel (HEP2055) preparado por el procedimiento previo (como se describe en el Ejemplo 1) en presencia de
tiomersal.
2.1.2 Ensayos y pruebas sobre al antígeno a granel
Los tres lotes de antígeno a granel producidos por el procedimiento libre de tiomersal se ensayaron y los resultados se resumen en la Tabla 2.
Se midió el contenido proteico por el procedimiento de Lowry y col (J. Biol. Chem. 1951:193:265).
Se midió el contenido de endotoxina mediante una técnica de coagulación en gel de Limulus usando un kit disponible en el mercado de Cape Cod Associates, 704 Main St., Falmouth, MA 02540, USA. El reactivo se normaliza frente al patrón de referencia de endotoxina de US Pharm.
Se midió Tween 20 por el procedimiento de Huddleston y Allred (J, Amer. Oil Chemist Soc, 1965:42:983).
Se midió el contenido de HBsAg por el kit AusZYME disponible en el mercado de Abbott Laboratories, One Abbott Park Road, Abbott Park, IL 60064, USA. Se empleó el procedimiento de ensayo B del fabricante. Se usó un lote de antígeno a granel purificado por el procedimiento que contiene tiomersal como patrón para establecer la curva de respuesta a dosis.
Se midieron los polisacáridos por el procedimiento de Dubois y col (Anal. Chem. 1956:28:350).
Se midieron los lípidos usando un kit disponible en el mercado (Merkotest Total Lipids 3321) de E.Merck, B.P. 4119, Darmstad D-6100, Alemania.
Se midió el contenido de ADN por el procedimiento de umbral usando aparatos y reactivos disponibles de Molecular Devices Corp., GutenbergstraBe 10, Ismaning, Munich, Alemania.
Los valores encontrados en los ensayos y pruebas están en el intervalo visto para los lotes de antígeno a granel fabricados usando tiomersal en el tampón de elución de la etapa de permeación en gel de Sepharose 4B, con la excepción de la actividad antigénica por ELISA. Los valores para esta medida para las tres preparaciones de HEF son superiores (1,63-2,25) que los encontrados para el lote de antígeno a granel HEP2055 que tiene una proporción ELISA/proteína de 1,13. Las proporciones ELISA/proteína medidas por el kit AUSZYME para lotes que contienen tiomersal de antígeno a granel son generalmente aproximadamente 1,0 y en el intervalo de 0,8-1,2 y muy raramente exceden de 1,4.
2.1.3 Análisis en gel SDS-PÀGE
Las preparaciones de antígeno a granel se ensayaron por análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras y tinción con azul de Coomassie. Todas las muestras mostraron una banda principal a 24 K con trazas de una proteína dimérica. Se juzgó que las muestras tenían una pureza alta (>99% de pureza) como se evalúa por la ausencia de bandas visibles de proteínas contaminantes.
Las muestras (1 \mug) de las preparaciones de antígeno a granel se ensayaron por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y tinción con plata (Figura 2). En condiciones reductoras las muestras mostraron una banda intensa que migra a 24 K con trazas de formas diméricas y multiméricas. Los patrones del gel son indistinguibles de los de HEP2055 como elemento de comparación. Las muestras también se procesaron en condiciones no reductoras. En estas condiciones menos material migra a 24 K y la cantidad de polipéptido que migra a posiciones diméricas y multiméricas se aumenta. Los lotes de antígeno a granel libres de tiomersal parecen tener un grado algo más alto de polimerización que el elemento de comparación lote HEP2055.
La identidad del polipéptido de 24 K relevado por azul de Coomassie o tinción con plata se confirmó por transferencia de Western con anticuerpos policlonales de conejo producidos frente HBsAg de plasma. Las preparaciones de antígeno a granel muestran una banda principal a 24 K junto con formas diméricas y triméricas. La técnica revela trazas minoritarias de productos de descomposición de la proteína antigénica de superficie. No hay diferencias entre el antígeno a granel preparado por el procedimiento libre de tiomersal y el lote HEP2055.
La presencia de proteínas de levadura residuales se ensayó por análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras y transferencia de Western con antisuero policlonal de conejo producido frente a proteínas de levadura (Figura 3). La técnica es cualitativa y no permite la cuantificación de las impurezas.
Se muestra un patrón de bandas constante de los tres lotes de antígeno a granel preparados por el procedimiento libre de tiomersal y el lote HEP2055 con una excepción.
Está casi ausente una banda de tinción más pesada presente a \pm 23 K en el antígeno a granel HEP2055 en las tres preparaciones de HEF. La transferencia de Western muestra que el procedimiento de purificación libre de tiomersal produce un producto antigénico más puro.
TABLA 2 Resultados de los ensayos y pruebas del antígeno purificado, a granel libre de tiomersal
Ensayo Resultado
HEF001 HEF002 HEF003 HEP2055
pH 6,8 6,8 6,8 6,8
Contenido de proteínas por Lowry 1312 \mul/ml 888 \mul/ml 913 \mul/ml 995 \mul/ml
Contenido de endotoxinas < 0,25 EU < 0,25 EU < 0,25 EU < 0,25 EU
Contenido de Tween 20 7,1 \mug 6,6 \mug 7,4 \mug 5,8 \mug
Actividad antigénica por ELISA 2957 \mul/ml 1505 \mul/ml 1486 \mul/ml 1128 \mul/ml
Proporción ELISA/proteína 2,25 1,69 1,63 1,13
Contenido de polisacáridos 0,33 \mug 0,35 \mug 0,33 \mug 0,34 \mug
Contenido lipídico 13,7 \mug 12,8 \mug 12,9 \mug 11,8 \mug
Contenido de ADN por umbral < 1 pg < 1 pg < 1 pg < 1 pg
2.1.4 Otros ensayos y pruebas bioquímicos 2.1.4.1 Contenido de ADN
El contenido de ADN de los 3 lotes de antígeno a granel se midió por el procedimiento de umbral (Molecular Devices Corp). Las cantidades medidas fueron de menos de 10 pg de ADN por 20 mg de proteína (Tabla 2); el mismo nivel de contenido de ADN visto con antígeno a granel producido por el procedimiento actualmente aprobado.
2.1.4.2 Composición de aminoácidos
La composición de aminoácidos de los tres lotes de antígeno a granel HEF se determinó después de hidrólisis ácida con HCl 6 N por cromatografía de los aminoácidos en una columna de intercambio iónico con una columna posterior de detección con ninhidrina. No se determinó ni la prolina ni el triptófano. Los resultados se proporcionan en la Tabla 3.
Las composiciones encontradas están en buen acuerdo con las determinadas en HEP2055 y con la composición esperada derivada de la secuencia de ADN. Aunque la cantidad de restos de glicina para HEP2055 está cercana a la composición esperada, es más habitual medir un valor de 16 a 17 restos para las preparaciones de antígeno a granel. La cantidad media de restos de cisteína encontrada es la esperada 14, mostrando que no se unen cisteínas adicionales a la partícula como resultado del tratamiento en la etapa de gradiente de CsCl.
2.1.4.3 Cuantificación de cisteína libre
La cantidad de cisteína libre presente en las preparaciones de antígeno a granel obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito se midió después de la oxidación de las partículas con ácido perfórmico sin hidrólisis ácida anterior. Los restos de cisteína libres oxidados se separaron en una columna de intercambio iónico con una columna posterior de detección con ninhidrina. El límite de detección de cisteína en este procedimiento es 1 \mug/ml.
No pudieron medirse cisteínas libres en las 3 preparaciones de antígeno HEF cuando se ensayaron a las concentraciones proteicas iniciales dadas en la Tabla 2.
La técnica mide tanto restos de cisteína libres presentes en el tampón como restos de cisteína que están unidos a la proteína HBsAg por puentes disulfuro pero que no forman parte de la secuencia polipeptídica.
2.1.4.4 Análisis de la secuencia N-terminal
La presencia de posibles contaminantes proteicos y productos de degradación en los tres lotes de antígeno a granel producidos por el procedimiento modificado se evaluó por análisis de secuencia N-terminal en base a la degradación de Edman. La secuencia N-terminal MENITS... de la proteína HBsAg se detectó sin interferencia de otras secuencias. La metionina N-terminal también se confirmó que estaba bloqueada en un 60-75% por acetilación, como se observó previamente para el polipéptido HBsAg producido por el procedimiento de rutina.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 Composición de aminoácidos de HBsAg
Aminoácido HEF001 HEF002 HEF003 Comp. media HEF2055 Comp. esperada
Asp 11,3 11,3 11,3 11,3 11,5 10
Thr 17,5 17,4 17,2 17,4 17,8 17
Ser 21,4 21,6 21,4 21,5 20,9 23
Glu 11 11 11 11,0 10,5 9
Pro nd nd Nd Nd 24
Gly 17,1 16,8 16,7 16,9 14,6 14
Ala 7,5 7,4 7,4 7,4 7,2 6
Cys 12,3 14,95 14,9 14,1 13,2 14
Val 10,9 11 10,9 10,9 10,7 11
Met 6,8 6,7 7,1 6,9 7,1 6
Ile 12,3 12,4 12,5 12,4 12,2 16
Leu 26,3 26,6 26,2 26,4 26,7 33
Tyr 6,8 6,8 6,8 6,8 7 6
Phe 13,8 13,9, 13,8 13,8 13,9 15
His 3 2,8 3,3 3,0 3,3 1
Lys 4 4 3,9 4,0 4,2 3
Arg 5,7 5,8 5,7 5,7 6,1 5
Trp nd nd nd nd 13 
\vskip1.000000\baselineskip
2.1.4.5 Análisis por dispersión de luz láser
Se hicieron comparaciones de tamaño de partícula por dispersión de luz láser entre las partículas de HBsAg usando el procedimiento modificado y el lote de referencia HEP2055 (Tabla 4). Los pesos moleculares medios determinados muestran una buena consistencia entre las preparaciones.
TABLA 4 Pesos moleculares de partículas HBsAg por dispersión de luz láser
Lote de antígeno PM (Dalton)
HEF001 3,07 x 10^{6}
HEF002 2,76 x 10^{6}
HEF003 2,76 x 10^{6}
HEP2055 3,34 x 10^{6} 
\vskip1.000000\baselineskip
2.1.4.6 Microscopía electrónica
Las preparaciones de antígeno a granel se examinaron por microscopía electrónica después de fijación y tinción con acetato de uranilo.
Las partículas observadas fueron similares en todas las muestras y conformaban las partículas tipo subesférico o adoquín de \pm 20 nm típicas de HBsAg. Las partículas observadas en los 3 lotes HEF fueron indistinguibles de HEP2055.
2.1.5 Análisis inmunológicos 2.1.5.1 Reactividad con anticuerpo monoclonal RF1
Las tres preparaciones de antígeno a granel se ensayaron para su reactividad con el anticuerpo monoclonal RF1 por ensayo de inhibición ELISA. El anticuerpo monoclonal RF1 ha demostrado proteger a los chimpancés frente a la estimulación con HBV y se considera que reconoce un epítope conformacional protector en la partícula HBsAg (Iwarson S y col, 1985, J.Med, Virol., 16: 89-96).
Puede propagarse el hibridoma RF1 en la cavidad peritoneal de ratones BalbC o en cultivo tisular.
Se 1:1 mezcló fluido ascítico diluido a 1/50000 en tampón de saturación (PBS que contiene BSA al 1%, Tween 20 al 0,1%) con diversas diluciones en PBS de las muestras de HBsAg a ensayar (concentraciones finales que varían entre 100 \mug y 0,05 \mug/ml).
Las mezclas se incubaron en inmunoplacas Nunc (96U) durante 1 h a 37ºC antes de trasferirlas durante 1 h a 37ºC en placas revestidas con una preparación patrón de HBsAg. La preparación de HBsAg patrón fue un lote de antígeno a granel (Hep 286) purificado por el procedimiento que contiene tiomersal. Después de una etapa de lavado con PBS que contiene Tween 20 al 0,1%, se añadió IgG de oveja anti-ratón conjugada con biotina diluida 1/1000 en tampón de saturación y se incubó durante 1 h a 37ºC. Después de la etapa de lavado, se añadió complejo estreptavidina-peroxidasa biotinilada diluido 1/1000 en tampón de saturación a los mismos pocillos y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron y se incubaron con una solución de OPDA al 0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03% en tampón citrato 0,1 M, pH 4,5 durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2 N y las densidades ópticas (D.O.) se midieron a 490/630 nm y se representaron gráficamen-
te.
La CI50, definida como la concentración de antígeno (concentración inhibidora) que inhibe el 50% de la unión del anticuerpo a HBsAg revestido se calculó usando una ecuación de 4 parámetros y se expresó en ng/ml.
También se ensayó una serie de lotes de antígeno HEP incluyendo HEP2055, junto con el antígeno gD del herpes simple como control negativo. El ensayo mide la capacidad de cada antígeno de ensayo de inhibir la unión de RF1 a una preparación antigénica patrón (HEP286) unida a placas de microtitulación.
La Tabla 5 proporciona las concentraciones de cada antígeno que se encontró que inhibían el 50% de la unión de RF1 al antígeno fijado.
TABLA 5 Inhibición de la unión del anticuerpo monoclonal RF1 a HBsAg
Antígeno a granel CI50 (ng/ml)*
HEP286 3834
HEP673 3437
HEP720 3150
HEP2055 2384
HEF001 468
HEF002 574
HEF003 540
* CI50 = concentración de antígeno (ng/ml) que inhibe el 50% de la unión de RF1 al antígeno fijado.
Los resultados muestran que se necesitan de 4 a 7 veces menos antígeno HEF para inhibir la unión de RF1 (Tabla 5). Esto muestra que el antígeno preparado por el procedimiento modificado tiene una presentación aumentada del epítope en comparación con el antígeno a granel HEP.
Se realizó el mismo tipo de ensayo de inhibición usando sueros humanos de vacunas Engerix B™ en lugar del mAb RF1 y no se revelaron diferencias entre los lotes de antígeno HEP y los antígenos HEF.
2.1.5.2 Afinidad de unión a RF1 monoclonal
Se midieron los parámetros cinéticos de la unión del anticuerpo monoclonal RF1 a los 3 lotes de antígeno HEF y a HEP2055 por resonancia de plasmón superficial usando un aparato Biacore 2000 de Amersham Pharmacia Biotech, Amersham Place, Little Chalfont, Bucks, UK.
Los parámetros cinéticos medidos fueron:
ka:
la constante de velocidad de asociación (M^{-1}S^{-1})
kd:
la constante de velocidad de disociación (S^{-1})
Ka:
la constante de equilibrio o afinidad (M^{-1})
\quad
Donde Ka = ka/kd
Los valores encontrados se proporcionan en la Tabla 6.
TABLA 6 Constantes de afinidad de unión de RF1 a HBsAg
Antígeno a granel ka (x 10^{-3}) kd (x 10^{5}) Ka (x 10^{-7})
HEF001 6,81 3,21 21,97
HEF002 6,89 3,73 18,83
HEF003 7,39 4,67 15,80
HEP2055 3,31 6,30 5,31
\begin{minipage}[t]{160mm} Los tres lotes de antígeno HEF proporcionaron constantes de asociación/disociación y valores de afinidad de unión similares. Por el contrario, HEP2055 tiene una afinidad más débil de unión a FR1. \end{minipage}
Esto es consistente con los resultados del ensayo de inhibición ELISA que mostró que el antígeno preparado por el procedimiento libre de tiomersal tuvo una presentación aumentada del epítope RF1.
2.2 Ensayos y pruebas de la vacuna formulada con antígeno producido por el procedimiento modificado
Los tres lotes de antígeno HEF se adsorbieron en hidróxido de aluminio y se formularon como una vacuna de acuerdo con la composición que se muestra en la Tabla 1. La presentación es la dosis para adultos en viales (20 \mug de proteína antigénica en 1 ml). Los lotes se identifican como DENS001A4, DENS002A4 y DENS003A4.
La potencia de la vacuna se midió por un ensayo de contenido de antígeno in vitro usando el kit de ELISA AUSZYME de Abbott Laboratories y un lote clásico de vacuna formulado con 50 \mug/ml de tiomersal como patrón. La potencia de la vacuna se midió usando el procedimiento B como se describe en PharmaEuropa Special Issue Bio97-2 (Diciembre de 1997). Los tres lotes de HEF dan valores altos del contenido de antígeno, casi dos veces el contenido señalado de 20 \mug de proteína antigénica.
2.2.1 Reactividad de la vacuna DENS con anticuerpo monoclonal RF1
Se ensayó adicionalmente la antigenicidad de la vacuna adsorbida en un ensayo de inhibición con anticuerpo monoclonal RF1. El ensayo mide la capacidad de la muestra de vacuna de inhibir la unión de RF1 a un antígeno a granel fijado (HEP286).
Se mezcló 1:1 fluido ascítico diluido a 1/50000 en tampón de saturación (PBS que contiene BSA al 1%, Tween 20 al 0,1%) con diversas diluciones en PBS de las muestras de vacuna a ensayar (concentración que varía entre 20 \mug y 0,05 \mug/ml).
Se incubaron las mezclas en inmunoplacas Nunc (96U) durante 2 horas a 37ºC con agitación antes de transferirlas a placas revestidas con HBsAg. La preparación de HBsAg usada para revestir fue un lote de antígeno a granel (Hep 286) purificado por el procedimiento que contiene tiomersal. Estas placas después se incubaron durante 2 h a 37ºC con agitación. Después de una etapa de lavado con PBS que contiene Tween 20 al 0,1%, se añadió IgG de oveja anti-ratón conjugada con biotina diluida 1/1000 en tampón de saturación y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Después de la etapa de lavado, se añadió complejo estreptavidina-peroxidasa biotinilada diluido 1/1000 en tampón de saturación a los pocillos y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente con una solución que contenía OPDA AL 0,04%, H_{2}O_{2} al 0,03% en tampón citrato 0,1 M, pH 4,5. La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 2 N y las densidades ópticas (D.O.) se midieron a 490/630 nm y se representaron gráficamente.
La CI50, definida como la concentración de antígeno (concentración inhibidora) que inhibe el 50% de la unión del anticuerpo a HBsAg revestido se calculó usando una ecuación de 4 parámetros y se expresó en ng/ml.
La vacuna preparada a partir del antígeno a granel producido por el procedimiento modificado se comparó con la vacuna Engerix B™ formulada a partir del antígeno a granel HEP clásico sin tiomersal como conservante.
Los ensayos se procesaron por triplicado.
Los resultados se proporcionan en la Tabla 7 y muestran que aproximadamente la mitad de la cantidad de vacuna DENS es necesaria para conseguir un 50% de la inhibición de la unión de RF1 en comparación con la vacuna en Engerix B™ libre de conservante. Esto refleja una presentación aumentada del epítope RF1 en el antígeno HEF/DENS y es consistente con el ensayo hecho con anticuerpo RF1 sobre el antígeno a granel purificado.
TABLA 7 Inhibición de la unión de RF1 por la vacuna formulada
Lote de vacuna CI-50 (ng/ml)^{(1)}
Experimento Media
1 2 3
DENS001A4 913 662 603 726
DENS002A4 888 715 521 708
DENS003A4 817 685 582 695
ENG5100A2 1606 1514 1481 1534
ENG3199B9 1329 1170 1286 1262
ENG3328A9 1417 1194 1334 1315
(1) Concentración de vacuna que inhibe el 50% de la unión del anticuerpo RF1 al antígeno fijado.
2.2.2 Inmunogenicidad de la vacuna DENS en ratones
Se realizó un estudio en ratones Balb/C para comparar la inmunogenicidad de los tres lotes de consistencia DENS con Engerix™ producido de acuerdo con el procedimiento de fabricación de antígeno actual y formulado con tiomersal.
Se ensayaron los siguientes lotes:
Nº DENS001A4
Nº DENS002A4
Nº DENS003A4
Nº ENG2953A4/Q como referencia
Brevemente, se inmunizaron grupos de 12 ratones por vía intramuscular dos veces en intervalos de 2 semanas con dosis de vacuna que corresponden a 1/10 (2 \mug) o 1/50 (0,4 \mug) de la dosis para adultos humanos. La respuesta de anticuerpo frente a HBsAg y el perfil isotípico inducido por la vacunación se controlaron a partir de los sueros tomados en el día 28.
Diseño experimental
Se inmunizaron grupos de 12 ratones Balb/C por vía intramuscular en ambas patas traseras (2 x 50 \mul) en los días 0 y 15 con las siguientes dosis de vacuna
TABLA 8 Grupos y dosis de vacuna
Grupo Vacuna Volumen Dosis de antígeno
1 DENS001A4 100 \mul 2 \mug
2 \rightarrow Diluido 5X en PO4/NaCl 100 \mul 0,4 \mug
3 DENS002A4 100 \mul 2 \mug
4 \rightarrow Diluido 5X en PO4/NaCl 100 \mul 0,4 \mug
5 DENS003A4 100 \mul 2 \mug
6 \rightarrow Diluido 5X en PO4/NaCl 100 \mul 0,4 \mug
7 ENG2953A4/Q 100 \mul 2 \mug
8 \rightarrow Diluido 5X en PO4/NaCl 100 \mul 0,4 \mug
En los días 15 (2 semanas después de I) y 28 (2 semanas después de II) se tomó sangre del seno retroorbital.
Para el diseño de este experimento (4 formulaciones por x 2 dosis con 12 ratones por grupo), se estimó a priori la potencia con el programa estadístico PASS. El programa estadístico PASS (Power and Sample Size) se obtuvo de NCSS, 329 North 1000 East, Kaysville, Utah 84037. Para el análisis de dos vías de la varianza, debe detectarse una diferencia de 2,5 veces de GMT entre las formulaciones con un error alfa del 5% con una potencia de > 90%.
Resultados Serología
Se midieron las respuestas humorales (Ig e isotipos totales) por ensayo ELISA usando HBsAg (Hep286) como antígeno de revestimiento y anticuerpos anti-ratón conjugados con biotina para revelar la unión de anticuerpo anti-HBs. Se analizaron sólo los sueros después de II.
La Tabla 9 muestra la media y GMT de respuestas de anticuerpo Ig anti-HBs medidas en sueros individuales 2 semanas después de II.
Se inducen respuestas de anticuerpos equivalentes por las formulaciones DENS y de hepatitis B clásica: GMT que varía entre 2304 y 3976 EU/ml para los lotes DENS en comparación con 2882 EU/ml para la vacuna monovalente de hepatitis B de SB Biologicals (Engerix B™) a la dosis de 2 \mug, y GMT que varía entre 696 y 1182 EU/ml para los lotes DENS en comparación con 627 EU/ml para la vacuna monovalente de hepatitis B de SB Biologicals (Engerix B™) a la dosis de 0,4 \mug.
\bullet Como se esperaba, se observa un efecto que varía con la dosis de antígeno claro para todas las formulaciones a las dosis de 2 \mug y 0,4 \mug con una diferencia de 3 a 6 veces en GMT.
\bullet Se observaron 4 ratones no sensibles (títulos <50 EU/ml) sin uniones claras a las dosis de antígeno o lotes usados para la inyección (Grupos 1, 2, 3 y 8; un ratón por grupo).
En base al análisis estadístico (ensayo de Grubbs) estos ratones se descartaron del análisis adicional.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 9 Respuesta de anticuerpo en ratones en el día 28 (2 semanas después de II)
Grupo Vacuna Dosis Número Titulos ELISA (Ig)
Media GMT
1 DENS001A4 2 \mug 11 3466 2971
2 0,4 \mug 11 1283 1182
3 DENS002A4 2 \mug 11 2436 2304
4 0,4 \mug 12 984 786
5 DENS003A4 2 \mug 12 4583 3976
6 0,4 \mug 12 997 696
7 ENG2953A4/Q 2 \mug 12 3999 2882
0,4 \mug 11 737 627 
\vskip1.000000\baselineskip
Análisis estadístico
Se realizó un análisis de la varianza de dos vías sobre los títulos anti-HBs después de la transformación logarítimica de los datos después de II, usando las vacunas (4 lotes) y dosis de antígeno (2 \mug y 0,4 \mug) como factores. Este análisis confirmó que se observó una diferencia estadísticamente significativa entre las dos dosis de antígeno (valor p <0,001) y no mostró ninguna diferencia significativa entre los lotes de vacuna (valor p = 0,2674). Como se mencionó previamente, se estimó a priori la potencia y el diseño fue de tal modo que pudo detectarse una diferencia de 2,5 veces de GMT con un error alfa del 5% entre las formulaciones con una potencia de > 90%.
Perfil isotípico
La Tabla 10 muestra el reparto isotípico (IgG1, IgG2a y IgG2b) calculado a partir del análisis de los sueros combinados después de II.
\bullet Como se esperaba, se induce una respuesta TH2 clara por estas vacunas basadas en alumbre ya que se observan principalmente anticuerpos IgG1.
No se observa diferencia entre los lotes DENS o la vacuna monovalente de hepatitis B de SB Biologicals en términos del perfil isotípico.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 10 Reparto de los isotipos de IgG en los sueros del día 28 combinados
Grupo Vacuna Dosis Isotipo (%)
IgG1 IgG2a IgG2b
1 DENS001A4 2 \mug 91 4 5
2 0,4 \mug 87 8 5
3 DENS002A4 2 \mug 97 2 1
4 0,4 \mug 87 6 7
5 DENS003A4 2 \mug 98 1 1
6 0,4 \mug 93 4 3
7 ENG2953A4/Q 2 \mug 88 8 4
0,4 \mug 88 9 3 
\newpage
Ejemplo 3
Formulación de vacunas combinadas
El antígeno a granel de la invención es particularmente adecuado para la formulación en una vacuna combinada que comprende IPV.
Los estudios de estabilidad realizados en lotes iniciales de una vacuna DTPa- HBV-IPV combinada indicaron una disminución de la potencia del componente IPV, particularmente del antígeno de la poliomielitis tipo 1, cuando se usa un inmunoensayo in vitro (determinación del contenido de antígeno D por ELISA) y un ensayo de potencia en ratas in vivo. No se observó pérdida de potencia para el tipo 3. Para el tipo 2, la pérdida de la potencia estuvo en el intervalo esperado (no más de 10% de pérdida por año de almacenamiento).
Se iniciaron estudios para determinar la causa de esta pérdida de potencia en la vacuna DTPa-HBV-lPV combinada. A partir de la observación de que la estabilidad de IPV en la vacuna DTPa-lPV de SB Biologicals es satisfactoria (no más del 10% de pérdida del contenido de antígeno por año de almacenamiento) se concluyó que el componente HBV era probablemente responsable de la inestabilidad de IPV en la vacuna DTPa-HBV-IPV.
El componente HBV usado en la formulación DTPa-HBV-lPV inicial es el ADNr purificado de HBsAg obtenido de levaduras también usado para la fabricación de la vacuna monovalente de la hepatitis B de SB Biologicals y preparado como se describe en el Ejemplo 1.
Como primer intento para determinar qué elemento en el componente HBV era nocivo para IPV, se analizó el HBsAg a granel para la presencia de tiomersal. Se ha descubierto previamente (Davisson y col., 1956, J. Lab. Clin. Med 47:8-19) que el tiomersal usado como conservante en vacunas DTP "era nocivo para el virus de la poliomielitis" en una combinación DTP-IPV. Esta observación se consideró por los fabricantes de la vacuna que han remplazado el tiomersal por otros conservantes para formular sus vacunas que contienen IPV. Más recientemente, se volvió a investigar el efecto de tiomersal en la potencia de IPV en condiciones de almacenamiento de larga duración a +4ºC. Se informó de la pérdida de potencia del antígeno del poliovirus tipo 1 a niveles indetectables después de 4-6 meses (Sawyer, LA. y col. 1994, Vaccine 12; 851-856).
Usando espectroscopía de absorción atómica, se detectaron aproximadamente 0,5 \mug de mercurio (Hg) por 20 \mug de HBsAg en antígeno purificado de acuerdo con el Ejemplo 1.
Esta cantidad de mercurio (como tiomersal y cloruro de etilmercurio, el producto de degradación de tiomersal) puede reducir a niveles indetectables la respuesta ELISA para el contenido de antígeno D de tipo 1 en un concentrado a granel de IPV incubado a 37ºC durante 7 días.
Se estableció un procedimiento para liberar el mercurio presente en el HBsAg a granel. Se postuló que el mercurio podría unirse a grupos tiol en la partícula HBsAg y podría, por lo tanto, liberarse en presencia de agentes reductores. Después de la experimentación con otros agentes reductores, se seleccionó L-cisteína como agente para la liberación de mercurio a partir de la partícula de HBsAg. Después de la diálisis de HBsAg a granel frente a solución salina que contiene L-cisteína 5,7 mM, no se detectó mercurio en el retenido (límite de detección del método de ensayo: 25 ng de Hg/20 \mug de HBsAg). El antígeno dializado se mezcló con concentrado a granel de IPV y la estabilidad del virus de tipo 1 se evaluó midiendo el contenido de antígeno D después de incubación a 37ºC durante 7 días. El concentrado a granel de IPV no mezclado y mezclado con HBsAg no tratado con cisteína se usaron como controles. El título de ELISA de referencia se obtuvo de las muestras almacenadas de +2ºC a 8ºC durante 7 días.
Los resultados se resumen en la Tabla 11:
TABLA 11
Muestra Contenido de antígeno D (tipo 1) ^{(1)} Pérdida
7 días/4ºC 7 días/37ºC
IPV (no mezclado) 31,6 24,2 23%
IPV + HBsAg no tratado 31,1 18,1 42%
IPV + HBsAg tratado con cisteína 31,4 27,6 12%
IPV + tiomersal (1 \mug/ml) 30,5 11,0 74%
^{(1)} expresado en unidades de antígeno D (DU)
Los datos obtenidos de estas preparaciones de laboratorio demuestran claramente que la estabilidad del poliovirus tipo 1 está significativamente mejorada si se trata HBsAg con cisteína para retirar el mercurio residual antes de mezclar con IPV.
Los datos presentados anteriormente también muestran una pérdida del contenido de antígeno D del 23% para la preparación de IPV de referencia después de la incubación durante 7 días a 37ºC. Esto confirma la inestabilidad inherente del poliovirus de Mahoney tipo 1, como se ha informado previamente (Sawyer, LA. y col. (1994), Vaccine 12: 851-856).
Aunque los lotes comerciales de vacunas DTPa-HBV-IPV y DTPa-HBV-IPV/Hib se han preparado usando un procedimiento de diálisis con L-cisteína 5,7 mM para retirar el mercurio residual y conservar la estabilidad de IPV, el procedimiento de diálisis no es adecuado para la producción a gran escala e implica una serie de etapas suplementarias para preparar HBsAg libre de tiomersal o mercurio. Por el contrario, el HBsAg de la presente invención, preparado sin tiomersal, puede usarse directamente en formulaciones de vacunas combinadas especialmente las que contienen IPV.
4. Sumario
El procedimiento usado previamente para la purificación de antígenos de superficie obtenidos de levaduras contiene una etapa de permeación en gel en la que se incluye un compuesto tiomersal antimicrobiano que contiene mercurio en el tampón de elución para controlar la bioacumulación.
El tiomersal no se elimina completamente durante las posteriores etapas del procedimiento de modo que queda presente aproximadamente 1,2 \mug de tiomersal por 20 \mug de proteína en el antígeno a granel purificado.
Para producir un antígeno a granel completamente libre de tiomersal (mercurio) se ha alterado el procedimiento de purificación a dos etapas.
\bullet Se suprime tiomersal del tampón de elución en la etapa de permeación en gel 4B.
\bullet Se añade cisteína (concentración final 2 mM) a la combinación eluida de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Esto evita la precipitación del antígeno durante la centrifugación en gradiente de densidad de CsCl.
No hay otros cambios del procedimiento de producción.
El antígeno a granel producido por el procedimiento modificado se ha caracterizado. Los ensayos fisicoquímicos y pruebas muestran que el antígeno libre de tiomersal no se puede distinguir en sus propiedades del antígeno producido por el procedimiento usado previamente. Las partículas antigénicas tienen los mismos constituyentes.
La identidad e integridad del polipéptido HBsAg no se ve afectado por el procedimiento modificado según el juicio del análisis SDS-PAGE, transferencia de Western usando anticuerpos anti- HBsAg policlonales, análisis de secuencia N-terminal y composición de aminoácidos. La microscopía electrónica y análisis de dispersión de luz láser muestran que las partículas son de la forma típica y tamaño esperados para HBsAg obtenido de levaduras. El análisis por transferencia de Western con sueros anti-proteínas de levaduras muestra que el antígeno producido por el procedimiento libre de tiomersal tiene un patrón similar de proteínas de levadura contaminantes. Sin embargo, la cantidad de una banda contaminante que migra a 23 K se reduce enormemente en los 3 lotes de HBsAg producidos usando el procedimiento modificado.
Los análisis inmunológicos muestran que las partículas libres de tiomersal tienen una antigenicidad aumentada. Las partículas son más reactivas con el kit AUSZYME de Abbott (que contiene una mezcla de anticuerpos monoclonales) dando proporciones ELISA/proteína de 1,6 a 2,25. Esta antigenicidad aumentada también se muestra con el anticuerpo monoclonal RF1 protector. Se necesita aproximadamente de 4 a 7 veces menos antígeno libre de tiomersal para inhibir la unión de RF1 a un antígeno fijado convencional. Las curvas de inhibición de la unión de antígeno libre de tiomersal y clásico pertenecen a dos familias distintas. Esta diferencia también se muestra por las medidas de la constante de afinidad de unión para RF1 usando resonancia de plasmón superficial. Las afinidades de unión de las preparaciones libres de tiomersal son de 3 a 4 veces superiores en comparación con el lote de antígeno a granel clásico.
Las preparaciones de antígeno a granel se formularon como una vacuna por adsorción sobre hidróxido de aluminio y sin conservante.
El ensayo para la potencia in vitro usando el kit de ELISA AUSZYME de Abbott y la vacuna contra la hepatitis B de SB Biologicals que contiene tiomersal como patrón mostró que se obtenían altos valores de potencia in vitro. El contenido de antígeno medido por este ensayo fue casi el doble que el valor indicado de 20 \mug de proteína por ml.
También se vio una reactividad aumentada de la vacuna preparada a partir del antígeno libre de tiomersal en un ensayo de inhibición con anticuerpo monoclonal RF1 para la unión al antígeno fijado. Aproximadamente la mitad de la cantidad de la vacuna libre de tiomersal fue necesaria para proporcionar una inhibición del 50% de la unión de RF1 al antígeno fijado en comparación con el antígeno purificado por el procedimiento usado previamente y formulado sin conservante.
Esta antigenicidad aumentada de la vacuna libre de tiomersal con respecto a RF1 es consistente con los resultados del ensayo de potencia in vitro (contenido de antígeno) y con los ensayos de anticuerpo RF1 realizados en las preparaciones de antígeno a granel.
Se realizó un ensayo de inmunogenicidad en ratones usando vacunaciones de inicio y refuerzo separadas por dos semanas y dosis de 2 y 0,4 \mug de antígeno. Se extrajo sangre de los ratones en día 28, 14 días después del refuerzo. Se analizaron los sueros para el título de anticuerpo y composición de isotipo. Se observó un claro efecto de dosis de antígeno para las dos dosis administradas, pero no hubo diferencia estadísticamente significativa en la respuesta en términos de títulos de anticuerpo (GMT) entre las vacunas libres de tiomersal y libres de conservante.
No se observaron diferencias sustanciales en los perfiles de isotipo.

Claims (22)

1. Un procedimiento para producir una vacuna contra la hepatitis B, comprendiendo la vacuna un antígeno de superficie de hepatitis B purificado y un excipiente farmacéuticamente aceptable, comprendiendo el antígeno menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína, donde el antígeno está purificado en presencia de un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la vacuna está sin conservante.
3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el conservante es tiomersal.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el antígeno de hepatitis se adsorbe sobre hidróxido de aluminio.
5. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que una preparación de antígeno de hepatitis B en bruto
(a)
se somete a cromatografía de permeación en gel;
(b)
se somete a cromatografía de intercambio iónico; y
(c)
se mezcla con un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.
6. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el agente reductor es cisteína, glutatión, ditiotreitol o \beta-mercaptoetanol.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el agente reductor es cisteína.
8. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la cisteína se añade a una concentración final entre 1-10 mM.
9. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la cisteína se añade a una concentración final de aproximadamente 2 mM.
10. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que el antígeno se purifica en presencia de tiomersal antes del tratamiento con agente reductor.
11. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el antígeno purificado está completamente libre de tiomersal.
12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la vacuna es una vacuna libre de tiomersal.
13. Un procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que la vacuna comprende un adyuvante.
14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13, en el que el adyuvante es una sal de aluminio.
15. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la sal de aluminio es hidróxido de aluminio.
16. Un procedimiento de acuerdo con lo reivindicado en las reivindicaciones 13-15, que comprende un adyuvante que induce TH-1.
17. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que el adyuvante que induce TH-1 se selecciona entre el grupo constituido por: 3-DMPL, QS21, 3-DMPL y QS-21, y un oligonucleótido CpG.
18. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13- 17, en el que la vacuna comprende adicionalmente uno o más antígenos seleccionados entre el grupo constituido por: toxoide de la difteria (D), toxoide del tétanos (T), antígenos de pertussis acelular (Pa), poliovirus inactivado (IPV), antígeno de haemophilus influenzae (Hib), antígeno de la hepatitis A, virus del herpes simple (HSV), clamidia, GSB, HPV, antígenos de streptococcus pneumoniae y neisseria.
19. Un procedimiento para producir un antígeno de superficie de hepatitis B adecuado para su uso en una vacuna, comprendiendo el procedimiento la purificación del antígeno en presencia de un agente reductor que tiene un grupo -SH libre, donde el antígeno se purifica en presencia de tiomersal antes del tratamiento con el agente reductor.
20. Un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el producto antigénico purificado comprende menos de 0,025 \mug de mercurio por 20 \mug de proteína.
21. Un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20, en el que la preparación de antígeno de hepatitis B en bruto:
(a)
se somete a cromatografía de permeación en gel;
(b)
se somete a cromatografía de intercambio iónico; y
(c)
se mezcla con un agente reductor que tiene un grupo -SH libre.
22. Un procedimiento para producir un antígeno de hepatitis B de acuerdo con las reivindicaciones 19-21, en el que el agente reductor es cisteína, glutatión, ditiotreitol o \beta-mercaptoetanol.
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