BRPI0408635B1

BRPI0408635B1 - Método de preparação de uma emulsão de óleo em água microfluidizada na faixa dos submicrômetros com um tamanho médio de gotícula de óleo inferior a 0,5 ?m, emulsão de óleo em água microfluidizada, método de preparação de uma composição de vacina microfluidizada e composições de vacina microfluidizadas

Info

Publication number: BRPI0408635B1
Application number: BRPI0408635-0A
Authority: BR
Inventors: Paul Joseph Dominowski; Pamela Kay Klose; Richard Lee Krebs; Ramasamy Mannar Mannan
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2003-04-04
Filing date: 2004-03-22
Publication date: 2019-07-16
Also published as: NZ542576A; RU2005130646A; CY1113546T1; US20100173854A1; ES2398235T3; AU2004226591B2; PT1613346E; BRPI0408635A; KR20060006909A; RU2009113834A; MXPA05010697A; CN1767854B; CA2521051A1; JP2006522090A; US20040258701A1; DK1613346T3; TW200509966A; WO2004087204A2; CN1767854A; EP1613346B1

Abstract

"emulsões de óleo em água microfluidizadas e composições de vacinas". esta invenção apresenta emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros utilizáveis como um adjuvante de vacina para aumentar a imunogenicidade de antígenos. a presente invenção também apresenta composições de vacina contendo um antígeno associado a essas emulsões intrinsecamente ou extrinsecamente. também são apresentados pela presente invenção métodos de preparação das emulsões e vacinas.

Description

“MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA EMULSÃO DE ÓLEO EM ÁGUA MICROFLUIDIZADA NA FAIXA DOS SUBMICRÔMETROS COM UM TAMANHO MÉDIO DE GOTÍCULA DE ÓLEO INFERIOR A 0,5 MM, EMULSÃO DE ÓLEO EM ÁGUA MICROFLUIDIZADA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA MICROFLUIDIZADA E COMPOSIÇÕES DE VACINA MICROFLUIDIZADAS”

CAMPO DA INVENÇÃO [001]Esta invenção relaciona-se genericamente com o campo das vacinas e particularmente com formulações adjuvantes para aumentar a resposta imune de animais em veterinária. Em particular, a invenção relaciona-se com a utilização de uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros como adjuvante de vacinas para aumentar a imunogenicidade de antígenos. A presente invenção proporciona formulações em emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros, composições de vacinas contendo um antígeno incorporado nessas emulsões, bem como métodos de preparação das emulsões e vacinas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]As infecções bacterianas, virais, parasíticas e por micoplasma estão muito disseminadas em animais em veterinária tais como gado bovino, suínos e animais de companhia. As doenças causadas por estes agentes infecciosos são frequentemente resistentes a terapêutica farmacêutica antimicrobiana, não restando meios de tratamento eficazes. Consequentemente, uma abordagem de vacinologia é cada vez mais utilizada para controlar a doença infecciosa de animais em veterinária. Um agente patogênico infeccioso inteiro pode se tornar adequado para utilização em uma formulação de vacina após inativação química ou manipulação genética apropriada. Alternativamente, uma subunidade de proteína do agente patogênico pode ser expressa em um sistema de expressão recombinante e purificada para utilização em uma formulação de vacina.

[003]Adjuvante refere-se genericamente a qualquer material que aumente a

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2/58 resposta imune humoral e/ou celular a um antígeno. As vacinas tradicionais são compostas por preparação em bruto de microrganismos patogênicos mortos e as impurezas associadas às culturas dos microrganismos patológicos podem atuar como adjuvante para aumentar a resposta imune. Contudo, quando preparações homogêneas de microrganismos patológicos ou subunidades de proteínas modificadas são utilizadas como antígenos para vacinação, a imunidade suscitada por esses antígenos é fraca e torna-se, portanto, necessária a adição de certos materiais exógenos como adjuvante. Além disso, a produção de vacinas sintéticas e de subunidades é cara. Consequentemente, com a ajuda de adjuvante, pode ser necessária uma dose menor de antígeno para estimular a resposta imune, poupando assim no custo de produção de vacinas.

[004]Sabe-se que os adjuvantes atuam de várias maneiras diferentes para aumentar a resposta imune. Muitos adjuvantes modificam a rede de citocinas associadas à resposta imune. Estes adjuvantes imunomoduladores podem exercer o seu efeito mesmo quando não estão juntamente com antígenos. Em geral os adjuvantes imunomoduladores provocam uma sobre-regulação geral de certas citocinas e uma sub-regulação concomitante de outras conduzindo a uma resposta celular Th1 e/ou humoral Th2.

[005]Alguns adjuvantes têm a aptidão de conservar a integridade conformacional de um antígeno de tal forma que os antígenos podem ser eficazmente apresentados às células efetoras imunes apropriadas. Como resultado desta conservação da conformação do antígeno pela formulação de adjuvante, uma vacina teria uma vida útil aumentada tal como a demonstrada para complexos imuno estimulantes (ISCOMs). Ozel M. et al., Quaternary Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom), J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989).

[006]Alguns adjuvantes têm a propriedade de reter o antígeno como um depósito no sítio de injeção. Como resultado deste efeito de depósito, o antígeno não é rapidamente perdido por eliminação no fígado. Os sais de alumínio e as emulsões

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3/58 de água em óleo atuam através deste efeito de depósito durante um período mais curto. Por exemplo, pode obter-se um depósito de longa duração utilizando adjuvante completo de Freund (FCA) que é uma emulsão de água em óleo. O FCA tipicamente permanece no sítio de injeção até a biodegradação permitir a remoção do antígeno pelas células apresentadoras de antígenos.

[007]Com base na sua natureza física, os adjuvantes podem ser agrupados em duas categorias muito amplas, nomeadamente adjuvantes em partículas e adjuvantes não em partículas. Os adjuvantes em partículas existem como micropartículas. O imunógeno é capaz de se incorporar ou de se associar às micropartículas. Os sais de alumínio, emulsões de água em óleo, emulsões de óleo em água, complexos imuno estimuladores, lipossomas, e nano- e micropartículas são exemplos de adjuvantes em partículas. Os adjuvantes não em partículas são geralmente imunomoduladores e são geralmente utilizados em associação com adjuvantes em partículas. O dipeptídio muramila (um adjuvante - componente ativo de um peptidoglicano extraído de Mycobacteria), copolímeros de blocos não iônicos, saponinas (uma mistura complexa de triterpenóides extraídos da casca da árvore Quillaja saponaria), lipídio A (um dissacarídeo de glucosamina com dois grupos fosfato e cinco ou seis cadeias de ácidos graxos geralmente de comprimento C12 a C16), citocinas, polímeros de hidratos de carbono, polissacarídeos e toxinas bacterianas tais como toxina da cólera e toxina lábil de E. coli (LT) são exemplos de adjuvantes não em partículas.

[008]Alguns dos adjuvantes melhor conhecidos são associações de imunomoduladores não em partículas e materiais em partículas que podem conferir efeito de depósito à formulação de adjuvante. Por exemplo, o FCA associa as propriedades imunomoduladoras dos componentes de Mycobacterium tuberculosis ao efeito de depósito de curto prazo de emulsões oleosas.

[009]Há muito tempo que as emulsões oleosas têm sido utilizadas como adjuvante de vacinas. Le Moignic e Pinoy verificaram em 1916 que uma suspensão de

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Salmonella typhimurium morta em óleo mineral aumentava a resposta imune. Subsequentemente em 1925, Ramon descreveu óleo de amido como uma das substâncias que aumentava a resposta antitóxica ao toxóide da difteria. Contudo, as emulsões oleosas não se tornaram populares até 1937 quando Freund surgiu com a sua formulação de adjuvante agora conhecidas como Adjuvante Completo de Freund (FCA). O FCA é uma emulsão de água em óleo constituída por óleo mineral (óleo de parafina) mistura de Mycobateria mortas e Arlacel A. Arlacel A é principalmente monooleato de manida e é utilizado como um agente emulsificador. Embora o FCA seja excelente na indução de uma resposta de anticorpos, provoca dor forte, formação de abcessos, febre e inflamação granulomatosa. Para evitar estas reações secundárias indesejadas, foi desenvolvido o Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). O IFA é semelhante ao FCA quanto à sua composição exceto pela ausência dos componentes micobacterianos. O IFA atua através da formulação em depósito no sítio de injeção e liberação lenta do antígeno com estimulação de células produtoras de anticorpos.

[010]Outra abordagem para melhorar o FCA baseou-se na noção de que substituindo o óleo mineral por um óleo biocompatível ajudaria a eliminar as reações associadas ao FCA no sítio da injeção. Também se acreditava que a emulsão devia ser de óleo em água em vez de água em óleo, porque esta última produz um depósito duradouro no sítio de injeção. Hilleman et al. descreveram um adjuvante à base de óleo Adjuvante 65, que consiste em 86% de óleo de amendoim, 10% de Arlacel A como emulsificador e 4% de monoestearato de alumínio como estabilizador. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman e Beale, 1983, em New Approaches to Vaccine Development (Eds. Bell, R. e Torrigiani, G.), Schwabe, Basel. Em seres humanos, o Adjuvante 65 era seguro e potente mas apresentava menos adjuvanticidade do que o IFA. No entanto, a utilização de Adjuvante 65 foi abandonada devido a reatogenicidade para o homem com certos lotes de vacina e redução em adjuvanticidade quando se utilizava um emulsificador purificado ou sintético em

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5/58 vez de Arlacel A. As patentes U.S. 5.718.904 e 5.690.942 descrevem que o óleo mineral na emulsão de óleo em água pode ser substituído por óleo metabolizável para efeitos de melhoramento do perfil de segurança.

[011]Além da adjuvanticidade e segurança, o aspecto físico de uma emulsão também é uma consideração comercial importante. O aspecto físico depende da estabilidade da emulsão. A sedimentação, deposição e coalescência são indicadores da instabilidade da emulsão. A sedimentação ocorre quando as fases oleosa e aquosa da emulsão têm diferentes densidades relativas. A sedimentação também ocorre quando o tamanho inicial das gotículas da emulsão é grande e as gotículas da emulsão não estão tendo qualquer movimento browniano. Quando o tamanho das gotículas é grande, há uma tendência para a ruptura interfacial e as gotículas coalescem em partículas grandes. A estabilidade da emulsão é determinada por vários fatores tais como a natureza e quantidade de emulsificador utilizado, o tamanho do tamanho de gotículas na emulsão e a diferença de densidade entre a fase oleosa e aquosa.

[012]Os emulsificadores promovem a estabilização da gotícula dispersada por redução da energia livre interfacial e criação de barreiras físicas ou eletrostáticas à coalescência das gotículas. Como emulsificadores, têm sido utilizados detergentes não iônicos, assim como iônicos. Os emulsificadores não iônicos orientam na interface e produzem estruturas relativamente volumosas, o que evita estericamente gotículas dispersadas. Os emulsificadores aniônicos ou catiônicos induzem a formação de uma dupla camada elétrica por atração de contra-íons; as forças de repulsão da dupla camada fazem com que as gotículas se repilam umas às outras quando se aproximam.

[013]Além da utilização de emulsificadores, a estabilidade da emulsão também pode ser conseguida através da redução do tamanho de gotículas da emulsão por meios mecânicos. Tipicamente, misturadores de pás, rotores de turbinas, moinhos coloidais, homogeneizadores e sonicadores têm sido utilizados para produzir

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6/58 emulsões. A microfluidização é outra maneira de aumentar a homogeneidade do tamanho de gotícula na emulsão. A microfluidização pode produzir uma emulsão elegante e fisicamente estável com tamanho de partículas consistente na faixa dos submicrômetros. Além de aumentar a estabilidade da emulsão, o processo de microfluidização permite a filtração terminal que é uma forma preferida de assegurar a esterilidade do produto final. Além disso, as partículas de óleo na faixa dos submicrômetros podem passar dos sítios de injeção para os linfáticos e depois para os nódulos linfáticos da cadeia de drenagem, sangue e baço. Isto reduz a probabilidade de estabelecer um depósito oleoso no sítio de injeção que pode produzir inflamação local e reação significativa no sítio da injeção.

[014]Os microfluidizadores estão agora disponíveis comercialmente. A formação de emulsões ocorre em um microfluidizador à medida que duas correntes fluidizadas interatuam a altas velocidades em uma câmara de interação. O microfluidizador é operado a ar ou nitrogênio e pode funcionar a pressões internas superiores a 1.406 kg/cm² (20.000 psi). A patente U.S. 4.908.154 descreve a utilização de um microfluidizador para obtenção de emulsões essencialmente isentas de quaisquer agentes emulsificadores.

[015]Foram descritas na literatura várias formulações de adjuvante de óleo em água na faixa dos submicrômetros. A patente U.S. 5.376.369 descreve uma formulação de adjuvante em emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros conhecida como formulação adjuvante Syntax (SAF). A SAF contém esqualeno ou esqualano, como o componente oleoso, uma quantidade formadora de emulsão de copolímero de blocos (polioxi-propileno-polioxietileno) Pluronic L121 e uma quantidade imunopotenciadora de dipeptídio de muramila. O esqualeno é um hidrocarboneto linear precursor do colesterol que se encontra em muitos tecidos, particularmente nos fígados de tubarões e de outros peixes. O esqualano é preparado por hidrogenação de esqualeno e é completamente saturado. Tanto o esqualeno como o esqualano podem ser metabolizados e têm um bom registo de estudos toxicológi

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7/58 cos. As emulsões de esqualeno ou esqualano têm sido utilizadas em vacinas do câncer humano com efeitos secundários suaves e uma eficácia desejável. Ver, por exemplo, Anthony C. Allison, 1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19: 87-93.

[016]A patente U.S. 6.299.884 e a publicação da patente internacional WO90/14837 descrevem que os copolímeros de blocos de polioxi-propilenopolioxietileno não são essenciais para a formação de uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros. Além disso, estas referências descrevem a utilização de óleo não tóxico e metabolizável e excluem expressamente a utilização de óleo mineral e de óleos de destilados de petróleo tóxicos nas suas formulações em emulsão.

[017]A patente U.S. 5.961.970 descreve ainda outra emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros para ser utilizada como adjuvante de vacinas. Na emulsão descrita nesta patente, o componente hidrófobo é selecionado do grupo que consiste em um óleo de triglicerídeos de cadeia média, um óleo vegetal e uma sua mistura. O tensoativo incluído nesta emulsão pode ser um tensoativo natural compatível biologicamente tal como um fosfolipídio (por exemplo, lecitina) ou um tensoativo não natural farmaceuticamente aceitável tal como TWEEN-80. Esta patente também descreve a incorporação do antígeno na emulsão no momento da formação da emulsão, em contraste com a mistura do antígeno com a emulsão depois da emulsão ter sido formada independentemente e extrinsecamente.

[018]A patente U.S. 5.084.269 descreve que uma formulação de adjuvante contendo lecitina em associação com óleo mineral provoca uma diminuição da irritação no animal hospedeiro e simultaneamente induz imunidade sistêmica acrescida. A formulação de adjuvante resultante da patente U.S. 5.084.269 é utilizada comercialmente em vacinas veterinárias com o nome comercial AMPHIGEN^®. A formulação AMPHIGEN^® é constituída por micelas - gotículas de óleo rodeadas por lecitina. Estas micelas permitem que se liguem mais antígenos de células inteiras do que

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8/58 adjuvantes tradicionais à base de óleo. Além disso, as formulações de vacina à base de AMPHIGEN® contêm um baixo teor de óleo de 2,5 a 5% de óleo mineral, em comparação com outras formulações de vacina contendo adjuvantes oleosos, que tipicamente contêm de 10% a 20% de óleo. O seu baixo teor de óleo torna esta formulação de vacina à base de adjuvante menos irritante para os tecidos no sítio de injeção, resultando em menos lesões e menos desbaste no abate. Além disso, o revestimento de lecitina que rodeia as gotículas de óleo reduz mais as reações no sítio de injeção resultando em uma vacina que é simultaneamente segura e eficaz.

[019]A formulação AMPHIGEN® é utilizada como adjuvante em diversas vacinas veterinárias e há necessidade de manter o aspecto físico do produto de vacina durante períodos de armazenagem curtos e longos, bem como no momento da reconstituição. Além disso, um antígeno liofilizado é misturado com a formulação de adjuvante pré-preparada imediatamente antes da injeção. Esta prática nem sempre assegura que há uma distribuição uniforme de antígeno no seio da emulsão de óleo em água e o aspecto da emulsão pode não ser desejável. Além disso, quando em repouso, a emulsão homogeneizada pode apresentar separação de fases. Consequentemente, há necessidade de uma formulação de adjuvante estável que não apresente separação de fases na armazenagem prolongada. Uma forma de impedir a separação de fases é reduzir o tamanho das gotículas e aumentar a homogeneidade das partículas da emulsão. Embora o processo de microfluidização de formulações em emulsão de base oleosa esteja documentado, ainda não foi realizada a microfluidização de emulsões de óleo em água tais como a formulação AMPHIGEN®.

[020]Na presente invenção, utilizou-se a microfluidização para levar o tamanho das gotículas de óleo mineral rodeadas por lecitina à faixa dos submicrômetros. Inesperadamente, foi verificado pelos presentes inventores que a microfluidização de formulações de vacina com uma emulsão de óleo em água constituída por uma mistura de lecitina e óleo como adjuvante não só melhora o aspecto físico das forPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 15/72

9/58 mulações, mas também aumenta os efeitos imunizantes das formulações. As formulações microfluidizadas também são caracterizadas por um perfil de segurança melhorado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [021]Foi inesperadamente constatado pelos presentes inventores que a atividade adjuvante e o perfil de segurança de emulsões de óleo em água à base de óleo não metabolizável podem ser melhorados através de microfluidização. Os antígenos incorporados em emulsões microfluidizadas são estáveis mesmo quando os antígenos são incorporados intrinsecamente nas emulsões antes da microfluidização.

[022]Portanto, em uma modalidade, a presente invenção proporciona formulações em emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros úteis como adjuvante de vacinas. As emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros da presente invenção são constituídas por um óleo não metabolizável, pelo menos um tensoativo e um componente aquoso, em que o óleo está dispersado no componente aquoso com um tamanho médio de gotícula de óleo na faixa dos submicrômetros. Um óleo não metabolizável preferido é óleo mineral leve. Os tensoativos preferidos incluem lecitina, Tween-80 e SPAN-80.

[023]Uma emulsão de óleo em água preferida proporcionada pela presente invenção é constituída por uma formulação AMPHIGEN®.

[024]As emulsões de óleo em água da presente invenção podem incluir componentes adicionais que são apropriados e desejáveis, incluindo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imuno-estimuladoras. As moléculas imuno-estimuladoras preferidas incluem, por exemplo, Quil A, colesterol, GPI-0100, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA).

[025]Em outra modalidade, a presente invenção proporciona métodos de preparação de uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros. De acordo com a presente invenção, os vários componentes da emulsão, incluindo

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10/58 óleo, um ou mais tensoativos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado para utilização na emulsão, são misturados. A mistura é submetida a um processo de emulsificação primário para formar uma emulsão de óleo em água, que é então passada através de um microfluidizador para se obter uma emulsão de óleo em água com gotículas de menos do que 1 micrômetro de diâmetro, de um modo preferido com um tamanho médio de gotícula inferior a 0,5 micrômetros.

[026]Ainda em outra modalidade, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um antígeno e uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros aqui descrita acima. O antígeno é incorporado na emulsão ou extrinsecamente ou intrinsecamente, de um modo preferido intrinsecamente.

[027]O antígeno que pode ser incluído nas composições de vacina da presente invenção pode ser um antígeno bacteriano, fúngico ou viral ou uma associação destes. O antígeno pode tomar a forma de uma preparação inativada de células ou vírus inteiros ou parciais, ou a forma de moléculas antigênicas obtidas por purificação de proteínas, técnicas de engenharia genética ou síntese química convencionais.

[028]Em mais uma modalidade, a presente invenção proporciona métodos de preparação de composições de vacina contendo um antígeno ou antígenos associados com uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros.

[029]Na preparação de composições de vacina da presente invenção, o(s) antígeno(s) pode(m) ser associados intrinsecamente (por exemplo, antes da microfluidização) ou extrinsecamente (por exemplo, depois da microfluidização) aos componentes da emulsão de óleo em água. De um modo preferido, o antígeno é associado aos componentes da emulsão de óleo em água intrinsecamente.

[030]Ainda em outra modalidade, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um antígeno micro-encapsulado e uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros aqui descrita acima, em que o antígeno micro-encapsulado é associado à emulsão extrinsecamente.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [031]A Figura 1 ilustra o processo para a preparação em lotes de composições de vacina não microfluidizadas. Neste processo os vários componentes da vacina são adicionados ao reator de adição à esquerda e por fim bombeados para o reator de mistura em que os componentes são misturados através de meios mecânicos simples.

[032]A Figura 2 ilustra o processo para a preparação de composições de vacina microfluidizadas contendo antígeno incorporado intrinsecamente. Os vários componentes da vacina são adicionados ao reator de adição e transferidos para a unidade de mistura da pré-emulsão para mistura por meios mecânicos simples. Subsequentemente, a emulsão é passada através de um microfluidizador e é recolhida na câmara de pós-microfluidização.

[033]A Figura 3 ilustra a distribuição do tamanho de gotículas de uma vacina à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizada, a vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada e a preparação laboratorial de mistura para vacina.

[034]A Figura 4 mostra a ausência de separação de fases na preparação de vacina microfluidizada.

[035]A Figura 5 ilustra uma comparação da estabilidade de antígenos incorporados intrinsecamente em uma preparação de vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada (A907505) e três controlos, preparações de vacina à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizadas (A904369, A904370 e A904371). As quatro preparações de vacina foram armazenadas a 4 °C durante dois anos. Em diferentes momentos durante a armazenagem (0, 6, 12 ou 24 meses), as quatro formulações foram utilizadas para vacinar vacas com três meses de idade. A vacinação foi feita ao Dia 0 e 21 com uma dose de vacina de 2 mL e os plasmas foram recolhidos duas semanas após a segunda vacinação. O título de anticorpo neutralizante de vírus BDV de Tipo II foi determinado em cada uma das amostras de

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12/58 plasma. Os dados estão apresentados como a média geométrica para 5 animais.

[036]A Figura 6 mostra a média pelos mínimos quadrados da temperatura retal do gado antes e após a administração de vacinas microfluidizadas e não microfluidizadas. T01: Grupo de placebo - dose simples; T02: Grupo de placebo - dose dupla; T03: Formulação não microfluidizada - dose simples; T04: Formulação não microfluidizada - dose dupla; T05: Formulação microfluidizada - dose simples; T06: Formulação microfluidizada - dose dupla.

[037]A Figura 7 ilustra a média pelos mínimos quadrados dos volumes de reação no sítio de injeção observados no gado após a administração das formulações de vacina não microfluidizadas e microfluidizadas. T03: Formulação não microfluidizada - dose simples; T04: Formulação não microfluidizada - dose dupla; T05: Formulação microfluidizada - dose simples; T06: Formulação microfluidizada - dose dupla.

[038]A Figura 8 ilustra a média geométrica dos títulos de IgG para antígeno PauA recombinante de Streptococcus uberis após vacinação com as várias formulações de vacina contendo tanto antígeno PauA recombinante como antígeno de células inteiras de E. coli.

[039]A Figura 9 ilustra a média geométrica dos títulos de IgG para antígeno de células inteiras de E. coli de Streptococcus uberis após vacinação com as várias formulações de vacina contendo tanto antígeno PauA recombinante como antígeno de células inteiras de E. coli.

[040]As Figuras 10A e 10B ilustram a distribuição de tamanhos de partícula de uma formulação de Amphigen microfluidizada na produção inicial (Figura 10A) e aos 22 meses pós-produção (Figura 10B).

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO [041]Foi inesperadamente constatado pelos presentes inventores que a microfluidização de formulações de vacina tendo como adjuvante uma emulsão de óleo em água constituída por uma mistura de lecitina e óleo mineral só melhora o

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13/58 aspecto das formulações de vacina, como também aumenta os efeitos imunizantes das formulações de vacina. As formulações de vacina microfluidizadas também são caracterizadas por um perfil de segurança melhorado.

[042]Com base nestas constatações, a presente invenção proporciona emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros úteis como adjuvante em composições de vacina. Também são proporcionados métodos para a produção destas emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros por utilização de um microfluidizador. Além disso, a presente invenção proporciona composições de vacina na faixa dos submicrômetros em que um antígeno está associado à emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros. Também são proporcionados métodos para a preparação dessas composições de vacina. A presente invenção proporciona ainda composições de vacina contendo antígenos microencapsulados associados a uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros e métodos para a preparação dessas vacinas.

[043]Para clareza de descrição, e não a título de limitação, a descrição pormenorizada da invenção está dividida nas subseções seguintes que descrevem ou ilustram certas características, modalidades ou aplicações da invenção.

Emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros [044]Em uma modalidade, a presente invenção proporciona formulações em emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros úteis como adjuvante de vacina. As emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros da presente invenção aumentam a imunogenicidade de antígenos nas composições de vacina, são seguras para administração a animais e estáveis durante a armazenagem.

[045]As emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros da presente invenção são constituídas por um óleo não metabolizável, pelo menos um tensoativo e um componente aquoso, em que o óleo está dispersado no componente aquoso com um tamanho médio de gotícula de óleo na faixa dos submicrômetros.

[046]Por na faixa dos submicrômetros significa-se que as gotículas têm um

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14/58 tamanho inferior a 1 pm (micrômetro) e o tamanho médio das gotículas de óleo é inferior a 1 pm. De um modo preferido, o tamanho médio das gotículas da emulsão é inferior a 0,8 pm, de um modo mais preferido inferior a 0,5 pm e ainda de um modo mais preferido inferior a 0,4 pm, ou cerca de 0,1 - 0,3 pm.

[047]O tamanho médio das gotículas é definido como o diâmetro médio em volume (VMD), o tamanho de partículas no seio de uma distribuição em volume de tamanhos de partículas. O VMD é calculado multiplicando o diâmetro de cada partícula pelo volume de todas as partículas desse tamanho e somando. Este valor é então dividido pelo volume total de todas as partículas.

[048]O termo óleo não metabolizável tal como aqui utilizado refere-se a óleos que não podem ser metabolizados pelo organismo do animal ao qual é administrada a emulsão.

[049]O termo animal tal como aqui utilizado refere-se a todos os animais não humanos, incluindo gado bovino, ovelhas e porcos, por exemplo.

[050]Os óleos não metabolizáveis adequados para utilização nas emulsões da presente invenção incluem alcanos, alcenos, alcinos e os seus correspondentes ácidos e álcoois, os seus éteres e ésteres, e as suas misturas. De um modo preferido, os compostos individuais do óleo são compostos de hidrocarbonetos leves, isto é, componentes desses que têm 6 a 30 átomos de carbono. O óleo pode ser preparado sinteticamente ou purificado a partir de produtos do petróleo. Os óleos não metabolizáveis preferidos para utilização nas emulsões da presente invenção incluem óleo mineral, óleo de parafina e cicloparafinas, por exemplo.

[051]O termo óleo mineral refere-se a uma mistura de hidrocarbonetos líquidos obtida a partir de vaselina através de uma técnica de destilação. O termo é sinónimo de parafina liquefeita, vaselina líquida e óleo mineral branco. O termo também pretende incluir óleo mineral leve, isto é, óleo que é analogamente obtido por destilação de vaselina, mas que tem uma densidade relativa ligeiramente mais baixa do que o óleo mineral branco. Ver, por exemplo, RemingtonS Pharmaceutical

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Sciences, 18th Edition (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1990, nas páginas 788 e 1.323). O óleo mineral pode ser obtido de várias fontes comerciais, por exemplo, J. T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). O óleo mineral preferido é óleo mineral leve disponível comercialmente com o nome DRAKEOL®.

[052]Tipicamente, o componente óleo das emulsões na faixa dos submicrômetros da presente invenção está presente em uma quantidade de 1% a 50% em volume; de um modo preferido, em uma quantidade de 10% a 45; de um modo mais preferido, em uma quantidade de 20% a 40%.

[053]As emulsões de óleo em água da presente invenção tipicamente incluem pelo menos um (isto é, um ou mais) tensoativos. Os tensoativos e emulsificadores, termos esses que aqui são utilizados intermutavelmente, são agentes que estabilizam a superfície das gotículas de óleo e mantêm as gotículas de óleo dentro do tamanho desejado.

[054]Os tensoativos adequados para utilização nas presentes emulsões incluem tensoativos biologicamente compatíveis naturais e tensoativos sintéticos não naturais. Os tensoativos compatíveis biologicamente incluem compostos fosfolipídios ou uma mistura de fosfolipídios. Os fosfolipídios preferidos são fosfatidilcolinas (lecitina), tais como lecitina de soja ou de ovo. A lecitina pode ser obtida como uma mistura de fosfatidos e triglicerídeos por lavagem com água de óleos vegetais em bruto, e separação e secagem das gomas hidratadas resultantes. Um produto refinado pode ser obtido por fraccionamento da mistura em fosfolipídios insolúveis em acetona e glicolipídios remanescentes após remoção dos triglicerídeos e óleo vegetal por lavagem com acetona. Alternativamente, a lecitina pode ser obtida de várias fontes comerciais. Outros fosfolipídios adequados incluem fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina e fosfatidiletanolamina. Os fosfolipídios podem ser isolados de fontes naturais ou sintetizados de modo convencional.

[055]Os tensoativos sintéticos, não naturais, adequados para utilização nas

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16/58 emulsões na faixa dos submicrômetros da presente invenção incluem tensoativos não iônicos à base de sorbitano, por exemplo, tensoativos de sorbitano substituído com ácidos graxos (disponíveis comercialmente com o nome SPAN® ou ARLACEL^®), ésteres de ácidos graxos de sorbitol polietoxilado (TWEEN^®), ésteres de polietileno glicol de ácidos graxos de fontes tais como óleo de rícino (EMULFOR); ácido graxo polietoxilado (por exemplo, ácido esteárico disponível com o nome SIMULSOL M-53), polímero de iso-octilfenol polietoxilado/formaldeído (TYLOXAPOL), ésteres de polioxietileno álcool graxo (BRIJ^®); éteres polioxietileno nonilfenílicos (TRITON^® N), éteres polioxietileno iso-octilfenílicos (TRITON^® X). Os tensoativos sintéticos preferidos são os tensoativos disponíveis com o nome de SPAN® e TWEEN®.

[056]Os tensoativos preferidos para utilização nas emulsões de óleo em água da presente invenção incluem lecitina, Tween-80 e SPAN-80.

[057]De modo genérico, o tensoativo, ou a associação de tensoativos, se são utilizados dois ou mais tensoativos, está presente na emulsão em uma quantidade de 0,01% a 10% em volume, de um modo preferido 0,1% a 6,0%, de um modo mais preferido 0,2% a 5,0%.

[058]O componente aquoso constitui a fase contínua da emulsão e pode ser água, soro fisiológico tamponado ou qualquer outra solução aquosa adequada.

[059]As emulsões de óleo em água da presente invenção podem incluir componentes adicionais que são apropriados e desejáveis, incluindo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras.

[060]Crê-se que as moléculas bioadesivas podem aumentar a administração e ligação de antígenos à ou através da superfície mucosa alvo, conferindo imunidade à mucosa. Exemplos de moléculas bioadesivas adequadas incluem polímeros ácidos de ocorrência não natural tais como ácido poliacrílico e ácido polimetacrílico (por exemplo, CARBOPOL®, CARBOMER); polímeros naturais ácidos modificados sinteticamente tais como carboximetilcelulose; polímeros naturais neutros modificaPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 23/72

17/58 dos sinteticamente tais como (hidroxipropil) metilcelulose; polímeros básicos com aminas tais como quitosano; polímeros ácidos que podem ser obtidos de fontes naturais tais como ácido algínico, ácido hialurônico, pectina, goma tragacanta e goma karaya; e polímeros neutros de ocorrência não natural, tais como álcool polivinílico;

as suas associações.

[061]A frase moléculas imunoestimuladoras, tal como aqui utilizada, refere-se às moléculas que aumentam a resposta imune protetora induzida por um componente antigênico em composições de vacina. Os materiais imunoestimuladores incluem componentes da parede celular bacteriana, por exemplo, derivados de N-acetil muramil-L-alanil-D-isoglutamina tais como murabutide, treonil-MDP e tripéptido de muramila; glicosídeos de saponinas e os seus derivados, por exemplo, Quil A, QS 21 e GPI-0100; colesterol; e compostos de amônio quaternário, por exemplo, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) e N,N-dioctadecil-N,N-bis(2- hidroxietil)propanodiamina (avridina).

[062]As saponinas são compostos glicosídicos que são produzidos como metabolitos secundários por uma grande variedade de espécies de plantas. A estrutura química das saponinas confere uma gama ampla de atividades farmacológicas e biológicas, incluindo alguma atividade imunológica potente e eficaz.

[063]Estruturalmente, as saponinas consistem em qualquer aglicona ligada a uma ou mais cadeias de açúcares. As saponinas podem ser classificadas de acordo com a composição da sua aglicona: glicosídeos triterpênicos, glicosídeos esteroidais e glicosídeos de alcalóides esteroidais.

[064]A saponina pode ser isolada da casca de Quillaja saponaria. Há muito que se sabe que a saponina é um imunoestimulador. Daisgaard, K., Evaluation of its adjuvant ativity with a special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease, Acta Vet. Scand. 69:1-40, 1978. Os extratos em bruto de plantas contendo saponina aumentavam a potência de vacinas contra a febre aftosa. Contudo, os extratos em bruto estavam associados a efeitos secundáPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 24/72

18/58 rios adversos quando utilizados em vacinas. Subsequentemente, Dalsgaard purificou parcialmente o componente ativo como adjuvante da saponina por diálise, permuta iônica e cromatografia por filtração em gel. Dalsgaard, K. et a/.,Saponin adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant ativity in foot-and-mouth disease vaccines, Arch. Gesamte. Virusforsch. 44:243-254, 1974. Um componente ativo como adjuvante purificado desta forma é conhecido como Quil A, em uma base em peso a Quil A demonstrou potência acrescida e apresentou reações locais reduzidas em comparação com saponina. Quil A é amplamente utilizada em vacinas veterinárias.

[065]A análise adicional de Quil A por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) revelou uma mistura heterogênea de saponinas relacionada de perto e levou à descoberta de QS21 que era um adjuvante potente com toxicidade reduzida ou mínima. Kensil C. R. et a/.,Separation and characterization of saponins with adjuvant ativity from Qui//aja saponaria Molina cortex, J. Immuno/. 146:431-437,1991. Ao contrário da maioria de outros imunoestimuladores, a QS 21 é solúvel em água e pode ser utilizada em vacinas com ou sem formulações do tipo emulsão. Demonstrou-se que a QS21 induz uma resposta de tipo Th1 em murganhos estimulando a produção de anticorpos de IgG2a e IgG2b e induziu CD8+CTL (MHC de classe 1) específicos de anticorpos em resposta a antígenos de subunidades. Estudos clínicos em seres humanos provaram a sua adjuvanticidade com um perfil toxicológico aceitável. Kensil, C. R. et a/., Structural and immunological charaterization of the vaccine adjuvant QS-21. Em Vaccine Design: the subunit and Adjuvant Approach”, Eds. Powell, M. F. e Newman, M. J. Plenum Publishing Corporation, New York. 1995, pp. 525-541.

[066]A patente U.S. 6.080.725 descreve os métodos de preparação e utilização de conjugado lipofílico de saponina. Neste conjugado lipofílico de saponina, uma unidade lipofílica tal como lipídio, ácido graxo, polietileno glicol ou terpeno é ligado covalentemente a uma saponina triterpênica não acilada ou desacilada atra

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19/58 vés de um grupo carboxilo presente no ácido 3-O-glucurônico da saponina triterpênica. A ligação de uma unidade lipofílica ao ácido 3-O-glucurônico de uma saponina como desacilsaponina de Quillaja, luciosido P ou saponina de Gypsophila, saponaria e Acanthophyllum aumenta os seus efeitos adjuvantes sobre a imunidade humoral e mediada por células. Adicionalmente, a ligação de uma unidade lipofílica ao resíduo de ácido 3-O-glucurônico de saponina não acilada ou de desacil-saponina dá um análogo de saponina que é mais fácil de purificar, menos tóxico, quimicamente mais estável e possui propriedades adjuvantes iguais ou melhores do que a saponina original.

[067]O GPI-0100 é um conjugado lipofílico de saponina descrito na patente U.S. 6.080.725. O GPI-0100 é produzido pela adição de amina alifática a desacilsaponina através do grupo carboxilo do ácido glucurônico.

[068] Compostos de amônio quaternário - Várias bases nitrogenadas alifáticas foram propostas para utilização como adjuvantes imunológicos, incluindo aminas, compostos de amônio quaternário, guanidinas, benzamidinas e tiourônios. Compostos específicos desses incluem brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) e N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina (avridina).

[069]A patente U.S. 5.951.988 descreve uma formulação de adjuvante contendo sais de amônio quaternário tais como DDA em associação com um componente oleoso. Esta formulação é útil em associação com substâncias imunológicas conhecidas, por exemplo, antígenos virais ou bacterianos em uma composição de vacina, de forma a aumentar a resposta imunogênica. A composição também é útil sem um antígeno incorporado como formulação imunoestimuladora não específica.

[070]A patente U.S. 4.310.550 descreve a utilização de N,N-alquil superiorN,N'-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina e N,N-alquil superior-xililenodiaminas formuladas com emulsão graxa ou lipídica como adjuvante de vacina. Um método para induzir ou aumentar a resposta imunogênica de um antígeno no homem ou em um animal através da administração parenteral da formulação de adjuvante está des

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20/58 crito na patente U.S. 4.310.550.

[071]Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros útil como adjuvante de vacina, que é constituída por uma formulação AMPHIGEN®, com gotículas de um tamanho inferior a 1 pm e um tamanho médio das gotículas de cerca de 0,25 pm.

[072]O termo formulação AMPHIGEN® tal como aqui utilizado refere-se a uma solução formada por mistura de uma solução oleosa de lecitina DRAKEOL® (Hydronics, Lincoln, NE) com solução de soro fisiológico na presença de TWEEN® 80 e SPAN® 80. Uma formulação AMPHIGEN® típica contém 40% de óleo mineral leve em volume (v/v), cerca de 25% p/v de lecitina, cerca de 0,18% de TWEEN 80 em volume (v/v) e cerca de 0,08% de Span 80 em volume (v/v).

Métodos de preparação de emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros [073]Em outra modalidade, a presente invenção proporciona métodos de preparação de emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros aqui descritas acima.

[074]De acordo com a presente invenção, os vários componentes da emulsão, incluindo óleo, um ou mais tensoativos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado para utilização na emulsão, são combinados e misturados uns com os outros.

[075]A mistura formada é submetida a um processo de emulsificação, tipicamente por passagem uma ou mais vezes através de um ou mais homogeneizadores ou emulsificadores para formar uma emulsão de óleo em água que tem um aspecto uniforme e um tamanho médio de gotícula de cerca de 0,5 pm. Qualquer homogeneizador ou emulsificador disponível comercialmente pode ser utilizado para este fim, por exemplo, emulsificador Ross (Hauppauge, NY), homogeneizador Gaulin (Everett, MA).

[076]A emulsão assim formada é então submetida a microfluidização para

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21/58 levar o tamanho das gotículas à faixa dos submicrômetros. A microfluidização pode ser realizada pela utilização de um microfluidizador comercial, tal como o modelo número 11 OY disponível de Microfluidics, Newton, Mass.; Modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Rainnie Minilab Tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Estes microfluidizadores operam forçando os fluidos através de pequenas aberturas a alta pressão, de tal modo que duas correntes de fluido interatuam a altas velocidades em uma câmara de interação formando emulsões com gotículas de um tamanho na faixa dos submicrômetros.

[077]O tamanho das gotículas pode ser determinado por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, difração de lasers, por utilização de instrumentos de medida disponíveis comercialmente. O tamanho pode variar dependendo do tipo de tensoativo utilizado, da proporção de tensoativo para óleo, da pressão de trabalho, da temperatura e outros semelhantes. O especialista na matéria pode determinar a combinação desejada destes parâmetros para obter emulsões com o tamanho de gotícula desejado sem necessidade de experimentação. As gotículas das emulsões da presente invenção são inferiores a 1 pm de diâmetro, de um modo preferido com um tamanho médio das gotículas inferior a 0,8 pm e de um modo mais preferido com um tamanho médio das gotículas inferior a 0,5 pm, e ainda de um modo mais preferido com um tamanho médio das gotículas inferior a 0,3 pm.

[078]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a solução oleosa de lecitina DRAKEOL, que está disponível comercialmente de Hydronics (Lincoln, NE) e contém 25% de lecitina em óleo mineral leve, é associada e misturada com soro fisiológico bem como com os tensoativos TWEEN® 80 e SPAN® 80 para formar uma solução AMPHIGEN® ou formulação AMPHIGEN®. A solução AMPHIGEN® é então emulsificada com um emulsificador Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3.400 rpm para formar uma emulsão de óleo em água. Subsequentemente, a emulsão é passada uma vez através de um microfluidizador operando a cerca de 316 ± 35 kg/cm² (4.500 ± 500 psi). A emulsão de óleo em água

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22/58 microfluidizada tem gotículas de um tamanho inferior a 1 pm, com um tamanho médio das gotículas de cerca de 0,25 pm.

Composições de vacina contendo antígenos incorporados em emulsões de óleo em água na faixa dos submicrômetros [079]Em outra modalidade, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um antígeno e uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros aqui descrita acima. Estas composições de vacina são caracterizadas por terem um efeito imunogênico aumentado e um aspecto físico melhorado (por exemplo, não se observa separação de fases após um período de armazenagem prolongado). Além disso, as composições de vacina da presente invenção são seguras para administração a animais.

[080]De acordo com a presente invenção, o antígeno pode ser associado à emulsão extrinsecamente, ou de um modo preferido, intrinsecamente. O termo intrinsecamente refere-se ao processo em que o antígeno é associado aos componentes da emulsão antes do passo de microfluidização. O termo extrinsecamente refere-se ao processo em que o antígeno é adicionado à emulsão depois de a emulsão ter sido microfluidizada. O antígeno adicionado extrinsecamente pode ser antígeno livre ou pode estar encapsulado em micropartículas como aqui descrito mais adiante.

[081]O termo antígeno tal como aqui utilizado refere-se a qualquer molécula, composto ou composição que é imunogênico em um animal e está incluído na composição de vacina para induzir uma resposta imune protetora no animal ao qual a composição de vacina é administrada.

[082]O termo imunogênico tal como utilizado em relação a um antígeno refere-se à capacidade do antígeno para provocar uma resposta imune em um animal contra o antígeno. A resposta imune pode ser uma resposta imune celular mediada principalmente por células T citotóxicas, ou uma resposta imune humoral mediada principalmente por células T auxiliares, que por sua vez ativam as células B levando

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23/58 à produção de anticorpos.

[083]Uma resposta imune protetora é definida como qualquer resposta, seja uma resposta imune mediada por anticorpos ou por células, ou por ambos, que ocorre no animal que impede ou reduz de forma detectável a ocorrência, ou elimina ou reduz de forma detectável a gravidade, ou abranda de forma detectável a taxa de progressão, da patologia ou doença causada pelo antígeno ou por um agente patogênico contendo o antígeno.

[084]Os antígenos que podem ser incluídos na composição de vacina da presente invenção incluem antígenos preparados a partir de bactérias patogênicas tais como Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Manheimia hemolytica, Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Salmonella enterica serovars, Leptospira spp.; fungos patogênicos tais como Candida; protozoários tais como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp.; helmintas tais como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola, quer na forma de uma preparação de células inteiras ou parciais inativadas, ou na forma de moléculas antigênicas obtidas por purificação de proteínas convencional, técnicas de engenharia genética ou síntese química. Antígenos adicionais incluem vírus patogênicos tais como vírus do herpes-1,3, 6 de bovinos, vírus da diarréia viral de bovinos (BVDV) de tipos 1 e 2, vírus da para-influenza bovina, vírus sincicial respiratório dos bovinos, vírus da leucose bovina, vírus da peste bovina, vírus da febre aftosa, raiva, vírus da febre dos suínos, vírus da peste suína africana, parvovírus porcino, vírus PRRS, circovírus porcino, vírus da influenza, vírus da doença vesicular suína, vírus da febre de Techen, vírus da pseudorraiva, na forma de uma preparação de vírus inteiros ou parciais inativados, ou na forma de moléculas antigênicas

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24/58 obtidas por purificação de proteínas convencional, técnicas de engenharia genética ou síntese química.

[085]A quantidade do antígeno deve ser tal que o antígeno, em associação com a emulsão de óleo em água, é eficaz para induzir uma resposta imune protetora em um animal. A quantidade exacta de um antígeno para ser eficaz depende da natureza, atividade e pureza do antígeno, e pode ser determinada por um especialista na matéria.

[086]A quantidade de emulsão de óleo em água presente nas composições de vacina deveria ser suficiente para potenciação da imunogenicidade do(s) antígeno(s) nas composições de vacina. Quando desejável e apropriado, podem ser adicionadas mais quantidades de tensoativo(s) ou tensoativo(s) adicionais na composição de vacina Além do(s) tensoativo(s) proporcionados pela emulsão de óleo em água. Falando genericamente, o componente oleoso está presente no volume final de uma composição de vacina em uma quantidade de 1,0% a 20% em volume; de um modo preferido, em uma quantidade de 1,0% a 10%; de um modo mais preferido, em uma quantidade de 2,0% a 5,0%. O tensoativo, ou a associação de tensoativos se são utilizados dois ou mais tensoativos, está presente no volume final de uma composição de vacina em uma quantidade de 0,1 % a 20% em volume, de um modo preferido, 0,15% a 10%, de um modo mais preferido 0,2% a 6,0%.

[087]Além do(s) antígeno(s) e da emulsão de óleo em água, a composição de vacina pode incluir outros componentes que são apropriados e desejáveis, tais como conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadesivas e moléculas imunoestimuladoras (por exemplo, Quil A, colesterol, GPI-0100, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA) ), como aqui descrito acima em ligação com a emulsão de óleo em água.

[088]As composições de vacina da presente invenção também podem incluir um veículo veterinariamente aceitável. O termo um veículo veterinariamente aceitável inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvanPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 31/72

25/58 tes, agentes estabilizadores, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes de atraso da adsorção e outros semelhantes. Os diluentes podem incluir água, soro fisiológico, dextrose, etanol, glicerol e outros semelhantes. Os agentes isotónicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizadores incluem albumina, entre outros.

[089]Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma composição de vacina que inclui pelo menos um antígeno de BVDV tipo I ou BVDV tipo II, incorporado intrinsecamente em uma emulsão de óleo em água que tem gotículas de um tamanho inferior a 1 pm, de um modo preferido com um tamanho médio das gotículas inferior a 0,8 pm, de um modo mais preferido menos do que 0,5 pm e de um modo ainda mais preferido com um tamanho médio das gotículas de cerca de 0,5 pm. O antígeno de BVDV de tipo I e/ou II está de um modo preferido na forma de uma preparação viral inativada. A emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros de um modo preferido é constituída por formulação AMPHIGEN® (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80). A composição de vacina de um modo preferido também inclui Quil-A, colesterol e timerosol.

[090]Em outra modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma composição de vacina que inclui um antígeno de Leptospira e pelo menos um de um antígeno de BVDV de tipo I ou BVDV de tipo II em uma emulsão de óleo em água. Os antígenos, de um modo preferido na forma de uma preparação de células ou vírus inativados, são incorporados intrinsecamente na emulsão de óleo em água com gotículas de um tamanho inferior a 1 pm, de um modo preferido com um tamanho médio das gotículas inferior a 0,8 pm, de um modo mais preferido inferior a 0,5 pm e de um modo ainda mais preferido com um tamanho médio das gotículas de cerca de 0,5 pm. A emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros de um modo preferido é constituída por uma formulação AMPHIGEN (isto é, uma formula

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26/58 ção que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80). A composição de vacina de um modo preferido também inclui uma ou mais moléculas imunoestimuladoras selecionadas de Quil-A, colesterol, DDA, GPI-100 e hidróxido de alumínio (AlOH).

[091]Ainda em outra modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma composição de vacina que inclui pelo menos um antígeno bacteriano, por exemplo, a proteína PauA recombinante de Streptococcus uberis ou uma preparação de células de E. coli ou uma associação de ambas, em uma emulsão de óleo em água. O(s) antígeno(s) é(são) combinados intrinsecamente com a emulsão de óleo em água que tem gotículas de um tamanho inferior a 1 pm, de um modo preferido com tamanho médio das gotículas inferior a 0,8 pm, de um modo mais preferido inferior a 0,5 pm e de um modo ainda mais preferido com um tamanho médio das gotículas de cerca de 0,25 pm. A emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros de um modo preferido é constituída por uma formulação AMPHIGEN® (isto é, uma formulação que contém óleo mineral leve, lecitina, TWEEN® 80 e SPAN® 80). A composição de vacina de um modo preferido também inclui uma ou mais moléculas imunoestimuladoras selecionadas de Quil A, DDA e GPI-100.

[092]As composições de vacina da presente invenção podem ser administradas a um animal por vias conhecidas, incluindo a via oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica e parenteral (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea ou intramuscular). A administração pode ser realizada utilizando uma combinação de vias, por exemplo, a primeira administração utilizando uma via parenteral e a administração subsequente utilizando uma via mucosa.

Métodos de preparação de composições de vacina [093]Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona métodos de preparação de composições de vacina contendo um antígeno ou antígenos e uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros.

[094]Na preparação de composições de vacina da presente invenção, o(s)

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27/58 antígeno(s) pode(m) ser combinado quer intrinsecamente quer extrinsecamente com os componentes da emulsão de óleo em água. De um modo preferido, o antígeno está combinado com os componentes da emulsão de óleo em água intrinsecamente.

[095]O antígeno pode ser combinado com os vários componentes da emulsão, incluindo. óleo, um ou mais tensoativos, um componente aquoso e qualquer outro componente apropriado, para formar uma mistura. A mistura é submetida a um processo de mistura primário, tipicamente por passagem de uma ou mais vezes através de um ou mais homogeneizadores ou emulsificadores, para formar uma emulsão de óleo em água contendo o antígeno. Para este fim pode ser utilizado qualquer homogeneizador ou emulsificador disponível comercialmente, por exemplo, emulsificador Ross (Hauppauge, NY), homogeneizador Gaulin (Everett, MA) ou Microfluidics (Newton, MA). Alternativamente, os vários componentes da emulsão adjuvante, incluindo óleo, um ou mais tensoativos e um componente aquoso, podem ser combinados primeiro para formar uma emulsão de óleo em água por utilização de um homogeneizador ou emulsificador; e o antígeno é então adicionado a esta emulsão. O tamanho médio das gotículas da emulsão de óleo em água após a mistura primária é de aproximadamente 1,0 - 1,2 micrômetros.

[096]A emulsão contendo o antígeno é então submetida a microfluidização para que o tamanho das gotículas fique na faixa dos submicrômetros. A microfluidização pode ser realizada por utilização de um microfluidizador comercial, tal como o modelo número 11OY disponível de Microfluidics, Newton, Mass; o modelo 30 CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); e Rainnie Minilab tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy, Inc., Hudson, Wis.).

[097]O tamanho das gotículas pode ser determinado por diversos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, difração de lasers, por utilização de instrumentos de medição de tamanhos disponíveis comercialmente. O tamanho pode variar dependendo do tipo de tensoativo utilizado, da proporção de tensoativo para óleo,

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28/58 da pressão de trabalho, da temperatura e outros semelhantes. Pode determinar-se a combinação desejada destes parâmetros para obter emulsões com o tamanho de gotícula desejado.

[098]As gotículas das emulsões da presente invenção são inferiores a 1 pm de diâmetro. De um modo preferido o tamanho médio das gotículas é inferior a 0,8 pm. De um modo mais preferido o tamanho médio das gotículas é inferior a 0,5 pm. De um modo ainda mais preferido, o tamanho médio das gotículas é de cerca de 0,1 a 0,3 pm.

[099]Em uma modalidade preferida da presente invenção, a solução oleosa de lecitina DRAKEOL®, que contém 25% de lecitina em óleo mineral leve, é combinada e misturada com tensoativos TWEEN® 80 e SPAN® 80 e solução de soro fisiológico para formar uma mistura que contém 40% de óleo mineral leve, lecitina, 0,18% de TWEEN® 80 e 0.08% de SPAN® 80. A mistura é então emulsificada com um emulsificador Ross® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3.400 rpm para formar um produto em emulsão, que também é referido como uma formulação AMPHIGEN® ou solução AMPHIGEN®. Subsequentemente, o(s) antígeno(s) desejado^) é(são) combinado(s) com a solução AMPHIGEN® e quaisquer outros componentes apropriados (por exemplo, moléculas imunoestimuladoras) com a ajuda de um emulsificador, por exemplo, homogeneizador Ross, para formar uma emulsão de óleo em água contendo o(s) antígeno(s). Essa emulsão é passada uma vez através de um microfluidizador operando a cerca de 703 ± 35 kg/cm² (10.000 ± 500 psi). A emulsão de óleo em água microfluidizada tem gotículas de um tamanho inferior a 1 pm, com o tamanho médio das gotículas de cerca de 0,25 pm.

Composições de vacina contendo antígenos micro-encapsulados em uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros e métodos de preparação [0100]Ainda em outra modalidade, a presente invenção proporciona composições de vacina que contêm um antígeno encapsulado em micropartículas (ou antígeno microencapsulado), em que o antígeno microencapsulado é incorporado exPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 35/72

29/58 trinsecamente em uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros aqui descrita acima.

[0101]Os métodos para absorção ou retenção de antígenos em veículos em partículas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masatoshi Chiba e Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. Em: Vaccine design. The subunit e adjuvant approach. Eds. Michael F. Powell e Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, New York and London). Os veículos em partículas podem apresentar cópias múltiplas de um antígeno selecionado para o sistema imune em um indivíduo animal e promover a captura e retenção de antígenos em nódulos linfáticos locais. As partículas podem ser fagocitadas por macrófagos e podem aumentar a apresentação de antígeno através da liberação de citoquinas. Os veículos em partículas também foram descritos na técnica e incluem, por exemplo, os derivados de polímeros de poli(metacrilato de metilo), bem como os derivados de poli(lactidos) e poli(lactido-co-glicolidos), conhecidos como PLG. Os polímeros de poli(metacrilato de metilo) são não biodegradáveis enquanto que as partículas de PLG podem ser biodegradadas por hidrólise não enzimática aleatória de ligações éster a ácidos lático e glicólico que são excretados por vias metabólicas normais.

[0102]As microesferas biodegradáveis também foram utilizadas para conseguir liberação controlada de vacinas. Por exemplo, pode conseguir-se uma liberação contínua de antígeno durante um período de tempo prolongado. Dependendo do peso molecular do polímero e da proporção de ácido lático para glicólico no polímero, um polímero PLGA pode ter uma taxa de hidrólise desde alguns dias ou semanas até vários meses ou um ano. Uma liberação lenta e controlada pode resultar na formação de altos níveis de anticorpos semelhantes aos observados após injeções múltiplas. Alternativamente, uma liberação pulsada de antígenos de vacina pode ser conseguida por seleção de polímeros com diferentes taxas de hidrólise. A taxa de hidrólise de um polímero tipicamente depende do peso molecular do polímero e da

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30/58 proporção de ácido lático para glicólico no polímero. As micropartículas feitas a partir de dois ou mais polímeros diferentes com taxas variáveis de liberação de antígeno proporcionam libertações pulsadas de antígenos e imitam os regimes de vacinação de doses múltiplas.

[0103]De acordo com a presente invenção, um antígeno, incluindo qualquer dos aqui descritos acima, pode ser absorvido em um veículo de polímero em partículas, de um modo preferido um polímero PLG, por utilização de qualquer procedimento conhecido na técnica (tal como o exemplificado no Exemplo 17), para formar uma preparação de antígeno microencapsulado. A preparação de antígeno microencapsulado é então misturada e dispersada em uma emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros, emulsão essa que aqui foi descrita acima, para formar a composição de vacina.

[0104]Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma composição de vacina que contém um antígeno encapsulado em um polímero PLG, em que o antígeno microencapsulado está dispersado extrinsecamente em uma emulsão de óleo em água microfluidizada que é constituída por óleo mineral leve, lecitina, TWEEN 80, SPAN 80 e soro fisiológico, e tem um tamanho médio das gotículas inferior a 1,0 pm.

[0105]Adiante são apresentados exemplos de modalidades específicas para realização da presente invenção. Os exemplos são apresentados apenas a título ilustrativo e não têm a intenção de limitar por qualquer forma o âmbito da presente invenção.

EXEMPLO 1

Preparação de uma formulação AMPHIGEN® [0106]Preparou-se uma formulação AMPHIGEN® em um processo em dois passos. No primeiro passo, misturaram-se 80 litros de solução oleosa de lecitina Drakeol, 116 litros de solução de soro fisiológico de toxóide do tétano, 1,2 litros de SPAN 80 e 2,8 litros de Tween 80 e emulsificou-se utilizando um emulsificador

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Ross. A solução oleosa de lecitina Drakeol continha 25% de lecitina de soja e 75% de óleo mineral. O produto emulsificado foi recirculado através do emulsificador Ross durante um mínimo de 5 volumes ou um mínimo de 10 minutos. O produto emulsificado foi armazenado a 2 - 7 °C durante um máximo de 24 horas para processamento adicional. A emulsão do tanque do emulsificador Ross foi transferida para um homogeneizador Gaulin e foi homogeneizada durante 20 minutos sob uma pressão de 316 kg/cm² (4.500 psi). A solução oleosa de lecitina Drakeol a 40% resultante (daqui em diante a formulação AMPHIGEN® ou solução AMPHIGEN®) foi então distribuída por recipientes de polipropileno carbóxi estéreis. A distribuição foi realizada dentro de uma coifa de distribuição de classe 100 localizada em um ambiente controlado de classe 10.000. Os recipientes foram armazenados a 2 - 7 °C. Esta formulação ANPHIGEN® foi utilizada nas experiências aqui descritas adiante salvo indicação em contrário.

EXEMPLO 2

Mistura primária por homogeneização de pó em líquido da vacina de BVD [0107]O aparelho utilizado para este processo de homogeneização está ilustrado na Figura 1. Utilizando técnica asséptica ou válvulas cruzadas de vapor, um frasco contendo um antígeno de BVD de tipo I (uma preparação viral de BVD de tipo I inativada) foi fixado à saída lateral inferior do reator de mistura. Depois de a transferência do volume necessário do antígeno de BVD de tipo I estar completada, o frasco de BVD de tipo I foi substituído pelo frasco contendo uma preparação viral de BVD de tipo II inativada (uma preparação viral de BVD de tipo II inativada). Depois de a transferência do volume necessário do antígeno de BVD de tipo II estar completada, o homogeneizador Ross foi ligado ao reator portátil e a recirculação foi iniciada nas RPM máximas (3.300 rpm). A agitação no reator foi mantida a velocidade média.

[0108]Utilizando técnica asséptica ou válvulas cruzadas de vapor, um frasco contendo Quil-A a 50 mg/mL de concentração foi ligado à porta em linha do homoPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 38/72

32/58 geneizador no reator de mistura. Uma quantidade necessária da solução de Quil-A foi passada para reator através da linha de sucção. Depois de a transferência da solução de Quil-A estar completada, o frasco foi retirado. Do mesmo modo, uma quantidade necessária de solução de colesterol em etanol (18 mg/mL) foi transferida para o reator de mistura. Subsequentemente, uma quantidade necessária das soluções expansoras formulação AMPHIGEN®, solução de timerosol a 10% e meio de Eagle modificado básico (BME) foram adicionadas ao reator de mistura.

[0109]Uma vez completadas todas as adições, a mistura foi continuada durante mais 15 minutos. A formulação resultante foi dividida em doses de 2 mL e representou uma vacina de BDV à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizada. Cada dose da vacina continha 500 qg de Quil-A, 500 qg de colesterol, 2,5% de formulação AMPHIGEN® e 0,009% de timerosol. A concentração de antígeno para as duas estirpes de BVD foi determinada em termos do título ELISA para gp53.

EXEMPLO 3

Mistura secundária por microfluidização [0110]A Figura 2 ilustra o processo utilizado para a mistura secundária por microfluidização. O microfluidizador foi esterilizado com vapor. Primeiro instalou-se na unidade a câmara modular de processamento auxiliar e a câmara em branco foi instalada na segunda posição da câmara. O reator contendo a vacina de BDV completamente adjuvantada preparada como descrito no Exemplo 2 foi ligada ao microfluidizador ligando uma linha de transferência da válvula de descarga do reator de alimentação à entrada do microfluidizador. Ligou-se nitrogênio gasoso à entrada do filtro de ar do reator de alimentação e a regulação da pressão do reator foi ajustada para 1,4 ± 0,35 kg/cm² (20 ± 5 psi). A válvula de drenagem do reator de recolha foi ligada à linha de transferência da saída do microfluidizador. Depois de feitas todas as ligações, as válvulas foram abertas e a microfluidização foi iniciada a uma pressão de trabalho de 703 ± 35 kg/cm² (10.000 ± 500 psi). Todo o conteúdo da vacina foi passado através do microfluidizador uma vez e foi recolhido na câmara de pós

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33/58 microfluidização. Esta preparação foi distribuída em doses de 2 mL doses e representa a vacina de BDV à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada.

EXEMPLO 4

Preparação de uma composição de vacina por mistura em bancada [0111]A formulação AMPHIGEN® preparada como descrito no Exemplo 1 foi diluída para 2,5% com a adição de antígenos de BVD e o expansor. A solução resultante foi misturada em bancada utilizando uma barra de agitação em vez de se utilizar um homogeneizador. A preparação final continha a seguinte composição: antígenos de BVD de tipo 1 e tipo 2, 2,5% de formulação AMPHIGEN® (que contém óleo, lecitina, SPAN® e TWEEN®, como descrito no Exemplo 1) e soro fisiológico. O TWEEN 80 e SPAN 80 estão presentes na preparação de vacina final a 0,18% e 0,08% em volume, respectivamente.

EXEMPLO 5 [0112]Comparação da distribuição do tamanho das partículas entre as preparações de vacina à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizada e microfluidizada [0113]Utilizaram-se a vacina à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 2, a vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 3 e a preparação feita por mistura em bancada como descrito no Exemplo 4, para comparar o tamanho das gotículas das preparações de vacina. Dois mililitros de amostra de cada uma das preparações foram adicionados a um difratômetro de lasers Malvern 2000 e determinou-se a distribuição do tamanho das gotículas. Como ilustrado na Figura 3, os resultados indicam que a preparação de vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada tinha um volume de partículas máximo de cerca de 0,1 micrômetros enquanto que a preparação de vacina à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizada tinha uma distribuição volume de partículas máximo de cerca de 1 micrômetro.

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EXEMPLO 6

Redução da separação de fases da vacina [0114]Compararam-se três preparações de vacina: a vacina à base de formulação AMPHIGEN® não microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 2, a vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada preparada como descrito no Exemplo 3 e a vacina preparada por mistura em bancada como descrito no Exemplo 4, lado a lado, para determinar as suas propriedades de separação de fases por armazenagem prolongada. Todas estas preparações foram deixadas em repouso a 4 °C durante cerca de um mês e a separação de fases foi monitorizada em termos do aspecto de uma camada cremosa no topo das preparações de vacina. Como ilustrado na Figura 4, não houve separação de fases na preparação à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada em comparação com as outras duas preparações.

EXEMPLO 7

Preparação de vacina microfluidizada e não microfluidizada para gado contra o vírus da diarréia viral dos bovinos [0115]O antígeno do vírus da diarréia viral dos bovinos foi incorporado intrinsecamente na formulação AMPHIGEN^® por microfluidização. O termo incorporado intrinsecamente refere-se a um processo pelo qual o antígeno foi adicionado à formulação AMPHIGEN^® antes da microfluidização. O antígeno foi submetido às forças físicas do processo de microfluidização juntamente com os componentes da formulação de adjuvante. No grupo de controle não microfluidizado, a preparação de antígeno foi dispersada na formulação AMPHIGEN® por mistura.

[0116]A composição final das preparações de controle e microfluidizada eram as seguintes: BVD de tipo I com um título ELISA pós-inativação de 2.535 RU/dose para gp53, BVD de tipo II com um título ELISA pós-inativação de 3.290 RU/dose para gp53, Quil-A na concentração de 1,25 mg/dose, colesterol na concentração de 1,25 mg/dose, a formulação AMPHIGEN® na concentração final de 2,5%

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35/58 e timerosol na concentração final de 0,009%. A dose de vacina era de 5 mL.

EXEMPLO 8 [0117]Estabilidade a longo prazo de antígenos virais de BVD incorporados intrinsecamente na preparação de vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada [0118]Esta experiência foi realizada para determinar a estabilidade do antígeno incorporado intrinsecamente durante a armazenagem a longo prazo. Antígeno viral de BVD de tipo II morto foi incorporado intrinsecamente na formulação AMPHIGEN^® durante o processo de microfluidização para se obter a preparação de vacina microfluidizada (A907505). Três outras preparações de vacina contendo o mesmo antígeno em formulação AMPHIGEN® não microfluidizadas (A904369, A904370 e A904371) serviram como controlo. Nas preparações não microfluidizadas, o antígeno foi misturado com a formulação AMPHIGEN® e misturado utilizando um homogeneizador Ross. As quatro preparações de vacina foram armazenadas a 4 °C durante dois anos. Em diferentes momentos durante a armazenagem (0, 6, 12 ou 24meses), utilizaram-se as quatro formulações para vacinar vacas de três meses.

[0119]Aos dias 0 e 21, vacinaram-se vacas de três meses por via subcutânea com 2 mL de formulação de vacina. O plasma dos animais vacinados foi recolhido ao dia 35 e a resposta sorológica à vacina foi determinada em termos do título do anticorpo por ELISA BVDV-E2. Como ilustrado na Figura 5, a preparação de vacina microfluidizada apresentou um título de anticorpos mais elevado em todos os pontos de tempo testados (0, 6, 12 e 24 meses), sugerindo que a estabilidade da preparação do antígeno não é perdida durante a incorporação intrínseca do antígeno durante o processo de microfluidização. Além disso, também se verificou surpreendentemente que a preparação de vacina microfluidizada induzia uma resposta imune aumentada em todos os pontos de tempo.

EXEMPLO 9

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Redução do aumento da temperatura retal induzido pela vacina após microfluidização [0120]As preparações de vacina microfluidizadas e não microfluidizadas preparadas como descrito no Exemplo 7 foram utilizadas para vacinar o gado ao dia zero e a temperatura retal foi monitorizada durante o período desde um dia antes da vacinação até quatro dias após a vacinação. A dose de vacina era de 2 mL. Os grupos foram vacinados ou com uma dose simples ou dupla da vacina. As temperaturas retais foram medidas e registadas diariamente no Dia 1 até ao Dia 4, inclusivé. As temperaturas retais no dia 0 foram medidas antes da administração do produto de teste.

[0121]Como ilustrado na Figura 6, os resultados indicam que há um aumento abrupto da temperatura retal em cerca de 24 horas após a vacinação nos animais vacinados com uma dose simples ou dupla da formulação de vacina não microfluidizada. Contudo, nos animais vacinados com formas de vacina microfluidizadas, o aumento de temperatura retal após a vacinação era apenas mínimo e significativamente menor do que nos animais vacinados com a formulação não microfluidizada (Figura 6).

EXEMPLO 10 [0122]O volume da reação no sítio de injeção foi resolvido mais depressa quando vacinado com formulações de vacina microfluidizadas [0123]As preparações de vacina microfluidizadas e não microfluidizadas preparadas como descrito no Exemplo 7 foram utilizadas para vacinar gado no dia zero. Os animais incluídos neste estudo eram gado bovino de cruzamento para produção de carne. Havia três animais em cada um dos grupos de tratamento com placebo (T01 e T02). Havia seis animais em cada um dos grupos T03 a T06. A dose de vacina era de 2 mL e os grupos foram vacinas com uma dose ou com duas doses da vacina no dia zero. No dia 0, o produto de teste foi administrado do lado direito do pescoço. Os animais que receberam a dose dupla (4 mL) do produto de teste

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37/58 (T02, T04 e T06) receberam a dose dupla completa como uma única injeção de um lado. A observação dos sítios de injeção, incluindo a estimativa do tamanho da reação no sítio de injeção foram feitas do lado direito do pescoço no Dia 0 até ao Dia 4, inclusivé, e nos dias 6, 9 e 14. No Dia 0 os sítios de injeção foram observados antes da administração dos produtos de teste. Os grupos vacinados com uma ou duas doses do placebo não apresentaram qualquer aumento significativo de volume de reação no sítio de injeção e, portanto esses dados não estão apresentados na Figura 7. No caso da formulação de vacina não microfluidizada, houve um aumento proporcional do volume de reação no sítio de injeção entre a vacinação com uma dose e com duas doses. Por outro lado, no caso da formulação de vacina microfluidizada, embora a dose simples induzisse um maior volume de reação no sítio de injeção, a injeção com a segunda dose não provocou qualquer aumento adicional. Além disso, no caso dos animais injetados com formulação de vacina microfluidizada, o volume de reação no sítio de injeção foi resolvido mais rapidamente em comparação com o de animais injetados com uma formulação de vacina não microfluidizada. Estes resultados estão apresentados na Figura 7.

EXEMPLO 11 [0124]Preparação de preparações de vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada com antígenos de BDV viral e de Leptospira incorporados intrinsecamente e moléculas imunoestimuladores tais como Quil A e DDA [0125]Leptospira hardjo-bovis cepa CSL inativada com formol foi formulada no adjuvante apropriado a contagens diretas de cerca de 1,4 x10⁹ organismos/dose de 5 mL. Leptospira Pomona cepa T262 inativada com formol foi formulada a cerca de 2.400 unidades nefelométricas/dose de 5 mL. As unidades nefelométricas foram calculadas com base na medição nefelométrica do fluido de fermentação préprocessado. O vírus de BVD de tipo 1 foi formulado a um título de E2 Elisa de cerca de 3.000 unidades relativas/dose de 5 mL. O vírus de BVD de tipo 2 foi formulado a um título de E2 Elisa de cerca de 3.500 unidades relativas/dose de 5 mL. As unida

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38/58 des relativas foram calculadas com base no título por E2 ELISA de fluido em volume pós-inativação e pré-associação. Tanto Quil-A como colesterol foram utilizados na concentração de 0,5 mg por dose. Timerosol e a formulação AMPHIGEN® foram utilizados na concentração final de 0,009% e 2,5%, respectivamente. Utilizou-se hidróxido de alumínio (Rehydragel LV) na concentração final de 2,0%. Quando se utilizou DDA como um imunomodulador, o DDA foi incluído na formulação AMPHIGEN®. A formulação AMPHIGEN® (isto é, a solução mãe de lecitina a 40% Drakeol) continha 1,6 mg/mL de DDA e, quando diluída apropriadamente, a preparação final de vacina continha 2,5% de formulação AMPHIGEN^® e 0,1 mg/mL de DDA.

[0126]Na preparação de diferentes formulações de vacina, as frações de BVD, Leptos, Quil-A, colesterol, timerosol, a formulação AMPHIGEN® e soro fisiológico como expansor foram adicionados a um homogeneizador Silverson e misturados durante 15 minutos a 10.000 ± 500 RPM. Os componentes foram então microfluidizados através de um crivo de 200 micrômetros a 703 kg/cm² (10.000 psi).

[0127]Quando a formulação de vacina continha hidróxido de alumínio, a microfluidização foi realizada sem hidróxido de alumínio. Depois de completada a microfluidização, adicionou-se hidróxido de alumínio e misturou-se uma barra de agitação de um dia para o outro a 4 °C.

EXEMPLO 12

Preparação de vacina de viral de BVD para estudos de desafio [0128]A preparação de vacina utilizada nesta experiência continha antígenos tanto de vírus BVD de tipo 1 como de vírus BVD de tipo 2. Utilizou-se o antígeno BVD1-5960 no título ELISA pós-inativação de 2.535 UR/dose para gp53. Utilizou-se antígeno BVD2-890 no título ELISA pós-inativação de 3.290 UR/dose para gp53. Utilizou-se Quil A e colesterol na concentração de 0,5 mg/mL. Utilizou-se timerosol e a formulação AMPHIGEN® na concentração final de 0,009% e 2,5%, respectivamente. Quando DDA foi utilizado como modulador imune, o DDA foi incluído na for

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39/58 mulação AMPHIGEN®. A solução mãe de AMPHIGEN® (solução de lecitina a 40% Drakeol) continha quantidades variáveis de DDA e quando diluída apropriadamente, a preparação de vacina final continha 2,5% de formulação AMPHIGEN® e uma concentração de DDA na gama de 0,5 mg/dose até 2,0 mg/dose. Utilizou-se gel de alumínio (Rehydragel-LV) na concentração final de 2%. Utilizou-se GPI-0100 na gama de 2,3 e 5 mg/dose.

[0129]Todos os componentes foram adicionados a um homogeneizador Silverson e misturados durante 15 minutos a 10.500 rpm e depois microfluidizados por passagem através de uma câmara de 200 micrômetros com 703 kg/cm² (10.000 psi). Quando a preparação de vacina continha hidróxido de alumínio, a microfluidização foi realizada sem hidróxido de alumínio. Depois de completada a microfluidização, adicionou-se hidróxido de alumínio e misturou-se com uma barra de agitação de um dia para o outro a 4°C.

EXEMPLO 13 [0130]Proteção contra desafio com Leptospira após vacinação com uma formulação de vacina Amphigen microfluidizada com antígenos de Leptospira

Tabela 1 - Grupos de tratamento

Grupo de tratamento	Composição do adjuvante
T01	Soro fisiológico
T02	Quil-A, colesterol e formulação AMPHIGEN® ^(QAC)
T03	Quil-A, colesterol, formulação AMPHIGEN® e AlOH (QAC- AlOH)
T04	DDA, colesterol e formulação AMPHIGEN® ^(DDA)
T05	DDA, colesterol, formulação AMPHIGEN^® e AlOH (DDA- AlOH)

[0131]A Tabela 1 mostra a composição das formulações de adjuvante nas preparações de vacina testadas neste estudo. As preparações de vacina foram prePetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 46/72

40/58 paradas como descrito no Exemplo 11. Havia seis animais em cada grupo. Neste estudo foram utilizadas vitelas de produção de carne com cerca de sete meses de idade. A vacinação foi feita ao dia 0 e ao dia 21 por via subcutânea com um volume de 5 mL de vacina. O desafio foi realizado com L. hardjo-bovis cepa 203 de NADC (National Agricultural Disease Center). O desafio foi realizado durante os dias 57 59 com 1 mL de inóculo. O desafio foi administrado na conjuntiva do olho e vaginalmente. O material de desafio continha 5,0 x 10⁶ leptospiras/mL. A urina foi colhida semanalmente para lepto cultura, FA e PCR. A colheita dos rins foi feita durante os dias 112 e 113.

Tabela 2 - Resultados do estudo de desafio com Leptospira

Tratamento	Percentagem de vitelas positivas para Leptospira em urina e rim por cultura	Percentagem de vitelas positivas para Leptospira em urina e rim por FA	Percentagem de vitelas positivas para Leptospira em urina e rim por PCR	Percentagem de vitelas positivas para Leptospira em urina e rim por todos os ensaios
Soro fisiológico	100	83,3	83,3	100
QAC	0	0	0	0
QAC/AlOH	0	50,0	0	50,0
DDA	0	0	0	0
DDA/AlOH	0	33,3	16,7	50,0

[0132]A Tabela 2 mostra os dados do estudo de desafio com Leptospira. Na determinação da percentagem de infeção por Leptospira no animal desafiado, utilizou-se os seguintes critérios. Se a cultura de rim era positiva para uma só amostra, o animal é considerado como sendo positivo para Leptospira. Se o animal é positivo só em uma amostra para FA ou PCR, o animal é considerado como sendo negativo.

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Se a amostra é positiva para FA e PCR em uma só amostra, é considerado positivo para Leptospira.

[0133]Os resultados apresentados na Tabela 2 indicam que houve uma duração significativamente mais curta de eliminação urinária em todos os grupos de vacina com base nos três ensaios. No que se refere à colonização urinária e dos rins, as eficácias das formulações contendo QAC e DDA sem AlOH eram comparáveis. O AlOH não melhorou e até reduziu as eficácias das vacinas contendo QAC ou DDA neste estudo de desafio.

Tabela 3 - Faixa de títulos de aglutinação microscópica no dia do pico da média geométrica do título antes do desafio (dia 35)

Tratamento	L. Hardjo	L. pomona
Soro fisiológico	< 20	< 20
QAC	160 - 640	1.280 - 10.240
QAC/AlOH	160 - 2.560	8 - 10.240
DDA	40 - 1.280	320 - 2.560
DDA/AlOH	320 - 640	1.280 - 5.120

[0134]As respostas sorológicas contra ambos os antígenos de Leptospira na formulação de vacina foram detectados no animal vacinado e a resposta de pico foi observada ao dia 35. Não havia correlação entre a resposta sorológica e a proteção contra o desafio. A presença de gel de alumínio na formulação de vacina reduziu o nível de proteção embora a resposta sorológica fosse aumentada pela presença de gel de alumínio na vacina.

EXEMPLO 14 [0135]Produção de resposta imune ao antígeno do vírus de BVD e proteção contra o desafio com vírus de BVD de tipo 2 após imunização com uma preparação de vacina microfluidizada contendo formulação AMPHIGEN^® e DDA [0136]Nesta experiência utilizaram-se quatro vitelos soronegativos com sete meses de idade. Havia seis grupos diferentes e cada grupo tinha dez animais (Ta

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42/58 bela 4). No dia 0 e dia 21 cada animal recebeu uma dose subcutânea de 2 mL de vacina ou de placebo na parte lateral do pescoço aproximadamente a meio caminho entre a omoplata e a cabeça.

Tabela 4 - Grupos de tratamento

Tratamento	Composição do adjuvante
T01	Soro fisiológico
T02	Quil-A, formulação AMPHIGEN® e colesterol
T03	formulação AMPHIGEN®, colesterol, DDA (0,5 mg/ dose) e AlOH
T04	formulação AMPHIGEN®, colesterol, DDA (0,5 mg/ dose)
T05	formulação AMPHIGEN®, colesterol, DDA (1,0 mg/ dose)
T06	formulação AMPHIGEN®, colesterol, DDA (2,0 mg/ dose)

[0137]Administrou-se intranasalmente uma dose de 5 mL da preparação do vírus de desafio (aproximadamente 2,5 mL por narina) no dia 44 do estudo. Utilizouse isolado 24515 (cepa Ellis) de vírus BVD de tipo 2 não citopático, lote n° 46325-70 neste estudo como a cepa de desafio. As amostras retidas do material de desafio foram tituladas (duas réplicas por titulação) no momento do início do desafio e imediatamente depois de completada. O título médio do vírus vivo por dose de 5 mL era de 5,3 log₁₀ FAID50/5 mL antes do desafio e 5,4 log₁₀ FAID50/5 mL pós desafio (FAID é equivalente a TICD50).

[0138]Os animais foram monitorizados diariamente desde o dia -3 até ao dia 58. Foram atribuídas pontuações da doença clínica de 0, 1, 2 ou 3 com base em sinais clínicos atribuíveis a infeção por BDV 2 para cada animal nos dias 42 a 58. As pontuações no dia 44 foram registadas antes do desafio. Recolheram-se amostras de sangue (dois tubos de separação de plasma de 13 mL, SST) de cada animal nos dias 0, 21, 35, 44 e 58 para determinação dos títulos de anticorpos de neutralização de vírus BVD de tipo 1 e BVD de tipo 2 no plasma.

[0139]Recolheram-se amostras de sangue de cada animal nos dias 42 até

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43/58 ao dia 58, inclusive, e determinou-se a presença de vírus nas células da camada leuco-plaquetária. No dia 44, obtiveram-se amostras antes do desafio.

[0140]Para determinação das contagens de glóbulos brancos, colheram-se amostras de sangue (um tubo de 4 mL com EDTA) de cada animal no dia 42 até ao dia 58, inclusive. No dia 44, as amostras foram obtidas antes do desafio.

[0141]Leucopenia foi definida como um decréscimo de 40% ou mais da contagem de glóbulos brancos em relação à linha de base (média das contagens de glóbulos brancos pré-desafio de dois dias antes do e do dia do desafio).

[0142]Foram utilizadas pontuações clínicas da doença para definir o estado da doença como se segue: se a pontuação for 1, então não é doença; se a pontuação for >2, então há doença.

[0143]Como apresentado nas Tabelas 5 e 6, os grupos vacinados com vacinas contendo antígenos de vírus BVD juntamente com a formulação AMPHIGEN^®, Quil A ou DDA e microfluidizadas, sero converteram com títulos de neutralização de vírus no plasma para ambos os vírus BVD de tipo 1 e BVD de tipo 2. Nesses grupos houve também uma redução significativa na percentagem de animais apresentando viremia após o desafio, enquanto que no grupo de controle 100% dos animais estavam virêmicos (Tabela 7). Além disso, nesses grupos vacinados a frequência da doença também estava reduzida significativamente (Tabela 8). Analogamente, a percentagem de animais apresentando leucopenia também estava reduzida nos grupos de vacina e a redução da leucopenia era mais significativa no grupo contendo DDA do que no grupo contendo Quil A (Tabela 9). No grupo de controle havia uma queda significativa no ganho de peso em comparação com os grupos vacinados (Tabela 10).

Sorologia [0144]Antes da vacinação no dia 0, todos os animais do estudo estavam soronegativos (SVN < 1:2) para anticorpos contra vírus BVD dos tipos 1 e 2 (dados não apresentados). Catorze dias após a segunda vacinação (dia 35), todos os aniPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 50/72

44/58 mais a quem foi administrado o placebo (T01) permaneciam soronegativos para anticorpos dos vírus BVD de tipos 1 e 2; e todos os animais vacinados com os ITAs (Antígeno de Teste em Investigação) (T02, T03, T04, T05 e T06) eram soropositivos (SVN> 1:8) quanto a anticorpos de vírus BVD de tipos 1 e 2. Um animal a quem foi administrado o adjuvante da vacina com a formulação AMPHIGEN® a 2 mg/dose de DDA tinha um título SVN de 3 para anticorpos do vírus BVD de tipo 2 no dia 35 (Tabela 11 e 12).

[0145]Antes do desafio no dia 44, todos os controlos (T01), exceto um, estavam soronegativos (SVN < 1:2) para anticorpos do vírus BVD dos tipos 1 e 2 (dados não apresentados). O único controle (n°2497) estava soropositivo (SVN = 10) para anticorpos do vírus BVD de tipo 1 e soro negativo anticorpos do vírus BVD de tipo 2. Catorze dias após o desafio, todos os animais do estudo estavam soropositivos quanto a anticorpos do vírus BVD dos tipos 1 e 2.

Tabela 5. Vírus BVD de tipo 1 - Média geométrica dos títulos de soroneutralização do vírus

	Vírus BVD de tipo 1 - Média geométrica dos títulos SVN no dia do estudo
Tratamento	0	21	35	44	58
T01	Soro fisiológico	< 2	< 2	< 2	< 2	23,9
T02	Amphigen, Quil A	< 2	39,1	19824,5	14018,2	27554,5
T03	Amphigen 0,5 mg de DDA, Al	< 2	51,8	32204,8	22381,1	23170,4
T04	Amphigen, 0,5 mg de DDA	< 2	27,0	14512,4	8932,0	21996,2
T05	Amphigen,1,0 mg de DDA	< 2	26,7	11585,2	8194,6	20882,0

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45/58

T06	Amphigen, 2,0 mg	< 2	23,5	8778,7	6769,3	16961,1
	de DDA

Tabela 6. Vírus BVD de tipo 2 - Média geométrica dos títulos de soroneutralização do vírus

Tratamento	Vírus BVD de tipo 2 - Média geométrica dos títulos SVN no dia do estudo
0	21	35	44	58
T01	Soro fisiológico	< 2	< 2	< 2	< 2	522,0
T02	Amphigen, Quil A	< 2	8,9	2272,4	2048,2	24833,6
T03	Amphigen 0,5 mg de DDA, Al	< 2	9,5	3565,7	2702,2	20881,8
T04	Amphigen, 0,5 mg de DDA	< 2	4,1	1260,7	989,1	18496,2
T05	Amphigen,1,0 mg de DDA	< 2	6,4	1398,8	1453,9	30047,8
T06	Amphigen, 2,0 mg de DDA	< 2	7,7	1673,2	1428,9	16384,0

Tabela 7. Isolamento do vírus BVD após o desafio

		Isolamento do vírus BVD
Tratamento	Nos dias do estudo	Frequência (%) de animais virêmicos	Média pelos mínimos quadrados dos dias com viremia
T01	Soro fisiológico	47 a 58	10/10 (100,0)	10,4
T02	Amphigen, Quil A	50 a 53	1/10 (10,0)	0,4

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46/58

T03	Amphigen 0,5 mg de DDA, Al	—	0/10 (0,0)	0,0
T04	Amphigen, 0,5 mg de DDA	48,50 a 52, 57	3/10 (30,0)	0,5
T05	Amphigen, 1,0 mg de DDA	49 a 51	2/10 (20,0)	0,4
T06	Amphigen, 2,0 mg de DDA	48 a 52	2/10 (20,0)	0,5

Tabela 8. Sinais clínicos de doença por BVD após desafio

Tratamento	Frequência (%) com	Frequência (%) de observações com sinal clínico de doença por BVD	Total de
	Doença	0	1	2	3	observ.
T01	Soro fisiológi-	9/10	75	63	29	1	168
	co	(90,0)	(46)	(37,5)	(17,3)	(0,6)
T02	Amphigen,	1/10	105	63	2	0	170
	Quil A	(10,0)	(61,8)	(37,1)	(1,2)	(0)
T03	Amphigen	2/10	99	67	4	0
	0,5 mg de	(20,0)	(58,2)	(39,4)	(2,4)	(0)	170
	DDA, Al
T04	Amphigen,	0/10	118	52	0	0	170
	0,5 mg de	(0,0)	(69,4)	(30,6)	(0)	(0)
	DDA

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47/58

T05	Amphigen, 1,0 mg de DDA	0/10 (0,0)	101 (59,4)	69 (40,6)	0 (0)	0 (0)	170
T06	Amphigen, 2,0 mg de DDA	0/10 (0,0)	104 (61,2)	66 (38,8)	0 (0)	0 (0)	170

Tabela 9. Leucopenia após o desafio

	Leucopenia
Tratamento	Frequência (%) de animais leucêmicos	Média pelos mínimos quadrados dos dias com leucemia
T01	Soro fisiológico	10/10 (100,0)	7,8
T02	Amphigen, Quil A	6/10 (60,0)	1,2
T03	Amphigen 0,5 mg de DDA, Al	2/10 (20,0)	0,2
T04	Amphigen, 0,5 mg de DDA	4/10 (40,0)	0,8
T05	Amphigen, 1,0 mg de DDA	3/10 (30,0)	0,9
T06	Amphigen, 2,0 mg de DDA	2/10 (30,0)	0,5

Tabela 10. Peso corporal e ganho de peso corporal durante o estudo

Tratamento	Peso corporal médio (lb) no dia do estudo	Ganho de peso
	-1	43	50	58	(b

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48/58

T01	Soro fisiológico	378,0	484,9	491,0	476,9	98,9
T02	Amphigen, Quil A	428,0	526,5	546,7	579,0	151,0
T03	Amphigen 0,5 mg de DDA, AlOH	410,5	514,4	534,2	579,0	168,5
T04	Amphigen, 0,5 mg de DDA	373,7	472,3	492,6	538,1	164,4
T05	Amphigen, 1,0 mg de DDA	358,9	451,4	478,9	507,1	148,2
T06	Amphigen, 2,0 mg de DDA	408,	513,3	533,9	560,3	151,6

Isolamento de vírus [0146]Como mostram os dados da Tabela 13, durante o período de desafio (dias 44 até 58), todos os dez animais no controle (T01) estavam virêmicos (o vírus de BVD foi isolado em um ou mais dias). No grupo a quem foi administrado ITAs, a frequência de animais virêmicos foi de um, zero, três, dois e dois em cada grupo de dez (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controle e os grupos a quem foi administrado os ITAs era estatisticamente significativa (P < 0,05). A média pelos mínimos quadrados do número de dias pelos mínimos quadrados de viremia também era significativamente maior (10,4 dias) para o controle em comparação com os grupos a quem foram administrados os ITAs (0,0 a 0,5 dias).

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49/58

Doença clínica [0147]Os animais com pontuações de sinais clínicos de 2 ou 3 foram considerados como demonstrando sinais da doença BVD. Como ilustrado na Tabela 14, a frequência de animais com sinais clínicos de doença por vírus de BVD era de nove em dez no controle (T01) e um, dois, zero, zero e zero em dez em cada um dos grupos a quem foram administrados os ITAs (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controle e os grupos a quem foram administrados ITAs era estatisticamente significativa (P < 0,05).

Leucopenia [0148]Como ilustrado na Tabela 15, durante o período de desafio (dias 44 a 58), os dez animais do controle (T01) estavam leucêmicos (redução de 40% na contagem de glóbulos brancos em relação à linha de base pré-desafio, dias 42-44). A frequência de animais com leucemia foi de seis, dois, quatro, três e dois dos dez animais em cada um dos grupos a quem foram administrados os ITAs (T02, T03, T04, T05 e T06, respectivamente). A diferença entre o controle e o grupo a quem foi administrada vacina que tinha como adjuvante formulação AMFHIGNEN® a 0,5 mg/dose e hidróxido de alumínio (T03) era estatisticamente significativa (P < 0,05). A média pelos mínimos quadrados do número de dias de leucemia era significativamente maior (7,8 dias) para o controle em comparação com os grupos a quem foram administrados os ITAs (0,2 a 1,2 dias).

EXEMPLO 15 [0149]Produção de resposta imune ao antígeno do vírus de BVD e proteção contra o desafio com vírus de BVD de tipo 2 após imunização com formulação de vacina microfluidizada contendo GPI-0100 [0150]Seguiu-se um conjunto de condições experimentais como descrito no

Exemplo 14 e fez-se uma comparação entre Quil A e GPI-0100. Como ilustrado nas

Tabelas 11 e 12, os animais vacinados com antígenos de BVD na preparação à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada contendo Quil A ou GPI-0100 tinham

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50/58 um título de anticorpos significativo tanto para o vírus BVD de tipo 1 como para o vírus BVD de tipo 2. O título de anticorpos para o vírus BVD de tipo 1 era muito mais elevado do que para o vírus BVD de tipo 2. Contudo, o desafio subsequente com vírus BVD de tipo 2 mostrou uma proteção forte e a incidência de doença foi significativamente reduzida nos vitelos vacinados com a preparação de vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizada contendo GPI-0100.

Tabela 11. Vírus BVD de tipo 1 - Média geométrica dos títulos de soroneutralização do vírus

Tratamento	Média geométrica do título SVN
0	21	35	43	57
T01	Soro fisiológico	< 2	< 2	< 2	< 2	35,5
T02	Amphigen, Quil A	< 2	98,7	20171,0	12203,4	44762,4
T03	Amphigen, 2 mg de GPI- 0100, AlOH	< 2	84,6	10998,5	7383,2	25709,2
T04	Amphigen, 2 mg de GPI- 0100	< 2	106,0	18179,2	8933,2	28526,2
T05	Amphigen, 3 mg de GPI- 0100	< 2	62,9	15024,3	8780,1	19824,4
T06	Amphigen, 5 mg de GPI- 0100	< 2	71,1	12203,3	7512,0	16670,2

Tabela 12. Vírus BVD de tipo 2 - Média geométrica dos títulos de soroneutralização do vírus________________________________________________________

Vírus BVD de tipo 2 - Média geométrica dos títulos SVN no dia do estudo

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51/58

Tratamento	0	21	35	44	58
T01	Soro fisiológico	<2	<2	<2	<2	14,7
T02	Amphigen, Quil A	<2	12,9	2312,0	1692,5	1663,4
T03	Amphigen, 2 mg de GPI-0100, AlOH	<2	13,2	1663,5	1116,8	1562,3
T04	Amphigen, 2 mg de GPI-0100	<2	20,5	2610,2	1987,2	2478,7
T05	Amphigen, 3 mg de GPI-0100	<2	11,4	1752,8	1305,2	2435,4
T06	Amphigen, 5 mg de GPI-0100	<2	12,0	3158,4	2120,2	1845,6

Tabela 13. Isolamento do vírus BVD após o desafio

Tratamento	Isolamento do vírus BVD
Frequência (%) de animais virêmicos	Média pelos mínimos quadrados dos dias com viremia
T01	Soro fisiológico	10/10 (100,0)	8,4
T02	Amphigen, Quil A	3/10 (30,0)	0,3
T03	Amphigen2 mg de GPI-0100, AlOH	0/10 (0,0)	0,0
T04	Amphigen,2 mg de GPI-0100	1/10 (10,0)	0,1
T05	Amphigen,3 mg de GPI-0100	3/10 (30,0)	0,3
T06	Amphigen,5 mg de GPI-0100	2/10 (20,0)	0,2

Tabela 14. Sinais clínicos de doença BVD após desafio

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52/58

Tratamento	Frequência (%) com doença	Frequência (%) de observações com sinal clínico de doença BVD	Total de observ.
0	1	2
T01	Soro fisio-	5/10 (50,0)	103	55	12	170
	lógico		(60,6)	(32,4)	(7,1)
T02	Amphigen,	5/10 (50,0)	115	48	7	170
	Quil A		(67,6)	(28,2)	(4,1)
T03	Amphigen,	0/10	128	42	0	170
	2 mg de	(0,0)	(75,3)	(24,7)	(0)
	GPI-0100,
	AlOH
T04	Amphigen,	0/10	124	46	0	170
	2 mg de	(0,0)	(72,9)	(27,1)	(0)
	GPI-0100
T05	Amphigen,	0/10	104	66	0	170
	3 mg de	(0,0)	(61,2)	(38,8)	(0)
	GPI-0100
T06	Amphigen,	0/10	128	42	0	170
	5 mg de	(0,0)	(75,3)	(24,7)	(0)
	GPI-0100

Tabela 15. Leucopenia após o desafio

Tratamento	Leucopenia
Frequência (%) de animais leucopênicos	Média pelos mínimos quadrados dos dias com leucopenia

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53/58

T01	Soro fisiológico	9/10 (90,0)	8,7
T02	Quil A	6/10 (60,0)	1,6
T03	2 mg de GPI-0100, AlOH	7/10 (70,0)	2,6
T04	2 mg de GPI-0100	4/10 (40,0)	1,5
T05	3 mg de GPI-0100	7/10 (70,0)	2,6
T06	5 mg de GPI-0100	8/10 (80,0)	2,9

[0151]Para concluir, a segurança de cada vacina foi demonstrada pela ausência de reações adversas ou mortalidade nos animais vacinados. A potência de cada vacina foi demonstrada por sero conversão (títulos dos anticorpos de SVN para BVD-1 e BVD-2 > 1:8) em 100% dos animais vacinados. Foi demonstrada uma resistência satisfatória ao desafio pela vacina com 2 mg GPI-0100 só como adjuvante.

EXEMPLO 16 [0152]Preparação de vacina contendo antígeno microencapsulado em emulsão de óleo em água microfluidizada [0153]Adicionaram-se três gramas de trealose (Fluka) a água para se obter uma solução mãe de trealose com 333 mg/mL. Adicionou-se antígeno PauA recombinante solubilizado em solução de SDS a 0,8% (SDS/rPauA) à solução de trealose para se obter uma concentração final de 494 pg de rPauA/mL. No passo seguinte dissolveram-se 10 gramas de ácido glicólico polilático (PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim) em 200 mL de cloreto de metileno (MeCl2). A solução de PLG/MeCl2 resultante foi combinada com a solução de SDS-rPauA/trealose preparada no primeiro passo. A solução combinada foi submetida a microfluidização utilizando um microfluidizador de Microfluidics (Modelo M110EH) e a preparação microfluidizada foi secada por atomização utilizando um atomizador Temco (Modelo SD05). O material secado por atomização foi recolhido utilizando um peneiro de 500

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54/58 micrômetros.

[0154]A concentração de rPauA neste material secado por atomização foi quantificada utilizando uma análise por transferência Western. Foi dissolvido 1,04 mg de material secado por atomização em 50 μΙ_ de acetona e centrifugados a 13.200 rpm à temperatura ambiente durante 10 minutos. O sobrenadante foi retirado. O sobrenadante e as frações sedimentadas foram secados em uma coifa de segurança bioquímica durante 2,5 horas. O sedimento foi ressuspendido em 47,43 μ_ de solução de amostra (25 μ_ de tampão de amostra + 10 μ_ de agente redutor + 65 μ_ de água). A fração de sobrenadante seca foi ressuspendida em 20 μ_ de solução de amostra. Na análise Western utilizou-se PauA purificada como padrão para quantificar o teor de rPauA do material secado por atomização.

[0155]Preparou-se uma solução mãe de manitol a 20% por dissolução de 100 gramas de manitol (Sigma) em 500 m_ de água para injeção (WFI). A solução foi aquecida a 40 °C com uma placa de aquecimento/agitação e arrefecida a 30 °C. A solução foi esterilizada por filtração através de um filtro estéril de 0,22 micrômetros (Millipore). Preparou-se uma solução de carboximetilcelulose a 2,5% dissolvendo 12,5 gramas de carboximetilcelulose (Sigma) em 500 m_ de WFI e misturou-se de um dia para o outro a 4 °C. A solução foi autoclavada a 121 °C.

[0156]O pó resultante da secagem por atomização foi reconstituído em uma solução contendo 5% de manitol, 0,3% de carboximetil celulose e 1:5.000 de timerosol. A solução final foi distribuída em frascos de 3 m_ e liofilizada utilizando um liofilizador (USIFROID). O pó liofilizado representa a rPAuA microencapsulada. O antígeno da subunidade de proteína microencapsulado é ressuspendido em 2 m_ de emulsão de óleo em água microfluidizada contendo uma formulação AMPHIGEN® (como a emulsão microfluidizada descrita no Exemplo 20) e utilizado como vacina.

EXEMPLO 17 [0157]Preparação de formulação de vacina microfluidizada contendo antíPetição 870190038647, de 24/04/2019, pág. 61/72

55/58 geno bacteriano de células intactas e antígeno de proteína recombinante em emulsão de óleo em água [0158]Prepararam-se duas preparações de vacina que continham proteína PauA recombinante de Streptococcus uberis e células bacterianas de Escherichia coli, adicionadas intrinsecamente a emulsões de óleo em água como as descritas nos Exemplos 2 e 3. O antígeno de PauA recombinante estava em uma concentração de 100 pg por dose e as células de E. coli estavam em uma contagem final de 4 x 10⁹ por dose. As composições adjuvantes em emulsão das duas formulações de vacina estão apresentadas na Tabela 16.

Tabela 16. Formulações de vacina contendo proteína recombinante e células intactas de E. coli

Tratamento	Antígeno	Adjuvante
T01	Placebo	Soro fisiológico
T02	Pau A/E. coli	SEAM-14
T03	Pau A/E. coli	2,5% de Amphigen, 0,5 mg de GPI- 0100, 0,5 mg de colesterol
T04	Pau A/E. coli	2,5% de Amphigen, 0,5 mg de brometo de dimetildioctadecil-amônio (DDA), 0,5 mg de colesterol

EXEMPLO 18 [0159]Resposta imune a vacina microfluidizada contendo os agentes rPauA e bacteriano de células intactas em emulsão de óleo em água [0160]Nesta experiência utilizaram-se vacas leiteiras maduras. Os animais estavam no final da sua primeira ou segunda lactação no momento da integração na experiência. Dois mL de cada formulação de vacina foram administrados subcutaneamente três vezes, uma vez no momento da secagem (D-0), 28 dias mais tarde (D=28) e de novo 4 a 10 dias após o parto (C+4 - C+10). A primeira e a terceira dose foram administradas no lado esquerdo do pescoço e a segunda dose foi adminis

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56/58 trada no lado direito do pescoço. Recolheu-se sangue antes de cada vacinação e aproximadamente 14 dias e 32 dias após a terceira vacinação. O título de anticorpos contra E. coli e o antígeno rPauA foram determinados por meio de ELISA. Como ilustrado na Figura 8, os resultados indicam que o título de anticorpos contra rPauA era superior no grupo vacinado com formulação de vacina contendo GPI-0100 como imunoestimulador e atingiu o pico no dia 70 pós-vacinação inicial. O título de anticorpos contra o antígeno de E. coli está apresentado na Figura 9. O título de anticorpos contra antígeno de E. coli era comparável em ambas as formulações de vacina, embora a presença de GPI-0100 como imunoestimulador induzisse a um título de anticorpos relativamente mais elevado em comparação com a formulação com DDA como imunoestimulador.

EXEMPLO 19 [0161]Análise de atividade viricida das preparações de vacina à base de formulação AMPHIGEN® microfluidizadas [0162]Para determinar se a microfluidização inativa o vírus, determinou-se a atividade viricida de três preparações de vacina à base de AMPHIGEN® microfluidizadas. As três preparações continham três vírus infecciosos diferentes de bovinos, nomeadamente o vírus do herpes bovino (BHV), o vírus da parainfluenza (PI3) e o vírus sincicial respiratório bovino (BRSV).

[0163]A detecção da atividade viricida nas três preparações de vacina foi realizada de acordo com os requisitos da USDA 9CFR.113.35.

[0164]Os resultados apresentados na Tabela 17 indicam que a microfluidização de preparações de vacina à base de formulação AMPHIGEN® não provoca qualquer inativação significativa da preparação de vacina.

Tabela 17. Análise de atividades viricidas de vacinas microfluidizadas

Série	BRSV	BHV	PI3
A	0	0,2	0
AM200	- 0,2	0	- 0,2

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AM75	0	- 0,3	- 0,3
AM75@37C	0,1	- 0,3	.0,2
B	0	- 0,1	- 0,2
BM200	0	0	- 0,2
BM75	- 0,2	- 0,5	0
BM75@37C	0,5	- 0,5	0
C	0,1	- 0,1	- 0,2
CM200	- 0,2	- 0,1	- 0,2
CM75	0,1	0,5	- 0,2
CM75@37C	0,5	0,5	-0,2

A = Colesterol adicionado a 650 mL/min

B = Colesterol adicionado a 28 mL/min

C = Colesterol adicionado a 5 mL/min

M200 = Microfluidizada com crivo de 200 micrômetros

M75 = Microfluidizada com crivo de 75 micrômetros

M75@37C = Fluidos aquecidos a 37 °C antes da microfluidização [0165]Um valor acima de 0,7 é uma indicação de efeito viricida.

EXEMPLO 20 [0166]Preparação de uma formulação AMPHIGEN^® microfluidizada [0167]Preparou-se uma formulação AMPHIGEN® por combinação da solução oleosa de lecitina DRAKEOL (óleo mineral leve com 25% de lecitina) e TWEEN 80 (com a concentração final de 0,18%) e Span 80 (com a concentração final de 0,08%) misturando durante 8-22 horas a 36±1 °C. A mistura oleosa foi então adicionada a soro fisiológico com a ajuda de um emulsificador Ross^® (Hauppauge, NY 11788) a aproximadamente 3.400 rpm. Subsequentemente a mistura foi passada uma vez através de um microfluidizador com uma câmara de interação de 200 qm a 316 ± 35 kg/cm² (4.500 ± 500 psi). A Figura 10 A e 10B mostram a estabilidade da

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58/58 formulação AMPHIGEN® microfluidizada. A distribuição do tamanho das partículas, determinada por difração de laser, no ponto de partida inicial (Figura 10A) era praticamente idêntica à distribuição do tamanho das partículas após armazenagem durante 22 meses a 4 °C (Figura 10B).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de preparação de uma emulsão de óleo em água microfluidizada na faixa dos submicrômetros com um tamanho médio de gotícula de óleo inferior a 0,5 pm, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) preparar uma mistura através da combinação de um óleo não metabolizável de hidrocarbonetos leves, um tensoativo e um componente aquoso;

(b) submeter a referida mistura a um processo de emulsificação primário para produzir uma emulsão de óleo em água que tem um tamanho médio de gotícula de óleo de 1,0 pm a 1,1 pm; e (c) submeter a emulsão de óleo em água preparada em (b) à microfluidização para produzir a referida emulsão de óleo em água na faixa dos submicrômetros, em que a emulsão na faixa dos submicrômetros tem um tamanho médio de gotícula de óleo inferior a 0,5 pm.

2/4 de que o referido óleo é óleo mineral leve e está em uma quantidade de 1% a 50% v/v, o referido tensoativo compreende lecitina e está em uma quantidade de 0,01% a 10% v/v, e em que o referido óleo está dispersado no referido componente aquoso e o tamanho médio da gotícula de óleo está entre 0,1 pm a 0,5 pm.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido óleo é óleo mineral leve e está em uma quantidade de 1% a 50% v/v, o referido tensoativo compreende lecitina e está em uma quantidade de 0,01% a 10% v/v, e em que o referido tamanho médio de gotícula de óleo da referida emulsão na faixa dos submicrômetros está entre 0,1 pm a 0,5 pm.

3/4

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que ainda compreende adicionar um colesterol e uma saponina antes da microfluidização da referida emulsão.

4/4

4. Emulsão de óleo em água microfluidizada na faixa dos submicrômetros útil como adjuvante de vacinas, CARACTERIZADA pelo fato de que é preparada pelo método como definido na reivindicação 1, a referida emulsão compreendendo um óleo não metabolizável de hidrocarbonetos leves, um tensoativo e um componente aquoso, o referido óleo sendo disperso no referido componente aquoso com um tamanho médio de gotícula de óleo inferior a 0,5 pm.

5. Emulsão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato

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6. Emulsão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que o óleo não metabolizado é 40% v/v de óleo mineral, o tensoativo compreende 10% p/v de lecitina, 0,18% v/v de ésteres de ácidos graxos de sorbitol polietoxilado, e 0,08% v/v de tensoativos de sorbitano substituídos com ácido graxo, em que o referido óleo é disperso no referido componente aquoso e o tamanho médio da gotícula de óleo está entre 0,1 pm a 0,5 pm.

7. Emulsão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda uma saponina e um esterol.

8. Emulsão, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a saponina é Quil A e o esterol é colesterol.

9. Método de preparação de uma composição de vacina microfluidizada compreendendo a emulsão de óleo em água preparada pelo método como definido na reivindicação 1 e um antígeno, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(b) adicionar um antígeno à mistura formada em (a);

(c) submeter a mistura contendo o referido antígeno, que é formada em (b), a um processo de emulsificação primário para produzir uma emulsão de óleo em água que tem um tamanho médio de gotícula de óleo de 1,0 pm a 1,1 pm; e (d) submeter a emulsão formada em (c) à microfluidização para produzir a referida composição de vacina, em que a composição tem um tamanho médio de gotícula de óleo inferior a 0,5 pm.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antígeno é um antígeno viral ou um antígeno bacteriano.

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11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antígeno viral compreende vírus da diarreia viral de bovinos de tipo 1 ou tipo 2 inativado, e em que o referido antígeno bacteriano compreende pelo menos um de uma bactéria Leptospira inativada, a proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante ou uma preparação celular de E. coli .

12. Composição de vacina microfluidizada CARACTERIZADA pelo fato de que é preparada pelo método como definido na reivindicação 9, a referida composição compreendendo uma emulsão de óleo em água, como definida na reivindicação 4, e um antígeno, em que o referido antígeno é disperso na referida emulsão.

13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12, CARCATERIZADA pelo fato de que o referido óleo é óleo mineral leve e está presente na referida composição da vacina em uma quantidade de 1% a 20% v/v, o referido tensoativo compreende lecitina e está presente na referida composição de vacina em uma quantidade de 0,01% a 10% v/v, e em que o referido tamanho médio de gotícula está entre 0,1 a 0,5 pm.

14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 13, CARCATERIZADA pelo fato de que compreende ainda uma saponina e um esterol.

15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 14,

CARACTERIZADA pelo fato de que a saponina é Quil A e o esterol é colesterol.

16. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 13,

CARCATERIZADA pelo fato de que o referido antígeno é um antígeno viral ou um antígeno bacteriano.

17. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido antígeno viral compreende vírus da diarreia viral de bovinos de tipo 1 ou tipo 2 inativado, e em que o referido antígeno bacteriano compreende pelo menos um de uma bactéria Leptospira inativada, a proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante ou uma preparação celular de E. coli .

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18. Composição de vacina microfluidizada CARACTERIZADA pelo fato de que é preparada pelo método como definido na reivindicação 9, a referida composição compreendendo um antígeno microencapsulado e uma emulsão de óleo em água como definida na reivindicação 4, em que o referido antígeno microencapsulado é disperso na referida emulsão.

19. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido óleo é óleo mineral leve e está presente na referida composição de vacina em uma quantidade de 1,0% a 20% v/v, o referido tensoativo compreende lecitina e está presente na referida composição de vacina em uma quantidade de 0,01% a 10% v/v, o referido antígeno é um antígeno viral ou um antígeno bacteriano e está encapsulado em um veículo particulado, e em que o referido veículo compreende ácido glicólico polilático.