BRPI0210568B1 - conjugado, uso de um conjugado, e, composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

USO DE UM CONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, MÉTODO PARA TRATAR CÂNCER EM UM MAMÍFERO". A presente invenção diz respeito às composições e métodos de uso, em que a composição compreende um conjugado de um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo. Mais particularmente, o superantígeno bacteriano foi modificado para diminuir a sororreatividade com a atividade do superantígeno retido.

Description

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito ao campo da imunologia e das doenças proliferativas, tais como o câncer. Mais particularmente, ela diz respeito às composições e métodos de uso, em que as composições compreendem superantígenos que foram modificados para reduzir a sororreatividade.

Técnica Relacionada

Os superantígenos (SAg’s) constituem um grupo de proteínas virais e bacterianas que são extremamente eficientes na ativação de uma fração grande da população de célula T. Os superantígenos se ligam diretamente ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) sem que seja processado. De fato, os superantígenos se ligam não processados no lado de fora da ranhura de ligação de antígeno nas moléculas de MHC de classe II, evitando deste modo a maior parte do polimorfismo no sítio de ligação de peptídeo convencional. O mecanismo de ligação depende da ligação do superantígeno ao receptor de célula T (TCR) na cadeia VP, ao invés da ligação aos laços hipervariáveis do receptor de célula T (TCR).

As enterotoxinas estafilocócicas (SEs) são um grupo homólogo de superantígenos, com respeito tanto à estrutura quanto à função (Papageorgiou et al., 2000). Elas são conhecidas ser a causa principal do envenenamento alimentar e da síndrome do choque tóxico em seres humanos. Um novo método terapêutico de tumor com base em SAg foi desenvolvido para o tratamento adjuvante de tumores sólidos. Ele utiliza tanto os ramos principais do sistema imune pela incorporação da parte Fab de um anticorpo monoclonal específico de tumor quanto um SAg ativador de célula

T em uma única proteína de fusão recombinante. As proteínas Fab-SAg ligadas às células de tumor podem deflagrar as células T citotóxicas ativadas pelo SAg para matar as células de tumor diretamente pela citotoxicidade mediada pela célula dependente do anticorpo do superantígeno, SADCC. Além disso, as células T ativadas produzem citocinas tumoricidas e pró inflamatórias que contra atacam os problemas de heterogeneidade tumoral e absorção macromolecular, respectivamente.

Os produtos terapêuticos contra tumor com base em superantígeno tiveram algum sucesso, entretanto, um problema clínico que precisa ser tratado é a ativação do sistema imune sistêmico. As proteínas de fusão com SEA do tipo selvagem foram investigadas em testes clínicos de câncer colorretal e pancreático (Alpaugh et al., 1998). Ainda que resultados encorajadores fossem obtidos, limitações foram observadas. Em primeiro lugar, o produto foi muito tóxico. Em segundo lugar, os anticorpos pré formados contra os superantígenos nos pacientes tomaram a dosagem complexa. Além disso, o produto foi imunogênico. Portanto ciclos repetidos da terapia foi possível apenas em um número limitado de pacientes.

Até a presente invenção, as terapias com base em SAg foram limitantes de dose. A presente invenção é a primeira a modificar um superantígeno que resulta em sororreatividade diminuída com a atividade do superantígeno retido; assim, a presente invenção é nova e não óbvia.

Sumário Resumido da Invenção

O precedente esboçou bastante amplamente as características e vantagens técnicas da presente invenção de modo que a descrição detalhada da invenção que segue pode ser melhor entendida. As características e vantagens adicionais da invenção serão descritas a seguir de modo que formem o objeto das reivindicações da invenção. Deve ser avaliado por aqueles habilitados na técnica que a concepção e formas de realização específicas divulgadas podem ser facilmente utilizadas como uma base para modificar ou planejar outras estruturas para realizar o mesmo propósito da presente invenção. Também deve ser constatado por aqueles habilitados na técnica que tais construções equivalentes não divergem do espírito e escopo da invenção como apresentada nas reivindicações anexas. As novas características que acredita-se sejam características da invenção, tanto como para a sua organização quanto ao método de operação, juntas com outros objetivos e vantagens será melhor entendida a partir da seguinte descrição quando considerada em conexão com as figuras que acompanham. Deve ser expressamente entendido, entretanto, que cada uma das figuras é fornecida apenas para os propósitos de ilustração e descrição e não é intencionada como uma definição dos limites da presente invenção.

Na presente invenção, é fornecido um conjugado que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de DNA que codifica o superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região A sejam substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparada com o superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outra fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que é direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer. Os exemplos de superantígenos incluem, mas não são limitados a uma enterotoxina estafilocócica (SE), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina da síndrome do choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-1), uma exotoxina mitogênica estreptocócica (SME) e um superantígeno estreptocócico (SSA). Nas formas de realização específicas, a enterotoxina estafilocócica é a enterotoxina estafilocócica A (SEA) ou a enterotoxina estafilocócica E (SEE).

Nas formas de realização específicas, as posições de residuo de aminoácido na região A a serem substituídas são selecionadas do grupo que consiste de 20, 21, 24, 27, 173 e 204. Também é considerado que a região C pode compreender substituições em não mais do que 15 resíduos de aminoácido. Estas substituições podem ocorrer nas posições de resíduo de aminoácido de 79, 81, 83 e 84. Além disso, a região E pode compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido, em que uma substituição pode ocorrer na posição de resíduo de aminoácido 227.

Em outra forma de realização da presente invenção, é fornecido um conjugado que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região B sejam substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparada com o superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que é direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada ao câncer. Especificamente, as posições de resíduo de aminoácido na região B a serem substituídas podem ser selecionadas do grupo que consiste de 34, 35, 39, 40, 41, 42,44, 45 e 49.

Uma outra forma de realização da presente invenção, fornece um conjugado que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região C sejam substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparada com o superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que é direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada ao câncer. Em formas de realização específicas o câncer é selecionadas do grupo que consiste de câncer pulmonar, mamário, colônico, renal, pancreático, ovariano, estomacal, cervical e prostático.

As posições de resíduo de aminoácido na região C a serem substituídas são selecionadas do grupo que consiste de 74, 75, 78, 79, 81, 83 e 84.

Os exemplos de superantígenos incluem, mas não são limitados à enterotoxina estafílocócica (SE), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina associada ao choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-1), uma exotoxina mitogênica estreptocócica (SME) e um superantígeno estreptocócico (SSA). Em formas de realização específicas, a enterotoxina estafílocócica é a enterotoxina estafílocócica A (SEA) ou a enterotoxina estafílocócica E (SEE).

Em formas de realização específicas, o conjugado pode ainda compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região A. As substituições na região A podem ocorrer nas posições de resíduo de aminoácido 20, 21, 24, 27, 173 ou 204. Além disso, o conjugado pode compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região E. Mais particularmente, a substituição da região E pode ocorrer na posição de resíduo de aminoácido 227.

Em uma outra forma de realização específica, o conjugado pode compreender a seqüência de aminoácido SEE incluindo as substituições de R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S e D227S ou a seqüência de aminoácido SEE incluindo as substituições de R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S e D227A. Além disso, o conjugado pode compreender a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

Em outras formas de realização, o conjugado pode compreender uma porção de anticorpo, por exemplo, mas não limitado ao fragmento Fab. Os fragmentos Fab específicos podem incluir C215Fab ou 5T4Fab.

Além disso, o conjugado também pode compreender uma citocina, tal como interleucina. Em formas de realização específicas, a interleucina é a IL2 ou um derivado desta tendo essencialmente a mesma atividade biológica da IL2 nativa.

Uma outra forma de realização compreende um conjugado que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região D sejam substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparada com o superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que esteja direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer. As posições de resíduo de aminoácido na região D a serem substituídas são selecionadas do grupo que consiste de 187, 188, 189 e 190.

Em outra forma de realização, é fornecido um conjugado que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região E sejam substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tem sororreatividade reduzida comparado com o superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que é direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer. Em formas de realização específicas a enterotoxina estafílocócica é a enterotoxina estafílocócica A (SEA) ou a enterotoxina estafílocócica E (SEE). Também, as posições de resíduo de aminoácido na região E a serem substituídas são selecionadas do grupo que consiste de 217, 220, 222, 223, 225 e 227.

Em uma forma de realização específica, o conjugado ainda compreende substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região A. Especificamente, as substituições na região A podem ocorrer nas posições de resíduo de aminoácido de 20, 21, 24, 27, 173 e 204.

Em uma outra forma de realização específica, o conjugado ainda compreende substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região B em que as substituições podem ocorrer nas posições de resíduo de aminoácido de 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 e 49.

Além disso, o conjugado pode compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região C. Especificamente, as substituições na região C ocorrem nas posições de resíduo de aminoácido de 74, 75, 78, 79, 81, 83 e 84. Também, o conjugado pode ainda compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região D, em que as substituições podem ocorrer nas posições de resíduo de aminoácido de 187, 188, 189 e 190.

Em outra forma de realização específica, é fornecido uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado, em que o dito conjugado compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região C sejam substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparado ao superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que esteja direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer. Especifícamente, as posições de resíduo de aminoácido na região C a serem substituídas são selecionadas do grupo que consiste de 74, 75, 78, 79, 81, 83 e 84.

Em outras formas de realização, a composição farmacêutica pode compreender um conjugado que compreenda substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região A, em que as substituições na região A ocorrem nas posições de resíduo de aminoácido de 20, 21, 24, 27, 173 e 204. Além disso, a composição farmacêutica também pode compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região E. Especificamente, a substituição da região E pode ser na posição de resíduo de aminoácido 227.

Em formas de realização específicas, a composição farmacêutica pode compreender um conjugado que compreende a seqüência de aminoácido SEE (SEQ ID NO: 7) assim como as substituições adicionais de R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S e D227S.

Em uma outra forma de realização específica, a composição farmacêutica pode compreender a seqüência de aminoácido SEE (SEQ ID NO: 7) assim como as substituições adicionais de R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S e D227A. Além disso, a composição farmacêutica compreende um conjugado que tem a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

Em outras formas de realização específicas, a composição farmacêutica compreende uma porção de anticorpo, por exemplo um fragmento Fab. Especificamente, o fragmento Fab é C215Fab ou 5T4Fab. A composição farmacêutica pode ainda compreender uma citocina, tal como uma interleucina. A interleucina pode ser IL2 ou um derivado desta tendo essencialmente a mesma atividade biológica da IL2 nativa.

Uma outra forma de realização da presente invenção inclui um método para tratar câncer em um mamífero pela ativação do sistema imune do dito mamífero que compreende administrar ao dito mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado, em que o dito conjugado compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região C são substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparado ao superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que esteja direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer. Os exemplos de câncer incluem, mas não são limitados ao câncer pulmonar, mamário, colônico, renal, pancreático, ovariano, estomacal, cervical e prostático. Especificamente, as posições de resíduo de aminoácido na região C a serem substituídas são selecionadas do grupo que consiste de 74, 75, 78, 79, 81, 83 e

Em outras formas de realização, a região A também pode compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido, em que as substituições ocorrem nas posições de resíduo de aminoácido de 20, 21, 24, 27, 173 e 204. Também, a região E pode ainda compreender substituições de não mais do que 15 resíduos de aminoácido. Especificamente, uma substituição da região E pode ser na posição de resíduo de aminoácido 227. O conjugado pode compreender a seqüência de aminoácido SEE (SEQ ID NO: 7) assim como as substituições adicionais de R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S e D227S ou as substituições de R20G, N21T, S24G, R27K, K79E, K81E, K83S, K84S e D227A. Além disso, o conjugado tem a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

Os seguintes desenhos formam parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor entendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das formas de realização específicas aqui apresentadas. A FIG. 1 mostra fragmentos peptídicos reconhecidos pelo anti-SEA humano que foram identificados a partir de uma digestão com pepsina de SEA/E-18 eluído de uma coluna anti-SEA. Os fragmentos foram identificados tanto antes quanto depois da purificação usando a HPLC de fase reversa ligada a um espectrômetro de massa (MS). Os fragmentos encontrados na digestão no mesmo tempo de retenção tanto antes quanto depois da purificação por afinidade foram considerados como positivos. A FIG. 2 é os sete peptídeos diferentes identificados, demonstrados como linhas acima da seqüência de aminoácido para SEA/E-120. Os caracteres em cinza claro indicam que os resíduos foram alterados no SEA/E-120 comparado com o SEA/E-18. A FIG. 3 é um alinhamento de seqüência estrutural de SEA, SED e SEH usado como padrões para construir o modelo de computador comparativo de SEA/E-18. As regiões conservadas estruturais são marcadas com caixas pretas. A FIG. 4 é um alinhamento de seqüência múltiplo de SEA, SEE, SEA/E-18 e SEA/E-120. Demonstrados como linhas acima do alinhamento estão as cinco regiões de A a E diferentes dentro das quais todas as substituições em SEA/E-120 estão contidas. A FIG. 5 é um modelo de SEA/E-18 (em preto) sobreposto sobre o SEA (1SXT, em cinza). A FIG. 6 é as regiões de SEA/E-18 que correspondem aos peptídeos de sororreatividade identificados. A FIG. 7 é um Ensaio de proximidade de Cintilação (SPA) que mediu a ligação específica de 125I anti-SEA humano ligado ao C215FabSEA, C215FabSEA/E-18, -65, -97, -109, -110, -113 ou -120 em F(ab)2 anti-camundongo conjugado com biotina em pérolas de estreptavidina PVT. A FIG. 8A e FIG. 8B ilustram a capacidade para mediar a citotoxicidade direcionada a tumor. A FIG. 8A ilustra a citotoxicidade como medida em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo de superantígeno, SADCC. A FIG. 8B mostra a eficiência de superantígenos para mediar a morte de célula T de células que expressam o MHC de classe II resulta em citotoxicidade sistêmica que pode causar efeitos colaterais medida em um ensaio de citotoxicidade celular dependente de Superantígeno, SDCC. Todas as novas quimeras diminuíram seus efeitos no SDCC com pelo menos Ilog e com tanto quanto 31og para C215FabSEA/E-120. A FIG. 9 é o diagrama de fita do modelo de SEA/E-120. As cadeias laterais dos resíduos G20, T21, G24 e K27 estão marcadas em cinza escuro, as cadeias laterais dos resíduos S34, S39, S40, E41, K42, A44, T49, T74, A75, S78, E79, E81, S83 e S84 estão marcadas em cinza, as cadeias laterais dos resíduos T217, S220, T222, S223, S225 estão marcadas em preto e a cadeia lateral do resíduo S227 está marcada em cinza claro. A FIG. 10 é uma seqüência de aminoácido de 5T4FabSEA/ E-120 (SEQ ID NO: 1) com as partes variáveis do anticorpo 5T4 de murino e as partes constantes do anticorpo C242 de murino. As posições de 1 a 458 são a cadeia A e as posições de 459 a 672 são a cadeia B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Está facilmente evidente a uma pessoa habilitada na técnica que várias formas de realização e modificações podem ser feitas à invenção divulgada neste Pedido sem divergir do escopo e do espírito da invenção.

Como aqui usado no relatório descritivo, “um” ou “uma” podem significar um ou mais. Como aqui usado na(s) reivindicação(ões), quando usado em conjunção com a palavra “compreendendo”, as palavras “um” ou “uma” podem significar um ou mais do que um. Como aqui usado “um outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.

O termo “anticorpo” como aqui usado, refere-se a uma molécula de imunoglobulina, que é capaz de ligar-se especificamente a um epítopo específico em um antígeno. Como aqui usado, um anticorpo é intencionado a referir amplamente a qualquer agente de ligação imunológica tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Os anticorpos podem ser imunoglobulinas inteiras derivadas de fontes naturais ou de fontes recombinantes e podem ser porções imunoativas de imunoglobulinas inteiras. Os anticorpos na presente invenção podem existir em uma variedade de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, Fv, Fab e F(ab)2, assim como anticorpos de cadeia única e anticorpos humanizados (Harlow et al., 1988; Bird et al., 1988).

O termo “antígeno” como aqui usado é definido como uma molécula que provoca uma resposta imune. Esta resposta imune pode envolver a produção de anticorpo, a ativação de células imunologicamente competentes específicas ou ambos. Um antígeno pode ser derivado de organismos, subunidades de proteínas/antígenos, células inteiras mortas ou inativadas ou lisados. Portanto, um técnico habilitado constata que qualquer macromolécula, incluindo virtualmente todas as proteínas, podem servir como antígenos. Além disso, os antígenos podem ser derivados de DNA recombinante.

O termo “câncer,” como aqui usado é definido como uma doença proliferativa ou um neoplasmo maligno (tumor). Os exemplos incluem mas não são limitados a, câncer de mama, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer cervical, câncer de pele, câncer pancreático, câncer colorretal e câncer pulmonar.

O termo “conjugado” como aqui usado é definido como uma proteína de fusão de um superantígeno ou uma variante de um superantígeno fundido ou conjugado a um anticorpo ou a um fragmento de um anticorpo.

Os termos “imunogênico” ou “imunogenicidade,” como aqui usado é definido como uma substância ou uma molécula que evoca uma resposta imune.

O termo “complexo de histocompatibilidade principal” ou “MHC”, como aqui usado é definido como um cacho específico de genes, muitos dos quais codificam proteínas de superfície celular evolucionariamente relacionadas envolvidas na apresentação de antígeno, que estão entre os determinantes mais importantes de histocompatibilidade. O MHC de Classe I ou MHC-I, funciona principalmente na apresentação de antígeno aos linfócitos CD8 T. O MHC de Classe II ou MHC-II, funciona principalmente na apresentação de antígeno aos linfócitos CD4 T.

Os termos “sororreativo”, “sororreação” ou “sororreatividade” como aqui usados são definidos como uma reação ou ação que ocorre como um resultado de soro ou soros. Uma pessoa habilitada na técnica constata que o soro ou soros de um paciente ou animal contém anticorpos neutralizadores ou anticorpos pré formados ou anticorpos endógenos para uma variedade de antígenos ou moléculas. Assim, a sororreatividade diz respeito à reação de neutralizar anticorpos no soro.

O termo “superantígeno” como aqui usado é definido como uma classe de moléculas que estimulam um subconjunto de células T pela ligação às moléculas de MHC de classe II e domínios Vβ de receptores de célula T, estimulando a ativação dos segmentos de gene V de Vβ particulares que expressam células T.

O termo “receptor de célula T,” como aqui usado é definido como um receptor que consiste de um heterodímero ligado por dissulfeto das cadeias α ou β altamente variáveis expressadas na membrana celular como um complexo com as cadeias CD3 invariáveis. As células T que carregam este tipo de receptor são freqüentemente chamadas de células T α:β. Um receptor alternativo fabricado de cadeias y e δ variáveis é CD3 expressado em um subconjunto de células T.

O termo “terapeuticamente eficaz” como aqui usado é definido como a quantidade da composição farmacêutica que é eficaz em tratar uma doença ou uma condição.

Os termos “variante” ou “variantes” como aqui usados referem-se às proteínas ou peptídeos que diferem de uma proteína ou peptídeo de referência, respectivamente. As variantes neste sentido são descritas abaixo e em outra parte na presente divulgação em maiores detalhes. Por exemplo, as mudanças na seqüência de ácido nucléico das variantes podem ser silenciosas, isto é, elas não podem alterar os aminoácidos codificados pela seqüência de ácido nucléico. Onde as alterações são limitadas às mudanças silenciosas deste tipo uma variante codificará um peptídeo com a mesma seqüência de aminoácido como o peptídeo de referência. Mudanças na seqüência de ácido nucléico da variante podem alterar a seqüência de aminoácido de um peptídeo codificado pela seqüência de ácido nucléico de referência. Tais mudanças de ácido nucléico podem resultar em substituições, adições, supressões, fusões e truncagens de aminoácido no peptídeo codificado pela seqüência de referência, como debatido abaixo. No geral, diferenças nas seqüências de aminoácido são limitadas de modo que as seqüências da referência e da variante sejam firmemente similares de ponta a ponta e, em muitas regiões, idênticas. Uma variante e peptídeo de referência podem diferir na seqüência de aminoácido em uma ou mais substituições, adições, supressões, fusões e truncagens, que podem estar presentes em qualquer combinação. Uma variante também pode ser um fragmento de um peptídeo. da invenção que difira de uma seqüência de peptídeo de referência por ser mais curta do que a seqüência de referência, tal como em uma supressão terminal ou interna. Uma outra variante de um peptídeo da invenção também inclui um peptídeo que retenha essencialmente a mesma função ou atividade como tal peptídeo. Uma variante também pode ser (i) uma em que um ou mais dos resíduos de aminoácido são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado e tal resíduo de aminoácido substituído pode ser ou não um codificado pelo código genético ou (ii) um em que um ou mais dos resíduos de aminoácido incluem um grupo substituinte ou (iii) um em que o peptídeo maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia vida do peptídeo (por exemplo, polietileno glicol) ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao peptídeo maduro, tal como uma seqüência líder ou secretora ou uma seqüência que é utilizada para a purificação do peptídeo maduro. Variantes podem ser fabricadas pelas técnicas de mutagênese, incluindo aquelas aplicadas aos ácidos nucléicos, aminoácidos, células ou organismos ou podem ser fabricadas por meios recombinantes. Todas de tais variantes definidas acima são consideradas estar dentro do escopo daqueles habilitados na técnica a partir das divulgações neste e da técnica.

O termo “atividade biológica” como aqui usado refere-se a uma propriedade intrínseca de uma molécula específica, por exemplo, a ativação de certas células ou a ligação a certos receptores. A definição, como aqui usada, é primariamente qualitativa ao invés de quantitativa.

I. Modificação de Superantígenos

A presente invenção é traçada para modificar superantígenos pela diminuição da sua imunogenicidade pela redução da sua sororreatividade. Uma pessoa habilitada na técnica está ciente de que a sororreatividade refere-se à reação de moléculas ou antígenos com anticorpos neutralizadores nos soros. Especificamente a presente invenção é traçada para um conjugado que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é um superantígeno de título baixo que compreende as regiões de A a E, cuja região A é um sítio de ligação do TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC de classe II; e a seqüência de aminoácido do superantígeno é substituída de modo que não mais do que 15 resíduos de aminoácido na região de A a E são substituídos com aminoácidos diferentes, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparado com o superantígeno do qual ele é derivado; e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo de anticorpo de ligação de molécula, que é direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer.

A. Superantígenos

Os superantígenos bacterianos que são considerados para o uso na presente invenção incluem, mas não são limitados a uma enterotoxina estafílocócica (SE), uma exotoxina de Streptococcus pyogenes (SPE), uma toxina associada ao choque tóxico de Staphylococcus aureus (TSST-1), uma exotoxina mitogênica estreptocócica (SME) e um superantígeno estreptocócico (SSA). Uma pessoa de habilidade na técnica constata que as estruturas tridimensionais dos superantígenos listados acima podem ser obtidas a partir do Banco de Dados de Proteína (PDB, www.rcsb.org). Além disso, uma pessoa habilitada na técnica pode obter as seqüências de ácido nucléico e as seqüências de aminoácido dos superantígenos listados acima e outros superantígenos a partir do GenBank (http ://www .ncbi .nlm.nih. gov/Genbank/GenhankS earch.html).

Em formas de realização específicas, o superantígeno é um superantígeno de título baixo. É conhecido e entendido por aqueles de habilidade na técnica que os soros de seres humanos normalmente contêm títulos altos de anticorpos contra os superantígenos. Para os superantígenos estafilocócicos, por exemplo, os títulos relativos são TSST-1 > SED > SEC-1 > SEC2 > SEA > SED > SEE. Uma pessoa habilitada na técnica constata que estes títulos relativos indicam problemas de imunogenicidade e problemas com a sororreatividade ou problemas com os anticorpos neutralizadores. Assim, a presente invenção considera usar um superantígeno de título baixo, tal como SEA ou SEE para evitar a sororreatividade de superantígenos parenteralmente administrados.

Além disso, é claramente conhecido e entendido que as seqüências de proteína e a reatividade cruzada imunológica dos superantígenos ou enterotoxinas estafilocócicas estão divididos em dois grupos relacionados. Um grupo consiste de SEA, SEE, SED e SEH. O segundo grupo é SPEA, SEC, SEB e SSA. Assim, a presente invenção também considera o uso de superantígenos de título baixo para diminuir ou eliminar a reatividade cruzada da presente invenção com anticorpos de título alto ou endógenos contra enterotoxinas estafilocócicas.

B. Variantes de Superantígenos

As variantes de seqüência de aminoácido das proteínas de superantígeno podem ser variantes de substituição, de inserção ou de supressão. Estas variantes podem ser purificadas de acordo com métodos conhecidos, tais como precipitação (por exemplo, sulfato de amónio), HPLC, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade (incluindo cromatografia de imunoafinidade) ou várias separações por tamanho (sedimentação, eletroforese em gel, filtração em gel).

As variantes de substituição ou variantes de recolocação tipicamente contêm a troca de um aminoácido no lugar de um outro em um ou mais sítios dentro da proteína. As substituições podem ser conservativas, isto é, um aminoácido é substituído com um de forma e carga similares. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as mudanças de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e valina para isoleucina ou leucina.

Considera-se que várias mudanças podem ser feitas nas seqüências de DNA de genes sem perda apreciável da utilidade ou atividade biológicas das proteínas, como debatido abaixo. A atividade sendo a indução das respostas de célula T para resultar na citotoxicidade das células de tumor. Além disso, a afinidade do superantígeno com as moléculas de MHC de classe II é diminuída com efeitos mínimos na citotoxicidade do superantígeno.

Ao fazer tais mudanças, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice de aminoácido hidropático na conferência de função biológica interativa em uma proteína é no geral entendida na técnica (Kyte e Doolittle, 1982). É aceito que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribua para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez define a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e outros.

A cada aminoácido foi designado um índice hidropático com base na sua hidrofobicidade e características de carga (Kyte e Doolittle, 1982), estes são: isoleucina (+4,5), valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (- 3,9) e arginina (- 4,5).

E conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou pontuação hidropáticos similares e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína biológica e funcionalmente equivalente. Ao fazer tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 é preferida, aqueles que estão dentro de +1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

Também é entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. 4.554.101, incorporada aqui por referência, estabelece que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como controlada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona- se com uma propriedade biológica da proteína. Como detalhado na Patente US 4.554.101, os seguintes valores de hidrofilicidade foram designados aos resíduos de aminoácido: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0 ± 1), glutamato (+3,0 ± 1), serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 ± 1), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5), triptofano (-3,4).

E entendido que um aminoácido pode ser substituído no lugar de um outro tendo um valor de hidrofilicidade similar e ainda se obtém uma proteína biologicamente equivalente e imunologicamente equivalente. Em tais mudanças, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 é preferida, aqueles que estão dentro de ± 1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de +0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

C. Proteínas de Fusão

Um tipo especializado de variante de inserção é a proteína de fusão. Esta molécula no geral tem toda ou uma porção substancial da molécula nativa, ligada ao término N ou C, a todo ou a uma porção de um segundo polipeptídeo. Por exemplo, uma proteína de fusão da presente invenção inclui a adição de um domínio imunologicamente ativo, tal como um fragmento de anticorpo, às células de tumor alvo específicas.

Além disso, a inclusão de um sítio de divagem na ou próximo à junção de fusão facilitará a remoção do polipeptídeo estranho depois da purificação. Outras fusões úteis incluem a ligação de domínios funcionais, tais como sítios ativos de enzimas, domínios de glicosilação, outros sinais alvejadores celulares ou regiões de transmembrana.

D. Mudança de Domínio

Uma série interessante de variantes pode ser criada pela substituição de regiões homólogas de várias proteínas. Isto é conhecido, em certos contextos, como “mudança de domínio.”

A mudança de domínio envolve a geração de moléculas quiméricas usando polipeptídeos diferentes mas, neste caso, relacionados. Comparando-se várias proteínas SAg, pode-se fazer prognósticos como para as regiões funcionalmente significantes destas moléculas. E possível, então, mudar domínios relacionados destas moléculas em um esforço para determinar a criticalidade destas regiões para a função SAg. Estas moléculas podem ter valor adicional em que estas “quimeras” podem ser distinguidas das moléculas naturais, enquanto possivelmente forneçam a mesma função.

E. Purificação de Proteínas

Será desejável purificar a SAg ou variantes desta. As técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Estas técnicas envolvem, em um nível, o fracionamento bruto do meio celular em frações peptídicas e não peptídicas. Tendo separado a proteína de outras proteínas, a proteína de interesse pode ser ainda purificada usando-se técnicas cromatográficas e eletroforéticas para se obter a purificação parcial ou completa (ou a purificação até a homogeneidade). Os métodos analíticos particularmente adaptados para a preparação de um peptídeo puro são a cromatografia de troca iônica, a cromatografia de exclusão; eletroforese em gel de poliacrilamida; focalização isoelétrica. Um método particularmente eficiente de purificar peptídeos é a cromatografia líquida de proteína rápida ou mesmo a HPLC.

Certos aspectos da presente invenção dizem respeito à purificação e em formas de realização particulares, à purificação substancial de uma proteína ou peptídeo codificados. O termo “proteína ou peptídeo purificados” como aqui usado, é intencionado a se referir a uma composição, isolável de outros componentes, em que a proteína ou peptídeo são purificados em qualquer grau em relação ao seu estado naturalmente obtenível. Uma proteína ou peptídeo purificados portanto também se refere a uma proteína ou peptídeo, livres do ambiente no qual eles podem naturalmente ocorrer.

No geral, “purificado” referir-se-á a uma composição de proteína ou peptídeo que tenha sido submetida ao fracionamento para remover vários outros componentes e cuja composição substancialmente retém a sua atividade biológica expressada. Onde o termo “substancialmente purificado” é usado, esta designação referir-se-á a uma composição em que a proteína ou peptídeo formam o componente principal da composição, tal como constituindo cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 95 % ou mais das proteínas na composição. . 5 Vários métodos para quantificar o grau de purificação da proteína ou peptídeo serão conhecidos por aqueles de habilidade na técnica considerando-se a presente divulgação. Estes incluem, por exemplo, determinar a atividade específica de uma fração ativa ou avaliar a quantidade de polipeptídeos dentro de uma fração pela análise de SDS/PAGE. Um 10 método preferido para avaliar a pureza de uma fração é calcular a atividade específica da fração, para compará-la com a atividade específica do extrato inicial e para assim calcular o grau de pureza, aqui avaliada por um “número de vezes de purificação.” As unidades reais usadas para representar a quantidade de atividade, naturalmente, serão dependentes da técnica de ensaio 15 particular escolhida para seguir a purificação e se a proteína ou peptídeo expressados exibem ou não uma atividade detectável.

Várias técnicas adequadas para o uso em purificação de proteína serão bem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Estas incluem, por exemplo, a precipitação com sulfato de amónio, PEG, anticorpos 20 e outros ou pela desnaturação térmica, seguido pela centrifugação; as etapas de cromatografia tais como troca iônica, filtração em gel, fase reversa, hidroxilapatita e cromatografia de afinidade; focalização isoelétrica; eletroforese em gel; e combinações de tais e outras técnicas. Como é no geral conhecido na técnica, acredita-se que a ordem de conduzir as várias etapas de 25 purificação pode ser mudada ou que certas etapas possam ser omitidas e ainda resultarem em um método adequado para a preparação de uma proteína ou peptídeo substancialmente purificados.

E conhecido que a migração de um polipeptídeo pode variar, algumas vezes significantemente, com condições diferentes de SDS/PAGE (Capaldi et al., 1977). Portanto será avaliado que sob condições de eletroforese diferentes, os pesos moleculares evidentes de produtos de expressão purificados ou parcialmente purificados podem variar.

A Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) é caracterizada por uma separação muito rápida com resolução extraordinária dos picos. Isto é obtido pelo uso de partículas muito finas e alta pressão para se manter uma taxa de fluxo adequada. A separação pode ser realizada em uma questão de minutos ou no máximo e uma hora. Além disso, apenas um volume muito pequeno da amostra é necessário porque as partículas são tão pequenas e empacotadas próximas que o volume de vazio é uma fração muito pequena do volume do leito. Também, a concentração da amostra não necessita ser muito grande porque as faixas são tão estreitas que existe muito pouca diluição da amostra.

A cromatografia em gel ou cromatografia de peneira molecular, é um tipo especial de cromatografia de divisão que está fundamentada no tamanho molecular. A teoria por trás da cromatografia em gel é que a coluna, que é preparada com partículas muito pequenas de uma substância inerte que contém poros pequenos, separa as moléculas maiores das moléculas menores conforme elas passam através ou em tomo dos poros, dependendo do seu tamanho. Já que o material do qual as partículas são fabricadas não adsorve as moléculas, o único fator que determina a taxa de fluxo é o tamanho. Por este motivo, as moléculas são eluídas da coluna em tamanho decrescente, contanto que a forma seja relativamente constante. A cromatografia em gel é incomparável para separar moléculas de tamanhos diferentes porque a separação é independente de todos os outros fatores tais como pH, concentração iônica, temperatura, etc. Também, não existe virtualmente nenhuma adsorção, menos zona de espalhamento e o volume de eluição estão relacionados em uma simples questão de peso molecular.

A cromatografia de afinidade é um procedimento cromatográfico que conta com a afinidade específica entre uma substância a ser isolada e uma molécula que ela pode especificamente ligar-se. Esta é uma interação do tipo receptor-ligando. O material da coluna é sintetizado ligando- se covalentemente um dos parceiros de ligação a uma matriz insolúvel. O . 5 material da coluna é então capaz de adsorver especificamente a substância da solução. A eluição ocorre mudando-se as condições para aquelas em que a ligação não ocorre (pH alterado, concentração iônica, temperatura, etc.).

F. Mutagênese de Variantes

A presente invenção considera que a modificação da afinidade 10 do superantígeno para as moléculas de MHC de classe II pode diminuir a toxicidade do superantígeno. Assim, a afinidade diminuída para as moléculas de MHC de classe II resulta em sororreatividade diminuída ou reação diminuída com anticorpos neutralizadores ou anticorpos endógenos ou pré formados. 15 Em formas de realização específicas, a mutagênese será utilizada para modificar a região do superantígeno que determina a ligação às moléculas de MHC de classe II. A mutagênese será realizada por uma variedade de procedimentos mutagênicos, padrão. A mutação é o processo por meio do qual as mudanças ocorrem na quantidade ou estrutura de um 20 organismo. A mutação pode envolver a modificação da seqüência de nucleotídeo de um único gene, bloqueios de genes ou cromossoma inteiro. As mudanças em genes únicos podem ser a conseqüência de mutações de ponto, que envolvem a remoção, adição ou substituição de uma única base de nucleotídeo dentro de uma seqüência de DNA ou elas podem ser a 25 conseqüência de mudanças que envolvam a inserção ou supressão de números grandes de nucleotídeos.

Uma técnica de mutagênese particularmente útil é a mutagênese de triagem de alanina em que vários resíduos são substituídos individualmente com o aminoácido alanina de modo que os efeitos de perda das interações de cadeia lateral possam ser determinados, enquanto de minimiza o risco de perturbações em grande escala na conformação da proteína (Cunningham et al., 1989).

Nos últimos anos, técnicas para estimar a constante de 5 equilíbrio para a ligação de ligando usando quantidades minúsculas de proteína foram desenvolvidas (Patentes U.S. 5.221.605 e 5.238.808). A capacidade para realizar ensaios funcionais com quantidades pequenas de material pode ser explorada para desenvolver metodologias in vitro altamente eficientes para a mutagênese de saturação de anticorpos. Foram deixadas de 10 lado etapas de clonagem pela combinação da mutagênese por PCR com a transcrição/tradução ligadas in vitro para a geração de alto rendimento de mutantes de proteína. Aqui, os produtos de PCR são usados diretamente como o padrão para a transcrição/tradução in vitro dos anticorpos mutantes de cadeia única. Por causa da alta eficiência com que todas as 19 substituições de 15 aminoácido podem ser geradas e analisadas deste modo, é agora possível realizar a mutagênese de saturação em numerosos resíduos de interesse, um processo que pode ser descrito como a mutagênese de saturação de triagem in vitro (Burks et al., 1997).

A mutagênese de saturação de triagem in vitro fornece um 20 método rápido para se obter uma quantidade grande de informação de estrutura-fimção incluindo: (i) a identificação de resíduos que modulem a especificidade de ligação de ligando, (ii) um melhor entendimento da ligação de ligando com base na identificação daqueles aminoácidos que retêm a atividade e daqueles que anulam a atividade em um dado local, (iii) uma 25 avaliação da plasticidade global de um sítio ativo ou subdomínio de proteína, (iv) a identificação de substituições de aminoácido que resulta em ligação aumentada.

A mutagênese específica de sítio guiada pela estrutura representa uma ferramenta poderosa para a dissecação e engenheiramento de interações de proteína-ligando (Wells, 1996, Braisted et al., 1996). A técnica fornece a preparação e teste de variantes de seqüência pela introdução de uma ou mais mudanças de seqüência de nucleotídeo em um DNA selecionado.

A mutagênese específica de sítio usa seqüências de k 5 oligonucleotide© específicas que codificam a seqüência de DNA da mutação desejada, assim como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, não modificados. Deste modo, uma seqüência preparadora é fornecida com tamanho e complexidade suficientes para formar um duplex estável em ambos os lados da junção de supressão que é atravessada. Um preparador de cerca de 10 17 a 25 nucleotídeos no comprimento é preferido, com cerca de 5 a 10 resíduos em ambos os lados da junção da seqüência que é alterada.

A técnica tipicamente utiliza um vetor de bacteriófago que existe tanto em uma forma de filamento único quanto de filamento duplo. Os vetores úteis na mutagênese direcionada a sítio incluem vetores tais como o 15 fago Ml3. Estes vetores de fago são comercialmente disponíveis e o seu uso é no geral bem conhecido por aqueles habilitados na técnica. Os plasmídeos de filamento duplo também são rotineiramente utilizados na mutagênese direcionada a sítio, que elimina a etapa de transferir o gene de interesse de um fago para um plasmídeo. 20 No geral, primeiro se obtém um vetor de filamento único ou se funde dois filamentos de um vetor de filamento duplo, que inclua dentro da sua seqüência uma seqüência de DNA que codifique a proteína ou elemento genético desejados. Um preparador de oligonucleotide© que carrega a seqüência mutada desejada, sinteticamente preparada, é depois recozido com 25 a preparação de DNA de filamento único, levando-se em conta o grau de desemparelhamento quando da seleção de hibridização. O produto hibridizado é submetido às enzimas de polimerização de DNA tal como a E. coli polimerase I (fragmento Klenow) de modo a completar a síntese do filamento que carrega a mutação. Assim, um heteroduplex é formado, em que um filamento codifica a seqüência não mutada original e o segundo filamento carrega a mutação desejada. Este vetor heteroduplex é depois usado para transformar células hospedeiras apropriadas, tais como as células da E. coli e clones são selecionados de modo que incluam vetores recombinantes que . 5 carregam o arranjo da seqüência mutada.

A informação compreensiva sobre a significância funcional e teor de informação de um dado resíduo de proteína pode ser melhor obtidos pela mutagênese de saturação em que todas as 19 substituições de aminoácido são examinadas. A falha deste método é que as logísticas da mutagênese de 10 saturação de resíduo múltiplo são intimidadoras (Warren et al., 1996, Brown et al., 1996; Zeng et al., 1996; Burton e Barbas, 1994; Yelton et al., 1995; Jackson et al., 1995; Short et al., 1995; Wong et al., 1996; Hilton et al., 1996). Centenas e possivelmente ainda milhares de mutantes específicos de sítio devem ser estudados. Entretanto, técnicas melhoradas tomam a produção 15 e a triagem rápida de mutantes muito mais diretas. Ver também, as Patentes U.S. 5.798.208 e 5.830.650, para uma descrição da mutagênese de “ensaio”.

Outros métodos de mutagênese direcionada a sítio são divulgados nas Patentes U.S. 5.220.007, 5.284.760, 51354.670, 5.366.878, 5.389.514, 5.635.377, e 5.789.166. 20 Além dos equivalentes funcionais biológicos que são produzidos usando-se as técnicas de mutagênese debatidas acima, considera- se que estruturalmente os compostos similares podem ser formulados para imitar as porções chave do superantígeno ou conjugado da presente invenção. Tais compostos, que podem ser denominados peptidomiméticos, podem ser 25 usados da mesma maneira como os conjugados da invenção e, por este motivo, também são equivalentes funcionais.

Certos miméticos que imitam elementos das estruturas secundária ou terciária de proteína são descritos em Johnson et al. (1993). A base lógica subjacente por trás do uso de miméticos de peptídeo é que a cadeia principal peptídica de proteínas existe principalmente para orientar as cadeias laterais de aminoácido de um tal modo que facilite as interações moleculares, tais como aquelas de anticorpo e/ou antígeno. Um mimético de peptídeo é assim planejado para permitir interações moleculares similares à , 5 molécula natural.

Algumas aplicações bem sucedidas do conceito de mimético de peptídeo têm focalizado em miméticos de proteínas dentro da volta β, que são conhecidos ser altamente antigênicos. A estrutura da volta β provável dentro de um polipeptídeo pode ser prognosticada pelos algoritmos com base 10 em computador, como aqui debatido. Uma vez que os aminoácidos componentes da volta são determinados, miméticos podem ser construídos para se obter uma orientação espacial similar dos elementos essenciais das cadeias laterais de aminoácido.

Outros métodos focalizaram no uso de proteínas pequenas, 15 contendo multidissulfeto como padrões estruturais atraentes para produzir conformações biologicamente ativas que imitem os sítios de ligação de proteínas grandes. Vita et al. (1998). Um motivo estrutural que parece ser evolucionariamente conservado em certas toxinas é pequeno (30 a 40 aminoácidos), estável e altamente permissivo para a mutação. Este motivo é '20 composto de uma folha beta e uma hélice alfa ligadas em ponte no núcleo interior pelos três dissulfetos.

As voltas beta II foram imitadas com sucesso usando L-pentapeptídeos cíclicos e aqueles com D-aminoácidos (Weisshoff et al., 1999). Também, Johannesson et al. (1999) reporta tripeptídeos bicíclicos com 25 propriedades indutoras de volta reversa.

Os métodos para gerar estruturas específicas foram divulgadas na técnica. Por exemplo, miméticos de hélice alfa são divulgados nas Patentes U.S. 5.446.128, 5.710.245, 5.840.833 e 5.859.184. Estas estruturas tomam o peptídeo ou a proteína mais termicamente estável, também aumentam a resistência à degradação proteolítica. Estruturas de anel de seis, sete, onze, doze, treze e catorze membros são divulgadas.

Os métodos para gerar voltas beta e protuberâncias beta conformacionalmente restritas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.440.013, 5.618.914 e 5.670.155. As voltas beta permitem substituintes laterais trocados sem que se tenha mudanças na conformação da cadeia principal correspondente e têm términos apropriados para a incorporação em peptídeos pelos procedimentos de síntese padrão. Outros tipos de voltas miméticas incluem voltas reversas e gama. Os miméticos de volta reversa são divulgados nas Patentes U.S. 5.475.085 e 5.929.237 e os miméticos de volta gama são descritos nas Patentes US 5.672.681 e 5.674.976.

G. Expressão dos Superantígenos

A presente invenção também envolve o uso de vetores de expressão e células hospedeiras. Estes vetores de expressão, que foram geneticamente engenheirados para conter a seqüência de ácido nucléico dos conjugados, são introduzidos ou transformados em células hospedeiras para produzir os conjugados da presente invenção.

As células hospedeiras podem ser geneticamente engenheiradas para incorporar as seqüências de ácido nucléico e expressam os peptídeos da presente invenção. A introdução de seqüências de ácido nucléico na célula hospedeira pode ser afetada pela transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada pelo DEAE-dextrano, transfecção, microinjeção, transfecção mediada por lipídeo catiônico, eletroporação, transdução, carga por raspagem, introdução balística, infecção ou outros métodos. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padrão, tais como Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) e Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

Os exemplos representativos de células hospedeiras apropriadas incluem células bacterianas, tais como células estreptocócicas, estafilocócicas, de E. coli, de Streptomyces e de Bacillus subtilis’, células fúngicas, tais como células de levedura e de Aspergillus’, células de inseto tais como células Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animal tais como células CHO, COS, HeLa, Cl27, 3T3, BHK, 293 e do melanoma de Bowes.

II. Tratamento do Câncer

Na presente invenção, um superantígeno é conjugado a um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo para alvejar e destruir células cancerosas. Os exemplos de câncer incluem, mas não são limitados ao câncer pulmonar, mamário, colônico, renal, pancreático, ovariano, estomacal, cervical e prostático.

Em um aspecto da presente invenção, a célula de tumor deve carregar algum marcador que seja acessível para alvejamento, isto é, não esteja presente na maioria das outras células. Muitos marcadores de tumor existem e qualquer um destes pode ser adequado para o alvejamento no contexto da presente invenção. Os alvos específicos da presente invenção incluem os anticorpos. Os anticorpos que são considerados na presente invenção incluem, mas não são limitados ao fragmento Fab. Os exemplos do fragmento Fab incluem C215Fab ou ST4Fab. Além do Fab, outros marcadores de tumor comuns incluem o antígeno carcinoembriônico, o antígeno específico da próstata, o antígeno associado a tumor urinário, o antígeno fetal, a tirosinase (p97), gp68, TAG-72, HMFG, o Antígeno de Sialyl Lewis, MucA, Mucl3, PLAP, o receptor de estrogênio, o receptor de laminina, erh B e pl55.

Um outro aspecto da presente invenção é usar uma molécula estimuladora imune como um agente ou mais preferivelmente em conjunção com um outro agente, tal como por exemplo, uma citocina tal como por exemplo IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, fator de necrose de tumor; interferons alfa, beta e gama; F42K e outros análogos de citocina; uma quimiocina tal como por exemplo MIP-1, MIP-lbeta, MCP-1, RANTES, IL-8; ou um fator de crescimento tal como por exemplo o ligando FLT3. A molécula estimuladora pode ser conjugada ao conjugado da presente invenção ou administrada como um adjuvante em combinação com o conjugado da . 5 presente invenção.

Uma citocina particular considerada para o uso na presente invenção é a IL2 ou um derivado tendo essencialmente a mesma atividade biológica da IL2 nativa. A Interleucina-2 (IL-2), originalmente designada fator I de crescimento de célula T, é um indutor altamente proficiente da 10 proliferação da célula T e é um fator de crescimento para todas as subpopulações de linfócitos T. A IL-2 é um fator de proliferação independente de antígeno que induz a progressão do ciclo celular em células latentes e assim permite a expansão clonal de linfócitos T ativados. Visto que as células leucêmicas recém isoladas também secretam IL2 e respondem a ela, 15 a IL2 pode funcionar como um modulador do crescimento autócrino para estas células capazes de piorar o ATL. A IL2 também promove a proliferação de células B ativadas embora isto requeira a presença de fatores adicionais, por exemplo, IL4. A IL2 in vitro também estimula o crescimento de células oligodendrogliais. Devido aos seus efeitos sobre as células T e células B, a 20 IL2 é um regulador central de respostas imunes. Ela também desempenha um papel em reações antiinflamatórias, na hematopoiese e na fiscalização de tumor. A IL-2 estimula a síntese de IFN-y em leucócitos periféricos e também induz a secreção de IL-1, TNF-α e TNF-β. A indução da secreção de citocinas tumoricidas, separada da atividade na expansão de células LAK, 25 (células matadoras ativadas por linfocina) são provavelmente os fatores principais responsáveis pela atividade anti-tumor da IL2.

É considerado que a presente invenção pode ser administrada a um paciente que está sofrendo de câncer ou de uma doença proliferativa. A quantidade administrada ao paciente é uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade que resulte em tratamento do câncer ou doença. A administração do conjugado pode ser por intermédio de uma via parenteral ou alimentar. As vias alimentares exemplares incluem, mas não são limitados à oral, retal, sublingual e bucal. As vias parenterais exemplares incluem, mas , 5 não são limitadas à intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, intradérmica, intratumoral e intravascular.

III. Composições Farmacêuticas

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados sozinhos ou em conjunção com outros compostos, tais como compostos 10 terapêuticos.

As formas farmacêuticas adequadas para o uso injetável incluem soluções e/ou dispersões aquosas estéreis; as formulações incluindo óleo de gergelim, óleo de amendoim e/ou propileno glicol aquoso; e/ou pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções e/ou dispersões 15 injetáveis estéreis. Em todos os casos a forma deve ser estéril e/ou deve ser fluida até o grau em que exista seringabilidade fácil. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e/ou armazenagem e/ou deve ser preservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e/ou fungos.

As soluções dos compostos ativos como base livre e/ou sais 20 farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um tensoativo, tal como celulose hidroxipropílica. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos e/ou misturas destes e/ou em óleos. Sob condições comuns de armazenagem e/ou uso, estas preparações contêm um conservante 25 para impedir o crescimento de microorganismos.

O conjugado da presente invenção pode ser formulado em uma composição em uma forma neutra e/ou salina, os sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos de amino livre das proteína) e/ou que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico e/ou fosfórico e/ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e/ou coisa parecida. Os sais formados com os grupos carboxílicos livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, . 5 amónio, cálcio e/ou férrico e/ou bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e/ou coisa parecida. Em termos de usar produtos terapêuticos peptídicos como ingredientes ativos, a tecnologia das Patentes U.S. 4.608.251, 4.601.903, 4.599.231, 4.599.230, 4.596.792 e/ou 4.578.770, cada uma aqui incorporada por referência, pode ser usada. 10 O carregador também pode ser um solvente e/ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e/ou polietileno glicol líquido e/ou coisa parecida), misturas adequadas destes e/ou óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela 15 manutenção do tamanho de partícula requerido no case de dispersão e/ou pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser realizada por vários agentes antibacterianos e/ou antifungicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e/ou coisa parecida. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, 20 açúcares e/ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso nas composições de agentes que retardem a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e/ou gelatina.

As soluções estéreis injetáveis são preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade requerida no solvente 25 apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido pela esterilização filtrada. No geral, as dispersões são preparadas pela incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril contendo o meio de dispersão básico e/ou os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injetáveis os métodos preferidos de preparação são as técnicas de secagem a vácuo e/ou secagem por congelamento que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução deste previamente . 5 filtrada estéril. A preparação de soluções mais e/ou altamente concentradas para a injeção direta também é considerada, onde o uso de DMSO como solvente é prevista para resultar em penetração extremamente rápida, liberando altas concentrações dos agentes ativos a uma área pequena.

Na formulação, soluções serão administradas de uma maneira (10 compatível com a formulação de dosagem e/ou em quantidade tal como seja terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tal como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação de medicamento e/ou coisa parecida também podem ser utilizadas. 15 Para a administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e/ou o primeiro diluente líquido tomado isotônico com solução salina e/ou glicose suficientes. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para a administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e/ou 20 intraperitoneal. Nesta conexão, meios aquosos estéreis que podem ser utilizados serão conhecidos por aqueles de habilidade na técnica considerando a presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução de NaCl isotônica e/ou adicionada a 1000 ml de fluido de hipodermóclise e/ou injetado no local proposto de infusão, (ver por exemplo, 25 “Remington’s Pharmaceutic Sciences” 15a Edição, páginas 1035 a 1038 e/ou 1570 a 1580). Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá dependendo da condição do paciente que é tratado. A pessoa responsável pela administração, em qualquer evento, determinará a dose apropriada para o paciente individual.

O conjugado e/ou agentes ativos podem ser formulados dentro de uma mistura terapêutica para compreender cerca de 0,0001 a 1,0 miligramas e/ou cerca de 0,001 a 0,1 miligramas e/ou cerca de 0,1 to 1,0 e/ou ainda cerca de 10 miligramas por dose e/ou conforme foi mostrado. As doses . 5 múltiplas também podem ser administradas.

Além dos compostos formulados para a administração parenteral, tal como injeção intravenosa/ intra-articular e/ou intramuscular, outras formas farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, tabletes e/ou outros sólidos para a administração oral; formulações lipossômicas; 10 cápsulas de liberação com o tempo; e/ou qualquer outra forma correntemente usada, incluindo cremes.

Pode-se também usar soluções e/ou pulverizações, aerossóis e/ou inalantes nasais na presente invenção. As soluções nasais são usualmente soluções aquosas planejadas para serem administradas às passagens nasais em 15 gotas e/ou pulverizações. As soluções nasais são preparadas de modo que elas sejam similares em muitos aspectos às secreções nasais, de modo que a ação ciliar normal seja mantida. Assim, as soluções nasais aquosas usualmente são isotônicas e/ou levemente tamponadas para manter um pH de 5,5 a 6,5. Além disso, conservantes antimicrobianos, similares àqueles usados em preparações 20 oftálmicas e/ou estabilizadores de medicamento apropriados, se requeridos, podem ser incluídos na formulação. Várias preparações nasais comerciais são conhecidas e/ou incluem, por exemplo, antibióticos e/ou anti-histaminas e/ou são usadas para a profilaxia da asma.

As formulações adicionais que são adequadas para outros 25 modos de administração incluem supositórios e/ou pessários vaginais. Um pessário e/ou supositório retal também podem ser usados. Os supositórios são formas de dosagem sólidas de vários pesos e/ou formas, usualmente medicados, para a inserção no reto, vagina e/ou na uretra. Depois da inserção, os supositórios amolecem, fundem e/ou dissolvem nos fluidos da cavidade.

No geral, para supositórios, os aglutinantes e/ou carregadores tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis e/ou triglicerídeos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente ativo na faixa de 0,5 % a 10 %, preferivelmente de 1 % a 2 %. . 5 As formulações orais incluem excipientes normalmente utilizados tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e/ou coisa parecida. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, tabletes, pílulas, cápsulas, formulações de liberação prolongada 10 e/ou pós. Em certas formas de realização definidas, as composições farmacêuticas orais compreenderão um diluente inerte e/ou carregador comestível assimilável e/ou elas podem ser incluídas em cápsulas de gelatina de casca dura e/ou mole e/ou elas podem ser comprimidas em tabletes e/ou elas podem ser incorporadas diretamente com o alimento da dieta. Para a 15 administração terapêutica oral, os compostos ativos podem ser incorporados com excipientes e/ou usados na forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, óstias e/ou coisa parecida. Tais composições e/ou preparações devem conter pelo menos 0,1 % de composto ativo. A porcentagem das composições e/ou preparações, 20 naturalmente, pode ser variada e/ou pode estar convenientemente entre cerca de 2 a cerca de 75 % do peso da unidade e/ou preferivelmente entre 25 a 60 %. A quantidade de compostos ativos em tais composições terapeuticamente úteis é tal que uma dosagem adequada será obtida.

Os tabletes, trociscos, pílulas, cápsulas e/ou coisa parecida 25 também podem conter os seguintes: um aglutinante, como goma de tragacanto, acácia, amido de milho e/ou gelatina; excipientes, tais como fosfato de dicálcio; um agente desintegrante, tal como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e/ou coisa parecida; um lubrificante, tal como estearato de magnésio; e/ou um agente adoçante, tal como sacarose, lactose e/

ou sacarina podem ser adicionado e/ou um agente aromatizante, tal como hortelã, óleo de gaultéria e/ou aroma de cereja. Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, um carregador líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como . 5 revestimentos e/ou para de outro modo modificar a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, tabletes, pílulas e/ou cápsulas pode ser revestidos com goma laca, açúcar e/ou ambos. Um xarope de elixir pode conter os compostos ativos sacarose como um agente adoçante, metil e/ou propilparabenos como conservantes, um corante e/ou aromatizante, tal como sabor de cereja e/ou 10 laranja.

Em certas formas de realização, o uso de formulações lipídicas e/ou nanocápsulas é considerado para a introdução de um conjugado/ou agentes e/ou vetores de terapia de gene, incluindo tanto vetores do tipo selvagem e/ou de anti-sentido, em células hospedeiras. 15 As nanocápsulas podem no geral aprisionar compostos em uma maneira estável e/ou reprodutível. Para evitar os efeitos colaterais devido à sobrecarga polimérica intracelular, tais partículas ultrafinas (de tamanho em tomo de 0,1 pm) devem ser planejadas usando-se polímeros capazes de serem degradados in vivo. As nanopartí cuias de polialquil-cianoacrilato 20 biodegradáveis que atingem estas exigências são consideradas para o uso na presente invenção e/ou tais partículas podem ser facilmente fabricadas.

Em um forma de realização da invenção, o conjugado pode ser associado com um lipídeo. Os conjugados associados com um lipídeo podem ser encapsulados no interior aquoso de um lipossoma, interdisperso dentro da 25 bicamada lipídica de um lipossoma, ligado a um lipossoma por intermédio de uma molécula ligadora que esteja associada tanto com o lipossoma quanto com o oligonucleotídeo, aprisionados em um lipossoma, complexados com um lipossoma, dispersos em uma solução que contenha um lipídeo, misturados com um lipídeo, combinados com um lipídeo, contidos como uma suspensão em um lipídeo, contidos ou complexados com uma micela ou de * outro modo associados com um lipídeo. As composições associadas a lipídeo ou lipídeo/conjugado da presente invenção não são limitadas a qualquer estrutura particular em solução.. Por exemplo, elas podem estar presentes em . 5 uma estrutura de bicamada, como micelas ou com uma estrutura colapsada.

Elas também podem simplesmente estar interdispersas em uma solução, possivelmente formando agregados que não são uniformes no tamanho ou forma.

Os lipídeos são substâncias graxas que podem ser lipídeos que 10 ocorrem naturalmente ou sintéticos. Por exemplo, os lipídeos incluem as gotículas graxas que ocorrem naturalmente no citoplasma assim como a classe de compostos que são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica que contêm hidrocarbonetos alifáticos de cadeia longa e seus derivados, tais como ácidos graxos, álcoois, aminas, amino álcoois e aldeídos. 15 Os fosfolipídeos podem ser usados para preparar os lipossomas de acordo com a presente invenção e podem carregar uma carga líquida positiva, negativa ou neutra. O fosfato de diacetila pode ser utilizado para conferir uma carga negativa aos lipossomas e estearilamina pode ser usada para conferir uma carga positiva aos lipossomas. Os lipossomas podem 20 ser fabricados de um ou mais fosfolipídeos.

Um lipídeo carregado neutro pode compreender um lipídeo sem nenhuma carga, um lipídeo substancialmente descarregado ou uma mistura de lipídeo com número igual de cargas positiva e negativa. Os fosfolipídeos adequados incluem fosfatidil colinas e outros que são bem 25 conhecidos por aqueles de habilidade na técnica.

Os lipídeos adequados para o uso de acordo com a presente invenção podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, a dimiristil fosfatidil colina (“DMPC”) pode ser obtida da Sigma Chemical Co., o fosfato de dicetila (“DCP”) é obtido da K & K Laboratories (Plainview, NY); o colesterol (“Chol”) é obtido da Calbiochem-Behring; o dimiristil fosfatidilglicerol (“DMPG”) e outros lipídeos podem ser obtidos da Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, Ala.). As soluções de estoque de lipídeos em clorofórmio ou clorofórmio/metanol podem ser armazenadas a cerca de -20° . 5 C. Preferivelmente, o clorofórmio é usado como o único solvente visto que ele é mais facilmente evaporado do que o metanol.

Os fosfolipídeos de fontes naturais, tais como a fosfatidil colina do ovo ou soja, o ácido fosfatídico do cérebro, fosfatidilinositol do cérebro ou vegetal, cardiolipina do coração e vegetal ou fosfatidiletanolamina 10 bacteriana preferivelmente não são usados como o fosfatídeo primário, isto é, constituindo 50 % ou mais da composição de fosfatídeo total, por causa da instabilidade e vazamento dos lipossomas resultantes.

Os fosfolipídeos podem formar uma variedade de estruturas outras que não os lipossomas quando dispersos em água, dependendo da 15 relação molar de lipídeo para água. Em relações baixas o lipossoma é a estrutura preferida. As características físicas de lipossomas dependem do pH, concentração iônica e/ou da presença de cátions bivalentes. Os lipossomas podem apresentar baixa permeabilidade às substâncias iônicas e/ou polares, mas em temperaturas elevadas sofrem uma transição de fase que 20 acentuadamente altera a sua permeabilidade. A transição de fase envolve uma mudança de uma estrutura firmemente empacotada, ordenada, conhecida como o estado de gel, para uma estrutura vagamente empacotada, menos ordenada, conhecida como o estado fluídico. Isto ocorre em uma temperatura de transição de fase característica e/ou resulta em um aumento na 25 permeabilidade para íons, açúcares e/ou medicamentos.

Os lipossomas interagem com as células por intermédio de quatro mecanismos diferentes: Endocitose pelas células fagocíticas do sistema reticuloendotelial tal como macrófagos e/ou neutrófílos; adsorção à superfície celular, pelas forças hidrofóbicas e/ou eletrostáticas fracas não específicas e/ou pelas interações específicas com os componentes da superfície celular; fusão com a membrana de célula plasmática pela inserção da bicamada lipídica do lipossoma na membrana plasmática, com a liberação simultânea dos conteúdos lipossômicos no citoplasma; e/ou pela transferência de lipídeos . 5 lipossômicos para as membranas celulares e/ou subcelulares e/ou vice versa, sem qualquer associação dos conteúdos lipossômicos. Variando a formulação de lipossoma pode-se alterar que o mecanismo seja operativo, embora mais do que um possa operar ao mesmo tempo.

A liberação e a expressão de oligonucleotídeo mediadas por 10 lipossoma de DNA estranho in vitro foi muito bem sucedida. Wong et al., (1980) demonstrou a praticabilidade da liberação e expressão mediadas por lipossoma de DNA estranho em embrião de pinto cultivado, células HeLa e de hepatoma. Nicolau et al., (1987) realizaram com sucesso a transferência de gene mediada por lipossoma em ratos depois da injeção intravenosa. 15 Em certas formas de realização da invenção, o lipídeo pode estar associado com um vírus hemaglutinador (HVJ). Isto mostrou facilitar a fusão com a membrana celular e promover a entrada da célula de DNA encapsulado em lipossoma (Kaneda et al., 1989). Em outras formas de realização, o lipídeo pode ser complexado ou utilizado em conjunção com 20 proteínas cromossômicas que não de histona nucleares (HMG-1) (Kato et al., 1991). Ainda em outras formas de realização, o lipídeo pode ser complexado ou utilizado em conjunção tanto com HVJ quanto HMG-1. Visto que tais vetores de expressão foram utilizados com sucesso na transferência e expressão de um oligonucleotídeo in vitro e in vivo, então eles são aplicáveis 25 para a presente invenção. Onde um promotor bacteriano é utilizado na construção de DNA, também será desejável incluir dentro do lipossoma uma polimerase bacteriana apropriada.

Os lipossomas usados de acordo com a presente invenção podem ser fabricados por métodos diferentes. O tamanho dos lipossomas varia dependendo o método de síntese. Um lipossoma colocado em suspensão em uma solução aquosa está no geral na forma de uma vesícula esférica, tendo uma ou mais camadas concêntricas de moléculas de bicamada lipídica. Cada camada consiste de uma série paralela de moléculas representadas pela . 5 formula XY, em que X é uma porção hidrofilica e Y é uma porção hidrofóbica. Em suspensão aquosa, as camadas concêntricas são dispostas tal que as porções hidrofilicas tendem a permanecer em contato com uma fase aquosa e as regiões hidrofóbicas tendem a se auto-associar. Por exemplo, quando as fases aquosas estão presentes tanto dentro quanto fora do 10 lipossoma, as moléculas lipídicas podem formar uma bicamada, conhecida como uma lamela, do arranjo XY-YX. Agregados de lipídeos podem se formar quando as partes hidrofílicas e hidrofóbicas de mais do que uma molécula lipídica se tomam associadas uma com a outra. O tamanho e a forma destes agregados dependerão de muitas variáveis diferentes, tais como 15 da natureza do solvente e da presença de outros compostos na solução.

Os lipossomas dentro do escopo da presente invenção podem ser preparados de acordo com técnicas de laboratório conhecidas. Em uma forma de realização preferida, os lipossomas são preparados misturando-se lipídeos lipossômicos, em um solvente em um recipiente, por exemplo, um 20 frasco de vidro, na forma de pêra. O recipiente deve ter um volume dez vezes maior do que o volume da suspensão esperada de lipossomas. Usando um evaporador rotativo, o solvente é removido a aproximadamente 40° C sob pressão negativa. O solvente normalmente é removido dentro de cerca de 5 minutos a 2 horas, dependendo do volume desejado dos lipossomas. A 25 composição pode ser secada ainda em um dessecador sob vácuo. Os lipídeos secados no geral são descartados depois de cerca de 1 semana por causa de uma tendência a deteriorar com o tempo.

Os lipídeos secos podem ser hidratados em aproximadamente 25 a 50 mM de fosfolipídeo em água estéril, isenta de pirogênio pela agitação até que toda a película de lipídeo seja recolocada em suspensão. Os lipossomas aquosos podem ser depois separados em alíquotas, cada uma colocada em um frasco, liofilizada e selada sob vácuo.

Na alternativa, os lipossomas podem ser preparados de acordo - 5 com outros procedimentos de laboratório conhecidos: o método de Bangham et al., (1965), os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência; o método de Gregoriadis, como descrito em DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979) pp. 287 a 341, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência; e o método da evaporação de fase 10 reversa como descrito por Szoka e Papahadjopoulos (1978). Os métodos anteriormente mencionados diferem em suas respectivas capacidades para aprisionar material aquoso e suas respectivas relações de espaço aquoso para lipídeo.

Os lipídeos secos ou liofilizados preparados como descrito 15 acima podem ser desidratados e reconstituídos em uma solução de peptídeo inibidor e diluídos até uma concentração apropriada com um solvente adequado, por exemplo, DPBS. A mistura é depois vigorosamente agitada em um misturador de turbilhonamento. O ácido nucléico não encapsulado é removido pela centrifugação a 29.000 x g e as pelotas lipossômicas lavadas. 20 Os lipossomas lavados são recolocados em suspensão em uma concentração de fosfolipídeo total apropriada, por exemplo, cerca de 50 a 200 mM. A quantidade de ácido nucléico encapsulado pode ser determinada de acordo com métodos padrão. Depois da determinação da quantidade de ácido nucléico encapsulado na preparação lipossômica, os lipossomas podem ser 25 diluídos até concentrações apropriadas e armazenados a 4o C até o uso.

Uma composição farmacêutica que compreenda os lipossomas usualmente incluirá um carregador ou diluente estéreis, farmaceuticamente aceitáveis tal como água ou solução salina.

IV. EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as formas de realização preferidas da invenção. Deve ser avaliado por aqueles de habilidade na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que seguem representam técnicas verificadas para funcionar bem na prática da invenção e assim podem ser consideradas constituir modos preferidos para a sua prática. Entretanto, aqueles de habilidade na técnica devem, considerando a presente divulgação, avaliar que muitas mudanças podem ser feitas nas formas de realização específicas que são divulgadas e ainda obter um resultado igual ou similar sem divergir do espírito e escopo da invenção.

Exemplo I Mutagênese In Vitro

As variantes de superantígeno diferentes foram fabricadas usando um método com base na Reação de Cadeia de Polimerase (PCR).

Em resumo, os produtos de PCR contiveram dois sítios de enzima de restrição únicos, um em cada extremidade. Para o procedimento de subclonagem, pUC19 (GIBCO BRL Life Technologies, Middlesex, U.K.) foi usado, preparado de acordo com o Protocolo do Conjunto QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN, Hilden, Alemanha). As mutações de ponto que não afetam a seqüência de aminoácido foram incluídas para facilitar ainda mais as análises. A reação de PCR foi realizada em um Gene Amp PCR system 2400 da Perkin Elmer com Taq DNA Polimerase e tampão de PCR apropriado contendo 15 mM de MgCL (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Suíça). Os produtos e vetores de PCR foram clivados durante a noite com enzimas de restrição apropriadas. Elas foram purificadas usando a eletroforese em um gel de agarose a 1 % (GIBCO BRL Life Technologies) contendo 0,5 pg/ml de Brometo de etídio (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) em tampão TAE (Sigma-Aldrich). O fragmento contendo o DNA foi excisado do gel e extraído usando o Sistema de Extração em Gel Rápido CONSERT® (GIBCO BRL Life Technologies). O vetor e o inserto foram ligados (T4 DNA ligase, Roche Molecular Biochemicals) na temperatura ambiente durante 3 a 4 horas. A mistura de ligação foi transformada na cepa DH5oc da Escherchia coli (GIBCO BRL Life Technologies) de acordo com as instruções incluídas com as células. Os clones positivos foram verificados usando o seqüenciamento de DNA. As seqüências corretas foram clivadas com RsrlI/HindIII a 37° C durante a noite e ligadas no vetor de expressão (Dohlsten et al., 1994). As partes variáveis do Fab foram trocadas para C215 para adaptar-se aos modelos de animal internos. A construção foi finalmente eletroporada na cepa K12 ULG35 da Escherchia coli (xyl-7, ara-14, T4R, ΔompT).

Exemplo 2 Identificação de regiões de ligação de anti-SEA humano

As regiões reconhecidas pelo anti-SEA humano foram identificadas a partir de uma digestão com pepsina de SEA ou de uma variante quimérica de SEA e SEE, SEA/E-18, anteriormente descrita como SEE/A-A (Antonsson et al. 1997) com a substituição D227A.

Cada superantígeno foi incubado com pepsina a 0,5 % em HC1 10 mM, NaCl 150 mM (p/p) durante 60 minutos a 37° C. A mistura de peptídeo foi neutralizada com Tris 2 M-HC1 pH 8,0 e aplicada em uma coluna HiTrap de 1 ml (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) com anti- SEA humano imobilizado. PBS, 8,1 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, pH 7,3 foi usado como tampão de lavagem e os fragmentos de ligação de anticorpo foram eluídos usando ácido acético 0,1 M pH 3,0. Os fragmentos foram identificados tanto antes quanto depois da purificação usando HPLC ligada a um espectrômetro de massa (MS) (FIG. 1). A cromatografia foi realizada em uma coluna Cl8 (2 x 250 mm) (VYDAC®, Hesperia, Califórnia, USA) usando um gradiente linear de 10 a 60 % de acetonitrila em 0,1 % de ácido trifluoroacético em 30 minutos a 40° C. A determinação de massa foi realizada usando eletropulverização MS (Finnigan LCQ, Thermoquest, San Jose, Califórnia, USA). Os fragmentos encontrados na digestão no mesmo tempo de retenção tanto antes quanto depois da purificação por afinidade foram considerados como positivos (FIG. 2).

Exemplo 3 Modelagem Molecular

O superantígeno SEA/E-18 quimérico foi fundamentado na seqüência SEE exceto para os quatro resíduos de aminoácido próximos ao término N que foram de SEA e uma substituição na parte D227A do terminal C (FIG. 3 e FIG. 4) (Antonsson et al., 1997).

Em resumo, estruturas tridimensionais de superantígenos com identidade de seqüência muito mais alta à SEE que foram disponíveis a partir do PBD foram usadas como padrões para a construção de um modelo de homologia de SEAE-18, isto é, SEA (IESF, Shard et al, 1SXT, Sundstrom et al 1996 A), SED (Sundstrom et al., 1996 B) e SEH (1ENF) (Hakansson et al., 2000). A SEA foi mais similar à SEE com uma identidade de seqüência de 80 %. A SED teve uma identidade de seqüência de 60 % e a SEH de 50 % à SEE.

A construção do modelo foi realizada usando o módulo HOMOLOGY no software INSIGHTII (MSI, San Diego). As estruturas para os três superantígenos SEA, SED e SEH foram alinhados e as regiões conservadas estruturais (SCRs) foram determinadas (FIG. 3). Estas regiões tipicamente delinearam as estruturas secundárias regulares nas moléculas. A seqüência bruta para SEA/E-18 foi carregada e enfileirada nas SCRs da estrutura SEA (FIG. 5). As coordenadas 1SXT para SEA foram usadas exceto para os nove primeiros resíduos no término N onde IESF foi usado. As regiões entre as SCRs foram na maioria dos casos áreas de laço flexíveis e foram construídas a partir da SEA e SED. A maioria dos laços foram construídos a partir da SEA exceto para os resíduos Gin 19, Ilel40, Aspl41, Lysl42, Serl89, Glyl91, Asp200, Pro206, Asp207 e Leu224, que foram construídos a partir da SED. Algumas áreas dentro das SCRs apresentaram maior similaridade de seqüência com a SED e foram portanto construídas usando a SED como padrão estrutural (Ile37, Glu49, Asn50, Thr51, Leu52, Serl95 e Thr218) (FIG. 3).

Devido ao fato de que a SEA foi usada como padrão estrutural para a maioria dos resíduos na SEA/E-18 nenhum problema com cadeias laterais em sobreposição ocorreu. Os pontos de junção antes e depois das SCRs foram reparados. Primeiro as cadeias laterais substituídas foram relaxadas e depois a minimização de energia e as simulações das dinâmicas moleculares relaxaram todas as cadeias laterais dentro das SCRs usando protocolos padrão em HOMOLOGY. As áreas de laço foram relaxadas uma de cada vez usando primeiro 1000 etapas de minimização de energia seguidas por 1000 etapas de dinâmicas moleculares. Este protocolo de refinamento foi aplicado primeiro nas cadeias laterais de laço e depois em todos os átomos no laço. Para todas as simulações o campo de força de CVFF com uma constante de força de 100 kcal/Â2 foram usadas usando uma etapa de tempo de 2 fs.

O modelo final foi testado quanto as regiões más usando o módulo PROSTAT no INSIGHTII. Nenhuma região má foi detectada. O interior da proteína empacotou bem sem nenhuma diferença significante comparada com a SEA. Todos os resíduos terminaram em regiões estreitadas em uma plotagem de ramachandran. A sobreposição de 1SXT com o modelo produziu um RMSD de 0,4 Â quando átomos de Ca foram comparados. A diferença principal entre as duas estruturas é observada no laço P9-P10 (resíduos Hisl87-Thrl93) (FIG. 5).

Novos modelos de novas variantes de superantígenos foram construídas usando o modelo SEA/E-18 como um padrão. Os resíduos de aminoácido específicos foram trocados diretamente no modelo. A conformação de cadeia lateral mais favorável foi selecionada usando uma procura de impedimento estérico simples seguido por uma minimização de energia curta.

Exemplo 4 Cultura e Purificação

As quimeras C215FabSEA/E foram expressadas como proteínas de fusão na cepa Kl2 UL635 da E. coli usando um plasmídeo com um promotor Lac UV-5 induzido por IPTG e um gene de resistência à canamicina.

Em resumo, as bactérias de solução de estoque congelada (-70°) em glicerol a 20 % foram incubadas a 25° C durante 22 a 24 horas em frascos de agitador contendo (por litro) 2,5 g de (NH4)2SO4, 3 g de KH2PO4, 2 g de K2HPO4, 0,5 g de citrato de sódio, 1 g de MgSO4.H2O, 0,05 g de canamicina, 12 g de glicose monoidratada e 1 ml de solução de elemento traço entretanto sem Na2MoO4.2H2O. As células foram cultivadas até um Abs62o de2a3el0mldo meio de cultivo foram usados para inocular um fermentador de 1 litro (Belach Bioteknik, Suécia) com um volume de partida de 800 ml. O meio do fermentador conteve (por litro) 2,5 g de (NH4)2SO4, 9 g de K2HPO4, 6 g de K2HPO4, 0,5 g de citrato de sódio, 1 g de MgSO4.7H2O, 0,05 g de canamicina, 23,1 g de glicose monoidratada e 1 ml de solução de elemento traço como acima. O pH foi mantido constante a 7,0 pela titulação de 25 % de NH3, a aeração foi de 1 litro/minuto e a temperatura 25° C. Durante a fase de lote o O2 dissolvido foi mantido a 30 % regulando-se a agitação de 400 rpm a 2000 rpm e durante o lote alimentado regulando-se a alimentação de glicose (60 % p/v). A formação de produto foi induzida quando a Absorbância a 620 nm foi 45 pela adição de 0,1 mM de isopropil- β-D-tiogalactopiranosideo (IPTG). Depois da fermentação as células foram removidas pela centrifugação a -20° C antes da purificação.

O procedimento de purificação foi dividido em três etapas. Primeiro o DNA foi removido do sobrenadante da cultura por 0,19 % de Polietilenoimina (p/v) em NaCl 0,2 M, pH 7,4, usando uma bomba peristáltica com uma taxa de fluxo de 12 ml/minutos. Depois da centrifugação ••• ••• •• •• • •• •••• •• ββ • • ♦ • •• • •• • •• -• • • 48 r 1 J :" LL”:;: a 7500 x g durante 30 minutos, o sobrenadante foi coletado.

Ele foi aplicado em uma coluna defluxo rápido de proteína-G Sepharose 4, de 60 ml (Amersham Pharmacia Biotech) com uma taxa de fluxo de 14 ml/minutos. A coluna foi lavada usando PBS e a eluição foi - 5 realizada com ácido acético a 100 mM, 0,025 % de Tween 20, pH 3,0. O produto eluído foi coletado e o pH foi ajustado a 1,5 unidade abaixo do ponto isoelétrico teórico com NaOH 1 M, filtrado (0,2 pm) e diluído quatro vezes com 0,025 % de Tween 20. As variantes degradadas foram removidas usando a cromatografia de troca iônica. A concentração iônica da amostra foi ajustada 10 para 2 mS/cm e a coluna usada foi uma SP-Sepharose-HP, Hiload 16/10 (Amersham Pharmacia Biotech). A eluição foi realizada com um fluxo de 4,0 ml/minutos durante 50 minutos usando um gradiente linear de 0 a 55 % de tampão B, 100 mM de NaAc, 400 mM de NaCI, 0,025 % de Tween 20, pH 5,0 em tampão A, 10 mM de NaAc, 0,025 % de Tween 20, pH 5,0.

15 Exemplo 5 Sororreatividade

A reatividade entre as variantes de superantígeno e o anti-SEA humano foi medida em um Ensaio de Proximidade de Cintilação (SPA).

Em uma placa de microtítulo (OptiPlate, Packard Instruments) 20 pérolas de PVT revestidas com estreptavidina, 150 pg de pérolas/reservatório (Amersham Pharmacia Biotech) foram incubadas durante 30 minutos na temperatura ambiente com fragmentos F(ab)2 conjugados com biotina de IgG anti-Camundongo, 3 pg/mg de pérolas. As pérolas foram pré incubadas com Superantígenos conjugados com C215Fab em uma série de diluição de 1:2, 25 onde a concentração final mais alta nos reservatórios foram 40 nM. Finalmente elas foram incubadas com 1 nM de anticorpos anti-SEA humanos purificados por afinidade conjugados a 125I e a quantidade de cintilação D foi medida em um Top-Counter (Packard Instruments).

A reatividade de anti-SEA humano para as variantes de superantígeno também foi medida em um Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima, ELISA (Cavallin et al., 2000). Os resultados foram similares àqueles obtidos na SPA.

Exemplo 6 Função Biológica

A capacidade para induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpo de superantígeno, SADCC e citotoxicidade celular dependente de superantígeno, SDCC foi comparada em um ensaio de liberação de 51 Cr de 4 horas padrão.

Em resumo, os alvos que foram usados para a SDCC foram as células Raji de linfoma de célula B humano e os alvos para SADCC foram as células Colo205 de carcinoma colorretal humano. As células foram rotuladas com 51 Cr e diluídas até uma concentração de 50000 células/ml nos reservatórios de microtítulo na forma de V. Como células efetoras, uma linha de célula T humana reativa em SEA foi usada em um efetor para relação alvo de 45:1 para a SADCC e 30:1 para a SDCC. Variantes Sag foram adicionadas em concentrações de 10’9 a 10-16 M para a SADCC e de 10'7 a 10‘14 M para a SDCC. Os sobrenadantes foram coletados e a liberação de 51 Cr foi medida em um TopCount (Packard Instruments). A porcentagem de citotoxicidade específica foi calculada como 100 x [(cpm da liberação experimental - cpm de liberação de fundo)/(cpm de liberação total - cpm de liberação de fundo)].

Exemplo 7 Identificação de epítopos de anticorpo

Nos pacientes, os anticorpos pré existentes contra os superantígenos complicaram a sua aplicação clínica, requerendo ajuste da sua dosagem na terapia (Alpaugh et al., 1998). Um outro método para limitar o impacto de anticorpos pré formados foi modificar a região do superantígeno responsável pela ligação do receptor de célula T (Antonsson, et al., 1997). Entretanto, a presente invenção tem ainda melhorado o potencial terapêutico dos superantígenos pelo uso da engenharia genética para remover os epítopos de anticorpo do superantígeno.

Verificou-se que a SEE demonstrou uma redução forte na reatividade de anticorpo comparada com a SEA (Antonsson et al., 1997). - 5 Infelizmente, com esta redução também houve uma diminuição acentuada nas propriedades de matar tumor quando fundida a um Fab reativo em tumor (Antonsson et al., 1997). Portanto construções quiméricas de SEA e SEE foram investigadas. Quando da introdução dos aminoácidos correspondentes da SEA em quatro posições na região de ligação do TCR da SEE, as 10 propriedades desejadas foram obtidas. Estas substituições; Arg20Gly, Asn21Thr, Ser24Gly e Arg27Lys (região A) na SEE, resultaram na quimera SEA/E-18 (FIG. 4) (Antonsson et al., 1997). Esta quimera demonstrou mais do que uma redução de 50 % na reatividade de anticorpo, como na SEE, enquanto retém o nível eficiente de citotoxicidade, como na SEA. 15 Adicionalmente, para diminuir a afinidade entre o superantígeno e o MHC de classe II, que reduz a SDCC e deste modo melhora a janela terapêutica, a SEA/E-18 também contêm a substituição Asp227Ala (Abrahmsén et al., 1995). Para diminuir ainda mais a capacidade do anti-SEA humano 20 para reconhecer a SEA/E-18, os epítopos de ligação de anticorpo dentro dos superantígenos foram determinados. Peptídeo/fragmentos de uma digestão com pepsina parcial de SEAwt ou SEA/E-18 foram capturados usando anticorpos anti-SEA imobilizados. Depois da purificação, as seqüências de peptídeo foram identificadas usando LC-MS (FIG. 1). Deste modo as áreas 25 potenciais envolvidas no reconhecimento de anticorpo foram localizadas na seqüência de aminoácido. Notavelmente, a maioria dos peptídeos recuperados estavam localizados em tomo das regiões conhecidas por serem interativas com MHC de classe II (Abrahmsén et al.., 1995) (FIG. 2 e FIG. 6). A estrutura tridimensional de SEA (Schad et al., 1995; Sundstrõm et al., 1996) e um modelo de computador de SEA/E-18 (FIG. 5), com base na estrutura cristalina de SEA (Schad et al., 1995; Sundstrom et al., 1996 A), foi usado para localizar os resíduos expostos na superfície dentro dos peptídeos identificados. Os seguintes resíduos foram identificados como expostos e - 5 candidatos potenciais nos epítopos de ligação de anticorpo: Glu34, Lys35, Glu39, Asn40, Lys41, Glu42, Asp44, Asp45, Glu49, Lys74, Asp75, Asn78, Lys79, Lys81, Lys83, Lys84, Aspl73, Hisl87, Serl89, Glul90, Gln204, Lys217, Asn220, Glu222, Asn223, His225 e Asp227 (Tabela 1).

Estes resíduos foram subseqüentemente substituídos para 10 reduzir a ligação aos anticorpos. Novos modelos de computador com variantes de SAg ainda mais melhoradas foram continuamente fabricadas para confirmar e comparar os resultados adquiridos com o último. Especificamente a influência das cadeias laterais foi estudada e as mudanças que afetam a estabilidade da proteína foram identificadas.

15 Exemplo 8 Modificação do Superantígeno para reduzir a Sororreatividade

Os níveis de ligação de anticorpo dos resíduos identificados foram caracterizados inicialmente por duas a seis substituições simultâneas na SEA/E-18. Desse modo as variantes de SAg SRAJE-62 (Lys217Thr, '20 Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala„ His225Ala) (região E), SEA/E-63 (Serl89Asp, Glul90Ala) (região D), SEA/E-64 (Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys) (região B), SEA/E-65 (Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Glu, Lys84Glu) (região C), SEA/E-74 (Asp44Ala, Asp45Ala, Glu49Thr) (região B) e SEA/E-75 (Lys74Thr, 25 Asp75Ala, Asn78Ser) (região C) foram obtidas (Tabela 1, FIG. 4).

Para investigar se os anticorpos anti-SEA de uma reunião de IgG humana poderia reconhecer as variantes de Sag diferentes, um Ensaio de Proximidade de Cintilação (SPA) foi desenvolvido. As variantes modificadas foram todas reconhecidas em um grau mais baixo comparado com a

SEA/E-18 (Tabela 1). A redução mais substancial na ligação foi causada pelas substituições feitas na SEA/E-65. Na análise de SPA, uma redução com mais do que 40 % foi observada (FIG. 7). Entretanto, muitas substituições também geraram uma redução no nível de produção da E. coli e além disso, a - 5 atividade biológica foi também ocasionalmente diminuída. Pela inspeção das substituições pude-se identificar os resíduos responsáveis dentro de cada variante e excluí-los ou modificá-los para se obter propriedades melhores. No geral, o nível de produção foi aumentado pelas substituições hidrofílicas comparadas com as mais hidrofóbicas. 10 A redução na ligação de anticorpo foi sinergisticamente aumentada quando as variantes foram combinadas, como na SEA/E-91 composta de SEA/E-63, SEA/E-65 e uma SEA/E-74 modificada (com Asp45 do tipo selvagem) (Tabela 1). A variante com o resultado mais destacado na análise de SPA com uma redução de ligação de quase 70 % comparada com a 15 SEA/E-18 foi a SEA/E-110, uma combinação de SEA/E-63, SEA/E-75 e SRA/E-62 (SEA/E-97), SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) e SEA/E-74 (Asp45 do tipo selvagem) modificadas (FIG. 7, tabela 1). As modificações responsáveis pela maior parte das reduções na ligação de anticorpo foram dentro da SEA/E-109 (Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, ' 20 Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49Thr, Lys74Thr, Asp75Ala, Asn78Ser, Lys79Glu, Lys81Glu, Lys83Ser, Lys84Ser) uma combinação de SEA/E-75 e SEA/E-64 (SEA/E-108), SEA/E-65 (SEA/E-84) e SEA/E-74 (Asp45 do tipo selvagem) modificadas. Isto é porque as variantes de superantígeno, contendo aquelas substituições, todas demonstraram uma boa redução na análise de 25 SPA.

Assim, os resíduos substituídos na SEA/E-62, SEA/E64, SEA/E-6S e SEA/E-74 resultaram entre 20 e 40 % de redução na reatividade de anticorpo, comparadas com a SEA/E-18 (Tabela 1). Tabela 1

Exemplo 9 * Substituições que afetam os níveis de produção

Como indicado acima, algumas das substituições na superfície do superantígeno resultaram em níveis diminuídos de produção na E. coli. ■ 5 Muitas combinações de tais substituições ainda não foram possíveis de produzir. Portanto, foi decidido investigar modificações alternativas destes resíduos que evidentemente causam uma redução no rendimento. As substituições que afetaram a rendimento sem diminuir a ligação aos anticorpos não foram ainda investigadas. Ao invés os resíduos do tipo 10 selvagem foram usados.

No conjunto inicial de variantes de superantígeno, o resíduo Lys35 na SEA/E-64 afetou o nível de expressão negativamente. Quando do uso do resíduo do tipo selvagem na posição 35 junto com substituições de serina de Glu34 e Glu39, resultando na variante SAg SEA/E-108, houve um 15 aumento no rendimento de 23 mg/litro para 30 mg/litro. A redução na reatividade de anticorpo foi entretanto mantida. Quando da introdução das substituições de ácido glutâmico dos resíduos Lys79, Lys81, Lys83 e Lys84 em SEA/E-65, isto resultou em um nível de produção de apenas 1,5 mg/litro. Devido ao fato de que o efeito na reatividade de anticorpo foi diminuída em 20 43 % comparada ao SEA/E-18, esforço foi feito para identificar substituições melhores. A melhor combinação, com respeito tanto ao rendimento quanto à reatividade de anticorpo reduzida, verificou-se ser a SEA/E-84 com resíduos de serina na posição 83 e 84 e ácido glutâmico preservado nas posições 79 e 81 (Tabela 1). O nível de produção foi aumentado dez vezes e a reatividade 25 de anticorpo foi reduzida em 41 % comparada com SEA/E-18 (Tabela 1). O nível de produção foi aumentado dez vezes e a reatividade de anticorpo foi reduzida em 41 % comparada com SEA/E-18 (Tabela 1). O nível de produção também foi diminuído mais do que dez vezes com as substituições Lys217Thr, Asn220Ala, Glu222Thr, Asn223Ala, His225Ala e Asp227Ala em SEA/E-62, para 1,0 mg/1. Entretanto, substituindo-se as substituições de alanina no lugar dos resíduos de serina, resultando em SEA/E-97, rendimentos de produção de 48 mg/ml foram obtidos (Tabela 1).

De modo interessante, quando da combinação de SEA/E-65 - 5 com mais variantes, tais como SEA/E-63 e SEA/R-74 modificada, como em SEA/E-91, o nível de produção baixo foi revertido para 12 mg/litro (Tabela 1). Por outro lado houve apenas um nível de expressão de variante de superantígeno SEA/E-110 de 0,5 mg/litro e 14 mg/litro, respectivamente. O nível de produção de SEA/E-110 foi entretanto aumentado para 30 mg/litro 10 quando da remoção das substituições Aspl74Ala, His87Ala, Serl88Thr, Serl89Asp, Glul90Ala e Gln204TAhr criando SEA(E-120 (Tabela 1).

A introdução de um número grande de substituições dentro do superantígeno pode levar a problemas com a expressão de E. coli. Existem pelo menos três mecanismos diferentes para isto; termodinâmica diminuída, 15 caminho de dobra natural destruído ou sítios proteolíticos recém introduzidos.

Posto que a intenção com este estudo foi remover epítopos antigênicos na superfície, que mais provavelmente não interferiria com nenhuma das espinhas dorsais estruturais principais, houve sempre uma possibilidade de que as novas estruturas fossem dependentes de outros resíduos além da 20 construção do tipo selvagem para manter a sua estabilidade. Portanto, novos modelos de computador foram constantemente fabricados para prognosticar ou confirmar a localização dos resíduos substituídos dentro da nova estrutura. Deste modo pude-se identificar os resíduos responsáveis dentro das variantes de superantígeno precoces que causam problemas por exemplo com os níveis 25 de expressão e realizam variantes melhoradas com resíduos do tipo selvagem ou substituições melhores (Tabela 1).

Em conclusão, para realizar um nível melhor de produção, os seguintes resíduos Lys83, Lys84, Asn220, Asn223, His225 e Asp227 devem ser substituídos com serina, não alanina. Adicionalmente, para evitar uma redução nos níveis de expressão, os resíduos Lys35, Aspl73, hisl87, Serl88, Serl89, Glul90 e Gln204 devem ser conservados.

Exemplo 10

Avaliação da função biológica dentro das variantes Sac diferentes » 5 Porque os superantígenos foram primariamente planejados para a terapia de tumor (Dohlsten et al., 1994), foi importante evitar substituições que diminuam a citotoxicidade direcionada a tumor dentro das novas variantes de superantígeno. A capacidade para mediar esta citotoxicidade direcionada a tumor foi portanto medida para todos as novas 10 variantes de superantígeno em um ensaio SADCC (Fig. 3). Além disso, a eficiência de superantígenos para mediar a morte de célula T de células que expressam o MHC da classe II na citotoxicidade sistêmica que pode causar efeitos colaterais medidos em um ensaio de SDCC (FIG. 3). Para o uso clínico, o SDCC deve ser mais provavelmente baixo para aumentar a janela 15 terapêutica.

A maior parte do conjunto inicial de variantes SAg teve o mesmo nível de potência citotóxica específica de tumor como SEA/ E-18 (Tabela 1). As exceções foram SEA/E-75 com as substituições Lys74Thr, Asp75Ala e Asn78Ser que foi diminuída dez vezes e SEA/E-64, com as 20 substituições Glu34Lys, Lys35Glu, Glu39Lys, Asn40Ser, Lys41Glu e Glu42Lys, que foi diminuída cinco vezes comparada com SEA/E-18 (Tabela 1). De modo interessante, a atividade diminuída em SEA/E-75 foi apenas observada nesta variante, em combinação com outras substituições por exemplo em SEA/E-109 a atividade completa foi detectada (tabela 1). Além 25 disso, a atividade de SDCC foi inalterada em SEA/E-75 comparada com SEA/E-18. As substituições Lys74Thr, Asp75Ala e Asn78Ser foram portanto prováveis de perturbar as interações importantes para a citotoxicidade dependente de anticorpo sozinhas.

A maioria das variantes de superantígeno aqui descrita apresentou uma redução clara em SDCC. Uma diminuição leve na atividade de SDCC foi observada para as variantes iniciais SEA/E-62, SEA/E-63, SEA/E-64, SEA/E-65 e SEA/E-74 em comparação com SEA/E-18.

Todos as variantes de superantígeno contiveram os resíduos - 5 Asp227Ala ou Ser substituídos. Esta substituição foi conhecida reduzir a afinidade ao MHC de classe II 100 vezes e desse modo a atividade de SDCC (Abrahmsén et al., 1995). Entretanto, visto que a variante SAg de SEA/E-109, com as substituições no terminal N, apresentaram uma diminuição maior comparada com a SEA/E-18 do que a SEA/E-113, com as substituições de 10 terminal C, isto indicou que dentro da SEA/E-109 resíduos, adicionais foram trocados que são importantes para a SDCC e mais provavelmente se ligam ao MHC de classe II (FIG. 8).

Assim, os resíduos que causaram a maior redução foram Lys79Ser e Lys81Ser na SEA/E-83 e a substituição Asp45Ala na SEA/E-74. 15 A maior parte destas substituições estão localizadas em tomo dos resíduos que mostraram anteriormente interagir com o MHC de classe II (Abrahmsén et al., 1995).

Exemplo 11

Planejamento de uma nova variante de superantígeno 20 De modo a planejar a variante de superantígeno ótima, todas as substituições favoráveis foram combinadas levando à SEA/E-120 superior (FIG.4 e FIG 9).

Primeiro, todas as modificações favoráveis no término C isto é, os resíduos Aspl73Ala, Serl89Thr, Glul90Ala, Lys217Thr, Asn220Ser, 25 Glu222Thr, Asn223Ser, His225Ser e Asp227Ser juntas com Gln204Thr foram montadas formando a variante de SAg SEA/E-113. Esta variante exibiu a redução esperada na reatividade anti-SEA e níveis aceitáveis de expressão mas com uma atividade biológica um tanto diminuída (Tabela 1, FIG. 7 e FIG. BA e FIG. 8B). Todas as substituições favoráveis no terminal N isto é, os resíduos Glu34Ser, Glu39Ser, Asn40Ser, Lys41Glu, Glu42Lys, Asp44Ala, Glu49T, Lys74T, Asn78Ser, Lys79Glu, LysδlGlu, Lys83Ser e Lys84Ser foram montadas na SEA/E-109. Uma diminuição extraordinária na reatividade anti-SEA foi observada para esta variante de superantígeno junto - 5 com um nível alto de expressão e ainda perfil biológico melhorado (Tabela 1, FIG. 7 e FIG. 8A e FIG. 8B). Entretanto, quando da criação da combinação destas duas variantes SEA/E-113 e SEA/B-109 na SEA/E-110, houve uma perda dramática tanto do rendimento quanto da função biológica (Tabela 1). A potência biológica foi completamente recuperada quando os resíduos do 10 Ser 189, Glul90 e Gln204 tipo selvagem foram usados mais uma vez na

SEA/E-115 (Tabela 1), mas os níveis de produção estavam ainda em um nível baixo. A modelagem molecular desta variante sugeriu que os resíduos Aspl73, Hisl87 e Serl88, seriam importantes para a estabilização da dobra e subsequentemente resultando em rendimentos mais altos. 15 Diversas combinações diferentes foram fabricadas para avaliar estes resíduos, que resultam na SEA/E-118, SEA/E-119, SEA/E-120, SEA/E-121 e SEA/E-122 (Tabela 1). A melhor produção foi obtida com SEA/E-120 com resíduos do tipo selvagem em todas as três posições. Junto com as SEA/E-21, SEA/E-74, SEA/E-97, SEA/E-108 e SEA/E-109 20 antigamente fabricadas, estas foram as únicas variantes de SAg que atingem níveis de expressão de mais do que 20 mg/litro (Tabela 1). Nenhuma diferença significante com respeito á atividade biológica ou reatividade de anticorpo foram observadas entre as variantes.

Planejamento de um novo conjugado

A SEA/R-120 foi geneticamente fundida com a porção Fab do anticorpo reativo em tumor isto é ST4 (Dohlsten et al., 1994) (FIG. 10). O antígeno de 5T4 é expressado em uma variedade tumores diferentes, tais como câncer pulmonar de célula não pequena, câncer de mama, câncer de célula renal, câncer pancreático, câncer ovariano e câncer de cólon. As substituições na seqüência do tipo selvagem de 5T4 também foram * feitas para realizar rendimentos mais altos. Na cadeia pesada; His41Pro, Ser44Gly, Ile69Thr e Valll3Gly e na cadeia leve; PhelOSer, Thr45Lys, Ile63Ser, Phe73Leu, Thr77Ser, Leu78Val e Leu83Ala. . 5 Embora a presente invenção e suas vantagens tenham sido descritas em detalhes, deve ser entendido que várias mudanças, substituições e alterações podem ser feitas nela sem divergir do espírito e do escopo da invenção como definido pelas reivindicações anexas. Além disso, o escopo do presente pedido não é intencionado a ser limitado pelas formas de realização 10 particulares do processo, máquina, fabricação, composição de matéria, meios, métodos e etapas descritos no relatório descritivo. Como uma pessoa de habilidade comum na técnica facilmente avaliará a partir da divulgação da presente invenção, os processos, máquinas, fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas, presentemente existentes ou a serem 15 posteriormente desenvolvidos que executam substancialmente a mesma função ou obtêm substancialmente o mesmo resultado como as formas de realização correspondentes aqui descritas podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Conseqüentemente, as reivindicações anexas são intencionadas a incluírem dentro do seu escopo tais processos, máquinas, 20 fabricação, composições de matéria, meios, métodos ou etapas.

Uma pessoa de habilidade na técnica facilmente avaliará que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter as finalidades e vantagens mencionadas assim como aquelas aqui inerentes. As composições, métodos, procedimentos e técnicas aqui descritas são 25 presentemente representativas das formas de realização preferidas e são intencionados a serem exemplares e não são intencionados como limitações do escopo. Mudanças nesse sentido e outros usos ocorrerão àqueles habilitados na técnica as quais são abrangidas dentro do espírito da invenção ou definidas pelo escopo das reivindicações pendentes.  REFERENCIAS CITADAS Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas do nível daqueles habilitados na técnica à qual a invenção pertence. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas por 5 referência no mesmo grau como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência. Patente U.S. 4.554.101 Patente U.S. 5.221.605 Patente U.S. 5.238.808 10 Patente U.S. 5.798.208 Patente U.S. 5.830.650 Patente U.S. 5.220.007 Patente U.S. 5.284.760 Patente U.S. 5.354.670 15 Patente U.S. 5.366.878 Patente U.S. 5.389.514 Patente U.S. 5.635.377 Patente U.S. 5.789.166 Patente U.S. 5.446.128 20 Patente U.S. 5.710.245 Patente U.S. 5.840.833 Patente U.S. 5.859.184 Patente U.S. 5.440.013 Patente U.S. 5.618.914 25 Patente U.S. 5.670.155 Patente U.S. 5.475.085 Patente U.S. 5.929.237 Patente U.S. 5.672.681 Patente U.S. 5.674.976 6:- .LU.::: Patente U.S. 4.608.251 Patente U.S. 4.601.903 Patente U.S. 4.599.231 Patente U.S. 4.599.230 v 5 Patente U.S. 4.596.792 Patente U.S. 4.578.770 Abrahmsén L., et al. EMBO J. 14: 2978-86, 1995. Alpaugh R. K., et al. Clin Cancer Res. 4: 1903 a 1914, 1998. Antonsson P., et al. J. Immunol 158: 4245 a 4251, 1997. • 10 Bangham et al., J.. Mol. Biol., 13: 238 a 252, 19GS. Bird et al., Science. 242: 423 a 426, 1988. Braisted et al, Proc Natl Acad Sci USA. 93(12): 5688 a 5692, 1996. Burks et al., proc Natl Acad Sci USA. 94(2): 412 a 417, 15 1997. Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425, 1977. Cavallin A., et al. J Biol Chem. 275: 1665 a 1672, 2000. Cunningham et al., Science. 244(4908): 1081 a 1085, 1989. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986 W 20 Dohlsten M., et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91: 8945 a 8949, 1994. DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND MEDICINE, G. Gregoriadis ed. (1979) pp. 287 a 341. Hakansson, M. et al. J Mol Biol. 302: 527 a 537, 2000. 25 Harlow, et al. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988. Johannesson et al., J. Med. Chem. 42: 601 a 608, 1999. Kaneda et al., J Biol Chem., 264(21): 12126 a 12129, 1989. Kato et al., J Biol Chem., 266(6): 3361 a 3364, 1991. Nicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176, 1987. A Papageorgiou A. C. et al. Trends in Microbiology 8: 369 a • 375, 2000. • Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15a Edição, Capítulo 61, páginas 1035 a 1038 e 1570 a 1580. • 5 Sambrook et al., em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., 1989. SchadE. M., et al. EMBO J. 14: 3292 a 3301, 1995. Short et al., J Biol Chem. 270(48): 28541 a 28550, 1995. Sundstrom M, et al. EMBO J. 15: 6832 a 6840, 1996 A. B 10 Sundstrom M., et al. J. Biol Chem 271: 32212 a 32216, 1996 B. Szoka e Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 4194 a 4198, 1978. Vita et al., Biopolimers 47: 93 a 100, 1998. 15 Warren et al., Biochemistry 35(27): 8855 a 8862, 1996. Weisshoff etal., Eur. J. Biochem. 259: 776 a 788, 1999. Wells etal., Methods. 10(1): 126 a 134, 1996. Wong et al., Gene, 10: 87 a 94, 1980. Yelton et al., J Imunol. 155(4): 1994 a 2004, 1995.

Claims (11)

1. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um superantígeno bacteriano e uma porção de anticorpo, em que o superantígeno é a enterotoxina estafílocócica E (SEE), na qual a sequência de aminoácidos do superantígeno compreende as regiões de A a E, cuja região A está dentro do sítio de ligação do TCR e determina a ligação ao TCR e as regiões de B a E determinam a ligação às moléculas de MHC da Classe II, em que as seguintes substituições de resíduos de aminoácido foram introduzidas na região C: K79E, K81E, K83S, K84S, e em que as seguintes substituições de resíduos de aminoácido foram introduzidas na região A: R20G, N21T, S24G, R27K, e em que opcionalmente também os aminoácidos na posição 173 e/ou posição 204 na região A foi/foram substituído(s), e em que a substituição D227S (ou A) na região E foi introduzida, e em que que um ou mais dos resíduos de aminoácido nas posições 34, 35, 39, 40, 41, 42, 44, 45 e 49 da região B e/ou nas posições 74, 75, 78 da região C e/ou nas posições 187, 188, 189, 190 da região D e/ou na posição 217, 220, 222, 223, 225 da região E foram substituídos, tal que o superantígeno substituído tenha sororreatividade reduzida comparada com o superantígeno a partir do qual ele foi derivado, e em que a porção de anticorpo é um anticorpo de comprimento completo ou qualquer outro fragmento ativo do anticorpo de ligação de antígeno, que esteja direcionado contra uma estrutura de superfície celular associada a câncer.

2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o superantígeno tem a seqüência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 2 {SEA/E-120}.

3. Conjugado de acordo com qualquer uma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a porção de anticorpo é um fragmento Fab.

4. Conjugado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a porção de anticorpo é C215Fab.

5. Conjugado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a porção de anticorpo é 5T4Fab.

6. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 1.

7. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para o uso no tratamento de câncer.

8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste de câncer pulmonar, mamário, colônico, renal, pancreático, ovariano, estomacal, cervical e prostático.

9. Uso de um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para tratar câncer.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para a administração intravenosa.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende, como ingrediente ativo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

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