BRPI0409571B1 - método para manter uma ou mais gravidezes em um ou mais mamíferos - Google Patents

Abstract

"métodos e kits para manutenção de gravidez, tratamento de cistos foliculares, e sincronização de ovulação empregando-se hormônio de luteinização". a presente invenção refere-se a métodos e kits para manter gravidez em mamíferos. a gravidez é mantida por administração de quantidades eficazes de hormônio de luteinização (lh) ou gonadotropina coriônica (cg). ambos lh e cg podem ser empregados sozinhos, em combinação entre si, ou em combinação com hormônio de crescimento (gh) ou hormônio de estimulação de folículo (fsh). hormônios são administrados em torno do dia 4 a cerca do dia 7, seguindo a inseminação. quantidades eficazes de lh variam de cerca de 10 microgramas a cerca de 25 miligramas, preferivelmente cerca de 2 a cerca de 8 mg, e de cg varia de cerca de 100 iu (unidades internacionais) a cerca de 2000 iu. os mamíferos tratáveis pelos métodos desta invenção incluem ungulados e mamíferos relacionados, incluindo bovinos. kits fornecidos por esta invenção incluem quantidades eficazes de um ou mais hormônios, um dispositivo para administrar o(s) hormônio(s) e instruções. esta invenção também fornece métodos para tratar cistos foliculares e para sincronizar a ovulação em mamíferos empregando-se lh.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA MANTER UMA OU MAIS GRAVIDEZES EM UM OU MAIS MAMÍFEROS".

Referência Cruzada para Pedidos Relacionados Este pedido reivindica prioridade para os Pedidos Provisionais dos Estados Unidos 60/452.297 depositado em 4 de março de 2003 e 60/516.002 depositado em 31 de outubro de 2003, e ambos são incorporados aqui por referência até o ponto não inconsistente com a descrição em anexo.

Antecedentes da Invenção Existe mais de nove milhões de vacas leiteiras nos Estados Unidos, mais de um milhão no Canadá e mais de cinquenta milhões em todo o mundo. A indústria leiteira é extrema mente competitiva e a capacidade de uma leiteira manter gravidez após inseminação é crítica à rentabilidade do produtor. É estimado que o custo de uma vaca nâo-grávida é cerca de cinco dólares por dia. É estimado também que as inseminações atuais resultam em aproximadamente trinta a quarenta por cento de vacas grávidas no dia 45 e dessas vacas noventa a noventa e cinco por cento dão à luz bezerros ao término do período de gestação de 283 dias. Eficiência reprodutiva em gado leiteiro foi declinando continuamente durante um período prolongado de tempo. A magnitude e a consistência desta tendência são de grande importância à indústria leiteira e chegam a um declínio fixo de aproximadamente um por cento em primeiras taxas de concepção de serviço por ano durante os últimos dez anos. O impacto desta mudança em produtividade não foi facilmente aparente, porque a produção de leite de vaca individual aumentou em vinte por cento durante o mesmo período. No final das contas, a indústria leiteira não pode dar-se o luxo de continuar a taxa atual de declínio de desempenho reprodutivo. A fonte de renda primária na indústria leiteira é produção de leite. O progresso na genética e administração de vacas leiteiras levou a aumentos notáveis em produção de leite ao longo das últimas décadas, com um aumento de vinte por cento na produção por vaca nos últimos dez anos somente (USDA National Agricultural Statístlcs Service, http//www.usda.gov/nass). A fim de manter produtividade de rebanho alta, entretanto, vacas devem ficar grávidas e dar à luz um bezerro de forma que o ciclo de tactação seja renovado. Adicionalmente, números suficientes de novilhas devem ser produzidos para substituir vacas mais velhas. Por esse motivo, a produtividade do futuro da indústria leiteira é muito dependente da manutenção de fertilidade e reprodução.

Durante o mesmo tempo que produção de leite por vaca aumentou, entretanto, eficiência reprodutiva de vacas leiteiras continuamente declinou. Rebanhos leiteiros do Colorado estão entre os mais produtivos da nação, e o estado atualmente classificado como segundo em produção por vaca anualmente média ( USDA National Agricultural Statistics Service, http//www.usda.gov/nass). A indústria leiteira do Colorado é típica quanto à tendência nacional em declínio de fertilidade de vaca. Desde 1992 até hoje, enquanto a produção de leite aumentou de 9,5 para 10,9 toneladas/vaca/ano (21.000 para 24.000 libras/ vaca/ano), aberta de dias médios (dias até a concepção) aumentaram de 130 a 173 dias. A primeira taxa de concepção de serviço para rebanhos do Colorado declinou de 51 % para 37%, e a taxa de serviços por concepção subiu de 2 para 2,8 durante os últimos 10 anos ( dados de Dairly Herd Im-provement Association, www.dhiprovo.com).

Declínio da eficiência reprodutiva de gado leiteiro foi observado em todas as partes dos Estados Unidos, e outras partes do mundo onde a produção de leite foi aumentada (Lucy, M.C., "Reproductive loss in high-producing dairy cattle: Where will it end ?, "J. Dairy Sei., 84 : 1277 - 1293, 2001; Roche, J. F. e outros, "Reproductive management of postpartum cows", Anim. Reprod. Sei., 60-61 : 703 - 712, 2000; Royal, M. D. e outros, "Declining fertility in dairy cattle: changes in traditional and endocrine para-meters of fertility", Anim. Sei., 70 : 487 - 502, 2000; e Macmiilan, K. L. e outros, "The effects of lactation on the fertility of dairy cows" Aust. Vet. J., 73 : 141 - 147, 1996). A associação temporal forte entre aumento na produção de leite e diminuição da fertilidade não fornece uma causa conhecida do fenômeno. Enquanto a relação entre produção de leite e fertilidade parece ser antagônica (Dematawewa, C. M., e P. J. Berger, "Genetics and phenotypic parameters for 305 day yield, fertility, and survival in Holsteins", J. Dairy Sei., 81 : 2700 - 2709, 1998; e Hansen, L. B., "Consequences of selection for milk yield from a geneticisfs viewpoint", J. Dairy Sei., 83 : 1145 - 1150, 2000), alguns estudos demonstram um efeito neutro de produção de leite per se (Grohn, Y. T. e P. J. Rajala-Schultz, ''Epidemiology of reproduetive performance in dairy cows", Anim. Repro. Sei., 60-61: 605 - 614, 2000), e outros estudos mostram maior produção de rebanhos tem desempenho reprodutivo melhor que produção inferior de rebanhos (Nebel, R. L. e M. L. McGilliard, "Interactions of high milk yield and reproduetive perforance dairy cows", J. Dairy Scí., 76 : 3257 - 3268, 1993; e Stevenson, J. S., "Can you have good reproduetion and high milk yield?" Hoard’s Dairyman, 145 : 202 — 203, 1999). Numerosas características de vacas de produção elevada podem influenciar negativamente a fertilidade, incluindo equilíbrio de energia negativa e eventos de doença tais como placenta retida, cetose, ovário cístico, e mastite (Lucy 2001, supra; Grohn 2000, supra; e Staples, C. R. e outros, "Re-lationship between ovarian activity and energy status during the early post-partum period of high producing dairy cows", J. Dairy Sei., 73 : 938 - 947, 1990). Uma tendência proeminente na indústria leiteira dos Estados Unidos é o número diminuído de fazendas leiteiras, tamanho de rebanho continuamente crescente, e movimento de produção leiteira para os estados do oeste (USDA National Agricultural Statistics Service, http//www.usda.gov/nass). Tamanho de rebanho maior pode contribuir para desempenho reprodutivo diminuído por causa das mudanças associadas à mão-de-obra leiteira e administração de vaca, resultando em trabalhadores superatarefados ou mal treinados que identificam comportamento de estro, desempenhando inseminação artificial, conduzindo programas de sincronização de estro, e identificando e tratando vacas doentes (Lucy 2001, supra). Estresse por calor, que ocorre por toda a maioria do ano em rebanhos leiteiros do oeste e sudoeste dos EUA, tem impacto negativo significante em fertilidade de gado (Wolfen-son, D. e outros, "Impaired reproduetion in heat-stressed cattle: basic and applied aspects", Anim. Reprod. Sei., 60-61: 535 - 547, 2000).

Estudos recentes com detecção de gravidez ultra-sônica demonstram perdas embrionárias de pelo menos 20 % entre 28 e 60 dias de gravidez (Pursley, J. R. e outros, "Effect of time of artificial insemination on pregnancy rates, calving rates, pregnancy loss, and gender ratio after sync-hronization of ovulation ín lactating dairy cows", J. Dairy Sei., 81 : 2139 -2144, 1998; e Vasconcelos, J. L., e outros, "Pregnancy rate, pregnancy loss, and response to heat stress after Al at 2 different times from ovulation in dairy cows" Biol. Reprod., 56 (Supp. 1): 140, 1997), e há perdas provavelmente até maiores antes dos 28 dias que são indetectáveis por exame de ultra-som (Lucy 2001, supra). Dados sugerem que vacas leiteiras modernas não estabelecem gravidez por causa do ambiente uterino subótimas (Gustafs-son, H. and K. Larsson, "Embryonic mortality in heifers after artificial insemination and embryo transfer: differences between Virgin and repeat breeder heifers", Res. Vet. Sei., 39 : 271 -274, 1985). Embora haja numerosos fatores possíveis que poderiam ser responsáveis por perdas embrionárias, uma causa potencial é concentração de progesterona do sangue baixa.

Progesterona é requerida para manter gravidez em gado, e baixas concentrações de progesterona estão associadas com infertilidade. Concentrações de progesterona do sangue são influenciadas por taxas de secreção e metabolismo / liberação. Há evidência que vacas leiteiras modernas mantêm concentrações de progesterona do sangue mais baixas que aquelas medidas em gado várias décadas atrás (Lucy, M. C. e outros, "Re-produetive endocrinology of lactating dairy cows selected for increased milk produetion", J. Anim. Sei., 76 (Suppl. 1): 296, 1998). Corpora lutea maiores segregam mais progesterona e têm um efeito positivo em reconhecimento de gravidez e taxas de gravidez, mas há evidência que vacas leiteiras têm menor que Corpora lutea desejáveis em algumas circunstâncias (Lucy 2001, supra; Vasconcelos, J. L. M. e outros, "Reduction in size of the ovulatory fol-licle reduces subsequent lutea! size and pregnancy rate", Theriogenology, 56 : 307 - 314, 2001). O fígado é o sítio primário de metabolismo de progesterona. Estudos recentes mostram que entrada de alimento aumentada aumenta o fluxo de sangue do fígado e aumenta a taxa de liberação de pro- gesterona, deste modo, diminuindo as concentrações de progesterona do soro (Sangsritavong, S. e outros, "Liver blood flow and steroid metabolism are increased by both acute feeding and hypertnophy of the digestive tract", J. Anim. Sei., 78 (Suppl 1) 221, 2000; e Wiltbank, M. C. e outros, "Novel effects of nutrition on reproduetion in lactating dairy cows", J. Dairy Sei., 84 (Supl. 1): 84, 2001).

Progesterona de soro baixa durante a fase luteal do ciclo de estro seria associada com primeira taxa de concepção de serviço baixa. Baixas concentrações de progesterona podem resultar de secreção inadequada, ou alternativamente níveis altos de metabolismo / liberação, até mesmo quando inseminação produziu um embrião potencialmente viável. Progesterona baixa permitiría a geração de prostaglandina por endométrio uterino por volta do dia 16 do ciclo de estro, resultando em luteólise e indução de ovula-ção, deste modo morte embrionária e fracasso para manter a gravidez (Bi-nelli, M.e outros, "Antiluteolytic strategies to improve fertility in cattlé', Theri-ogenology, 56 : 1451 -1463, 2001).

Binelli e outros 2001, supra, revisa estratégias anti-luteolíticas para melhorar fertilidade em gado.

Em vacas, o ciclo de estro é cerca de 21 dias. Para determinar quando uma vaca do ciclo está pronta para procriação, a vaca pode ser observada para estro comportamental. Altemativamente, uma vaca pode ser induzida ou forçada em estro com terapias de hormônio efetivas. Estro de um rebanho inteiro pode ser sincronizado (Patente dos Estados Unidos N®8 3.892.855 emitida em 1 de julho de 1975, e 4.610.687 emitida em 9 de setembro de 1986; Patente dos Estados Unidos 60/380.042; Wilson, T. W., "Estrous Synchronization for Beef Cattle", (junho, 2003), Boletim 1232, a cooperação da University of Geórgia College of Agricultural and Environ-mental Sciences e U.S. Departament of Agriculture). Sincronização de estro, ou, de preferência, sincronização de ovulação, é usada em programas de procriação de inseminação artificial cronometrada (TAI). Programas de procriação de TAI envolvem sincronização de estro, que permite procriação cronometrada sem monitoração por estro comportamental. Exemplos de métodos para forçar estro incluem Patente dos Estados Unidos N2 5.589.457 (emitida em 31 de dezembro de 1996), Ovsynch (Pharmacia Animai Health, Peapack, NJ), Cosynch, Select Synch, Select Synch Modificado, MGA/PGF, e Syncro-Mate-B. Tais métodos tipicamente empregam hormônios tais como prostaglandinas, por exemplo, PGF2a (Lutalyse®, Pharmacia Upjohn, Peapack, NJ; Bovilene®, Syntex; Animal Health, Des Moines, lowa; e Estrumate® Haver Lockhart, Shawnee, Kansas), e hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH). Ovsynch envolve uma injeção de GnRH seguida por uma injeção de prostaglandina uma semana mais tarde, seguida por uma segunda injeção de GnRH 48 horas mais tarde. Inseminação é executada idealmente então em 12 -18 horas, de preferência, cerca de 16 horas, após a segunda injeção de GnRH. Ovsynch é maximamente efetivo quando implementado entre os Dias 18 - 20 de um ciclo de estro bovino de 20 dias (Thatcher, W. W. e outros (2000) "New Strategies to Increase Pregnancy Rates" www.naab-css.org/education/Thatcher.html). Presynch (Pharmacia Animal Health, Peapack, NJ) pode ser empregado para sincronizar novilhas antes da implementação de Ovsynch. Ovsynch é maximamente efetivo quando implementado entre os Dias 18 - 20 de um ciclo de estro bovino de 20 dias (estudos mostram que começar entre os dias 5 - 12 é melhor. (Moreira, F. e outros (2000) "Effect of day of the estrous cycle at the initiation of a timed insemination protocol on reproductive responses in dairly heifers", J Anim Sei 78: 1568 - 1576, 2000; Vasconcelos JLM, e outros (1999) "Sync-hronization rate, size of the ovulatory follicle, and pregnancy rate after sync-hronization of ovuiation beginning on different days of the estrous cycle in lactating dairy cows", Theriogenology 52: 1067 - 1078, 1999). Presynch envolve duas injeções de prostaglandina. Certos métodos mencionados acima também são usados em vacas de não-ciclo para induzir ciclo, tal como em lactação de vacas leiteiras. Entretanto, estes protocolos não induzem ciclici-dade - somente preparação de progesterona faz isso. O único programa de sincronização que induz ciclicidade em lactação de vacas é o emprego de um dispositivo de liberação de droga interno controlado (CIDR) que libera progesterona ou acetato de melengestrol (MGA), que é ilegal em lactação de vacas leiteiras). Após sincronização de estro precisa, animais não necessitam ser monitorados quanto a estro comportamental e podem ser originados por compromisso. Alguns animais podem precisar de pré-sincronização de estro antes da sincronização de estro. Acetato de melengestrol (MGATM) na alimentação (Imwalle, D. B. e outros (1998) "Effects of melengestrol ace-tate on onset of puberty, follicular growth, and patterns of luteinizing hormo-ne secretion in beef heifers" Biol. Repro. 58:1432 - 1436) ou implantes (Publicação de Patente dos Estados Unidos NP2001 /0041697, publicada em 15 de novembro de 2001) podem ser empregados para pré-sincronização de estro em novilhas. Resynch é um programa, por meio do qual, animais são sincronizados e gerados, e então esses animais que são determinados estarem abertos (não grávidos) são sincronizados de novo e regerados.

Pesquisa prévia mostrou resultados conflitantes em ciclos reprodutivos e taxas de concepção de vacas recebendo hCG (Eduvie e Seguin (1982) Theriogenology 17: 415 - 422; Helmer e Britt (1986) Theriogenology 26: 683 - 695; Sianangama e Rajamahendran (1992) Theriogenology 38: 85 - 96; Diaz e outros (1998) J. Anim. Sei. 76: 1929 - 1936; Sianangama e Rajamahendran (1996) Theriogenology 45: 977 - 990; Schmitt e outros (1996) J. Anim. Sei. 74: 1074 - 1083; e Schmitt e outros (1996) J. Anim. Sei. 74: 1915-1929).

Thatcher e outros (2001 Theriogenology 55: 75 - 89) descrevem os efeitos de tratamentos hormonais no desempenho reprodutivo de gado. Tratamentos hormonais incluem administração de somatotrofina bovina (bST) e hCG. DOcchio e outros (2000 Anim. Reprod. Sei. 60 - 61: 433 - 442) descrevem várias estratégias para administração de gado de carne de boi empregando implantes de agonista de GnRH. De Rensis e outros (2002 Theriogenology 58(9): 1675 - 1687) descrevem o efeito em vacas leiteiras da administração de GnRH ou hCG antes de inseminação artificial. Martinez e outros (1999 Anim. Reprod. Sei. 57: 23 - 33) descrevem a capacidade de hormônio de luteinização de porcino (LH) e hormônio de liberação de gona-dotropina (GnRH) induzir surgimento de onda folicular em novilha de carne de boi nos Dias 3, 6, e 9 do ciclo de estro, após a ovulação (Dia 0), sem in- seminação. Santos e outros (2001 J. Animal Science 79: 2881 - 2894) descrevem o efeito em desempenho reprodutivo de administração intramuscular de 3.300 lU de gonadotropina coriônica humana (hCG) para vacas leiteiras de produção elevada no Dia 5 após a inseminação artificial. Lee e outros (1983 Am. J. Vet. Res. 44 (11): 2160 - 2163) descrevem o efeito em vacas leiteiras de administração de GnRH na hora da inseminação artificial (Al). As Patentes dos Estados Unidos N“ 5.792.785 (emitida 11 de agosto de 1998) e 6.403.631 (emitida 11 de junho de 2002) descrevem métodos e composições para administração de melatonina antes e após a inseminação para aumentar o sucesso da gravidez em um animal. Chagas e Silva e outros (2002 Theriogenology 58(1): 51 - 59) descrevem perfis de progesterona de plasma seguindo transferência de embrião em gado leiteiro. Weems e outros (1998 Prostaglandins and others Lipid Mediators) descrevem os efeitos de hormônios na secreção de progesterona por corpos lúteos (CL) de vacas não-grávidas e grávidas. A Patente dos Estados Unidos Nfi 4.780.451 (emitida 25 de outubro de 1988) descreve composições e métodos empregando hormônio de estimulação de folículo (FSH) e LH para produzir superovula-ção em gado. Farin e outros (1988 Biol. Reprod. 38: 413 - 421) descrevem o efeito em peso lúteo ovino de administração intravenosa de 300 IU de hCG nos Dias 5 e 7,5 do ciclo de estro, sem inseminação. Hoyer e Niswender (1985 Can. J Physiol. Pharmacol. 63 (3): 240 - 248) descrevem a regulação de esteroidogênese em células lúteas ovinas. Juengel e Niswender (1999 J. Reprod. Fértil. Suppl, 54: 193 - 205) descrevem a regulação molecular de progesterona lútea em ruminantes domésticos. Patente dos Estados Unidos 5.589.457 (emitida 31 de dezembro de 1996) descreve métodos para sincronização de ovulação em gado empregando GnRH, LH, e/ou hCG e PGF2a.

As gonadotropinas formam uma família de hormônios de glico-proteína estruturalmente relacionados. Os membros incluem gonadotropina coriônica (CG), hormônio de estimulação de folículo (FSH), hormônio de lu-teinização (LH), também conhecido como lutropina, e estimulante de estimulação de tiróide (TSH). FSH, LH, e TSH estão presentes na maioria das es- pécies vertebradas e são sintetizados pela glândula pituitária. CG foi achado somente em primatas, incluindo seres humanos, e em cavalos, e é sintetizado por tecidos placentários. As gonadotropinas são heterodímeros de duas subunidades, α e β, que são associados com ligações não-covalentes. Dentro de uma espécie, a subunidade α é essencialmente idêntica para cada membro da família de gonadotropina. As subunidades β são diferentes para cada membro, mas são semelhantes em estrutura. A subunidade β de hCG é substancialmente maior que as outras subunidades β, pelo fato de que contém um adicional de 34 aminoácidos na extremidade terminal C da proteína.

Os efeitos de LH dependem do sexo do organismo. Em fêmeas sexualmente maduras, LH estimula o folículo para segregar estrogênio na primeira metade do ciclo menstruai. Uma onda de LH inicia a conclusão de meiose I do ovo e liberação do ovo (ovulação) no meio do ciclo estimula o folículo agora vazio para desenvolver no corpo lúteo, que segrega progeste-rona durante a última metade do ciclo menstruai. Em machos, LH age nas células intersticiais dos testículos, estimulando-os a sintetizar e secretar a testosterona de hormônio de sexo masculino. LH em machos também é conhecido como hormônio estimulante de célula intersticial (ICSH).

Produção de LH bovino recombinante é descrita em WO 90/02757 (publicada em 22 de março de 1990), Patente dos Estados Unidos n° 6.455.282 (emitida em 24 de setembro de 2002); Patente dos Estados Unidos No. 5.639.639 (emitida em 17 de junho de 1997), Patente dos Estados Unidos n° 5.767.251 (emitida em 16 de junho de 1998), Nilson (1987) J. Reprod. Fértil. Suppl. 34: 227 - 36, Boime e outros (1992) Seminars in Reprod. Endocrin. 10: 45- 50, e Kaetzel (1985) PNAS USA 82 : 7280 - 7283. Um processo para a purificação de LH recombinante é descrito em WO 01/62774 (publicada em 30 de agosto de 2001). Patente dos Estados Unidos n° 5.929.028 (emitida em 27 de julho de 1999) descreve gonadotropina líquida que contém formulações que podem incluir LH. Otieno e outros (2002 Reproduction 123 (1): 155 -162) descreve expressão de genes de LH em conceptos bovinos. Há uma necessidade na técnica por um produto terapêutico se- guro para manter gravidez de vacas pós-inseminadas.

Todas as publicações e pedidos de patente citados são incorporados neste relatório por referência em suas totalidades na medida em que não são inconsistentes com a descrição. Citação dos documentos acima não é planejada como uma admissão que qualquer antecedente seja técnica anterior pertinente. Todas as declarações sobre a data ou representação sobre os conteúdos destes documentos estão baseados em caracterização subjetiva da informação disponível para a requerente, e não constituem qualquer admissão sobre a precisão das datas ou conteúdos destes documentos.

Sumário da Invenção Esta invenção fornece métodos e kits para manutenção da gravidez em mamíferos. A gravidez é mantida por administração de quantidades efetivas de hormônio de luteinização (LH) ou gonadotropina coriônica (CG). Ambos LH e CG podem ser empregados sozinhos, em combinação entre si, ou em combinação com hormônio de crescimento (GH) ou hormônio estimulante de folículo (FSH), Hormônios são administrados por volta do Dia 4 até por volta do Dia 7 seguindo inseminação. Quantidades efetivas de LH variam a partir de cerca de 10 microgramas a aproximadamente 25 miligramas e de CG variam a partir de cerca de 100 lü (unidades internacionais) a cerca de 2000 IU. Mamíferos tratáveis pelos métodos desta invenção incluem mamíferos relacionados e ungulados, incluindo bovinos. Kits fornecidos por esta invenção incluem quantidades efetivas de um ou mais hormônios, um dispositivo para administrar o(s) hormônio(s) e instruções.

Esta invenção também fornece um método de sincronização de ovulação em um rebanho de animais fêmeas, o referido método compreendendo: administração de hormônio de luteinização para os animais do referido rebanho, de preferência por injeção intramuscular. Sincronização de ovulação pode sincronizar estro; entretanto, os animais podem ser criados, por exemplo, através de inseminação artificial, sem sinais de estro sendo observados. De preferência, hormônio de luteinização é usado em um método de sincronização de estro conhecido na técnica em vez de hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH). Em protocolos de sincronização típicos, cerca de 100 mg de gonadotropina são usados. Vários métodos de sincronização de estro conhecidos na técnica são descritos na Descrição Detalhada disto. De preferência, a quantidade de hormônio de luteinização administrada está entre cerca de 2 mg e cerca de 10 mg. Estes métodos induzem ovu-lação mais confiantemente que métodos de sincronização de estro que empregam GnRH; entretanto, uma combinação de hormônio de luteinização e GnRH também pode ser empregada, por exemplo, em qualquer relação de hormônio de luteinização para GnRH entre cerca de 99:1 a 1:99, de preferência a relação empregada está entre cerca de 25:75 e cerca de 75:25.

Alguns métodos de sincronização de estro envolvem administração de prostaglandina aos animais referidos em uma quantidade entre cerca de 25 mg e cerca de 35 mg seguindo administração de GnRH. Hormônios de luteinização (ou uma mistura de hormônio de luteinização e GnRH) podem ser empregados em vez de GnRH nestes métodos, nas dosagens descritas no parágrafo precedente. Outros métodos de sincronização de estro envolvem administração de GnRH, e então prostaglandina, e então GnRH adicional; e de novo, hormônio de luteinização (ou uma mistura de hormônio de luteinização e GnRH) pode ser empregado em vez de GnRH nestes métodos nas dosagens descritas no parágrafo precedente. A cronometragem de administração de hormônio de luteinização e prostaglandina nestes métodos de sincronização de ovulação é como descrita na técnica para a cronometragem de administração de GnRH e prostaglandina em métodos de sincronização de estro. De preferência, prostaglandina é administrada entre cerca de 6 e cerca de 8 dias, e de preferência, cerca de 7 dias após a administração do primeiro hormônio de luteinização, isto é, um tempo suficiente para causar regressão do folículo dominante. De preferência, uma segunda dose de hormônio de luteinização é administrada entre cerca de 40 e cerca de 60 horas, e de preferência cerca de 48 horas após administração de prostaglandina, isto é, um tempo suficiente para permitir maturação suficiente do folículo para produzir um ovário de qualidade boa, mas não tão longo que permita o animal ovular espontaneamente (uma vez que a reprodução deveria ser feita antes da ovulação).

Os métodos de sincronização desta invenção também podem compreender procriação dos animais por quaisquer meios conhecidos na técnica, de preferência por inseminação artificial. Procriação pode ser feita imediatamente após a administração da dose final de hormônio; isto é, dentro de um período de um dia, e de preferência dentro de cerca de 16 horas, de forma que procriação pode ser realizada antes de ovulação ocorrer.

Os métodos de sincronização de ovulação desta invenção podem ser aplicados a animais selecionados a partir do grupo consistindo em bovino, ovelha, cabras, iaques, búfalos de água, bisão, antílopes, gazelas, alce, rena, alce americano, ovelha de chifre grande, girafas, e camelos incluindo camelos dromedários e Bactriano, lhamas, suínos, cavalos, alpacas, e vicu-nhas. De preferência, o animal é um bovino.

Os métodos de sincronização de ovulação desta invenção podem ser empregados em combinação com métodos de pré-sincronização conhecidos na técnica.

Esta invenção também fornece um método para tratar cisto foli-cular em um mamífero compreendendo administrar a um mamífero diagnosticado com um cisto folicular uma quantidade efetiva de hormônio de luteini-zação. Hormônio de luteinização é, de preferência, administrado intramuscu-larmente, e em uma quantidade entre cerca de 2 e cerca de 10 mg. De novo, o tratamento pode ser aplicado a um mamífero selecionado a partir do grupo consistindo em bovino, ovelha, cabras, iaques, búfalos de água, bisão, antílopes, gazelas, alce, rena, alce americano, ovelha de chifre grande, girafas, e camelos incluindo camelos dromedários e Bactriano, lhamas, suínos, cavalos, alpacas, e vicunhas, de preferência, bovino.

Hormônio de luteinização recombinante pode ser empregado em quaisquer dos métodos desta invenção. Hormônio de luteinização recombinante pode ser feito por quaisquer meios conhecidos na técnica, e pode ser feito por novos métodos descritos aqui. Hormônio de luteinização recombinante é mais efetivo em doses mais baixas que hormônio de luteinização purificado a partir de glândulas pituitárias porque é mais uniformemente cor- retamente glicosilado. A quantidade de glicosilação depende da fase de produção de hormônio de luteinização na glândula pituitária a partir da qual o hormônio está sendo colhido. Tipicamente, o hormônio é colhido a partir de glândulas pituitárias em todas as fases de produção de hormônio. Hormônio de luteinização que é subglicosilado tem uma meia-vida mais curta que hormônio de luteinização que é corretamente glicosilado. Por esse motivo, hormônio de luteinização recombinante que é corretamente glicosilado pode ser empregado em dosagens mais baixas que hormônio de luteinização ocorrendo naturalmente isolado.

Um método de produção de hormônio de luteinização recombi-nante compreende expressar codificação de D NA para o hormônio de luteinização referido em células de inseto. LH recombinante também pode ser produzido através do emprego de animais não-humanos transgênicos, como conhecido na técnica. Um método útil adicional de produção de LH recombinante compreende empregar um vetor no qual as subunidades alfa e beta de hormônios de luteinização são fundidas sob o controle de um único promotor. Métodos de preparação de LH recombinante podem incluir "métodos de expressão duais", que significa que as subunidades alfa e beta são expressas a partir do mesmo plasmídeo ou DNA viral. Nesse caso estão sob o controle de promotores separados na mesma molécula de DNA. Os métodos podem usar "co-expressão", que significa que as subunidades alfa e beta são codificadas por moléculas de DNA separadas {cada uma, tendo um gene de resistência antibiótica diferente). Para realizar co-expressão, dois plasmídeos separados são introduzidos em uma linhagem de célula (mamífero ou inseto). A linhagem de célula é tratada com dois antibióticos para selecionar uma linhagem de célula que contém ambos os plasmídeos. Outro método de preparação de LH recombinante compreende expressar formas de cadeia única de codificação de DNA de LH, onde as subunidades alfa e beta são ligadas covalentemente.

Esta invenção também fornece um dispositivo de injeção para administrar uma dose única de hormônio de luteinização recombinante, em que a dose referida compreende entre cerca de 2 e cerca de 10 mg de hor- mônio de luteinização recombinante. O dispositivo de injeção pode ser parte de um kit que também inclui tais componentes como dispositivos de injeção para administrar doses únicas de outros hormônios requeridos para sincronização de ovulação, e ensaios de gravidez.

Referência para Listagens de Seaüência SEQ ID NO: 1 é LH bovino alfa de Número de Acessão Gen-bank X00050. SEQ ID NO: 2 é LH bovino beta de Número de Acessão Gen-bank M10077. SEQ ID NO: 3 é a seqüência de nucleotídeo para subunidade de LH bovino alfa de Número de Acessão Genbank NM_173901. SEQ ID NO: 4 é a seqüência de nucleotídeo para subunidade de LH bovino beta de Número de Acessão Genbank NM_173930.

Descrição Detalhada da Invenção Como empregado aqui, "pronto para procriação" refere-se a um animal que não está grávido. O animal pode ter sido monitorado quanto a estro e teve estro detectado. O animal pode ter tido estro forçado.

Como empregado aqui, "vaca" refere-se a bovinos fêmeas, incluindo novilhas.

Como empregado aqui, "primeiro ciclo de estro" refere-se ao ciclo de estro após a inseminação. Em vacas, o primeiro ciclo de estro é cerca de 21 dias que seguem um estro prévio.

Como empregado aqui, "estro" refere-se ao período durante o qual um animal mais provavelmente ficará grávido.

Como empregado aqui, "em calor" refere-se a estar no tempo de estro, quando um animal é mais sexualmente receptivo. Em vacas este período dura cerca de 12 -18 horas.

Como empregado aqui, "estro comportamental" refere-se à demonstração comportamenta! que um animal está em calor, incluindo apresentando calor permanente.

Como empregado aqui, "calor permanente" refere-se ao período durante o qual uma vaca é receptiva a um touro e suportará reproduzir ou suportará ser montada por outras vacas.

Como empregado aqui, "Dia 0” é o dia que um animai está em estro comportamental ou o dia de procriação.

Como empregado aqui, "forçar estro" refere-se a métodos conhecidos na técnica para forçar calor. Forçar estro pode incluir períodos de espera, como apropriado.

Como empregado aqui, "forçar ovulação" refere-se a induzir ovu-lação, geralmente dentro de um dia do tratamento empregado para induzir ovulação.

Como empregado aqui, "aberto" refere-se a um animal que não está grávido.

Como empregado aqui, "ciclo" refere-se a um animal que está experimentando um ciclo de estro, isto é, não está grávido.

Como empregado aqui, "prontidão para procriação" refere-se a um tempo no ciclo de estro quando procriação é mais provável de resultar em gravidez.

Como empregado aqui, "procriação" refere-se a métodos na técnica conhecida que pertence à preparação de um animal fêmea grávido. Tais métodos incluem inseminação natural e artificial. Métodos de procriação podem incluir um tempo de espera após a observação de estro comportamental ou após o forçar estro. Em gado, o tempo de espera após a observação de estro comportamental é 12 - 18 horas. Em gado, após forçar estro com prostaglandina no Dia 17, o tempo de espera é 72 - 80 horas. Depois que a última injeção de hormônio empregada para forçar ovulação, procriação deve ser dentro de cerca de 24 horas, por exemplo, entre cerca de 0 a cerca de 24 horas, e de preferência cerca de 16 horas após essa injeção, de forma que procriação será feita antes de ovulação ocorrer.

Como empregado aqui, "anticorpo específico para" refere-se a anticorpo que não se liga significativa mente a qualquer componente de a-mostra diferente do componente desejado.

Como empregado aqui, "teste de gravidez" refere-se a teste para gravidez e/ou não-gravidez.

Como empregado aqui, "sangue inteiro" refere-se a sangue como tirado. Sangue inteiro contém uma quantidade substancial de células.

Como empregado aqui, "plasma" refere-se a sangue sem quantidade substancial de células. Plasma contém fatores de coagulação.

Como empregado aqui, "soro" refere-se a sangue sem uma quantidade substancial de células ou fatores de coagulação.

Como empregado aqui, "sincronização de estro" refere-se a um processo por meio do qual estro para um grupo de animais é forçado, tal que cada animal é provável que esteja em estro dentro de cerca de uma janela de 2 - 5 dias.

Como usado aqui, "sincronização de ovulação" refere-se a um processo por meio do qual ovulação para um grupo de animais é forçada, tal que cada animal é provável ovular dentro de uma janela de 3 - 4 dias.

Como empregado aqui, "pré-sincronização de estro" ou "pré-sincronização de ovulação" refere-se a um processo por meio do qual o ciclo de estro, frequentemente para um grupo de animais, é bloqueado ou forçado em um estágio particular do ciclo, de forma que procedimentos de sincronização de ovulação ou estro que devem ser executados mais tarde tenham mais êxito.

Como empregado aqui, "cowside" refere-se a um ambiente no qual um animal domesticado é achado, particutarmente em contraste com um ambiente de laboratório.

Como empregado aqui, "tempo de ciclo de procriação" refere-se ao tempo entre uma procriação de um animal e a próxima procriação durante o próximo ciclo de estro do mesmo animal.

Como empregado aqui, "mamífero grávido" refere-se a um mamífero que foi inseminado e pode estar grávido ou a uma pluralidade de mamíferos inseminados, alguns dos quais provavelmente devem estar grávidos.

Como empregado aqui, "manter gravidez" refere-se a aumento da probabilidade que um animal que foi inseminado testará teste positivo para gravidez de dar à luz um bezerro vivo ou aumento de probabilidade que uma pluralidade de animais que foram inseminados testarão positivo para gravidez ou darão à luz um bezerro vivo.

Como empregado aqui, "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade que é efetiva para produzir o resultado desejado.

Como empregado aqui, "administrar" refere-se a qualquer método de administração conhecido na técnica que produz esse resultado desejado. Exemplos de administração incluem mas não são limitados à injeção subcutânea, intramuscular e intravenosa.

Como empregado aqui, "cerca de 98 % puro" refere-se à pureza como medido por qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não limitado à eletroforese de proteína.

Como empregado aqui, "inseminação" refere-se à introdução de sêmen por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado à, inseminação natural e artificial.

Como empregado aqui, "aumento de probabilidade de concepção" refere-se a aumento da probabilidade de concepção detectável. Por exemplo, concepção pode ser detectada em bovino já por volta do Dia 15 após a inseminação pela presença de proteínas induzidas interferon-tau.

Como empregado aqui, "diminuição da probabilidade de perda do embrião" refere-se à diminuição da chance que um mamífero inseminado testará negativo para gravidez. Como empregado aqui, "diminuição da porcentagem de perda embrionária" com respeito a uma pluralidade de mamíferos que foram inseminados refere-se à diminuição da porcentagem de tais animais que testarão negativo para gravidez.

Sistemas de expressão de baculovírus são bem conhecidos na técnica (0'Reilly e outros (1994) Baculovírus Expression Vectors: A Labora-tory Manual, Oxford University Press). Há muitas vantagens de empregar baculovírus para expressão de gene heterólogo. cDNA heterólogo é expressado bem. O próprio processo transcricional de genes com íntrons ocorre mas expressão é menos eficiente. Como com outros sistemas de expressão eucarióticos, expressão de baculovírus de genes heterólogos permite dobra, oligomerização e modifica- ção pós-translacional em modos que são freqüentemente idênticos àqueles que ocorrem em células de mamífero. O ambiente citoplásmico de inseto permite dobra própria e formação de ligação S-S, diferente da redução de ambiente do citoplasma de E, coti. Processo pós-translacional idêntico àquele de células de mamífero foi informado para muitas proteínas. Estas incluem a própria proteólise, N- e O-glicosilação, acilação, amidação, carboxime-tilação, fosforilação, e prenilação. Proteínas podem ser secretarias a partir de células visadas para locais subcelulares diferentes. Polipeptídeo único, proteínas diméricas e triméricas foram expressos em baculovírus. Finalmente, expressão de proteínas heterólogas está sob o controle do promotor de poliedro forte, permitindo níveis de expressão de até 30 % da proteína de célula total. Células de inseto SF-9, SF-21, e High-Five são geralmente usadas para expressão de baculovírus. SF-9 e SF-21 são linhagens de célula ovariana de Spodoptera frugiperda. Elas são desenvolvidas em meio de Grace (ou um similar) suplementado com 10 % de soro de bezerro fetal, lac-tatbumina, e levedurato. Células High-Five são células de ovo de Trichoplu-sia ni. Estas células são menos onerosas para manter desde que possam ser desenvolvidas sem soro de bezerro fetal. Elas expressam, segundo notícias, níveis mais altos de proteínas recombinantes, embora acredita-se que estas diferenças sejam mínimas. Todas as três linhagens de célula podem ser desenvolvidas em temperatura ambiente (ótima = 25-27°C), e não requerem incubadoras de COa. Seu tempo de duplicação é 18 - 24 horas. Proteínas expressas podem ser recuperadas empregando métodos de purificação de proteína conhecidos na técnica, incluindo emprego de tecnologia de proteína de fusão, cromatografia de imunoafinidade, e cromatografia de exclusão de tamanho.

Constructos de DNA preparadas para introdução em um hospedeiro eucariótico ou procariótico compreenderão tipicamente um sistema de replicação (isto é, vetor) reconhecido pelo hospedeiro, incluindo o fragmento de DNA planejado codificando o polipeptídeo desejado, e também incluirão, de preferência, sequências reguladoras de iniciação translacional e transcri- ção operavelmente ligadas ao segmento de codificação de polipeptídeo. Sistemas de expressão (vetores de expressão) podem incluir, por exemplo, uma origem de replicação ou seqüência autonomamente replicante (ARS) e seqüências de controle de expressão, um promotor, um realçador e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de ligação de ribossomo, sítios de junção de RNA, sítios de poliadenilação, seqüências finalizadoras transcricionais, e seqüências de estabilização de mRNA. Pep-tídeos notáveis também podem ser incluídos onde apropriado de polipeptí-deos secretados das mesmas ou relacionadas espécies, que permitem que a proteína cruze e/ou se aloje em membranas de célula ou seja secretada da célula.

Um promotor apropriado e outras seqüências de vetor necessárias serão selecionados para serem funcionais no hospedeiro. Exemplos de combinações executáveis de linhagens de célula e vetores de expressão são descritos em Sambrook e outros (1989 Molecular Clonina. Segunda E-dição, cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY; Ausubel e outros (Eds.) (1995) Current Protocols in Molecular Bioloav. Greene Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque; e Metzger e outros (1988) Nature, 334: 31 - 36. Muitos vetores úteis para expressão em células de bactérias, levedura, fungos, mamífero, inseto, planta ou outras, são bem conhecidos na técnica e podem ser obtidos de vendedores tais como Stratagene, New England Bio-labs, Promega Biotech, e outros. Além disso, o constructo pode ser juntado a um gene amplificável (por exemplo, o gene de dihidrofolato redutase DH-FR) de forma que múltiplas cópias do gene possam ser feitas. Para realça-dor apropriado e outras seqüências de controle de expressão, ver também Enhancers and Eukarvotic Gene Expression. Cold Spring Harbor Press, NY (1983). Enquanto tais vetores de expressão podem replicar autonomamente, podem replicar menos preferivelmente sendo inseridos no genoma da célula hospedeira.

Vetores de clonagem e expressão provavelmente conterão um marcador selecionável, quer dizer, um gene que codifica uma proteína necessária para a sobrevivência ou desenvolvimento de uma célula hospedei- ra transformada com o vetor. Embora tal gene de marcador possa ser carregado em outra sequência de polinucleotídeo co-introduzida na célula hospedeira, é mais frequentemente contido no vetor de clonagem. Somente aquelas células hospedeiras nas quais o gene de marcador foi introduzido sobreviverão e/ou desenvolverão sob condições seletivas. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras substâncias tóxicas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, etc.; (b) complementam deficiências auxotráficas; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos. A escolha do próprio marcador selecionável dependerá da célula hospedeira; marcadores apropriados para hospedeiros diferentes são conhecidos na técnica. Células hospedeiras recombinantes, no presente contexto, são aquelas que foram geneticamente modificadas para conter uma molécula de DNA isolada da invenção instantânea. O DNA pode ser introduzido por qualquer meio conhecido na técnica que seja apropriado para o tipo de célula particular, incluindo sem limitação, transformação, lipofecção ou eletropo-ração.

Adicionalmente, será reconhecido por aqueles versados na técnica que variações alélicas podem ocorrer nas seqüências de DNA, que não mudarão significativamente atividade das seqüências de aminoácido dos peptídeos que as seqüências de DNA codificam. Todas tais seqüências de DNA equivalentes são incluídas dentro do escopo desta invenção. Técnicas padrão para clonagem, isolamento de DNA, amplificação e purificação, para reações enzimáticas que envolvem DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e outras mais, e várias técnicas de separação são aquelas conhecidas e geralmente empregadas por aqueles versados na técnica. Várias técnicas padrão são descritas em Sambrook e outros (1989) Molecular Clonina. Second Edition, cold Spring Harbor Labora-tory, Plainview, New York; Maniatis e outros (1982) Molecular Clonina. Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (ed.) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (ed.) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu e outros (eds.) (1983) Meth. Enzymol. 100 and 101; Grossman and Moldave (eds.) Meth.

Enzymol. 65; Miller (ed.) (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose (1981) Principies of Gene Manipulation. University of Califórnia Press, Ber-kley; Schleif and Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Bioloqy ; Glover (ed.) (1985) DNA Clonina Vol. I and II, IRL Press, Oxford, UK; Hames and Higgins (eds.) (1985) Nucleic Acid Hvbridization. IRL Press, Oxford, UK; Setlow and Hollaender (1979) Genetic Enaineerina ; Principies and Methods. Vols. 1-4, Plenum Press, New York; e Ausubel e outros (1992) Current Pro-tocols in Molecular Bioloav. Greene / Wiley, New York, NY. Abreviações e nomenclatura, onde empregadas, são julgadas padrão no campo e geralmente empregadas em jornais profissionais tais como esses citados aqui. É dito que um polinucleotídeo codifica um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos conhecidos para a-queles na versados na técnica, pode ser transcrito e/ou transladado para produzir o polipeptídeo ou um fragmento deste. Também é dito que o filamento de anti-sentido de tal polinucleotídeo codifica a seqüência.

Uma seqüência de nucleotídeo é operavelmente ligada quando é colocada em uma relação funcional com outra seqüência de nucleotídeo. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se o promotor efetua sua transcrição ou expressão. Geralmente, operavelmente ligado significa que as seqüências que são ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões de codificação de proteína, contíguas e em estrutura de leitura. Entretanto, é bem conhecido que certos elementos genéticos, tais como realçadores, podem ser operavelmente ligados até mesmo a uma distância, isto é, até mesmo se não contíguo.

Esta invenção fornece métodos e kits para manter gravidez em mamíferos. Gravidez é mantida por administração de quantidades efetivas de hormônio de luteinização (LH) ou gonadotropina coriônica (CG). Ambos LH e CG podem ser empregados sozinhos, em combinação entre si, ou em combinação com hormônio de crescimento (GH) ou hormônio estimulante de folículo (FSH). Hormônios são administrados de preferência por volta do Dia 4 até aproximadamente o Dia 7 seguindo a inseminação. Quantidade efeti- vas de LH variam a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 25 miligramas e de CG variam a partir de cerca de 100 IU (unidades internacionais) a cerca de 2000 IU. Mamíferos tratáveis pelos métodos desta invenção incluem mamíferos relacionados e ungulados, incluindo bovinos. Kits fornecidos por esta invenção incluem quantidades eficazes de um ou mais hormônios, um dispositivo para administração do(s) hormônio(s) e instruções.

Na prática desta invenção, composições de hormônio desta invenção são administradas a mamíferos que possivelmente estão grávidos como resultado de inseminação, inseminação é executada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo inseminação artificiai. De preferência, inseminação é executada através de inseminação artificial cronometrada após sincronização de ovulação. Sincronização de ovulação opcionalmente inclui pré-sincronização de ovulação, e é executada de preferência pelos métodos desta invenção.

Na prática desta invenção, hormônio de luteinização é administrado a um ou mais mamíferos grávidos para manter gravidez. Um mamífero grávido pode ser um mamífero que possivelmente está grávido a partir de quando foi inseminado, de preferência durante estro, que nem mesmo pode ser detectavelmente grávido, e uma pluralidade de mamíferos grávidos pode ser uma pluralidade de mamíferos dos quais somente alguns estão grávidos.

Em uma modalidade desta invenção, LH é LH recombinante. O LH pode ser produzido em um baculovírus ou mamífero ou outro sistema de expressão. Em uma modalidade, LH recombinante é recuperado a partir do leite ou claras de ovo de um animal transgênico. Métodos de produção de proteínas recombinantes em animais transgênicos são bem conhecidos e foram descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 4.873.316, 5.322.775, 6.111.165, 6.472.584 e 6.528.699 e outros meios conhecidos na técnica.

Em outra modalidade, LH é purificado a partir de células pituitá-rias ou tecido pituitário. LH bovino pode ser purificado através de métodos conhecidos na técnica, e LH bovino purificado está disponível no mercado (AspenBio Inc., Castle Rock, CO, Scripps Laboratories, San Diego, CA e BioTrend, Cologne, Alemanha). LH bovino purificado também está disponível a partir do NIH National Hormone and Pituitary Program (NHPP, Torran-ce, CA). Quando LH recombinante é usado na prática desta invenção, o LH recombinante é estruturalmente semelhante e tem atividade semelhante a LH purificado nativo. LH recombinante pode ser feito empregando genes de LH mutantes e clonados que codificam peptídeos idênticos a LH nativo, ou tendo pelo menos cerca de 80 % de homologia para isso, mais preferivelmente tendo pelo menos cerca de 90 % de homologia para isso, e mais preferivelmente tendo pelo menos cerca de 95 % de homologia para isso e também sendo capaz de induzir ovulação em um mamífero. LH recombinante pode ser feito também empregando genes de LH mutantes e clonados que codificam peptídeos que não são idênticos a LH nativo, das espécies selecionadas, desde que o LH recombinante produzido tenha uma atividade similar como LH nativo. LH recombinante também pode ser feito de acordo com os métodos conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Na 20030059898 designada para Genzyme por Beck e outros, e números de patente 6.635.256, 6.242,580, 6.238.890, 6.225.449, 6.103.501, 6.028.177, 5.985.611, 5.958.737, 5.883.073, 5.792.460, 5.759.818, 5.733.735, 5.712.122, 5.705.478, 5.585.345, 5.405.945, 5.338.835 e 5.177.193, e Publicação de Patente dos Estados Unidos Números 20020160944, e 20010007757, e outros meios conhecidos na técnica.

Na prática desta invenção, hormônio de gonadotropina coriônico é de primatas, incluindo seres humanos, e cavalos. Hormônios das espécies a serem tratadas, como também hormônios de outras espécies são úteis na prática desta invenção. O emprego de hormônios das espécies a serem tratadas é menos provável de causar uma resposta imune no mamífero tratado.

Em uma modalidade desta invenção, hormônio de crescimento é somatotrofina bovina (bST). Em uma modalidade desta invenção, FSH é FSH humano ou FSH bovino.

Na prática desta invenção, gravidez é testada por qualquer teste de gravidez conhecido na técnica, incluindo ultra-som ou por teste por molé- cuias indicando gravidez, às vezes apropriado para as espécies selecionadas, como é conhecido na técnica, Quando o animal tratado for um bovino, gravidez pode ser testada por teste da presença de proteínas induzidas por interferon-tau por volta do Dia 15 (Pedido de Patente dos Estados Unidos ISF 60/377.987, 60.377.166, 60/380.043, 60/377.921, 60/377.165, 60/377.355, 60/377.829, e 60/380.042), e/ou através de ultra-som por volta dos Dias 28, 45, ou 56.

Na prática desta invenção, se um mamífero é determinado não estar grávido após a prática dos métodos desta invenção, o próximo ciclo de estro pode ser forçado através de métodos conhecidos na técnica.

Os métodos desta invenção são úteis em mamífero que está pela primeira vez em estro, esteve mais de uma vez em estro, nunca teve cria, teve uma ou mais crias, nunca foi administrado com uma composição de hormônio desta invenção para manter a gravidez, ou foi administrado previamente com uma composição de hormônio desta invenção para manter a gravidez. Os métodos desta invenção são especifica mente úteis em mamíferos que foram administrados com composições de hormônio desta invenção previamente com a finalidade de manter gravidez.

Em uma modalidade desta invenção, LH bovino é administrado a um bovino grávido, ou uma pluralidade de bovinos grávidos, por volta do Dia 4 até aproximadamente o Dia 7 após inseminação. Em uma modalidade desta invenção, LH bovino é administrado a um bovino grávido, ou uma pluralidade de bovinos grávidos, por volta do Dia 4 até aproximadamente o Dia 5 após a inseminação. Em uma modalidade desta invenção, LH bovino é administrado a um bovino grávido, ou uma pluralidade de bovinos grávidos, por volta do Dia 2 até aproximadamente o Dia 10 após a inseminação.

Em uma modalidade desta invenção, mamíferos grávidos podem ser controlados através de ultra-som para a presença de um folículo suficientemente maduro antes de administração de uma composição de hormônio desta invenção. Em uma modalidade desta invenção, um folículo maduro de um bovino é pelo menos cerca de 10 mm em diâmetro. Em uma modalidade desta invenção, após a administração de LH, ultra-som é execu- tado no mamífero para controlar ovulação e luteinização, (produção de corpo lúteo).

Em uma modalidade desta invenção, LH bovino é administrado em uma quantidade que varia a partir de cerca de 10 microgramas a cerca de 25 miligramas, a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 5 miligramas, a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 1 miligrama, a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 250 microgramas, a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 175 microgramas, ou a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 100 microgramas, ou a partir de cerca de 25 microgramas a cerca de 75 microgramas. Uma vaca média pesa cerca de 453,59 Kg a cerca de 680,38 Kg (1000 a cerca de 1500 libras). Em uma modalidade desta invenção, LH bovino é administrado em uma quantidade que equaciona a cerca de 10 nanogramas a cerca de 25 microgramas por libra de vaca.

Em uma modalidade desta invenção, CG humano é administrado em uma quantidade variante a partir de cerca de 100 IU a cerca de 2000 IU, a partir de cerca de 100 IU a cerca de 1750 IU, ou a partir de cerca de 250 IU a cerca de 1000 IU.

Em uma modalidade desta invenção, a composição de hormônio que deve ser administrada é cerca de 90 % pura, cerca de 95 % pura, cerca de 98 % pura, cerca de 99 % pura, ou cerca de 100 % pura, como determinado por um ensaio de purificação de proteina conhecido na técnica.

Mamíferos tratáveis pelos métodos desta invenção incluem mamíferos relacionados e ungulados. Mamíferos tratáveis pelos métodos desta invenção incluem, mas não são limitados a gado, ovelha, cabras, iaques, búfalos de água, bisão, antílopes, gazelas, alce, rena, alce americano, ovelhas de chifre grande, girafas, e camelos incluindo camelos dromedários e bactríano, lhamas, suínos, cavalos, alpacas, e vicunhas.

De preferência, uma composição de hormônio desta invenção é derivada a partir da mesma espécie como a espécie de mamífero a ser administrada com a referida composição. Se o mamífero for gado, de preferência a composição de hormônio a ser administrada na prática desta invenção compreende um ou mais hormônios que são todos derivados de gado ou a partir de genes de gado.

Em uma modalidade desta invenção, uma composição de hormônio a ser administrada também contém outros componentes úteis para injeção como conhecido na técnica. Outros componentes úteis para injeção incluem, mas não são limitados a, adjuvante e solução salina.

Em uma modalidade desta invenção, uma composição de hormônio desta invenção é administrada mais de uma vez após a inseminação. Em uma modalidade desta invenção, mais de uma composição de hormônio desta invenção é administrada.

Na prática desta invenção, gravidez é mantida em pelo menos cerca de quarenta por cento, pelo menos cerca de quarenta e dois por cento, pelo menos cerca de quarenta e cinco por cento, pelo menos cerca de cinqüenta por cento, pelo menos cerca de cinquenta e cinco por cento, ou pelo menos cerca de sessenta por cento de vacas tratadas empregando as composições e métodos desta invenção.

Embora a requerente não deseje ser limitada por uma teoria particular, administração após a inseminação de hCG e/ou bLH pode agir induzindo formação de corpo lúteo adicional que aumenta a secreção de proges-terona e aumenta concentrações de progesterona de soro durante o tempo crítico quando o útero deve reconhecer a gravidez, resultando em manutenção aumentada de gravidez.

Cistos foliculares não tratados em um animal aberto podem prevenir um animal normalmente de ciclo. Esta invenção também fornece um método útil no tratamento de cistos foliculares em mamíferos, mais preferivelmente, vacas. Pelo menos cerca de 2 mg até cerca de 10 mg de hormônio de luteinização deveríam ser injetados (de preferência intramuscular-mente) em uma vaca na qual um cisto folicular foi diagnosticado. Aqueles de versatilidade na técnica são capazes de aperfeiçoar dosagens com base no tamanho do animal, e os ensinos disso sem experimentação imprópria. Resolução bem-sucedida do cisto pode ser confirmada por ultra-som ou outros meios conhecidos na técnica. Se o animal está grávido e tem um corpo lúteo normal na presença do cisto, tratamento geralmente não é necessário.

Esta invenção também fornece métodos para sincronizar ovula-ção em uma pluralidade de animais fêmeas. Várias técnicas são conhecidas para sincronizar estro, muitas das quais pedem o emprego de hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH), um hormônio que é secretado a partir do hipotálamo e afeta o pituitário anterior. Esta invenção envolve substituição de GnRH com hormônio de luteinização. O LH fornece sincronização mais efetiva que GnRH. O LH é administrado em quantidades eficazes, de preferência em quantidades entre cerca de 2 mg e cerca de 10 mg em gado. Alguém versado na técnica pode aperfeiçoar dosagens com base em tamanho de animal e resposta sem experimentação indevida.

Um sistema de sincronização de estro conhecido na técnica é Sistema de MGA / GnRH / PGF2 (Wood, S. L., e outros (2001), "Improved synchrony of estrus and ovulation with the addition of GnRH to a melenges-trol acetate-prostaglandin synchronization treatment in beef heifers", J. Anim. Sei. 79: 2210 - 2216). Acetato de melengestrol (MGA) é uma progestina sintética oralmente ativa que foi desenvolvida para controlar estro em novilhas em confinamento (Lauderdale, e outros, 1977). Esta progestina pode ser empregada em sincronização estrual para imitar progesterona e pode estimular estro em novilhas. Uma vez que quantidades pequenas de MGA são usadas, ter cuidado quando misturar rações de volume para assegurar mesma distribuição ao longo da ração. PGF2 é prostaglandina, um hormônio liberado do útero uma vez que a fêmea reconhece que ela não está grávida. Prostaglandina faz o CL regredir ou diminuir e, uma vez que isto ocorre, concentrações de progesterona diminuem rapidamente. O sistema de MGA / GnRH / PGF2 inclui as seguintes etapas: MGA alimentado durante 14 dias a 0,5 mg/hd/d. No dia 26, injetar um tiro de GnRH IM; seguir isso 7 dias depois (dia 33) por um tiro de prostaglandina IM. Checagem de calor e procriação a partir do dia 33 a dia 38.

Alimentar MGA Não procriar; GnRH PGF2a (0,5 mg/hd/d) calores inférteis Checagem de calor podem ocorrer e procriação No sistema desta invenção, usado para sincronização de ovula-ção, LH na dosagem descrita acima é administrado em vez de GnRH. Se desejado, o animal pode ser gerado imediatamente após o este tratamento. Nesta invenção, progestina pode ser substituída por MGA. MGA é ilegal para emprego em lactação de vacas leiteiras, mas o método é útil para produtores de carne de boi.

Outros sistemas de sincronização de estro conhecidos na técnicas incluem o sistema Select Synch. Este sistema compreende as seguintes etapas: Injetar GnRH intramuscularmente (IM) no dia 0, seguido por prosta-glandina IM no dia 7. Pesquisa por Geary e Whittier (Geary, T. W., e J. C. Whittier (1999), "Various protocole for synchronization of estrus or ovulation using GnRH and prostaglandina”, 1999 Beef Program Report, Departament of Anim. Sei., Colorado State University) taxas de gravidez de relatório de 61 por cento para gado criado baseado em calor parado.

Seleção Synch Outro método de sincronização de estro é o sistema Co-Synch (Geary, T. W., e J. C. Whittier (1999), "Various protocols for synchronization of estrus or ovulation using GnRH and prostaglandin", 1999 Beef Program Report, Departament of Anim. Sei. , Colorado State University) que envolve as seguintes etapas: injetar GnRH IM no dia 0, seguido por prostaglandina IM no dia 7. Injetar GnRH de novo no dia 9; e então cronometrar a procriação.

Um sistema de sincronização de estro adicional é o sistema Ov-Synch (Geary, T. W., e J. C. Whittier (1999), "Various protocols for synchro-nization of estrus or ovulation using GnRH and prostaglandin", 1999 Beef Program Report, Departament of Anim. Sei., Colorado State University), que envolve as etapas seguintes: Injetar GnRH IM no dia 0, seguido por prosta-glandina IM no dia 7. Injetar GnRH de novo no dia 9, e cronometrar a procri-ação no dia 10.

Outro programa de sincronização de estro comum em gado leiteiro é chamado Heatsynch que emprega GnRH (dia 0), PGF (dia 7), e então cipronato de estradiol (ECP) (dia 8). Vacas são observadas quanto a calor e geradas em qualquer calor. Qualquer vaca que não é encontrada em calor são cronometradas procriação 48 horas após a injeção de ECP (dia 10).

Nos sistemas desta invenção, LH é substituído por GnRH nas dosagens descritas acima.

Os exemplos seguintes são fornecidos para propósitos ilustrativos, e não são pretendidos para limitar o escopo da invenção como reivindicado aqui. Quaisquer variações nos artigos exemplificados que ocorrem para o técnico versado são pretendidas incluírem-se no escopo da presente invenção.

Exemplos Exemplo 1 Expressão de bLH Recombinante em um Sistema de Expressão de Baculo-vfrus.

Seqüências de DNA que codificam as subunidades de hormônio de luteinização bovino alfa e beta são ligadas em um vetor de transferência bacteriano. Suplementos para purificação de proteína são incluídos opcionalmente. O suplemento é flanqueado por porções de genes virais para permitir recombinação homóloga com DNA defectivo, linear, viral de replica-ção. A direção dos suplementos relativos ao promotor de poliedro é verificada. As seqüências dos suplementos são opcionalmente verificadas. Plasmí-deos são purificados para transfecção em células de inseto. Células de inseto são co-transfectadas com os vetores de transferência recombinante de LH alfa e beta e vetor viral linearizado. Opcionalmente, transfecções de LH alfa e beta são executadas individualmente. Métodos de transformação e transfecção são bem conhecidos na técnica e incluem eletroporação, lipídio, e métodos de transformação mediada por fosfato de cálcio. Vírus replicativos se formam por recombinação homóloga intracelular entre as extremidades das moléculas virais e porções do vetor de transferência que flanqueia LH alfa e beta. LH bovino alfa e beta são inseridos no gene(s) viral(s) defectivo(s) de complemento e vírus para permitir replicação viral. Proteínas de marcador são opcionalmente incluídas e expressas em eventos de inserção selecionados.

Os sobrenadantes de célula transfectada são colhidos. Células de inseto são infectadas com diluições do sobrenadante para isolar placas de vírus únicas que opcionalmente expressam proteínas de marcador. Células de inseto adicionais são infectadas com virus a partir de placas selecionadas para ampliar a quantidade e titulagem de estoques virais. Expressão de proteína é examinada opcionalmente por Western Blotting. Atividade e expressão de proteína são testadas por bioensaio.

Exemplo 2 Sincronização de Estro e Controle de Inseminação artificial Várias centenas de vacas foram induzidas a ovular usando um protocolo de sincronização de estro padrão, artificialmente inseminadas, e intravenosamente foram administradas com água estéril.

Nos Dias 14 e 21 soro foi coletado para ensaio de progesterona. Estes tempos de coleção representam o período crítico para progesterona manter gravidez, e o tempo esperado de concentração de progesterona mais baixa se o animal não está grávido e retornar a estro. Exame de ultra-som das estruturas ovarianas foi executado nos Dias 14 e 21 para avaliar a correlação de tamanho de CL e concentração de progesterona, e permitir comparação de ambas as medições com tratamento e com resultado da procriação. Nos Dias 28, 35, e 56 após a inseminação, exame de ultra-som do útero foi empregado para determinar o estado de gravidez. Dia 28 é o tempo mais cedo para visualizar uma gravidez confiantemente. Gravidez foi monitorada de perto nestas vezes para determinar taxas de perda embrionária e resultado final de cada procriação.

Dados foram analisados através de software estatístico (SAS). Efeitos de estação e rebanho foram analisados empregando ANOVA e análise de regressão. No Dia 56, 38 % de vacas tratadas estavam grávidas. Exemplo 3 Administração de 1660 IU de hCG no Dia 7 após a Inseminação Semanalmente, vacas ao término do período de espera eletivo foram induzidas a ovular empregando um protocolo de sincronização de estro padrão, e na hora da procriação cada vaca foi designada ao tratamento ou grupo de controle (Exemplo 2) em uma base alternante. No Dia 7, vacas de pós-procriação foram intramuscularmente administradas com 1.660 IU de hCG. (O padrão da Organização Mundial de Saúde para atividade de hCG foi determinado ser aproximadamente 10.000 IU por miligrama).

Nos Dias 14 e 21, soro foi coletado para ensaio de progesterona. Estes tempos de coleção representam o período critico para progesterona manter gravidez, e o tempo esperado de concentração de progesterona mais baixa se o animal não está grávido e retorna a estro. Exame de ultra-som das estruturas ovarianas foi executado nos Dias 14 e 21 para avaliar a correlação de tamanho de CL e concentração de progesterona, e permitir a comparação de ambas as medições com tratamento e com resultado da procriação. Nos Dias 28, 35, e 56 após a inseminação, exame de ultra-som do útero foi empregado para determinar o estado de gravidez. O Dia 28 é o tempo mais cedo para visualizar confiantemente uma gravidez. Gravidez foi monitorada de perto nestas vezes para determinar taxas de perda embrioná- ria e resultado final de cada procriação. Várias centenas de vacas foram testadas. Dados foram analisados por software estatístico (SAS). Efeitos de estação e rebanho foram analisados empregando ANOVA e análise de regressão. No Dia 56, 50 % de vacas tratadas estavam grávidas.

Exemplo 4 Administração de 830 IU de hCG no Dia 7 após a Inseminação Várias centenas de vacas ao término do período de espera eletivo foram induzidas a ovular usando um protocolo de sincronização de estro padrão, e na hora da procriação cada vaca foi designada ao tratamento ou grupo de controle (Exemplo 2) em uma base altemante. No Dia 7, vacas de pós-procriação foram intramuscularmente administradas com 1.660 IU de hCG.

Nos Dias 14 e 21, soro foi coletado para ensaio de progestero-na. Exame de uitra-som das estruturas ovarianas foi executado nos Dias 14 e 21 para avaliar a correlação de tamanho de CL e concentração de proges-terona, e permitir a comparação de ambas as medições com tratamento e com resultado da procriação. Nos Dias 28, 35, e 56 após a inseminação, exame de ultra-som do útero foi empregado para determinar estado de gravidez. Gravidez foi monitorada de perto nestas vezes para determinar taxas de perda embrionária e resultado final de cada procriação. Várias centenas de vacas foram testadas. Dados foram analisados através de software estatístico (SAS). Efeitos de estação e rebanho foram analisados empregando ANOVA e análise de regressão. No Dia 56, 52 % de vacas tratadas estavam grávidas.

Exemplo 5 Administração de 830 IU de hCG no Dia 5 após a Inseminação Vacas são forçadas em estro, artificialmente inseminadas, e intramuscularmente administradas com 830 IU de hCG no Dia 5 após a inseminação. Soro é coletado nos Dias 14 e 21 e ensaiado para progesterona. Ultra-som é executado nos Dias 14 e 21. Exame de ultra-som é executado nos Dias 28, 35, e 56. No Dia 56, pelo menos cerca de 50 % de vacas estão grávidas.

Exemplo 6 Administração de 156. 83. 25 e 10 microaramas e 1. 10 e 25 ma de bLH no Dia 5 após a Inseminação.

Vacas são forçadas em estro, artificial mente inseminadas, e in~ tramuscularmente administradas com 156, 83, 25 e 10 microgramas ou 1, 10 e 25 mg de bLH, purificadas a partir de pituitário bovino, no Dia 5 após a inseminação. Soro é coletado nos Dias 14 e 21 e ensaiado para progestero-na. Ultra-som é executado nos Dias 14 e 21. Exame de ultra-som é executado nos Dias 28, 35, e 56. No Dia 56, melhoria em manutenção de gravidez é mostrada comparada a vacas não administradas com bLH ou outro hormônio, e vacas administradas com hCG somente.

Exemplo 7 Administração de 156. 83. 25 e 10 microaramas e 1. 10 e 25 ma de bLH no Dia 5 após a Inseminação.

Vacas são forçadas em estro, artificialmente inseminadas, e in-tramuscularmente administradas com 156, 83, 25 e 10 microgramas ou 1, 10 e 25 mg de bLH recombinante, obtido a partir de um sistema de expressão de baculovírus (Exemplo 1), no Dia 5 após a inseminação. Soro é coletado nos Dias 14 e 21 e analisados para progesterona. Ultra-som é executado nos Dias 14 e 21. Exame de ultra-som é executado nos Dias 28, 35, e 56. No Dia 56, melhoria em manutenção de gravidez é mostrada comparada a vacas não administradas com bLH ou outro hormônio, e vacas administradas somente com hCG.

Exemplo 8 Administração Intravenosa de 10 microaramas de bLH no Dia 5 após a Inseminação.

Vacas são forçadas em estro, artificialmente inseminadas, e in-travenosamente administradas com 10 microgramas de bLH, purificados a partir de pituitário bovino, no Dia 5 após a inseminação. Soro é coletado no Dias 14 e 21 e analisados para progesterona. Ultra-som é executado nos Dias 14 e 21. Exame de ultra-som é executado nos Dias 28, 35, e 56. No Dia 56, melhoria em manutenção de gravidez é mostrada comparada a va- cas não administradas com bLH ou outro hormônio, e vacas somente administradas com hCG.

Exemplo 9 Desenvolvimento de Acessório de Coroo Lúteo Adicional Testes foram executados durante um período de três meses utilizando um total de 31 vacas em oito testes diferentes. Hormônio de luteini-zação bovino foi administrado em níveis de dosagem variantes, de 0,5 mg a 8 mg em solução salina estéril para vacas quatro dias após a inseminação artificial. Testes determinaram que um nível de dosagem efetivo era 2 mg, intravenosamente, ou maior. Empregando esta dosagem de 2 mg em um teste limitado de 15 vacas, pudemos ser capazes de criar pelo menos um acessório de corpo lúteo em doze vacas (80 % de resposta). Ovários foram examinados através de ultra-som ambos antes e após o tratamento que emprega um Sonosite VET180plus com um transdutor de setor de banda larga de 11 mm com uma faixa de 4 - 7 MHz. A varredura após tratamento foi executada sete dias após a injeção. Os resultados são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Produção de Comus Luteum Adicional Através de Iniecão de Hormônio de Luteinizacão Bovino. * Resposta - desenvolvimento de pelo menos um acessório de corpo lúteo.

Esta resposta é comparável à formação de acessório de corpo lúteo achado após administrar uma dose de gonadotropina coriônica huma- na (hCG) para lactação de gado leiteiro.

Exemplo 10 Tratamento de Cistos Foliculares em Gado.

Três vacas não-grávidas, não-inseminadas foram examinadas através de ultra-som para determinar a presença de cistos foliculares. As vacas foram tratadas com injeções de 2 mg de hormônio de luteinização em solução salina. Sete vacas mais não-grávidas, não-inseminadas diagnosticadas com cistos foliculares foram tratadas como acima. Quarenta e oito horas após o tratamento, as vacas são examinadas quanto à presença de cistos usando ultra-som para confirmar que os cistos resolveram.

Exemolo 11 Sincronização de Ovulacão Em dez vacas não-grávidas não exibindo sinais de estar em calor, são injetado 2 mg de hormônio de luteinização, IM. Sete dias depois, 25 mg de prostaglandina são injetados IM nas vacas. 9 dias depois, 2 mg de hormônio de luteinização são injetados de novo nas vacas. As vacas são inseminadas artificialmente dentro de algumas horas após a segunda injeção de hormônio de luteinização, resultando em uma taxa de gravidez maior que cerca de quarenta por cento. Comparado com o emprego de GnRH, o emprego de LH fornece sincronização mais segura e uma maior taxa de gravidez.

Exemolo 12 Clonagem de subunidade alfa de bLH RNA foi extraído a partir de 1 glândula pituitária bovina empregando RNeasy Midiprep (Qiagen cat ne 75142). RT-PCR foi executado empregando-se o RT PCR de Uma Etapa Superscript com Platina Taq (Invitro-gen cat na 10928-034). Iniciadores empregados nesta reação foram bLH alfa BamH1 U (GGATCCATGGGATTACTACAGAAA) e bLH alfa RI L (GA-ATTCTTAGGATTTGTGATAATAAC). Produto de RT-PCR foi purificado por gel empregando QiaQuick (Qiagen cat ns 28704). Produto purificado foi polido e ligado em vetor de clonagem pCRScript empregando reagentes de kit (Statagene cat na 211188). Ligação foi transformada em E. Coli Top10 eletro competente (Invitrogen cat na C4040-50) e banhada sobre ágar LB com am-picilina. Transformantes foram analisados através de sumário de restrição empregando BamHI (NEB cat nc R0136S) e sequência confirmada através de seqüenciamento de DNA (MMR), Exemplo 13 Clonagem de subunldade beta de bLH RNA foi extraído de 3 glândulas pituitárias bovinas empregando Tri-Reagente BD (Sigma cat ns T3809). DNA foi sintetizado empregando o Kit de Síntese de iScript cDNA (BioRad cat ns 170-8890). PCR primário foi executado empregando o cDNA acima, DNA de Fenda Profunda Polimerase (NEB cat n° 170-8890) e os seguintes iniciadores: bLH-B L 9-9-0 (TTTCCAGAGTTAGGATGGGCATGG) e bLH-B U 9-9-03 (CAAGGATGGAGATGTTCCAGGGAC). PCR secundário foi executado empregando o produto de PCR primário como modelo, DNA de Fenda Profunda Polimerase e os seguinte iniciadores: 5’bglMEbLHb (AG AT CTAT G G AG AT GTT CC AG G G ACT G) e 3’bLHbetaR1 (GAATTCAGTGGGGCATCCTTAGAGGAAGAG). Produto de PCR secundário foi purificado por gel empregando QiaQuick e reação de extensão de adenosina executado empregando PCR Master Mix (Promega cat n2 M7501). O produto foi ligado em pCR2.1 TOPO Cloning Vector (Invitrogen cat ns K4500-01). Ligação foi transformada em E. Coli Top 10F’ químico competente (Invitrogen cat na C3030-03) e banhada sobre ágar LB com ampicilina. Transformantes foram analisados por sumário de restrição empregando EcoRI (NEB cat n2 R0101S) e seqüência confirmada através de seqüenciamento de DNA (Lark Technologies).

Exemplo 14 Estratégias de Expressão de Inseto Expressão de Baculovírus LH alfa e beta bovinos são inseridos em pBac4x-1 (Novagen cat ns 70045-3) separadamente e juntos para igualmente expressão individual e dual empregando o sistema de Expressão de Baculovírus BacVector (Novagen cat n2 70077) em sf9, Sf21, e células de inseto High Five. LH alfa e beta bovinos são inseridos em pFastBack Dual (Invitrogen cat n210712-024) para expressão dual em Sf9,Sf21, e células de inseto High Five. LH bovino alfa em pBac4x-1 bLH alfa em pCRScript e pBac4X-1 foram digeridos com Notl (NEB cat n3 R0189S) e Xhol (NEB cat na R0146S). Suplemento alfa de bLH e vetor cortado foram purificados por gel empregando QiaQuick e ligados empregando T4 DNA Ligase (NEB cat na; M0202S). Ligação foi transformada em E. Coli Top10 eletro competente e banhada sobre ágar de LB com ampicilína. Transformantes foram analisados por sumário de restrição empregando Notl e Xhol e seqüência era confirmada através de seqüencia-mento de DNA (Lark Technologies). LH bovino beta em oBac4x-1 bLH beta em pCR2.1 e pBac4x-1 foram digeridos com Bgl II (NEB cat n° R0144S) e EcoRI. Suplemento de bLH beta e vetor cortado foram purificados por gel empregando QiaQuick e ligados empregando T4 DNA Ligase (NEB). Ligação foi transformada em Azul XLI eletrocompetente e banhada sobre ágar LB com ampicilina. Os transformantes foram analisados por sumário de restrição empregando Bgl II e EcoRI e seqüência foi confirmada através de seqüenciamento de DNA (Lark Technologies). LH bovino alfa e beta em pBac4x-1 bLH alfa e bLH beta, cada qual em pBac4x-1, foram cortados com Agel (NEB cat n3 R0552S) e Bgl II. O fragmento que contém o suplemento alfa e o fragmento que contém a subunidade beta foram purificados por gel empregando QIAex II (Qiagen cat na; 20021). Fragmentos foram ligados juntos empregando T4 DNA Ligase (NEB). Ligação foi transformada em E. coli Top10 químico competente e banhada sobre ágar LB com ampicilina. Transformantes foram analisados por sumário de restrição empregando EcoRI e seqüência confirmada por seqüenciamento de DNA (Lark Technologies).

Expressão de Linhagem de Célula de Inseto LH alfa e beta bovinos são inseridos em plZ/V5-His (Invitrogen cat na V8000-01) e ρΙΒΑ/5-His (Invitrogen cat nc V8020-01) separadamente para co-expressão empregando o InsectSelect System para expressão de linhagem de célula estável em Sf9, Sf21 e células de inseto High Five. Co-expressão é executada empregando bLH alfa / pIZ / V5-His com bLH beta / plB / V5-His e também empregando bLH alfa / plB / V5-His com bLH beta / pIZ / V5-His. Linhagens estáveis que expressam cadeias únicas também são infectadas com baculovírus que codifica a cadeia complementar. LH alfa bovino em pIZ / V5-His bLH alfa em pBac4X-1 e pIZ / V5-His formam, cada qual, digeridos com BamHI e EcoRI. Fragmentos que contêm bLH alfa e pIZ / V5-His cortado foram purificados por gel empregando QIAex II. Fragmentos foram ligados juntos empregando T4 DNA Ligase (Invitrogen cat na 15224-017). Ligação foi transformada em E. coli Top10 eletrocompetente (Invitrogen cat ne C664-11) e banhada sobre ágar LB com Zeocina. Transformantes foram analisados através de sumário de restrição com Saci (NEB cat na R0156) e EcoRI e sequência confirmada através de seqüenciamento de DNA (Lark Technologies). LH beta bovino em pIZ / V5-His bLH beta em pCR2.1 foi digerido com Bgl II e EcoRI e, ρΙΖΑ/5-His foi digerido com BamHI e EcoRI. Fragmentos que contêm bLH beta e plZ/V5 -His cortado foram purificados por gel empregando QIAex II. Fragmentos foram ligados juntos empregando T4 DNA Ligase (Invitrogen). Ligação foi transformada em E. coli Top10 eletrocompetente e banhada sobre ágar LB com Zeocina. Transformantes foram analisados através de sumário de restrição com Saci e EcoRI e sequência confirmada por seqüenciamento de DNA (Lark Technologies) LH alfa bovino em dIB/V5-Hís e LH beta bovino em plB/V5-His A estratégia de clonagem segue plZ/V5-His com a exceção que seleção de clone ocorre empregando ampicilina e seleção de célula ocorre empregando blasticidina.

Exemplo 15 Estratégias de Expressão de Mamífero. LH alfa e beta bovinos são inseridos em pBudCE4.1 (Invitrogen cat na V532-20) para expressão dua! em células de mamífero COS7, CHO, 293 e 3T3. LH alfa e beta bovinos também são inseridos em pBudCE4.1 e pWE1 (ATCC cat nQ 87 678) separadamente para co-expressão em células de mamífero COS7, CHO, 293 e 3T3. Co-expressão é executada empregando bLH alfa / pBudCE4.1 com bLH beta / pWE1 e também empregando bLH alfa / pWE1 com bLH beta / pBudCE4.1.

Subunidades de LH alfa e beta bovino em pBudCE4.1 (Invitro-gen cat n2 V532-20) para expressão dual em células de mamífero COS7, CHO, 293 e 3T3 são como segue: bLH alfa é inserido em pBudCE4.1 que emprega sítios de Notl / Xhol. bLH beta é inserido em pBudCE4.1 que emprega sítios de BamH1/EcoR1. LH alfa e beta bovinos são inseridos em pWE1 que emprega BamH1 e EcoRI.

Exemolo 16 LH bovino recombinante de cadeia única LH bovino recombinante de cadeia única pode ser feito de acordo com os métodos descritos na Patente dos Estados Unidos 6.242.580, que descreve LH recombinante em que a subunidade beta é covalentemen-te ligada à subunidade alfa. Alternativamente, um ligador está presente entre as subunidades beta e alfa. Formas de cadeia única precisam de somente um único gene para serem transcritas durante produção de recombinante e são vantajosas sobre as formas diméricas em termos de estabilidade da proteína. SEQ ID NO: 1-4 apresenta as seqüências de nucleotídeo para subunidades de LH beta e alfa bovino. Vetores de expressão onde o terminal C da subunidade beta bovina é ligado ao terminal N da subunidade alfa bovina são transfectados em células de CHO para expressão.

Será apreciado por aqueles versados na técnica que métodos, composições, e kits diferentes daqueles especificamente descritos aqui estejam disponíveis na técnica e possam ser empregados na prática desta invenção. Todos os equivalentes funcionais conhecidos na técnica são pretendidos ser abrangidos dentro do escopo desta invenção.

Claims (17)

1. Método para manter uma ou mais gravidezes em um ou mais mamíferos, em que inseminação foi realizada nos referidos mamíferos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar entre 10 microgramas e 25 miligramas de hormônio de luteinização bovino recombinante de cadeia única aos referidos mamíferos no Dia 2 ao Dia 10 após a referida inseminação, em que o referido um ou mais mamíferos são bovinos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a gravidez é mantida em mais do que 40% dos referidos mamíferos.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a gravidez é mantida em mais do que 50% dos referidos mamíferos.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que nenhum outro hormônio é administrado ao referido mamífero quando o referido hormônio de luteinização bovino é administrado ao referido mamífero.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre 10 microgramas e 5 miligramas do referido hormônio de luteinização bovino recombinante de cadeia única é administrado no Dia 2 ao Dia 10 após a referida inseminação.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre 10 microgramas e 1 miligrama do referido hormônio de luteinização bovino recombinante de cadeia única é administrado no Dia 2 ao Dia 10 após a referida inseminação.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre 25 microgramas e 250 microgramas do referido hormônio de luteinização bovino recombinante de cadeia única é administrado no Dia 2 ao Dia 10 após a referida inseminação.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que entre 75 microgramas e 175 microgramas do referido hormônio de luteinização bovino recombinante de cadeia única é administrado no Dia 2 ao Dia 10 após a referida inseminação.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o referido hormônio de luteinização bovino no Dia 4 ao Dia 7 após a referida inseminação.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida gravidez é mantida no Dia 15 após a referida inseminação.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida gravidez é mantida no Dia 30 após a referida inseminação.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida gravidez é mantida no Dia 56 após a referida inseminação.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração é intramuscular.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que de 75 microgramas a 1 miligrama de hormônio de luteinização bovino são administrados aos referidos um ou mais mamíferos no Dia 4 ao Dia 7 após a referida inseminação.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que de 75 microgramas a 175 microgramas de hormônio de luteinização bovino são administrados aos referidos um ou mais mamíferos no Dia 4 ao Dia 7 após a referida inseminação.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar menos do que 1000 IU de gona-dotropina coriônica ao referido um ou mais mamífero além da administração do referido hormônio de luteinização bovino.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda administrar de 250 UI a 1000 UI de gonado-tropina coriônica humana ao referido um ou mais mamífero além da administração do referido hormônio de luteinização bovino.