BRPI0306955B1

BRPI0306955B1 - variante de protease subtilisina de bacillus lentus, dna, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica, bem como composição de limpeza

Info

Publication number: BRPI0306955B1
Application number: BRPI0306955A
Authority: BR
Inventors: Ayrookaran J Poulose; David A Estell; James T Kellis Jr; Richard R Bott
Original assignee: Danisco Us Inc; Genencor Int
Priority date: 2002-01-16
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2016-03-22
Also published as: EP1523553A4; WO2003062381A2; BR0306955A; PT1523553E; EP1523553B1; CA2472725C; MXPA04006809A; CA2472725A1; JP2005519592A; EP1523553A2; WO2003062381A3; ES2336092T3; DK1523553T3; US20080124783A1; ATE450606T1; US20130171717A1; US7306937B2; JP2011041571A; US20090011489A1; JP4703113B2

Abstract

"variantes de protease com várias substituições". a presente invenção refere-se às novas variantes de enzima que incluem variantes de protease derivadas das seqüências de dna de proteases não-humanas naturais ou recombinantes. as proteases variantes, em geral, são obtidas por modificação in vitro de uma seqüência de dna precursora codificando a protease natural ou recombinante para gerar a substituição de vários resíduos de aminoácido na seqüência de aminoácidos de uma protease precursora. tais proteases variantes têm propriedades que são diferentes daquelas da protease precursora, tal como desempenho de lavagem alterado. o resíduo de aminoácido substituído corresponde às posições 27, 45, 170, 181, 251 e 271 da subtilisina do bacillus amyloliquefaciens. também estão descritas variantes adicionais compreendendo pelo menos uma substituição adicional em uma posição selecionada de 1, 14, 49, 61, 87, 100, 102, 118, 128, 204 e 258 da subtilisina do bacillus amyloliquefaciens.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTE DE PROTEASE SUBTIUSINA DE BACILLUS LENTUS, DNA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA PROCARIÓTICA, BEM COMO COMPOSIÇÃO DE LIMPEZA".

Antecedentes da Invenção Serina proteases são um subgrupo de carbonil hidrolases. Elas compreendem uma classe distinta de enzimas com uma ampla gama de espe-cificidades e funções biológicas, Stroud, R, Sei. Amer, 131; 74-88, Apesar de sua diversidade funcional, o mecanismo catalítico das serina proteases foi proposto através de pelo menos duas famílias geneticamente distintas de enzimas: 1) as subtilisinas e 2) as serina proteases bactéria nas homólogas e relacionadas com quimotripsina de mamíferos (por exemplo, tripsina e tripsina de $. gre-sius). Estas duas famílias de serina proteases apresentam mecanismos de ca-tálise extrema mente similares, Kraut, J. (1977), Annu, Rev, Biochem.. 46; 331 -358, Além disso, embora a estrutura primária não esteja relacionada, a estrutura terciária dessas duas famílias de enzimas têm em comum uma tríade catalítica conservada de aminoácidos que consiste em serina, histidina e aspartato.

Subtilisinas são serina proteases {PM aproximado 27.500) que são secretadas em grandes quantidades de uma ampla variedade da espécie Bacilíus e outros microrganismos. Foi determinada a sequencia proteica da subtil isina de pelo menos nove espécies diferentes de Bacilíus, Markland, F. S. et al. (1983), Hoope-Sevler’s Z. Phvsiol, Chem.. 364; 1537-1540. Já foi apresentada a estrutura cristalográfica tridimensional das subtilisinas do Ba-cillus amyloliquefaciens, Bacilíus íicheniforimis e diversas variantes naturais do B. íentus. Esses estudos indicam que embora a subtil isina não seja geneticamente relacionadas com as serina proteases de mamíferos, ela tem uma estrutura de sítio ativo similar. As estruturas cristalinas por difração de raios X da subtilisina contendo inibidores de peptídeo coval ente mente ligados (Robertus, J, D, et al, (1972), Biochemistrv. 11: 2439-2449) ou complexos de produtos (Robertus, J, D, et al. (1976), J. Biol, Chem.. 251: 1097-1103) também forneceram informações referentes ao sítio ativo e à suposta fenda fixadora de substrato da subtilisina, Além disso, foi apresentado um grande número de estudos sobre a modificação cinética e química para a subtilisina; Svendsen, B. (1976), Carlsberq Res. Commun.. 41:237-291; Ma-rkland, F. S. Id.) bem como pelo menos um relatório onde a cadeia lateral da metionina no resíduo 222 da subtilisina foi convertida por peróxido de hidrogênio em suifóxido de metionina (Stauffer, D. C. et ai. (1965), J. Biol. Chem., 244: 5333-5338) e foi feita uma extensa mutagênese específica para sítio (Wells e Estell (1988) TIBS 13: 291-297).

Sumário da Invenção Em um aspecto da invenção, a distribuição de carga de uma molécula é alterada para afetar sua orientação e interação com fases, superfícies, outras moléculas e campos. A presente invenção contempla uma variante de enzima de uma enzima precursora ou elementar, a variante compreendendo uma ou mais modificações em uma posição de um resíduo de aminoácido carregado, a variante sendo caracterizada por ter a mesma carga eletrostática efetiva e/ou o mesmo ponto isoelétrico que a enzima precursora.

Em um outro aspecto, a presente invenção contempla uma variante de protease de uma protease precursora, a variante compreendendo uma ou mais modificações em uma posição de um resíduo de aminoácido carregado, a variante sendo caracterizada por ter a mesma carga eletrostática efetiva ou o mesmo ponto isoelétrico que a protease precursora. Os aminoácidos carregados podem ser ácido aspártico, ácido glutâmico, histidi-na, lisina, tirosina e arginina. As posições no resíduo podem ser aquelas equivalentes às posições 5, 7, 23, 26, 28-31, 34, 47, 63, 65, 66, 69, 70, 73, 82-85, 88, 90, 92, 93, 105,113, 125, 138, 139,148-151, 176,178, 179, 193, 196, 200, 201, 202, 207, 219, 220, 223, 229, 233, 250, 266, 267 e 273 da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens identificadas neste relatório. As posições no resíduo também podem ser aquelas equivalentes às posições 27, 39, 41, 45, 67, 94, 136, 170,181, 247, 251 e/ou 271 da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens. Constitui um outro aspecto fornecer seqüências de DNA codificando tais variantes da protease, bem como vetores de expressão contendo tais seqüências de DNA variantes.

Uma variante de protease de uma protease precursora, a referi- da variante compreendendo um ou mais modificações em uma posição de um resíduo de aminoácido carregado, a referida variante sendo caracterizado por ter a mesma carga eletrostática efetiva que a referida protease precursora. A variante de protease de acordo com a reivindicação 1, onde o referido aminoácido carregado é selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina e arginina. A variante de protease compreende uma seqüência de aminoácidos tendo uma substituição em uma ou mais posições no resíduo equivalentes às posições no resíduo selecionadas do grupo que consiste em 27, 45,170,181, 251 e 271 da subtilisina do Ba-cillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID N° 2. A variante de protease compreendendo uma substituição em uma ou mais posições correspondentes às posições 27, 45,170,181, 251 e 271 é uma substituição selecionada de K27T, R45N, R170S, D181N, K251G e E271T. A variante de protease pode compreender ainda uma substituição adicional em uma ou mais posições correspondentes às posições 1,14, 49, 61, 87,100,102,118,128, 204 e 258 da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID N° 2. As variantes podem ser selecionadas das combinações R45N-G118E-E271R, R45N-P14R, R45N-N204R, D181N-G118D, R45N-G258R, R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, K251G-S87K, R170S-S216R, E271T-G100E, E271T-G102E, E271T-S128E, K27T-G100E, R170S-G100R, E271T-S49E e E271T-S128E.

Constitui ainda um outro aspecto da invenção fornecer células hospedeiras transformadas com tais vetores. É ainda oferecida uma composição de limpeza compreende uma variante de protease da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos As figuras 1 A-C mostram as seqüências de DNA (SEQ ID N°: 1) e de aminoácidos (SEQ ID N°: 2) da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens e um mapa de restrição parcial desse gene. A figura 2 mostra os resíduos de aminoácidos conservados entre subtilisinas do Bacillus amyloliquefaciens (BPN)’ e do Bacillus lentus (tipo selvagem).

As figuras 3A e 3B mostram a seqüência de aminoácidos de quatro subtilisinas. A linha superior representa a seqüência de aminoácidos da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens (às vezes também chamada de subtilisina BPN') (SEQ ID N°: 3). A segunda linha representa a seqüência de aminoácidos da subtilisina do Bacillus subtilis (SEQ ID N°: 4). A terceira linha representa a seqüência de aminoácidos da subtilisina do B. lichenifor-mis (SEQ ID N°: 5). A quarta linha representa a seqüência de aminoácidos da subtilisina do Bacillus lentus (também chamada de subtilisina 309 na publicação PCT WO 89/06276 (SEQ ID N°: 6). O símbolo * significa a ausência de resíduos de aminoácidos específicos em comparação com a subtilisina BPN'. A figura 4 mostra o vetor de expressão pVS08 do B. subtilis. A figura 5 mostra a orientação do iniciador Apal normal, do inici-ador Apal invertido, do iniciador mutagênico invertido e do iniciador mutagê-nico normal.

Descrição Detalhada da Invenção Proteases são carbonil hidrolases que geralmente agem para clivar ligações peptídicas de proteínas ou peptídios. Conforme aqui usado, "protease" significa uma protease natural ou uma protease recombinante. Proteases naturais incluem α-aminoacilpeptídio hidrolase, peptidil aminoáci-do hidrolase, acilamino hidrolase, serina carboxipeptidase, metalocarboxi-peptidase, tiol proteinase, carboxil proteinase e metaloproteinase. Estão incluídas serina, metalo, tiol e ácido proteases, bem como endo e exo-proteases.

A presente invenção inclui enzimas do tipo protease que são variantes de carbonil hidrolase (variantes de protease) não-naturais com atividade proteolítica, estabilidade, especificidade para substrato, perfil de pH e/ou desempenho diferentes em comparação com a carbonil hidrolase precursora da qual deriva a seqüência de aminoácidos da variante. Especificamente, tais variantes de protease têm uma seqüência de aminoácidos não encontrada na natureza, que é obtida por substituição de vários resíduos de aminoácido de uma protease precursora com diferentes aminoácidos. A protease precursora pode ser uma protease natural ou uma protease re-combinante.

As variantes de protease úteis nesta invenção abrangem a substituição de qualquer um dos dezenove L-aminoácidos naturais nas posições designadas no resíduo de aminoácido. Tais substituições podem ser feitas em qualquer subtilisina precursora (de procariota, eucariota, mamífero etc.). Em todo este relatório referimo-nos aos vários aminoácidos por meio de códigos comuns de uma a três letras. Tais códigos estão identificados em Dale, M. W. (1989), Molecular Genetics of Bactéria. John Wiley & Sons, Ltd., Apêndice B.

As variantes de protease úteis nesta invenção derivam de preferência de uma subtilisina de Bacillus. Mais preferivelmente, as variantes de protease derivam da subtilisina do Bacillus lentus e/ou da subtilisina 309.

Subtilisinas são proteases bacterianas ou fúngicas que geralmente agem para clivar ligações peptídicas de proteínas ou peptídios. Conforme aqui usado, "subtilisina" significa uma subtilisina natural ou uma subtilisina recombinante. Sabe-se que uma série de subtilisinas naturais são produzidas e geralmente secretadas por várias espécies microbianas. As se-qüências de aminoácidos dos membros desta série não são totalmente homólogas. No entanto, as subtilisinas nesta série apresentam o mesmo tipo ou um tipo similar de atividade proteolítica. Esta classe de serina proteases compartilha uma seqüência de aminoácidos comum definindo uma tríade catalítica que as distingue da classe relacionada com quimotripsina das serina proteases. As subtilisinas e serina proteases relacionadas com quimotripsina possuem uma tríade catalítica compreendendo aspartato, histidina e serina. Nas proteases relacionadas com subtilisina, a ordem relativa desses aminoácidos, lendo do terminal amino para o carbóxi, é aspartato-histidina-serina. Nas proteases relacionadas com quimotripsina, a ordem relativa, no entanto, é histidina-aspartato-serina. Assim, neste relatório subtilisina refere-se a uma serina protease com a tríade catalítica de proteases relacionadas com subtilisina. Exemplos incluem, porém sem limitação, as subtilisinas identificadas na figura 3 deste relatório. Em geral e para os propósitos da presente invenção, a numeração dos aminoácidos nas proteases corresponde aos números atribuídos à seqüência da subtilisina madura do Bacillus amyloliquefaciens apresentada na figura 1. "Subtilisina recombinante" ou "protease recombinante" referem-se a uma subtilisina ou protease em que a seqüência de DNA codificando a subtilisina ou protease é modificada para produzir uma seqüência de DNA variante (ou mutante) que codifica a substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácidos natural. Métodos adequados para produzir tal modificação, e que podem ser combinados com aqueles aqui descritos, incluem aqueles descritos na Patente US RE 34.606, Patente US 5.204.015 e Patente US 5.185.258, Patente US 5.700.676, Patente US 5.801.038 e Patente US 5.763.257. "Subtilisinas não-humanas" e o DNA que as codifica podem ser obtidos de muitos organismos procarióticos e eucarióticos. Exemplos adequados de organismos procarióticos incluem organismos Gram-negativos tais como E. coli ou Pseudomonas e bactérias Gram-positivas tais como Mi-crococcus ou Bacillus. Exemplos de organismos eucarióticos dos quais se podem obter subtilisina e seus genes incluem levedura tal como Saccha-romyces cerevisiae, fungos tal como Aspergillus sp.

Uma "variante de enzima" tem uma seqüência de aminoácidos que deriva da seqüência de aminoácidos de uma "enzima precursora". As enzimas precursoras proteases incluem enzimas naturais e enzimas recom-binantes. As enzimas contempladas pelos inventores incluem, porém sem limitação, oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Enzimas exemplificativas específicas contempladas pelos inventores incluem, porém sem limitação, amilases, lacases, proteases, desidroge-nases e permeases. A seqüência de aminoácidos da variante de enzima "deriva" da seqüência de aminoácidos da enzima precursora pela substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos da seqüência de aminoácidos precursora. Tal modificação é da "seqüência de DNA da enzima precursora" que codifica a seqüência de aminoácidos da enzima precursora ao invés de manipulação da enzima precursora per se. Métodos adequados para tal manipulação da seqüência de DNA precursora incluem métodos descritos nesta invenção, bem como métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Considera-se que qualquer referência ou discussão referente a proteases pode ser aplicável a outras enzimas, por exemplo aquelas identificadas acima.

Uma "variante de protease" tem uma seqüência de aminoácidos que deriva da seqüência de aminoácidos de uma "protease precursora". As proteases precursoras incluem proteases naturais e proteases recombinan-tes. A seqüência de aminoácidos da variante de protease "deriva" da seqüência de aminoácidos da protease precursora pela substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos da seqüência de aminoácidos precursora. Tal modificação é "seqüência de DNA precursora" que codifica a seqüência de aminoácidos da protease precursora ao invés de manipulação da enzima protease precursora per se. Métodos adequados para tal manipulação da seqüência de DNA precursora incluem métodos descritos nesta invenção, bem como métodos conhecidos pelos versados na técnica (vide, por exemplo, as publicações EP 0 328299, WO 89/06279 e as patentes e pedidos US já mencionados). "Aminoácido carregado" é definido como um aminoácido que é potencialmente ionizável, muda de carga e oferece uma carga eletrostática a um pH específico ou em uma faixa de pH. Estes aminoácidos incluem, por exemplo, aminoácidos ácidos, aminoácidos básicos e alguns aminoácidos polares. Aminoácidos ácidos são aqueles que têm carga negativa a um pH igual a 6,0, por exemplo ácido aspártico (Asp ou D) e/ou ácido glutâmico (Glu ou E). Aminoácidos básicos são aqueles que têm carga positiva a um pH igual a 6,0, por exemplo lisina (Lys ou K), arginina (Arg ou R) e/ou histi-dina (His ou H). "Aminoácido não-carregado" é definido como um aminoácido que não é potencialmente ionizável. Estes aminoácidos incluem, porém sem limitação, aminoácidos não-polares não-carregados e/ou aminoácidos polares não-carregados. Aminoácidos não-polares não-carregados incluem, porém sem limitação, alanina (Ala ou A), valina (Vai ou V), leucina (Leu ou L), isoleucina (lie ou I), prolina (Pro ou P), fenilalanina (Phe ou F), triptofano (Trp ou W) e/ou metionina (Met ou M). Aminoácidos polares não-carregados incluem, porém sem limitação, glicina (Gly ou G), serina (Ser ou S), treonina (Thr ou T), cisteína (Cys ou C), tirosina (Tyr ou Y), asparagina (Asn ou N) e/ou glutamina (Gin ou Q). "Carga eletrostática efetiva" é definida como a soma das cargas eletrostáticas da variante ou enzima precursora ou protease a um dado pH ou faixa de pH. Um pH exemplificativo é pH 6,0. "Ponto isoelétrico" (pio) é definido como o valor de pH em que a proteína ou o complexo de proteína, por exemplo, a protease ou complexo de protease (com íons de metal ou outros íons opcionalmente ligados), é neutro, isto é, a soma das cargas eletrostáticas (carga eletrostática efetiva = NEC) no complexo é igual a zero. Nesta soma deve-se ievar em conta a natureza positiva ou negativa das cargas eletrostáticas individuais. O "mesmo ponto isoelétrico (pio) é definido como o pio dentro de uma faixa definida de unidades pH. Por exemplo, uma faixa definida de unidades pH poderia ser não superior a 1 unidade pH, entre 0,25 e 0,75, por exemplo 0,5 unidade pH, de preferência entre 0,01 e 0,5 unidade pH, por exemplo 0,1 unidade pH, e mais preferivelmente entre 0,001 e 0,05 unidade pH, por exemplo 0,01 unidade pH do pio com o qual o outro pio está sendo comparado. O mesmo ponto isoelétrico pode ser determinado a um dado pH ou a uma faixa de pH definida. "Carga eletrostática idêntica" é definida como mantendo "Z" ou o mesmo número de resíduos carregados específicos na variante de protease que o existente na protease precursora. Embora o número de resíduos carregados possa ser o mesmo, os resíduos de aminoácido específicos podem ser substituídos em outras posições do exterior da variante de protease desde que a carga eletrostática efetiva seja a mesma que a da protease precursora a um dado pH. A "mesma carga eletrostática efetiva" é definida como mantendo Z, ou a mesma soma das cargas eletrostáticas do precursor de protease em uma faixa definida da soma das cargas eletrostáticas da variante de protea- se. Mantendo a mesma soma das cargas eletrostáticas significa mantendo a carga eletrostática efetiva em uma faixa definida de unidades de carga em uma faixa definida de pH. Uma variante de protease tendo a mesma carga eletrostática efetiva que o precursor de protease teria uma carga eletrostática efetiva em um número definido de unidades de carga da protease precursora. Por exemplo, a variante de protease tendo a mesma carga eletrostática efetiva não pode ser superior a 1 unidade pH, entre 0,25 e 0,75 unidades de carga, por exemplo 0,5 unidade, da carga eletrostática efetiva da protease precursora. Ainda mais preferivelmente a variante de protease tendo a mesma carga eletrostática efetiva pode ser entre 0,05 e 0,25 unidade, por exemplo, 0,1 unidade da carga eletrostática efetiva da protease precursora. Ainda mais preferivelmente a variante de protease tendo a mesma carga eletrostática efetiva pode ser entre 0,001 e 0,05 unidade, por exemplo, 0,01 unidade da carga eletrostática efetiva da protease precursora. Unidades de carga podem ser definidas como o numero de prótons doados (ácidos) ou aceitos (básicos). A carga eletrostática de um aminoácido individual geralmente pode ser calculada determinando-se o número de prótons aceitos ou doados a um dado pH, por exemplo 6,0 ou 7,0. Os valores de Z também podem ser determinados pelas equações descritas mais adiante neste relatório. O "teor de cargas totais" da protease variante ou precursora é definido como o número total de cargas eletrostáticas da respectiva protease. Uma variante de protease com a mesma carga eletrostática efetiva pode ter um teor de cargas totais diferente daquele da protease precursora.

Como sabem os versados na técnica, o ponto isoelétrico pode ser convenientemente calculado usando-se considerações de equilíbrio usando valores de pK para os vários resíduos carregados na enzima em questão e em seguida encontrando por iteração o valor do pH em que a NEC da molécula da enzima é igual a zero, como descrito na publicação EP 0 945 502 e nos exemplos nela constantes, que está aqui incorporada em sua integridade a título de referência.

Um problema com esse cálculo é que os valores de pK para os resíduos carregados dependem de seu ambiente e por conseguinte estão sujeitos à variação. No entanto, resultados muito bons podem ser obtidos atribuindo-se valores de pK aproximados específicos aos resíduos carregados independentemente do valor real. Também é possível fazer cálculos mais sofisticados, levando-se parcialmente em consideração o ambiente. O pl0 também pode ser determinado experimentalmente por concentração ("focusing") isoelétrica ou titulação de uma solução contendo a enzima. Além disso, os vários valores de pK para os resíduos carregados podem ser determinados experimentalmente por titulação.

Em um outro aspecto da invenção, as observações acima acerca do pl0 são ainda utilizadas em um método para determinar ou escolher a(s) posição (posições) e o(s) aminoácido(s) a serem deletados, substituídos ou inseridos para o(s) aminoácido(s) na protease precursora, para que a carga eletrostática efetiva ou o ponto isoelétrico da protease variante seja a mesma que a NEC ou o pl0 da protease precursora calculados ao mesmo valor de pH ou em uma faixa definida de pH.

Uma outra maneira de expressar este princípio coberto pela invenção é que a(s) posição (posições) e o(s) aminoácido(s) a sere(m) deleta-do(s), substituído(s) ou inserido(s) para o(s) aminoácido(s) na referida protease ou enzima precursora são selecionados de maneira que o número total de cargas ou o teor de cargas totais (= TCC) e/ou a NEC em uma protease ou enzima variante resultante seja mantido constante para oferecer uma protease ou enzima variante tendo um ponto isoelétrico mantido o mesmo a um pH definido ou em uma faixa definida de pH para ótimo desempenho de lavagem da protease ou enzima, cujo pH ótimo deve estar o mais próximo possível do pH da solução de lavagem, na qual se pretende usar a protease mutante.

Como indicado acima, o pio de uma macromolécula tal como uma enzima é calculado como o pH em que a NEC da molécula é zero. O procedimento está exemplificado nos exemplos descritos na publicação EP 0 945 502, porém os princípios estão descritos mais detalhadamente neste relatório.

Valores de pK são atribuídos a cada resíduo de aminoácido potencialmente carregado. Em seguida a razão da ocorrência de um resíduo de aminoácido a um dado pH na forma carregada ou não-carregada (carre-gada/não-carregada, C/U(i)) é calculada tanto para a carga negativa como para a carga positiva usando as fórmulas Ia e Ib: (carga negativa) (Ia) (carga positiva (Ib).

De acordo com as fórmulas acima, se o pH for igual ao pKi, C/U(i) será igual a 1. A carga relativa, Qr (i), ou contribuição de carga atribuída a cada resíduo carregado é então calculada usando as fórmulas lia e llb: Qr (i) = C/U(i) / (1+C/U(i)) (carga negativa) (Ita) Qr (i) = -C/U(i) / (1+C/U(i)) (carga positiva (llb). O valor do pH em que a soma de todas as contribuições de carga dos resíduos carregados é igual a zero pode ser encontrado por iteração ou por interpolação em uma tabela de soma de pH-carga suficientemente compacta.

Os versados na técnica vão perceber que um outro método de determinação da carga eletrostática efetiva Z quando, se o grupo (tal como o grupo R ou amino) tiver a forma de um ácido catiônico, α representa a carga positiva fracionada: Por outro lado, para grupos como a carboxila, com uma forma de ácido neutro e uma base conjugada aniônica, α representa a fração não-carregada. A carga fracionada é então: Foi observado que várias propriedades de massa da protease ou da enzima dependem da NEC e/ou do ponto isoelétrico da molécula da protease ou da enzima. Por exemplo, a solubilidade, a estabilidade, a distribuição de fases em meios de fases múltiplas e/ou a carga superficial da protease ou enzima são propriedades que são afetadas por uma alteração da NEC e/ou do ponto isoelétrico da molécula. Surpreendentemente, é possível obter características melhoradas da protease ao mesmo tempo em que se mantém o mesmo ponto isoelétrico ou a mesma carga eletrostática efetiva. Embora não desejando se ater a uma teoria em particular, os inventores acreditam que existem situações em que se deseja manter as propriedades de massa da proteína, enzima ou protease em questão embora modificando a cinética da interação da molécula, por exemplo a distribuição de cargas ou a orientação da molécula em relação a um substrato, uma superfície ou um meio.

Em um aspecto da invenção, a variante de protease e a protease precursora têm a carga eletrostática efetiva idêntica e o ponto isoelétrico idêntico. A mesma carga eletrostática efetiva pode ser mantida tendo a carga eletrostática idêntica ou compensando a variação de carga resultante das posições adicionalmente modificadas por modificações adicionais na se-qüência de aminoácidos da protease precursora. Essas modificações adicionais incluem, porém sem limitação, a substituição ou inserção de um resíduo que tenha uma carga oposta à carga do resíduo adicional (adição de um resíduo ácido adicional para compensar um resíduo básico adicional). Assim, considera-se que o número de resíduos carregados na variante de protease pode ser diferente daquela do precursor de protease, por exemplo, quando o número de resíduos carregados é maior que no precursor de protease. Para compensar o resíduo carregado adicional, pode-se fazer uma substituição de aminoácido de carga oposta correspondente para manter a mesma carga eletrostática efetiva. Além disso, o número de resíduos carregados na variante de protease ou enzima pode ser menor que o número de resíduos carregados no precursor de protease ou enzima se uma deleção ou substituição de aminoácido de carga oposta correspondente de um outro resíduo não-carregado quando um resíduo carregado for deletado ou substituído com um resíduo não-carregado.

Em um aspecto da presente invenção, é quando a NEC ou o pl0 é idêntico, quando o teor de cargas totais da variante de protease e o da protease precursora são iguais; ou quando é mantido o mesmo número de resíduos carregados na protease precursora. Quando o aminoácido carregado é reposicionado para manter a NEC ou o pio idêntico, pelo menos um desses aminoácidos carregados é substituído em uma posição no resíduo diferente daquela na protease precursora. Se houver um número específico de um aminoácido carregado específico no precursor de protease, "X" lisi-nas no Bacillus lentus (GG36), então a protease variante vai reter o mesmo número de resíduos lisina, isto é, "X", porém em posições diferentes em relação à protease precursora. Assim, por exemplo, K27 pode ser substituído com um resíduo diferente e o K correspondente substituído em uma outra posição, de preferência uma posição na superfície. Em uma modalidade, um resíduo carregado, por exemplo, ácido glutâmico, ácido aspártico, lisina ou arginina, pode ser substituído em uma posição diferente. Para manter a carga eletrostática idêntica, o resíduo precursor específico que é substituído pelo resíduo carregado, por exemplo, o resíduo K da posição 27, pode ser substituído na posição 27. Por exemplo, um R45N-N204R tem posições de resíduo idênticos substituídas para manter a carga eletrostática idêntica. Além disso, se o resíduo precursor específico que é substituído pelo resíduo carregado for um resíduo não-carregado, outros resíduos não-carregados podem ser substituídos em uma posição tendo originalmente um resíduo carregado. Por exemplo, uma combinação R170S-A1R substitui uma alanina por uma arginina enquanto substitui uma arginina por uma serina. Naturalmente, se forem feitas várias modificações, qualquer resíduo substituído pode ser substituído em qualquer dos outros resíduos sendo modificados desde que seja mantido o mesmo número de cada aminoácido respectivo. A carga eletrostática pode ser determinado a qualquer pH predeterminado, desde que a determinação seja feita ao mesmo pH para a variante de protease e para a protease precursora.

Em um outro aspecto da invenção, a mesma carga eletrostática efetiva da molécula é mantida compensando-se a variação na carga eletrostática efetiva resultante da modificação na protease precursora. Por exemplo, uma maneira de obter tal alteração é inserir ou substituir com um resíduo de aminoácido de carga oposta adicional ou deletar um resíduo de aminoácido de mesma carga porém diferente. Se, por exemplo, estiverem presentes mais aminoácidos ácidos na variante de protease do que na pro-tease precursora, a variante vai incluir aminoácidos básicos adicionais. Se, por exemplo, estiverem presentes mais de um aminoácido ácido específico, por exemplo, ácido glutâmico, na variante de protease do que na protease precursora, para compensar tais modificações, um número correspondente de resíduos ácido aspártico podería ser deletado ou substituído com um aminoácido não-carregado. Por exemplo, se houver um número específico de aminoácidos carregados na protease precursora, os inventores consideram aumentar ou diminuir o número daquele aminoácido na protease variante com um aumento ou uma diminuição correspondente nos aminoácidos que compense a variação no número de aminoácidos carregados. Assim, como descrito acima, resíduos de carga positiva adicionais poderiam compensar a adição de um número correspondente de aminoácidos de carga negativa ou a substituição de um número correspondente de outros aminoácidos de carga positiva por um resíduo não-carregado ou combinações dos mesmos. Um número menor de resíduos de carga positiva poderia compensar a deleção de um número correspondente de aminoácidos de carga negativa, a substituição de um número correspondente de resíduos não-carregados por um número correspondente de aminoácidos de carga negativa ou combinações dos mesmos.

Em uma modalidade, o mesmo resíduo de aminoácido carregado que é substituído por um resíduo não-carregado em uma primeira posição no aminoácido é substituído em uma segunda posição no aminoácido em que está presente o mesmo aminoácido não-carregado substituindo o resíduo carregado. Um resíduo não-carregado pode ser substituído na posição original do aminoácido carregado, enquanto que o aminoácido carregado substituído pode substituir a posição do aminoácido não-carregado. Por exemplo, R45N-N204R reflete a substituição de um aminoácido não-carregado, asparagina por um aminoácido carregado, arginina. O mesmo aminoácido não-carregado substituído pelo aminoácido carregado não pre- cisa estar presente na posição em que é reinserido o aminoácido carregado. Por exemplo, um aminoácido não-carregado selecionado do grupo de alani-na (Ala ou A), glicina (Gly ou G), asparagina (Asn ou N), prolina (Pro ou P), serina (Ser ou S) e/ou treonina (Thr ou T) pode ser substituído na posição do aminoácido carregado enquanto que o resíduo de aminoácido carregado é substituído em uma posição no aminoácido originalmente ocupada por um outro no grupo acima. Por exemplo, na variante E271T-G100E, o aminoácido ácido glutâmico na posição 271 é substituído por um aminoácido treonina, ao passo que um resíduo glicina na posição 100 é substituído com um aminoácido ácido glutâmico. Da mesma forma, o aminoácido carregado idêntico não precisa ser substituído na posição originalmente não carregada, por exemplo, K27T-G100E. Os aminoácidos carregados ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), lisina (K) e arginina (R) são úteis sob este aspecto.

Em ainda um outro aspecto da invenção, a NEC da variante de protease varia menos que uma faixa de 0,5 unidade de carga (Z) em relação à NEC da protease precursora na faixa de pH de 0 a 14.

Em ainda um outro aspecto da invenção, a NEC da variante de protease varia menos que uma faixa de 1 unidade de carga em relação à NEC da protease precursora em uma faixa de pH definida. Esta faixa de pH definida poderia estar, por exemplo, dentro de 2 unidades de pH daquela reconhecida na literatura como o pH ótimo ou desejado para o ambiente da protease ou enzima desejada ou dentro de uma faixa de 4 unidades de pH.

Em um outro aspecto da invenção, foi determinado que a modificação dos resíduos carregados encontrados na protease precursora mantendo a mesma carga eletrostática efetiva ou uma carga eletrostática efetiva idêntica pode ser resultar em uma variante de protease apresentando características de lavagem vantajosas aumentadas.

Em ainda um outro aspecto da invenção, foi determinado que a modificação dos resíduos carregados encontrados na protease precursora mantendo a mesma carga eletrostática efetiva ou uma carga eletrostática efetiva idêntica a um pH definido, em uma faixa definida de pH, por exemplo em uma faixa de 4 unidades de pH, ou na faixa de pH de 0,001 a 14 pode resultar em uma variante de protease apresentando características de lavagem vantajosas aumentadas.

Resíduos de aminoácido carregados exemplificativos considerados para modificação pelos inventores incluem, por exemplo, aminoácidos básicos tais como lisina, arginina e/ou histidina; aminoácidos ácidos, por exemplo ácido aspártico e/ou ácido glutâmico; e/ou outros grupos R polares, por exemplo tirosina.

Em um outro aspecto, as proteases variantes da presente invenção têm, em relação à referida protease precursora, o mesmo número de resíduos de aminoácido de carga positiva que os aminoácidos idênticos na protease precursora e os aminoácidos diferentes tendo a mesma carga, e o mesmo número de resíduos de aminoácido de carga negativa que na protease precursora; ou mais ou menos resíduos de aminoácido de carga positiva e um número maior ou menor correspondente de resíduos de aminoácido de carga negativa, de modo que a carga eletrostática efetiva e/ou o ponto iso-elétrico da variante de protease sejam os mesmos que os da protease precursora, embora tendo modificações entre os resíduos de aminoácido equivalentes em qualquer uma ou mais das posições: 5, 7, 22, 23,24, 26, 28-31, 34, 45, 47, 63, 65, 66, 69, 70, 73, 82-85, 88, 90, 92, 93, 97, 102, 105, 113, 125, 127, 138, 139, 148-151, 169, 170, 176, 178, 179, 193, 196, 200, 201, 202, 207, 219, 220, 223, 229, 233, 250, 266, 267 e 273 do Bacillus amyloli-quefaciens (BPN'). Em uma modalidade, as modificações entre os resíduos de aminoácido equivalentes em uma ou mais das posições 27, 45,136,170, 181, 247, 251 e/ou 271 incluem a substituição de um resíduo não-carregado por uma posição de resíduo carregado. Essas posições de resíduo são interessantes já que essas posições equivalentes no tipo selvagem do Bacillus lentus têm resíduos de aminoácidos carregados nessas posições. Por exemplo, as posições de resíduo em 27, 38, 40, 44, 65, 92, 134, 164, 175, 241, 245 e/ou 265 da subtilisina (SEQ ID N° 6) do Bacillus lentus são equivalentes, respectivamente, a 27, 39, 41, 45, 67, 94,136, 170,181,247, 251 e/ou 271 do Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID N° 2).

Em um outro aspecto, as proteases variantes da presente in- venção têm, em relação à referida protease precursora, o mesmo número de resíduos de aminoácido de carga positiva que os aminoácidos idênticos na protease precursora e os aminoácidos diferentes tendo a mesma carga, e o mesmo número de resíduos de aminoácido de carga negativa que na protease precursora; ou mais ou menos resíduos de aminoácido de carga positiva e um número maior ou menor correspondente de resíduos de aminoácido de carga negativa, de modo que a carga eletrostática efetiva e/ou o ponto iso-elétrico da variante de protease sejam os mesmos que os da protease precursora, embora tendo modificações entre os resíduos de aminoácido equivalentes em qualquer uma ou mais das posições: 27, 39, 41, 45, 67, 94, 136, 170, 181, 197, 247, 249, 251 e 271 do Bacillus amyloliquefaciens (BPN‘). Substituições específicas contempladas pelos inventores incluem K27A, K27C, K27E, K27Q, K27G, K27H, K27I, K27L, K27M, K27F, K27P, K27S, K27T, K27W, K27Y, H39A, H39R, H39D, H39N, H39C, H39E, H39Q, H39G, H39H, H39I, H39L, H39K, H39M, H39F, H39P, H39T, H39W, H39Y, H39V, D41A, D41R, D41C, D41E, D41Q, D41G, D41H, D41I, D41L, D41K, D41M, D41F, D41P, D41S, D41T, D41W, D41Y, D41V, R45A, R45R, R45D, R45N, R45C, R45E, R45Q, R45G, R45H, R45I, R45L, R45K, R45M, R45F, R45P, R45S, R45T, R45W, R45Y, R45V, H67A, H67R, H67D, H67N, H67C, H67E, H67Q, H67G, H67H, H67I, H67L, H67K, H67M, H67F, H67P, H67S, H67T, H67W, H67Y, H67V, K94A, K94R, K94D, K94N, K94C, K94E, K94Q, K94G, K94H, K94I, K94L, K94K, K94M, K94F, K94P, K94S, K94T, K94W, K94Y, K94V, E136A, E136D, E136N, E136C, E136E, E136G, E136H, E136I, E136L, E136K, E136M, E136F, E136P, E136S, E136T, E136W, E136Y, E136V, R170A, R170R, R170D, R170N, R170C, R170E, R170Q, R170G, R170H, R170I, R170L, R170K, R170M, R170F, R170P, R170S, R170T, R170W, R170Y, R170V, D181A, D181R, D181D, D181N, D181C, D181E, D181Q, D181G, D181H, D181I, D181L, D181K, D181M, D181F, D181P, D181S, D181T, D181W, D181Y, D181V, D197A, D197R, D197D, D197N, D197C, D197E, D197Q, D197G, D197H, D197I, D197L, D197K, D197M, D197F, D197P, D197S, D197T, D197W, D197Y, D197V, R247A, R247R, R247D, R247N, R247C, R247E, R247Q, R247G, R247H, R247I, R247L, R247K, R247M, R247F, R247P, R247S, R247T, R247W, R247Y, R247V, Η249Α, H249R, H249D, Η249Ν, H249C, Η249Ε, H249Q, H249G, Η249Η, Η249Ι, Η249Κ, Η249Μ, H249F, Η249Ρ, H249S, Η249Τ, H249W, H249V, Κ251Α, K251D, K251C, K251Q, K251G, Κ251Η, Κ251Ι, K251L, Κ251Κ, Κ251Μ, K251F, Κ251Ρ, K251S, Κ251Τ, K251W, Κ251Υ, K251V, Ε271Α, E271R, E271D, Ε271Ν, E271C, Ε271Ε, Ε271Η, Ε271Ι, E271L, Ε271Κ, Ε271Μ, E271F, Ε271Ρ, E271S, Ε271Τ, E271W, Ε271Υ e/ou E271V do Bacillus amyloliquefaciens. Observou-se que um aumento no número de resíduos de carga positiva por substituição do mesmo pode resultar em um aumento na eficácia daquela variante em particular em um ambiente de lavagem particular, embora uma variação de carga oposta correspondente pudesse resultar em eficácia aumentada em um ambiente de lavagem diferente. Por exemplo, espera-se que mutações de carga negativa ofereçam características vantajosas em ambientes de lavagem pouco iônicos e que mutações de carga positiva ofereçam características vantajosas em ambientes de lavagem bastante iônicos. Espera-se que variantes que contenham um aumento positivo e um aumento negativo, porém mantendo a mesma carga eletrostática efetiva ou o mesmo ponto isoelétrico, resultem em uma molécula de protease que apresente características melhoradas nos dois ambientes em comparação com o desempenho da protease precursora.

Essas substituições são de preferência feitas na subtilisina do Bacillus lentus (recombinante ou do tipo nativo), embora as substituições possam ser feitas em qualquer protease de Bacillus, por exemplo Bacillus amyloliquefaciens e/ou subtilisina 309.

Um aspecto da presente invenção inclui uma variante de protease compreendendo ainda pelo menos um aminoácido substituído adicional em uma ou mais posições de resíduo equivalentes a posições de resíduo ou selecionadas do grupo que consiste de 1, 2-4,6, 9-12,14,15,17-20, 25, 27, 36-38, 40, 44, 49, 51, 52, 54-61, 68, 71, 75, 76, 87, 89, 91, 97, 100-102, 104, 108, 111, 112, 115, 117, 118, 120-123, 128, 129, 131, 133, 134, 136, 137, 140, 143-146, 159, 164, 165, 167, 170, 171, 173, 175, 180, 182-187, 191, 192, 194, 195, 204, 206, 209-212, 216, 218, 222, 224, 226, 234-245, 252, 255, 257-263, 265, 268, 269 e 274. Substituições específicas consideradas pelos inventores incluem aquelas equivalentes a: I122A, Y195E, M222A, M222S, Y167A, R170S, A194P, D36, N76D, H120D, G195E e K235N do Bacillus amyloliquefaciens ou do Bacillus lentus, cuja variante deriva de uma subtilisina de Bacillus.

De particular interesse são as variantes nessas posições demonstrando desempenho de lavagem aumentado com uma substituição de aminoácido carregado. Combinações de variantes que incluem essas posições e aquelas tendo originalmente um aminoácido carregado são de interesse. Exemplos de combinações consideradas pelos inventores incluem K27T-G100E, R45N-A1R, R45N-P14R, R45N-G61R, R45N-S128R, R45N-N204R, R45N-S216R, R45N-G258R, R170S-A1R, R170S-P14R, R170S-S49R, R170S-G61R, R170S-G100R, R170S-S128R, R170S-N204R, R170S-S216R, R170S-G258R, D181N-G118D, D181N-G258D, K251G-S87K, E271T-S49E, E271T-T66E, E271T-G100E, E271T-G102E, E271T-S128E, R45N-G118E-E271R, S49R-G102E-R170S-E271T e P14R-R45N-R170S-G258R. Os versados na técnica vão reconhecer as variantes de protease tendo essas modificações podem ser feitas e estão descritas nas patentes US 5.741.694, 6.190.900 e 6.197.567, aqui incorporadas em sua integridade a título de referência. Além disso, essas modificações também podem ser feitas usando-se métodos de transformação direta de Bacillus descritos no Pedido Provisório Ser. N° 60/423.087 (depositado em 1 de novembro de 2002; Neelam Amin e Volker Schellenberger). Em uma modalidade, as modificações foram feitas usando técnicas de PCR por fusão (Te-plyakov, A. V. et al., Protein Enq.. julho de 1992 5(5): 413-20). Pedido Provisório Série Número _/______, depositado nesta mesma data (Chris Lee- flang et al.) Ainda um outro aspecto da invenção inclui uma variante de protease compreendendo ainda pelo menos um aminoácido substituído adicional em uma ou mais posições de resíduo do grupo que consiste em 21, 22, 24, 32, 33, 36, 50, 64, 67, 77, 87, 94, 95, 96, 97, 104, 107, 110, 124, 123, 126, 127, 128, 129, 135, 152, 155, 157, 156, 166, 169, 170, 171, 172, 189, 197, 204, 213, 214, 215, 217, 222 ou 274 do Bacillus amyloliquefaciens. Resíduos específicos considerados pelos inventores incluem: K27R, M50F, N76D, S101G, S103A, V104I, V104Y, I122A, M123S, M124L, G159D, Y217L, A232V, Q236H, Q245R, N248D, N252K, T274A e M222S. Variantes de protease, DNA recombinante codificando mutantes nessas posições /ou métodos para fazer essas modificações estão descritos nas patentes US N-RE 34.606, 5.972.682, 5.185.258, 5.310.675, 5.316.941, 5.801.038, 5.972.682, 5.955.340 e 5.700.676, aqui incorporadas em sua integridade a título de referência.

Esses números de posição de aminoácido referem-se aos números atribuídos à seqüência de subtilisina madura do Bacillus amyloliquefaciens apresentada na figura 1. A invenção, no entanto, não se limita à mutação desta subtilisina em particular mas estende-se a proteases precursoras contendo resíduos de aminoácido em posições que são "equivalentes" aos resíduos identificados particulares na subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a protease precursora é a subtilisina do Bacillus lentus (SEQ ID N° 6) e as substituições são feitas nas posições equivalentes de resíduo de aminoácido no B. lentus correspondentes às listadas acima.

Uma posição de resíduo (aminoácido) de uma protease precursora é equivalente a um resíduo de subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens se for homóloga (isto é, correspondente em posição na estrutura primária ou terciária) ou análoga a um resíduo ou porção específica daquele resíduo na subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens (isto é, tendo a mesma capacidade funcional ou capacidade funcional similar de combinar, reagir ou interagir quimicamente).

Para estabelecer homologia com a estrutura primária, a seqüência de aminoácidos de uma protease precursora é diretamente comparada com a seqüência primária da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens e em particular com um grupo de resíduos conhecidos como invariantes nas sub-tilisinas para as quais se conhece a seqüência. Por exemplo, a figura 2 mostra os resíduos conservados entre a subtilisina do B. amyloliquefaciens e a subtilisina do B. lentus. Depois de alinhar os resíduos conservados, permitindo as inserções e deleções necessárias para manter o alinhamento (isto é, evitando a eliminação de resíduos conservados por meio de deleção ou inserção arbitrária), são definidos os resíduos equivalentes a aminoácidos particulares na seqüência primária da subtilisina do Bacillus amyloli-quefaciens. O alinhamento de resíduos conservados devem de preferência conservar 100% desses resíduos. No entanto, um alinhamento de mais de 98%, de mais de 95%, de mais de 90%, de mais de 85%, de mais de 80%, de mais de 75%, de mais de 50% ou de pelo menos mais de 45% dos resíduos conservados também é adequado para definir resíduos equivalentes. A conservação da tríade catalítica, Asp32/His64/Ser221, deve ser mantida. Siezen et ai. (1991) Protein Eng. 4(7): 719-737 mostram o alinhamento de um grande número de serina proteases. Siezen et al. também referem-se ao grupamento como subtilases ou serina proteases semelhantes à subtilisina.

Por exemplo, na figura 3, a seqüência de aminoácidos da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens, do Bacillus subtilis, do Bacillus licheni-formis (carlsbergensis) e do Bacillus lentus são alinhadas para dar uma quantidade máxima de homologia entre seqüências de aminoácidos. Uma comparação dessas seqüências mostra que existem inúmeros resíduos conservados contidos em cada seqüência. Esses resíduos conservados (entre BPN' e B. lentus) estão identificados na figura 2.

Esses resíduos conservados podem, portanto, ser usados para definir os resíduos de aminoácidos equivalentes correspondentes da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens em outras subtilisinas tal como a subtilisina do Bacillus lentus (Publicação PCT N° WO 89/06279 publicada em 13 de julho de 1989), a enzima precursora de protease preferida desta invenção, ou a subtilisina denominada PB92 (EP 0 328 299), que é altamente homóloga à subtilisina de Bacillus lentus preferida. As seqüências de aminoácidos de algumas dessas subtilisinas estão alinhadas nas figuras 3A e 3B com a seqüência da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens para produzir a homologia máxima dos resíduos conservados. Como pode ser visto, existem inúmeros deleções na seqüência do Bacillus lentus em comparação com a subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens. Assim, por exemplo, o aminoácido equivalente para Val165 na subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens nas outras subtilisinas é ísoleucina para o B. lentus e para o B. licheniformis. "Resíduos equivalentes" também podem ser definidos determinando-se a homologia a nível de estrutura terciária para uma protease precursora cuja estrutura terciária tenha sido determinada por cristalografia por raios X. Resíduos equivalentes são definidos como aqueles para os quais as coordenadas atômicas de dois ou mais dos átomos da cadeia principal de um resíduo de aminoácido particular da protease precursora e da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens (N em N, CA em CA, C em C e O em O) estão em 0,13 nm e de preferência 0,1 nm depois do alinhamento. O alinhamento é obtido depois de o melhor modelo ter sido orientado e posicionado para dar a sobreposição máxima de coordenadas atômicas de átomos de proteína diferentes de hidrogênio da protease em questão para a subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens. O melhor modelo é o modelo cristalográfico dando o fator R mais baixo para dados de difração experimental na melhor resolução disponível.

Resíduos equivalentes que são funcionalmente similares a um resíduo específico da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens são definidos como os aminoácidos da protease precursora que podem adotar uma conformação tal que eles alteram, modificam ou contribuem para a estrutura da proteína, ligação de substrato ou catálise de maneira definida 4e atribuída a um resíduo específico da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens. Além disso, são esses resíduos da protease precursora (para qual se obteve uma estrutura terciária por cristalografia por raios X) que ocupam uma posição análoga na medida em que, embora os átomos da cadeia principal do resíduo dado possa não satisfazer os critérios de equivalência no sentido de ocupar uma posição homóloga, as coordenadas atômicas de pelo menos dois dos átomos da cadeia lateral do resíduo situam-se a 0,13 nm dos átomos da cadeia lateral correspondente da subtilisina do Bacillus amylolique- faciens. As coordenadas da estrutura tridimensional da subtilisina do Baci-llus amyloliquefaciens estão mostradas na Publicação EPO N° 0 251 446 (equivalente à Patente US 5.182.204, cujo relatório está aqui incorporado a título de referência) e podem ser usadas da maneira descrita acima para determinar resíduos equivalentes a nível de estrutura terciária.

Alguns dos resíduos identificados para substituição são resíduos conservados ao passo que outros, não. No caso de resíduos que não são conservados, a substituição de um ou mais aminoácidos é limitada a substituições que produzem uma variante que tenha uma seqüência de aminoácidos que não corresponde a uma seqüência encontrada na natureza. No caso de resíduos conservados, tais substituições não devem resultar em uma seqüência natural. As variantes de protease da presente invenção incluem as formas maduras de variantes de protease, bem como as pro- e prepro-formas de tais variantes de protease. As prepro-formas são a construção preferida visto que isto facilita a expressão, a secreção e a maturação das variantes de protease. "Prosseqüência" refere-se a uma seqüência de aminoácidos ligada à porção N terminal da forma madura de uma protease que quando removido resulta no aparecimento da forma "madura" da protease. Muitas enzimas proteolíticas são encontradas na natureza como produtos de pro-enzimas translacionais e, na ausência de processamento pós-translacional, são expressas dessa maneira. Uma prosseqüência preferida para produzir variantes de protease é a suposta prosseqüência da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens, embora se possa usar outras prossequências de protease.

Uma "seqüência de sinal" ou "pressequência" refere-se a qualquer seqüência de aminoácidos ligada à porção N terminal de uma protease ou à porção N terminal de uma proprotease que pode participar da secreção das formas maduras ou proformas da protease. Esta definição de seqüência de sinal é uma definição funcional, usada para incluir todas as seqüências de aminoácidos codificadas pela porção N terminal do gene da protease que participa da realização da secreção de protease em condições nativas. A presente invenção utiliza tais seqüências para efetuar a secreção das variantes de protease aqui definidas. Uma seqüência de sinal possível compreende os sete primeiros resíduos de aminoácido da seqüência de sinal da subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens fundida ao restante da seqüência de sinal da subtilisina do Bacillus lentus (ATCC 21536).

Uma "prepro" forma de uma variante de protease consiste na forma madura da protease tendo uma prossequência operacionalmente ligada ao terminal amino da protease e uma "pressequência" ou seqüência de "sinal" operacionalmente ligada ao terminal amino da prossequência. "Vetor de expressão" refere-se a uma constructo de DNA contendo uma seqüência de DNA que está operacionalmente ligada a uma seqüência de controle adequada capaz de efetuar a expressão do referido DNA em um hospedeiro adequado. Tais seqüências de controle incluem um promotor para efetuar a transcrição, uma seqüência operadora opcional para controlar tal transcrição, uma seqüência codificando sítios de ligação de ribossoma ao mRNA adequados e seqüências que controlam o término da transcrição e da translação. O vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago, ou simplesmente uma inserção genômica potencial. Uma vez transformado em um hospedeiro adequado, o vetor pode replicar e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode, em alguns casos, in-tegrar-se ao genoma. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" às vezes são usados de forma intercambiável já que o plasmídeo normalmente é mais usado na forma de vetor. No entanto, a invenção pretende incluir as outras formas de vetores de expressão que têm funções equivalentes e que são ou vão se tomar conhecidos na literatura.

As "células hospedeiras" usadas na presente invenção geralmente são hospedeiros procarióticos ou eucarióticos que de preferência foram manipulados pelos métodos descritos na Patente US RE 34.606 e/ou na Patente US 5.441.882 para que fiquem incapacitadas de secretar endo-protease enzimaticamente ativa. Uma célula hospedeira útil para expressar protease o Bacillus cepa BG2036 que é deficiente na protease neutra e na protease alcalina (subtilisina) enzimaticamente ativas. A construção da cepa BG2036 está descrita detalhadamente na Patente US 5.264.366. Outras células hospedeiras para expressão da protease incluem Bacillus subtilis 1168 (também descrita na Patente US RE 34.606, Patente US 5.441.882 e Patente US 5.264.366, cujos relatórios estão aqui incorporados a título de referência), bem qualquer cepa de Bacillus adequada tal como B. lichenifor-mis, B. lentus etc. Uma célula hospedeira particularmente útil é o Bacillus cepa BG2864. A construção da cepa BG2864 está descrita detalhadamente em D. Naki, C. Paech, G. Ganshaw, V. Schellenberger, Appl. Microbiol. Bi-otechnol. (1998)49:290-294. Células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com vetores construídos usando técnicas de DNA recombinante. Essas células hospedeiras transformadas são capazes de replicar vetores codificando as variantes de protease ou expressando a variante de protease desejada. No caso de vetores que codificam a preforma ou a proforma da variante de protease, tais variantes, quando expressas, são tipicamente secretadas da célula hospedeira no meio da célula hospedeira.

Operacionalmente ligada", quando descrevendo a relação entre duas regiões de DNA, significa simplesmente que elas estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, uma presseqüência está operacionalmente ligada a um peptídio se ela funcionar como uma seqüência de sinal, participando da secreção da forma madura da proteína mais provavelmente envolvendo divagem da seqüência de sinal. Um promotor está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se ele controlar a transcrição da seqüência; um sítio de ligação de ribossoma está operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se ele for posicionado de maneira a permitir a translação.

Os genes codificando a protease precursora natural podem ser obtidos de acordo com métodos genéricos conhecidos pelos versados na técnica. Os métodos geralmente compreendem sintetização de sondas marcadas tendo supostas seqüências codificando regiões da protease de interesse, preparação de bibliotecas genômicas de organismos expressando a protease, e rastreamento das bibliotecas quanto à presença do gene de in- teresse por hibridização para as sondas. Clones de hibridização positiva são então mapeados e sequenciados. A protease clonada é então usada para transformar uma célula hospedeira para expressar a protease. O gene da protease é então ligado em um plasmídeo com grande número de cópias. Este plasmídio replica-se em hospedeiros no sentido de que ele contém os elementos conhecidos necessários para replicação de plasmídeo: um promotor operacionalmente ligado ao gene em questão (que pode ser fornecido como o promotor homólogo do próprio gene se ele for reconhecido, isto é, transcrito, pelo hospedeiro), uma região de poliadenilação e término de transcrição (necessária para estabilidade do mRNA transcrito pelo hospedeiro a partir do gene de protease em certas células hospedeiras eucarióticas) que é exógena ou é fornecido pela região de término endógena do gene de protease e, desejavelmen-te, um gene de seleção tal como um gene de resistência a antibiótico que permite a manutenção cultura constante de células hospedeiras infectadas com plasmídeo por crescimento em meio contendo antibiótico. Plasmídeos com grande número de cópias também contêm uma origem de replicação para o hospedeiro, dessa forma permitindo que grandes números de plasmídeos sejam gerados no citoplasma sem limitações cromossômicas. No entanto, faz parte do escopo desta invenção integrar várias cópias do gene de protease no genoma hospedeiro. Isto é facilitado por organismos procari-óticos e eucarióticos que são particularmente suscetíveis à recombinação homóloga. 0 gene pode ser um gene natural de B. lentus. Alternativamente, pode-se produzir um gene sintético codificando uma protease precursora natural ou mutante. Nessa abordagem, é determinada a seqüência de DNA e/ou aminoácidos da protease precursora. Em seguida são sintetizados vários fragmentos superpostos de DNA de cordão simples sintético que, por hibridização e ligação, produzem um DNA sintético codificando a protease precursora. Um exemplo de construção de gene sintético está mostrado no exemplo 3 da Patente US 5.204.015, cujo relatório está aqui incorporado a título de referência.

Uma vez clonado o gene de protease precursora natural ou sintética, inúmeras modificações são feitas para aumentar o uso do gene além da síntese da protease precursora natural. Tais modificações incluem a produção de proteases recombinantes descritas nas Patentes US RE 34.606, 5.741.694, 6.190.900, 6.197.567, 5.972.682, 5.185.258, 5.700.676 e na Publicação EPO N° 0 251 446 e a produção de variantes de protease descritas nesta invenção. O método de mutagênese por cassete a seguir pode ser usado para facilitar a construção das variantes de protease da presente invenção, embora outros métodos possam ser usados. Em primeiro lugar, o gene natural codificando a protease é obtido e sequenciado total ou parcialmente. Em seguida a seqüência é examinada em busca de um ponto no qual se deseja fazer uma mutação (deleção, inserção ou substituição) de um ou mais ami-noácidos na enzima codificada. As enzimas que flanqueiam esse ponto são avaliadas quanto à presença de sítios de restrição para substituir um pequeno segmento do gene por uma combinação de oligonucleotídeos que quando expressa vai codificar vários mutantes. Tais sítios de restrição são de preferência sítios únicos no gene de protease para facilitar a substituição do segmento genético. No entanto, pode-se usar qualquer sítio de restrição conveniente que não seja redundante demais no gene de protease, contanto que os fragmentos genéticos gerados por digestão de restrição possam ser reagrupados na seqüência apropriada. Caso sítios de restrição não estejam presentes em localizações a uma distância conveniente do ponto selecionado (de 10 a 15 nucleotídeos), esses sítios serão gerados por substituição de nucleotídeos no gene de tal maneira que nem a estrutura de leitura nem os aminoácidos codificados sejam alterados na construção final. A mutação do gene com a finalidade de alterar sua seqüência para se ajustar à seqüência desejada é feita por extensão do iniciador M13 de acordo com métodos geralmente conhecidos. A tarefa de localizar regiões flanqueadoras adequadas e avaliar as alterações necessárias para se obter duas seqüên-cias convenientes de sítio de restrição é rotineiramente feita pela redundância do código genético, um mapa de enzimas de restrição do gene e o gran- de número de enzimas de restrição diferentes. Observe que se um sítio de restrição flanqueador conveniente estiver disponível, o método acima precisa ser usado somente em relação à região flanqueadora que não contenha um sítio.

Uma vez clonado o DNA natural ou o DNA sintético, os sítios de restrição flanqueando as posições a serem alterados são digeridos com as enzimas de restrição cognatas e uma pluralidade de cassetes de oligonu-cleotídeos de terminais complementares são ligados no gene. A mutagêne-se é simplificada por este método porque todos os oligonucleotídeos podem ser sintetizados de modo a terem os mesmos sítios de restrição, e não são necessários ligantes sintéticos para criar os sítios de restrição.

As proteases variantes expressas após transformação das células hospedeiras podem ser rastreadas quanto à presença de enzimas isoladas ou recuperadas apresentando características desejadas, por exemplo melhor desempenho de lavagem, maior especificidade para substrato, maior estabilidade à oxidação, melhores perfis de atividade de pH e outras.

Conforme aqui usado, atividade proteolítica é definida como a taxa de hidrólise das ligações peptídicas por miligrama de enzima ativa. Existem muitos procedimentos conhecidos para medir a atividade proteolítica (K. M. Kalisz, "Microbial Proteinases", Advances in Biochemical Enginee-ring/Biotechnology, A. Fiechter ed., 1988). Outros métodos exemplificativos para determinar a atividade proteolítica incluem os vários ensaios espectro-fotométricos que medem a conversão de substratos selecionados indiretamente medindo a variação na absorção pela protease adicionada a uma concentração predeterminada de substrato. Substratos exemplificativos incluem dimetil caseína, succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, e queratina (vide Patente US Ser. N° 60/344.702).

Além da atividade proteolítica modificada e como alternativa para a mesma, as enzimas variantes da presente invenção podem ter outras propriedades modificadas tais como Km, k^, a razão k^/K*, e/ou especificidade para substrato modificada e/ou perfil de atividade de pH modificado. Essas enzimas podem construídas para o substrato específico que se acre- dita estar presente, por exemplo, na preparação de peptídios ou para processos hidrolíticos tais como usos em lavanderia.

Uma alteração na especificidade para substrato pode ser definida como uma diferença entre a razão da enzima precursora e a razão KJK* do mutante. A razão é uma medida da eficiência catalítica. Carbonil hidrolases procarióticas com razões k^/K^, maiores ou menores estão descritas nos exemplos. Geralmente, o objetivo será conseguir um mutante com uma razão kca/Km maior (numericamente maior) para um dado substrato, permitindo assim que a enzima aja de forma mais eficiente sobre um substrato alvo. Um aumento na razão kcat/Km para um substrato pode ser acompanhado de uma redução na razão para outro substrato. Isto significa uma mudança na especificidade para substrato, e mutantes apresentando tais mudanças são úteis onde os precursores são indesejáveis, por exemplo para impedir a hidrólise indesejada de um substrato particular em uma mistura de substratos. k^, e K^, podem ser medidos de acordo com procedimentos conhecidos, ou da maneira descrita no exemplo 18 da Patente US N° 5.441.882. A estabilidade à oxidação é um outro objetivo que pode ser atingido pela variante de protease descrita nos exemplos. A estabilidade pode ser aumentada ou diminuída conforme desejado para vários usos. Estabilidade aumentada pode ser obtida por deleção de um ou mais resíduos meti-onina, triptofano, cisteína ou lisina e, opcionalmente, substituição de um outro resíduo de aminoácido que não metionina, triptofano, cisteína ou lisina. As substituições opostas resultam em estabilidade diminuída à oxidação. O resíduo substituído pode ser alanil, mas resíduos neutros também são adequados. A estabilidade, por exemplo termoestabilidade, é um outro objetivo que pode ser atingido pela variante de protease descrita nos exemplos. A estabilidade pode ser aumentada ou diminuída conforme desejado para vários usos. Estabilidade aumentada pode ser obtida por substituição de um ou mais resíduos identificados no presente pedido e, opcionalmente, subs- tituição de um outro resíduo de aminoácido que não o mesmo. A termoesta-bilidade mantém a atividade enzimática durante o tempo a uma dada temperatura. Uma termoestabilidade aumentada envolve a manutenção de uma maior quantidade de atividade enzimática pela variante em comparação com a protease precursora. Por exemplo, um nível aumentado de atividade enzimática da variante em comparação com o precursor a uma dada temperatura, tipicamente a temperatura operacional medida.

As variantes de protease aqui descritas podem apresentar melhor desempenho de lavagem em condições de lavagem específicas. Por exemplo, as variantes de protease podem apresentam desempenho de lavagem diferente em condições de lavagem diferentes, por exemplo temperatura, dureza da água e/ou concentrações de detergente conforme indicado pelo desempenho determinado por vários ensaios conhecidos na literatura, por exemplo WO 99/34011 ("An Improved Method of Assaying for a Prefer-red enzyme and/or Preferred Detergent composition", publicado em 8 de julho de 1999).

No caso da subtilisina de Bacillus ou suas preformas, preprofor-mas ou proformas, mutações nas posições descritas acima produzem mu-tantes com alterações nas características descritas acima ou no processamento da enzima. Observe que esses números da posição dos aminoácidos são aqueles atribuídos à subtilisina do B. amyloliquefaciens, como visto na figura 1. Deve ficar entendido que uma deleção ou inserção na direção do terminal N de uma dada posição vai mudar as posições relativas do aminoácido de modo que um resíduo não vai ocupar sua posição numérica do tipo original ou selvagem. Também, diferenças alélicas e a variação entre várias espécies procarióticas vão resultar em mudanças de posições, de modo que a posição 169 nessas subtilisinas não será ocupada por glicina. Nesses casos, as novas posições para glicina serão consideradas equivalentes à glici-na+169 e abrangidas por ela. A nova posição para glicina+169 é facilmente identificada examinando a subtilisina em questão em busca de uma região homóloga à glicina+169 na figura 1.

Um ou mais, normalmente até cerca de 10, resíduos de aminoá- cido podem ser alterados. No entanto, não há limite quanto ao número de mutações que podem ser feitas além da praticidade comercial.

As enzimas desta invenção podem ser obtidas como sais. Está claro que o estado de ionização de uma proteína vai depender do pH do meio circundante, se ela estiver em solução, ou da solução da qual ela é preparada, se ela estiver na forma sólida. Proteínas ácidas são normalmente preparadas, por exemplo, como os sais de amônio, de sódio ou de potássio; proteínas básicas, como os cloretos, sulfatos ou fosfatos. Por conseguinte, o presente pedido inclui tanto as formas eletricamente neutras como as formas salinas das proteases variantes indicadas, e o termo protease refere-se ao esqueleto estrutural orgânico independente do estado de ionização.

As variantes de protease são particularmente úteis nas áreas de processamento de alimentos e limpeza. As carbonil proteases, incluindo variantes de protease e proteases precursoras, são produzidas por fermentação da maneira aqui descrita e recuperadas por técnicas adequadas. Vide, por exemplo, K. Anstrup, 1974, Industrial Aspects of Biochemistry, ed. B. Spencer páginas 23-46.

Em um aspecto da invenção, o objetivo é obter uma protease variante com desempenho de lavagem alterado, de preferência melhorado, em comparação com uma protease precursora em pelo menos uma formulação detersiva ou em pelo menos um conjunto de situações de lavagem. Elas são formuladas com detergentes ou outros tensoativos de acordo com métodos conhecidos per se para uso em processos industriais, especialmente lavanderia. Neste último caso as enzimas são combinadas com detergentes, reforçadores, agentes alvejantes e/ou branqueadores fluorescentes, de maneira conhecida na literatura de enzimas proteolíticas. Detergentes adequados incluem alquil benzeno sulfonatos lineares, alquil sulfato etoxilado, álcool linear sulfatado ou álcool linear etoxilado. As composições podem ser formuladas em forma granular ou líquida. Vide, por exemplo, as Patente US N°s 3.623.957, 4.404.128, 4.381.247, 4.404.115, 4.318.818, 4.261.868, 4.242.219, 4.142.999, 4.111.855, 4.011.169, 4.090.973, 3.985.686, 3.790.482, 3.749.671, 3.560.392, 3.558.498 e 3.557.002.

Existem várias condições de lavagem, que incluem formulações detersivas variadas, volume da água de lavagem, temperatura da água de lavagem e tempo de lavagem, às quais a variante de protease deve ser exposta. Por exemplo, formulações detersivas usadas em áreas diferentes têm concentrações diferentes de seus componentes principais presentes na água de lavagem. Por exemplo, um detergente europeu tem tipicamente cerca de 3000 a 8000 ppm de componentes detersivos na água de lavagem ao passo que um detergente japonês tem tipicamente menos de 800, por exemplo 667 ppm de componentes detersivos na água de lavagem. Na América do Norte, particularmente nos Estados Unidos, um detergente tem tipicamente cerca de 800 a 2000 ppm, por exemplo 975 ppm, componentes detersivos presentes na água de lavagem.

Um sistema com baixa concentração de detergente inclui detergentes nos quais menos de cerca de 800 ppm de componentes detersivos estão presentes na água de lavagem. Os detergentes japoneses tipicamente são considerados sistemas de baixa concentração de detergente já que eles têm aproximadamente 667 ppm de componentes detersivos presentes na água de lavagem.

Uma concentração média de detergente inclui detergentes nos quais entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm de componentes detersivos estão presentes na água de lavagem. Os detergentes norte-americanos geralmente são considerados sistemas com concentração média de detergente já que eles têm aproximadamente 975 ppm de componentes detersivos presentes na água de lavagem. O Brasil tipicamente tem aproximadamente 1500 ppm de componentes detersivos presentes na água de lavagem.

Um sistema com alta concentração de detergente inclui detergentes nos quais mais de 2000 ppm de componentes detersivos estão presentes na água de lavagem. Os detergentes europeus geralmente são considerados de sistemas com alta concentração de detergente já que eles têm aproximadamente 3000 - 8000 ppm de componentes detersivos na água de lavagem.

Os detergentes da América Latina geralmente são detergentes reforçados com fosfato e alta espumação e a gama de detergentes usados na América Latina podem ser considerados tanto de concentração média quanto de alta concentração de detergente já que eles variam de 1500 ppm a 6000 ppm de componentes detersivos na água de lavagem. Como mencionado acima, o Brasil tipicamente tem aproximadamente 1500 ppm de componentes detersivos presentes na água de lavagem. No entanto, outras regiões de detergentes reforçados com fosfato e alta espumação, não limitadas a outros países da América Latina, podem ter sistemas de alta concentração de detergente até cerca de 6000 ppm de componentes detersivos presentes na água de lavagem.

Tendo em vista o acima exposto, é evidente que as concentrações de composições detersivas em soluções de lavagem típicas em todo o mundo variam de menos de cerca de 800 ppm de composição detersiva ("regiões com baixa concentração de detergente"), por exemplo cerca de 667 ppm Japão, a entre cerca de 800 ppm e cerca de 2000 ppm ("regiões com concentração média de detergente"), por exemplo cerca de 975 ppm nos Estados Unidos e cerca de 1500 ppm no Brasil, a mais de cerca de 2000 ppm ("regiões com alta concentração de detergente"), por exemplo cerca de 4500 ppm a cerca de 5000 ppm na Europa e cerca de 6000 ppm em regiões de builder de fosfato de alta espumação.

As concentrações das soluções de lavagem típicas são determinadas de forma empírica. Por exemplo, nos Estados Unidos, uma lavadora típica tem capacidade para um volume de cerca de 64,6 I de solução de lavagem. Por conseguinte, para obter uma concentração de cerca de 975 ppm de detergente na solução de lavagem devem ser adicionados cerca de 62,79 g de composição detersiva aos 64,4 I de solução de lavagem. Esta quantidade é a quantidade típica medida na água de lavagem pelo consumidor que usa o copo de medir oferecido junto com o detergente.

Como um outro exemplo, regiões diferentes utilizam temperaturas de lavagem diferentes. A temperatura da água de lavagem no Japão é tipicamente inferior àquela usada na Europa. Por exemplo, a temperatura da água de lavagem na Europa geralmente é da ordem de 30 a 50 graus centígrados, tipicamente cerca de 40 graus centígrados. A temperatura da água de lavagem na América do Norte e/ou no Japão geralmente é inferior àquela da água de lavagem na Europa, por exemplo da ordem de 10 a 30 graus centígrados, tipicamente cerca de 20 graus centígrados.

Como um outro exemplo, áreas diferentes usam dureza da água. Dureza da água é tipicamente descrita como grãos por galão de Ca2+/Mg2+ misturados. Dureza é uma medida da quantidade de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+) na água. Quase toda água nos Estados Unidos é dura, mas o grau de dureza varia. A água moderadamente dura (60 - 120 ppm) a dura (121 - 181 ppm) tem 60 a 181 partes por milhão [partes por milhão convertidas em grãos por galão US é ppm # dividido por 17,1 é igual a grãos por galão] de minerais duros ("hardness minerais"). A dureza da água na Europa é tipicamente 170-340 ppm (10 -20 grãos por galão) de Ca2+/Mg2+ misturados. A dureza da água na América do Norte é tipicamente maior que a dureza da água no Japão, porém menor que a dureza da água na Europa, por exemplo, entre 51 e 170 ppm (3 e 10 grãos), 51-136 ppm (3 - 8 grãos), ou cerca de 102 ppm (6 grãos). A dureza da água no Japão é tipicamente menor que a dureza da água na América do Norte, tipicamente inferior a 4, por exemplo 51 ppm (3 grãos por galão) de Ca2+/Mg2+ misturados.

Por conseguinte, um aspecto da presente invenção inclui uma variante de protease que apresenta desempenho de lavagem melhorado em pelo menos um conjunto de condições de lavagem. Um outro aspecto da presente invenção inclui uma variante de protease que apresenta desempenho de lavagem melhorado em mais de uma condição de lavagem, por exemplo nas condições da Europa, do Japão ou da América do Norte.

Com base nos resultados de rastreamento obtidos com as pro-teases variantes, as mutações observadas na subtilisina de Bacillus são importantes para a atividade proteolítica, o desempenho e/ou a estabilidade dessas enzimas e o desempenho de limpeza ou lavagem dessas enzimas variantes.

Muitas dessas variantes de protease da invenção são úteis na formulação de várias composições detersivas ou formulações para cuidado pessoal tais como xampus ou loções. Inúmeros compostos conhecidos são tensoativos adequados úteis em composições compreendendo os mutantes de protease da invenção. Estes incluem tensoativos não-iônicos, aniônicos, catiônicos ou zwiteriônicos, descritos na Patente US 4.404.128 concedida a Barry J. Anderson e na Patente US N° 4.261.868 concedida a Jiri Flora et al. Uma formulação detersiva adequada é aquela descrita no exemplo 7 da Patente US 5.204.015 (aqui incorporada a título de referência). A técnica está familiarizada com as diferentes formulações que podem ser usadas como composições de limpeza. Além das composições de limpeza típicas, entende-se facilmente que as variantes de protease da presente invenção podem ser usadas para qualquer finalidade que são usadas as proteases nativas ou do tipo selvagem. Assim, essas variantes podem ser usadas, por exemplo, em sabão em barra ou líquido, formulações para lavar louça, soluções ou produtos para limpeza de lentes de contato, hidrólise peptídica, tratamento de despejo, aplicações têxteis, como enzimas de fusão-clivagem na produção de proteínas etc. As variantes da presente invenção podem compreender desempenho melhorado em uma composição detersiva (comparadas com o precursor). Conforme aqui usado, desempenho melhorado em um detergente é definido como aumento de limpeza de certas manchas sensíveis à enzima tais como grama ("grass") ou sangue, conforme determinado por avaliação de rotina depois de um ciclo de lavagem padrão.

As proteases da invenção podem ser formuladas como detergentes em pó e líquidos conhecidos tendo um pH entre 6,5 e 12,0 a níveis entre cerca de 0,01 e cerca de 5% (de preferência 0,1% e 0,5%) em peso.

Essas composições de limpeza detersivas também podem incluir outras enzimas tais como proteases, amilases, celulases, lipases ou endoglicosidases conhecidas, bem como builders e estabilizantes. A adição de proteases da invenção a composições de limpeza convencionais não cria qualquer limitação especial de uso. Em outras palavras, qualquer temperatura e pH adequados para o detergente também são adequados para as presentes composições desde que o pH esteja dentro da faixa acima, e a temperatura esteja abaixo da temperatura de desnatura-ção da protease descrita. Além disso, as proteases da invenção podem ser usadas em uma composição de limpeza sem detergentes, seja isoladas ou em combinação com builders e estabilizantes. A presente invenção também refere-se a composições de limpeza contendo as variantes de protease da invenção. As composições de limpeza podem ainda conter aditivos que são comumente usados em composições de limpeza. Estes podem ser selecionados, porém sem limitação, de alvejantes, tensoativos, builders, enzimas e catalisadores de alvejamento. É facilmente evidente para o versado na técnica quais aditivos são adequados para inclusão nas composições. A lista aqui oferecida não é de forma alguma limitativa e deve ser vista apenas como exemplos de aditivos adequados. Também será facilmente evidente para o especialista na técnica usar somente os aditivos que sejam compatíveis com as enzimas e os outros componentes na composição, por exemplo, tensoativo.

Quando presente, a quantidade de aditivo presente na composição de limpeza varia de cerca de 0,01% a cerca de 99,9%, de preferência cerca de 1 % a cerca de 95%, mais preferivelmente cerca de 1 % a cerca de 80%.

As proteases variantes da presente invenção podem ser incluídas em rações para animais como parte dos aditivos alimentares para animais como descrito, por exemplo, nas patentes US 5.612.055, US 5.314.692 eUS 5.147.642.

Um aspecto da invenção é uma composição para o tratamento de um têxtil que inclui proteases variantes da presente invenção. A compo- sição pode ser usada para tratar por exemplo seda ou lã como descrito em publicações tais como RE 216.034, EP 134.267, US 4.533.359 e EP 344.259.

Os exemplos a seguir são exemplificativos e não devem ser interpretados como limitativos do escopo das reivindicações.

Todas as publicações e patentes aqui mencionados estão aqui incorporadas em sua integridade a título de referência.

Exemplo 1 Um grande número de variantes de protease pode ser produzido e purificado usando-se métodos conhecidos na técnica. Pode-se fazer mutações na subtilisina do Bacillus amyloliqefaciens (BPN') ou na subtilisina do Bacillus lentus GG36. As variantes podem ser selecionadas do seguinte grupo: K27A, K27C, K27E, K27Q, K27G, K27H, K27I, K27L, K27M, K27F, K27P, K27S, K27T, K27W, K27Y, H39A, H39R, H39D, H39N, H39C, H39E, H39Q, H39G, H39I, H39L, H39K, H39M, H39F, H39P, H39T, H39W, H39Y, H39V, D41A, D41R, D41C, D41E, D41Q, D41G, D41H, D41I, D41L, D41K, D41M, D41F, D41P, D41S, D41T, D41W, D41Y, D41V, R45A, R45D, R45N, R45C, R45E, R45Q, R45G, R45H, R45I, R45L, R45K, R45M, R45F, R45P, R45S, R45T, R45W, R45Y, R45V, H67A, H67R, H67D, H67N, H67C, H67E, H67Q, H67G, H67I, H67L, H67K, H67M, H67F, H67P, H67S, H67T, H67W, H67Y, H67V, K94A, K94R, K94D, K94N, K94C, K94E, K94Q, K94G, K94H, K94I, K94L, K94M, K94F, K94P, K94S, K94T, K94W, K94Y, K94V, E136A, E136D, E136N, E136C, E136G, E136H, E136I, E136L, E136K, E136M, E136F, E136P, E136S, E136T, E136W, E136Y, E136V, R170A, R170D, R170N, R170C, R170E, R170Q, R170G, R170H, R170I, R170L, R170K, R170M, R170F, R170P, R170S, R170T, R170W, R170Y, R170V, D181A, D181R, D181N, D181C, D181E, D181Q, D181G, D181H, D181I, D181L, D181K, D181M, D181F, D181P, D181S, D181T, D181W, D181Y, D181V, D197A, D197R, D197N, D197C, D197E, D197Q, D197G, D197H, D197I, D197L, D197K, D197M, D197F, D197P, D197S, D197T, D197W, D197Y, D197V, R247A, R247D, R247N, R247C, R247E, R247Q, R247G, R247H, R247I, R247L, R247K, R247M, R247F, R247P, R247S, R247T, R247W, R247Y, R247V, Η249Α, H249R, H249D, Η249Ν, H249C, Η249Ε, H249Q, H249G, Η249Ι, Η249Κ, Η249Μ, H249F, Η249Ρ, H249S, Η249Τ, H249W, H249V, Κ251Α, K251D, K251C, K251Q, K251G, Κ251Η, Κ251Ι, K251L, Κ251Μ, K251F, Κ251Ρ, K251S, Κ251Τ, K251W, Κ251Υ, K251V, Ε271Α, E271R, E271D, Ε271Ν, E271C, Ε271Η, Ε271Ι, E271L, Ε271Κ, Ε271Μ, E271F, Ε271Ρ, E271S, Ε271Τ, E271W, Ε271Υ e/ou E271V do Bacillus amyloliquefaciens.

Exemplo 2 Um grande número de variantes de protease pode ser produzido e purificado usando-se métodos conhecidos na técnica. Pode-se fazer mutações na subtilisina do Bacillus amyloliquefaciens (BPN') ou na subtilisina do Bacillus lentus GG36. As variantes podem ser feitas com inserções, dele-ções ou substituições nos aminoácidos equivalentes àqueles nas posições: 5, 7, 23, 26, 28-31,34,47, 63, 65, 66, 69, 70, 73, 82-85, 88, 90, 92, 93,105, 113, 125, 138, 139, 148-151, 176, 178, 179, 193, 196, 200, 201, 202, 207, 219, 220, 223, 229, 233, 250, 266, 267 e 273 do Bacillus amyloliquefaciens (BPN').

Exemplo 3 Um grande número das variantes de protease produzidas nos exemplos 1 e/ou 2 pode ser testado quanto ao desempenho em dois tipos de soluções detersivas e de lavagem usando um ensaio de microamostra ("microswatch") descrito em "An improved method for assaying for a prefer-red enzyme and/or preferred detergent composition", Pedido US Série N° 60/068.796.

As proteases variantes podem ser analisadas e testadas em vários detergentes. Por exemplo, um detergente possível pode ser Ariel Ultra filtrado a 0,67 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 51 ppm (3 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,3 ppm de enzima usado em cada compartimento a 20°C. Um outro detergente exemplificativo pode ser Ariel Futur filtrado a 3,38 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 15 grãos por galão de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,3 ppm de enzima usado em cada com- partimento a 40°C. Um valor relativo mais alto comparado com o do tipo selvagem poderia indicar e melhorar a eficácia do detergente.

Exemplo 4 As proteases variantes que podem ser analisadas da maneira descrita nos exemplos 1 e 2 também podem ser analisadas em outros detergentes diferentes. Os mesmos testes de desempenho do exemplo 2 podem ser feitos nas proteases variantes mencionadas com os seguintes detergentes: um primeiro detergente pode ser o Ariel Ultra filtrado a 0,67 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 51 ppm (3 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,3 ppm de enzima poderia ser usado em cada compartimento a 20°C. Um segundo detergente pode ser o Ariel Futur filtrado a 3,38 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 255 ppm (15 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,3 ppm de enzima pode ser usado em cada compartimento a 40°C. Um terceiro detergente pode ser o detergente HSP1 a 3,5 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 136 ppm (8 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,3 ppm de enzima pode ser usado em cada compartimento a 20°C. Um quarto detergente pode ser o detergente Tide KT a 1,5 ml/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 51 ppm (3 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,3 ppm de enzima pode ser usado em cada compartimento a 20°C.

Exemplo 5 Um grande número de variantes de protease foram produzidas e purificadas usando-se métodos conhecidos na técnica. Todas as mutações foram feitas na subtilisina do Bacillus lentus GG36. As variantes estão mostradas na Tabela 3.

Para construir as bibliotecas saturadas de sítio de GG36 e as variantes específicas para sítio, foram feitas três reações de PCR: duas PCRs para introduzir o códon de interesse alterado no GG36 e uma PCR por fusão para construir o vetor de expressão incluindo a(s) alteração (alterações) desejada(s).

Os códons de interesse do GG36 estão numerados de acordo com a numeração de BPN' (listada nas figuras 1A-C e 3A-B).

Para construção de biblioteca saturada de sítio O método de mutagênese baseou-se na abordagem de mutação específica para região (Teplyakov et al., 1992) no qual a criação de todas as mutações possíveis de uma só vez em um códon de DNA específico foi feita usando um conjunto de iniciadores de oligonucleotídeos complementares normais e invertidos com um comprimento de 30 - 40 nucleotídeos contendo uma seqüência de DNA tripla específica criada NNS ((A, C, T ou G), (A, C, T ou G), (C ou G)) que corresponde à seqüência do códon a ser alterado e garante a incorporação aleatória de nucleotídeos naquele códon.

Para construção de variante específica para sítio O iniciador mutagênico normal e invertido contém as três mutações desejadas no meio do iniciador com ~15 bases de seqüência homóloga nos dois lados. Essas mutações, que cobrem o códon de interesse, são específicas para o aminoácido desejado e são sintetizadas deliberadamen-te. O segundo conjunto de iniciadores usado para construir as bibliotecas e variantes contém o sítio de digestão Apal de pVS08 junto com sua seqüência de nucleotídeos flanqueadora.

Iniciadores Apal Iniciador Apal normal GTGTGTGGGCCCATCAGTCTGACGACC Iniciador Apal invertido GTGTGTGGGCCCTATTCGGATATTGAG A introdução das mutações em moléculas do GG36 foi feita usando-se Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity da Invitrogen (Carlsbad, CA, Cat. n° 11304-102) junto com o DNA gabarito de pVS08 e o iniciador mutagênico normal e o iniciador Apal invertido para a reação 1, ou o iniciador mutagênico invertido e o iniciador Apal normal para a reação 2. A construção do vetor de expressão incluindo as mutações desejadas foi feita por PCR por fusão usando fragmento de PCR das duas re- ações 1 e 2, o iniciador Apal normal e invertido e Platinum® Taq DNA Po-lymerase High Fidelity da Invitrogen (Cat. n° 11304-102).

Todas as PCRs foram feitas de acordo com o protocolo da Invitrogen fornecido junto com as polimerases, exceto quanto ao número de ciclos: 20 ao invés de 30. Duas reações de PCR separadas são feitas usando Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity da Invitrogen (Cat. n° 11304-102): o fragmento linear ampliado de 5,6 kb foi purificado (usando o kit de purificação de PCR Qiagen® Qiaquick Cat. n° 28106) e digerido com a enzima de restrição Apal para criar extremidades coesas nos dois lados do fragmento de fusão: . 35 μΙ de fragmento de DNA purificado . 4 μΙ de tampão React® 4 (Invitrogen®: Tris-HCI 20 mM, MgCI2 5 mM, KCI 50 mM, pH 7,4) . 1 μΙ de Apal, 10 unidades/ml (Invitrogen® Cat. n° 15440-019) - condições reacionais: 1 hora, 30°C.

Foi feita uma digestão adicional com Dpnl da Invitrogen para remover o DNA gabarito de pVS08: . 40 μΙ de fragmento de DNA digerido - 1 μΙ de Dpnl, 3 unidades/μΙ (Invitrogen® Cat. n° 15242-019) . condições reacionais: 16-20 horas, 37°C.

Ligação do fragmento digerido e purificado duplo resulta em um novo DNA circular contendo a mutação desejada com foi diretamente transformado para Bacillus subtilis competente: - 30 μΙ de fragmento de DNA digerido com Apal e Dpnl - 8 μΙ de tampão T4 DNA ligase (Invitrogen® Cat. n° 46300-018) - 1 μΙ de T4 DNA ligase, 1 unidade/μΙ (Invitrogen® Cat. n° 15224-017) - condições reacionais: 16-20 horas, 16°C.

Misturas de ligação foram transformadas para Bacillus subtilis BG2864 (Naki et al., 1997) usando o método de Anagnostopoulos e Spizi-zen (1961) e selecionadas quanto à resistência a cloranfenicol e atividade de protease. Método para produção de proteína Inocular 1 - 50 μΙ de cultura de glicerol em meio Mops (Frederick C. Neidhardt et al., 1974) contendo fonte de carbono (glicose e maltodextri-na, 10,5 e 17,5 g/l), uma fonte de nitrogênio (uréia, 3,6 g/l) e nutrientes essenciais tais como fosfato (0,5 g/l) e sulfato (0,5 g/l) e ainda suplementada com elementos de traço (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, 1 - 4 mg/ml). O meio foi tam-ponado com uma mistura de MOPS/tricina resultando em um pH variando de 7 a 8. Incubar a cultura por 1 - 5 dias a 37°C / 220 rpm (Infors HT® Multi-tron II).

Referências - Protein engineering of the high-alkaline serine protease PB92 from Baci-llus alcalophilus: functional and structural consequences of mutation at the S4 substrate binding pocket.

Teplyakov A. V., van der Laan J. M., Lammers A. A., Kelders H., Kalk K. H., Misset O., Mulleners L. J., Dijkstra B. W.

Protein Eng. julho 1992 5(5): 413-20. - Selection of a subtilisin-type producing Bacillus in a highly structured envi-ronment, D. Naki, C. Paech, G. Ganshaw, V. Schellenberger em Appl. Mi-crobiol. Biotechnol. (1998) 49:290-294. . Requirements for transformation in Bacillus subtilis, Anagnostopoulos, C. e Spizizen, J. em J. Bacteriol. 81,741-746 (961). . Culture Médium for Enterobacteria, Frederick C. Neidhardt, Philip L. Bloch e David F. Smith em Journal of Bacteriology, setembro 1974, págs. 736-747 vol. 119 N° 3.

Tabela 3 Exemplo 6 Um grande número das variantes de protease produzidas no exemplo 1 foram testadas quanto ao desempenho em dois tipos de deter- gente e condições de lavagem usando um ensaio de microamostra ("mi-croswatch") descrito em "An improved method for assaying for a preferred enzyme and/or preferred detergent composition", Pedido US Série N° 09/554.992 [WO 99/34011]. A Tabela 4 lista as proteases variantes analisadas e os resultados dos testes em dois detergentes diferentes. Para as colunas A e C, o material analisado foi produzido por crescimento das cepas transformantes em um MTP [o que significam estas iniciais?] - placa de acordo com [citação?]. Para as colunas B e D, o material analisado foi produzido por crescimento das cepas transformantes em um frasco vibratório (250 ml) de acordo com [citação?]. Para as colunas A e B, o detergente usado foi o Ariel Regular filtrado a 7,6 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 255 ppm (15 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,5 ppm de enzima usado em cada compartimento a 40°C [condições européias]. Para as colunas C e D, o detergente usado foi o Tide Opal filtrado a 0,67 g/l (Procter & Gamble, Cincinnati, OH, EUA), em uma solução contendo 51 ppm (3 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, e 0,5 ppm de enzima usado em cada compartimento a 20°C [condições japonesas]. Um índice de desempenho foi calculado pela seguinte fórmula: Desempenho de limpeza da variante dividido pelo desempenho de limpeza do GG36 (tipo selvagem) Foi calculada a média de quatro valores de desempenho para se chegar aos valores mostrados na Tabela 4.

Tabela 4 Continuação... * nível de protease baixo demais para um teste de desempenho confiável Tabela 5 Continuação... * nível de protease baixo demais para um teste de desempenho confiável 1 GG 36 é a protease selvagem do Bacillus lentus (SEQ ID N° 4) Como resultado dos ensaios descritos acima, algumas variantes apresentaram um índice de desempenho maior que aquele da protease selvagem do GG36. Por exemplo, as variantes R45N-G118E-E271R, R45N-P14R, R45N-N204R, D181N-G-118D e R45N-G258R apresentaram índices de desempenho de 1,75, 1,28, 1,28, 1,24 e 1,23, respectivamente (Tabela 4), em um ensaio de microamostra (WO 99/34011) em condições européias 225 ppm (15 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, 40 graus centígrados, 0,5 ppm. As variantes R170S-A1P, R170S-G61R, R170S-N204R, K251G-S87K e R170S-S216R apresentaram índices de desempenho de 2,09, 2,03,1,79,1,54,1,47, 1,39 e 1,21, respectivamente (Tabela 5). As variantes E271T-G100E, E271T-G102E, E271T-S128E, K27T-G100E, R170S-G100R e E271T-S49E apresentaram índices de desempenho de 3,22, 1,85, 2,33, 2,04, 1,79 e 1,43, respectivamente (coluna Tabela 5), no ensaio de microamostra em placa de microtitulação de 96 compartimentos ["Microswatch 96 microtiter well plate assay"] (WO 99/34011) em condições japonesas 51 ppm (3 grãos por galão) de dureza de Ca2+/Mg2+ misturados, 20 graus centígrados, 0,5 ppm. As variantes K251G-S87K, R170S-A1R e E271T-S128E apresentaram índices de desempenho de 2,06, 1,55 e 1,20, respectivamente (Tabela 5). As variantes K251G-S87K e R170S-A1R apresentaram índices de desempenho superiores a 1,00 tanto em condições japonesas quanto em condições européias.

Embora a presente invenção tenha sido discutida e exemplificada com relação a várias modalidades específicas, isto não deve ser interpretado como uma limitação à aplicabilidade e ao escopo do relatório, que se estende a todas as combinações e subcombinações dos aspectos mencionados e descritos acima bem como nas reivindicações anexas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> GENENCOR INTERNATIONAL, INC

<120> VARIANTE DE PROTEASE SUBTILISINA DE BACILLUS LENTUS, DNA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA PROCARIÓTICA, BEM COMO COMPOSIÇÃO DE LIMPEZA

<130> GC716-2-PCT <140> PI0306955-9 <141> 16/01/2003 <150> US 60/350,222 <151> 16/01/2002 <160> 10 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1494 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 ggtctactaa aatattattc catactatac aattaataca cagaataatc tgtctattgg 60 ttattctgca aatgaaaaaa aggagaggat aaagagtgag aggcaaaaaa gtatggatca 120 gtttgctgtt tgctttagcg ttaatcttta cgatggcgtt cggcagcaca tcctctgccc 180 aggcggcagg gaaatcaaac ggggaaaaga aatatattgt cgggtttaaa cagacaatga 240 gcacgatgag cgccgctaag aagaaagatg tcatttctga aaaaggcggg aaagtgcaaa 300 agcaattcaa atatgtagac gcagcttcag ctacattaaa cgaaaaagct gtaaaagaat 360 tgaaaaaaga cccgagcgtc gcttacgttg aagaagatca cgtagcacat gcgtacgcgc 420 agtccgtgcc ttacggcgta tcacaaatta aagcccctgc tctgcactct caaggctaca 480 ctggatcaaa tgttaaagta gcggttatcg acagcggtat cgattcttct catcctgatt 540 taaaggtagc aggcggagcc agcatggttc cttctgaaac aaatcctttc caagacaaca 600 actctcacgg aactcacgtt gccggcacag ttgcggctct taataactca atcggtgtat 660 taggcgttgc gccaagcgca tcactttacg ctgtaaaagt tctcggtgct gacggttccg 720 gccaatacag ctggatcatt aacggaatcg agtgggcgat cgcaaacaat atggacgtta 780 ttaacatgag cctcggcgga ccttctggtt ctgctgcttt aaaagcggca gttgataaag 840 ccgttgcatc cggcgtcgta gtcgttgcgg cagccggtaa cgaaggcact tccggcagct 900 caagcacagt gggctaccct ggtaaatacc cttctgtcat tgcagtaggc gctgttgaca 960 gcagcaacca aagagcatct ttctcaagcg taggacctga gcttgatgtc atggcacctg 1020 gcgtatctat ccaaagcacg cttcctggaa acaaatacgg ggcgtacaac ggtacgtcaa 1080 tggcatctcc gcacgttgcc ggagcggctg ctttgattct ttctaagcac ccgaactgga 1140 caaacactca agtccgcagc agtttagaaa acaccactac aaaacttggt gattctttct 1200 actatggaaa agggctgatc aacgtacagg cggcagctca gtaaaacata aaaaaccggc 1260 cttggccccg ccggtttttt atttttcttc ctccgcatgt tcaatccgct ccataatcga 1320 cggatggctc cctctgaaaa ttttaacgag aaacggcggg ttgacccggc tcagtcccgt 1380 aacggccaag tcctgaaacg tctcaatcgc cgcttcccgg tttccggtca gctcaatgcc 1440 gtaacggtcg gcggcgtttt cctgataccg ggagacggca ttcgtaatcg gatc 1494 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <220>

Claims

1. Variante de protease, caracterizada pelo fato de que é uma variante de uma protease precursora subtilisina de Bacillus lentus tendo a sequência mostrada na FIGURA 3 e que apresenta a mesma carga eletros-tática efetiva em pH 7 ou o mesmo ponto isoelétrico da referida protease precursora, em que a referida variante compreende uma sequência de ami-noácidos tendo as substituições R170S-A1R, R170S-G61R, R170S-N204R, R170S-S216R, ou R170S-G100R em relação à referida protease precursora, em que as posições das referidas substituições são equivalentes às posições especificadas na subtilisina madura de Bacillus amyloliquefaciens, como mostrado na FIGURA 3.

2. DNA, caracterizado pelo fato de que codifica uma variante de protease, como definida na reivindicação 1, e que apresenta a sequência mostrada na SEQ ID NO:1.

3. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende o DNA, como definido na reivindicação 2.

4. Célula hospedeira procariótica, caracterizada pelo fato de que é transformada com o vetor de expressão, como definido na reivindicação 3.

5. Composição de limpeza, caracterizada pelo fato de que compreende a variante de protease, como definida na reivindicação 1.