BRPI0301159B1 - Solução protetora para prevenção de danos isquêmicos, e seu processo de preparação - Google Patents

Abstract

"solução protetora para prevenção de danos isquêmicos". a presente invenção refere-se a uma solução protetora para evitar danos isquêmicos em órgãos, ou em sistemas celulares isolados, ou partes de tecidos após perfusão, operação, transplante, ou crioconservação e em seguida reperfusão, que contém como eletrólitos íons alcalinos, opcionalmente também íons alcalino-terrosos, uma solução tampão, assim como poliol e/ou um açúcar, que apresenta uma osmolaridade de cerca de 290 mosm/l até cerca de 250 mosm/l, assim como um valor de ph de cerca de 6,8 até cerca de 7,4, e são adicionados o ácido hidroxâmico, e/ou um ou mais derivados de ácido hidroxâmico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SOLUÇÃO PROTETORA PARA PREVENÇÃO DE DANOS ISQUÊMICOS, E SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO". A presente invenção refere-se a uma composição aperfeiçoada de soluções para proteção de órgãos, de preferência coração, pulmão, fígado, pâncreas e sistemas vasculares, para poder realizar operações opcionalmente de longa duração em órgãos isquêmicos com deficiência de suprimento sangüíneo, para conservação do mesmo órgão de transplante com reduzido dano ao tecido perante outros processos de conservação durante o tempo de transporte, a saber, o tempo de armazenamento, ou reperfusão de órgãos isquêmicos. A presente invenção coloca à disposição para tanto soluções apropriadas assim como processo para sua preparação segundo as exigências das linhas gerais GMP.

Com a implantação da cessação súbita da função de bombeamen-to do coração hipercalêmica por Melrose no ano de 1955, os cirurgiões cardíacos puderam realizar intervenções complexas em corações pobres em sangue e não pulsantes. Embora com as soluções cardioplégicas daquela época pudessem ser feitas operações apenas de até 40 minutos, foram possíveis as primeiras operações reconstrutoras de má-formações cardíacas em recém-nascidos e o emprego de próteses de válvulas cardíacas. Um marco da cirurgia cardíaca foi Barnard em 1967, com o primeiro transplante de coração. O alvo da pesquisa posterior consistiu em prolongar o tempo de operação até aqui limitado por soluções apropriadas e o respectivo processo de emprego. Já nos anos 60 o grupo de trabalho de Bretschneider com novos conceitos para aperfeiçoamento da proteção miocárdia pode prolongar consideravelmente os tempos de isquemia. Pela primeira vez induz-se a cessação súbita da função de bombeamento do coração por extração de sódio, e com substratos, como por exemplo procaína, acetilcolina e novocaí-na, a membrana celular é protegida, para agir contra o surgimento de um edema intracelular.

Na patente européia 12272 é descrita uma solução protetora para coração, rins e outros órgãos, que é caracterizada por um sistema tampão à base de histidina + histidina HCI e que além disso contém íons sódio, potássio e magnésio, assim como um poliol ou um açúcar. Com essa solução protetora obtém-se o tempo de isquemia tolerável em torno do fator 8 em relação aos tempos dos corações não-tratados. Um aperfeiçoamento dessa solução é descrito no pedido de patente europeu 54635, segundo o qual através da adição de α-cetoglutarato, da troca aeróbica de material durante cerca de 8 até 10 minutos de perfusão contínua do órgão com a solução protetora, reduz-se a perda de ATP (trifosfato de adenosina) através da atuação favorável do ciclo de citrato. Nos anos que se seguiram a isto, a atenção dos clínicos e fisiólogos dirigiu-se à fase de tempo do término da isquemia que é finalizada com o aquecimento dos órgãos hipotérmi-cos e hipóxidos e da reperfusão com sangue, na qual os órgãos recobram sua função total. Estudos aqui mostram que logo na denominada fase de reperfusão ocorrem diversos processos patofisiológicos que são resumidos no conceito de danos de reperfusão (Danos l-R). Assim, tem-se sobretudo danos das células endoteliais que são sintetizados em parte como causa, em parte como consequência de processos inflamatórios, e em cuja patogê-nese espécies reativas a oxigênio parecem ser importantes. Nos últimos anos, comprovou-se que o próprio frio empregado para proteção dos órgãos era um fator de dano; nenhuma das soluções de conservação empregadas naquele tempo podiam oferecer uma proteção contra esse dano. É propósito da presente invenção impedir ou evitar as seguintes etapas patofisiológicas durante a isquemia e a reperfusão: . danos isquêmicos . danos produzidos por frio (apoptose induzida por frio) . danos de reperfusão . processos inflamatórios.

Para tanto, na reivindicação 1 da patente, ou alternativamente na reivindicação 8 da patente, em cada uma delas é indicada uma solução protetora de órgão, que serve para satisfazer a tarefa mencionada. A partir dos mecanismos apresentados dos danos à célula e ao tecido na cardiople-gia e na conservação de órgão, dá-se uma série de exigências para a com- posição de uma solução protetora de órgão. Para a realização dessas exigências descobriu-se substâncias que permitem a concepção das novas soluções protetoras de órgãos efetivamente eficazes de acordo com as reivindicações 1 e/ou 8. A composição da solução é escolhida de tal forma que ela oferece, sobretudo contra os mencionados componentes de danos, uma proteção eficaz. Através dos componentes orientados para o mecanismo e não tóxicos pode ser visivelmente reduzido o dano de conservação. A toxi-dez das soluções de conservação até agora empregadas no aquecimento (acidental ou que ocorre durante o tempo de anastomosição) do órgão é evitada. Deste modo a funcionalidade e viabilidade dos respectivos tecidos dos órgãos é aperfeiçoada e a tolerância a isquemia e armazenamento no frio é aumentada; assim, são possíveis tempos de conservação de órgãos maiores. Isto também pode fornecer uma contribuição para a logística, aperfeiçoando a disponibilidade de órgãos para transplante.

Apresenta-se como vantajoso o emprego de um derivado de ácido hidroxâmico, pelo qual o átomo de hidrogênio no nitrogênio de ácido hidroxâmico é substituído por alquila, arila ou alquilarila com Ci até C2o- Além disso, aconselha-se no derivado de ácido hidroxâmico o átomo de hidrogênio no carbono de ácido hidroxâmico substituído por alquila, arila, ou alquilarila com Ciaté C20, sendo que esse substituinte também pode conter heteroátomos e/ou grupos hidróxi, grupos amino e grupos metóxi.

Também é favorável quando os substituintes no nitrogênio de ácido hidroxâmico são fechados em um anel com os substituintes no carbono hidroxama.

Para a invenção aconselha-se um ou mais dos compostos e/ou seus sais dos grupos ácido acetohidroxâmico, ácido aceto-N-metilhidroxâmico, ácido N-benzilacetohidroxâmico, ácido hexanohidroxâmico, ácido hexano-N-metilhidroxâmico, ácido benzohidroxâmico, ácido N-metilbenzohidroxâmico; ácido salicilhidroxâmico, ácido salicil-N-metilhidroxâmico, ácido salicil-N-benzilhidroxâmico, ácido 2-fenilacetohidroxâmico, ácido 2-fenilaceto-N-metilhidroxâmico, ácido 3,4-dimetoxibenzohidroxâmico, ácido 3,4-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 2,3-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 2,4-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 3,5-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 2,4-dihidroxibenzohidroxâmico, ácido 2,3-dihidroxibenzohidroxâmico, ácido 3,4-dihidroxibenzohidroxâmico, ácido 3,4,5-trimetóxi-benzohidroxâmico, ácido 3,4,5-trimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 4-hidróxi-3-metóxi-benzohidroxâmico, ácido 2-hidróxi-3-metóxi-benzohidroxâmico, ácido 2-hidróxi-5-metóxi-benzohidroxâmico, 2-hidróxi-3-metil-isocarbostirila ácido 4-cloro-N-metil-benzohidroxâmico, 6-ciclohexi-1 -hidróxi-4-metil-2(1 H)-piridona.

Além disso, interessa uma adição de deferoxamina com a vantagem de que aconselha-se uma concentração de deferoxamina de até 10 mmoles/l. É aconselhável uma adição de um derivado do ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico ou do respectivo metiléster. É oportuna a solução tampão à base de N-acetilhistidina, particularmente à base de histidina N-acilada, opcionalmente em combinação com uma base orgânica apropriada, por exemplo cloridrato de N-glicilhistidina/N-glicilhistidina ou da N-acetilhisdirina/lisina e/ou arginina e/ou colina.

Vantajosamente a solução contém um teor de cátions de lisina e/ou derivado de lisina, de preferência dipeptídeo contendo lisina, assim como opcionalmente um teor de ânions de aspartato.

Oportunamente o ácido hidroxâmico e/ou seus derivados está em uma concentração de até cerca de 10 mmoles/l na solução.

Também é favorável quando o trolox está contido em uma concentração de até cerca de 10 mmoles/l na solução.

Vantajosamente a N-acetilhistidina/N-acetohistidina está em uma concentração de cerca de 20 mmoles/l até cerca de 265 mmoles/l.

Aconselha-se, além disso, prever na solução, como eletrólito, sódio oportunamente em uma concentração de cerca de 10 mmoles/l até cerca de 120 mmoles/l. Alternativamente, ou completando-se, potássio pode oportunamente estar contido em uma concentração de cerca de 5 mmoles/l até cerca de 25 mmoles/l.

Além disso, magnésio pode estar contido oportunamente em uma concentração de cerca de 3 mmoles/l até cerca de 27 mmoles/l.

Finalmente, cálcio está vantajosamente contido em uma concentração livre de oportunamente cerca de 0,0001 mmoles/l até cerca de 1,5 mmoles/l.

Particularmente aconselhável é lisina e/ou seus derivados, de preferência como um dipeptídeo contendo lisina, oportunamente em uma concentração até cerca de 140 mmoles/l.

Um teor de aspartato é vantajoso em uma concentração de até cerca de 140 mmoles/l na solução. A menos que cloreto esteja contido na solução, aconselha-se prever aspartato em excesso em relação a cloreto.

Também foi comprovado um teor de α-cetoglutarato oportunamente em uma concentração de cerca de 1 mmoles/l até cerca de 9 mmoles/l.

Vantajosamente osmolit está oportunamente contido em uma concentração de até cerca de 140 mmoles/l na solução.

Para preparação de uma solução segundo uma das reivindicações anteriores aconselha-se um processo pelo qual dissolve-se, sob agitação, os eletrólitos em um excesso de água, oportunamente em cerca de 90% da quantidade necessária de água, em seguida adiciona-se a solução tampão e os ácidos hidroxâmicos e/ou seus derivados, então ajusta-se o valor do pH, adiciona-se o osmólito ou os osmólitos, e a solução é preenchida no volume nominal com água.

Para obtenção do ácido hidroxâmico e/ou seus derivados podem ser oportunamente empregados, como solvente, álcoois baixos e/ou DMF e/ou THF. O processo molda-se particularmente favoravelmente, quando a conversão é realizada com um éster de ácido carboxílico catalisado por base. A invenção particularmente segundo a reivindicação 5 da patente pode ser empregada para atenuação ou prevenção de danos de re-perfusão após infarte cardíaco, ataque de apoplexia, ataques de acidentes cirúrgicos ou reperfusão das extremidades. Além disso, aconselha-se seu emprego na terapia de doenças que têm como causa uma hiperferremia (por exemplo, Alzheimer), em um dano celular por radicais, radicais oxigênio ou h2o2.

Queladores de ferro podem servir para inibição do dano de frio dependente de ferro ou da apoptose induzida por frio. Como compostos para se evitar esses danos celulares não é apropriado todo formador de complexo. Então por exemplo a histidina obtida em EDTA como também em custodiol é aqui pouco eficaz, apesar de que esses ligantes também formam complexos de ferro fortes. O ferro deve estar ligado, antes pelo contrário, de maneira especial a partir dos ligantes e o ligante deve atingir rapidamente os compartimentos intracelulares e em concentração suficiente.

Pode ser verificado que o elemento estrutural do ácido hidroxâmico I ou II, que está contido três vezes na deferoxamina, tem um particular significado como elemento estrutural apropriado ou ligante para ferro, na qual R1 = Ci até C2o alquila, arila, alquil-arila de cadeia reta ou ramificada, também pode abranger heteroátomos e/ou outros substituintes como -OH, -NH2 etc e R2 representa H, no mais pode ser como R1 e sendo que R1 e R2 estão fechados em um anel e/ou podem conter outros substituintes, como por exemplo 2-hidroxipiridina-N-óxido e derivados, que apresentam apenas uma outra estrutura tautomérica do caso, sendo que R1 e R2 podem estar fechados em um anel com duplas ligações conjugadas. Com as substâncias lipófilas e pequenas em comparação a deferoxamina, é realizada a estratégia de uma disponibilidade rápida intracelular de um quelador de ferro forte. Ácidos hidroxâmicos simples também indicam eficácia positiva; entretanto para uma boa eficácia é requisitada uma determinada proporção de hidrofilia/lipofilia. Além disso, pode ser indicado que nitrogênio de ácido hidroxâmico substituído por alquila (R2 = alquila) são geralmente mais eficazes perante os compostos não substituídos (R2 = II). Caso R2 leve a um grupo que atrai fortemente elétrons como, por exemplo, -CO-R3 (R3 tem igual significado que R1) isto leva à ineficácia, apesar de esses compostos também formarem ainda mais facilmente complexos de ferro, como por exemplo: N-hidroxissuccinimida 3,4-dihidro-3-hidróxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina. A eficácia dessas 2 substâncias exemplo é mostrada nas figuras 1 e 2.

Os ácidos hidroxâmicos e/ou derivados podem portanto estar contidos nas soluções de acordo com a invenção, oportunamente em concentrações até cerca de 10 mmoles/l. A fig. 1 indica a inibição dos danos por frio das células endoteli-ais do fígado por meio de ácido salicil-N-metilhidroxâmico. Células endoteli- ais do fígado de ratazanas cultivadas foram incubadas por 72 horas a 4°C na solução da Universidade de Wisconsin (UW) sob condições aeróbicas na presença e ausência de 1 mM ácido salicil-N-metilhidroxâmico e, em seguida, reaquecidas (37°C) em meios de cultura celular por 3 horas. A liberação de lactato deshidrogenase citosolítica (LDH) serviu como parâmetro dos danos celulares. A fig. 2 indicou a inibição de danos por frio de hepatocitos por ácido 3,4-dimetóxi-N-metil-benzihidroxâmico. Hepatocitos de ratazanas cultivadas foram incubados por 24 horas a 4°C na solução da Universidade de Wisconsin (UW) sob condições aeróbicas na presença e ausência de 1 mM de ácido 3,4-dimetóxi-N-metil-benzidroxâmico e, em seguida re-aquecidos (37°C) em meio de cultura celular por 3 horas. Como parâmetro do dano celular serviu a liberação de lactato deshidrogenase (LHD) citosolítico.

Deferoxamina é um forte quelador de ferro, que se liga como ligante hexadentado do ferro na forma não redox ativa. Ele serve assim para uma ótima proteção à maior exposição a frio. Deferoxamina é, entretanto, uma molécula hidrófila relativamente grande com uma permeabilidade da membrana limitada por isso. Deferoxamina não atinge assim todos os compartimentos intracelulares em concentração e velocidade suficientes, para oferecer uma proteção completa. Ela pode estar contida em uma concentração de preferência de até cerca de 10 mmoles/l na solução.

Outros compostos que podem ser adicionados oportunamente à solução protetora de órgãos de acordo com a invenção são indicados nas reivindicações de patente 5 e 6.

Em uma outra forma de execução da invenção adiciona-se a solução de acordo com a reivindicação de ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox) ou um derivado dela. O Trolox ou um seu derivado, captador de radical relativamente hidrófilo, mas permeável a membrana, são adicionados para captar radicais intracelulares originados dos danos de reoxigenação. O derivado de trolox apresenta-se na solução de acordo com a invenção oportunamente em uma concentração de até cerca de 10 mmoles/l.

Todas as soluções protetoras de órgãos dispõem de substâncias tampão, que reagem contra a acidose inevitável durante a isquemia. Fosfatos ou bicarbonatos são aqui os sistemas tampão inorgânicos os mais empregados. Considerou-se como absoluto, com relação à capacidade da solução tampão e estabilidade do pH, o sistema tampão histidina/histidina-HCI orgânico empregado em Custodiol ®. Particulares vantagens foram mostradas quando derivados da histidina, como por exemplo N-acetilhistidina, ao invés de histidina/histidina- HCI são utilizados como solução tampão nas soluções protetoras anteriormente mencionadas, mas também em outras soluções protetoras conhecidas. A figura 3 mostra uma capacidade da solução tampão aperfeiçoada em torno do fator 2 da N-acetilhistidina no âmbito fisiológico em comparação com histidina/histidina-HCI. Através do emprego do derivado de histidina também são evitados alguns efeitos colaterais indesejados da histidina (toxidez particularmente no calor mas também no frio em alguns tipos celulares, como por exemplo he-patocitos) sem prejudicar a boa capacidade da solução tampão (figura 4). A fig. 3 indica a respectiva curva de neutralização de histidi-na/histidina-HCI e N-acetilhistidina, com o que as capacidades da solução tampão utilizáveis se dão na faixa do valor de pH fisiológico; em N-acetilhistidina, de cerca de 60%, e em histidina, de cerca de 30%, relativo à proporção de base usada para substrato. O sistema tampão mencionado pode estar contido na solução de acordo com a invenção em uma concentração de preferência de cerca de 20 mmoles/l até cerca de 265 mmoles/l. A figura 4 mostra um exemplo de toxidez de histidina sob condições de calor e a diminuição dessa toxidez por meio de derivados de histidina. Hepatócitos de ratazanas cultivadas foram incubados por 5 horas a 37°C sob condições aeróbicas na presença e ausência de 198 mM I de histidina, a saber de 198 mm de N-acetilhistidina. Como solução básica serviu solução tampão de Krebs-Henseleit (KH), uma solução salina fisiológica frequentemente empregada em culturas celulares; nas soluções contendo (derivado) histidina ajustou-se a concentração de NaCI em torno de 99 mM e o valor do pH foi reduzido por adição de HCI ou NaOH, ajustado no pH 7,2.

Esse desenvolvimento posterior permite uma manutenção ainda melhor das funções celulares após conservação.

Um dos cátions é oportunamente sódio. Concentrações de sódio relativamente baixas são por um lado vantajosas para o desacoplamento eletromecânico em uma membrana celular (estado de parada cardíaca), por outro lado elas reduzem os danos de hipóxidos devido a prevenção/redução do fluxo de sódio induzido por hipóxido. Além disso, mantém-se uma reserva osmótica para outras substâncias (por exemplo substâncias tampão, ver abaixo). Também em uma baixa concentração de sódio da solução, é possível um ajuste rápido da homeostase na fase de reperfusão, já que o aumento intersticial de sódio (140 mM) ocorre rapidamente. Portanto aconselha-se uma concentração de sódio de cerca de 10 mmoles/h até cerca de 120 mmoles/l na solução de acordo com a invenção.

Uma concentração de potássio relativamente pequena, entretanto situada sobre o valor fisiológico extra-celular, apoia o desengate eletromecânico final na membrana celular (parada cardíaca) evitando-se, entretanto, as desvantagens de induzir soluções hipercalêmicas (soluções fortemente hipercalêmicas induzem uma rápida parada cardíaca, são porém também responsáveis na fase de reoxigenação por perturbações de ritmo e opcionalmente danos de reperfusão maiores; na fase de reperfusão o ajuste da concentração intersticial de potássio é temporariamente retardado, com o que a cota de funções iniciais adiadas dos órgãos é aumentada nessas soluções). Apenas soluções levemente hipercalêmicas possuem, além disso, a vantagem de não ser necessária uma lavagem da solução do órgão a ser transplantado antes da reperfusão (as soluções podem também desenvolver suas propriedades protetoras até o término do tempo de isquemia), e dispõem sobre uma elevada tolerabilidade sistêmica. Portanto aconselha-se uma concentração de potássio de cerca de 5 mmoles/l até cerca de 25 mmoles/l na solução de acordo com a invenção.

Uma concentração de magnésio visivelmente elevada (acima do valor da norma do soro) é almejada, já que magnésio como co-fator de di- versos sistemas de enzima glicólicas, apóia a troca de material anaeróbico e assim importa para formação de ATP também durante a isquemia fria. Além disso magnésio contribui para manutenção da atividade da Na+- K+-ATPase da membrana de plasma e reage contrariamente às modificações da homeostase iônica. Como antagonista Ca2+ fisiológico magnésio pode, além disso, atuar contra os efeitos de uma acumulação intracelular de cálcio. Na fase de reperfusão é requisitado um elevado pool de magnésio, para estimular a troca de energia aeróbica. As propriedades do magnésio dilata-tivas de vasos atuam, além disso, nos efeitos constritores, de encontro aos danos de reperfusão. Portanto, aconselha-se uma concentração de magnésio de cerca de 3 mmoles/l até cerca de 27 mmoles/l na solução de acordo com a invenção.

Sob condições isquêmicas (e da acidose intracelular ligada a elas e perturbações da homeostase do sódio) há o risco de um aumento citossólico de cálcio. Isto leva a um aumento indesejado das atividades, por exemplo, estimulação de proteases e fosfolipases, e no coração tem-se como conseqüência uma hipercontratura com um elevado consumo de ATP. As funções fisiológicas de cálcio devem, assim, durante a isquemia ser o mais amplamente reprimidas, com o que a concentração de cálcio pode se movimentar na solução, no âmbito das concentrações citoplasmáticas. Aconselha-se portanto uma concentração livre de cálcio de cerca de 0,0001 mmol/l até cerca de 1,5 mmoles/l na solução de acordo com a invenção.

Os aminoácidos básicos lisina e arginina ou seus derivados como dipeptídeos com glicina (Lys-Gly, Gly-Lys, ou Arg-Gly, Gly-Arg) podem ser empregados para substituir equivalentes de base ausentes, já que a concentração e a proporção dos cátions sódio, potássio, magnésio e cálcio, devido às causas já descritas, é fixada. A concentração de lisina e/ou derivados de lisina ou arginina e/ou derivados de arginina na solução de acordo com a invenção pode ser, respectivamente, de até cerca de 140 mmoles/l. O ânion cloreto fisiológico extracelular é empregado em uma concentração visivelmente mais reduzida em comparação aos valores fisio- lógicos, para reduzir perturbações da homeostase iônica durante a isquemia a frio. Isto é válido particularmente para um fluxo induzido por hipoxia de cátions como o de sódio. Por motivos de eletroneutralidade este fluxo é dependente de fluxos paralelos de ânions, de preferência de cloreto. A partir de conselhos de diversos autores, pode-se assim concluir que elevadas concentrações de cloreto favorecem o tamanho de um edema intracelular. Portanto aconselha-se manter uma concentração de cloreto, na solução de acordo com a invenção, o mais possivelmente amplamente abaixo do nível fisiológico, até no máximo 90 mmoles/l. Além do cloreto, o lactobionato também pode ser adicionado como ânion impermeável em uma concentração até cerca de 140 mmoles/l.

As concentrações de ânions empregadas nas soluções protetoras de órgãos originam-se em geral da escolha dos câtions, como por exemplo lactobionato, mas deveríam agir contra o surgimento de um edema intracelular. Aspartato representa uma excelente alternativa, sobretudo com o emprego de aspartato podem ser perseguidos diversos objetivos: a) aspartato como equivalente ácido substitui o cloreto desvantajoso. b) O ácido asparagínico suporta ativamente a troca de material em membranas e acelera a re-preparação da homeostase. c) Aspartato favorece, em ligação com α-cetoglutarato, a troca de energia aeróbica na fase crítica da reperfusão ou reoxigenação do órgão e acelera suas funções iniciais.

Particularmente na fase de re-oxigenação, quando com crescente aquecimento do órgão a necessidade de energia aumenta sensivelmente, é necessário forçar a disponibilização de energia, já que uma falta de ATP já nesta fase de aquecimento prejudicaria sensivelmente a funcionalidade do órgão e aumentaria a dimensão de um dano de reperfusão. Aconselha-se uma concentração de aspartato de cerca de até 140 mmoles/l na solução de acordo com a invenção. Oportunamente, na solução de acordo com a invenção, aspartato está disponível em excesso na proporção em relação a cloreto. O aminoácido glicina é empregado em concentração milimolar mais elevada, já que glicina nessas concentrações inibe o fluxo de sódio induzido por hipóxi através de uma estabilização da membrana plasmática (evitando uma troca de material orientado para difusão) e, além disso, inibe a ativação de macrófagos. É aconselhável uma concentração de glicina de até cerca de 30 mmoles/l na solução de acordo com a invenção.

Também durante a isquemia fria a necessidade de energia do órgão em questão não é insignificante, com o que para suporte são adicionados à solução substratos transportadores de energia ou substâncias promotoras de troca de energia. Diversos conceitos são assim perseguidos (ver também aspartato, acima, e α-cetoglutarato, abaixo), um deles é a adição de glicose.

Uma concentração da solução também permite às células, que se dirijam à oferta de glicose exógena devido a provisões de glicogênio comparativamente menores, como por exemplo células endoteliais, a obtenção de energia sobre glicólise anaeróbica durante a isquemia. A concentração de glicose entretanto é de tal modo escolhida, que é evitada uma absorção excessiva de glicose por outras células, particularmente por hepató-citos (um problema em soluções de conservação anteriores com concentrações de glicose extremamente elevadas). Portanto as soluções de acordo com a invenção contêm até 10 mmoles/l de glicose. α-cetoglutarato serve, juntamente com aspartato, para apoio do metabolismo sob/após condições hipóxicas. Escolhe-se oportunamente uma concentração de cerca de 1 mmol/l até cerca de 9 mmoles/l. A adição de substâncias osmoticamente eficazes é necessária na grandeza, como para obtenção da pressão osmótica fisiologicamente necessária de cerca de 300 mosm/l. Em geral polióis/açúcar (por exemplo manitol, rafinose, sacarose) ou também substâncias de alto peso molecular (por exemplo HES, dextrano) são empregadas aqui. Por último não se assegurou para alguns órgãos, evitar que as desvantagens da elevada viscosidade preparada por HES e dextrano prejudicassem a qualidade da proteção.

Viscosidade a 4°C: Custodiol® 1,8 cP

Solução UW 4,8 cP

Como osmólitos devem ter emprego dependendo do órgão ma-nitol, xilitol, sorbitol, sacarose ou rafinose. A concentração de osmólito é oportunamente de até 140 mmoles/l na solução de acordo com a invenção.

Para evitar um edema intersticial em alguns órgãos/tecidos a adição de uma substância coloidosmoticamente eficaz é vantajosa, por exemplo, dextrano-40/dextrano-70. Isto é válido em grande escala para proteção de pulmões e de pâncreas.

Para congelamento de células e tecidos é, além disso vantajosa a adição de crioprotetores adicionais, como por exemplo sulfóxido de dime-tila (DMSO). A fig. 5 mostra o dano celular de hepatócitos por peróxido de hidrogênio e sua proteção com diversos ácidos hidroxâmicos, e correspondem: Curva 1) N4 + 20 mM/l H202 Curva 2) N4 + 20 mM/l H202 + 1 mM/l de ácido 4-cloro-N-metil-benzohidroxâmico Curva 3) N4 + 20 mM/l H202 + 1 mM/l de 2-hidróxi-3-metil-isocarboesterila Curva 4) N4 + 20 mM/l H202 + 1 mM/l de ácido 3,4,5-trimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico Curva 5) N4 + 20 mM/l H202 + 1 mM/l de ácido 3,4-dimetóxi-N-metil-hidroxâmico sendo que N4 representa a solução de acordo com o exemplo II, entretanto sem Trolox e derivado de ácido hidroxâmico. A fig. 6 indica a inibição do dano por frio do hepatócito através da nova solução de conservação. Hepatócitos de ratazanas cultivadas foram incubadas por 24 horas a 4°C em uma solução de acordo com a invenção com N-actilhistidina como solução tampão e sob adição de Trolox, 1 mM/l e o derivado de ácido hidroxâmico ácido veratril-N-metilhidroxâmico, 0,05 mM/l e como comparação solução tampão de Krebs-Henseleit (KH). A incubação a frio ocorreu sob condições aeróbicas; após 24 horas reaque-ceu-se as células para simulação de uma reperfusão em meio de cultura celular a 37° C. Como indicador de um dano celular serviu a liberação de lactato desidrogenase citosólico (LDH).

Exemplos A seguir são apresentados exemplos de soluções, que correspondem às exigências do âmbito de proteção aqui exigido.

Exemplo I: Relativo aos constituintes funcionais de uma solução protetora de órgãos, a saber sistema tampão, eletrólitos, substâncias atuando como protetoras e osmolitos, é preparada a solução de acordo com a invenção. Para tanto são dissolvidas primeiramente as substâncias tampão em cerca de 90% da quantidade de água necessária. Então os sais neutros dos cáti-ons necessários como eletrólitos, portanto por exemplo sódio, potássio, magnésio e cálcio, são adicionados nas concentrações indicadas, fisiologi-camente plausíveis, e dissolvidos sob agitação. Segue-se como outros constituintes as substâncias protetoramente eficazes, que são adicionadas à solução. Depois disso o valor do pH é verificado na solução e opcionalmente ajustado no valor indicado no pedido de patente 1. Finalmente adiciona-se a quantidade de osmólito indicada e a solução é diluída até no volume correto. Após preenchimento em recipientes apropriados esteriliza-se a solução. A preparação dos ácidos hidroxâmicos cíclicos, por exemplo que se derivam dos compostos 2-hidroxipiridina-N-óxido é descrita por exemplo em Organic Synthesis Collektiv volume V página 623 e seguintes. Um processo de preparação para ácidos hidroxâmicos a partir de derivados de ácido carboxílico encontra-se em Houben-Weyl, Processos de química orgânica, página 686 e seguintes, sendo que como solvente são utilizados álcoois baixos, DMF, THF. A conversão com os respectivos ésteres de ácido carbo-xílico pode ocorrer catalisadas por base (NaOMe, K2C03, CaO). Finalmente para preparação de ácidos hidroxâmicos cíclicos faz-se referência a A. Kle-emann, J. Engel, Substâncias ativas Farmacêuticas, segunda edição, 1987, páginas 206 e seguintes.

REIVINDICAÇÕES

Claims (16)

1. Solução protetora para evitar danos de armazenamento ou danos de isquemia ou danos de reperfusão em órgãos, ou em sistemas celulares isolados ou partes de tecidos após perfusão, operação, transplante, ou crio-conservação e consecutiva reperfusão, que contém como eletrólitos íons alcalinos, opcionalmente também alcalino-terrosos, uma solução tampão assim como um poliol e/ou um açúcar, apresenta uma osmolaridade de 290 mosm/L até 350 mosm/L, assim como, um valor de pH de 6,8 até 7,4, e são adicionados o ácido hidroxâmico e/ou um ou mais derivados de ácido hidroxâmico, a dita solução protetora sendo caracterizada pelo fato de que, no derivado de ácido hidroxâmico, o átomo de hidrogênio, no carbono do ácido hidroxâmico, é substituído por alquila com Ci até C20 ou substituído por arila com C20, sendo que 0 substituinte também pode conter heteroátomos e/ou grupos hidróxi, grupos amino, grupos metóxi, com uma solução tampão à base de N-acetilhistidina, um teor de cátions em lisina e/ou derivado de lisina, de preferência dipeptídeos contendo lisina, um teor de ânions em aspartato em uma concentração de até 140 mmoles/L e com cloreto, sendo que, na dita solução protetora o ácido hidroxâmico e/ou seus derivados está contido em uma concentração de até 10 mmoles/L e a N-acetilhistidina/N-acetohistidina está contida em uma concentração de 20 mmoles/L até 265 mmoles/L, assim como eletrólito sódio está contido oportunamente em uma concentração de 10 mmoles/L até 120 mmoles/L e potássio está contido oportunamente em uma concentração de 5 mmoles/L até 25 mmoles/L, assim como magnésio está oportunamente contido em uma concentração de 3 mmoles/L até 27 mmoles/L e cálcio está oportunamente contido em uma concentração livre de 0,0001 mmoles/L até 1,5 mmoles/L, sendo que na solução protetora α-cetoglutarato está contido oportunamente em uma concentração de 1 mmoles/L até 9 mmol/l, e um osmólito está oportunamente contido em uma concentração de até 140mmoles/L, e como cátion está contido lisina, e/ou seus derivados, de preferência como um dipeptídeo contendo lisina, oportunamente em uma concentração de até 140 mmoles/L.

2. Solução, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o derivado de ácido hidroxâmico é empregado no qual o átomo de hidrogênio no nitrogênio de ácido hidroxâmico é substituído por alquila, arila, ou alquilarila com Ci até C20·

3. Solução, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que os substituintes no nitrogênio de ácido hidroxâmico são fechados com os substituintes em um anel no carbono hidroxama.

4. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que contém um ou mais dos compostos e/ou seus sais dos grupos ácido acetohidroxâmico, ácido aceto-N-metilhidroxâmico, ácido N-benzilacetohidroxâmico, ácido hexanohidroxâmico, ácido hexano-N-metilhidroxâmico, ácido benzohidroxâmico, ácido N-metilbenzohidroxâmico; ácido salicilhidroxâmico, ácido salicil-N-metilhidroxâmico, ácido salicil-N-benzilhidroxâmico, ácido 2-fenilacetohidroxâmico, ácido 2-fenilaceto-N-metilhidroxâmico, ácido 3,4-dimetóxibenzohidroxâmico, ácido 3,4-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 2,3-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 2,4-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 3,5-dimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 2,4-dihidroxibenzohidroxâmico, ácido 2,3-dihidroxibenzohidroxâmico, ácido 3,4-dihidroxibenzohidroxâmico, ácido 3,4,5-trimetóxi-benzohidroxâmico, ácido 3,4,5-trimetóxi-N-metil-benzohidroxâmico, ácido 4-hidróxi-3-metóxi-benzohidroxâmico, ácido 2-hidróxi-3-metóxi-benzohidroxâmico, ácido 2-hidróxi-5-metóxi-benzohidroxâmico, 2-hidróxi-3-metil-isocarbostirila ácido 4-cloro-N-metil-benzohidroxâmico, 6-ciclohexi-1 -hidróxi-4-metil-(2(1 H)-piridona.

5. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de ser com uma adição de deferoxamina.

6. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de ser com uma adição de um derivado do ácido 6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromato-2-carboxílico, de preferência o respectivo metiléster.

7. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é uma solução tampão à base de histidina N-acilada, em combinação com uma base orgânica apropriada, por exemplo cloridrato de N-glicilhistidina/N-glicilhistidina ou N-acetilhistidina/lisina e/ou arginina e/ou colina.

8. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que deferoxamina está contida em uma concentração de até 10 mmoles/L.

9. Solução, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizada pelo fato de que Trolox está contido em uma concentração de até 10 mmoles/L.

10. Solução, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o aspartato está contido em excesso na proporção para cloreto.

11. Solução, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é para emprego após infarto cardíaco, ataque de apoplexia, intervenções cirúrgicas ou reperfusão das extremidades.

12. Solução, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é para terapia de doenças que têm como causa uma hiperfer-ramia (por exemplo Alzheimer).

13. Solução, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que é para terapia de doenças que têm como causa um dano celular por radicais, radicais oxigênio ou H2O2.

14. Processo para preparação de uma solução, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que em um excesso em água, oportunamente em 90% da água necessária, os eletrólitos são dissolvidos sob agitação, a solução tampão e em seguida 0 ácido hidroxâmico e/ou seus derivados são adicionados, então o valor do pH é ajustado, adiciona-se o(s) osmólito(s) e a solução é preenchida com água até 0 volume aparente do solvente.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que para obtenção do ácido hidroxâmico e/ou seus derivados são empregados álcoois mais baixos, e/ou DMF, e/ou THF como solventes.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a conversão é realizada com um éster de ácido carboxílico catalisado por base.