BRPI0306432B1

BRPI0306432B1 - Processo de cultura de plantas transformadas e processo para conferir uma tolerância aos inibidores de p-hidroxifenilpiruvirato dioxigenase às plantas

Info

Publication number: BRPI0306432B1
Application number: BRPI0306432-8A
Authority: BR
Inventors: Michel Matringe; Pascal Rippert; Manuel Dubald; Renaud Dumas
Original assignee: Bayer Sas
Priority date: 2002-09-11
Filing date: 2003-09-10
Publication date: 2019-04-02
Also published as: JP2010246552A; EP1537216B1; JP5336428B2; JP4683923B2; US20050257283A1; WO2004024928A2; WO2004024928A3; BR0306432A; KR20050046764A; CN1688700A; JP2005537808A; CN100335641C; AU2003278294A1; ATE532871T1; US10138490B2; FR2844142B1; EP1537216A2; ES2375718T3; AU2003278294B2; FR2844142A1

Abstract

"plantas e células vegetais transformadas e uso das mesmas, processo de cultura das plantas transformadas, processo para conferir uma tolerância aos inibidores de p-hidroxifenilpiruvirato dioxigenase às plantas, processo para aumentar a quantidade de prenilquinonas nas plantas e processo de produção de prenilquinonas". a presente invenção trata das plantas transformadas, em particular das plantas transformadas que produzem quantidades mais elevadas de plastoquinonas, tocotrienóis e tocoferóis que plantas idênticas não transformadas. esta invenção trata também de um processo de produção dessas plantas, bem como de um processo de cultura dessas plantas. as plantas de acordo com a presente invenção possuem ainda a propriedade de ser tolerantes aos herbicidas inibidores da enzima p-hidroxifenilpiruvato dioxigenase.

Description

“PROCESSO DE CULTURA DE PLANTAS TRANSFORMADAS E PROCESSO PARA CONFERIR UMA TOLERÂNCIA AOS INIBIDORES DE PHIDROXIFENILPIRUVIRATO DIOXIGENASE ÀS PLANTAS”

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a plantas transformadas, em particular plantas transformadas que produzem quantidades mais elevadas de plastoquinonas, tocotrienóis e tocoferóis, que plantas idênticas não transformadas. Esta invenção refere-se ainda a um processo de produção dessas plantas, bem como de um processo de cultura das mesmas. As plantas de acordo com a presente invenção possuem ainda a propriedade de serem tolerantes aos herbicidas inibidores da enzima p-hidroxifenilpiruvirato dioxigenase (denominada a seguir HPPD).

Antecedentes da Invenção [002] As prenilquinonas são um grande grupo de compostos com afinidades lipídicas que compreendem, entre outros, as plastoquinonas, os tocoferóis, os tocoferóis e os tocotrienóis. Nessas plantas, as prenilquinonas são sintetizadas por meio do homogentisato.

[003] A mais conhecida das prenilquinonas é a vitamina E, ou α-tocoferol, elemento essencial da nutrição humana e animal, em particular da nutrição dos mamíferos que não a produzem naturalmente, mas precisam dela em sua dieta. O efeito mais reconhecido da vitamina E é sua ação antioxidante sobre os lipídios das membranas celulares (Epstein et al; 1966, Radical Research 28: 322-335; Kamel-Eldin & Appelqvist, 1996, Lipids 31: 671-701).

[004] Além da vitamina E, demonstrou-se que os tocotrienóis, embora não essenciais na nutrição humana e animal, possuem propriedades antioxidantes particularmente interessantes, mais elevadas que as da vitamina E (Kamat et al., 1997, Mol. Cell. Biochem. 170: 131-137). Esses compostos são, em particular, conhecidos por

2/32 proteger as células contra os radicais livres, bem como para prevenir o aparecimento de doenças cardiovasculares ou cancerígenas (Packer et al., 2001, J. Nutr. 131(2): 369S-373S). Ainda, os tocotrienóis apresentam uma atividade anticancerígena pela inibição da proliferação de receptores estrógenos, atividade essa que os tocoferóis não possuem (Guthrie et al., 1997, J. Nutr. 127: 544-548). Eles apresentam também uma atividade hipocolesterolêmica bem melhor que os tocoferóis (Pearce: et al., 1992, J. Med. Chem. 35: 3595-3606; Qureshi et al., 2001, J. Nutr. 131: 2606-2618), o que os torna mais aptos a lutar contra a arteriosclerose.

[005] As plastoquinonas não têm um papel conhecido na saúde humana ou animal, mas desempenham um papel benéfico nas plantas. Essas moléculas estão presentes nas membranas dos cloroplastos e possuem por função o transporte de elétrons durante a reação de fotossíntese (Grumbach, 1984, Structure Function and Metabolism of Plant Lipids, Siegenthaler & Eichenberger eds).

[006] Além disso, um aumento da quantidade de prenilquinonas deveria conferir às plantas uma melhor resistência frente aos estresses oxidantes, em particular o frio, a estiagem ou uma forte iluminação.

[007] Nas plantas e nos organismos fotossintéticos em geral, o homogentisato constitui o precursor aromático das prenilquinonas. O homogentisato é o produto da enzima p-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (denominada a seguir HPPD). Na maior parte dos organismos, as HPPD são enzimas envolvidas na via de degradação catabólica do ácido aromático Tirosina (Goodwin, 1972, em Tyrosine Metabolism: The biochemical, physiological and clinical significance of p-hydroxyphenylpyruvate oxygenase, Goodwin B.L., ed., Oxford University Press: 1-94). AS HPPD catalisam a reação de transformação da p-hidroxifenilpiruvato (HPP), produto de degradação da tirosina em homogentisato.

3/32 [008] A maior parte das plantas sintetisam a tirosina através do arogenato (Abou-Zeid et al. 1995, Applied Env. Microb 41: 1298-1302; Bonner et al., 1995, Plant Cells Physiol. 36: 1013-1022; Byng et al., 1981 Phytochemistry 6: 1289-1292; Connely & Conn, 1986, Z. Naturforsch 41c: 6978; Gaines et al., 1982. Plants 156: 233-240). Nessas plantas, o HPP deriva apenas da degradação da tirosina. Em compensação, em organismos como o levedura Saccharomyces cerevisiae ou a bactéria Escherichia coli, o HPP é um precursor da Tirosina e é sintetizado pela ação de uma enzima prefenato desidrogenase (a seguir PDH) que transforma o prefenato em HPP (Lingens et al., 1967. European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar & Morrisson, 1982, Bioch Biophys Acta 702; 204-211). Nesses organismos, a produção de HPP está portanto ligada diretamente à via de biossíntese dos aminoácidos aromáticos (via de shiquimato) e não à via de degradação da tirosina (vide Figura 1).

[009] A fim de aumentar a biossíntese de prenilquinonas pelas plantas, os inventores do presente documento procuraram aumentar o fluxo do precursor HPP nas células dessas plantas conectando a síntese do dito precursor à via dita do shiquimato por superexpressão de uma enzima PDH. O efeito esperado é um fluxo maior de precursor HPP que deve aumentar globalmente a biossíntese de prenilquinonas.

[010] Foi efetivamente constatado que a transformação das plantas com um gene que codifica uma enzima PDH permitia aumentar a produção de prenilquinonas pelas ditas plantas. Esse aumento é muito significativo quando as plantas transformadas com um gene que codifica uma enzima PDH são plantas que superexpressam uma enzima HPPD.

[011] Há alguns anos que o interesse pelos HPPD vem aumentando consideravelmente após a demonstração que essa enzima é o alvo de novas famílias de herbicidas chamados “branqueadores”. Esses

4/32 herbicidas que têm por alvo a HPPD são em particular os isoxazóis (EP 0.418.175, EP 0.470.856, EP 0.487.352, EP 0.527.036, EP 0.560.482, EP 0.682.659, US 5.424.276), em particular o isoxaflutol, herbicida seletivo do milho, as dicetronitrilas (EP 0.496.630, EP 0.496.631), em particular a 2-ciano-

3-ciclopropil-1-(2-SO2-CH₃-4-CF₃-fenil)-propano-1,3-diona e a 2-ciano-3ciclopropil-1-(2-SO2-CH₃-4-2,3-Cl₂-fenil)-propano-1,3-diona, as tricetonas (EP 0.625.505, EP 0.625.508, US 5.506.195), em particular a sulcotriona ou a mesotriona, ou ainda os pirazolinatos.

[012] Uma das vantagens dos herbicidas que têm por alvo enzimas envolvidas nas vias metabólicas vitais das plantas é seu amplo espectro de atividade sobre plantas de origens filogenéticas distantes. Todavia, esses herbicidas apresentam também o sério inconveniente, quando são aplicados sobre culturas para eliminar os vegetais indesejáveis ou “ervas daninhas”, de agir também sobre as plantas cultivadas. Esse inconveniente pode ser corrigido pelo uso de plantas cultivadas tolerantes ao ditos herbicidas. Essas plantas são geralmente obtidas por engenharia genética por meio da introdução em seu genoma de um gene que codifica uma enzima de resistência ao dito herbicida de maneira que elas superexpressem a dita enzima nos tecidos.

[013] Até o presente, três principais estratégias que utilizam a engenharia genética foram empregadas para tornar plantas tolerantes aos herbicidas. A primeira consiste em detoxificar o herbicida por transformação da planta com um gene que codifica uma enzima de detoxificação. Essa enzima transforma o herbicida, ou seu metabólito ativo, em produtos de degradação não tóxicos, como por exemplo, enzimas de tolerância ao Bromoxinil^® ou ao Basta^® (EP 0.242.236, EP 0.337.899). A segunda estratégia consiste em transformar a planta com um gene que codifica a enzima alvo mutada de maneira que ela seja menos sensível ao herbicida, ou seu metabólito ativo,

5/32 como por exemplo as enzimas de tolerância ao glifosato (EP 0.293.356, Padgette et al., J. Biol. Chem., 266: 33, 1991). A terceira estratégia consiste em superexpressar a enzima alvo sensível, de maneira a produzir na planta quantidades elevadas de enzima alvo, se possível bem superior à quantidade de herbicidas que penetra a planta. Essa estratégia permite manter um nível suficiente de enzima funcional, apesar da presença de seu inibidor.

[014] Essa terceira estratégia foi utilizada com sucesso e permitiu obter plantas tolerantes aos inibidores de HPPD (WO 96/38567). Além disso, essa estratégia de simples superexpressão da enzima alvo sensível (não mutada) foi empregada pela primeira vez com sucesso para conferir às plantas uma tolerância a um nível agronômico a um herbicida.

[015] Sabe-se ainda que a maior parte dos herbicidas inibidores de HPPD são inibidores competitivos em relação ao substrato, de fixação lenta e quase irreversível (Ellis et al., 1996, Chem. Res. Toxicol. 9: 24-27; Viviani et al.,1998; Pestic. Biochem. Physiol. 62: 125-134). Seu mecanismo de ação consiste, portanto, em entrar em competição com o HPP fixando-se de modo preferencial em seu sítio de fixação. O resultado dessa fixação é a parada da síntese pela célula do homogentisato.

[016] A presente invenção, que realiza um aumento do fluxo do substrato HPP da HPPD por superexpressão de uma enzima PDH, parece constituir uma quarta estratégia possível para se obter plantas tolerantes aos herbicidas, em particular aos herbicidas inibidores da HPPD.

Descrição Resumida da Invenção [017] A presente invenção refere-se, portanto, a plantas transformadas, caracterizadas pelo fato de compreenderem:

(1) um gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima PDH.

(2) um gene funcional nas plantas que permitem a

6/32 superexpressão de uma enzima HPPD.

[018] De acordo com um modo particular de realização, a presente invenção refere-se a plantas transformadas caracterizadas pelo fato de compreenderem:

(1) um gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima PDH (2) um gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima HPPD, com a exceção de um gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima a fitilprenil transferase.

[019] De acordo com outro modo particular de realização, a presente invenção refere-se a plantas transformadas, caracterizadas pelo fato de consistirem em plantas transformadas com:

(1) um gene funcional	nas	plantas	que	permitem	a
superexpressão de uma enzima PDH, e
(2) um gene funcional	nas	plantas	que	permitem	a
superexpressão de uma enzima HPPD.
[020] De acordo com um	modo	particular de	realização	da

presente invenção, as plantas transformadas de acordo com a presente invenção podem ser representadas por células vegetais transformadas.

Breve Descrição da Listagem de Sequências [021] As SEQ ID NO: 1 e 2 referem-se às sequências PDH de Saccharomyces cerevisae, de uso preferencial na presente invenção.

[022] As SEQ ID NO: 3 e 4 referem-se às sequências de HPPD de Pseudomonas fluorescens, de uso preferencial na presente invenção.

Descrição Detalhada da Invenção [023] Por plantas transformadas ou células vegetais transformadas, entende-se de acordo com a presente invenção plantas ou

7/32 células vegetais que integraram, de modo estável, em seu genoma pelo menos um transgene (gene exógeno), em que o dito transgene pode provir da planta transformada ou de qualquer outro organismo. De preferência, um transgene de acordo com a presente invenção é representado por um gene quimérico que compreende elementos provenientes de pelo menos um outro organismo diferente da planta transformada. Em particular, um transgene de acordo com a presente invenção pode conter, entre outros elementos, pelo menos um promotor, uma sequência codificadora e um terminador proveniente de organismos diferentes, sendo que os ditos organismos são também diferentes da planta transformada.

[024] Na expressão “gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima PHD”, o termo PHD pode ser interpretado como fazendo referência a qualquer enzima PDH nativa, ou mutada, que apresenta a atividade PHD de transformação do prefenato em HPP. Em particular, a dita enzima PHD pode provir de qualquer tipo de organismo. A identificação de uma enzima com atividade PDH pode ser realizada por qualquer método que permita medir a diminuição da quantidade de substrato prefenato, ou medir o acúmulo de um produto proveniente da reação enzimática, ou seja o HPP ou um dos cofatores NADH ou NADPH. Em particular, a medição da atividade PDH pode ser realizada pelo método descrito no exemplo 2.

[025] Numerosos genes que codificam enzimas PDH estão descritos na literatura e suas sequências podem ser identificadas no site http://www.ncbi.nlm.mih.gov/entrez/. Conhece-se em particular o gene que codifica a enzima PHD da levedura Saccharomyces cerevisiae (N^o de acesso S46037) tal como descrito em Mannhaupt et al., (1989, Gene 85: 303-311), de bactéria do gênero Bacillus, em particular da espécie B. subtilis (N^o de acesso P20692) tal como descrita em Henner et al. (1986, Gene 49 (1): 147-152), de

8/32 bactéria do gênero Escherichia, em particular da espécie E. coli (N². de acesso KMECTD) tal como descrita em Hudson et al., (1984. J. Mol. Biol. 180(4): 10231051), ou de bactéria do gênero Erwinia, em particular da espécie de E. herbicola (N^o de acesso S29934) tal como descrita em Xia et al., (1992. J. Gen. Microbiol. 138(7): 1309-1316).

[026] Na expressão “gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima HPPD”, o termo HPPD deve ser interpretado como fazendo referência a qualquer enzima HPPD nativa, mutada ou quimérica, que apresenta a atividade HPPD de transformação do HPPD em homogentisato. Uma medida da atividade enzimática das HPPD pode ser realizada por qualquer método que permita medir a diminuição da quantidade do substrato HPP ou então de medir o acúmulo do produto proveniente da reação enzimática, ou seja, o homogentisato. Em particular, a medida da atividade HPPD pode ser realizada pelo método descrito no Exemplo 1 e em Garcia et al. (1997, Biochem. J. 325: 761-769) ou Garcia et al. (1999, Plant Physiol.119: 1507-1516).

[027] Em particular, a dita enzima HPPD pode provir de qualquer tipo de organismo. Numerosos genes que codificam enzimas HPPD estão descritos na literatura, em particular os genes de bactérias como Pseudomonas (Rüetschi et al., 1992, Eur. J. Biochem., 205: 459-466, documento WO 96/38567), de plantas como de Arabidopsis (WO 96/38567), Genebank 87257, de Cocciocoides (Genebank COITRP), ou de mamíferos como os camundongos ou o porco.

[028] Por HPPD mutada, entende-se de acordo com a presente invenção uma HPPD que possui pelo menos uma mutação em relação a uma HPPD nativa e que possui a propriedade de ser mais tolerante aos herbicidas inibidores de HPPD que a HPPD nativa correspondente. De modo vantajoso, a HPPD mutada é uma HPPD mutada em sua parte C-terminal tal como descrita

9/32 no documento WO 99/24585. De maneira preferida, a HPPD mutada compreende a mutação W336 tal como descrita no documento WO 99/24585.

[029] Por HPPD quimérico, entende-se uma HPPD que compreende elementos provenientes de diferentes HPPD. Essas HPPD quiméricas estão descritas em particular no documento WO 99/24586.

[030] De modo vantajoso, a HPPD é uma HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO 96/38567) ou de Arabidopsis thaliana (WO 96/38567).

[031] Na expressão “gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima fitilprenil transferase”, o termo fitilprenil transferase deve ser interpretado como fazendo referência a uma enzima fitilprenil transferase tal como descrita no documento WO 02/089561. Em particular, o dito gene funcional nas plantas que permite a superexpressão de uma enzima “fitilprenil transferase” consiste em um gene funcional selecionado entre o gene s1 r1736 de Synechocystis (sequência descrita na Cyanobase no site da Web http://www.jkarusa.or.jpcyanobase) e o gene ATPT2 de Arabidopsis (Smith et al., 1997, Plant J. 11, 83-92).

[032] As plantas ou células vegetais transformadas de acordo com a presente invenção produzem quantidades de prenilquinonas superiores às de plantas não transformadas. De maneira preferida, as plantas ou células vegetais transformadas de acordo com a presente invenção produzem quantidades de prenilquinonas superiores às das plantas transformadas com apenas um dos genes funcionais nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima PHD ou HPPD. De preferência, as prenilquinonas produzidas pelas plantas ou células vegetais transformadas de acordo com a presente invenção são tocoferóis e/ou tocotrienóis e/ou plastoquinonas. Diversos métodos de medida da quantidade de tocoferóis, tocotrienóis e plastoquinonas são conhecidos e à disposição do técnico no assunto. Como exemplo, os

10/32 tocoferóis, os tocotrienóis e as plastoquinonas podem ser medidos pelo método de Frazer et al. (2000. Plant J. 24: 551-558). Por quantidades superiores, entende-se de acordo com a presente invenção quantidades de preferência pelo menos 2 vezes superiores, de preferência, pelo menos 5 vezes superiores, de preferência, pelo menos 10 vezes superiores, de preferência, pelo menos 50 vezes superiores, de preferência, pelo menos 100 vezes superiores, de preferência, pelo menos 500 vezes superiores e, de maneira preferida, pelo menos 1.000 vezes superiores.

[033] As plantas transformadas de acordo com a presente invenção possuem também por efeito tolerância aos inibidores da HPPD.

[034] Por plantas transformadas tolerantes aos inibidores da HPPD, entendem-se plantas transformadas tais como descritas anteriormente que apresentam pelo menos a característica de tolerância a uma dose de inibidor da HPPD normalmente tóxica para plantas idênticas não transformadas. A dose de inibidor da HPPD normalmente tóxica para uma planta não transformada depende do inibidor de HPPD utilizado e a planta sobre a qual o dito inibidor é aplicado, bem como do estágio em que ele é aplicado na dita planta. Todavia, um técnico no assunto saberá determinar essa dose sabendo que o caráter tóxico do dito inibidor pode corresponder tanto a um efeito mortal do dito inibidor que leve à morte da planta um certo número de dias após a aplicação do dito inibidor, efeito mortal esse que pode ser precedido por um efeito chamado de “branqueamento” da planta como é geralmente o caso para os inibidores da HPPD, quanto a um efeito de diminuição do crescimento da planta. De preferência, as plantas transformadas tolerantes aos inibidores da HPPD de acordo com a presente invenção são tolerantes a uma dose de inibidor da HPPD normalmente tóxica para plantas idênticas transformadas unicamente com o gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de uma enzima HPPD.

11/32 [035] Por inibidores da HPPD, entende-se qualquer composto, de origem natural ou artificial, capaz de se ligar a uma enzima HPPD de planta de maneira a bloquear, de modo transitório ou permanente, sua atividade enzimática natural de transformação da HPPD em homogentisato. Por meio dessa propriedade, os inibidores da HPPD de acordo com a presente invenção induzem à morte ou à inibição de crescimento das plantas sobre as quais são aplicados, em que a dita morte geralmente ocorre após um “branqueamento” das ditas plantas.

[036] Como exemplos de inibidores de HPPD, podem-se citar os isoxazóis (EP 418.175, EP 470.856, EP 487.352, EP 527.036, EP 560.482, EP 682.659, US 5.424.276), em particular o isoxaflutol, herbicida seletivo do milho, as dicetronitrilas (denominadas a seguir DKN e descritas na EP 496.630, EP 496.631), em particular a 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2-CH₃-4-CF₃-fenil)propano-1,3-diona e a 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2-CH3-4,2,3-Cl2-fenil)propano-1,3-diona, as tricetonas (EP 0.625.505, EP 0.625.508, US 5.506.195), em particular a sulcotriona ou a mesotriona, ou ainda os pirazolinatos.

[037] Por gene funcional nas plantas, entende-se de acordo com a presente invenção um gene capaz de funcionar em uma planta. Um gene capaz de funcionar em uma planta é um gene capaz de expressar a proteína que ele codifica em pelo menos um tecido da dita planta. Em particular, os genes funcionais nas plantas de acordo com a presente invenção permitem a superexpressão das enzimas PDH e HPPD. A superexpressão de uma proteína significa a expressão dessa proteína nos tecidos da planta transformada em um nível superior ao que existe em uma planta idêntica não transformada, nível esse que é medido em um estágio idêntico de desenvolvimento das ditas plantas. De preferência, o gene funcional nas plantas de acordo com a presente invenção é um gene quimérico que pode compreender elementos provenientes de organismos diferentes da planta no qual ele é introduzido.

12/32 [038] Os genes funcionais nas plantas de acordo com a presente invenção são de preferência genes quiméricos que compreendem pelo menos um promotor funcional operacionalmente ligados entre si em uma planta, uma sequência que codifica uma enzima PDH e/ou HPHD, e um elemento terminador funcional nessa mesma planta. Os diferentes elementos que um gene quimérico pode conter são, de um lado, elementos reguladores da transcrição, da tradução e da maturação das proteínas, tais como um promotor, uma sequência que codifica um peptídeo sinal ou um peptídeo de trânsito, ou um elemento terminador que constitui um sinal de poliadenilação, e de outro lado, uma sequência que codifica uma proteína. A expressão “operacionalmente ligados entre si” significa que os ditos elementos do gene quimérico estão ligados entre si de modo que seu funcionamento esteja operacionalmente ligado a uma sequência codificadora quando ele é capaz de assegurar a expressão da dita sequência codificadora. A construção de um gene quimérico de acordo com a presente invenção e a junção de seus diferentes elementos é realizável pelo uso de técnicas bem conhecidas pelos técnicos no assunto, em particular as descritas em Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). A escolha dos elementos reguladores que constituem o gene quimérico é essencialmente função da planta na qual eles devem funcionar e o técnico no assunto é capaz de selecionar elementos reguladores funcionais em uma dada planta.

[039] Os promotores que podem conter o gene quimérico de acordo com a presente invenção podem ser constitutivos, indutíveis, regulados espacialmente ou temporalmente.

[040] Entre os promotores constitutivos que podem ser utilizados no gene quimérico da presente invenção, pode-se citar, a título de exemplo, promotores bacterianos, como o do gene da octopina sintase ou o da

13/32 nopalina sintase (Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res.15: 1543-1548), promotores virais, como o do gene que controla a transcrição dos ARN19S ou 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV; Lawton et al, 1987, Plant Mol. Biol., 9, 315-324; Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), os promotores do vírus do mosaico da nervura da mandioca (CsVMV; tais como descritos no documento WO 97/48819). Entre os promotores de origem vegetal, pode-se citar o promotor do gene da pequena subunidade de ribulosebiscarboxilase/oxigenase (RuBisCO), o promotor de um gene de histona tal como descrito no pedido EP 0.507.698, ou o promotor de um gene de actina de arroz (Wang et al., 1992, Mol. Cell. Biol. 12 (8): 3399-3406; US 5.641.876).

[041] Entre os promotores indutíveis que podem ser utilizados no gene quimérico da presente invenção, pode-se citar como exemplo, o promotor do gene que codifica a proteína que liga a auxina (Schwob et al.,

1993, Plant J. 4 (3): 423-432), o promotor do gene que codifica a UDP-glicose flavonóide glicosil-transferase (Ralston et al., 1988, Genet., 119 (1): 185-197), o promotor do gene que codifica o inibidor da MIP proteinase (Cordero et al.,

1994, Plant J., 6 (2): 141-150), ou o promotor do gene que codifica a glicerilaldeído-3-fosfato desidrogenase (Martinez et al., 1989., J. Mol. Biol., 208 (4): 551.565; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol., 29 (5): 412-421; Kohler et al.,

1995, Plant Mol. Biol., 29 (6): 1293-1298).

[042] Entre os promotores tecidos específicos que podem ser utilizados no gene quimérico da presente invenção podem-se citar como exemplo, os promotores específicos de raízes como por exemplo o descrito no documento WO 00/29594, promotores específicos das flores tais como os descritos nos documentos WO 98/22593, WO 99/15679 ou WO 99/43818, ou promotores específicos das frutas, em particular das sementes, tais como os descritos nos documentos WO 91/13993, WO 92/17580, WO 98/45460, WO 98/45461, ou WO 99/16890.

14/32 [043] Entre os elementos terminadores que podem ser utilizados no gene quimérico da presente invenção, pode-se citar como exemplo o elemento terminador nos do gene que codifica a nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), 369385), ou o elemento terminador de um gene de histona tal como descrito no pedido EP 0.633.317.

[044] O gene quimérico pode também compreender uma sequência de endereçamento subcelular que codifica um peptídeo sinal ou um peptídeo de trânsito. Essa sequência, situada a montante ou a jusante da sequência que codifica uma enzima HPPD e/ou PDH, permite dirigir a dita enzima HPPD ou PDH de modo específico em um compartimento celular do organismo hospedeiro. Por exemplo, o gene quimérico pode compreender uma sequência que codifica um peptídeo sinal ou um peptídeo de trânsito que permite dirigir a enzima HPPD e/ou PDH para um compartimento particular do citoplasma como as mitocôndrias, os plastos, o retículo endoplasmático ou os vacúolos.

[045] O papel dessa sequência está descrito em particular no número 38 da revista Plant Molecular Biology (1998) dedicado em grande parte ao transporte das proteínas nos diferentes compartimentos da célula vegetal (Sorting of proteins to vacuoles in plant cells pp 127-144; the nuclear pore complex pp 145-162; protein translocation into and across the chloroplastic enveloppe membranes pp 91-207; multiple pathways for the targeting and thyialkoid proteins in chloroplastic pp 209-211; mitochondrial proteins import in plants pp 311-338).

[046] De acordo com um modo de realização, o peptídeo de trânsito pode ser um sinal de endereçamento cloroplasmático ou mitocondrial, o qual é depois clivado nos cloroplastos ou nas mitocôndrias. De modo preferido, o gene quimérico de acordo com a presente invenção compreende

15/32 uma sequência de endereçamento subcelular que codifica um peptídeo de trânsito que endereça a enzima HPPD e/ou PDH nos cloroplastos.

[047] Os peptídeos de trânsito podem ser simples ou duplos. Os peptídeos de trânsito duplos estão eventualmente separados por uma sequência intermediária. Como exemplo, um peptídeo de trânsito preferido de acordo com a presente invenção compreende, no sentido da transcrição, uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, uma parte de sequência da parte matura N-terminal de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial, e a seguir uma sequência que codifica um segundo peptídeo de trânsito de um gene vegetal que codifica uma enzima com localização plastidial. Esses peptídeos de trânsito duplos estão descritos, por exemplo, no documento EP 0.508.909.

[048] De acordo com a presente invenção, o gene quimérico pode também compreender outras sequências de regulação, que estão situadas entre o promotor e a sequência codificadora, tais como ativadores de transcrição (enhancer), como por exemplo o ativador de transcrição do vírus do mosaico do tabaco (VMT) descrito no documento WO 87/07644, do vírus etch do tabaco (TEV) descrito por Carrington & Freed (1990, J. Virol. 64(4):1590-1597), ou do vírus do mosaico do “figwort” (Figwort Mosaic Virus, US 5.994.521). O gene quimérico de acordo com a presente invenção pode também conter íntrons, em particular íntrons que favorecem a expressão dos genes nas plantas monocotiledôneas tal como o íntron 1 do gene da actina de arroz descrito no documento WO 99/34005, ou o íntron adh1 de milho.

[049] As plantas e células vegetais de acordo com a presente invenção são plantas e células vegetais transformadas. Para obter as plantas e as células vegetais transformadas de acordo com a presente invenção, o

16/32 técnico no assunto utiliza diversos métodos de transformação das plantas conhecidas.

[050] De modo preferido, as plantas e as células vegetais de acordo com a presente invenção são transformadas com um vetor de clonagem, de expressão e/ou de transformação que compreende um gene funcional nas plantas de acordo com a presente invenção que permitem a superexpressão de HPPD ou de PDH.

[051] Os vetores que podem ser úteis para o uso na presente invenção são por exemplo plasmídeos, cosmídeos, bacteriófagos ou vírus. De modo preferencial, os vetores de transformação das células vegetais ou das plantas de acordo com a presente invenção são plasmídeos. De modo geral, as principais qualidades de um vetor devem ter uma capacidade de se manter e de se auto-replicar nas células das plantas, em particular graças à presença de uma origem de replicação. Visando uma transformação estável do organismo hospedeiro, o vetor pode também se integrar no genoma. A escolha desse vetor, bem como das técnicas de inserção nele do gene de acordo com a presente invenção estão amplamente descritas em Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a edição, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) e fazem perda dos conhecimentos gerais do técnico no assunto. De modo vantajoso, o vetor utilizado na presente invenção contém ainda, além do gene de acordo com a presente invenção, outro gene que codifica um marcador de seleção. O marcador de seleção permite selecionar os organismos hospedeiros efetivamente transformados, ou seja aqueles que incorporaram o vetor. Entre os marcadores de seleção utilizáveis, podem-se citar marcadores que contêm genes de resistência aos antibióticos tais como, por exemplo, o gene da higromicina fosfotransferase (Gritz et al., 1983, Gene 25:179-188), e também marcadores que contêm genes de tolerância aos herbicidas tais como gene bar (White et al., Nucleic Acid Res.

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18(4):1062, 1990) para a tolerância ao bialafos, o gene EPSPS (US 5.188.642) para a tolerância ao glifosato ou ainda o gene HPPD (WO 96/38567) para a tolerância aos isoxazóis. Podem-se também citar genes que codificam enzimas facilmente identificáveis como a enzima GUS, genes que codificam pigmentos ou enzimas que regulam a produção de pigmentos nas células transformadas. Esses genes marcadores de seleção estão descritos em particular nos documentos WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, e WO 97/04103.

[052] Entre os métodos de transformação utilizáveis para obter plantas transformadas de acordo com a presente invenção, um deles consiste em colocar as células ou os tecidos das plantas que se deseja transformar em presença de polietilenoglicol (PEG) e dos vetores acima citados (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115, Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). A eletroporação é outro método que consiste em submeter as células ou os tecidos a serem transformados e os vetores da presente invenção em um campo elétrico (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62). Outro método consiste em injetar os vetores diretamente nas células ou nos tecidos hospedeiros por micro-injeção (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). De maneira vantajosa, poderá ser utilizado o método denominado “biobalística”. Ele consiste em bombardear células ou tecidos com partículas nas quais são adsorvidos os vetores da presente invenção (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291; US 4.945.050). De maneira preferencial, a transformação de células ou tecidos vegetais pode ser feita por meio de bactérias do gênero Agrobacterium, de preferência por infecção das células ou dos tecidos das ditas plantas por A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan e Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16:357-384; Tepfer and

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Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De maneira preferencial, a transformação de células ou tecidos vegetais por Agrobacterium tumefaciens é realizada de acordo com o protocolo descrito por Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750). O técnico no assunto fará a escolha do método apropriado em função da natureza das plantas a serem transformadas.

[053] A presente invenção tem também por objeto um processo de produção de plantas de acordo com a presente invenção. Esse processo consiste em regenerar plantas transformadas a partir de células vegetais transformadas tais como descritas acima. A regeneração é obtida por qualquer processo apropriado que depende da natureza da planta.

[054] A presente invenção compreende também partes dessas plantas transformadas, e a descendência dessas plantas. Entende-se por “partes dessas plantas”, qualquer órgão dessas plantas, seja ele aéreo ou subterrâneo. Os órgãos aéreos são os caules, as folhas, e as flores que compreendem os órgãos reprodutores masculino e feminino. Os órgãos subterrâneos são principalmente as raízes, mas pode ser também tubérculos. Por “descendência”, entende-se principalmente as sementes que contêm os embriões provenientes da reprodução dessas plantas entre si. Por extensão, o temo “descendência” aplica-se a todas as sementes formadas a cada nova geração proveniente de cruzamentos em que pelo menos um dos pais é uma planta transformada de acordo com a presente invenção. Uma descendência pode também ser obtida por multiplicação vegetativa das ditas plantas transformadas. As sementes de acordo com a presente invenção podem ser revestidas por uma composição agroquímica que compreende pelo menos um produto ativo que possui uma atividade selecionada entre as atividades fungicida, herbicida, inseticida, nematicida, bactericida ou virucida.

[055] As plantas transformadas de acordo com a presente invenção podem compreender pelo menos um outro gene que codifica uma

19/32 proteína de interesse, no qual o outro gene é também introduzido artificialmente no genoma da planta, simultânea, anterior ou posteriormente ao gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de PDH e/ou HPPD. Entre os genes que codificam uma proteína de interesse, podem-se citar genes que codificam outra enzima de resistência a um herbicida, por exemplo o gene que codifica uma enzima bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) para a tolerância ao bialafos, ou o gene que codifica uma enzima EPSPS (US 5.188.642; WO 97/04103) para a tolerância ao glifosato. Pode-se também citar um gene que codifica uma toxina inseticida, por exemplo um gene que codifica uma δ-endotoxina da bactéria Bacillus thuringiensis (por exemplo, ver o documento WO 98/40490). Podem também estar contidos nessas plantas outros genes de resistência às doenças, por exemplo um gene que codifica uma enzima oxalato oxidase tal como descrito no documento EP 0.531.498 ou na patente US 5.866.778, ou um gene que codifica outro peptídeo antibacteriano e/ou um antifúngico como os descritos nos documentos WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, e WO 99/91089. Podem-se também citar genes que codificam caracteres agronômicos da planta, em particular um gene que codifica uma enzima Δ-6 desaturase tal como descrito nas patentes US 5.552.306, US 5.614.313, e nos documentos WO 98/46763 e WO 98/46764, ou um gene que codifica uma enzima serina acetiltransferase (SAT) tal como descrito nos documentos WO 00/01833 e WO 00/36127.

[056] Os genes adicionais que codificam uma proteína de interesse podem ser integrados por meio de um vetor. Nesse caso, o vetor compreende o gene de acordo com a presente invenção que codifica uma enzima PDH e/ou HPPD e pelo menos um gene que codifica um outro peptídeo ou proteína de interesse.

[057] Eles podem também ser integrados por meio de pelo menos um outro vetor que compreende o dito gene adicional, de acordo com as técnicas usuais definidas acima.

20/32 [058] As plantas de acordo com a presente invenção podem ser obtidas por cruzamento de plantas, sendo que uma porta o gene que codifica uma enzima PHD e/ou HPPD de acordo com a presente invenção, e a outra porta um outro gene que codifica pelo menos um outro peptídeo ou proteína de interesse.

[059] As plantas transformadas de acordo com a presente invenção podem ser monocotiledôneas ou dicotiledôneas. De preferência, essas plantas são plantas de interesse agronômico. De modo vantajoso, as plantas monocotiledôneas são o trigo, o milho, o arroz. De modo vantajoso, as plantas dicotiledôneas são a colza, a soja, o tabaco, o algodão.

[060] A presente invenção trata ainda de um processo de cultura das plantas transformadas de acordo com a presente invenção, caracterizada pelo fato de consistir em plantar as sementes das ditas plantas transformadas sobre a superfície de um campo apropriado para a cultura das ditas plantas, em aplicar sobre a dita superfície do dito campo pelo menos uma composição herbicida que compreende um inibidor de HPPD, sem afetar substancialmente as ditas sementes ou as ditas plantas transformadas, e em colher a seguir as plantas cultivadas quando elas atingirem a maturidade desejada e eventualmente em separar as sementes das plantas colhidas.

[061] A presente invenção trata também de um processo para conferir às plantas uma tolerância aos inibidores de HPPD, caracterizado pelo fato de se transformar as ditas plantas simultânea ou sucessivamente, com:

(1) um gene funcional nas plantas que permite a superexpressão de uma enzima PDH (2) um gene funcional nas plantas que permite a superexpressão de uma enzima HPPD.

[062] A presente invenção trata também do uso das plantas ou células vegetais de acordo com a presente invenção para produzir prenilquinonas, em particular tocoferóis, tocotrienóis e/ou plastoquinonas.

21/32 [063] A presente invenção trata também de um processo para aumentar a quantidade de prenilquinonas nas plantas, caracterizado pelo fato de se transformar as ditas plantas, simultânea ou sucessivamente, com:

[064] A presente invenção trata também de um processo de produção de prenilquinonas, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de colocação em cultura de uma célula vegetal ou de uma planta transformada de acordo com a presente invenção em um meio de cultura adaptado ao crescimento e à multiplicação da dita célula vegetal ou da dita planta.

[065] De acordo com um modo particular de realização do dito processo, as prenilquinonas produzidas são preferencialmente tocoferóis representados pela vitamina E.

[066] De acordo com um modo particular de realização do dito processo, as prenilquinonas produzidas são preferencialmente tocotrienóis.

[067] De acordo com um modo de realização particular da presente invenção, o dito processo de produção de prenilquinonas compreende uma etapa posterior de extração das ditas prenilquinonas produzidas pela dita célula vegetal ou pela dita planta transformada cultivada na primeira etapa.

[068] Quando o dito processo de produção de prenilquinonas é realizado com células vegetais transformadas de acordo com a presente invenção, as ditas células vegetais são cultivadas em um meio de cultura favorável a sua sobrevida e a seu crescimento. O técnico no assunto saberá determinar a composição do dito meio de cultura de modo a permitir um crescimento ótimo das ditas células vegetais. A título de exemplo, os métodos

22/32 e meio de cultura de células vegetais estão descritos em Murashige et Skoog (1962, Physiol. Plant. 15: 473-497) e em Gamborg et al. (1968, Exptl. Cell Research, 50: 151-159).

[069] Além disso, quando o dito processo é realizado com células vegetais transformadas de acordo com a presente invenção, as ditas prenilquinonas produzidas podem ser secretadas no meio de cultura ou não. Quando as ditas prenilquinonas são secretadas no meio de cultura, a etapa de extração do dito processo pode ser antecedida por uma etapa de recuperação do meio de cultura por eliminação das ditas células vegetais. Uma etapa de recuperação do meio de cultura por eliminação das ditas células vegetais pode ser feita por qualquer meio de separação de frações sólidas compreendidas em uma fração líquida. Em particular, a filtração e a centrifugação são meios apropriados à realização dessa etapa.

[070] Quando as prenilquinonas não são secretadas no meio de cultura, a etapa de extração pode ser realizada por sucessão de etapas de concentração das células vegetais cultivadas, de quebra celular das células vegetais isoladas, de centrifugação do extrato celular quebrado, seguida de recuperação do sobrenadante que compreende as ditas prenilquinonas. A etapa de quebra celular pode ser realizada pela utilização das técnicas conhecidas do técnico no assunto tais como a moagem mecânica (por diferença de pressão, por ação dos ultrassons, por trituração), a lise enzimática, ou o choque osmótico, sendo que as ditas técnicas podem ser empregadas individualmente ou em combinação.

[071] Quando o dito processo de produção de prenilquinonas é realizado com plantas transformadas de acordo com a presente invenção, as ditas plantas são cultivadas sobre um substrato apropriado a sua sobrevida e a seu crescimento, substrato esse que pode ser natural ou artificial. Um substrato natural pode ser, por exemplo, terra, ou uma mistura de terras, e as ditas

23/32 plantas poderão ser cultivadas em condições controladas como, por exemplo, em câmaras de cultura, em condições semi-controladas como, por exemplo, em estufa, ou em condições naturais como, por exemplo, em pelo pleno campo. Um substrato artificial pode ser, por exemplo, um substrato líquido ou gelificado cuja composição seja favorável à sobrevida e ao crescimento das plantas de acordo com a presente invenção. O técnico no assunto saberá determinar a composição do dito substrato artificial de modo a permitir um crescimento ótimo das ditas plantas. A título de exemplos de substratos de cultura de plantas, podem-se citar meios de tipo lã de Roche, ou vermiculita irrigada por uma solução nutritiva que contém elementos nutritivos N (Nitrogênio), P (Fósforo), K (Potássio), ou qualquer outra solução nutritiva, comercial ou adaptada, que permita que as plantas cresçam sobre esses meios. Quando as plantas de acordo com a presente invenção são cultivadas sobre um substrato artificial, elas são geralmente cultivadas em condições controladas em câmara de cultura.

[072] Além disso, quando o dito processo é realizado com plantas transformadas de acordo com a presente invenção, as ditas prenilquinonas produzidas são geralmente imobilizadas nas ditas plantas transformadas.

[073] As plantas transformadas de acordo com a presente invenção, ou uma parte das ditas plantas, podem ser utilizadas diretamente e incorporadas às composições alimentares destinadas à alimentação humana ou animal, ou então sofrer uma extração das prenilquinonas que elas contêm. Conforme indicado anteriormente, por “parte de plantas”, entende-se qualquer órgão dessas plantas, seja ele aéreo ou subterrâneo. Os órgãos aéreos são os caules, as folhas, e as flores que compreende os órgãos reprodutores masculino e feminino, bem como as sementes. Os órgãos subterrâneos são principalmente as raízes, mas pode ser também tubérculos. De acordo com um

24/32 modo preferido de realização da presente invenção, as sementes são as partes das plantas transformadas destinadas à alimentação.

[074] A presente invenção compreende também as sementes das plantas transformadas de acordo com a presente invenção, sementes essas que são ricas em prenilquinonas em comparação com as sementes de plantas não transformadas. Além disso, a presente invenção compreende também composições alimentares que compreendem sementes ou qualquer outra parte das plantas transformadas de acordo com a presente invenção. O óleo produzido a partir dessas plantas, em particular das sementes, é também um objeto da presente invenção.

[075] A fim de recuperar as prenilquinonas produzidas na planta transformada, uma etapa de extração pode ser realizada pela sucessão de etapas de moagem das plantas cultivadas, de filtração e/ou centrifugação do homogenato das plantas, seguida de recuperação do sobrenadante que compreende as ditas prenilquinonas, recuperação essa que pode consistir em uma extração dos compostos lipídicos. De preferência, a etapa de moagem consiste em uma moagem mecânica (por diferença de pressão, por ativação dos ultra-sons, por trituração), que pode ser seguida de uma lise enzimática, ou de um choque osmótico.

[076] O presente processo pode também realizar uma etapa final de purificação das prenilquinonas contidas no extrato da célula vegetal ou de planta obtida. A purificação das ditas prenilquinonas pode ser feita por qualquer técnica de concentração ou de separação de compostos, em particular de técnicas de microfiltração, ultrafiltração, de eletroforese ou de cromatografia bem conhecidas do técnico no assunto. A fim de chegar a prenilquinonas purificadas, o técnico no assunto saberá empregar um método de mensuração das ditas prenilquinonas para identificar a(s) fração(ões) de purificação que contêm as ditas prenilquinonas. De acordo com esse processo,

25/32 as ditas prenilquinonas produzidas podem ter uma pureza de 50%, de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou vantajosamente 100%.

[077] De acordo com um modo particular de realização da presente invenção, as plantas transformadas de acordo com a presente invenção compreendem, além de um gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão da enzima PDH e de um gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão da enzima HPPD, um gene funcional nas plantas que permite a superexpressão de enzima geranilgeranil redutase (denominada a seguir GGR). Entre as prenilquinonas produzidas, essas plantas produzem preferencialmente tocoferóis, em particular vitamina E, em relação aos tocotrienóis e às plastoquinonas.

[078] A enzima GGR é uma enzima que catalisa a transformação do geranilgeranil pirofosfato em fitilpirofosfato. De acordo com um modo particular de realização, o gene funcional nas plantas que permitem a superexpressão de GGR compreende a sequência codificadora de um gene que codifica uma GGR de planta. Como exemplo, pode-se utilizar a sequência que codifica a GGR de Arabidopsis tal como publicada em Keller et al., (1998. Eur. J. Biochem. 251(1-2): 413-417), ou as descritas pelos números de acesso AJ 007789 (Tabaco), AF 069318 (Mesembryanthenum crystallinum), Y14044 (Arabidopsis), Q55087 (Synechocystis sp PCC 6803).

Exemplos [079] Os exemplos a seguir permitem ilustrar a presente invenção sem, todavia limitar seu alcance.

[080] Todos os métodos ou operações descritos a seguir nestes exemplos são dados a título de exemplos e correspondem a uma escolha, efetuada entre os diferentes métodos disponíveis para chegar ao mesmo resultado. Essa escolha não tem nenhuma incidência sobre a qualidade do resultado e, conseqüentemente, todo método adaptado pode ser utilizado pelo técnico no

26/32 assunto para chegar ao mesmo resultado. Em particular, e a menos que seja especificado de outra forma nos exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante empregadas são utilizadas de acordo com os protocolos padrão descritos em Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^a edição, Nolan C. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), em Sambrook and Russel (2001, Molecular cloning: A laboratory manual, 3a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), em Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current protocols, USA, Vol.1 e 2), e em Brown (1998, Molecular Biology LabFax, 2a edição, Academic Press, UK). Materiais e métodos padrão para a biologia molecular das plantas estão descritos em Croy R.D.D. (1993, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications (UK). Materiais e métodos padrão para a PCR (Reação em Cadeia de Polimerase) estão também descritos em Dieffenbach and Dveksler (1995, PCR Primer: A Iaboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) e em McPherson et al.(2000, PCR - Basics: From background to bench, 1a edição, Springer Verlag, Germany).

Exemplo 1: Mensuração da atividade HPPD [081] A atividade HPPD pode ser medida pelo método descrito em Garcia et al. (1997, Biochem. J. 325: 761-769) ou Garcia et al. (1999, Plant Physiol.119: 1507-1516).

Exemplo 2: Mensuração da atividade prefenato desidrogenase [082] A atividade prefenato desidrogenase é medida a 25°C por acompanhamento espectrofotométrico a 340 nm da formação de NADH ou NADPH em uma solução que contém 50 mM de Tris HCl, pH 8,6, 300 μΜ de prefenato, e 1 mM de NAD ou NADP em um volume total de 200 μι

Exemplo 3: Construção de um gene quimérico que superexpressa HPPD [083] Foi construído um gene quimérico que permite a superexpressâo de HPPD para conferir a resistência a plantas frente a herbicidas que inibem a HPPD.

27/32 [084] Ele consiste em reunir, no sentido da transcrição, um promotor chamado de “dupla histona” (PdH4) tal como descrito no documento EP 0.507.698, a sequência do amplificador translacional do vírus etch do tabaco (TEV) descrito em Carrington and Freed (1990, J. Virol. 64:1590-1597), uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito otimizado (OTP) tal como descrito no documento EP 0.508.909, a parte codificadora do gene da HPPD de Arabidopsis thaliana descrita no documento WO 96/38567, e a seguir o terminador nos do gene da nopalina sintase descrito em Bevan et al., (1983, Nucleic Acids Res. 11(2): 369-385). O conjunto é depois clonado em um vetor binário e tem por estrutura:

PdH4

HPPD

Exemplo 4: Construção de um gene quimérico que superexpressa PDH [085] A construção de um gene quimérico que superexpressa PDH consiste em reunir no sentido da transcrição um promotor chamado de “dupla histona” (PdH4) tal como descrito no documento EP 0.507.698, a sequência do amplificador translacional do vírus etch do tabaco (TEV) descrito em Carrington and Freed (1990, J. Virol. 64:1590-1597), uma sequência que codifica um peptídeo de trânsito otimizado (OTP) tal como descrito no documento EP 0.508.909, a parte codificadora do gene PDH de levedura descrito em Mannhaupt et al. (1989, Gene 85: 303-311), e a seguir o terminador nos da nopalina sintase descrito em Bevan et al. (1983, Nucleic Acids Res. 11(2): 369-385). O conjunto é depois clonado em um vetor binário pRD 224 que contém um gene de resistência à canamicina (NPTII) para dar um vetor pRD 224-PDH. Esse vetor tem por estrutura:

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[086] Esse vetor binário foi depois utilizado para transformar a linhagem de Agrobacterium EHA 105 para dar a linhagem de Agrobacterium EHA, 105-pRD 224-PDH. Essa linhagem de Agrobacterium foi utilizada para transformar tabaco PBD6 e tabaco PBD6-ARA9 (tabaco transformado com o gene quimérico que permite a superexpressão da HPPD de Arabidopsis thaliana).

[087] As plantas transformadas foram selecionadas com canamicina.

Exemplo 5: Transformação dq tabaco PBD6-ARA9 com um cassete de EXPRESSÃO QUE SUPEREXPRESSA PDH [088] Os tabacos PBD6-ARA9 são tabacos transformados com um gene quimérico tal como descrito no exemplo 3, e superexpressam a HPPD de A. thaliana descrita no documento WO 96/38567. O método de obtenção dos tabacos PBD6-ARA9 está descrito em Garcia et al. (1999, Plant Physiol.ld, 1507-1516). As linhagens PBD6-ARA9 transformadas com o gene quimérico que superexpressa PDH tal como descrito no exemplo 4 são denominadas linhagens ARA9-PDH.

5.1: Transformação [089] A transformação é realizada com a linhagem não oncogênica de Agrobacterium tumefaciens EHA 105-pRD 224-PDH de acordo com a técnica dos discos foliares (Horsch et al., 1985, Science 227: 12291231).

5.2: Regeneração [090] A regeneração do tabaco ARA9-PDH é realizada a partir de explantos foliares sobre um meio de base Murashig & Skoog (MS) que

29/32 compreende 30 g/l de sacarose bem como 350 mg/l de cefotaxima e 200 mg/ml de canamicina. Os explantos foliares são preferidos sobre plantas em estufa e regenerados de acordo com a técnica dos discos foliares (Horsch et al., 1985, Science 227: 1229-1231) em três etapas sucessivas:

- A primeira compreende a indução das mudas sobre um meio MS ao qual foram adicionadas 30 g/l de sacarose que contém 0,05 mg/l de ácido naftilacético (ANA) e 2 mg/l de benzilaminopurina (BAP) durante 15 dias e 200 mg/ml de canamicina.

- As mudas verdes formadas durante essa etapa são depois desenvolvidas por cultura sobre um meio MS ao qual foram adicionadas 30 g/l de sacarose e 200 mg/ml de canamicina, mas que não contêm hormônios, durante 10 dias.

- Mudas desenvolvidas são depois retiradas, e depois cultivadas sobre um meio de enraizamento MS com um teor metade em sais, vitaminas e açúcares, 200 mg/ml de canamicina e sem conter hormônios. Após cerca de 15 dias, as mudas enraizadas são passadas para a terra.

[091] A tolerância das plantas transformadas é estudada por semeadura em um solo tratado com dicetonitrila (DKN).

Exemplo 6: Tolerância dos tabacos PBD6-ARA9 e ARA9-PDH aos

INIBIDORES DA HPPD

6.1 Tolerância à dicetonitrila (DKN) [092] Foram semeadas 13 linhagens ARA9-PDH e a linhagem PBD6-ARA9 que serviu de material de partida para a transformação em concentrações crescentes de DKN: 5,10 e 32 ppm.

[093] A 5 ppm de DKN, todas as linhagens PBD6-ARA9 e ARA9PDH resistem, em particular, pois todas superexpressan a HPPD de A. thaliana. A 10 ppm de DKN, a linhagem parental PBD6-ARA9 fica completamente inibida. Ao contrário, todas as linhagens ARA9-PDH resistem bem, com a exceção de uma

30/32 única (ARA9-PDH4) que fica inibida. A 32 ppm de DKN, todas as linhagens ARA9PDH que resistiam a 10 ppm de DKN possuem plantas que resistem e crescem normalmente, enquanto a linhagem parental PBD6-ARA9 que só expressa a HPPD recombinante fica completamente inibida. As linhagens que mostram a melhor tolerância são as linhagens ARA9-PDH14, ARA9-PDH18, e ARA9-PDH24.

6.2 Tolerância à sulcotriona e à mesotriona [094] A mesma experiência foi realizada com inibidores da HPPD, sulcotriona e mesotriona. A linhagem ARA-PDH18 mostra ser tolerante a 3 pM de mesotriona e a 6 pM de sulcotriona, enquanto que uma linhagem de tabaco selvagem do tipo “Tipo Havana” é sensível a 0,375 pM desses dois compostos.

Exemplo 7: Mensuração das taxas de tocoferóis e de tocotrienóis em tabacos PBD6-ARA9 e ARA9-PDH [095] Um extrato lipídico é obtido pelo método de Folch (Folch et al., 1957, J. Biol. Chem., 226-497), em amostras de folhas médias e de folhas muito jovens de cada uma das plantas analisadas. Uma análise de seus conteúdos em tocoferóis e tocotrienóis é depois realizada por HPLC de acordo com o método de Frazer et al. (2000, Plant J. 24: 551-558). Esses conteúdos são depois quantificados em relação a produtos de referência, e depois expressos em pg por g de massa seca. Os resultados são apresentados na Tabela I.

Tabela 1

Taxa de tocoferóis e de tocotrienóis em amostras das plantas PBD6,

PBD6-ARA9 (ARA9) E ARA9-PDH (PDH4, PDH 14, PDH 18, PDH 24).

Folhas médias	PBD6	ARA9	PDH 4 (pg por g de	PDH 14 peso seco)	PDH18	PDH 24
α Tocoferol	62,2	64,73	66,9	89,7	91,03	83,4
β/γ Tocoferol	1,73	1,93	2,16	4,56	4,28	4,01
δ Tocoferol	nd	nd	nd	nd	nd	Nd

31/32

Folhas médias	PBD6	ARA9 (gg	PDH 4 por g de p	PDH 14 eso seco)	PDH18	PDH 24
α Tocotrienol	nd	nd	nd	64,58	66,99	55,35
β/γ Tocotrienol	nd	nd	nd	2,04	2,23	1,98
δ Tocotrienol	nd	nd	nd	nd	nd	Nd

Folhas muito jovens	PBD6	ARA9	PDH 4 (gg por g dc	PDH 14 peso seco)	PDH18	PDH 24
α Tocoferol	73,5	64,73	68,7	76,2	75,4	83,4
β/γ Tocoferol	1,83	2,37	1,86	3,32	3	3,5
δ Tocoferol	nd	nd	nd	nd	nd	Nd
α Tocotrienol	nd	nd	nd	275,26	224,50	242,40
β/γ Tocotrienol	nd	nd	nd	17,45	15,3	17,14
δ Tocotrienol	nd	nd	nd	6,2	4,3	5,4

[096] Esses resultados mostram claramente que os tabacos

ARA9-PDH duplamente transformados com genes quiméricos que permitem a superexpressão das enzimas PDH e HPPD possuem quantidades superiores de prenilquinonas, em particular de tocoferóis e de tocotrienóis, em relação aos tabacos PBD6-ARA9 simplesmente transformados com um gene que codifica uma enzima HPPD. O efeito mais importante diz respeito aos tocotrienóis. Esse efeito é ainda mais acentuado nas folhas muito jovens ricas em tecidos meristemáticos. A origem dessa especificidade de tecido está ligada ao promotor utilizado para criar os tabacos ARA9-PDH que se expressa preferencialmente nos tecidos em crescimento rápido das plantas, em particular os meristemas (PdH4). O uso de outros tipos de promotores deveria permitir obter um efeito similar em outros tecidos da planta.

32/32 [097] Por outro lado, as diferenças observadas entre as diferentes linhagens ARA9-PDH provêm do fato de se tratar de eventos de transformação diferentes. Cruzamentos entre as melhores linhagens que visam a elaboração de linhagens homozigotas deveriam permitir a obtenção de linhagens homogêneas quanto à produção de prenilquinonas e à tolerância aos inibidores de HPPD.

Claims

1. Processo para conferir uma tolerância aos inibidores de phidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) às plantas, caracterizado pelo fato das ditas plantas (i) serem transformadas, simultânea ou sucessivamente, com (1) um gene quimérico compreendendo um promotor que é funcional nas plantas e uma sequência que codifica uma enzima prefenato desidrogenase (PDH) exceto a sequência codificante de PDH originada do gene TyrA de Erwinia herbicola e (2) um gene quimérico compreendendo um promotor que é funcional nas plantas e uma sequência que codifica uma enzima phidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) e (ii) serem selecionadas por cultivo em presença de herbicidas do tipo inibidores de HPPD.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da enzima prefenato desidrogenase (PDH) ser de levedura.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato da enzima prefenato desidrogenase (PDH) de levedura ser de Saccharomyces cerevisiae.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato da enzima p-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) ser de planta.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da enzima p-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) de planta ser de Arabidopsis thaliana.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato das plantas serem transformadas, simultânea ou sucessivamente, com adicionalmente um gene quimérico compreendendo um promotor que é funcional nas plantas e uma sequência que codifica uma enzima geranilgeranil redutase (GGR).

Petição 870180145838, de 29/10/2018, pág. 6/9

2/2

7. Processo de cultura de plantas transformadas a partir do processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de consistir em plantar sementes das ditas plantas transformadas em uma superfície de um campo apropriado para a cultura das ditas plantas, em aplicar sobre a dita superfície do dito campo pelo menos uma composição herbicida que compreende um inibidor de p-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), sem afetar substancialmente as ditas sementes ou as ditas plantas transformadas, e em colher a seguir as plantas cultivadas quando elas atingem a maturidade desejada e eventualmente em separar as sementes das plantas colhidas.