BRPI0115096B1

BRPI0115096B1 - métodos para modificar geneticamente um gene endógeno ou local cromossômico em células eucarióticas não humanas, e em células-tronco embriônicas de camundongos

Info

Publication number: BRPI0115096B1
Application number: BRPI0115096A
Authority: BR
Inventors: Andrew J Murphy; Aris N Economides; David Frendewey; David M Valenzuela; George D Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2016-03-01
Also published as: CN100497642C; HUP0301575A2; JP6486979B2; NZ525511A; JP2004536556A; US6586251B2; JP2013162803A; HUP0301575A3; EP1399575A2; DE60121372T2; JP2017123855A; PL204759B1; DE60121372D1; JP2014039567A; JP2017104125A; NO20031897D0; KR100833136B1; PL361927A1; MXPA03003797A; WO2002036789A2

Abstract

"métodos para modificar geneticamente um gene endógeno ou local cromossômico em células eucarióticas, e em células-tronco embriônicas de camundongos, gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado, célula eucariótica e célula-tronco embriônica geneticamente modificadas, organismo não humano, camundongo, e, usos da célula e da célula-tronco embriônica geneticamente modificadas". um método para engenheirar e utilizar grandes vetores de dna para marcar, via recombinação homóloga, e modificar, em qualquer modo desejável, genes endógenos e locais cromossômicos em células eucarióticas. estes grandes vetores de marcação de dna para células eucarióticas, chamados ltvecs, são derivados de fragmentos de dna genômico clonado maior do que os tipicamente usados por outras abordagens destinadas a realizar marcação homóloga em células eucarióticas. também é provido um método rápido e conveniente de detecção de células eucarióticas em que ltvec foi corretamente marcado e modificado o(s) gene(s) endógeno(s) desejado (s) ou local cromossômico (locais) assim como o uso destas células para gerar organismos contendo a modificação genética.

Description

“MÉTODOS PARA MODIFICAR GENETICAMENTE UM. GENE ENDÓGENO OU LOCAL CROMOSSÔMICO EM CÉLULAS EUCARIÓTICAS NÃO HUMANAS, E EM CÉLULAS-TRONCO EMBRIÔNICAS DE C A M UNDONGOS ” Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente US No, 09/732.234, depositado em 7 de dezembro de 2000 e pedido de patente US provisório No, 60/244.665, depositado em 31 de outubro de 2000, Por todo este pedido, faz-se referência a várias publicações. As descrições destas publicações em sua totalidade são aqui incorporadas por referência neste pedido.

Campo da Invenção O campo desta invenção é um método para engenheirar e utilizar vetores de DNA grandes para marcação, por meio de recombinação homóloga, e modificar, de qualquer forma desejada, genes endógenos e locais cromossômicos em células eucarilóricas. Estes vetores de marcação de DNA grandes, denominados LTVECs, são derivados de fragmentos de DNA genômico clonado maior do que aqueles tipicamente usados por outras abordagens destinadas a realizar marcação homóloga em células eucarilóricas. O campo da invenção ainda provê uni método rápido e conveniente para detectar células eucarilóricas em que o LTVEC marcou e modificou corretamente o(s) gene(s) endógeno(s) desejado(s) ou local(is) cromossômico(s). O campo ainda engloba o uso destas células para gerar organismos contendo a modificação genética, os próprios organismos e métodos de usos dos mesmos. introdução O uso de LTVECs provê vantagens substanciais sobre os métodos atuais. Por exemplo, uma vez que estes são derivados de fragmentos de DNA maiores do que aqueles usados presentemente para gerar vetores de marcação, LTVECs podem ser mais rapidamente e convenientemente gerados de bibliotecas disponíveis de fragmentos de DNA genômico grandes (tais como bibliotecas BAC e PAC) do que vetores de marcação feitos usando tecnologias atuais. Adicionalmente, maiores modificações assim como modificações abrangendo regiões genômicas maiores podem ser mais convenientemente geradas do que usando-se tecnologias atuais.

Além do mais, a presente vantagem tem vantagem em regiões longas de homologia para aumentar a freqüência de marcação de locais "difíceis de marcar" e também diminui o benefício, se algum, de usar-se DNA isogênico nestes vetores de marcação. A presente invenção, assim, provê um método rápido, conveniente, e direto para modificar sistematicamente virtualmente todos os genes endógenos e locais cromossômicos de um dado organismo.

Antecedentes da Invenção A marcação de genes por meio de recombinação homóloga entre DNA exógeno homólogo e seqüências cromossômicas endógenas provaram ser uma forma extremamente valiosa para criar deleções, inserções, mutações do desenho, mutações de gene corretas, introduzir transgenes ou fazer outras modificações genéticas em camundongos. Os métodos atuais envolvem o uso de vetores de marcação padrão, com regiões de homologia para DNA endógeno tipicamente totalizando menos do que 10-20 kb, para introduzir a modificação genética desejada nas células troncos embriônicas (ES) de camundongo, seguida pela injeção das células ES alteradas em embriões de camundongo para transmitir estas modificações genéticas engenheiradas na linhagem germinal do camundongo (Smithies et al., Nature, 317:230-234, 1985; Thomas et al., Cell, 51:503-512, 1987; Koller et al., Proc Natl Acad Sei USA, 86:8927-8931, 1989; Kuhn et al., Science, 254:707-710, 1991; Thomas et al., nature, 346:847-850, 1990; Schwartzberg et al., Science, 246:799-803, 1989; Doetschman et al., Nature, 330:576-578, 1987; Thomson et al., Cell, 5:313-321, 1989; DeChiara et al., Nature, 345:78-80, 1990; patente US No. 5.789.215, concedida em 4 de agosto de 1998 no nome de GenPharm International). Nestes métodos atuais, detectar as células ES raras em que os vetores de marcação padrão marcaram e modificaram corretamente o gene(s) endógeno(s) desejado(s) ou local(is) cromossômico(s) requer a informação de seqüência fora das seqüências de marcação homólogas contidas dentro do vetor de etiquetagem. Testes para marcação bem-sucedida envolvem Southern blotting padrão ou PCR longa (Cheng et al., Nature, 369:684-5, 1994; Foord and Rose, PCR Methods Appl, 3:S149-61, 1994; Ponce and Micol, Nucleic Acid Res, 20:623, 1992; patente US No. 5.436.149 concedida a Takara Shuzo Co., Ltd.) de seqüências fora do vetor de etiquetagem e abrangendo um braço de homologia inteiro (ver Definições); assim, por causa de considerações de tamanho que limitam estes métodos, o tamanho dos braços de homologia são restritos a menos do que 10-20 kb no total (Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999). A capacidade de se utilizar vetores de marcação com braços de homologia maiores do que aqueles usados nos métodos atuais seria extremamente valiosa. Por exemplo, tais vetores de marcação poderíam ser mais rapidamente e convenientemente gerados de bibliotecas disponíveis contendo insertos genômicos grandes (por exemplo, bibliotecas BAC ou PAC) do que vetores de marcação feitos usando-se tecnologias atuais, em que tal insertos genômicos devem ser extensamente caracterizados e aparados antes do uso. Adicionalmente, modificações maiores assim como modificações abrangendo regiões genômicas maiores poderíam ser mais convenientemente geradas e em menos etapas do que usando-se tecnologias atuais. Além do mais, o uso de regiões longas de homologia podería aumentar a ffeqüência de marcação de locais "difíceis de marcar" em células eucaritóricas, uma vez que a marcação de recombinação homóloga em células eucaritóricas parece estar relacionada à homologia total contida dentro do vetor de etiquetagem (Deng and Capecchi, Mol Cell Biol, 12:3365-71, 1992). Adicionalmente, a freqüência de marcação aumentada obtida usando-se braços de homologia longos podería diminuir qualquer benefício em potencial que possa ser derivado do uso de DNA isogênico nestes vetores de marcação. O problema de se engenheirar modificações precisas em fragmentos genômicos muito grandes, tais como aqueles clonados em bibliotecas BAC foi amplamente resolvido através do uso de recombinação homóloga em bactérias (Zhang, et al., Nat Gent, 20:123-8; Yang, et al., Nat Biotechnol, 15:859-65, 1997; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27:el6, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999), permitindo a construção de vetores contendo regiões grandes de homologia a genes endógenos eucarióticos ou locais cromossômicos. No entanto, uma vez feitos, estes vetores não foram geralmente úteis para modificar os genes endógenos ou locais cromossômicos por meio de recombinação homóloga por causa da dificuldade em detectar em eventos de marcação corretos raros quando os braços de homologia são maiores do que 10-20 kb (Joyner, the Practical Approach series, 293, 1999). Conseqüentemente, os vetores gerados usando recombinação homóloga bacteriana de fragmentos genômicos BAC devem ainda ser extensivamente aparados antes do uso como vetores de marcação (Hill et al., Genomics, 64:111-3, 2000). Portanto, ainda existe uma necessidade de uma metodologia rápida e conveniente que tome possível o uso de vetores de marcação contendo grandes regiões de homologia de modo a modificar genes endógenos ou locais cromossômicos em células eucaritóricas.

De acordo com a presente invenção, os requerentes provêem novos métodos que permitem o uso de vetores de marcação contendo grandes regiões de homologia de modo a modificar genes endógenos ou locais cromossômicos em células eucaritóricas por meio de recombinação homóloga. Tais métodos superam as limitações descritas acima das tecnologias atuais. Adicionalmente, o versado na arte irá prontamente reconhecer que os métodos da invenção são facilmente adaptados para uso com qualquer DNA genômico de qualquer organismo eucariótico incluindo, mas não limitado a, animais tais como camundongo, rato, outro roedor, ou humanos, assim como plantas tais como soja, milho e trigo.

Sumário da Invenção De acordo com a presente invenção, os requerentes desenvolveram um método novo, rápido, direto e eficiente para criar e triar células eucarióticas que contém genes endógenos modificados ou locais cromossômicos. Este novo método combina, pela primeira vez: 1. recombinação homóloga bacteriana para engenheirar com precisão uma modificação genética desejada dentro de um grande fragmento genômico clonado, assim criando um vetor de etiquetagem grande para uso em células eucarióticas (LTVECs); 2. introdução direta destes LTVECs em células eucarióticas para modificar o local cromossômico endógeno de interesse nessas células, e 3. uma análise para determinar as células eucarióticas raras em que o alelo marcado foi modificado, como desejado, envolvendo um teste para modificação de alelo (MOA) do alelo parental que não requer informação de seqüência fora da seqüência de marcação, como, por exemplo, PCR quantitativo.

Uma forma de realização preferida da invenção é um método para modificar geneticamente um gene endógeno ou local cromossômico em células eucarióticas, compreendendo: a) obter um grande fragmento genômico clonado contendo uma seqüência de DNA de interesse; b) usar uma recombinação homóloga bacteriana para modificar geneticamente o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem para uso em células eucarióticas (LTVEC); c) introduzir o LTVEC de (b) em células eucarióticas para obter o gene endógeno ou local cromossômico nas células; e d) usar um teste quantitativo para detectar a modificação de alelo (MOA) nas células eucarióticas de (c) para identificar as células eucarióticas em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado.

Outra forma de realização da invenção é um método em que a modificação genética para o gene endógeno ou local cromossômico compreende deleção de uma seqüência de codificação, segmento de gene, ou elemento regulador, alteração de uma seqüência de codificação; segmento de gene ou elemento regulador; inserção de uma nova seqüência de codificação; segmento de gene ou elemento regulador; criação de um alelo condicional; ou substituição de uma seqüência de codificação ou segmento de gene de uma espécie com uma seqüência de codificação homóloga ou ortóloga de uma espécie diferente.

Uma forma de realização alternativa da invenção é um método em que a alteração de uma seqüência de codificação; segmento de gene ou elemento regulador compreende uma substituição, adição, ou fusão, em que a fusão compreende uma etiqueta de epítopo ou par bifimcional.

Ainda outra forma de realização da invenção é um método em que o teste quantitativo compreende PCR quantitativo, hibridação genômica comparativa, amplificação de DNA isotérmica, hibridação quantitativa para uma sonda imobilizada, Invader Probes®, ou MMP assays ®, e em que o PCR quantitativo compreende TaqMan® Molecular Beacon, ou tecnologia de sonda Eclipse ®.

Outra forma de realização preferida da invenção é um método em que a célula eucariótica é uma célula-tronco embriônica de mamíferos e, particularmente, em que a célula-tronco embriônica é uma célula-tronco embriônica de camundongos, ratos, ou outros roedores.

Outra forma de realização preferida da invenção é um método em que o gene endógeno ou local cromossômico é um gene de mamífero ou local cromossômico, preferivelmente um gene humano ou um local cromossômico ou um gene ou local cromossômico de um camundongo, rato ou outro roedor.

Uma forma de realização preferida adicional é uma em que o LTVEC é capaz de acomodar grandes fragmentos de DNA maiores do que 20 kb, e particularmente fragmentos de DNA grandes, maiores do que 100 kb.

Outra forma de realização preferida é um gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado que é produzido pelo método da invenção.

Ainda outra forma de realização preferida é uma célula eucariótica geneticamente modificada que é produzida pelo método da invenção.

Uma forma de realização preferida da invenção é um organismo não humano contendo o gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado que é produzido pelo método da invenção.

Também é preferido um organismo não humano produzido a partir das células eucarióticas geneticamente modificadas ou células-tronco embriônicas produzidas pelo método da invenção.

Uma forma de realização preferida é um organismo não humano contendo um gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado produzido por um método compreendendo as etapas de: a) obter um grande fragmento genômico clonado contendo uma seqüência de DNA de interesse; b) usar recombinação homóloga bacteriana para geneticamente modificar o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem (LTVEC) para uso em células-tronco embriônicas; c) introduzir o LTVEC de (b) nas células-tronco embriônicas para modificar o gene endógeno ou local cromossômico nas células; d) usar um teste quantitativo para detectar a modificação de alelo (MOA) nas células-tronco embriônicas de (c) para identificar as células-tronco embriônicas em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado; e) introduzir a célula-tronco embriônica de (d) em blastocistos; e f) introduzir o blastocisto de (e) em uma "mãe de aluguel" para gestação.

Uma forma de realização preferida adicional da invenção é um organismo não humano contendo um gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado, produzido pelo método compreendendo as etapas de: a) obter um grande fragmento genômico clonado contendo uma seqüência de DNA de interesse; b) usar recombinação homóloga bacteriana para modificar geneticamente o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem para uso em células eucarióticas (LTVEC); c) introduzir o LTVEC de (b) nas células eucarióticas para modificar geneticamente o gene endógeno ou local cromossômico nas células; d) usar um teste quantitativo para detectar modificação de alelo (MOA) nas células eucarióticas de (c) para identificar essas células eucarióticas em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado; e) remover o núcleo da célula eucariótica de (d); f) introduzir o núcleo de (e) em um oócito; e g) introduzir o oócito de (f) em uma "mãe de aluguel" para gestação.

Ainda outra forma de realização preferida é um organismo não humano contendo um gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado, produzido por um método compreendendo as etapas de: a) obter um grande fragmento genômico clonado contendo uma seqüência de DNA de interesse; b) usar recombinação homóloga bacteriana para geneticamente modificar o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem para uso em células eucarióticas (LTVEC); c) introduzir o LTVEC de (b) em células eucarióticas para geneticamente modificar o gene endógeno ou local cromossômico nas células; d) usar um teste quantitativo para detectar modificação de alelo (MOA) nas células eucarióticas de (c) para identificar estas células eucarióticas em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado; e) fundir a célula eucariótica de (d) com outra célula eucariótica; f) introduzir a célula eucariótica fundida de (e) em uma "mãe de aluguel" para gestação.

Em formas de realização preferidas, o organismo não humano é um camundongo, rato ou outro roedor; o blastocisto é um blastocisto de camundongo, rato ou outro roedor, o oócito é um oócito de camundongo, rato ou outro roedor, e a "mãe de aluguel" é um camundongo, rato ou outro roedor.

Outra forma de realização preferida é uma em que a célula-tronco embriônica é uma célula-tronco embriônica de mamíferos, preferivelmente uma célula-tronco embriônica de camundongo, rato ou outro roedor.

Uma forma de realização preferida adicional é o uso de células eucarióticas geneticamente modificadas da invenção para a produção de um organismo não humano, e particularmente o uso de célula-tronco embriônica geneticamente modificada da invenção para a produção de um organismo não humano.

Uma forma de realização preferida da invenção é um método para modificar geneticamente um gene endógeno ou local cromossômico de interesse em células-tronco embriônicas de camundongos; compreendendo a) obter um grande fragmento genômico clonado maior do que 20 kb que contém uma seqüência de DNA de interesse, em que o grande fragmento de DNA clonado é homólogo ao gene endógeno ou local cromossômico; b) usar recombinação homóloga bacteriana para geneticamente modificar o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem para uso nas células-tronco embriônicas de camundongos, em que a modificação genética é uma deleção de uma seqüência de codificação, um segmento de gene ou elemento regulador; c) introduzir o grande vetor de etiquetagem de (b) nas células-tronco embriônicas de camundongos para modificar o gene endógeno ou local cromossômico nas células, e d) usar um teste quantitativo para detectar a modificação de alelo (MOA) nas células-tronco embriônicas de camundongos de (c) para identificar as células-tronco embriônicas de camundongos em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado, em que o teste quantitativo é PCR quantitativo. Também é preferida uma célula-tronco embriônica de camundongo geneticamente modificada produzida por este método; um camundongo contendo um Gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado produzido por este método; e um camundongo produzido a partir da célula-tronco embriônica de camundongo geneticamente modificada.

Outra forma de realização preferida é um camundongo contendo um Gene endógeno ou local cromossômico geneticamente modificado de interesse, produzido por um método compreendendo as etapas de a) obter um grande fragmento genômico clonado maior do que 20 kb que contém uma seqüência de DNA de interesse, em que o grande fragmento de DNA clonado é homólogo ao gene endógeno ou local cromossômico; b) usar recombinação homóloga bacteriana para geneticamente modificar o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem para uso nas células-tronco embriônicas de camundongos; em que a modificação genética é deleção de uma seqüência de codificação, segmento de gene, ou elemento regulador; c) introduzir o grande vetor de etiquetagem de (b) nas células-tronco embriônicas de camundongos para modificar o gene endógeno ou local cromossômico nas células; e d) usar um teste quantitativo para detectar modificação de alelo (MOA) nas células-tronco embriônicas de camundongos de (c) para identificar as células-tronco embriônicas de camundongos em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado, em que o teste quantitativo é PCR quantitativo; e) introduzir a célula-tronco embriônica de camundongos de (d) em um blastocistos; e f) introduzir o blastocisto de (e) em uma "mãe de aluguel" para gestação.

Também é preferido o uso da célula-tronco embriônica de camundongos geneticamente modificada descrita acima para a produção de um camundongo.

Também são preferidos métodos em que cerca de 1-5 pg de DNA de vetor de etiquetagem grande é introduzido em cerca de 1 x 107 células eucarióticas.

Breve Descrição Dos Desenhos Figura 1 - Diagrama esquemático da geração de um LTVEC típico usando recombinação homóloga bacteriana (hbl= caixa de homologia 1; hb2 = caixa de homologia 2; RE = sítio de enzima de restrição) Figura 2 - Diagrama esquemático de fragmento doador e LTVEC para OCRIO de camundongo. (hbl = caixa de homologia, lacZ = β -galactosidase ORF; SV40 polyA = um fragmento de DNA derivado de vírus 40 de símios contendo um sítio de poliadenilação e sinal; PGK p = promotor de fosfoglicerato quinase de camundongo (PGK); EM7 = um promotor bacteriano; neo = neomicina fosfotransferase; PGK polyA = 3' região não traduzida derivada de gene PGK contendo um sítio de poliadenilação e sinal; hb2 = caixa de homologia 2) Figura 3A-3D: Seqüência de cDNA OCRIO de camundongo, caixa de homologia 1 (hbl), caixa de homologia 2 (hb2), e sondas TaqMan ® e iniciadores usados em um teste quantitativo PCR para detectar modificação de alelo (MOA) em células ES marcadas usando LTVEC mOCRIO. hbl - pares de bases 1 a 211 hb2 - pares de bases 1586 a 1801 Sonda TaqMan ® e conjunto de iniciador PCR correspondente derivado de um exon 3 mOCRIO;

Sonda TaqMan ®: nucleotídeos 413 a 439 - filamento superior Iniciador ex3-5': nucleotídeos 390 a 410 - filamento superior Iniciador ex3-3': nucleotídeos 445 a 461 - filamento inferior Sonda TaqMan (D e conjunto de iniciador de PCR correspondente derivado de exon 4 mOCRIO.

Sonda Taq Man ®: nucleotídeos 608 a 639 - filamento superior Iniciador ex4-5': nucleotídeos 586 a 605 - filamento superior Iniciador ex4-3': nucleotídeos 642 a 662 - filamento inferior Definições Um "vetor de etiquetagem" é uma construção de DNA que contém seqüências "homólogas" a seqüências de ácido nucleico cromossômico endógeno flanqueando uma modificação(ões) genética desejada. As seqüências de homologia de flanco, a que se faz referência como " braços de homologia", direcionam o vetor de etiquetagem a um local cromossômico específico dentro do genoma por meio da homologia que existem entre os braços de homologia e a seqüência endógena correspondente e introduzem a modificação genética desejada por um processo a que se faz referência como "recombinação homóloga". "Homólogo" significa duas ou mais seqüências de ácido nucleico que são idênticas ou similares o bastante de forma a serem capazes de se hibridizarem entre si ou sofrerem troca intermolecular. "Marcação de gene" é a modificação de um local cromossômico endógeno pela inserção, deleção, ou substituição da seqüência endógena por meio de recombinação homóloga usando um vetor de etiquetagem.

Uma "inativação de gene" uma modificação genética resultante da interrupção da informação genética codificada em um local cromossômico.

Um " ativação de gene" é uma modificação genética resultante da substituição da informação genética codificada em um local cromossômico com uma seqüência de DNA diferente.

Um "organismo de inativação" é um organismo em que uma proporção significativa das células do organismo abrigam uma "ativação de gene".

Um "organismo de ativação" é um organismo em que uma proporção significativa das células do organismo abrigam uma ativação de gene.

Um "marcador" ou "marcador selecionável" é um marcador de seleção que permite o isolamento de células transfectadas raras expressando o marcador da maioria das células tratadas na população. Tal gene de marcador inclui, mas não está limitado a, neomicina fosfotransferase e higromicina B fosfotransferase, ou proteínas fluorescentes tais como GFP.

Uma "célula ES" é uma célula-tronco embriônica. Estas células são normalmente derivadas de uma massa interior de células de embrião no estágio de blastocisto.

Um "clone de célula ES" é uma subpopulação de células derivadas de uma única célula da população de células ES seguinte à introdução de DNA e seleção subseqüente.

Um "DNA de flanco" é um segmento de DNA que é colinear e adjacente a um ponto de referência em particular. "LTVECs" são vetores de marcação grandes para células eucaritóricas que são derivados de fragmentos de DNA genômico clonado maior do que aqueles tipicamente usados por outras abordagens destinadas a realizar marcação homóloga em células eucaritóricas.

Um "organismo não-humano" é um organismo que não é normalmente aceito pelo público como sendo humano. "Modificação de alelo" (MOA) refere-se à modificação da seqüência de DNA exata de um alelo de um gene(s) ou local(is) cromossômico(s) em um genoma. Esta modificação de alelo (MOA) inclui, mas não está limitada a, deleções, substituições, ou inserções de tão pouco quanto um único nucleotídeo ou deleções de muitas quilobases abrangendo um gene(s) ou local(is) cromossômico(s) de interesse, assim como qualquer e todas as modificações possíveis entre estes dois extremos.

Seqüência "ortóloga" refere-se a uma seqüência de uma espécie que é o equivalente funcional daquela seqüência em outra espécie. A descrição e exemplos apresentados infra são providos para ilustrar a presente invenção. Uma pessoa versada na arte irá reconhecer que estes exemplos são providos por meio de ilustração apenas e não são incluídos com o propósito de limitar a invenção.

Descrição Detalhada da Invenção Os requerentes desenvolveram um método novo, rápido, direto e eficiente para criar e triar células eucarióticas que contém genes endógenos modificados ou locais cromossômicos. Nestas células, a modificação pode ser inativações de gene(s), ativações, mutações de pontos, ou grandes inserções ou deleções genômicas ou outras modificações. A título de exemplo não limitativo, estas células podem ser células-tronco embriônicas que são utilizáveis para criar organismos de inativação ou ativação, e particularmente camundongo de inativação a ativação, para o fim de determinar a função do(s) gene(s) que foi alterada, deletada e/ou inserida.

Os novos métodos descritos aqui combinam, pela primeira vez: 1. recombinação homóloga bacteriana para engenheirar com precisão uma modificação genética desejada dentro de um grande fragmento genômico clonado, assim criando um vetor de etiquetagem grande para uso em células eucarióticas (LTVECs); 2. introdução direta destes LTVECs em células eucarióticas para modificar o gene (s) endógeno(s) correspondente (s) ou local cromossômico (locais) de interesse nessas células, e 3. uma análise para determinar as células eucarióticas raras em que o alelo marcado foi modificado, como desejado, envolvendo um teste quantitativo para modificação de alelo (MOA) do alelo parental.

Deve ser enfatizado que os métodos anteriores para detectar recombinação homóloga de sucesso em células eucarióticas não podem ser usados em conjunto com um LTVEC da invenção dos requerentes devido aos longos braços de homologia presentes em LTVEC. Usar um LTVEC para modificar deliberadamente os genes endógenos ou locais cromossômicos em células eucarióticas via recombinação homóloga é tomado possível pela nova aplicação de um teste para determinar as células eucarióticas raras em que o alelo marcado foi modificado como desejado, este teste envolvendo um teste quantitativo para modificação de alelo (MOA) de um alelo parental, por emprego, por exemplo, de PCR quantitativo ou outros testes quantitativos apropriados para MOA. A capacidade de utilizar vetores de marcação com braços de homologia maiores do que os usados em métodos atuais é extremamente valiosa pelas seguintes razoes: 1. vetores de marcação são mais rapidamente e convenientemente gerados a partir de bibliotecas disponíveis contendo grandes insertos genômicos (por exemplo bibliotecas BAC ou PAC) do que os vetores de marcação feitos usando tecnologias anteriores, em que os insertos genômicos precisam ser extensivamente caracterizados e "aparados" antes do uso (explicado em detalhes abaixo). Além disso, a informação de seqüência mínima precisa ser conhecida sobre o local de interesse, isto é, é somente necessário conhecer os aproximadamente 80-100 nucleotídeos que são requeridos para gerar as caixas de homologia (descritas abaixo) e gerar sondas que possam ser usadas em teste quantitativo para MOA (descritos abaixo). 2. modificações maiores assim como modificações na faixa de maiores regiões genômicas são geradas de modo mais conveniente e em menores etapas do que usando as tecnologias anteriores. Por exemplo, o método da invenção toma possível modificação precisa de locais grandes que não podem ser acomodados por vetores de marcação à base de plasmídeos tradicionais devido às suas limitações de tamanho. Também toma possível a modificação de qualquer local dado em pontos múltiplos (por exemplo a introdução de mutações específicas em diferentes exons de gene multi-exons) em uma etapa, aliviando a necessidade de engenheirar vetores de marcação múltiplos e realizar ciclos múltiplos de marcação e triagem para recombinação homóloga em células ES. 3. O uso de regiões longas de homologia (braços de homologia longos) aumentam a freqüência de marcação de locais "difíceis de marcar" em células eucarióticas, consistente com descobertas anteriores que a marcação de recombinação homóloga em células eucarióticas parece estar relacionada com a homologia total contida dentro do vetor de etiquetagem. 4. A aumentada freqüência de marcação obtida usando braços de homologia longos aparentemente diminui o benefício, se qualquer, de usar DNA isogênico nestes vetores de marcação. 5. A aplicação de testes quantitativos MOA para triar células eucarióticas para recombinação homóloga não somente fortalece o uso de LTVEC como vetores de marcação (vantagens dadas acima) mas também reduz o tempo para a identificação correta de células eucarióticas modificadas dos vários dias típicos para algumas horas. Além disso, a aplicação de MOA quantitativo não requer o uso de sondas localizadas fora do(s) gene(e) endógeno(s) ou local cromossômico (locais) que estão sendo modificados, assim eliminando a necessidade de conhecer a seqüência flanqueando o(s) gene(s) modificado (s) ou local (locais). Esta é uma melhora significante no modo de triar que foi realizado no passado e o toma uma abordagem bem menos intensiva na mão de obra como bem mais efetiva no custo para triar eventos de recombinação homólogos em células eucarióticas. Métodos Muitas das técnicas usadas para construir vetores de DNA descritos aqui são técnicas de biologia molecular padrão bem conhecidas dos versados na arte (ver, por exemplo (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1,2 e 3,1989, Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al, Greene Publ. Assoe. Wiley Interscience, NY). Todo o sequenciamento de DNA é feito por técnicas padrões usando um sequenciador de DNA ABI 373A e kit de sequenciamento de ciclo Taq Dideoxy Terminator (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA).

Etapa 1- Obtenção de um clone de DNA genômico grande contendo o(s) gene(s) ou local cromossômico (locais) de interesse Um gene(s) ou local (locais) de interesse pode ser selecionado em critérios específicos, como dados funcionais ou estruturais detalhados ou pode ser selecionado na ausência desta informação detalhada à medida que genes potenciais ou fragmentos de genes se tomam previstos através dos esforços de seqüenciamento do genoma.

Importantemente, deve ser notado que não é necessário conhecer a seqüência completa e estrutura de gene de um gene (s) de interesse para aplicar o método da presente invenção para produzir LTVECs. De fato, a única informação de seqüência que é requerida são aproximadamente 80-100 nucleotídeos de modo a obter o clone genômico de interesse bem como gerar as caixas de homologia usadas para produzir LTVEC (descritas em detalhe abaixo) e para produzir sondas para uso em testes quantitativos MOA.Uma vez que um gene (s) ou local (locais) de interesse foi selecionado, um clone (s) genômico (s) grande (s) contendo este (s) gene (s) ou local (locais) é obtido. Este (s) clone (s) pode(m) ser obtido (s) em qualquer um de vários modos incluindo, mas não limitados a triagem de bibliotecas de DNA apropriadas (por exemplo, BAC, PAC, YAC, ou cosmídeo) por técnicas PCR ou de hibridação padrão, ou por quaisquer outros métodos familiares aos versados na arte.

Etapa 2. Anexação de caixas de homologia 1 e 2 a um cassete de modificação e geração de LTVEC.

Caixas de homologia marcam os sítios de recombinação homóloga bacteriana que são usados para gerar LTVECs de fragmentos genômicos clonados grandes (figura 1). Caixas de homologia são segmentos curtos de DNA, geralmente de filamento duplo e pelo menos 40 nucleotídeos de comprimento, que são homólogos a regiões no fragmento genômico clonado flanqueando a “região a ser modificada”. As caixas de homologia são anexadas ao cassete de modificação, de modo que após recombinação homóloga em bactérias, o cassete de modificação substitui a região a ser modificada (figura 1). A técnica de criar um vetor de etiquetagem usando recombinação homóloga bacteriana pode ser realizada em uma variedade de sistemas (Yang et al., Nat. Biotechnol, 15: 859-65, 1997; Muyrers et al., Nucleic Acids Res, 27: 1555-7, 1999; Angrand et ah, Nucleic Acids Res, 27:el6, 1999; Narayanan et ah, Gene Ther, 6: 442-7, 1999; Yu et ah, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 97: 5978-83, 2000). Um exemplo de uma tecnologia favorecida atualmente em uso é clonagem ET (Zhang et ah, Nat. Genet, 20: 123-8, 1998; Narayanan et ah, Gene Ther, 6: 442-7, 1999) e variações desta tecnologia (Yu et ah, Proc. Natl. Acad. Sei USA, 97: 5978-83, 2000). ET refere-se às proteínas recE (Hall e Kolodner, Proc Natl Acad Sei USA, 91: 3205-9, 1994) e recT (Kusano et ah, Gene, 138:17-25, 1994) que realiza a reação de recombinação homóloga. RecE é uma exonuclease que dispõe um filamento de DNA de filamento duplo linear (essencialmente o fragmento de DNA doador descrito infra) 5’ a 3’, dando depois um fragmento de filamento duplo linear com suspensão de filamento único 3’. Esta suspensão de filamento único é revestido pela proteína recT, que tem atividade de ligação de DNA de filamento único (ssDNA) (Kovall e Matthewsm, Science, 277: 1824-7, 1997). Clonagem de ET é realizada usando E. coli que expressa transientemente os produtos do gene de E. coli de recR e recT (Hall e Kolodner, Proc Natl Acad Sei USA 91: 3205-9, 1994; Clark et ah, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49: 453-62, 1984; Noirot e Kolodner, J Biol Chem, 273: 12274-80, 1998; Thresher et al., J Mol Biol, 254: 364-71, 1995; Kolodner et al., Mol Microbiol, 11: 23-30, 1994; Hall et al., J Bacteriol, 175: 277-87, 1993) e a proteína λgam (λ) lamba de bacteriófago (Murphy, J Bacteriol, 173: 5808-21, 1991; Poteete et al., J Bacteriol, 170: 2012-21, 1988). A proteína Xgam é requerida para proteger o fragmento de DNA doador de degradação pelo sistema de exonuclease recBC (Myers e Stahl, Annu Rev Genet, 28: 49-70, 1994) e é requerida para clonagem de ET eficiente em hospedeiros recBC+ como a cepa DHIOb de E. coli ffeqüentemente usada. A região a ser modificada e substituída usando recombinação homóloga bacteriana pode estar na faixa de zero nucleotídeos de comprimento (criando uma inserção no local original) a muitas dezenas de quilobases (criando uma deleção e/ou uma substituição do local original). Dependendo do cassete de modificação, a modificação pode resultar no seguinte: (a) deleção de seqüências de codificação, segmentos de genes ou elementos regulatórios; (b) alteração (ões) de seqüências de codificação, segmentos de genes ou elementos regulatórios incluindo substituições, adições e fusões (por exemplo, etiquetas de epítopos ou criação de proteínas bifuncionais como com GFP); (c) inserção de novas regiões de codificação, segmentos de genes ou elementos regulatórios, como os para genes marcadores selecionáveis ou genes repórteres ou colocando novos genes sob controle transcripcional endógeno; (d) criação de alelos condicionais, por exemplo, por introdução de sítios loxP flanqueando a região a ser excisada por recombinase Cre (Abremski e Hoess, J Biol Chem, 259: 1509-14, 1984), ou sítios FRT flanqueando a região a ser excisada por recombinase Flp (Andrews et al., Cell, 40: 795-803, 1985; Meyer-Leon et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 49: 797-804, 1984; Cox, Proc Natl Acad Aci USA, 80: 4223-7, 1983); ou (e) substituição de seqüências de codificação ou segmentos de genes de uma espécie com seqüências de codificação ortólogas de uma espécie diferente, por exemplo, substituindo um local genético de murinos com o local genético humano ortólogo para engenheirar um camundongo onde o local particular foi “humanizado”.

Qualquer uma ou todas estas modificações pode ser incorporada em um LTVEC. Um exemplo específico não limitativo, em que uma seqüência de codificação endógena é completamente deletada e simultaneamente substituída com tanto um gene repórter bem como um marcador selecionável, é dado abaixo no exemplo 1, pois representam as vantagens do método da invenção quando comparadas a tecnologias anteriores.

Etapa 3 (opcional). Verificar que cada LTVEC foi engenheirado corretamente.

Verificar que cada LTVEC foi engenheirado corretamente por: a. PCR de diagnóstico para verificar as novas junções criadas pela introdução do fragmento doador no (s) gene (s) ou local (locais) cromossômico (s) de interesse. Os fragmentos de PCR assim obtidos podem ser seqüenciados para ainda verificar as novas junções criadas pela introdução do fragmento doador no (s) gene (s) ou local (locais) cromossômico (s) de interesse. b. Digestão da enzima de restrição de diagnóstico para certificar-se de que somente as modificações desejadas foram introduzidas no LTVEC durante o processo de recombinação homóloga bacteriana. c. Seqüenciamento direto de LTVEC, particularmente as regiões transpondo o sítio da modificação para verificar as novas junções criadas pela introdução do fragmento doador no (s) gene (s) ou local (locais) cromossômico (s) de interesse.

Etapa 4. Purificação, preparação e linearização de LTVEC DNA para introdução em células eucarióticas. a. Preparação de LTVEC DNA: Preparar DNA miniprep (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1, 2 e 3, 1989; Tillett e Neilan, Biotechniques, 24: 568-70, 572, 1998; (http://vmw.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdt); do LTVEC selecionado e re-transformar o LTVEC DNA miniprep em E. coli usando eletroporação (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1, 2 e 3, 1989). Esta etapa é necessária para livrar-se do plasmídeo codificando as proteínas recombinantes que são utilizadas para a recombinação homóloga bacteriana (Zhang et al., Nat Genet, 20: 123-8, 1998; Narayanan et al., Gene Ther, 6: 442-7, 1999). Ela é útil para livrar-se deste plasmídeo (a) porque ele é uma plasmídeo com alto número de cópias e pode reduzir os rendimentos obtidos em preparações de LTVEC em grande escala; (b) para eliminar a possibilidade de induzir expressão das proteínas de recombinação; e (c) porque ele pode obscurecer o mapeamento físico do LTVEC. Antes de introduzir o LTVEC em células eucarióticas, grandes quantidades de LTVEC DNA são preparadas por metodologia padrão (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow.pdt); Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1, 2 e 3, 1989; Tillett e Neilan, Biotechniques, 24: 568-70, 572, 1998). No entanto, esta etapa pode ser ultrapassada se for usado um método de recombinação homóloga bacteriana que utiliza um pró-fago recombinogênico, isto é, onde os genes codificando as proteínas recombinogênicas são integrados no cromossoma bacteriano (Yu, et al., Proc Natl Acad Sei USA, 97: 5978-83, 2000). b. Linearização do LTVEC DNA: Para preparar LTVEC para introdução em células eucarióticas, LTVEC é preferivelmente linearizado de um modo que dá o (s) gene (s) endógeno (s) modificado (s) ou local (locais) cromossômico(s). DNA flanqueado com braços de homologia longos. Isto pode ser realizado linearizando o LTVEC, preferivelmente na estrutura dorsal do vetor, com qualquer enzima de restrição apropriada que digere somente raramente. Exemplos de enzimas de restrição apropriadas incluem Notl, PacI, Sfil, Srfl, Swal, Fsel, etc. A escolha da enzima de restrição pode ser determinada experimentalmente (isto é, testando vários cortadores raros de candidatos diferentes), ou, se a seqüência de LTVEC for conhecida, analisando a seqüência e escolhendo uma enzima de restrição apropriada baseada na análise. Em situações onde o LTVEC tem uma estrutura dorsal de vetor contendo sítios raros como sítios CosN, então ele pode ser clivado com enzimas reconhecendo estes sítios, por exemplo λ terminase (Shizuya et al., Proc Natl Acad Sei USA, 89: 8794-7, 1992; Becker e Gold, Proc Natl Acad Sei USA, 75: 4199-203, 1978; Rackwitz et ah, Gene, 40: 259-66, 1985.

Etapa 5. Introdução de LTVEC em células eucarióticas e seleção de células onde introdução bem-sucedida do LTVEC se realiza. LTVEC DNA pode ser introduzido em células eucarióticas usando metodologia padrão, como transfecção mediada por fosfato de cálcio, lipídeos, ou eletroporação (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1, 2 e 3, 1989). As células onde o LTVEC foi introduzido com sucesso podem ser selecionadas por exposição a agentes de seleção, dependendo do gene marcador selecionável que foi engenheirado no LTVEC. Como um exemplo não limitativo, se o marcador selecionável é o (neo) gene de neomicina fosfotransferase (Beck et ah, Gene, 19: 327-36, 1982) então células que absorvem o LTVEC podem ser selecionadas em meio contendo G418; células que não têm o LTVEC morrerão enquanto células que absorvem o LTVEC sobreviverão (Santerre et al., Gene, 30: 147-56, 1984). Outros marcadores selecionáveis apropriados incluem qualquer droga que tem atividade em células eucarióticas (Joyner, The Practical Approach Series, 293,1999), como higromicina B (Santerre et al., Gene, 30: 147-56, 1984; Bemard et al., Exp Cell Res, 158: 237-43,1985; Giordano e McAlliester, Gene, 88: 285-8,1990), Blasticidina S (Izumi et al., Exp Cell Res, 197: 229-33, 1991), e outros que são familiares aos versados na arte.

Etapa 6. Triar os eventos de recombinação homóloga em células eucarióticas usando teste quantitativo para modificação do alelo (MOA). Células eucarióticas que foram modificadas com sucesso marcando o LTVEC no local de interesse podem ser identificadas usando várias abordagens que podem detectar modificação do alelo no local de interesse e que não dependem de testes transpondo os braços ou braço de homologia total. Estas abordagens podem incluir, mas não estão limitadas a: (a) PCR quantitativo usando TaqMan® (Lie e Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43-8, 1998); (b) teste MOS quantitativo usando Molecular Beacons (Tan et al, Chemistry, 6: 1107-11, 2000) (c) hibridação in situ com fluorescência FISH (Laan et al., Jum Gent, 96: 275-80, 1995) ou hibridação genômica comparativa (CGH) (Forozan et al., Trends Genet, 13: 405-9, 1997; Thompson e Gray, J Cell Biochem Suppl, 139-43, 1993; Houldsworth e Chaganti, Am J Pathol 145: 1253-60, 1994); (d) amplificação de DNA isotérmico (Lizardi et al., Nat genet, 19: 225-32,1998; Mitra e Church, Nucleic Acids Res, 27:e34, 1999); (e) hibridação quantitativa em uma sonda (s) imobilizada (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975; Kafatos FC; Jones CW; Efstratiadis A, Nucleic Acids Res 7 (6): 1541-52, 1979); (f) Probes® invasoras (Third Wave Technologies); (g) Sondas Eclipse® e Molecular Beacon (Synthetic Genetics); e (h) Testes MMP (High Throughput Genomic) r E provido aqui um exemplo em que PCR quantitativo TaqMan® é usado para triar células eucarióticas marcadas com sucesso. Neste exemplo não limitativo, TaqMan® é usado para identificar células eucarióticas que sofreram recombinação homóloga, em que uma porção de um de dois alelos endógenos em um genoma diplóide foi substituída por outra seqüência. Em contraste com métodos tradicionais, em que uma diferença no comprimento do fragmento de restrição transpondo os braços ou braço de homologia total indica a modificação de um de dois alelos, o método TaqMan® quantitativo detectará a modificação de um alelo medindo a redução em número de cópia (pela metade) do alelo não modificado. Especificamente, a sonda detecta o alelo não modificado e não o alelo modificado. Conseqüentemente, o método é independente da natureza exata da modificação e não limitado à substituição de seqüência descrita neste exemplo. TaqMan é usado para quantificar o número de cópias de um gabarito de DNA em uma amostra de DNA genômico, especialmente por comparação a um gene de referência (Lie e Petropoulos, Curr Opin Biotechnol, 9: 43-8, 1998). O gene de referência é quantificado no mesmo DNA genômico como o local (locais) ou gene (s) de marcação, conseqüentemente, duas amplificações TaqMan® (cada uma com sua respectiva sonda) são realizadas. Uma sonda TaqMan® determina o “Ct” (Ciclo Limite) do gene de referência, enquanto a outra sonda determina o Ct da região do local (locais) ou gene (s) marcados que é substituído com marcação bem-sucedida. O Ct é uma quantidade que reflete a quantidade do DNA de partida para cada uma das sondas TaqMan®, isto é, uma seqüência menos abundante requer mais ciclos de PCR para alcançar o ciclo limite. A diminuição pela metade do número de cópias da seqüência gabarito para uma reação TaqMan® resultará em um aumento de cerca de uma unidade Ct. Reações TaqMan® em células onde um alelo do local (locais) ou gene (s) de marcação foi substituído por recombinação homóloga resultarão em um aumento de um Ct para a reação TaqMan® de marcação sem um aumento no Ct para o gene de referência quando comparado a DNA de células não marcadas. Isto permite pronta detecção da modificação de um alelo do (s) gene (s) de interesse em células eucarióticas usando LTVECs.

Como descrito acima, modificação de triagem de alelo (MOA) é o uso de qualquer método que detecta a modificação de um alelo para identificar células que sofreram recombinação homóloga. Não é um requisito que os alelos marcados sejam idênticos (homólogos) um ao outro, e de fato, eles podem conter polimorfismos, como é o caso em descendência resultante do cruzamento de duas cepas diferentes de camundongos. Além disso, uma situação especial que também é coberta pela triagem MOA é a marcação de genes que estão normalmente presentes como uma cópia única em células, como alguns dos localizados nos cromossomas sexuais e, em particular, no cromossoma Y. Neste caso, métodos que detectarão a modificação do alelo marcado único, como PCR quantitativo, Southern blottings, etc., podem ser usados para detectar o evento de marcação. É evidente que o método da invenção pode ser usado para gerar células eucarióticas modificadas mesmo quando os alelos são polimórficos ou quando estão presentes em uma cópia única nas células marcadas.

Etapa 8. Usos de células eucarióticas geneticamente modificadas. (a) As células eucarióticas geneticamente modificadas geradas pelos métodos descritos nas etapas 1 a 7 podem ser empregadas em qualquer teste in vitro ou in vivo, onde é desejável mudar o fenótipo da célula. (b) A célula eucariótica geneticamente modificada gerada pelos métodos descritos nas etapas 1 a 7 também pode ser usada para gerar um organismo contendo a modificação genética. Os organismos geneticamente modificados podem ser gerados por várias técnicas diferentes incluindo mas não limitadas a: 1. Células-tronco embriônicas modificadas (ES) como as células ES de camundongos e de ratos ffeqüentemente usadas. Células ES podem ser usadas para criar camundongos e ratos geneticamente modificados por tecnologia de injeção de blastocitos padrão ou técnicas de agregação (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987; Wood et al., Nature, 365: 87-9, 1993; Joyner, The Practical Approach Series, 293, 1999), injeção de blastocitos tetraplóides (Wang et al., Mech Dev, 62: 137-45, 1997), ou clonagem e transferência nuclear (Wakayama et al., Proc Natl Acad Sei USA, 96: 14984-9,1999). Células ES derivadas de outros organismos como coelhos (Wang et al., Mech Dev, 62: 137-45, 1997; Schoonjans et al., Mol Reprod Dev, 45: 439-43, 1996) ou frangos (Pain et al., Development, 122: 2339-48, 1996) ou outras espécies também devem ser receptivas a modificação (ões) genética (s) usando os métodos da invenção. 2. Protoplastos modificados podem ser usados para gerar plantas geneticamente modificadas (ver, por exemplo, patente US 5.350.689 “Zea mays plants and transgenic Zea mays plants regenerated fforn protoplasts or protoplast-derived cells”, e patente US 5.508.189 “Regeneration of plants fforn cultured guard cell protoplasts” e referências na mesma). 3. Transferência nuclear de células eucarióticas modificadas para oócitos para gerar organismos clonados com alelo modificado (Wakayama et al., Proc Natl Acad Sei US A, 96: 14984-9, 1999; Baguisi et al., Nat Biotechnol, 17: 456-61, 1999; Wilmut et al., Reprod Fértil Dev, 10: 639-43, 1998; Wilmut et al., Nature, 385: 810-3, 1997; Wakayama et al., Nat Genet, 24: 108-9,2000; Wakayama et al., Nature, 394: 369-74,1998; Rideout et al., Nat Genet, 24: 109-10, 2000; Campbell et al., Nature, 380: 64-6,1996). 4. Fusão de células para transferir o alelo modificado para outra célula, incluindo transferência de cromossoma(s) engenheirado(s), e usos desta(s) célula(s) para gerar organismos contendo o alelo modificado ou cromossoma (s) engenheirado (s) (Kuroiwa et al., Nat Biotechnol, 18: 1086-1090, 2000). 5. O método da invenção também é receptivo a quaisquer outras abordagens que foram usadas ou ainda devem ser descobertas.

Apesar de muitas das técnicas usadas na prática das etapas individuais dos métodos da invenção serem familiares aos versados na arte, os requerentes sustentam que a novidade do método da invenção está na combinação única das etapas e técnicas em conjunto com o método que nunca tinha sido descrito de introduzir um LTVEC diretamente nas células eucarióticas para modificar um local cromossômico, e o uso de testes quantitativos MOA para identificar células eucarióticas que tinham sido modificadas de modo apropriado. Esta nova combinação representa um aperfeiçoamento significante sobre tecnologias anteriores para criar organismos possuindo modificações de genes endógenos ou locais cromossômicos.

Exemplos Exemplo 1 - Engenharia de células ES de camundongos contendo uma delecão do gene OCRIO a. Seleção de clone de DNA genômico grande contendo mOCRIO

Um clone de cromatografia artificial bacteriano (BAC) contendo um fragmento de DNA genômico grande que continha a seqüência de codificação do gene OCRIO do camundongo (mOCRIO) foi obtido por triagem de uma bibliotecas BAC de DNA genômico de camundongo em matriz (Incyte Genomics) usando PCR. Os iniciadores empregados para triar esta biblioteca foram derivados de seqüência cDNA de gene mOCRIO.

Dois pares de iniciadores foram usados: (a) OCRIO.RAA (5'- AGCTACCAGCTGCAGATGCGGGCAG- 3') e OCRIO.PVIrc (5'- CTCCCCAGCCTGGGTCTGAAGATGACG-3') que Amplifica um DNA de 102 bp, e (b) OCRIO.TDY (5'-GACCTCACTTGCTACACTGACTAC -3') e OCRIO.QETrc (5'-ACTTGTGTAGGCTGCAGAAGGTCTCTTG- 3') que amplifica um DNA de 1500 bp.

Este mOCRIO BAC continha aproximadamente 180 kb de DNA genômico incluindo a completa seqüência de codificação mOCRIO. Este clone BAC foi usado para gerar um LTVEC que foi subseqüentemente usado para deletar uma porção da região de codificação de mOCRIO enquanto simultaneamente introduzindo um gene repórter cujo códon de iniciação precisamente substituiu o códon de iniciação de OCRIO, assim como inserção de um gene marcador selecionável utilizável para seleção tanto em células de E. coli como de mamíferos seguindo o gene repórter (figura 2). O gene repórter (neste exemplo não limitativo LacZ, cuja seqüência é prontamente disponível para os versados), codifica a enzima β- galactosidase de E. coli. Devido à posição de inserção de LacZ (seu códon de iniciação está na mesma posição que o códon de iniciação de mOCRIO), a expressão de lacZ deve imitar a de mOCRl 0, como foi observado em outros exemplos onde substituições similares com LacZ foram realizadas usando tecnologias anteriores, (ver "Gene Trap strategies in ES cells", por W. Wurst e A. Gossler em Joyner The Practical Approach Series, 293, 1999). O gene LacZ permite a realização de um teste enzimático simples e padrão que pode revelar seus padrões de expressão in situ, assim provendo um teste suplementar que reflete os padrões de expressão normais do(s) gene(s) substituído(s) ou local cromossômico (locais). b. construção de fragmento doador e geração de LTVEC. O cassete de modificação usado na construção de mOCRIO LTVEC é o casse lacZ-SV40- polyA-PGKp- EM7-neo-PGK polyA em que lacZ é um gene marcador como descrito acima, SV40 polyA é um fragmento derivado de vírus simiano 40 (Subramanian et al Prog. Nucleic Acid Res Mol. Biol. 19: 157 - 64,1976; Thimmappaya et al, J. Biol. Chem. 253: 1613-8,1978, Dhar et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71: 371-5, 1974, Reddy et al, Science 200: 494-502, 1978) e contendo um sítio de poliadenilação e sinal ( Subramanian et al Prog. Nucleic Acid Res Mol. Biol. 19: 157 - 64, 1976; Thimmappaya et al, J. Biol. Chem. 253: 1613-8, 1978, Dhar et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71: 371-5, 1974, Reddy et al, Science 200: 494-502, 1978), PGKp é o promotor de fosfoglicerato quinase de camundongos (PGK) (Adra et al, Gene 60:65- 74, 1987) (que foi usado extensivamente para acionar a expressão de genes de resistência a drogas em células de mamíferos), EM7 é um promotor bacteriana forte que tem a vantagem de permitir seleção positiva em bactérias da construção LTVEC completada acionando a expressão de do gene neomicina fosfotransferase (neo), neo é um marcador selecionável que confere resistência a canamicina em células procarióticas e resistência a G418 em células eucarióticas (Beck et al, Gene, 19: 327-36, 1982) e PGK poly A é uma região 3' não traduzida derivada de um gene PGK e contendo um sítio de poliadenilação e sinal (Boer et al, Biochem Genet. 28: 299-308,1990).

Para construir o mOCRIO LTVEC, primeiro um fragmento de doador foi gerado consistindo de caixa de homologia 1 mOCRIO (hblO fixada montante do gene LacZ no cassete de modificação e uma caixa de homologia 2 de mOCRIO (hb2) fixada a jusante da seqüência polyA neo-PGK no cassete de modificação (figura 2) usando tecnologia de engenharia genética recombinante padrão. A caixa de homologia 1 (hbl) consiste de 211 bp de seqüência não traduzida imediatamente a montante da metionina de iniciação da matriz de leitura aberta de mOCRIO (mOCRIO ORF) (figura 3A-3D). A caixa de homologia 2 (hb2) consiste dos últimos 216 bp de mOCRIO ORF, terminando no códon de parada (figura 3A-3D).

Subseqüentemente, usando recombinação homóloga bacteriana (Zhang, et al., Nat Gent, 20:123-8; Angrand, et al., Nucleic Acids Res, 27:el6, 1999; Muyrers, et al., Nucleic Acids Res, 27:1555-7, 1999; Narayanan, et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999, Yu et al Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97: 5978-83, 2000), este fragmento de doador foi usado para substituir precisamente a região de codificação de mOCRIO (de metionina de iniciação para códon de parada) com o cassete de inserção, resultando na construção do mOCRIO LTVEC (figura 2). Assim, neste mOCRIO LTVEC, a seqüência de codificação de mOCRIO foi substituída por cassete de inserção criando uma deleção de aproximadamente 20 kb no local de mOCRIO enquanto deixando aproximadamente 130 kb de homologia a montante (braço de homologia a montante) e 32 kb de homologia a jusante (braço de homologia a jusante). E importante notar que LTVECs podem ser mais rapidamente e convenientemente gerados de bibliotecas BAC disponíveis do que os vetores de marcação feitos usando tecnologias anteriores porque somente uma única etapa de recombinação homóloga bacteriana é requerida e a única informação de seqüência requerida é a necessária para gerar as caixas de homologia. Em contraste, abordagens anteriores para gerar vetores de marcação usando recombinação de homologia bacteriana requerem que grandes vetores de marcação sejam "aparados" antes de sua introdução nas células ES (Hill et al, Genomics, 64: 111-3, 2000). Este aparamento é necessário devido à necessidade de gerar braços de homologia curtos o suficiente para acomodar os métodos de triagem utilizados pelas abordagens anteriores. Uma desvantagem principal do método de Hill et al é que duas etapas de recombinação homólogas adicionais são necessárias simplesmente para aparar (uma para aparar a região a montante do local modificado e uma para aparar a região a jusante do local modificado). Para fazer isto, substancialmente mais informação de seqüência é necessária, incluindo informação de seqüência na faixa dos sítios de aparamento.

Além disso, outra vantagem óbvia, ilustrada pelo exemplo acima, é que uma deleção muito grande na faixa de gene mOCRIO (aproximadamente 20 kb) pode ser facilmente gerada em uma única etapa. Em contraste, usando tecnologias anteriores, para obter a mesma tarefa pode requerer várias etapas e pode envolver a marcação de regiões a jusante e a montante das seqüências de codificação com sítios loxP a fim de usar Cre recombinase para remover a seqüência flanqueada por estes sítios após introdução do local modificado em células eucarióticas. Isto pode não ser atingido em uma etapa, e pode requerer a concentração de dois vetores de marcação usando diferentes marcadores de seleção e dois eventos de marcação seqüenciais em células ES, um para introduzir o sítio loxP na região a montante da seqüência de codificação e outro para introduzir o sítio loxP na região a jusante da seqüência de codificação. Será ainda notado que a criação de grandes deleções com ffeqüência ocorre com baixa eficiência usando as tecnologias de marcação anteriores em células eucarióticas, devido à ffeqüência de obtenção de uma recombinação homóloga pode ser baixa quando usando vetores de marcação contendo grande deleção flanqueada por braços de homologia relativamente curtos. A alta eficiência obtida usando o método da invenção (ver abaixo) é devido aos braços de homologia muito longos presentes em LTVEC que aumentam a taxa de recombinação homóloga em células eucarióticas. c. Verificação, preparação e introdução de mOCRIO LTVEC DNA em células ES. A seqüência circundando a junção de cassete de inserção e a seqüência de homologia foi verificada por seqüenciamento de DNA. O tamanho do mOCRIO LTVEC foi verificado por análise de restrição seguido por eletroforese de gel de campo pulsado (PFGE) (Cantor, et al, Annu Rev Biophys Biophys Chem. 17: 287- 304, 1988, Schwartz e Cantor, Cell 37: 67-75, 1984). Uma preparação de plasmídeos em grande escala padrão de mOCRIO LTVEC foi feita, o DNA plasmídeo foi digerido com a enzima de restrição Notl, que corta na estrutura do vetor do mOCRIO LTVEC, para gerar DNA linear, subseqüentemente, o DNA linearizado foi introduzido em células ES de camundongos por eletroporação (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner The Practical Approach Series, 293, 1999, (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1, 2 e 3, 1989). As células ES transfectadas com sucesso com mOCRIO LTVEC foram selecionadas para meio contendo G418 usando métodos de seleção padrões (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner The Practical Approach Series, 293, 1999) d. identificação de clones de células ES marcadas usando modificação quantitativa de teste de alelo (MOA) Para identificar células ES em que um dos dois genes mOCRIO endógenos tinha sido substituído pela seqüência de cassete de modificação, DNA de clones de células ES individuais foram analisados por PCR quantitativo usando metodologia TaqMan® padrão como descrito (Applied Biosystems, Taqman ® Universal PCR Master Mix, número de cat. P/N 4304437, ver também http://www.pebiodocs.com/pediodocs/04304449.pdf). Os iniciadores e sondas Taqman® usadas são como descrito na figura 3A-3D. Um total de 69 células ES independentes foram tríadas e 3 identificadas como positivas, isto é, como clones em que uma dentre a seqüência de codificação de mOCRIO endógeno tinha sido substituída pelo cassete de modificação acima mencionado. Várias vantagens da abordagem MOA são evidentes: (i) não requer o uso de uma sonda fora do local sendo modificado, assim eliminando a necessidade de conhecer o flanco da seqüência do local modificado. (ii) requer pouco tempo de realização em comparação com a metodologia Southern Blot convencional que era o método anterior de escolha (Robertson, Practical Approach Series, 254, 1987, Joyner The Practical Approach Series, 293, 1999), assim reduzindo o tempo para a identificação de células corretamente modificadas dos vários dias típicos para apenas algumas horas.

Esta é uma melhora significante no modo de triagem que foi realizada no passa e a toma uma abordagem com menor emprego de mão de obra e mais efetiva em seu custo para triar eventos de recombinação homólogos em células eucarióticas.

Ainda outra vantagem do método da invenção é que é também superior em tecnologias anteriores devido à sua capacidade de marcar locais difíceis. Usando tecnologias anteriores, foi mostrado que para alguns locais, a freqüência de marcação com sucesso pode ser tão baixa como de 1 em 2000 eventos de integração, talvez mesmo menor. Usando o método da invenção, os requerentes demonstraram que estes locais difíceis podem ser marcados bem mais eficientemente usando LTVECs que contém longos braços de homologia (isto é maior do que permitido por tecnologias anteriores). Como o exemplo não limitativo acima descrito demonstra, os requerentes marcaram o local OCRIO, um local que foi previamente provado recalcitrante para a marcação usando tecnologias convencionais. Usando o método da invenção, os requerentes mostraram que eles obtiveram sucesso na marcação de 3 dentre 69 clones de células ES em que o mOCRIO LTVEC (contendo mais de 160 kb de braços de homologia, e introdução de uma deleção de 20 kb) tinham integrado, enquanto usando tecnologia anterior para marcação de células ES (Joyner, the Practical Approach Series, 293, 1999) usando um vetor à base de plasmídeo com braços de homologia mais curtos do que 10-20 kb enquanto também introduzindo uma deleção de menos que 15 kb, não foram identificados eventos marcados dentre mais de 600 integrantes do vetor. Estes dados demonstram claramente a superioridade do método da invenção além de tecnologias anteriores.

Exemplo 2 - Aumentada freaüência de marcacão e ab-rogacão da necessidade de usar DNA isogênico quando LTVECs são usados como os vetores de marcacão Como notado acima, a aumentada freqüência de marcação obtida usando longos braços de homologia deve diminuir o benefício, se qualquer, derivado de usar DNA genômico na construção de LTVECs que é isogênico com (isto é idêntico à seqüência) o DNA da célula eucariótica sendo marcada. Para testar esta hipótese, os requerentes construíram vários LTVECs usando DNA genômico derivado da mesma sub-cepa de camundongos como as células eucarióticas a serem marcadas (provavelmente isogênicas) e um grande número de outros LTVECs usando DNA genômico derivado de sub-cepas de camundongos diferentes dos da célula eucariótica a ser marcada (provavelmente não isogênica). Os LTVECs não isogênicos demonstraram uma freqüência de marcação média de 6% (na faixa de 1-20%, tabela 1) enquanto os LTVECs isogênicos demonstrados como freqüência de marcação média de 3% (na faixa de 2-5%), indicando que a taxa de marcação de sucesso usando LTVECs não depende na isogenicidade.

Exemplo 3- Descrição detalhada de MOA à base de TaaMan® para identificação de clones ES marcados Os clones de células ES que foram tomados pelo LTVEC e incorporados no genoma no local marcado por recombinação homóloga são identificados por uma modificação de teste de alelo (MOA) que usa PCR quantitativo em tempo real para discernir a diferença entre clones de células ES marcadas, em que um dos dois alelos marcados é modificado, e clones de células ES não marcadas em que ambos os alelos permanecem não modificados. O teste MOA consiste de uma triagem primária e uma secundária. A triagem primária contém as seguintes etapas: (1) crescimento de clones de células ES transfectadas com LTVEC em placas de 96 reservatórios revestidas com gelatina, (2) isolamento de DNA genômico de cada clone de células ES; (3) uso de cada amostra de DNA genômico como um gabarito em 8 PCRs quantitativos separados em duas placas de 384 reservatórios, em que 2 dos PCRs empregam um conjunto de iniciador específico para local de marcação que hibridiza as sequências de DNA em uma extremidade do fragmento genômico marcado para deleção (PCR' a jusante"), 2 dos PCRs empregam um conjunto de iniciador específico para local de marcação que hibridiza para seqüências de DNA na outra extremidade do fragmento genômico marcado para deleção ('PCR a jusante'), 4 dos PCRs empregam conjuntos de iniciadores que reconhecem quatro locais de referência não marcados ('PCRs de referência'), e cada PCR inclui uma sonda fluorescente (por exemplo uma TaqMan ® [ABI], Eclipse®, ou sonda Molecular Beacon [Synthetic Genetics]) que reconhece a seqüência ampliada e cujo sinal de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto PCR; (4) ciciar o PCRs em um dispositivo que combina um termociclador com um detector de fluorescência (por exemplo o ABI 7900HT) que quantifica o acúmulo de produtos de amplificação durante o PCR e determina o ciclo de limiar (Cp), o ponto no PCR em que o sinal de fluorescência e detectável acima do ruído de fundo; (5) para cada amostra de DNA de clone de célula ES, cálculo da diferença nos valores Ct (ACx) entre os PCRs a montante e cada um dos quatro PCRs de referência e entre os PCRs a jusante e cada uma dos quatro PCRs de referência para criar 8 tabelas de valores ACT 96; (6) normalização de valores ACT para valores positivos; (7) cálculo do valor ACT mediano para cada tabela de comparação de referência de marcação, (8) determinação de um escore de confiança por uso de um programa de computador que examina as oito tabelas ACT e calcula o número de vezes uma dada amostra de DNA de clone de célula ES produz um valor ACT dentro das faixas de tolerância 0,5 a 1,5, 0,25 a 1,5, 0,5 a 2,0, 0,25 a 2,0, 0,5 a 3,0 e 0,25 a 3,0 ciclos maior do que o ACy mediano (exemplos de linguagens de programação de computador apropriadas para criar ou escrever este programa incluem visual basics, Java, ou qualquer outra linguagem de computador bem conhecida dos versados na arte); (9) traçar em gráfico os valores e seus medianos para cada uma das oito tabelas ΔΟχ como histogramas; e (10) identificação de candidatos de clones de células ES corretamente marcados de uma inspecção dos escores de confiança e os histogramas ACT. Em um exemplo preferido, o valor de ΔΟχ para o clone marcado como candidato cai em 0,5 a 1,5 ciclos maior do que o mediano em 8 dentre 8 comparações de referência.

Os clones candidatos identificados pela triagem primária de teste MOA foram confirmados ou rejeitados em uma triagem secundária, que contém as seguintes etapas: (1) uso de dg de cada um dos clones de célula ES candidatas positivas de um número maior de clones negativos, e de padrões de número de cópia de DNA genômico de camundongos que transportam uma ou duas cópias do cassete LacZ-Neo de LTVEC por genoma diplóide como gabaritos em 8 PCRs quantitativos separados em duas placas de 384 reservatórios em que 1 reação é um PCR a montante (como na triagem primária), uma reação é um PCR a jusante (como na triagem primária), 4 reações são PCRs de referência com dois locais de referência que são diferentes dos usados na triagem primária, uma reação é um PCR com iniciadores e uma sonda que são específicas para o gene LacZ do LTVEC, e uma reação é um PCR com iniciadores e uma sonda que são específicos para o gene Neo do LTVEC; (2) ciciar os PCRs em um dispositivo PCR quantitativo, como a triagem primária; (3) cálculo como na triagem primária, dos valores ACT entre o PCR a montante e cada um dos dois PCRs de referência, entre os PCRs a jusante e cada um dos dois PCRs de referência, entre o PCR LacZ e cada um dos dois PCRs de referência, e entre o PCR Neo e cada um dos dois PCRs de referência para criar oito tabelas ACT; (4) normalização dos valores ACT para valores positivos; (5) cálculo do valor mediano para cada tabela ACT; (6) cálculo de escores de confiança como na triagem primária; e (7) traçar em gráficos os valores e seus medianos para cada uma das oito tabelas ACT como histogramas.

De uma inspeção de escores de confiança e os histogramas de ACj para tanto triagem primária como secundária, candidatos de clone ES corretamente marcados são ou confirmados ou rejeitados. Em um exemplo preferido, o valor ACT para o clone marcado candidato está na faixa de 0,5 a 1,5 ciclos maior do que o mediano em 12 dentre 12 comparações de referência da triagem primária e secundária combinada.

Para classificar o número de cópias do LTVEC por genoma diplóide nos clones ES corretamente marcados confirmados, seus valores ACt das comparações dos PCRs LacZ e Neo com os dois PCRs de referência são comparados com os valores ACT para os padrões de número de cópia LacZ-Neo. Cada clone de célula ES é classificado como tendo 1, 2 ou mais do que 2 cópias do LTVEC. Para cada projeto de alelo modificado, os clones de células ES foram triados em grupos de 96 (geralmente menos do que 288 clones totais) até 3 clones que classificam positivo no teste MOA e tem uma única cópia do cassete LacZ-neo são identificados.

Exemplo 4 - Uso de FISH para identificar LTVECs corretamente modificados em células ES

Usando a tecnologia LTVEC descrita aqui, requerentes eliminaram o gene SM22 alfa em células ES. SM22 alfa é uma proteína limitada em linhagem de célula de músculo liso 22-kDa (SMC) que fisicamente se associa com feixes de filamentos de actina citoesqueletal em SMCs contráteis. As células ES marcadas foram então submetidas a hibridação in situ de fluorescência padrão (FISH) em espalhados cromossômicos metafásicos para verificar que o gene foi marcado de modo apropriado. A experiência foi realizada com duas sondas: 1) uma sonda de gene SM22alfa consistindo de clone BAC SM22 alfa não modificado para gerar o LTVEC e 2) uma sonda de DNA LacZ e neomicina que detecta somente a modificação de gene feita por evento de marcação (inserção de cassetes de genes LacZ e Neo). Os espalhados cromossômicos de metafase foram preparados a partir de células e hibridação foi realizada simultaneamente com ambas as sondas que foram rotuladas com diferentes fluoróforos coloridos para permitir a detecção de hibridação de cada sonda dentro do mesmo espalhado. Uma linhagem de célula ES não marcada foi analisada em paralelo como um controle. Como esperado, nos espalhados de controle, dois alelos de SM22alfa foram detectados em braços cromossômicos homólogos, mas não ocorreu hibridação da sonda LacZ-Neo. Como em controles, em espalhados de células ES marcadas, dois alelos também foram detectados no mesmo local cromossômico e em cromossomos homólogos, mas a rotulação dupla com a sonda LacZ-Neo foi evidente em um dos dois cromossomos indicando co-localização de seqüências de DNA SM22alfa e LacZ-Neo neste alelo de SM22-alfa. Como importante, não foram detectadas seqüências de genes SMS22alfa ou LacZ-Neo em locais inapropriados nos espalhados. A falta de integração extra de seqüências de genes SM22alfa e co-localização de LacZ-Neo com SM22alfa em um cromossomo de um par homólogo sugere fortemente que a marcação correta de LacZ-Neo em um dos alelos SM22alfa via recombinação homóloga tinha ocorrido.

Exemplo 5- Diminuição da quantidade de DNA usada para eletroporar células ES melhora a eficiência de marcação Os métodos padrões para modificação marcada de genes em células-tronco embriônicas de camundongos (ES) tipicamente empregam 20 a 40 pg de vetor de etiquetagem no procedimento de eletroporação. Os requerentes verificaram que com LTVECs, eletroporação com quantidades bem menores de DNA - na faixa de cerca de 1 a 5 pg por 1 x 107 células - duplica a ffeqüência de eventos de recombinação homólogos corretamente marcados enquanto reduzindo muito o número de eventos de inserção não homólogos, secundários. Esta melhora clara na eficiência de marcação é importante porque reduz de modo significante o número de clones de células ES que precisam ser tríadas para encontrar vários clones positivos com uma modificação corretamente marcada, de cópia única. Os benefícios associados são de custo reduzido e aumentada produção.

Exemplo 6 - Uso do método da invenção para criar camundongo de ínativacão MA61 para estudar atrofia muscular MA61, também chamado MAFbx, é uma ubiquitina ligase recentemente descoberta que é regulada em várias condições de atrofia muscular (ver pedido provisório US 60/264.926, depositado em 30 de janeiro de 2001, pedido provisório US no. 60/ 311. 697, depositado em 10 de agosto de 2001, e pedido provisório US (número de série ainda não conhecido), depositado em 22 de outubro de 2001, todos designados para Regeneron Pharmaceuticals Inc., cada sendo aqui incorporado por referência em sua totalidade). Para ainda estudar o significado biológico deste gene em atrofia muscular, os camundongos de inativação foram criados usando o método da invenção como a seguir.

Primeiro, para obter um fragmento genômico clonado grande contendo o gene MA61, uma biblioteca de cromossomo artificial bacteriano (BAC) foi tríada com iniciadores derivados de seqüência de cDNA MA61. O clone BAC assim obtido foi então usado para criar um vetor de etiquetagem grande para células eucarióticas LTVEC, como a seguir. Um cassete de modificação contendo uma caixa de homologia 57 gene lacZ/ polyA/ promotor PGK/ neo / polyA/ caixa de homologia 3' foi engenheirado. As caixas de homologia foram anexadas para mar os sítios de recombinação homóloga bacteriana durante a geração do LTVEC. O LacZ é um gene repórter que foi posicionado de modo que seu códon de iniciação esta na mesma posição que o códon de iniciação de MA61. Após recombinação homóloga em bactérias, o cassete de modificação substituiu o gene MA61. Assim, um MA61 LTVEC foi criado em que as seqüências de codificação MA61 no clone BAC foram substituídas pelo cassete de modificação engenheirado como descrito supra. LTVEC DNA foi então preparado, purificado e linearizado para introdução em células eucarióticas como descrito infra.

Um miniprep MA61 LTVEC DNA foi preparado ( Sambrook et al, Molecular Biology, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, Tillett e Neilan, Biotechniques, 24: 568-70, 572, 1998; (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plkmini/ plm 399.pdf), e re-transformado em E. coli usando eletroporação (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1, 2 e 3, 1989) a fim de se afastar do plasmídeo codificando as proteínas recombinogênicas que são usadas para a etapa de recombinação homóloga bacteriana (Zhang, et al., Nat Gent, 20:123-8, 1998, Narayanan, et al., Gene Ther, 6:442-7, 1999). Antes da introdução do MA61 LTVEC em células eucarióticas, maiores quantidades de MA61 LTVEC foram preparadas por metodologia padrão (http://www.qiagen.com/literature/handbooks/plk/plklow/ pdf) (Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1,2 e 3,1989). Tillett e Neilan, Biotechniques, 24: 568-70, 572, 1998). A seguir, para preparar ο MA61 LTVEC para introdução em células eucarióticas, ο MA61 LTVEC foi linearizado. Isto foi obtido por digestão com a enzima de restrição Notl que deixa o DNA do (s) gene(s) endógeno(s) modificado(s) ou local cromossômico (locais) flanqueado com longos braços de homologia. Ο MA61 LTVEC foi então introduzido em células eucarióticas usando metodologia de eletroporação padrão ((Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, vols. 1,2 e 3, 1989). As células em que ο MA61 LTVEC foi introduzido com sucesso foram selecionadas por exposição a um agente de seleção. Porque o marcador selecionável usado no cassete de modificação foi o gene neomicina fosfotransferase (neo) (Beck et al, Gene 19: 327- 36, 1982), as células que tinham absorvido ο MA61 LTVEC foram selecionadas em um meio contendo G418; células que não tem ο MA61 LTVEC morreram, enquanto as células que tinham absorvido ο MA61 LTVEC sobreviveram (Santerre et al, Gene, 30: 147-56, 1984).

As células eucarióticas que foram modificadas com sucesso por marcação do MA61 LTVEC no local MA61 foram identificadas com o método de PCR quantitativo TaqMan® (Lie e Petropoulos, Curr Opin Biotechnol. 9: 43-8, 1998).

Finalmente, as células ES geneticamente modificadas foram usadas para criar camundongos geneticamente modificados, neste caso inativação, por tecnologia de injeção de blastocistos padrão. Assim, foram criados camundongos de inativação MA61, em que o gene MA61 foi deletado.

Tanto os camundongos knock-out como de tipo selvagem (WT) foram expostos a condições indutoras de atrofia criadas por desenervação dos camundongos, e níveis de atrofia comparados. Primeiro, o nervo ciático foi isolado na região do meio da coxa do membro de trás direito e transcetados em camundongos. A transecção do nervo ciático leva a desnervação e, durante um período de quatorze dias, a atrofia nos músculos do membro inferior, especificamente a tibialis anterior e músculo gastrocnemius, durante um período de 14 dias. Em 7 e 14 dias após a desnervação, os animais foram sacrificados por inalação de dióxido de carbono. Então, a tibialis anterior (TA) e complexo gastrocnemius (GA) foram removidos dos membros de trás direito (desnervado) e esquerda (intacto), pesados, e congelados em uma extensão fixa em isopentano resfriado com nitrogênio líquido. A quantidade de atrofia foi avaliada por comparação do peso dos músculos do membro desnervado com o peso dos músculos do membro não desnervado. A atrofia muscular foi avaliada 7 e 14 dias após transeção do nervo ciático direito. Os pesos no estado úmido dos músculos desnervados direitos foram comparados com os pesos no estado seco de músculos não desnervados, esquerdos. As comparações direito: esquerdo são dadas na tabela 2.

Em 7 e 14 dias, os músculos do camundongo de inativação mostraram significativamente (p < 0,001) menor atrofia do que os músculos dos camundongos tipo selvagem. A diferença entre os camundongos de inativação e tipo selvagem foi maior em 14 dias do que em 7 dias. Apear dos camundongos do tipo selvagem continuarem a atrofiar entre 7 e 14 dias, os camundongos de inativação não mostraram atrofia adicional.

Em resumo, a abordagem de criação de LTVECs e de seu uso direto como vetores de marcação combinada com triagem MOA para eventos de recombinação homólogos em células ES cria um novo método para engenheirar locais geneticamente modificados que é rápido, barato e representa uma melhora significante sobre os métodos tediosos e consumidores de tempo previamente usados. Assim, ela abre a possibilidade de uma análise genômica funcional in vivo, em larga escala, rápida, de essencialmente qualquer e todos os genes em um genoma de organismo em uma fração de tempo e custo que era necessária por metodologias anteriores.

Apesar da presente invenção ter sido descrita em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplos, será prontamente evidente para os versados na arte que algumas mudanças e modificações podem ser feitas nos ensinamentos da invenção sem sair do espírito e escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Método para modificar geneticamente um gene endógeno ou local cromossômico em células eucarióticas não humanas, caracterizado pelo fato de compreender: a) obter um grande fragmento genômico clonado maior que 20 kb contendo uma seqüência de DNA de interesse; b) usar uma recombinação homóloga bacteriana para modificar geneticamente o grande fragmento genômico clonado de (a) para criar um grande vetor de etiquetagem para uso em células eucarióticas (LTVEC) tendo braços de homologia maior que 20kb; c) introduzir o LTVEC de (b) em células eucarióticas não humanas para modificar o gene endógeno ou local cromossômico nas células por recombinação homóloga; e d) usar um teste quantitativo para detectar a modificação de alelo (MOA) nas células eucarióticas de (c) para identificar as células eucarióticas em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado,

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grande fragmento genômico clonado contendo uma seqüência de DNA é homólogo ao gene endógeno ou local cromossômico de interesse,

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a modificação genética para o gene endógeno ou local cromossômico compreende deleção de uma sequência de codificação, segmento de gene, ou elemento regulador, alteração de uma seqüência de codificação; segmento de gene ou elemento regulador; inserção de uma nova seqüência de codificação; segmento de gene ou elemento regulador; criação de um alelo condicional; ou substituição de uma seqüência de codificação ou segmento de gene de uma espécie com uma seqüência de codificação homóloga ou ortóloga da mesma ou de espécies diferentes.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a alteração de um sequência de codificação, segmento de gene, ou elemento regulador compreende uma substituição, adição ou fusão.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a fusão compreende uma etiqueta de epítopo ou proteína bifuncional.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o teste quantitativo compreende PCR quantitativo, FISH, hibridação genômica comparativa, amplificação de DNA isotérmica, ou hibridação quantitativa para uma sonda imobilizada,

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o PCR quantitativo compreende tecnologia de sonda Molecular Beacon,

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula cucariótica é uma cclula-tronco embriônica não humana de mamíferos,

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco embriônica não humana é uma célula-tronco embriônica de camundongo, rato ou outro roedor.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o gene endógeno ou local cromossômico é um gene de mamífero ou local cromossômico.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene endógeno ou local cromossômico é um gene humano ou local cromossômico,

12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene endógeno ou local cromossômico é um gene de camundongo, rato ou outro roedor ou local cromossômico.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o LTYEC é capaz de acomodar grandes fragmentos de DNA maiores do que 100 kb.

14. Método para modificar geneticamente um gene endógeno ou local cromossômico de interesse em células-tronco embriônicas de camundongos, caracterizado pelo fato de compreender: a) obter um fragmento genômico clonado grande maior que 20 kb que contém uma seqüência de DNA de interesse, em que o fragmento de DNA clonado grande é homólogo ao gene endógeno ou local cromossômico; b) usar recombinação homóloga bacteriana para geneticamente modificar o fragmento genômico clonado grande de (a) para criar um vetor de etiquetagem grande para uso em células-tronco embriônicas de camundongos, em que a modificação genética é deleção de uma seqüência de codificação, segmento de gene, ou elemento regulador; c) introduzir o vetor de etiquetagem grande de (b) nas células-tronco embriônicas de camundongos para modificar o gene endógeno ou local cromossômico nas células por recombinação homóloga; e d) usar um teste quantitativo para detectar a modificação de alelo (MOA) nas células-tronco embriônicas de camundongos de (c) para identificar as células-tronco embriônicas de camundongos em que o gene endógeno ou local cromossômico foi geneticamente modificado, em que o teste quantitativo é PCR quantitativo.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que 1-5 μg do grande vetor de etiquetagem de (c) é introduzido a 1 x 107 células.