BRPI0314060B1 - composição compreendendo variante ou componente de variante de lactobacillus fermentum e usos da variante ou componente de variante de lactobacillus fermentum e da composição - Google Patents

Abstract

"bactéria probiótica: lactobacillus fermentum". a presente invenção refere-se a variante da bactéria lactobacillus fermentum e seu uso no tratamento de distúrbios gastrointestinais, distúrbios das superfícies de mucosa ou distúrbios no sistema imune ou estado de um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO VARIANTE OU COMPONENTE DE VARIANTE DE LACTO-BACILLUS FERMENTUM E USOS DA VARIANTE OU COMPONENTE DE VARIANTE DE LACTOBACILLUS FERMENTUM E DA COMPOSIÇÃO".

Campo da Técnica A presente invenção refere-se a variantes de bactéria de Lacto-bacillus fermentum, a formulações da variante e seus componentes, e a seu uso na prevenção e/ou tratamento de doença em mamíferos e promoção de saúde de mamífero.

Antecedentes Qualquer discussão da técnica anterior através de todo o relatório não deve de maneira alguma ser considerada como uma admissão que tal técnica anterior seja amplamente conhecida ou faça parte de conhecimento geral no campo.

Bactérias indígenas desempenham um papel principal na prevenção de certas doenças bacterianas e fúngicas. Elas fazem isso por um processo de antagonismo bacteriano, evitando que outros micróbios estabeleçam uma presença no corpo. Mecanismos envolvidos nesta atividade incluem competição direta para nutrientes, alterações na atividade de uma área tornando-a hóstil para outros micróbios, produzindo metabólitos inibitó-rios e produtos químicos antimicrobianos e por evitar que outros micróbios se liguem às superfícies de hospedeiro.

Flora indígena também influencia o sistema imune. Animais criados em ambientes livres de germe exibem tecidos linfóides relativamente não-diferenciados e subdesenvolvidos, baixos níveis de proteínas imunes e uma resposta primária à infecção ao invés de uma resposta secundária pronunciada.

Estes micróbios desempenham um papel importante na saúde do hospedeiro, por produzir nutrientes e vitaminas essenciais exigidos pelo colonocitos, auxiliar com a degradação de nutrientes complexos, protegendo o hospedeiro de invsão por patógenos e estimular o sistema imune. Além disso, foi proposto que os micróbios no intestino contribuem para absorção mineral e metabolismo de lipídio uma vez que o pH é diminuído como um resultado dos ácidos graxos de cadeia curta produzidos pelos micróbios.

Estes ácidos graxos de cadeia curta de fisiologia de cólon e desempenham um papel importante na manuteção de função de intestino normal. O trato gastrointestinal superior contém apenas bactérias engolidas com a saliva e alimento. Como um resultado da alta acidez de sucos gástricos, poucos organismos, a maioria lactobacilos, podem ser cultivados a partir do estômago normal. O intestino delgado superior contém números relativamente escassos de lactobacilos e enterococos. A flora do trato gastrointestinal gradualmente muda até ela se tornar similar àquela encontrada no cólon, predominantemente Bacteroides, Bifidobacterium, Fusobacterium, Lactobacillus e Eubacterium.

Esta flora normal do corpo é um ecossistema complexo, que é regulada pela dieta, interações microbianas e fatores do hospedeiro tais como motilidade do intestino e secreções intestinais. Fatores externos tais como stress, mudanças de dieta e medicações que podem afetar a flora normal e alterar os tipos de organismos presentes ou seu metabolismo. Se o equilíbrio é rompido ele pode ser prejudicial para o hospedeiro e pode causar doença.

Algumas vezes, no entanto, o equilíbrio é perdido e invasão de patógenos são bem-sucedidos na penetração das defesas do corpo causando infecções ou disparo de respostas imunes inadequadas. Similarmente o equilíbrio entre hospedeiro e flora indígena pode ser comprometido levando a infecção por organismos normalmente dominantes, por exemplo, episódios de sapinho (infecção por Candida albicans) ou infecção por Clostridium diffi-cile após o uso de antibióticos.

Desapontadamente, as "balas mágicas" que antibióticos aparentemente oferecidos perderam algum de seu impacto. Nos últimos 30 anos, um problema sempre crescente de resistência a antibiótico se tomou uma principal questão de saúde pública. Hoje, alguns antibióticos são todos inúteis contra certos micróbios, enquanto que algumas bactérias são resistentes a quase todas as medicações antibióticas conhecidas.

Além disso, evidência está se acumulando que os micróbios in-dígenos do intestino grosso podem estar implicados em síndrome do intesti- no irritável (IBS), uma condição caracterizada por mudanças no habitat intestinal, distensão e defecação desordenada.

Claramente alternativos e talvez métodos complementares de tratamento são necessários. É um objetivo da presente invenção superar ou melhorar pelo menos uma das desvantagens da técnica anterior, ou para prover uma alternativa útil.

Sumário da Invenção Uma nova variante probiótica de Lactobacillus fermentum tendo características surpreendentemente vantajosas sobre cepas pré-existentes desta bactéria bem como outros microorganismos probióticos foi isolada. É particularmente útil na prevenção e/ou tratamento de distúrbios gastrointestinais devido a sua capacidade de colonizar o tatro gastrointestinal. Além disso, esta variante tem efeitos imunomoduladores vantajosos, que ocorrem tanto localmente no intestino quanto em sítios de mucosa através de todo o corpo via o sistema imune de mucosa normal. Como um resultado do caráter comum do sistema de mucosa, a variante pode também ser usada na prevenção e/ou no tratamento de outros distúrbios de condições e de superfícies de mucosa resultante de distúrbios de superfície de mucosa ou distúrbios no sistema imune ou estado de um indivíduo.

De acordo com um primeiro aspecto, é provido uma nova variante de Lactobacillus fermentum tendo as seguintes características: (a) ela é um bastonete facultativo, Gram-positivo, (b) ela fermenta ribose, galactose, glicose, frutose, manose, maltose, lactose, melibiose, sacarose, trealose, rafinose, L-arabinose e ma-nitol, (c) ela sobrevive a pH 1,5 por até 4 horas com uma perda em crescimento de não mais do que log 3, (d) ela se propaga na presença de 0,5% de sais biliares a 37°C resultando em um aumento na densidade ótica de 0,5 a 0,8, (e) ela é estável quando armazenada em cápsulas de gelatina a 25°C, (f) ela adere a Emplastros de Peyer em mais do que log 5 cfu por mg de tecido inibindo patógenos tanto por um efeito antogonístico direto quando por disparo de uma modulação imune; ou um seu componente.

De preferência a cepa variante Lactobacillus fermentum é VRI003 e número de acesso NM 02/31074).

De preferência, o componente é um componente purificado, secreção, extrato ou fragmento de célula.

De acordo com um segundo aspecto da invenção, é provido uma composição compreendendo uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto e um veículo farma-ceuticamente aceitável.

De preferência, a composição compreende cepa VRI 003 ou um seu componente. Em uma concretização preferida, a composição compreende células vivas da variante de Lactobacillus fermentum. No entanto, estará claro para o destinatário versado que a composição pode também conter células mortas da variante de Lactobacillus fermentum. Em uma concretização, a composição compreende um componente que é um componente purificado, secreção, extrato ou fragmento de célula.

Procedimentos para a preparação de tais fragmentos, extratos, secreções ou componentes purificados são bem conhecidos. Por exemplo, as células podem ser sonicadas ou a própria parede de célula pode ser fisicamente rompida e/ou o conteúdo de célula coletado. Células inteiras podem ser lavadas para dar componentes de superfície de extrato e estes extratos podem então ser fracionados se necessário.

De preferência, o Lactobacillus fermentum é combinado com outros compostos tais como prebióticos, componentes de dieta não-digeríveis, fibra de dieta ou compostos farmaceuticamente ativos. Mais de preferência, o prebiótico compreende ou consiste em inulina, um amido resistente, um oligossacarídeo, uma goma ou um beta-glucano. Ainda mais de preferência, o prebiótico é um amido de milho de alto teor de amilose não-modificado ou um beta-glucano. A composição pode ser preparada como um comprimido, cáp- sula, pó, gel, pasta, formulação líquida, suplemento de dieta ou um produto alimentício e semelhantes. De preferência, a composição é preparada em uma forma de comprimido ou cápsula.

De acordo com um terceiro aspecto, a invenção provê um método para a prevenção e/ou o tratamento de um distúrbio gastrointestinal ou um seu sintoma, compreendendo a etapa de administração de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.

De preferência o Lactobacillus fermentum é a variante VRI 003.

Os termos e "indivíduo" são usados intercambeavelmente neste relatório e no contexto da presente invenção incluem dentro de seu escopo qualquer mamífero que possa desenvolver, ou já tem, um distúrbio gastrointestinal e/ou distúrbios de superfícies de mucosa e/ou condições resultantes de distúrbios de superfície de mucosa ou distúrbios no sistema imune de qualquer que seja a causa. Estes indivíduos preferidos para administração do tratamento da presente invenção são seres humanos, animais de estimação domésticos e animais de fazenda.

De preferência, o distúrbio gastrointestinal é a síndrome do intestino irritável (IBS), doença de intestino inflamatório, doença de Crohn e/ou seus sintomas, tais como, por exemplo, diarréia, inchamento, flatulência, espasmo abdominal, dor abdominal, ou constipação. O distúrbio gastrointestinal pode ser causado por organismos patogênicos que podem ser bacteria-nos, virais ou protozoários. No entanto, pode também ser causado meramente por colonização do trato gastrointestinal com organismos inadequados ou por mecanismos auto-imunes e/ou inflamatórios.

De preferência, o distúrbio é o resultado de colonização do trato gastrointestinal do indivíduo por um patógeno. De preferência, o distúrbio é o resultado de uma alta carga de patógeno como aqui definido. Mais de preferência, o patógeno é uma bactéria, vírus ou protozoário. Mais de preferência, o patógeno é Salmonella, E. coli, Helicobacter, Vibrío, Pseudomonas, Clos-tridium, bacterióides; ou um vírus tal como Norwalks ou rotavírus ou um protozoário tais como Cryptosporidium, Entamoeba, Giardia e Dentamoeba.

No contexto da presente invenção, uma "alta carga de patógeno" pode ocorrer quando o indivíduo (a) foi submetido a ataque por um patógeno em uma quantidade não dentro da faixa normal de sua exposição habitual; (b) foi submetido a ataque por um patógeno viruiento; (c) foi submetido a ataque por um patógeno em uma hora em que quando a resistência do indivíduo está diminuída, por exemplo, de uma vez quando o sistema imune está depauperado e/ou quando os outros mecanismos de defesa do indivíduo não estão funcionando normalmente. A resistência de indivíduo pode estar baixa devido a, por exemplo, stress ou tratamento com antibiótico.

Em um quarto aspecto, a invenção provê um método para a prevenção e/ou tratamento de um distúrbio de uma superfície de mucosa ou um seu sintoma, compreendendo a etapa de administração de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição de acordo com o segundo aspecto a um indivíduo que necessita de tal tratamento.

De preferência, o distúrbio da superfície de mucosa é eczema roseaca ou dermatite atópica.

Em um quinto aspecto, a invenção provê um método de estimulação de produção de IL-12 em um indivíduo, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.

Em um sexto aspecto, a invenção provê um método de regulação para cima de IFN-Y; compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.

Em um sétimo aspecto, a invenção provê um método de indução de uma resposta de tipo Th 1 em um indivíduo, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.

Em um oitavo aspecto, a invenção provê um método de inibição do crescimento de um patógeno, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto, ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.

Em um nono aspecto, a invenção provê um método de modulação de micróbios indígenos do trato gastrointestinal, compreendendo a etapa de administração de uma quantidade eficaz de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente de acordo com o primeiro aspecto ou uma composição de acordo com o segundo aspecto, a indivíduo que necessita de tal tratamento. A quantidade de dosagem exigida variará de acordo com a severidade da condição a ser tratada, a causa da condição, idade do indivíduo e outros parâmetros clínicos padrão que podem ser facilmente determinados por procedimentos rotineiros dentro do conjunto de habilidade daqueles versados na técnica. A variante de Lactobacillus fermentum, ou um seu componente ou a composição compreendendo a dita variante, pode ser administrado por qualquer meio conhecido mas de preferência é administrado oralmente. A variante de Lactobacillus fermentum, ou a composição compreendendo a dita variante ou um seu componente, pode ser administrada em combinação com um ou mais outros agentes farmacêutica mente ativos. A variante, ou a composição compreendendo a dita variante, pode ser administrada simultaneamente (co-administrada) com os outros tratamentos ou pode ser administrada sequencialmente em qualquer ordem. É preferido que a variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente ou uma composição compreendendo-a, seja administrada diariamente. Ela pode ser administrada várias vezes por dia, ou pode ser administrada raramente (por exemplo, a cada dois ou três dias), dependendo do progresso de tratamento da condição em questão, sua causa e severidade. Estes parâmetros podem também ser facilmente determinados por aqueles versados na técnica.

No contexto da presente invenção, o termo "estável" inclui dentro de seu escopo uma perda em viabilidade de até 25% por seis meses de armazenagem a 25°C.

No contexto da presente invenção, o termo "componente" como se aplica a componentes do Lactobacillus fermentum da invenção inclui mas não é limitado a fragmentos de célula, extratos, secreções e agentes purificados derivados da bactéria. A não ser que o contexto claramente exija de outra maneira, através de toda a descrição e as reivindicações, as palavras "compreende", "compreendendo", e semelhantes devem ser interpretados em um sentido em comparação com um sentido exclusivo ou exaustivo; isto é, no sentido de "incluindo, mas não limitado a".

Breve Descrição das Figuras A figura 1. Efeito sobre diferentes concentrações de sais biliares sobre crescimento e viabilidade de Lactobacillus fermentum VRI 003. A figura 2. O efeito de baixo pH sobre viabilidade de cultura de VRI 003 in vitro. A figura 3. Adesão de Lactobacillus spp a emplastros de Peyer de camundongo.

As figuras 4 e 5. Uma análise bidimensional das proteínas de parede de célula extraídas a partir de células de VRI 003 Lactobacillus fermentum em comparação com as paredes de célula de Lactobacillus fermentum LMG, anteriormente não mostraram aderir aos emplastros de Peyer, mostra que o VRI 003 regula para cima duas proteínas de parede de célula e regula para baixo a expressão de uma série de outras proteínas de parede de célula, (figura 4) quando em comparação com Lactobacillus fermentum LMG (figura 5). A figura 6. Efeito de estimulação de VRI 003 de Lactobacillus fermentum sobre produção de citocina por macrófagos. A figura 7. Aumento de níveis de citocina nos emplastros de Peyer após administração dosada oral de Lactobacillus fermentum VRI 003. A figura 8 Efeito de administração oral de Lactobacillus fermentum VRI 003 sobre níveis de citocina no baço após a administração dosada oral de Lactobacillus fermentum VRI 003. A figura 9. Estabilidade de Lactobacillus fermentum VRI 003 em cápsulas de gelatina de tamanho 1 combinadas com amido resistente a baixa atividade de água e armazenadas em embalagens de blister folha-folha a 4C, 25C e 30C. A figura 10. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo IBS N°4 durante uma experiencia de 8 semanas. Perfis microbia-nos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, place-bo, suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml. A figura 11. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo de IBS N°5 durante uma experiência de 8 semanas. Perfis microbi-anos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, pla-cebo, suspensão de tratamento e simbióticos. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml. A figura 12. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo IBS N° 9 durante uma experiência de 8 semanas. Perfis microbia-nos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, place-bo, suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml. A figura 13. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo IBS N°2 durante uma experiência de 8 semanas. Perfis microbia-nos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, place-bo, suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml.

Figura 14. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo IBS N°3 durante uma experiência de 8 semanas. Perfis microbia-nos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, place-bo, suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml.

Figura 15. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo IBS N°7 durante uma experiência de 8 semanas. Perfis microbia-nos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, place-bo, suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml.

Figura 16. Mudanças em bactérias em material fecal oriundo de indivíduo IBS N°6 durante uma experiência de 8 semanas. Perfis microbia-nos monitorados durante os períodos de tratamento de linha de base, place-bo, suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados expressos como unidades formadoras de colônia (cfu) por ml.

Descrição Detalhada da Invenção Embora tenha havido várias tentativas para usar probióticos na prevenção e no tratamento de muitos distúrbios, a evidência para o uso de probióticos no tratamento de distúrbios gastrointestinais era muito variável. Agora verificou-se que uma variante de Lactobacillus fermentum tendo as seguintes características: (a) ela é um bastonete facultativo, Gram-positivo, (b) ela fermenta ribose, galactose, glicose, frutose, manose, maltose, lactose, melibiose, sacarose, trealose, rafinose, L-arabinose e ma-nitol, (c) ela sobrevive a pH 1,5 por até 4 horas com uma perda em crescimento de não mais do que log 3, (d) ela se propaga na presença de 0,5% de sais biliares a 37°C resultando em um aumento na densidade ótica de 0,5 a 0,8, (e) ela é estável quando armazenada em cápsulas de gelatina a 25°C, (f) ela adere a Emplastros de Peyer em mais do que log 5 cfu por tecido inibindo patógenos tanto por um efeito antogonístico direto quanto por disparo de uma modulação imune; ou um seu componente, é/são altamente eficaz na prevenção e/ou tratamento de um distúrbio gastrointestinal e/ou seus sintomas. De preferência, a variante é Lactobacillus fermentum VRI 003. A presente invenção também provê um método para a prevenção e/ou tratamento de um distúrbio gastrointestinal compreendendo a administração de uma variante de Lactobacillus fermentum ou um seu componente, ou uma composição compreendendo a variante a um indivíduo. A variante pode ser combinada com outros agentes, por exemplo, um prebiótico, um componente de dieta não-digerível, fibra de dieta ou um composto farmaceuticamente ativo tais como aspirina e estatinas.

Os métodos e composições da presente invenção foram desenvolvidos para aplicações humanas e veterinárias no tratamento de distúrbios gastrointesinais, mas como um resultado do caráter comum do sistema de mucosa, os tratamentos podem ser aplicados a outros distúrbios de superfícies de mucosa e condições resultantes de distúrbios de superfície de mucosa ou distúrbios no sistema imune ou estado de um indivíduo. Se usado para tratamentos de seres humanos ou animais domésticos, os princípios subjacentes são os mesmos e vantajosamente os tratamentos da presente invenção podem ser usados independentemente da causa das condições descritas acima.

Tipicamente, a dosagem diária eficaz está na faixa de cerca de 108-1012 bactérias e freqüência de administração é uma vez ou duas vezes diariamente.

Para ingestão de longo prazo a quantidade pode, por exemplo, ser abaixo da faixa mencionada acima; e em outras circunstâncias, ela pode ser usada em uma quantidade acima da faixa. A variante de Lactobacillus fermentum pode ser formulada por meios conhecidos, usando-se veículos, excipientes, solventes ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis. Tais procedimentos e ingredientes são bem conhecidos e são amplamente descritos em manuais e textos padrão, por exemplo, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 1995, Mack Publishing Co. Easton, PA 18042, USA, que é incorporado aqui por referência. A variante de Lactobacillus fermentum ou seus componentes podem também ser formulados para formação de um produto alimentício pelos meios bem conhecidos usais. A composição compreendendo a bactéria inclui bactérias viáveis, bactérias úmidas, bactérias secas ou componentes da bactéria incluindo mas não restritos a fragmentos de célula, extratos, secreções e componentes purificados. O produto alimentício ou de bebida da invenção contém pelo menos uma das bactérias, um material contendo o mesmo e um seu produto processado que o ingrediente eficaz.

Uma composição pode ser formulada para ser adequada para a administração oral em uma variedade de meios, por exemplo, na forma de um comprimido, uma cápsula, um líquido, um suplemento de dieta, uma pasta, um gel, um produto alimentício, e semelhantes. Outras formulações estarão prontamente evidentes por aquele versado na técnica. A bactéria pode ser usada em produtos alimentícios ou de bebida ou pode ser usada em combinação com outros materiais alimentícios e componentes alimentícios apropriadamente de modo convencional.

De preferência, a composição é preparada como um produto alimentício de laticínio ou produto alimentício à base de laticínio com ou sem outros componentes que são rotineiramente usados na produção de tais produtos de laticínio.

As composições da presente invenção podem também incluir antioxidantes, agentes de tamponamento e outros agentes conhecidos tais como agentes de coloração, flavorizantes, vitaminas ou minerais. Agentes de espessamento podem ser adicionados às composições tais como amido de milho, goma guar, goma de xantano, e semelhantes. Componentes adicionais preferidos de uma composição terapêutica desta invenção podem incluir prebióticos tais como inulina, componentes de dieta não-digerível, fibra de dieta, compostos farmaceuticamente aceitáveis e outros nutrientes. En- zimas de dieta ou suplementares tais como lactase, amilase, glucanase, ca-talase, e semelhantes enzimas podem também ser incluídas. Prebióticos preferidos incluem amido de milho de alto teor de amilose não-modificado ou beta-glucano. A bactéria é combinada com um veículo que é fisiologicamente compatível com o tecido gastrointestinal ou superfície de mucosa da espécie à qual ela é administrada. Veículos podem ser constituídos de materiais secos, com base em sólido para formulação para formar comprimido, cápsulas ou forma em pó; ou o veículo pode ser constituído de materiais líquidos ou à base de gel para formulações para formar formas de gel ou líquida. O tipo específico de veículo, bem como a formulação final depende, em parte, da(s) rota(s) selecionada(s) de administração.

Veículos típicos para formulações secas incluem, mas não são limitados a: trealose, maltodextrina, farinha de arroz, celulose microcristalina (MMC), estearato de magnésio, inositol, FOS, GOS, dextrose, sacarose, e veículos semelhantes. Formulações secas (por exemplo, pós) podem ser adicionadas a alimentos comercialmente disponíveis (por exemplo, fórmulas líquidas, produtos de dieta, ou água). Similarmente, o tipo específico de formulação depende da rota de administração.

Veículos à base de gel ou líquidos adequados incluem mas não são limitados a: água e soluções salina fisiológicas; uréia; álcoois e derivados (por exemplo, metanol, etanol, propanol, butanol); glicóis (por exemplo, etileno glicot, propileno glicol e semelhantes). De preferência, veículos à base de água possuem um valor de pH neutro (isto é, pH 7,0).

Conservantes podem também ser incluídos dentro do veículo incluindo metilparabeno, propilparabeno, álcool benzílico e sal de tetraace-tato de etileno diamina. A composição do veículo pode ser variada contanto que ela não interfira significativamente com a atividade farmacológica dos ingredientes ativos.

Os métodos da presente invenção compreendem a administração da variante de Lactobacillus fermentum ou seus componentes uma composição compreendendo a variante ou seus componentes, a um ser hu- mano ou animal para tratar e/ou prevenir um distúrbio gastrointestinal ou um distúrbio de uma superfície de mucosa e condições resultantes de distúrbios de superfície de mucosa ou distúrbios no sistema imune ou estado de um indivíduo e/ou os sintomas associados a tais distúrbios, por exemplo, sín-drome do intestino irritável (IBS), doença de intestino inflamatório e/ou seus sintomas, tais como, por exemplo, diarréia, inchamento, flatulência, espasmo abdominal, dor abdominal ou constipação e eczema ou rosacea. Este tratamento pode resultar em uma modulação dos micróbios indígenos do trato gastrointestinal. Administração é de preferência realizada usando-se um comprimido, uma cápsula, um gel, uma formulação líquida, um pó, uma pasta, um suplemento de dieta ou um produto alimentício e formulação semelhante, todos formulados para conter uma composição terapêutica da presente invenção por uso de métodos bem conhecidos dentro da técnica.

Concretizações preferidas da invenção agora serão descritas a título de exemplo apenas.

Exemplos Exemplo 1: Origem e Identificação A variante de VRI 003 foi isolada de um indivíduo saudável. Em uma série de experiências de laboratório, a variante de VRI 003 demonstrou aderir ao tecido epitelial gastrointestinal. Também demonstrou ter um efeito demonstrável sobre patógenos gastrointestinais humanos, e era resistente a ácidos biliares. A variante de VRI 003 também sobreviveu em um ambiente de baixo pH e era resistente à pepsina e a condições limitadas de nutriente. A variante bacteriana VRI 003 pode ser cultivada sobre Placas de ágar Rogosa (Oxoid) que foram incubadas a 37°C em uma câmara anae-róbica por 24 horas. A cepa foi purificada por sucessivas transferências sobre placas de ágar de MRS (Oxoid) incubadas a 37°C em uma câmara anae-róbica por 24 horas e a cultura final armazenada a -70°C em 20% de glicerol por sub-cultivo em caldo de MRS a 37°C por 24 horas em condições anae-róbicas antes da adição de glicerol ao caldo de cultura.

Variante VRI 003 era um bastonete Gram-positivo, negativo a catalase que produziu gás quando desenvolvido anaerobicamente em caldo de infusão de cérebro coração (BHI) (Oxoid) contendo glicose. Foi amplamente identificado, portanto, como um lactobacilo heterofermentativo e confirmou ser cepa de Lactobacillus fermentum de acordo com o kit de carboi-drato de API (kit de 50 CHL; Biomerieux; base de dados e base de dados de fornecedor com uma certeza de 99,9%. Em particular, açúcares 5, 10, 11, 12, 13, 25, 28, 29, 30, 31, 32 e 25 são utilizados por cepa VRI 003. A célula é um bastonete curto, Gram-positivo e consistente com a descrição da mor-fologia de Lactobacillus fermentum.

Cepa de Lactobacillus fermentum VRI 003 foi depositada sob as condições do Tratado de Budapeste, no Australian Govermment Analytical Laboratories, PO BOX 385 Pymble 2073, NSW, Austrália, 27 de agosto de 2002 e o depósito foi alocado a número de acesso NM02/31074.

Exemplo 2: Características e Descrição de Cepa VRI 003 (i) morfoloqia de colônia Quando desenvolvidas sobre ágar de MRS (Oxoid) em uma câmara anaeróbica a 37°C, as colônias são cerca de 1 mm de diâmetro, brilhantes, de forma de cúpula, opacas e quando tocadas com um laço mostram uma viscosidade. A viscosidade pode ser devido à presença de um polímero ex-tracelular. Incubação de placas similares em condições aeróbicas a 37°C fornece algumas colônias de aparência áspera e aresta irregular. Subcultura destas colônias ásperas sobre ágar de MRS e incubação a 37°C na câmara anaeróbica fornece colônias opacas brilhantes, de forma de cúpula opacas que são pegajosas para se tocar. (ii) Crescimento em Caldo A cultura de variante VRI 003 em caldo de MRS (Oxoid) ou em vários outros caldos, resulta em caldo viscoso quando desenvolvido a 37°C em condições anaeróbicas. (iii) Resistência a ácidos biliares Como mostrado na figura 1, cepa VRI 003 se desenvolve na presença de 0,5% e 0,15% de sais biliares quando ácidos foram adicionados a caldo de MRS (Oxoid) e a cepa foi incubada anaerobicamente a 37°C por 8 horas.

(M Sobrevivência em ambiente de baixo pH VRI 003 oriundo de estoque de glicerol foi passado duas vezes em caldo de MRS antes do uso para o ensaio. No dia do ensaio as culturas foram coletadas a partir do caldo de MRS por centrifugação a 400 x g e pé-lote foi diluído em tampão de Clark e Lubs ajustado para pHs 1,5 e 2,0 respectivamente para dar uma densidade ótica de 0,4 (correspondendo a 1x108 CFU/ml). A sobrevivência do organismo foi determinada por alíquotas de diluição em série tiradas de hora em hora durante 4 horas e espalhando alíquotas de 100 microlitros sobre placas de ágar de MRS que foram então incubadas a 37°C anaerobicamente por 24 h. Como mostrado na figura 2, cepa de Lactobacillus fermentum VRI 003 mostrou melhor sobrevivência do que cepa de Lactobacillus fermentum VRI 002 que diminuiu de log 8,75 cfu por ml a pH 1,5 a log 4,93 cfu/ml durante 4 horas. (v) Utilização de carboidrato Usando-se os kits de utilização de carboidrato de API 50 CHL para estudar, carboidratos esses que o Lactobacillus fermentum VRI 003 poderia utilizar, algumas diferenças com cepa de Lactobacillus fermentum VRI 002 foram observadas com tempo de incubação. Depois de 6 horas de incubação, VRI 003 foi capaz de utilizar os seguintes açúcares, como definido por meios tornando-se amarelo, Ribose, Galactose, Glicose, Frutose, Manose, Maltose, Lactose, Melibiose, Sacarose, Trealose, Rafinose. VRI 002 era capaz de utilizar tudo acima neste momento, exceto manose.

Depois de 6 horas de incubação, ambas as cepas eram capazes de ligeiramente utilizar Gluco Na Te.

Por 18 horas de incubação, uma mudança foi observada na área contendo manose da tira a partir da qual ela foi submetida a infravermelho que VRI 002 estava utilizando manose, mas relativa e lentamente.

Por 24 horas de incubação, estava claro que VRI 003 estava utilizando os açúcares L-Arabinose e Manitol. VRI 002, além destes dois açúcares de extra-utilização, a saber, ramnose e N-acetil-glucosamina.

Depois de incubação de 48 horas, VRI 003 utlizou todos o Gluco Na Te, enquanto a cepa de VRI 002 tinha apenas utilização muito leve. (vi) Adesão de Lactobacillus fermentum VRI 003 (a) adesão in vitro a emplastros de Pever Lactobacillus fermentum VRI 003 radioativamente marcado foi incubado por 30 minutos com emplastros de Peyer in vitro e nível de adesão foi quantificado. Como mostrado na figura 3, VRI 003 exibiu ligação aumentada a células de emplastro de Peyer em comparação com outras cepas encontradas no lab (La 1-L.acidophilus 1, LA 2-L. acidophilus 2, L. casei e VRI-002). Como os emplastros de Payer agem como o sítio de amostragem para o sistema imune no intestino. Esta adesão aumentada de cepa de Lactobacillus fermentum VRI 003 aos emplastros de Peyer levará a um efeito imunoestimulador aumentado desta cepa. (b) Ligação mediada por proteína de Lactobacillus fermentum 003 a emplastros de Pever A fim de caracterizar o mecanismo de ligação aos emplastros de Peyer, as células de Lactobacillus fermentum foram pré-tratadas antes do ensaio de adesão com enzimas de proteinase e metraperiodato para determinar se polissacarídeo de proteínas estava envolvido na adesão. Verificou-se que o tratamento com metaperiodato aumentou adesão e, portanto, sem estar ligado pela teoria, pode-se concluir que os polissacarídeos extracelula-res não estavam envolvidos em adesão e, de fato, ligação reduzida. O tra- tamento das células de Lactobacillus fermentum com enzimas de pnoteinase dramaticamente diminuiu ligação, assim implicando proteínas de parede de célula na ligação aos emplastros de Peyer. Além do mais, extratos de superfície de célula poderiam significativamente bloquear ligação quando adicionados ao tecido anterior à adição das células de Lactobacillus fermentum inteiras, confirmando a presença de uma porção com afinidade para os emplastros de Peyer sobre a superfície de parede de célula do Lactobacillus fermentum VRI 003.

Tabela 1. Efeito de tratamentos químicos e enzimáticos de Lactobacillus fermentum VRI 003 e tecidos de emplastro de Pever sobre a aderência tratamento índice de adesão (%)a L fermentun VRI 003 emplastro de Peyer PBS apenas 100 + 10,13 100 + 8,05 Proteinase K 33,48 + 5,67* 120,76 ± 0,27 Tripsina 48,69 + 5,22 60,81 +0,38 Periodato 224,08 + 21,73* 64,24 + 6,60 lodato 108,59 + 2,80 69,54 + 3,69 Tampão 100 + 0,84 100 + 12,50 proteínas de superfície de célula (5 48,15+ 10,23* ND pg/ml) proteínas de superfície de célula (50 46,14 + 7,91* ND mg/ml) proteínas de superfície de célula (100 42,23 + 6,37* ND mg/ml) a índice de adesão expresso como uma percentagem do número de bactérias aderentes por mg de peso úimido de amplastros de Peyer. Adesão a tecidos de controle representa 100% de adesão.

Dados são expressos como médias + 61617; médias de erro padrão. Ou o Lactobacillus fermentum VRI 003 ou os emplastros de Peyer foram pré-tratados com os vários tratamentos antes de estarem incluídos no ensaio de adesão. A análise bidimensional das proteínas de parede de célula extraídas das células de Lactobacillus fermentum VRI 003 e em comparação com as paredes de célula de Lactobacillus fermentum LMG, anteriormente mostrou não aderir aos emplastros de Peyer, mostra que VRI 003 regula para cima duas proteínas de parede de célula e regula para baixo a expressão de uma série de outras proteínas de parede de célula (figura 4), quando em comparação com Lactobacillus fermentum LMG (figura 5). (c) Adesão à mucosa intestinal humana Indivíduos tomando o Lactobacillus fermentum como um pó seco por congelamento em uma cápsula de gelatina (log 10-11 por dia por 14 dias) foram submetidos à endoscopia e uma biopsia foi tirada da parede do intestino delgado. A biopsia foi lavada e foi homogeneizada antes de ser diluída em série e foi laminada sobre ágar de MRS para isolamento de aderir lactobacilos. Os lactobacilos isolados foram purificados e foram provados serem Lactobacillus fermentum VRI 003 usando-se anticorpos específicos de VRI 003. (vii) Efeito de Lactobacillus fermentum VRI 003 sobre parâmetros de imunidade (a) Efeitos diretos de Lactobacillus fermentum VRI 003 sobre macrófaqos Macrófagos derivados de medula óssea foram gerados e foram estimulados com diferentes concentrações de Lactobacillus fermentum VRI 003 por 4 horas. Lactobacillus fermentum VRI 003 foram ou dados a uma alta concentração (multiplicidade de infecção (MOI-260; Cone. 1) ou uma baixa concentração (MOI-26, Cone. 2).

Como pode ser visto a partir da figura 6, há uma concentração de liberação de citocina dependente de resposta pelos macrófagos. No dia 1 pós-estimulação, os macrófagos que foram estimulados com a concentração mais alta de ou Lactobacillus fermentum VRI 002 ou Lactobacillus fermentum VRI 003 produziu IL-12 significativamente maior em comparação com macrófagos que tinham recebido a concentração mais baixa. Os níveis de IL-10 produzidos pelos macrófagos em resposta à estimulação por Lactobacillus fermentum VRI 003 eram muito baixos em comparação com níveis de IL-12 produzidos.

Isto é como esperado uma vez que IL-12 e IL-10 são produzidos mutuamente exclusivos do outro por macrófagos. Acredita-se que o nível de IL-12 produzido por macrofágos desempenhe um papel significativo na determinação da resposta imune dirigida contra um antígeno. A presença de IL-12 no ambiente local das células dendríticas do trato gastrointestinal inici-alizam células T em direção a uma resposta de tipo Th 1. Estes dados sugerem que doses mais altas de Lactobacil/us fermentum VRI 003 tem a capacidade de mover o sistema imune em direção a uma resposta de Th 1, e que isto é feito mais eficazmente do que é feito pelo Lactobacillus fermentum VRI 002. (b) Efeito de Lactobacillus fermentum VRI 003 sobre parâmetros imunes in vivo A camundongos BALB/c foram oralmente administrados com 1 x 109 cfu/camundongo/dia de Lactobacillus fermentum VRI 003. Os camundongos foram sacrificados em pontos de tempo diferentes. Baços e emplastros de Peyer foram extirpados e parâmetros imunes foram medidos. A camundongos BALB/c foram oralmente administrados com 1 x 109 cfu/camundongo/dia de Lactobacillus fermentum VRI 003 por 5 dias. Camundongos de controle receberam PBS. Os camundongos foram sacrificados no dia 6. Baços e emplastros de Peyer foram extirpados e parâmetros imunes foram medidos.

Como mostrado na figura 7, alimentação oral de Lactobacillus fermentum VRI 003 por 5 dias leva a IL-12 e IFN-Y; significativamente aumentados pelos emplastros de Peyer em comparação com o grupo de controle e com a outra cepa de lab usada na experiência (uma outra cepa de Lactobacillus fermentum LF 1). A figura 8 mostra que alimentação de Lactobacillus fermentum VRI-003 não pareceu afetar níveis de citocina no baço. Níveis de IL-12 e IFN-Y; de camundongos alimentados com Lactobacillus fermentum VRI 003 foram comparáveis para controlar camundongos (que tinham sido alimentados com PBS). Portanto alimentação oral de Lactobacillus fermentum VRI 003 em camundongos normais na ausência de uma infecção ativa estimula imunidade de mucosa, e inicializa-a para montagem de ótimas respostas contra patógenos de intestino. (viiO Estabilidade de pó seco por congelamento de Lactobacillus fermentum VRI 003 A figura 9 mostra que VRI 003 é particularmente estável em cápsulas de gelatina quando em combinação com amido resistente à baixa atividade de água e armazenado a 25°C e 30°C. (ix) Adesão Enquanto a capacidade de colonizar o trato gastrointestinal humano não é um pré-requisito para a função ativa de uma cepa probiótica no trato digestivo, ela é uma característica desejável. Se a cepa probiótica puder aderir ao epitélio do trato gastrointestinal, ela pode colonizar, isto é, estabelecer e se desenvolver dentro do trato, e continuamente produzir meta-bólitos que podem mediar o efeito benéfico. A variante VRI 003 coloniza o trato digestivo humano quando oralmente administrada a uma faixa de seres humanos. (x) Efeitos antaqonísticos A partir dos estudos de inibição de patógeno in vitro era evidente que a cepa produzisse metabólitos que inibissem o crescimento de uma gama de patógenos potenciais, tanto espécie Gram-negativa quanto espécie Gram-positiva incluindo numerosas cepas de Escherichia coli, Salmonella typhimirium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Enterococcus fae-cium, Enterococcus facalis, Candida albicans e Staphylococcus aureus.

Sem querer estar ligado por qualquer mecanismo particular de ação, para uma cepa probiótica para eficazmente proteger o indivíduo contra patógenos do trato gastrointestinal, pode ser necessário produzir alguns metabólitos inibitórios para o crescimento do patógeno. Este efeito inibitório sobre crescimento é chamado de um efeito antagonístico e os metabólitos antagonísticos podem ser classificados como composto de baixo ou alto peso molecular. Três diferentes métodos foram usados para avaliar a capacidade antagonística de cepa VRI 003 contra uma gama de patógenos humanos, a saber um ensaio de co-cultura de placa direta, cultura de caldo em fluido de cultura gasto do Lactobacillus e um modelo de desafio de animal. O método de placa direto foi usado para triagem de um grande número de patógenos por uso de um inóculo de ponto do Lactobacfflus que é revestido com os patógenos e o tamanho da zona de inibição de crescimento do patógeno medido depois da incubação. Para quantificar ulterior-mente o efeito antagonístico detectado usando-se este método, o VRI 003 foi co-cultivado com o patógeno em meio líquido e o número de células de patógeno viáveis enumeradas depois de 24 horas. O tamanho da zona foi usado para quantificar a extensão da inibição. A atividade inibitória da cepa VRI 003 foi também examinada para determinar se metabólitos de baixo e alto peso molecular dos lactoba-cilos mediaram os efeitos inibitórios de crescimento detectados. O fluido de cultura gasto bacteriano de VRI 003 foi coletado e uma parte dialisada para reter apenas compostos com um peso molecular maior do que 8.000. O crescimento de patógenos humanos selecionados foi estudado na ausência e na presença do retentatos de diálise e os fluidos de cultura gastos não-dialisados. Enquanto o fluido de cultura gasto esterilizado de filtro não-dialisado preveniu crescimento dos patógenos, os dialisados exibiram efeitos bacterioestáticos bem como efeitos bacteriocidas. A partir dos estudos de inibição de patógeno in vitro era evidente que a cepa produzisse metabólitos que inibissem o crescimento de uma gama de patógenos potenciais, tanto espécie Gram-negativa quanto espécie Gram-positiva. A variante VRI 003 produziu metabólitos de baixo e alto peso molecular que poderíam inibir patógenos e proteger em estudos de desafio de animal. A administração oral da cepa a camundongos desafiados com Safmonella previne a perda de peso observada que ocorre em camundongos de controle apenas recebendo a Safmonella e nenhum Lactobacillus. Exemplo 3: Cultura e formulações fi) Crescimento de cultura Variante de Lactobacillus fermentum VRI 003 é desenvolvida em um recipiente de fermentação a 37°C. O recipiente é então resfriado e o caldo de fermentação é concentrado, de preferência por centrifugação. A cultura coletada é seca, de preferência por secagem por congelamento e subse-qüentemente é moída. O material moído é então combinado com o principal excipiente para dar o nível desejado de micróbios por grama de material seco. O nível a ser usado é dependente da apliação (faixa até log 11 por grama). O material padronizado é então usado na formulação por misturação de todos os ingredientes em um misturador (de preferência um misturador V.). (ii) Formulações (a) Formulação A: com base em milho de alto teor de amílase (formulação simbiótica) Lactobacillus fermentum VRI 003 100 mg H-milho 958 (ou 1043) 170 mg ácido esteárico até 4,5 mg dióxido de sílica até 4,5 mg (b) Formulação B: com base em Celulose microcristalina (MCC) Lactobacillus fermentum VRI 003 100 mg Avicel Ph 112 (ou equivalente) 170 mg ácido esteárico até 4,5 mg dióxido de sílica até 4,5 mg (c) Formulação C: Ou a base de milho de alto teor de amilase ou o MCC baseado como descrito em A e B, com sílica coloidal (até 4,5 mg) ao invés de dióxido de sílica ou com dióxido de sílica também (até 4,5 mg).

Uma das características desejadas para VRI 003 é que ela permanece viável e tem a capacidade de se desenvolver dentro do trato gastrointestinal humano depois da dosagem. Como delineado acima esta característica era uma dos critérios de seleção para uma cepa desejável. No entanto, isto não é necessariamente essencial para os efeitos benéficos desejados.

Um fator importante adicional aqui é que embora a cepa tenha a capacidade de sobreviver a várias condições dentro do trato, a cepa deve reter viabilidade e características de cepa desejadas quando desenvolvidas em uma grande escala e distribuídos em uma forma de produto. Todos os resultados apresentados acima foram com base em células de VRI 003 coletadas diretamente das culturas de laboratório de desenvolvimento ativo. A seguir é uma análise da viabilidade e características de cepa de VRI 003 depois da cultura em grande escala e secagem por congelamento, bem como depois da encapsulação em cápsulas de gelatina.

Viabilidade de VRI 033 seco por congelamento A viabilidade de VRI 003 depois de produção em grande escala e de secagem por congelamento foi determinada por análise das unidades formadoras de colônia por grama (CFU/g) de material seco. O pó seco foi examinado tanto antes quanto depois da encapsulação nas cápsulas de gelatina. O número de células viáveis foi determinado para 10 amostras de 1 g individuais do pó. O conteúdo de dez cápsulas foi também individualmente analisado. VRI 003 mantinha altos níveis de viabilidade através da produção e da encapsulação. O pó seco continha 5,6 x 1010 cfu/g e o conteúdo das cápsulas continha 4,15 x 1010 CFU/g; resultados expressos como a média onde n = 10.

Quando as cápsulas foram armazenadas em embalagem de fo-Iha/folha, uma perda 1,5 log, ou menos de viabilidade foi observada com armazenagem a 30°C e 25°C por 6 meses. (iv) Características de variante O pó seco e o conteúdo da cápsula foram suspensos em solução salina tamponada por fosfato (0,1 M, pH 7,2) para fornecer uma diluição de 100 vezes. As características da variante delineadas acima foram testadas nesta suspensão bacteriana. Para todos os testes, uma cultura de desenvolvimento ativo de VRI 003 foi incluída como o controle interno. Como detalhado a seguir nenhuma perda marcada de características de cepa foi observada para o pó seco por congelamento ou para o conteúdo da cápsula.

Além disso, o pó e o conteúdo da cápsula mostraram características de adesão similares àquelas de cultura de controle desenvolvida em laboratório.

Exemplo 4. Efeito de administração de Lactobacillus fermentum VRI. VRI 003 com ou sem um prebiótico. nos sintomas de síndrome de intestino irritável (IBS) e perfil de flora gastrointestinal (\) Projeto experimental Participantes Sete pacientes com IBS (2 machos e 5 fêmas) participaram no estudo depois de darem consentimento informado por escrito (HREC 99264). Todos os pacientes não tinham tomado antibióticos três meses antes do início do estudo. Todos os pacientes foram examinados por um médico antes da participação na experiência para apresentação de critérios de diagnósticos de IBS e ausência de doença orgânica. Todos os pacientes eram sintomáticos na hora do estudo.

Projeto da experiência A experiência com placebo uni-cego se prolongou por uma duração de 8 semanas, que consiste em três semanas de tratamento com placebo seguido por duas semanas suspensão de tratamento (nenhum tratamento) e concluindo com 3 semanas de tratamento simbiótico, isto é, tratamento com uma formulação contendo variante de VRI 003 e um prebiótico. Um grupo menor de pacientes foi tratado com uma formulação contendo VRI 003 sozinho.

Dietas dos pacientes não foram controladas no estudo, no entanto, eles foram aconselhados a abester-se de consumo de produtos de leite fermentado (por exemplo, iogurte e coalhada). Amostras fecais frescas foram exigidas dos pacientes no dia um da experiência para formar a linha de base, e então nos dias 21, 35 e 56 (antes e depois de cada período de tratamento). Um questionário inicial foi completado pelos pacientes no primeiro dia da experiência e depois disso questinionários semanais foram completados pelos pacientes para cada semana da experiência. O protocolo de tratamento típico era como se segue (provido pela formulação simbiótica mas um protocolo similar foi usado para uma formulação com VRI 003 sozinho). Cápsulas e carboidratos Cápsulas vázias foram manualmente enchidas. Conjunto de cápsulas foi realizado em uma capela de fluxo laminar e materiais foram es-teralizados por 15 minutos sob UV antes do uso. Cápsulas de placebo continham celulose microcristalina NF XVIII (Mingtai Chemical Company Ltd, Taiwan), enquanto cápsulas probióticas consistiam em Lactobacillus fer-mentum (VRI 003) como um pó seco por congelamento. (1,6 x 1010 cfu.gm'1, DSM Moorebank, Sydney). Cápsulas mostradas foram colocadas em vidros de amostra com dois sachets de sílica-gel.

Maltodextrina (Fieldstar®, Goodman Fielder, Sydney) e amido resistente (Culture Pro®; 958, Penfold Australia), foram utilizados como o placebo e carboidratos prebióticos, respectivamente. Carboidratos foram colocados sob UV por 15 minutos em uma capela de fluxo laminar, antes que as amostras fossem pesadas (20 g) e fossem colocadas em 70 ml de vidros de amostra que foram armazenados na câmara limpa.

Questionários Um questionário inicial foi usado para estabelecer sintomas presentes e anteriores dos pacientes antes do início da experiência. A pacientes foram perguntados para avaliar a severidade de seus sintomas, incluindo diarréia, constipação, diarréia altemante e constipação, flatulência, incha-mento e dor abdominal com espasmo, em uma escala de 0 (ausente) até 10 (extrema). Outras questões referindo-se a causas e alívio de distúrbios de intestino e alergias de alimento são também perguntadas.

Pacientes eram obrigados a completar um questionário semanalmente no fim de cada semada pela duração da experiência que mais uma vez perguntou-lhes para avaliar a severidade de seus sintomas e também a natureza de quaisquer distúrbios de intestino. Além disso, questões referentes a consumo e efeitos aparentes das cápsulas e carboidratos foram também perguntados.

Preparação de material fecal Inóculo fecal foi coletado a partir de indivíduos com IBS que não tinham tomado antibióticos por três meses antes do início da experiência.

Fezes foram coletadas para dentro de um recipiente plástico limpo e foram transferidas para dentro da câmara anaeróbica quando da chegada. Uma parte das fezes foi homogeneizada com três partes de caldo de Wilkin-Chalgrens (WC) de meia-força (Oxoid, CM643) em uma bolsa de "stoma-cher" Seward.

Enumeração de bactérias Uma diluição em série de dez vezes foi realizada em caldo de Wilkin-Chalgrens (WC) de meia-força (Oxoid, CM643) em tubos de micro-centrífugas estéreis, depois do que alíquotas de 10 ML foram laminadas por gotas em triplicata sobre vários meios (tabela 1), a fim de avaliar os números de principais grupos microbianos presentes nas amostras fecais. Meios foram preparados de acordo com as recomendações do fabricante. Amostras laminadas sobre placas de RCA foram primeiramente aquecidas até 90°C por 10 minutos.

Tabela 1 Populações de bactérias enumeradas na fermentação * Oxoid 1 sangue desfibrinado com Oxoid (50 ml por 1 L ágar) 2 suplemento SR108B seletivo anaeróbico de Oxoid G-N fii) Efeitos de administração de Lactobacillus fermentum VRI 003 sozinho ou em combinação com um prebiótico - resultados de resumo Tabela 2: Efeitos de cepa de Lactobacillus fermentum VRI 003 sobre a severidade de sintomas de IBS quando administrado sozinho ou juntamente com um prebiótico (amido de milho de alto teor de amilose) (amido resistente = RS). Resultados expressos como que corresponde a nenhum sintoma "+" até"+++" onde os sintomas mais severos são apresentados como ”+++".

Sintomas Linha de base Placebo VRI 003+RS VRI 003 sozinho diarréia +++ +++ + + inchamento +++ ++ + ++ Administração de VRI 003 era eficaz mesmo quando administrado sozinho. No entanto, a combinação de VRI 003 com amido de milho de alto teor de amilase elevou os níveis de bactérias de VRI 003 e níveis diminuídos de certas bactérias tais como Salmonella e Clostrídium quando em comparação com o probiótico sozinho ou beta-glucano sozinho.

Exemplo 5: Mudanças nos perfis microbianos fecais usando-se material oriundo de indivíduos com IBS durante a experiência Resultados foram obtidos para mudanças nos aeróbicos totais, bactérias entéricas, anaeróbicos totais, anaeróbicos Gram-negativo, lactoba-cilos, clostridia e bifidobactérias durante a experiência. Pontos de tempo exibidos sobre o gráfico são representativos do perfil microbiano fecal no início da experiência (linha de base), fim de tratamento com placebo, fim de período de suspensão de tratamento e fim de tratamento simbiótico. Com referência aos resultados, indivíduos foram separados nos subgrupos, diarréia, constipação e diarréia alternante e constipação predominante, de acordo com os sintomas que eles normalmente experimentam com a condição. Este subagrupamento permite que indivíduos sejam apropriadamente avaliados devido à ampla variabilidade em sintomas experimentados por aqueles com a condição (Akehurst e Kaltenthaler, 2001). Um indivíduo, no entanto, não se ajustava em qualquer dos três subgrupos e foi colocado em um grupo separado para flatulência, inchamento, dor abdominal com espasmo predominante.

Indivíduos com diarréia predominante Mudanças do perfil microbianao fecal de indivíduos com diarréia predominante são mostradas na figura 10 (indivíduo 4), figura 11 (indivíduo 5) e figura 12 (indivíduo 9). O indivíduo 4 (figura 10): aeróbicos totais permaneceram a um nível constante de 1 x 105 log cfu.ml'1, exceto durante o período de suspensão de tratamento, em que aeróbicos totais aumentaram por 1,0 log. Números de bactérias entéricas que foram inicialmente detectadas a 1 x 105 log cfu.ml'1 foram diminuídos por 1,5 log no fim do período de tratamento simbi-ótico, embora bactérias entéricas comecem a exibir um aumento de disparidade em comparação com números de aeróbicos totais no fim do período de suspensão de tratamento. Tanto anaeróbicos totais quanto anaeróbicos Gram-negativos, que começam a 5 x 108 log cfu.ml-1, exibiam um aumento de 1,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Lactobacilos foram inicialmente detectados a 1 x 107 log cfu.ml'1 e exibiam uma diminuição de 2,0 log no fim dos períodos de tratamento com placebo e simbióticos, que atingiu pico novamente em entre, durante o período de suspensão de tratamento. Clostridia permaneceu indetectável através de toda a experiência, enquanto números de bifidobactérias, que começam a 5 x 107 cfu.ml'1, aumentaram por 1,0 log durante o período de tratamento simbiótico. O indivíduo 5 (figura 11): aeróbicos totais, que foram inicialmente detectados a 5 x 105 log cfu.ml'1, aumentaram por 1,0 log durante os períodos de tratamento com suspensão de tratamento e simbióticos. Bactérias entéricas permaneceram a níveis similares àqueles dos aeróbicos totais (5 x 105 log cfu.ml'1) durante todos os pontos de tempo, exceto no fim do período de tratamento com placebo, em que números de bactérias entéricas diminuídos por 2,0 log. Números de anaeróbicos totais e anaeróbicos Gram-negativos continuam através de toda a experiência a um nível constante de 1 x 109 log cfu.ml'1, embora diminuídos por 1 a 1,5 log no fim do período de tratamento com placebo. Lactobacilos, que começam a 1 x 106 log cfu.ml'1, diminuídos por 1,0 log no fim do período de tratamento com placebo mas aumentou por 3,0 log no fim do período de suspensão de tratamento, apenas para diminuir novamente por 1,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Clostridia foi detectada no início da experiência a 1 x 103 log cfu.ml'1 e permaneceu indetectável através do resto da experiência. Bifido-bactérias, que começam a 5 x 108 log cfu.ml'1 diminuídas por 1,0 log no fim dos períodos de tratamento com placebo e simbiótico, mas diminuído por 1,0 log em entre durante o período de suspensão de tratamento. O indivíduo 9 (figura 12): aeróbicos totais e bactérias entéricas foram detectados a 1 x 107 log cfu.rnr1 na linha de base e foram processados para diminuir lentamente por 1,5 log no fim do período de tratamento simbiótico. Anearóbicos totais e anaeróbicos Gram-negativos foram detectados a 5 x 108 log cfu.rnr1 na linha de base, foram diminuídos por 1,0 log no fim do período de tratamento com placebo e permaneceram em um nível constante pelo resto do estudo. Lactobacilos foram detectados a 5 x 105 log cfu.ml"1 na linha de base, no entanto se tornaram indetectáveis durante o período de tratamento com placebo. Lactobacilos foram detectados novamente a 5 x 103 log cfu.ml'1 no fim do período de tratamento com suspensão de tratamento e diminuídos por 1,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Clostridia estava ausente para a duração da experiência. Bifidobac-térias começam a 5 x 107 log cfu.ml'1, diminuídas por 1,5 log no fim do período de tratamento com placebo, no entanto, aumentaram novamente para 5 x 108 log cfu.ml'1 no fim do período de tratamento com suspensão de tratamento e permaneceram neste nível até o fim do período de tratamento simbiótico.

Indivíduos com consticão predominante Mudanças no perfil microbiano fecal de indivíduos com constipação predominante são mostradas na figura 13 (indivíduo 2) e figura 14 (indivíduo 3). O indivíduo 2 (figura 13): Aeróbicos totais e bactérias entéricas foram inicialmente detectados a 1 x 107 log cfu.ml'1 e permaneceram a níveis similares através de toda a experiência, exceto no fim do período de tratamento com placebo, onde números de bactérias entéricas diminuídos por 1,0 log. Números de anaeróbicos totais e anaeróbicos Gram-negativos permaneceram a níveis similares 1 x 108 log cfu.ml"1 através de toda a experiência, com um aumento de 1,0 log no fim do período de tratamento com placebo, que diminuiram por 0,5 log no fim do período de tratamento simbiótico. Lactobacilos, que começam a 1 x 103 log cfu.ml"1, aumentados por 1,0 log no fim do período de tratamento com placebo, mas se tornaram indectáveis no fim do período de tratamento com suspensão de tratamento e diminuídos novamente por 3,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Clostridia estava presente apenas no início da experiência a 1 x 103 log cfu.ml'1 e permaneceram indetectáveis através do resto da experiência. Bifidobactérias foram inicialmente detectadas a 1 x 107 log cfu.ml'1 e diminuídas por 1,5 log no fim do período de tratamento com placebo, e então se tornaram indetectáveis durante o resto da experiência.

Indivíduo 3 (figura 14): Aeróbicos totais e bactérias entéricas permaneceram a níveis similares de 5 x 104 log cfu.ml'1 pela duração da experiência e aumentados por 2,0 log no fim do período de tratamento com placebo, embora diminuíssem por 1,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Anaeróbicos totais e anaeróbicos Gram-negativos começam a 1 x 107 log cfu.ml'1 e continuam um aumento regular de 2,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Lactobacilos foram detectados no início da experiência a 1 x 104 log cfu.ml'1, mas então se tornaram indectáveis no fim do período de tratamento com placebo. No entanto, lactobacilos demonstraram aumentar por 4,5 log no fim do período de tratamento com suspensão de tratamento e diminuídos novamente por 0,5 log no fim do período de tratamento simbiótico. Clostridia era apenas detectada no fim do período de tratamento com placebo a 1 x 104 log cfu.ml'1 e permaneceram indectáveis pelo resto da experiência. Bifidobactérias, que começam a 1 x 107 log cfu.ml'1 não são capazes de ser detectadas no fim do período de tratamento com placebo, embora se tomassem detectáveis novamente no fim do período de suspensão de tratamento e aumentadas por 4,5 log no fim do período de tratamento simbióstico.

Indivíduo alternando diarréia e constipação predominante Mudanças no perfil microbiano fecal de um indivíduo alternando diarréia e constipação predominante é mostrado na figura 15 (indivíduo 7). O indivíduo 7 (figura 15): Aeróbicas totais e bactérias entéricas que foram inicialmente detectadas a 5 x 105 log cfu.ml'1, aumentadas por 2,0 log no fim do período de suspensão de tratamento, no entanto diminuídas por 1,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. Anaeróbicos totais e anaeróbicos gram-negativos começaram a 5 x 108 log cfu.mr1 e permaneceram a um nível constante através de todo o estudo, até que o período de tratamento simbiótico, onde anaeróbicos totais diminuídos por 1,0 log enquanto anaeróbicos Gram-negativos diminuídos por 2,0 log. Lactobacilos não eram detectados pela maior parte do estudo, exceto no fim do período de tratamento simbiótico, a 5 x 103 log cfu.mr1. Em contraste com isso, clos-tridia foi apenas detectada no início da experiência a 1 x 103 log cfu.mr1. Bi-fidobactérias foram inicialmente detectadas a 5 x 106 log cfu.ml"1, no entanto se tornaram indetectável durante o período de tratamento com placebo, apenas para ser detectada novamente durante o período de suspensão de tratamento a 5 x 107 log cfu.ml'1 e diminuída por 0,5 log no fim do período de tratamento simbiótico.

Outro: Indivíduo com flatulência, inchamento e dor abdominal com espasmo predominante Mudanças no perfil fecal de um indivíduo com flatulência, inchamento e dor abdominal com espasmo predominante são mostradas na figura 16 (indivíduo 6).

Indivíduo 6 (figura 16): Aeróbicos totais e aeróbicos entéricos foram inicialmente detectados a 5 x 105 log cfu.ml'1 e permaneceram nesse nível até que o período de tratamento simbiótico, que viu aumento de 2,0 log em aeróbicos totais e bactérias entéricas. Anaeróbicos totais e anaeróbicos Gram-negativos foram detectados a 1 x 108 log cfu.ml'1 na linha de base e aumentados por 1,0 log no fim do período de tratamento com placebo, depois do que eles permaneceram neste nível pelo resto do estudo. Lactoba-ciíos permaneceram a um nível relativamente estável de 1 x 104 log cfu.ml'1 pela duração do estudo. Clostridia não era detectada durante o estudo, exceto no fim do período de tratamento simbiótico a 5 x 103 log cfu.ml'1. Bifido-bactérias começaram a 5 x 107 log cfu.ml'1 e diminuídas por 3,0 log no fim do período de tratamento com placebo, apenas para aumentar novamente a 1 x 107 log cfu.ml"1 durante o período de suspensão de tratamento e finalmente diminuídas por 3,0 log no fim do período de tratamento simbiótico.

Exemplo 6: Mudanças na severidade de sintomas de indivíduos com IBS durante a experiência Resultados foram obtidos para as mudanças na severidade de sintomas incluindo diarréia, constipação, diarréia alternante e constipação, flatulência, inchamento e dor abdominal com espasmo. Cada sintoma é graduado sobre uma escala de 0 a 10, com 0 indicando ausência do sintoma e 10 indicando severidade extrema do sintoma. Resultados são exibidos sobre uma escala de 1 a 5, com 1 indicando severidade moderada do sintoma e 5 severidade extrema do sintoma. Mudanças na severidade dos sintomas foram monitoradas a cada semana em todos os indivíduos, no entanto, os resultados exibiram apenas pontos de tempo que representam o período de tratamento de linha de base (início da experiência) com placebo, período de suspensão de tratamento, e período de tratamento simbiótico. Indivíduos foram novamente separados em subgrupos, diarréia predominante, constipação predominante e alternando diarréia e constipação de acordo com os sintomas que eles normalmente experimentam com a condição.

Indivíduos com diarréia predominate Mudanças na severidade dos sintomas para indivíduos com diarréia predominante são mostradas na tabela 3 (indivíduo 4) tabela 4 (indivíduo 5) e tabela 5 (indivíduo 9).

Indivíduo 4 (tabela 3): A severidade de diarréia na linha de base foi extremamente alta, no entanto, esta foi reduzida à metade da severidade no fim do período de tratamento com placebo, que ulteriormente diminuiu para baixa severidade no fim do período de tratamento simbiótico. Flatulência e inchamento eram a média severidade (3) na linha de base e finalmente reduziu a baixa severidade (1) no fim do período de tratamento simbiótico. Dor abdominal com espasmo era também baixa (2) no início da linha de base e ulteriormente reduziu em severidade até 1 no fim do período de tratamento simbiótico.

Tabela 3 Mudanças na severidade de sintomas do indivíduo N° 4 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade) Indivíduos 5 (tabela 4): A severidade de diarréia na linha de base foi extremamente alta e apenas diminui levemente para 4 no período de tratamento de placebo, depois do que ela permaneceu em alta severidade. Flatulência era baixa na linha de base, ausente durante o período de tratamento com placebo, mas aumentou novamente durante os períodos de tratamento, suspensão de tratamento e simbiótico por 1 e 2 respectivamente. A severidade de dor abdominal com espasmo permaneceu no mesmo nível de 3 através de toda a experiência, embora diminuísse um pouco por 1 durante o período de suspensão de tratamento. Sintomas de flatulência e incha-mento permaneceram ausentes através de toda a duração da experiência. Tabela 4 Mudanças na severidade de sintomas do indivíduo N° 5 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade) Indivíduo 9 (tabela 5): diarréia começa a faixa média (3) na linha de base e continuou nesta severidade até o período de tratamento simbióti-co, onde ela tinha reduzido por 2 até baixa severidade. Constipação estava ausente durante a experiência, apesar do período de tratamento com place-bo, em que ela tinha aumentado por 1. Flatulência estava também ausente durante a experiência, no entanto, aumentou por 3 durante o período de suspensão de tratamento. Inchamento que estava em severidade média (3) na linha de base, reduziu por 1 durante o período de tratamento com place-bo. No entanto, esta aumentou por 1 durante o período de suspensão de tratamento e então caiu até baixa severidade (1) durante o período de tratamento probiótico. Dor abdominal com espasmo estava ausente através de toda a duração da experiência.

Tabela 5 Mudanças na severidade de sintomas do indivíduo N° 9 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade).

Indivíduos com constipação predominante Mudanças na severidade de sintomas para indivíduos com constipação predominante são mostradas na tabela 6 (indivíduo 2) e tabela 7 (indivíduo 3). O indivíduo 2 (tabela 6): Diarréia, que estava ausente na linha de base e pela maior parte da experiência, aumentou por 1 durante o período de tratamento simbiótico. Constipação, flatulência e inchamento permaneceram em alta severidade (5) na linha de base e durante os períodos suspensão de tratamento e com placebo, embora diminuíssem por 1 durante um período de tratamento simbiótico. Dor abdominal com espasmo estava a alta severidade (4) na linha de base e durante o período de tratamento com pla-cebo, no entanto reduziram por 3 até baixa severidade durante o período de tratamento simbiótico e suspensão de tratamento.

Tabela 6 Mudanças na severidades de sintomas do indivíduo N° 2 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade). O indivíduo 3 (tabela 7): Constipação começa em baixa severidade (2) na linha de base e continuou neste nível durante o período de tratamento com placebo, no entanto se tornou ausente durante os períodos de tratamento simbiótico e suspensão de tratamento. Flatulência começou em severidade muito alta (5) na linha de base, reduziu até 3 durante o período de tratamento com placebo e ulteriormente reduziu até baixa severidade (2) durante os períodos de tratamento simbiótico e suspensão de tratamento. Inchamento também começou em severidade muito alta na linha de base e foi também capaz de reduzir em severidade durante os períodos de tratamento com placebo, suspensão de tratamento e simbiótico a 4, 3 e 3 respectivamente. Dor abdorminal com espasmo começou em alta severidade (4) na linha de base e reduziu a baixa severidade (1) durante o período de tratamento com placebo, depois do que ela se tomou ausente pelo restante da experiência. Diarréia estava ausente pela duração da experiência.

Tabela 7 Mudanças na severidades de sintomas do indivíduo N° 3 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade).

Indivíduo alternando diarréia e constipação predominante Mudanças na severidade de sintomas para um indivíduo alternando diarréia e constipação predominante são mostradas na tabela 8 (indivíduo 7). O indivíduo 7 (tabela 8): Diarréia iniciou em baixa severidade (1) na linha de base mas aumentou para 2 durante os períodos de tratamento simbiótico e suspensão de tratamento. Constipação, que era em baixa severidade (2) na linha de base, diminuiu por 1 durante os períodos de suspensão de tratamento e com placebo, mas aumentou para 3 durante o período de tratamento simbiótico. Flatulência começou em baixa severidade (1) na linha de base e permaneceu baixa pela maior parte da experiência, no entanto ela aumentou para 3 durante o período de tratamento simbiótico. In-chamento começou em baixa severidade (2) e diminuiu para 1 durante o período de tratamento com placebo, no entanto continuou a aumentar durante os períodos de tratamento, suspensão de tratamento e simbiótico para 3 e 4 respectivamente. Dor abdominal com espasmo estava ausente durante a experiência, exceto durante o período de tratamento simbiótico, quando ela tinha aumentado para severidade média (3).

Tabela 8 Mudanças na severidades de sintomas do indivíduo N° 7 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade).

Outro: Indivíduo com flatulência, inchamento e dor abdorminal com espasmo predominante Mudanças na severidade de sintomas para um indivíduo com flatulência, inchamento e dor abdominal com espasmo predominante são mostradas na tabela 9 (indivíduo 6) Indivíduo 6 (tabela 9): Diarréia estava ausente pela maior parte da experiência, exceto durante o período de tratamento simbiótico, em que ela tinha aumentado por 1 para baixa severidade. Flatulência começou em severidade média (3) à linha de base e reduzida para baixa severidade (1) durante os períodos com placebo e suspensão de tratamento, no entanto aumentou até severidade média (3) uma vez novamente durante o período de tratamento simbiótico. Inchamento também começou em severidade média (3) na linha de base e tornou-se ausente durante o período de tratamento com placebo, no entanto ela tinha também aumentado novamente durante os períodos de tratamento, suspensão de tratamento e simbiótico para 1 e 3 respectivamente. Dor abdominal com espasmo em baixa severidade (2) na linha de base, estava ausente durante o período de tratamento com placebo mas aumentou por 1 e 3 durante os períodos de tratamento, suspensão de tratamento e simbiótico respectivamente. Constipação permaneceu ausente pela duração da experiência.

Tabela 9 Mudanças na severidade de sintomas do indivíduo Nd 6 durante uma experiência de 8 semanas. Severidade de sintomas foi monitorada durante os períodos de tratamento simbiótico. suspensão de tratamento, com placebo e linha de base. Resultados expressos como + (baixa severidade) a +++++ (extrema severidade).

Discussão Correlações entre mudanças nos perfis microbianos fecais usando-se material oriundo de indivíduos com IBS e severidade de sintomas durante a experiência A experiência clínica durou por uma duração total de 8 semanas, as primeiras 3 semanas envolviam um tratamento com placebo que consiste em cápsulas de maltodextrina e celulose. Esta foi seguida por um período de suspensão de tratamento por 2 semanas em que nenhum tratamento foi tomado. As últimas 3 semanas envolveu um tratamento simbiótico que consiste em cápsulas de VRI 003 e RS. Amostras fecasis foram coletadas no início da experiência para estabelecer uma linha de base, depois do que outras amostras foram tiradas antes e depois de cada período de tratamento. Além disso, questionários semanais foram também completados por cada paciente para monitorar mudanças em sua severidade de sintomas através de um sistema de classificação graduada de 0 a 10, com 0 sendo a ausência do sintoma e 10 sendo o mais severo. Resultados foram então vertidos em uma escala de 1 a 5 para conveniência e mostraram para os períodos de tratamento de linha de base, placebo, suspensão de tratamento e simbiótico.

Pacientes foram agrupados em 3 subgrupos de acordo com sua predominância nos sintomas, como mostrado por Akehurst e outros and Weston e outros (Akehurst and Kaltenthaler, 2001; Weston e outros, 1993).

Separação de pacientes em ou subgrupos de diarréia, constipação ou alternando diarréia e constipação predominante permite mudanças em sintomas particulares a serem analisadas correspondentemente, devido à ampla variabilidade entre diferentes pacientes nos sintomas que eles normalmente experimentam com a condição. Um indivíduo em particular (N°6) exibia sintomas diferentes daqueles experimentados por qualquer um dos outros pacientes nos 3 subgrupos, e era desse modo agrupado em um outro grupo para sintomas de flatulência, inchamento e dor abdominal com espasmo predominante.

Indivíduos com diarréia predominante O indivíduo 4 exibiu uma diminuição geral na severidade de todos os sintomas (tabela 3) no fim do período de tratamento simbiótico, em particular diarréia, que começou com alta severidade na linha de base e então prosseguiu até baixa severidade no fim do período de tratamento simbiótico. Uma correlação possível com este sintoma pode ser vista na diminuição lenta de bactérias entéricas (figura 10) de 1 x 105 log cfu.ml'1 na linha de base, até 5 x 103 log cfu.ml'1 no fim do período de tratamento simbiótico. Números de lactobacilos não parecem se correlacionar com qualquer um dos sintomas exibidos pelo indivíduo 4, no entanto bifidobactérias foram observadas aumentar por 1,0 log durante o período de tratamento simbiótico, que se correlaciona com a discussão anterior que bifidobactérias são capazes de utilizar RS. No entanto, é improvável que o aumento em bifidobactérias resultasse no aumento de diarréia, uma vez que redução na severidade deste sintoma começa durante o período com placebo, assim pode ser que neste indivíduo, bactérias entéricas podem ter tido mais de um efeito sobre a severidade da diarréia. O Indivíduo 5 não pareceu exibir uma redução global na severidade de quaisquer sintomas (tabela 4) durante a experiência. No entanto, pode ser observado que durante o período de tratamento com placebo, ausência de flatulência foi observada, que pode estar relacionada com uma diminuição de 2,0 log nos números de bactérias entéricas (figura 11). A visão geral deste indivíduo indicaria que o tratamento simbiótico não pareceu pro- mover quaisquer efeitos benéficos sobre o indivíduo, mas, sim, o tratamento com placebo pode ter tido algum efeito benéfico sobre a severidade de sintomas. Números de lactobacilos aumentaram por 3,0 log durante o período de suspensão de tratamento, embora diminuísse 1,0 log no fim do período de tratamento simbiótico. O grande aumento em lactobacilos durante o período de suspensão de tratamento pode também se relacionar com a diminuição em dor abdominal com espasmo exibida no indivíduo durante este tempo, que então aumentou a severidade no fim do período de tratamento simbiótico, juntamente com uma diminuição menor em lactobacilos durante este período. A observação de um aumento em lactobacilos associada a uma diminuição de dor abdominal com espasmo pode também se relacionar com a constatação de Nobaek e outros, que observaram que administração de Lactobacillus plantarum diminuiu dor e flatulência em pacientes com IBS (Nobaek e outros, 2000). Um aumento de 1,0 log em bifidobactérias foi também observado durante o período de suspensão de tratamento, que também se correlaciona com um aumento em lactobacilos, uma vez que se assume a hipótese de que bifidobactérias indiretamente promovem o crescimento de lactobacilos. Embora os sintomas não parecessem melhorar durante o período de tratamento simbiótico neste indivíduo, comentários nos questionários semanais indicam que os sintomas permaneceram os mesmos durante o tratamento, ao invés de aumentar em severidade. O indivíduo 9 exibiu um melhoramento global na severidade de todos os sintomas (tabela 5) no fim da experiência, particularmente diarréia e inchamento, que tinham reduzido de severidade média até baixa severidade no fim do período de tratamento simbiótico. A diminuição destes sintomas pode estar relacionada com uma diminuição de 2,0 log em bactérias entéri-cas a partir da linha de base no fim do período de tratamento simbiótico. Bifidobactérias foram também observadas aumentar por 3,0 log depois do período de tratamento com placebo. No entanto, este aumento começou durante o período de suspensão de tratamento, quando sintomas ainda permaneceram em severidade média, assim números de bifidobactérias podem não ter tido um efeito sobre a diminuição de sintomas durante o período de tratamento simbiótico. Números de lactobacilos foram também observados aumentar (1,0 log) no fim do período de tratamento simbiótico, que pode estar correlacionado com a diminuição em severidade de sintomas. O aumento em bifidobactérias e lactobacilos podem também estar associados com a administração de RS, que demonstrou promover o crescimento de bifidobactérias e desse modo lactobacilos (Brown e outros, 2000).

Indivíduos com constipação predominante O indivíduo 2 não pareceu exibir um melhoramente na maioria dos sintomas (tabela 6), apesar da dor abdominal com espasmo, que grandemente aumentou em severidade durante os períodos de tratamento com suspensão de tratamento e simbiótico. Resultados do perfil microbiano fecal (figura 13) mostram que durante o período de tratamento simbiótico, bifidobactérias eram incapazes de serem detectadas e uma diminuição (1,0 log) em aeróbicos totais e bactérias entéricas foi observadas durante este tempo. Isto indicaria que a diminuição em bactérias entéricas pode reduzir sintomas de dor abdominal com espasmo, no entanto pode ser apenas especulado que a ausência de bifidobactérias pode estar relacionada também com uma diminuição no sintoma, uma vez que bifidobactérias são percebidas serem benéficas no intestino humano. O perfil microbiano fecal do indivíduo 2 mostrou que lactobacilos não foi promovido para números mais altos durante o período de tratamento simbiótico. Isto pode ser devido a baixos números de partida dos lactobacilos no intestino do indivíduo, que pode exigir um período de tempo mais longo para estimular para números superiores. Embora o indivíduo não mostrasse um melhoramento global em sintomas, os questionários semanais indicam que sintomas que foram experimentados durante a experiência permaneceram constante e não aumentaram em severidade. O indivíduo 3 exibiu um melhoramento geral global na severidade de sintomas (tabela 7), particularmente constipação e dor abdominal com espasmo, que cedeu no fim dos períodos de tratamento com suspensão de tratamento e simbiótico. O melhoramento nestes sintomas podem estar relacionados com o grande aumento (4,0 log) no número de bifidobactérias (figura 5) no fim do período de tratamento simbiótico. O aumento em bifidobacté- rias indica que a administração de RS durante o período de tratamento sim-biótico estimulou o crescimento de bifidobactérias. Administração de fibra de dieta (por exemplo, RS) também demonstrou reduzir sintomas de constipação através de volume fecal (Lambert e outros, 1991; Phillips e outros, 1995). Embora números de lactobacilos permanecessem baixo em comparação com as bifidobactérias durante a experiência, é possível que se a experiência se prolongasse por um período de tempo mais longo, lactobacilos pudessem aumentar em números em uma extensão maior. Bactérias entéri-cas também diminuiram (1,0 log) no fim do período de tratamento simbiótico e embora apenas uma diminuição secundária, possa ter contribuído para a diminuição na severidades dos sintomas.

Indivíduo com diarréia alternante e constipação predominante O indivíduo 7 exibe melhoramento de todos os sintomas (tabela 6) durante o período de tratamento com placebo, enquanto exibindo um auemnto na severidade de sintomas durante o período de tratamento simbiótico. Um aumento gradual nos números de bactérias entéricas (figura 15) foi observado durante a experiência, que sugere que um aumento em bactérias entéricas pode estar relacionado com um aumento nos sintomas tais como inchamento e diarréia. Uma observação importante a ser considerada, no entanto, é que administração de prebióticos, tal como RS, são prováveis de aumentar sintomas de inchamento e flatulência, mesmo em indivíduos saudáveis (Cummings e outros, 2001; Munster e outros, 1994), assim um aumento nestes sintomas experimentado por um indivíduo com IBS não é improvável. Bifidobactérias foram também observadas aumentar em números durante o período de suspensão de tratamento, embora não sendo capaz de ser detectada durante o período de tratamento com placebo, implicando que um aumento em bifidobactérias possa talvez estar relacionado com um aumento em severidade destes sintomas. Bifidobactérias foram também observadas serem detectadas em números muito altos sobre meios de RB e foi observado que outras espécies de bactérias embora bifidobactérias possam ser detectadas sobre estas placas, tais como espécie de lactobacilos (Hartemink e outros, 1996). Assim testes bioquímicos podem ter de ser realizados sobre colônias que se desenvolvem sobre meios de RB para confirmar que elas eram todas da espécie de bifidobactérias.

Embora sintomas aparecessem aumentar em severidade durante o período de tratamento simbiótico, comentários dos questionários semanais indicam que a experiência destes sintomas eram normais em relação à linha de base.

Outro: Indivíduo com flatulência. inchamento e dor abdominal com espasmo predominante Mudanças na severidade dos sintomas observadas para o indivíduo 6 (tabela 9), mostram que este indivíduo experimentou uma diminuição na severidade de sintomas durante o período de tratamento com placebo, enquanto o período de tratamento simbiótico pareceu ter um efeito adverso sobre os sintomas. Números de bifidobactérias, e em uma extensão menor, lactobacilos foram observados diminuir (figura 16) durante o período de tratamento com placebo. Bifidobactérias diminuíram em números por 3,0 log durante o período de tratamento com placebo, correspondendo com a diminuição em flatulência e ausência de inchamento e dor abdominal com espasmo. Pode ser apenas sugerido, no entanto, que bifidobactérias podem estar relacionadas com um aumento nestes sintomas como elas são vistas serem bactérias benéficas. Deve também ser levado em conta que admi-nistrção de prebióticos, particularmente RS, demonstrou aumentar sintomas de flatulência e inchamento (Cummings e outros, 2001; Munster e outros, 1994), que eram sintomas exibidos pelo indivíduo 6 durante a administração de RS durante o período de tratamento simbiótico. Um melhoramento geral na severidade de sintomas durante o período de tratamento com placebo pode também ser atribuído ao efeito de volume possível causado por celulose e desse modo facilidade de defecação. Questionários semanais indicam que o indivíduo consumiu uma pequena quantidade de álcool durante o período de suspensão de tratamento, que pode ter agravado um aumento em sintomas. Além do mais, não foi observado que este indivíduo experimentou stress durante o período de tratamento simbiótico, que pode ter também aumentado a severidade de sintomas, como observado por outros (Lidbeck and Nord, 1994; Longstreth and Wolde-Tsadik, 1993).

Resultados de experiência dos perfis microbianos fecais indicam uma diminuição geral no número de bactérias entéricas correlacionadas com uma diminuição na severidade dos sintomas. Um aumento no número de lactobacilos estava também associado a um melhoramento em alguns sintomas, tal como uma redução na flatulência (indivíduo N° 5). No entanto, lactobacilos não parecem exercer um efeito muito predominante em termos de um melhoramento nos sintomas. Em comparação, aumentos em bifido-bactérias podem parecer ter alguma correlação com severidade de sintoma, embora possa ser misto. Um aumento em bifidobactérias pode ser observado estar relacionado com uma diminuição em constipação e dor abdominal com espasmo (indivíduo N° 3), no entanto aumentos em bifidobactérias podem também estar associados com um aumento em flatulência e dor abdominal com espasmo (indivíduo N° 7). Talvez espécies diferentes de bifidobactérias possam estar envolvidas em aumentos ou diminuições em severidade de sintoma, ou possam ser que pacientes diferentes sejam afetados por colonização de diferentes microorganismos no intestino que afetem os níveis de bifidobactérias no trato gastrointestinal. A experiência provou resultados preliminares que demonstram mudanças favoráveis nos perfis microbianos fecais e severidade de sintomas de pacientes com IBS enquanto sendo administrada uma formulação simbiótica contendo VRI 003 e RS ou VRI 003 sozinho.

Exemplo 7: Tratamento de eczema Uma paciente feminina de 21 anos apresentada com eczema severo medicalmente diagnosticado manifestado por uma erupção difundida sobre todo o corpo e capilares dilatados nas bochechas. A pele é muito seca e esticada devido à secura. O tratamento na apresentação incluía cremes com cortisona e umidificadores diários.

Tratamento com Lactobacillus fermentum VRI-003 começado com 3 cápsulas pela manhã com alimento e 3 cápsulas à noite com alimento diariamente - cada cápsula contendo 4,2 x 1010 cfu. Umidificador e cremes com cortisona foram aplicados como usual. Após 2 semanas de administra- ção oral de Lactobacillus fermentum, a severidade do eczema foi reduzida por 2 unidades usando-se uma escala análoga visual (VAS; escala 1-10 com 1 = baixo e 10 = severa), vermelhidão da pele foi reduzida, alergia foi reduzida por 2 unidades usando-se VAS, textura da pele levemente melhorou. Coceira também foi reduzida e houve menos escamamento observado. Além de tudo, houve um melhoramento na qualidade de vida da paciente. Exemplo 8: Paciente com eczema com distúrbios intestinais Um paciente masculino de 33 anos apresentou com eczema medicalmente diagnosticado na forma de feridas abertas e pele seca e pruridos, inflamadas. Tratamento anterior incluía pomadas com esteróides. Depois de uma apendicectomina, o indivíduo também experimentou problemas de intestino.

Tratamento com Lactobacillus fermentum VRI 003 começou com 3 cápsulas pela manhã com alimento e 3 cápsulas à noite com alimento em uma base diária. Cada cápsula contém, 4,2 x 1010 cfu. Depois de duas semanas de tomar Lactobacillus fermentum VRI 003, o indivíduo relatou redução de coceira associada a seu eczema. Ele igualmente experimentou um melhoramento em sua saúde gastrointestinal, isto é, visitas ao banheiro foram consideravelmente reduzidas.

Exemplo 9: Doença de Crohn com fadiga crônica e pobre absorcão/disponi-bilidade de minerais e vitaminas Uma paciente feminina de 35-40 anos com doença de Crohn por mais do que 10 anos consumiu 3 cápsulas a cada manhã e à noite com alimento (cada cápsula continha 4 x 1010 cfu de Lactobacillus fermentum VRI 003) e depois de uma semana sintomas de diarréia, espasmos, dor abdominal, fadiga constante e retenção de fluido diminuíram dramaticamente. As fezes adquiriram formas. Níveis de ferro e vitamina B12 estavam excelentes, assim confirmando que a presença de Lactobacillus fermentum 003 no intestino melhorou absorção e/ou biodisponibilidade de ferro e vitamina B12. Exemplo 10: Efeitos de probiótico Lactobacillus fermentum VRI-003 em pacientes com síndrome de intestino irritável (IBS) Uma experiência aleatorizada, multicentrada, reticulada foi con- duzida em pacientes com IBS para ver os efeitos de probiótico Lactobacillus fermentum VRI 003 na redução de severidade de distúrbios gastrointestinais vistos em IBS. O estudo foi realizado por um total de 18 semanas (2 semanas depois da conclusão do estudo) em que indivíduos receberam um tratamento ativo e com placebo. Detalhes da escala de tratamento probiótico é como se segue: Este estudo direcionou indivíduos que pertencem ao grupo de 17-74 anos de idade que satisfaziam os Critérios de IBS Rome que foi verificado por um consultor médico. O estudo, no entanto, excluía pacientes que experimentam infecções gastrointestinais e qualquer outro tipo de doenças orgânicas (isto é, doença de fígado, etc). Voluntários eram também fortemente aconselhados a não tomar qualquer outra espécie de probióticos, embora participando no estudo.

História do paciente: Uma paciente feminina, branca, de 54 anos de idade que tinha IBS desde sua adolescência. Sintomas de IBS ativa incluem diarréia e in-chamento especialmente pela manhã. Sintomas do indivíduo 1 se agravam quando ela come alimento de alto teor de açúcar tais como tortas, produtos de pastelaria e chocolate.

Tratamento: 1 Cápsula de Lactobacillus fermentum VRI 003 foi tomada pela manhã e à noite com alimento. Cada cápsula continha 3x1010 VRI-003/cápsula.

Avaliação de sintomas: Tomar 1 cápsula de Lactobacillus fermentum VRI-003 pela manhã e à noite resultou em regular o movimento intestinal. Fezes se tornaram firmes e consistentes e houve redução na intensidade de inchamento. No entanto, Lactobacillus fermentum VRI-003 não minimizou a severidade dos sintomas quando alimentos ricos em açúcar eram comidos na dieta nem piorou os sintomas.

Exemplo 11. Benefícios de Lactobacillus fermentum VRI 003 para sintomas de Rosacea Um paciente masculino de 44-55 anos de idade com IBS ativa e Rosacea sobre a face tinha sido tratado por anos por seu dermatologista para a vermelhidão e lesões que são manifestações da condição Rosacea. Enquanto sendo tratado para a IBS com Lactobacillus fermentum VRI 003 (log 10-11 cfu por dia em uma cápsula de gelatina) o paciente experimentou uma extrema redução na vermelhidão e lesões sobre sua face devido à Rosacea e foi capaz de parar o uso de todos os cremes com antibiótico e cremes com esteróide. Sua condição de fase foi mantida em remissões enquanto tomando o Lactobacillus fermentum 003.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a estes exemplos específicos, será apreciado por aqueles versados na técnica que a invenção pode ser concretizada em muitas outras formas.

Claims (20)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma variante de Lactobacillus fermentum ou um componente de uma variante de Lactobacillus fermentum e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a dita variante é VRI 003 (N°. de acesso NM02/31074).

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende um prebiótico, um componente de dieta não-digerível, fibra de dieta ou um composto farmaceuticamente ativo.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o prebiótico é inulina, um amido resistente, um oligossaca-rídeo, uma goma ou um beta-glucano.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito prebiótico é beta-glucano ou amido com alto teor de amilose não-modifiçado.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende células vivas da variante de Lactobacillus fermentum.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a dita composição compreende células mortas da variante de Lactobacillus fermentum.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que está na forma de um comprimido, cápsula, pó, pasta, gel, formulação líquida, suplemento de dieta ou produto alimentício.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição está na forma de um comprimido.

9. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição está na forma de um produto alimentício.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o dito produto alimentício é um produto alimentício de laticínio ou produto alimentício à base de laticínio.

11. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição está na forma de uma formulação líquida.

12. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição está na forma de um suplemento de dieta.

13. Uso de uma variante de Lactobacillus fermentum, um componente de uma variante de Lactobacillus fermentum ou uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio gastrointestinal selecionado dentre síndrome do intestino irritável, doença de intestino inflamatório, diarréia, inchamento, flatulência, espasmo abdominal, dor abdominal, constipação ou doença de Crohn, em que a dita variante é VRI 003 (N°. de ace sso NM02/31074).

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito medicamento é formulado para ser administrado oralmente.

15. Uso de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio gastrointestinal é causado por um patógeno.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio gastrointestinal é causado por uma bactéria, vírus ou protozoário.

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a dita bactéria é Salmonella, Escherichia coli, Helicobacter, Vibrio ou Pseudomonas.

18. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito vírus é Norwalks ou rotavírus.

19. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito protozoário é Cryptosporidium, Entamoeba, Giardia ou Dientamoeba.

20. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio de uma superfície de mucosa é eczema, dermati-te atópica ou rosacea.