BRPI0418683B1

BRPI0418683B1 - polinucleotìdeos referentes aos eventos cry1f 281-24-236 e cry1ac 3006-210-23

Info

Publication number: BRPI0418683B1
Application number: BRPI0418683A
Authority: BR
Inventors: John W Pellow; Laura Tagliani; Ping Song
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2004-03-26
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2016-05-17
Also published as: US7883850B2; US20110191900A1; HUE047016T2; AR046599A1; EP2333082B1; CN101027396B; EP1737964A1; BR122015009611B8; BRPI0418683A; CN101027396A; ES2743789T3; EP2862934A3; ES2531980T3; BRPI0418683B8; WO2005103266A1; EP2862934B1; EP2862934A2; EP2333082A1; US20050216969A1; US7179965B2

Abstract

linhagens transgênicas de algodão, cry1f e cry1ac, e sua identificação específica de evento. a presente invenção refere-se ao cruzamento de plantas e à proteção de plantas contra insetos. mais especificamnte, esta invenção inclui eventos de transformação inusitados de plantas de algodão, que compreendem uma ou mais seqüências de polinucleotédeos, como aqui descritas, inseridas dentro de um sítio ou sítios específicos dentro do genoma de uma célula de algodão. em modalidades altamente preferidas, as ditas seqüências de polinucleotídeos codificam as proteínas inibitórias de insetos lepidópteros, cry1f e cry1ac "combinadas". entretanto, a invenção em questão inclui plantas que têm um único evento cry1f ou cry1ac, como aqui descrito. adicionalmente, a invenção refere-se a plantas de algodão derivadas desse evento de transformação e ensaios para detectar a presença do evento em uma amostra. mais especificamente, a presente invenção fornece ensaios de dna e ensaios relacionados para detectar a presença de certos eventos de resistência a insetos em algodão. os ensaios baseiam-se nas seqüências de dna de constructos recombinantes inseridos dentro do genoma do algadão e das seqüências genômicas que flanqueiam os sítios de inserção. estas seqüências são singulares. baseado nessas seqüências de inserções e limítrofes, foram gerados inciadores específicos de eventos. a análise por pcr demonstrou que essas linhagens de algodão podem ser identificadas em diferentes genótipos de algodão por análise dos amplicons da pcr gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos de eventos. assim sendo, estes procedimentos e outros procedimentos afins podem ser usados para identificar singularmente essas linhagens de algodão. são fornecidos também kits e condições úteis para conduzir os ensaios. estes materiais e métodos podem ser usados também para auxiliar programas de enxertia, a fim de desenvolver traços no algodoeiro.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PQLINU-CLÊOTlDEOS REFERENTES AOS EVENTOS CRY1F 281-24-236 E CRY1AC 3006-210-23".

Antecedentes da Invenção O algodão é uma cultura de fibras importante. O cruzamento e a biotecnologia foram aplicados ao algodão para melhorar seus traços agronômicos e a qualidade do produto. Um desses traços agronômicos é a resistência a insetos, cujas vantagens ficam facilmente evidentes. Os genes que codificam proteínas inseticidas foram introduzidos em plantas de algodão. Para atenuar qualquer preocupação de que um dado tipo de inseto possa desenvolver resistência a um único tipo de proteína inseticida, frequentemente são desenvolvidas plantas que produzem dois tipos diferentes de proteínas inseticidas. Assim sendo, a possibilidade de um inseto ser hipoteticamente capaz de desenvolver resistência a "duas" proteínas inseticidas diferentes é extremamente baixa.

As proteínas e genes inseticidas CrylAc são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, patentes US n“ 6.114.138; 5.710,020; 6,251,656; e 6,229.004). As proteínas e genes inseticidas C/y1F também são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, patentes US n— 5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; e 6,573.240). A expressão de genes estranhos em plantas é influenciada por onde o gene estranho é inserido no cromossoma. Isto poderia ser em virtude da estrutura da cromatina (como por exemplo, heterocromatina) ou da proximidade de elementos de regulação tran seriei ona I (como por exemplo, in-tensificadores) perto do sítio de integração (Weisíng et aí., Ann. Rev. Genet 22:421-477 (1988)). Por exemplo, o mesmo gene no mesmo tipo de planta transgênica (ou outro organismo) pode apresentar uma ampla variação no nível de expressão entre eventos diferentes, Podem existir também diferenças em padrões espaciais ou temporais de expressão. Por exemplo, diferenças na expressão relativa de um transgene em vários tecidos vegetais podem não corresponder aos padrões esperados de elementos reguladores transcrícionais presentes no constructo gênico introduzido.

Assim sendo, é necessário criar e triar um grande número de eventos, para identificar um evento que expressa otimamente um gene de interesse introduzido. Com propósitos comerciais, é comum produzir centenas de milhares de eventos diferentes e triar estes eventos quanto a um único evento que tenha níveis e padrões de expressão desejados dos transge-nes. Um evento que tem níveis e/ou padrões desejados da expressão do transgene é útil para efetuar a introgressão do transgene para dentro de outros antecedentes genéticos por cruzamento de indivíduos não relacionados (outcrossing) sexual, usando métodos de cruzamento convencionais. A pro-gênie de tais cruzamentos mantém as características de expressão do transgene do transformante original. Esta estratégia é utilizada para assegurar uma expressão gênica confiável em inúmeras variedades que estão bem adaptadas às condições locais de desenvolvimento.

Seria vantajoso ser capaz de detectar a presença de um evento específico, para determinar se a progênie de um cruzamento sexual contém um transgene de interesse. Além disso, um método para detectar um evento específico seria útil para atender às regulamentações exigidas para aprovação e rotulação pré-comercialização de alimentos derivados de plantas de culturas transgênicas, por exemplo. É possível detectar a presença de um transgene por qualquer método bem conhecido de detecção de ácidos nu-cléicos, tal como a reação da poíimerase em cadeia (PCR) e hibridização de DNA usando sondas de ácidos nucléicos. Estes métodos de detecção enfocam genericamente elementos genéticos usados frequentemente, tais como promotores, terminadores, genes marcadores, e similares. Como resultado, tais métodos podem não ser úteis para discriminar entre eventos diferentes, particularmente aqueles produzidos usando o mesmo constructo de DNA, a menos que a seqüência do DNA cromossômico adjacente ao DNA inserido ("DNA flanqueador") seja conhecida. Um ensaio de PCR específico de evento foi discutido, por exemplo, por Windels et ai (Med. Fac. Lartdbouww, Univ. Gent 64/5b; 459462, 1999). Isto se referiu à identificação do evento de soja tolerante a glifosato 40-3-2 por PCR, usando um conjunto de iniciadores cobrindo a junção entre a inserção e o DNA flanqueador. Mais especificamen- te, um iniciador incluía a seqüência a partir da inserção e um segundo inicia-dor incluía a seqüência a partir do DNA flanqueador.

Os pedidos de patente US n— 2002/0120964 A1 e 2004/0009504 A 1 referem-se a um evento de afgodão PV-GHGT07 (1445) e composições e métodos para sua detecção. O documento WO 2004/011601 refere-se ao evento de milho MON863 e composições e métodos para sua detecção. O documento WO 2004/072235 refere-se ao evento de milho MON88913 e composições e métodos para sua detecção.

Entretanto, ao que se saiba até agora, nenhum desses procedimentos e materiais pôde ser usado para identificar especificamente algodão combinado Cry1F e/ou CrylAc, como discutido abaixo.

Breve Sumário da Invenção Esta invenção refere-se ao cruzamento de plantas e à proteção de plantas contra insetos. Mais especificamente, esta invenção inclui eventos de transformação inusitados de plantas de algodão, que compreendem uma ou mais seqüências de polinucleotídeos, como aqui descritas, inseridas dentro de um sítio ou sítios específicos dentro do genoma de uma célula de algodão. Em modalidades altamente preferidas, as ditas seqüências de poíi-nucleotídeos codificam as proteínas inibitórias de insetos lepidópteros, Cry1F e CrylAc "combinadas". Entretanto, a invenção em questão inclui plantas que têm um único evento Cry1F ou CrylAc, como aqui descrito.

Adicionalmente, a invenção em questão fornece ensaios para detectar a presença de um ou mais dos eventos em questão em uma amostra. A presente invenção fornece ensaios de DNA e ensaios relacionados para detectar a presença de certos eventos de resistência a insetos em algodão. Os ensaios baseiam-se nas seqüências de DNA de constructos re-combinantes inseridas dentro do genoma do algodão e das seqüências ge-nômicas que flanqueiam os sítios de inserção. São fornecidos também kits e condições úteis para conduzir os ensaios.

Assim sendo, a invenção em questão refere-se em parte à clonagem e análise das seqüências de DNA de uma inserção integral cry1F, inserções integrais crylAc, e suas regiões limítrofes (em linhagens transgê- nicas de algodão). Estas sequências são singulares. Baseado nessas se-qüências de inserções e limítrofes, foram gerados iniciadores específicos de eventos. A análise por PCR demonstrou que esses eventos podem ser identificados por análise dos amplicons da PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos de eventos. Assim sendo, estes procedimentos e outros procedimentos afins podem ser usados para identificar singularmente linhagens de algodão que compreendem um ou mais eventos da presente invenção.

Breve Descrição das Figuras A Figura 1 ilustra o transgene cry1F inserido e as seqüências flanqueadoras para o evento de algodão 281-24-236. Esta figura ilustra também os amplicons e iniciadores aqui descritos. A Figura 2 ilustra o transgene c/ylAc inserido e as seqüências flanqueadoras para o evento de algodão 3006-210-23. Esta figura ilustra também os amplicons e iniciadores aqui descritos.

Breve Descrição das Seqüências SEQ ID N°: 1 é a seqüência de DNA para a inserção do evento 281-24-236 de cry1F e suas seqüências limítrofes. SEQ ID N°: 2 é a seqüência de DNA para a inserção do evento 3006-210-23 de c/y1Ac e suas seqüências limítrofes. SEQ ID N°: 3 é a seqüência do iniciador anverso "281-14" usado com o iniciador reverso "281-15" para ampliar um amplicon de 603 bp que cobre a junção 5' entre as regiões flanqueadoras e de inserção do evento 281-24-236 de c/y1F. SEQ ID N°: 4 é a seqüência do iniciador reverso "281-15" usado com o iniciador anverso "281-14" para ampliar um amplicon de 603 bp que . cobre a junção 5' entre as regiões flanqueadoras e de inserção do evento 281-24-236 de cry1F. SEQ ID N°: 5 é a seqüência de 603 bp do amplicon produzido usando os iniciadores de SEQ ID NoS: 3 e 4, SEQ ID N°: 6 é a seqüência do iniciador anverso "281-9" usado com o iniciador reverso "281-10" para ampliar um amplicon de 562 bp que cobre a junção 3' entre as regiões flanqueadoras e de inserção do evento 281-24-236 de cry1F. SEQ ID N°: 7 é a seqüência do iniciador reverso "281-10" usado com o iniciador anverso "281-09" para ampliar um amplicon de 562 bp que cobre a junção 3' entre as regiões flanqueadoras e de inserção do evento 281-24-236 dec/y1F. SEQ ID N°: 8 é a seqüência de 562 bp do amplicon produzido usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 6 e 7. SEQ ID N°: 9 é a seqüência do iniciador anverso "3006-20" usado com o iniciador reverso "3006-22" para ampliar um amplicon de 614 bp que cobre a junção 5’ entre as regiões flanqueadoras e de inserção do evento 3006-210-23 de c/y1Ac. SEQ ID N°: 10 é a seqüência do iniciador reverso "3006-22” u-sado com o iniciador anverso ”3006-20" para ampliar um amplicon de 614 bp que cobre a junção 5' entre as regiões flanqueadoras e de inserção do evento 3006-210-23 de cryVKc. SEQ ID N°: 11 é a seqüência de 614 bp do amplicon produzido usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10. SEQ ID N°: 12 é a seqüência do iniciador anverso "3006-9" usado com o iniciador reverso "3006-12" para ampliar um amplicon de 662 bp que cobre a junção 3' entre as regiões de inserção e flanqueadora do evento 3006-210-23 de cryA Ac. SEQ ID N°: 13 é a seqüência do iniciador reverso "3006-12" u-sado com o iniciador anverso "3006-9" para ampliar um amplicon de 662 bp que cobre a junção 3’ entre as regiões flanqueadora e de inserção do evento 3006-210-23 de cry1 Ac. SEQ ID N°: 14 é a seqüência de 662 bp do amplicon produzido usando os iniciadores de SEQ ID NOS: 12 e 13. SEQ ID N°: 15 é um segmento do DNA genômico de algodão para o evento 281-24-236 (53 bases faltantes). SEQ ID N°: 16 é um segmento do DNA genômico de algodão para o evento 3006-210-23 (16 bases faltantes).

Descrição Detalhada da Invenção Esta invenção refere-se ao cruzamento de plantas e proteção de plantas contra insetos. Mais especificamente, esta invenção inclui eventos de transformação inusitados de plantas de algodão (como por exemplo, Gossypium hirsutum e Gossipium barbadense), compreendendo uma ou mais seqüências de polinucleotídeos, como aqui descritas, inseridas dentro de um sítio ou sítios específicos dentro do genoma de uma célula de algodão. Em modalidades altamente preferidas, as ditas seqüências de polinucleotídeos codificam as proteínas inibitórias de insetos lepidópteros, Cry1 F e CrylAc, "combinadas". Entretanto, a invenção em questão inclui plantas que têm os eventos Cry1F e CrylAc individuais, como aqui descrito.

Adicionalmente, a presente invenção fornece ensaios para detectar a presença de um ou mais dos eventos em questão em uma amostra. Os aspectos da invenção em questão incluem métodos para desenhar e/ou produzir qualquer uma das moléculas de ácidos nucléicos diagnosticas, aqui exemplificadas ou sugeridas, particularmente aquelas baseadas total ou parcialmente nas seqüências flanqueadoras em questão.

Mais especificamente, a presente invenção refere-se em parte a dois eventos transgênicos de algodão (crylF 281-24-236 e crylAc 3006-210-23), linhagens de plantas que compreendem estes eventos, e a clonagem e análise das seqüências de DNA desta inserção cry1 F, destas inserções cry 1Ac, e/ou as suas regiões limítrofes. As linhagens de plantas da presente invenção podem ser detectadas usando as seqüências aqui descritas e sugeridas.

Em modalidades preferidas, esta invenção refere-se a linhagens de algodão resistentes a insetos, e sua identificação, que produz duas proteínas inseticidas "combinadas", conhecidas como CrylF e CrylAc. Em modalidades preferidas, uma linhagem de planta da presente invenção compreende o evento de crylF 281-24-236 e o evento de crylAc 3006-210-23. Entretanto, as plantas da presente invenção podem compreender um ou, de preferência, ambos eventos aqui discutidos.

Como aludido acima, na seção de Antecedentes da Invenção, a introdução e integração de um transgene dentro de um genoma vegetal envolvem alguns eventos aleatórios (daí o nome "evento" para uma dada inserção que é expressada). Isto é, com muitas técnicas de transformação, tais como transformação em Agrobacterium, a "pistola de genes", e WHIS-KERS, é imprevisível aonde no genoma um transgene ficará inserido. Assim sendo, identificar o DNA genômico vegeta! flanqueador em ambos lados da inserção pode ser importante para identificar uma planta que tem um dado evento de inserção. Por exemplo, podem ser desenhados iniciadores de PCR que geram um amplicon de PCR através da região de junção da inserção e o genoma hospedeiro. Este amplicon de PCR pode ser usado para identificar um tipo singular ou distinto de evento de inserção.

Como os "eventos" são eventos aleatórios e geralmente não podem ser duplicados, como parte desta revelação, pelo menos 2.500 sementes de uma linhagem de algodão, compreendendo o evento de cry1F 281-24-236 e o evento de c/y1Ac 3006-210-23, foram depositadas, e tornadas disponíveis para o público sem restrição (mas sujeitas a direitos de patente), junto à American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD 20852, U-SA. O depósito foi designado como Depósito da ATCC Ns PTA-6233. O depósito será mantido sem restrição no depositário ATCC, que é um depositó-rio público, por um período de 30 anos, ou cinco anos depois da solicitação mais recente, ou durante a validade efetiva da patente, o que for mais longo, e será substituído caso se torne inviável durante esse período.

As sementes depositadas fazem parte da presente invenção. Evidentemente, plantas de algodão podem ser desenvolvidas a partir dessas sementes, e tais plantas fazem parte da presente invenção. A presente invenção refere-se também a sequências de DNA contidas nessas plantas de algodão, que são úteis para detectar essas plantas e sua progênie. Os métodos de detecção e os kits da presente invenção podem ser direcionados para identificar qualquer um, dois ou mesmo todos os três desses eventos, dependendo do propósito final do teste.

As definições e os exemplos são aqui fornecidos para ajudar a descrever a presente invenção e orientar os versados nessas técnicas a pra- ticar a invenção. A menos que diferentemente indicado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados nas técnicas relevantes. Utiliza-se a nomenclatura para bases de DNA conforme estabelecida em 37 CFR § 1.822.

Um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vegetais com DNA heterólogo, isto é, um constructo de ácidos nucléicos que inclui um transgene de interesse, regeneração de uma população de plantas resultante da inserção do transgene dentro do genoma da planta, e seleção de uma planta específica distinguida pela inserção dentro de um local específico do genoma. O termo "evento" refere-se ao transformante original e a progênie do transformante, progênie esta que inclui o DNA heterólogo. O termo "evento" refere-se também à progênie produzida por um cruzamento sexual de indivíduos não relacionados {outcrossing) entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgênico. Mesmo depois de repetido o retrocruzamento até um ascendente, o DNA do transgene inserido e o DNA genòmico flanqueador (DNA genômi-co/transgênico) do ascendente transformado estão presentes na progênie do cruzamento no mesmo locai cromossômico. O termo "evento" refere-se também ao DNA do transformante original e sua progênie, que compreende o DNA inserido e a seqüência genômica flanqueadora imediatamente adjacente ao DNA inserido que se esperaria seja transferido para uma progênie que recebe o DNA inserido que inclui o transgene de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (como por exemplo, o transformante original e a progênie resultante da autogamia) e uma linhagem parental que não contém o DNA inserido.

Uma "seqüência de junção" cobre o ponto no qual o DNA inserido dentro do genoma é ligado ao DNA do genoma nativo de algodão que flanqueia o ponto de inserção, sendo que a identificação ou detecção de uma ou da outra entre as seqüências de junção em um material genético da planta é suficiente para ser diagnóstico para o evento. Estão incluídas as seqüências de DNA que cobrem as inserções em eventos de algodão aqui descritos e comprimentos similares do DNA flanqueador. Os exemplos es- pecíficos de tais seqüências diagnosticas são aqui fornecidos; entretanto, outras seqüências que se sobrepõem às junções das inserções, ou as junções das inserções e a seqüência genômica, também são diagnosticas e poderíam ser usadas de acordo com a invenção em questão. A presente invenção refere-se à identificação de tais seqüências de fianqueamento, junção e inserção. Os iniciadores e amplicons da PCR relacionados estão incluídos na invenção. De acordo com a presente invenção, os métodos de análise por PCR, usando amplicons que cobrem o DNA inserido inteiro e seus limites (de Cry1F 281-24-236 e/ou Cry 1Ac 3006-210-23) podem ser usados para detectar ou identificar variedades ou linhagens transgênicas de algodão comercializadas, derivadas das linhagens transgê-nicas de algodão patenteadas em questão.

As seqüências inteiras de cada uma dessas inserções, junto com as respectivas seqüências flanqueadoras, são aqui fornecidas como SEQ ID N°: 1 (c/y1F 281-24-236) e SEQ ID NO 2 (cry 1Ac 3006-210-23). A Tabela I fornece as coordenadas da inserção e das seqüências flanqueadoras para estes eventos.

Tabela I________________________________________________________________ Estes eventos de inserção, e componentes adicionais deles, estão ilustrados ainda mais nas Figuras 1 e 2. Estas seqüências (particularmente as seqüências flanqueadoras) são singulares. Baseado nestas seqüências de inserções e limítrofes, foram gerados iniciadores específicos de eventos. A análise por PCR demonstrou que essas linhagens de algodão podem ser identificadas em diferentes genótipos de algodão por análise dos amplicons da PCR gerados com esses conjuntos de iniciadores específicos de eventos. Assim sendo, estes procedimentos e outros procedimentos afins podem ser utilizados para identificar singularmente estas linhagens de algodão. As sequências aqui identificadas são singulares. Por exemplo, buscas por BLAST contra bases de dados do GENBANK não revelaram qualquer homologia significativa entre as seqüências limítrofes clonadas e as sequências existentes na base de dados.

As técnicas de detecção da presente invenção são especialmente úteis, em conjunto com o cruzamento de plantas, para determinar quais plantas progênitas compreendem um dado evento, depois que uma planta parental que compreende um evento de interesse é cruzada com outra linhagem da planta, em um esforço para conferir um ou mais traços de interesse adicionais à progênie. Estes métodos de análise por PCR beneficiam programas de cruzamento de algodão, bem como o controle de qualidade, especialmente para sementes de algodão transgênicas comercializadas. Kits de detecção por PCR para estas linhagens transgênicas de algodão também podem ser agora fabricados e usados. Isto pode beneficiar também o registro de produtos e a gestão de produtos.

Além disso, as seqüências flanqueadoras de algodão podem ser usadas para identificar especificamente a localização genômica de cada inserção. Estas informações podem ser usadas para produzir sistemas marcadores moleculares específicos para cada evento. Estes sistemas podem ser usados para estratégias de cruzamento aceleradas e para estabelecer dados de ligações.

Além disso, as informações sobre seqüências flanqueadoras podem ser usadas para estudar e caracterizar processos de integração de transgenes, características dos sítios de integração genômica, seleção de eventos, estabilidade dos transgenes e suas seqüências flanqueadoras, e expressão gênica (especialmente relacionada ao silenciamento de genes, padrões de metilação de transgenes, efeitos das posições, e elementos potenciais relacionados à expressão, tal como MARS (regiões de anexação da matriz), e similares). À luz do presente relatório descritivo inteiro, deve ficar evidente que a presente invenção inclui sementes disponíveis sob o depósito da ATCC Ne PTA-6233. A presente invenção inclui também uma planta de algodão resistente a insetos, desenvolvida a partir de uma semente depositada junto à ATCC sob o número de acesso PTA-6233. A presente invenção inclui ainda partes da dita planta, tais como folhas, amostras de tecido, sementes produzidas pela dita planta, pólen, e similares.

Além disso, a presente invenção inclui plantas descendentes e/ou progênitas de plantas desenvolvidas a partir da semente depositada, de preferência uma planta de algodão resistente a insetos, onde a dita planta tem um genoma que compreende um DNA genômico do tipo selva-gem/seqüência de junção de DNA da inserção, detectável, como aqui descrito. Como aqui utilizado, o termo ''algodão” significa Gossypium hirsutum e inclui todas variedades vegetais que podem ser cruzadas com algodão, inclusive Gossypium barbadense.

Esta invenção inclui ainda processos para produzir cruzamentos, usando uma planta da presente invenção como pelo menos um ascendente. Por exemplo, a invenção em questão inclui uma planta híbrida Fi que tem na qualidade de um ou ambos progenitores qualquer uma das plantas aqui e-xemplificadas. Está também dentro do âmbito da presente invenção uma semente produzida por tais híbridos Fi da presente invenção. Esta invenção inclui um método para produzir uma semente híbrida Fi cruzando uma planta exemplificada com uma planta diferente (como por exemplo, um ascendente endogâmico) e colher a semente híbrida resultante. A invenção em questão inclui uma planta exemplificada que é um ascendente fêmeo ou ascendente macho. As características das plantas resultantes podem ser melhoradas pela consideração cuidadosa das plantas parentais.

Uma planta de algodão resistente a insetos pode ser cruzada, em primeiro lugar, cruzando sexualmente uma primeira planta de algodão parental que consiste em uma planta de algodão desenvolvida a partir da semente de qualquer uma das linhagens aqui referidas, com uma segunda planta de algodão parental, produzindo desta forma uma pluralidade de plan- tas de primeira progênie; e depois, selecionar uma planta de primeira progê-nie que é resistente a insetos (ou que possui pelo menos um dos eventos da presente invenção); e autofecundar a planta de primeira progênie, produzindo desta forma uma pluralidade de plantas de segunda progênie; e depois, selecionar entre as plantas de segunda progênie uma planta que é resistente a insetos (ou que possui pelo menos um dos eventos da presente invenção). Estas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da planta de primeira progênie ou da pianta de segunda progênie até a segunda planta de algodão parental ou uma terceira planta de algodão parental. Uma cultura de algodão que compreende sementes de algodão da presente invenção, ou sua progênie, pode ser então plantada.

Deve-se entender também que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser acasaladas para produzir descendentes que contêm dois genes exógenos adicionados, independentemente segregantes. A autogamia da progênie apropriada pode produzir plantas homozigóticas para ambos genes exógenos adicionados. O retrocruzamento para uma planta parental e o cruzamento de indivíduos não aparentados (ouícrossing) com uma planta não-transgênica também estão contemplados, bem como a propagação vegetativa. Outros métodos de cruzamento usados comumente para diferentes traços e culturas são conhecidos na técnica. O retrocruzamento tem sido usado para transferir genes quanto a um traço altamente herdável, simplesmente herdado, para um cultivar homozigótico ou linhagem endogâmica desejável, que é o ascendente recorrente. A origem do traço a ser transferido é denominada ascendente doador. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos do ascendente recorrente (como por exemplo, o cultivar) e o traço desejável é transferido a partir do ascendente doador. Depois do cruzamento inicial, os indivíduos que possuem o fenótipo do ascendente doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzados) para o ascendente recorrente. Espera-se que o genitor resultante tenha os atributos do ascendente recorrente (como por exemplo, o cultivar) e o traço desejável é transferido a partir do ascendente doador.

As moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas como marcadores moleculares em um método de cruzamento auxiliado por marcador (MAB). As moléculas de DNA da presente invenção podem ser usadas em métodos (tais como marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNPs e SSRs) que identificam traços ligados geneticamente, úteis em agronomia, como é conhecido nessas técnicas. O traço de resistência a insetos pode ser rastreado no progênie de um cruzamento com uma planta de algodão da presente invenção (ou sua progênie e qualquer outro cultivar ou variedade de algodão), usando métodos MAB. As moléculas de DNA são marcadores para este traço, e os métodos MAB que são bem conhecidos nessas técnicas podem ser usados para rastrear o(s) traço(s) de resistência a insetos em plantas de algodão, quando pelo menos uma linhagem de algodão da presente invenção, ou sua progênie, fosse um progenitor ou ancestral. Os métodos da presente invenção podem ser usados para i-dentificar qualquer variedade de aigodão que tem o evento de resistência a insetos da linhagem de algodão 281-24-236 (crylF) e/ou 3006-210-23 (crylAc).

Os métodos da invenção em questão incluem um método para produzir uma planta de algodão resistente a insetos, onde o dito método compreende cruzar com uma planta da presente invenção. Mais especifica-mente, os ditos métodos podem compreender cruzar duas plantas da presente invenção, ou uma planta da presente invenção com outra planta. Os métodos preferidos compreendem ainda selecionar a progênie do dito cruzamento, analisando a dita progênie quanto a um evento detectável de acordo com a presente invenção.

Uma planta ou uma semente preferida da presente invenção compreende em seu genoma pelo menos uma das seqüências de inserção, como identificada na Tabela I, junto com pelo menos 20 a 500 ou mais nu-cleotídeos flanqueadores contíguos em ambos lados da inserção, como i-dentificado na Tabela I. A menos que diferente mente indicado, "evento de algodão crylF 281-24-236" refere-se ao DNA de SEQ ID N°: 1 que inclui o DNA heterólogo inserido no transformante original (nucleotídeos 2.075-12.748 de SEQ !D N°: 1) e a totalidade ou parte de ambas seqüências genômicas flanqueadoras de SEQ ID N°: 1 (resíduos de nucleotídeos 1-2.074 e 12.749-15490) imediatamente adjacentes ao DNA inserido que se esperaria fossem transferidas para a progênie que recebe o DNA inserido como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o evento. Similarmente, a menos que diferentemente indicado, "evento de algodão crylAc 3006-210-23" refere-se ao DNA de SEQ ID N°: 2 que inclui o DNA heterólogo inserido no transformante original (nucleotídeos 528-8.900 de SEQ ID N°: 2) e a totalidade ou parte de ambas seqüências genômicas flanqueadoras de SEQ ID N°: 2 (resíduos 1-527 e 8.901-9.382) imediatamente adjacentes ao DNA inserido que se esperaria fossem transferidas para a progênie que recebe o DNA inserido como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o evento. A invenção em questão inclui culturas de tecidos de células re-generáveis de uma planta de invenção em questão. Está incluída também uma planta regenerada a partir dessa cultura de tecido, particularmente quando a dita planta é capaz de expressar todas as propriedades morfológi-cas e fisiológicas de uma variedade exemplificada. As plantas preferidas da presente invenção têm todas as características fisiológicas e morfológicas de uma planta desenvolvida a partir da semente depositada. Esta invenção compreende ainda a progênie de tal semente e a semente que possui os traços de qualidade de interesse.

Manipulações (tais como mutação, transfecção adicional, e cruzamento adicional) de plantas ou sementes, ou parte delas, podem levar à criação do que se denomina "variedades "essencialmente derivadas". A União Internacional para a Proteção de Novas Variedades de Plantas (UPOV) forneceu a seguinte orientação para determinar se uma variedade foi essencialmente derivada de uma variedade protegida: Uma variedade deve ser julgada como sendo essencial mente derivada de outra variedade ("a variedade inicial") quando (i) ela é predominantemente derivada da variedade inicial, ou de uma variedade que é ela própria predominantemente derivada da variedade inicial, e ao mesmo tempo, retém a expressão das características essenciais que resultam do genótipo ou combinação de genótipos da variedade inicial; (ii) ela é claramente distinguível da variedade inicial; e (iii) exceto pelas diferenças que resultam do ato de derivação, ela conforma à variedade inicial na expressão das características essenciais que resultam do genótipo ou combinação de genótipos da variedade inicial. UPOV, Sexto Encontro com Organizações Internacionais, Genebra, 30 de outubro de 1992; documento preparado pelo Escritório da União.

Como aqui utilizado, o termo "linhagem" é um grupo de plantas que apresentam pouca ou nenhuma variação genética entre indivíduos quanto a pelo menos um traço. Tais linhagens podem ser criadas por várias gerações de autopolinização e seleção, ou propagação vegetativa a partir de um único ascendente, usando técnicas de cultura de tecidos ou células.

Como aqui utilizados, os termos "cultivar" e "variedade" são sinônimos e se referem a uma linhagem que é usada para produção comercial. "Estabilidade" ou "estável" significa que, com relação ao dado componente, o componente é mantido de geração para geração e, de preferência, pelo menos três gerações, substancialmente no mesmo nível, como por exemplo, de preferência, ± 15%, mais preferivelmente ± 10%, e com a maior preferência, ± 5%. A estabilidade pode ser afetada pela temperatura, pelo local, por tensão e pela época da plantação. Uma comparação de gerações subsequentes sob condições do campo deve produzir o componente de uma maneira similar. "Utilidade comercial" é definida como tendo bom vigor e alta fertilidade da planta, de tal modo que a safra possa ser produzida por fazendeiros usando equipamentos agrícolas convencionais, e o óleo com os componentes descritos pode ser extraído da semente usando equipamentos de trituração e extração convencionais. Para ser comercialmente útil, o rendimento, medido por peso de semente, teor de óleo, e óleo total produzido por hectare, fica dentro de 15% do rendimento médio de uma variedade de ca-nola comercial que de outra forma seria comparável, sem os traços de vaior agregado, desenvolvida na mesma região. "Agronomicamente da melhor qualidade" significa que uma li- nhagem tem características agronômicas desejáveis, tais como rendimento, maturação, resistência a doenças, e características similares, além da resistência a insetos, em virtude do evento ou eventos em questão.

Como os versados nessas técnicas devem reconhecer à luz deste relatório descritivo, as modalidades preferidas de kits de detecção podem incluir, por exemplo, sondas e/ou iniciadores direcionados para e/ou compreendendo "seqüências de junção1' ou "sequências de transição" (quando a seqüência genômica flanqueadora de algodão encontra a sequência de inserção). Por exemplo, isto inclui uma sonda, iniciadorou amplicon de polinu-cleotídeo, compreendendo uma seqüência que inclui os resíduos 2.074-2.075 ou 12.748-12.749 de SEQ ID N°: 1, ou os resíduos 527-528 ou 8.900-8901 de SEQ ID N°: 2, como indicado na Tabela I. Para serem diagnósticos para esses eventos específicos, os "iniciadores de junção" preferidos devem incluir pelo menos -15 resíduos da seqüência flanqueadora adjacente e pelo menos -15 resíduos da seqüência de inserção adjacente, Com este arranjo, outro iniciador na região de flanqueamento ou inserção pode ser usado para gerar um amplicon detectável que indica a presença de um evento da presente invenção, Em modalidades preferidas, entretanto, um iniciador se liga na região flanqueadora e um se liga na inserção, e estes iniciadores podem ser usados para gerar um amplicon que cobre (e inclui) uma seqüência de junção como indicada acima.

Os versados nessas técnicas devem reconhecer também que os iniciadores e sondas podem ser desenhados para hibridizar, sob uma faixa de condições de hibridização e/ou PCR padronizadas, para um segmento de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, e seus complementos, onde o iniciadorou sonda não é perfeitamente complementar à seqüência exemplificada. Isto é, algum grau de desemparelhamento pode ser tolerado. Para um iniciador com aproximadamente 20 nucleotídeos, por exemplo, tipicamente, um ou dois ou um número parecido de nucleotídeos não precisam se ligar ao filamento oposto, caso a base desemparelhada seja interna ou esteja na extremidade do iniciador oposto ao amplicon. Várias condições de hibridização apropriadas são fornecidas abaixo. Análogos de nucleotídeos sintéticos, tal como inostna, também podem ser usados em sondas. Sondas de ácidos nucléicos peptídicos (PNA), bem como sondas de DNA e RNA, também podem ser usadas. O que é importante é que tais sondas e iniciadores seja diagnósticos (capazes de identificar e distinguir singularmente) quanto à presença de um evento da presente invenção.

Deve-se assinalar ainda que podem ocorrer erros na ampliação por PCR, que poderíam resultar em pequenos erros de seqüenciamento, por exemplo. Isto é, a menos que diferentemente indicado, as sequências aqui listadas foram determinadas gerando amplicons longos a partir de DNAs ge-nômicos do algodão, e depois, clonando e seqüenciando os amplicons. Não é incomum encontrar ligeiras diferenças e pequenas discrepâncias em sequências geradas e determinadas desta maneira, em virtude das muitas corridas de ampliação que são necessárias para gerar amplicons suficientes para o seqüenciamento a partir de DNAs genômicos. Por exemplo, as seguintes diferenças entre as sequências determinadas dos DNAs flanqueado-res dos eventos e os DNAs genômicos e do tipo selvagem conhecidos, correspondentes, são assinaladas: no flanco 5' para o evento Cry1 F em questão, o resíduo 2.037 de SEQ ID N°: 1 foi determinado como sendo (listado como) nG", enquanto que o resíduo correspondente do lócus 281-24-236 da seqüência genômica conhecida é "A" (R pode ser usado em uma seqüência de consenso, de acordo com as convenções padronizadas de IUPAC-IUB). No flanco 3' deste evento, o resíduo 12.781 de SEQ ID N°: 1 é aqui listado como T, enquanto que C é fornecido na seqüência genômica publicada no local correspondente (Y é o código de consenso). A posição 12.811 de SEQ ID N°: 1 é C, enquanto que T é fornecido para o genoma (Y seria o consenso). A posição 12.866 é listada como C em SEQ ID N°: 1, enquanto que T aparece no genoma (Y é o consenso). A posição 12.882 é listada como G em SEQ ID N°: 1,enquanto que A aparece para o genoma (R é o consenso). A posição 12.918 é listada como A em SEQ ID N°: 1, enquanto que G aparece no genoma (R é o consenso). O resíduo 13.129 é listado como G em SEQ ID N°: 1, enquanto que A aparece no genoma (R é o consenso). O resíduo 13.222 é listado como C em SEQ ID N°: 1, enquanto que T aparece na seqüência genômica (Y é o consenso). Na posição 13.441 em SEQ ID NO 1, um T aparece enquanto que não há qualquer resíduo correspondente da listagem genômica. Assim sendo, esta inserção aparente se deslocaria consequentemente para a jusante da numeração de SEQ ID N°: 1, em comparação com a seqüência genômica. Os versados nessas técnicas devem reconhecer e serem informados que quaisquer ajustes necessários em virtude destes tipos de erros comuns de seqüenciamento estão dentro do âmbito da presente invenção.

Diferenças similares aparecem também no flanco 5' para o evento crylAc em questão. Nas posições 149, 153, 159, 165 e 244 de SEQ ID N°: 2, os seguintes resíduos estão listados, respectivamente: C, G, C, C, e C. Na seqüência genômica no lócus 3006-210-23, os seguintes resíduos aparecem, respectivamente, nas localizações correspondentes: A, A, A, A, e A. Os códigos de consenso para estas substituições são, respectivamente, M, R, Μ, M, e M. Ajustes para sondas e iniciadores podem ser feitos de a-cordo, e as diferenças correspondentes poderíam ser notadas em aplicons que cobrem ou incluem qualquer um dos resíduos acima.

Deve-se assinalar que não é incomum que alguma seqüência genômica seja deletada quando uma seqüência é inserida durante a criação de um evento. Esta foi o caso para ambos eventos da invenção em questão. Isto é, SEQ ID N°: 1 fornece um segmento com 53 bases do DNA genômico do algodão para o evento 281-24-236, que foi deletado durante a inserção. Este "segmento interno" ocorre entre os resíduos 2.074 e 12.749 de SEQ ID N°: 1 no genoma não-transformado do algodão. Similarmente, SEQ ID N°: 2 fornece um segmento com 16 bases do DNA genômico do algodão para o evento 3006-210-23, que foi deletado durante a inserção. Este "segmento interno" ocorre entre os resíduos 527 e 8.901 de SEQ ID N°: 2 no genoma não-transformado do algodão.

Como ilustrado nas Figuras 1 e 2, os componentes de cada uma das "inserções" são como se segue. As moléculas de DNA dos elementos genéticos do transgene, contidas no evento CrylF 281-24-236 em questão consiste no promotor de ubiquitina 1 do milho, conectado operacionalmente à fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) a partir de Streptomyces viridoc-hromogenes, conectada operacionalmente às sequências de poliadenilação ORF25 (Baker et ai, Plant Molecular Biology 2:335-350 (1983)); o promotor quimérico [(40CS)8MAS], contendo um promotor de manopines sintase parcialmente deíetado, com 4 elementos intensificadores do promotor de octo-pino sintase, ligado operacionalmente ao Cyr1 F(sinpro) a partir de Bacillus thuringiensis var. aizawai, ligado operacionalmente às sequências de poliadenilação ORF25 (Baker et ai, Plant Molecular Biology 2:335-350 (1983)); e o promotor de ubiquitina 1 do mitho ligado operacionalmente a uma seqüên-cia pat parcial. As seqüências do DNA dos polinucleotídeos, ou os fragmentos destes componentes, podem ser usadas como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos da presente invenção.

As moléculas de DNA de elementos genéticos do transgene, contidas no evento CrylAc 3006-210-23 em questão consistem no promotor [(40CS)5MAS] conectado operacionalmente a PAT (descrita acima), conectado operacionalmente a ORF25; e o promotor de ubiquitina 1 do milho conectado operacionalmente a Ciy1 Ac (sinpro) a partir de Bacillus thuringiensis var. kurstaki, conectado operacionalmente às seqüências de poliadenilação ORF25. As seqüências do DNA dos polinucleotídeos, ou os fragmentos destes componentes, podem ser usadas como iniciadores ou sondas de DNA nos métodos da presente invenção.

Em algumas modalidades da invenção, são fornecidas composições e métodos para detectar a presença da região de inserção transgêni-ca/genômica em plantas e sementes e similares, a partir de uma planta de algodão designada WIDESTRIKE que compreende c evento de Cry1F 281-24-236 e o evento de Cry\ Ac 3006-210-23. São fornecidas as seqüências de DNA que compreendem pelo menos uma seqüência de junção da região de inserção genômica/transgene aqui fornecida em SEQID N°: 1, SEQ ID N°: 2, seus segmentos, e complementos das seqüências exemplificadas e quaisquer segmentos deles. A seqüência de junção da região de inserção cobre a junção entre o DNA heterólogo inserido no genoma e o DNA da célula de algodão que flanqueia o sítio de inserção. Tais seqüências são diagnosticas para um ou mais dos dados eventos.

Baseado nestas seqüências de inserção e limítrofes, foram gerados iniciadores específicos de eventos. A análise por PCR demonstrou que essas linhagens de algodão (CrylF 281-24-236 e C/y1Ac 3006-210-23) podem ser identificadas em diferentes genótipos de algodão por análise dos amplicons da PCR gerados com estes conjuntos de iniciadores específicos de eventos. Estes procedimentos e outros procedimentos afins podem ser usados para identificar singularmente estas linhagens de algodão. Assim sendo, os amplicons da PCR derivados de tais pares de iniciadores são singulares e podem ser usados para identificar estas linhagens de algodão.

Em algumas modalidades, as seqüências de DNA que compreendem pelo menos uma das regiões inusitadas de inserção genômi-ca/transgene são um aspecto desta invenção. Estão incluídas as seqüências de DNA que compreendem um comprimento suficiente de polinucleotídeos da sequência de inserção do transgene e um comprimento suficiente de polinucleotídeos da sequência genômica do algodão a partir de uma ou mais das três plantas e/ou seqüências de algodão supramencionadas que são úteis como seqüências iniciadoras para a produção de um produto amplicon diagnóstico para uma ou mais destas plantas de algodão.

Modalidades afins pertencem a seqüências de que compreendem pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais nucleotídeos contíguos de uma parte do transgene de uma seqüência de DNA selecionada no grupo que consiste em SEQ ID N°: 1 e SEQ ID NOA: 2, ou complementos delas, e um comprimento similar de seqüência de DNA flanqueadora de algodão dessas seqüências, ou complementos delas. Tais seqüências são úteis como iniciadores de DNA em métodos de ampliação de DNA. Os amplicons produzidos usando estes iniciadores são diagnósticos para qualquer um dos eventos de algodão aqui referidos. Portanto, a invenção inclui também os amplicons produzidos por tais iniciadores de DNA e iniciadores homólogos, A tabela que se segue resume modalidades específicas da presente invenção.

Tabela II

Lista de Iniciadores e suas Seqüências Usadas em Ampliação por PCR Es-pecífica de Eventos________________________________________________________ Esta invenção inclui também métodos para detectar a presença de DNA, em uma amostra, que corresponde a pelo menos um dos eventos de algodão aqui referidos. Tais métodos podem compreender: (a) colocar a amostra que compreende o DNA em contato com um conjunto de iniciadores que, quando usados em uma reação de ampliação de ácidos nucléicos com o DNA de pelo menos um destes eventos de algodão, produz um amplicon que é diagnóstico para o(s) dito(s) evento(s); (b) realizar uma reação de ampliação de ácidos nucléicos, produzindo desta forma o amplicon; e (c) detectar o amplicon.

Outros métodos de detecção da presente invenção incluem um método para detectar a presença de um DNA, em uma amostra, correspondente a pelo menos um dos ditos eventos, onde o dito método compreende: (a) colocar a amostra que compreende o DNA em contato com uma sonda que hibridiza sob condições de hibridização severas com o DNA de pelo menos um dos ditos eventos de algodão e que não hibridiza sob condições de hibridização severas com uma planta de algodão de controle (DNA sem evento de interesse); (b) submeter a amostra e a sonda a condições de hibridização severas; e (c) detectar a hibridização da sonda para o DNA.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção inclui métodos para produzir uma planta de algodão que compreende um evento cry1F e/ou cyylAc da presente invenção, onde o dito método compreende as etapas de: (a) cruzar sexualmente uma primeira linhagem de algodão parental (que compreende um cassete de expressão da presente invenção, que confere o dito traço de resistência a insetos às plantas da dita linhagem) com uma segunda linhagem de algodão parental (que carece deste traço de tolerância a insetos), produzindo desta forma uma pluralidade de plantas progê-nitas; e (b) selecionar uma planta progênita pelo uso de marcadores moleculares. Tais métodos podem compreender opcionalmente a etapa adicional de retrocruzar a planta progênita para a segunda linhagem de algodão parental, para produzir uma planta de algodão de cruzamento verdadeiro que compreende o dito traço de tolerância a insetos.

De acordo com outro aspecto da invenção, são fornecidos métodos para determinar a zigosidade da progênie de um cruzamento com qualquer um (ou mais) dos ditos três eventos. Os ditos métodos podem compreender colocar uma amostra, que compreende o DNA de algodão, em contato com um conjunto de iniciadores da presente invenção. Os ditos iniciadores, quando usados em uma reação de ampliação de ácidos nucléicos com o DNA genômico de pelo menos um dos ditos eventos de algodão, produz um primeiro amplicon que é diagnóstico para pelo menos um dos ditos eventos de algodão. Tais métodos compreendem ainda realizar uma reação de ampliação de ácidos nucléicos, produzindo desta forma o primeiro amplicon; detectar o primeiro amplicon; e colocar a amostra que compreende o DNA de algodão em contato com o dito conjunto de iniciadores (o dito conjunto de iniciadores, quando usado em uma reação de ampliação de ácidos nucléicos com o DNA genômico de plantas de algodão, produz um segundo amplicon que compreende o DNA genômico nativo de algodão homólogo à região ge-nômica do algodão de uma inserção de transgene identificada como um dos ditos eventos de algodão); e realizar uma reação de ampliação de ácidos nucléicos, produzindo desta forma o segundo amplicon. Os métodos compreendem ainda detectar o segundo amplicon, e comparar os primeiro e segundo amplicons em uma amostra, onde a presença de ambos amplicons indica que a amostra é heterozigótica para a inserção do transgene.

Kits de detecção de DNA podem ser desenvolvidos usando as composições aqui descritas e métodos bem-conhecidos nas técnicas de detecção de DNA. Os kits são úteis para identificar o DNA do evento de algodão em questão em uma amostra e podem ser aplicados a métodos para cruzar plantas de algodão que contêm este DNA. Os kits contêm seqüências de DNA homólogas ou complementares aos amplicons, como aqui descrito, por exemplo, ou a seqüências de DNA homólogas ou complementares ao DNA contido nos elementos genéticos do transgene dos eventos em questão. Estas seqüências de DNA podem ser usadas em reações de ampliação de DNA ou como sondas em um método de hibridização de DNA. Os kits podem conter também os reagentes e materiais necessários para a realização do método de detecção.

Uma "sonda" é uma molécula de ácido nucléico isolada à qual é anexado um marcador detectável ou molécula repórter, convencional (tal como um isótopo radioativo, ligante, agente quimioluminescente ou enzima). Tal sonda é complementar a um filamento de um ácido nucléico alvo, no caso da presente invenção, a um filamento de DNA genômico de um dos ditos eventos de algodão, seja de uma planta de algodão ou de uma amostra que inclui o DNA do evento. As sondas, de acordo com a presente invenção, incluem não apenas os ácidos desoxirribonucíéico ou ribonucléico, mas também poliamidas e outro materiais da sonda que se ligam especifica mente a uma seqüência de DNA alvo e podem ser usadas para detectar a presença da seqüência de DNA alvo.

Os "iniciadores" são ácidos nucléicos isolados que são anelados a um filamento de DNA alvo complementar por hibridização com ácidos nucléicos, para formar um híbrido entre o iniciador e o filamento de DNA alvo, e depois estendidos ao longo do filamento de DNA alvo por uma polimerase, como por exemplo, uma DNA polimerase. Os pares de iniciadores da presente invenção referem-se ao seu uso para ampliação de uma seqüência de ácidos nucléicos alvo, como por exemplo, pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos convencionais de ampliação de ácidos nucléicos.

As sondas e iniciadores têm geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10,11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,100,101, 102, 103, 104, 105, 106,107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 165, 166, 267, 268, 269, 270, 271,272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281,282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 394, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491,492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500 po- linucleotídeos ou mais em comprimento. Tais sondas e iniciadores hibridi-zam especificamente para uma sequência alvo sob condições de hibridiza-ção altamente severas. De preferência, as sondas e iniciadores de acordo com a presente invenção têm similaridade de sequência completa com a seqüência alvo, embora sondas que diferem da sequência alvo e que retêm a capacidade de hibridizar para seqüências alvo possam ser desenhadas por métodos convencionais.

Os métodos para preparar e usar sondas e iniciadores estão descritos, por exemplo, em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2a edição, volumes 1-3, editora Sambrook et ai, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Os pares de iniciadores da PCR podem ser derivados a partir de uma seqüência conhecida, usando, por exemplo, programas de computador intencionados para tal propósito.

Os iniciadores e sondas baseados no DNA flanqueador e as seqüências de inserção aqui descritas podem ser usados para confirmar (e, caso necessário, corrigir) as seqüências descritas, por métodos convencionais, como por exemplo, reclonando e seqüenciando tais seqüências.

As sondas e iniciadores de ácidos nucléicos da presente invenção hibridizam sob condições severas para uma seqüência de DNA alvo. Qualquer método convenciona! de hibridização ou ampliação de ácidos nucléicos pode ser usado para identificar a presença do DNA de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de ácidos nucléicos ou seus fragmentos são capazes de hibridizar especificamente para outras moléculas de ácidos nucléicos sob certas circunstâncias. Como aqui utilizado, duas moléculas de ácidos nucléicos são ditas como sendo capazes de hibridizar especificamente para outra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico com duplo filamento antiparalelo. Uma molécula de ácido nucléico é dita como sendo "complemento" de outra molécula de ácido nucléico se elas apresentam complementaridade completa. Como aqui utilizado, as moléculas são ditas como apresentando "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas como sendo "minimamente complementares" se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas entre si sob pelo menos condições de "baixa severidade" convencionais. Similarmente, as moléculas são ditas como sendo "complementares" se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas entre si sob condições de "alta severidade" convencionais. As condições de severidade convencionais são descritas por Sambrook et a/., 1989. Afastamentos da complementaridade completa são portanto permissí-veis, desde que tais afastamentos não impeçam compleíamente a capacidade de as moléculas formarem uma estrutura de filamento duplo. Para que uma molécula de ácido nucléico sirva como um iniciador ou sonda, ela precisa apenas ser suficientemente complementar em sequência para ser capaz de formar uma estrutura de duplo filamento estável sob o solvente específico e concentrações de sais empregados.

Como aqui utilizado, uma seqüência substancialmente homóloga é uma seqüência de ácidos nucléicos que hibridizará especifica mente para o complemento da seqüência de ácidos nucléicos com a qual ela está sendo comparada sob condições de alta severidade. O termo "condições severas" é definido funcionalmente com relação à hibridização de uma sonda de ácido nucléico para um ácido nucléico alvo (isto é, para uma seqüência de ácidos nucléicos específica de interesse) pelo procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook et a/., 1989, em 9.52-9.55. Vide também Sambrook et ai., 1989, em 9.47-9.52 e 9.56-9.58. Conseqüentemente, as se-qüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas pela sua capacidade de formar seletivamente moléculas dúplex com prolongamentos complementares de fragmentos de DNA.

Dependendo da aplicação prevista, pode-se usar condições variadas de hibridização para atingir graus variados de setetividade da sonda em relação à seqüência alvo. Para aplicações que requerem alta seletividade, deve-se empregar tipicamente condições relativamente severas para formar os híbridos, como por exemplo, deve-se selecionar condições de sal relativamente baixas e/ou de temperaturas relativamente altas, tais como aquelas proporcionadas por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCI em temperaturas de cerca de 50 °C a cerca de 70 °C. As condições severas podem, por exemplo, envolver lavar o filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta severidade (0,2X SSC, 0,1% de SDS, 65 °C). As condições de severidade apropriadas, que promovem a hibridização de DNA, por exemplo, 6,0X de cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45 °C, e em seguida, uma lavagem com 2,0X SSC a 50 °C, são conhecidas para aqueles versados na técnica, 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração de sais na etapa de lavagem pode ser selecionada entre uma baixa severidade de cerca de 2,0X de SSC a 50°C e uma alta severidade de cerca de Q,2X SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de baixa severidade em temperatura ambiente, cerca de 22°C, até condições de alta severidade a cerca de 65°C. A temperatura e o sal podem variar, ou a temperatura ou a concentração de sais pode ser mantida constante enquanto que a outra variável é alterada. Tais condições seletivas toleram pouco ou nenhum desemparelhamento entre a sonda e o modelo ou filamento alvo. A detecção de sequências de DNA por intermédio de hibridização é bem-conhecida para aqueles versados na técnica, e os ensinamentos das patentes US n- 4.965.188 e 5.176.995 são exemplificativos dos métodos de análises de hibridização.

Em uma modalidade particularmente preferida, um ácido nucléi-co da presente invenção deve hibridizar especificamente para um ou mais dos iníciadores (ou amplicons ou outras sequências) aqui exemplificados ou sugeridos, incluindo seus complementos e fragmentos, sob condições de alta severidade. Em um aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção tem a sequência de ácidos nucléicos enunciada em SEQ [D NOS: 3-14, ou seus complementos e/ou fragmentos.

Em outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção compartilha entre 80% e 100% ou 90% e 100% de identidade de sequência com tais sequências de ácidos nucléicos. Em um outro aspecto da presente invenção, uma molécula de ácido nucléico marcadora da presente invenção compartilha entre 95% e 100% de identidade de sequência com tal sequência. Tais sequências podem ser u-sadas como marcadores em métodos de cruzamento de plantas para identificar a progênie de cruzamentos genéticos. A hibrídização da sonda para a molécula de DNA alvo pode ser detectada por qualquer um dos inúmeros métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, e eles podem incluir, • porém sem limitações, marcadores fluorescentes, marcadores radioativos, marcadores baseados em anticorpos, e marcadores quimioluminescentes.

Quanto a ampliação de uma seqüência de ácidos nucléicos aivo (como por exemplo, por PCR), usando um par de iniciadores específico de ampliação, as "condições severas" são condições que permitem que o par de iniciadores hibridize apenas para a sequência de ácidos nucléicos aivo, à qual um iniciador que tem a seqüência do tipo selvagem correspondente (ou seu complemento) se ligaria e, de preferência, produziría um produto singular da ampliação, o amplicon. O termo "específica para (uma seqüência alvo)" indica que uma sonda ou iniciador hibridiza sob condições severas de hibridtzação apenas para a seqüência alvo em uma amostra que compreende a seqüência alvo.

Como aqui utilizado, o termo "DNA ampliado" ou "amplicon" refere-se ao produto da ampliação de ácidos nucléicos de uma seqüência alvo de ácidos nucléicos que é parte de um modelo de ácidos nucléicos. Por e-xemplo, para determinar se a planta de algodão resultante de um cruzamento sexual contém o DNA genômico do evento transgênico da planta de algodão da presente invenção, o DNA extraído de uma amostra de tecido da planta de algodão pode ser submetido ao método de ampliação de ácidos nucléicos, usando um par de iniciadores que inclui um iniciador derivado da seqüência flanqueadora no genoma da planta adjacente ao sítio de inserção do DNA heterólogo inserido, e um segundo iniciador derivado do DNA hete-rólogo inserido, para produzir um amplicon que é diagnóstico quanto à presença do DNA do evento. O amplicon tem um comprimento e tem uma seqüência que também é diagnostica para o evento. O amplicon pode ter um comprimento na faixa entre o comprimento combinado dos pares de iniciado- res mais um par de bases de nucleotídeos, e/ou o comprimento combinado dos pares de iniciadores mais cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143,144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361,362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 394, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451,452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, ou 500, 750, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, ou mais pares de bases de nucleotí-deos (mais ou menos qualquer um dos incrementos listados acima). Alternativamente, um par de iniciadores pode ser derivado da seqüência flanquea-dora em ambos lados do DNA inserido, de modo a produzir um amplicon que inclui a seqüência de nucleotídeos da inserção inteira. Um membro de um par de iniciadores derivado da seqüência genômica da planta pode estar localizado a uma distância da seqüência de DNA inserida. Esta distância pode ficar na faixa entre um par de bases de nucleotídeos e cerca de vinte mil pares de bases de nucleotídeos. O uso do termo "amplicon" exclui especificamente dímeros de iniciadores que podem ser formados na reação de ampliação térmica do DNA. A ampliação de ácidos nucléicos pode ser realizada por qualquer um dos vários métodos de ampliação de ácidos nucléicos conhecidos na técnica, incluindo a reação em cadeia de polimerase (PCR). São conhecidos vários métodos de ampliação na técnica e eles estão descritos, inter alia, na patente US n- 4.683.195 e na patente US n- 4.683.202. Os métodos de ampliação por PCR foram desenvolvidos para ampliar em até 22 kb de DNA genômico. Estes métodos, bem como outros métodos conhecidos na técnica de ampliação de DNA, podem ser usados na prática da presente invenção. A seqüência da inserção de DNA do transgene heterólogo ou da seqüência genômica flanqueadora de um evento de algodão em questão pode ser verificada {e corrigida, caso necessário) ampliando tais seqüências a partir do evento, usando iniciadores derivados das seqüências aqui fornecidas, e em seguida, usando seqüenciamento de DNA padrão do amplicon da PCR ou do DNA clonado. O amplicon produzido por estes métodos pode ser detectado por uma pluralidade de técnicas. A eletroforese em gel de agarose, e corar com brometo de etídio, é um método comum bem-conhecido para detectar ampli-cons de DNA. Outro método é a Análise de Bits Genéticos, onde é desenhado um oligonucleotídeo de DNA que se sobrepõe à seqüência genômica flanqueadora do DNA e à seqüência de DNA inserida. O oligonucleotídeo é imobilizado em cavidades de uma placa de microcavidades. Depois da PCR da região de interesse (usando um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica flanqueadora adjacente), um produto da PCR com um único filamento pode ser hibridizado para o oligonucleotídeo imobilizado e serve com um modelo para uma reação de extensão de uma única base, usando uma DNA polimerase e ddNTPs marcados específicos para a próxima base esperada. A leitura pode ser fluorescente ou baseada em ELISA. Um sinal indica a presença da seqüência de inserção/flanqueadora em virtude da ampliação, híbridtzação e extensão de uma única base, exitosas.

Outro método é a técnica de pírosseqüenciamento descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24 (2000)). Neste método, desenha-se um oligonucleotídeo que se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e à junção do DNA da inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para um produto com filamento único da PCR da região de interesse (um iniciador na seqüência inserida e um na seqüência genômica flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, 5'-fosfossulfato de adenosina e luciferina. Os DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da seqüência da inserção/flanqueadora do transgene em virtude da ampliação, hibridização e extensão de uma única base ou muttibase, exitosas.

Polarização por fluorescência é um outro método que pode ser usado para detectar um amplicon da presente invenção. Seguindo este método, um oligonucieotídeo é desenhado que se sobrepõe à seqüência genômica flanqueadora e à junção do DNA inserido. O oligonucleotídeo é hibrídi-zado para um produto PCR com filamento único da região de interesse (um iniciador no DNA inserido e um na seqüência genômica de DNA flanqueadora) e incubado na presença de uma DNA polimerase e de um ddNTP identificado por fluorescência. A extensão de base única resulta na incorporação do ddNTP. A incorporação pode ser medida como uma mudança na polarização usando um fluorímetro. Uma mudança na polarização indica a presença de inserto transgênico/seqüência de flanqueamento devido à amplifi- cação, hibridização e extensão de base única bem-sucedidas. TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) é um método para detectar e quantificar a presença de uma seqüência de DNA. Resumidamente, é desenhada uma sonda de oligonucleotídeo FRET que se sobrepõe à seqüência genômica flanqueadora e à junção do DNA da inserção. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na seqüência de DNA da inserção e um na seqüência genômica flanqueadora) são passados pelo ciclo na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda FRET resulta na divagem e liberação da porção fluorescente para longe da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência da inserção do transgene/flanqueadora em virtude da ampliação e hibridização exitosas.

Beacons Moleculares foram descritos para uso em detecção de seqüências. Resumidamente, é desenhada uma sonda de oligonucleotídeo FRET que se sobrepõe à seqüência genômica flanqueadora e à junção do DNA da inserção. A estrutura singular da sonda FRET resulta em ela conter uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescente e de extinção em estreita proximidade. A sonda FRET e os iniciadores da PCR (um iniciador na seqüência de DNA da inserção e um na seqüência genômica flanqueadora) passam pelo ciclo na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Depois da ampliação exitosa por PCR, a hibridização da sonda FRET para a seqüência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e a separação espacial das porções fluorescente e de extinção. Resulta um sinal fluorescente. Um sinal fluorescente indica a presença da seqüência da inserção do transgene/flanqueadora em virtude da ampliação e hibridização exitosas.

Tendo sido descritos dois locais gerais no genoma do algodão que são excelentes para inserções, a presente invenção compreende também uma semente de algodão e/ou uma planta de algodão que compreende pelo menos uma inserção não-Cry1F e não-Cry1Ac na vizinhança geral de um ou de ambos estes locais. Uma opção é substituir uma inserção cry1 F e/ou crylAc aqui exemplificada por uma inserção diferente. Geralmente, a este respeito, pode-se usar recombinação homóloga direcionada, por exemplo, de acordo com a presente invenção. Este tipo de tecnologia é o tema, por exemplo, do documento WO na 03/080809 A2 e do pedido de patente correspondente (USPA 2003/0232410).

Todas patentes, pedidos de patente, pedidos de patente provisórios, e publicações aqui referidos ou citados são aqui incorporados como referência em sua totalidade até o grau em que eles não estejam inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.

Os exemplos que se seguem estão incluídos para ilustrar procedimentos para praticar a invenção e para demonstrar certas modalidades preferidas da invenção. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitativos. Aqueles versados na técnica devem avaliar que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam abordagens específicas usadas para ilustrar os modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem avaliar, à luz do presente relatório descritivo, que muitas mudanças podem ser feitas nessas modalidades específicas, e ao mesmo tempo obter resultados semelhantes ou similares, sem fugir do espírito e do âmbito da invenção. A menos que diferentemente indicado, todas percentagens são em peso e todas proporções de misturas de solventes são em volume, a menos que diferentemente assinalado.

Exemplo 1 Produção de Semente Depositada A resistência a insetos da marca WideStrike® para algodão é um traço transgênico desenvolvido pela Dow AgroSciences, que proporciona resistência a insetos in planta contra lepidópteros. Ela contém dois genes de tolerância a insetos, cry1 Ac e cry1F, que foram derivados a partir de Bacillus thuríngiensis subespécie kurstaki e Bacillus thuríngiensis subespécie aiza-wai, respectivamente. Bacillus thuríngiensis (B.t.) é uma bactéria gram-positiva comum, arrastada pelo solo. No seu estágio formador de esporos, ela produz vários cristais protéicos inseticidas (conhecidos como delta-endotoxinas) que incluem Cry 1Ac e C/y1F. Estas proteínas são tóxicas para certos insetos lepidópteros. Em insetos suscetíveis, elas se ligam a recepto- res específicos presentes em células epiteliais do intestino médio, formando poros que rompem o equilíbrio osmótico e eventualmente resuitam em lise e morte das células. CrylAc e Cry 1F demonstraram ser atóxicas para seres humanos, animais de criação e insetos benéficos, e não têm sítios de ligação para delta-endotoxina. Usando duas delta-endotoxinas em vez de uma, proporcionará melhor resistência a insetos porque as duas proteínas Cry proporcionam um espectro mais amplo de controle do que qualquer uma das duas sozinha e têm atividade diferencial contra pragas de lepidópteros contra as quais elas são eficazes. O mais importante é que isto pode retardar o desenvolvimento de insetos resistentes.

Os genes crylAc e cry1F em WideStrike foram introduzidos u-sando transformação mediada por Agrobacterium em plantas de algodão (Gossypium hirsutum L.) GC-510 em dois eventos de transformação separados, 3006-210-23 e 281-24-236. Depois do cruzamento para dar uma variedade de algodão de alta qualidade, estes eventos foram combinados por cruzamento convencional, para produzir algodão portador do traço de resistência a insetos WideStrike. WideStrike contém também o gene pat de S-treptomyces viridochromogenes, uma bactéria aeróbica comum do solo. O gene pat codifica a enzima Fosfinotricina Acetil Transferase (PAT) que desintoxica glicofosinato de amônio dando um composto inativo por acetilação. O gene pat foi incluído para permitir a seleção de plantas de algodão transformadas.

Exemplo 2 Teste Diagnóstico para o Evento de Algodão Cry 1F 281-24-236 O DNA do evento C/y1F 281-24-236 e o evento CrylAc 3006-210-23, e um PCS355 de algodão não-transgênico foi extraído de folhas de algodoeiro usando o kit Plant DNeasy da QIAGEN (n- do catálogo 69181, Qiagen, Valencia, CA, USA). Seguiu-se o protocolo sugerido pelo fabricante. Resumidamente, discos de folhas foram rompidos em um tampão preaque-cido suplementado com RNAse, usando um leito de carbureto de tungstênio (diâmetro de 0,125 mm) e um Moinho Misturador Retsch MM3000. A mistura foi centrifugada em temperatura ambiente, e o sobrenadante foi subseqüen- temente capturado através de uma placa DNeasy 96. 0 DNA foi eluído em um tampão de eluição e estocado congelado até o uso. O DNA extraído do tecido da folha de algodoeiro foi usado em uma ampliação de DNA por PCR das seqüências 5' genômica/inserção do transgene no evento Cry1F 281-24-236, usando o iniciador 281-14 (SEQ ID N°: 3, 5TGTCGGCTGAAGGTAGGGAGG3') e o iniciador 281-15 {SEQ ID N°: 4, 5'CCGGACATGAAGCCATTTAC3'), e as seqüências genômica/inserção do transgene 3' flanqueadoras, usando o iniciador 281-9 (SEQ ID N°: 6, 5TCTCTAGAGAGGGGCACGACC3’) e o iniciador 281-10 (SEQ ID N°: 7, 5'CGAGCTGGAGAGACCGGTGAC3'). As análises de ampliação de DNA por PCR foram conduzidas usando o DNA genômico extraído do evento de algodão Cry1F 281-24-236 e da linhagem de algodão não-transgênica PCS355. A reação de ampliação para a sequência genômica flanqueadora 5' foi conduzida usando o kit de PCR QIAGEN HotStarTaq (ne do catálogo 203203 ou 203205, QIAGEN, Valencia, CA, USA) com uma concentração final de 0,4 μΜ do Iniciador 281-14 e do Iniciador 281-15 em um volume de reação de 50 μΙ_. As reações foram realizadas usando um Sistema de PCR GenAmp 9600 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) sob as seguintes condições dos ciclos: 1 ciclo a 95°C por 15 min; 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 57°C por 30 segundos, 72°C por 60 segundos; 1 ciclo a 72°C por 10 min. A PCR para a sequência genômica flanqueadora 3' foi conduzida usando o kit de PCR Takara ExTaq (n° do catálogo RR001A, Panvera, Ma-dison, Wl, USA) em um volume de reação de 50 μΙ_, contendo uma concentração final de 0,4 μΜ do Iniciador 281-9 e do Iniciador 281-10. As reações foram realizadas usando um Sistema de PCR GenAmp 9600 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) sob as seguintes condições dos ciclos: 1 ciclo a 95°C por 5 min; 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 60°c por 30 segundos, 72°c por 60 segundos; 1 ciclo a 72° por 10 min. Os produtos da PCR foram separados usando eletroforese em gei de agarose a 1,0% a 100 V por cerca de 1 hora, e visualizados por coloração com brometo de etídio. A seqüência de DNA do produto da PCR 5’ foi determinada, resultando em uma seqüência de 603 pares de bases de nucíeotídeos, repre- sentando a sequência 5’ genômica/inserção do transgene do evento de algodão CrylF 281-24-236 e identificada como SEQ ID N°: 5. A seqüência de DNA do produto da PCR 3' foi determinada, resultando em uma seqüência de 562 pares de bases de nucleotídeos, representando a seqüência 3' genômica/inserção do transgene do evento de algodão C/y1F 281-24-236 e identificada como SEQ ID N°: 8.

As sequências genômica/junção do transgene, SEQ ID N°: 5 e SEQ ID N°: 8, são seqüências de DNA inusitadas no evento Cry1F 281-24-236, que são diagnosticas para o evento de planta algodão C/y1F 281-24-236 e sua progênie.

Exemplo 3 Teste Diagnóstico para o Evento de Algodão Ciy1Ac 3006-210-23 O DNA extraído do tecido da folha de algodoeiro foi usado em uma ampliação de DNA por PCR das seqüências 5' genômica/inserção do transgene no evento CrylAc 3006-210-23, usando o iniciador 3006-20 (SEQ ID N°: 9, 5TTCCAACCTTTAACTATTATCCTGC3’) e o iniciador 3006-22 (SEQ ID N°: 10, 5'GCTGCGGACATCTACATTTT3'), e as seqüências genômica/inserção do transgene 3' flanqueadoras, usando o iniciador 3006-9 (SEQ ID N°: 12, 5OACATGCAATGCTCATTATCTCTA3') e o iniciador 3006-12 (SEQ ID N°: 13, 5'AAGTCTCTGCCTTCTACCCTGG3'}. As análises de ampliação de DNA por PCR foram conduzidas usando o DNA genômico extraído do evento de algodão CrylAc 3006-210-23 e da linhagem de algodão não-transgênica PCS355. A reação de ampliação para a seqüência genômi-ca flanqueadora 5' foi conduzida usando o kit de PCR QIAGEN HotStarTaq (n- do catálogo 203203 ou 203205, QIAGEN, Valencia, CA, USA) com uma concentração final de 0,4 μΜ do Iniciador 3006-20 e do Iniciador 3006-22 em um volume de reação de 50 μΙ_. As reações foram realizadas usando um Sistema de PCR GenAmp 9600 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) sob as seguintes condições dos ciclos: 1 ciclo a 95°C por 15 min; 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 53°C por 30 segundos, 72°C por 60 segundos; 1 ciclo a 72°C por 10 min. A PCR para a seqüência genômica flanqueadora 3' foi conduzida usando o kit de PCR QIAGEN HotStarTaq (nQ do catálogo 203203 ou 203205, QIAGEN, Valencia, CA, USA) em um volume de reação de 50 μ!_, contendo uma concentração final de 0,4 μΜ do Iniciador 3006-9 e do Iniciador 3006-12. As reações foram realizadas usando um Sistema de PCR GenAmp 9600 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) sob as seguintes condições dos ciclos: 1 ciclo a 95°C por 5 min; 30 ciclos de 94°C por 30 segundos, 56°C por 30 segundos, 72°C por 60 segundos; 1 ciclo a 72°C por 10 min. Os produtos da PCR foram separados usando eletroforese em gel de agarose a 1,0% a 100 V por cerca de uma hora, e visualizados por coloração com brometo de etídio. A sequência de DNA do produto da PCR 5' foi determinada, resultando em uma seqüência de 614 pares de bases de nucleotídeos, representando a seqüência 5' genômica/inserção do transgene do evento de algodão C/y1Ac 3006-210-23 (identificada como SEQ ID N°: 11). A seqüência de DNA do produto da PCR 3' foi determinada, resultando em uma seqüência de 662 pares de bases de nucleotídeos, representando a seqüência 3' genômica/inserção do transgene do evento de algodão Cry 1Ac 3006-210-23 (identificada como SEQ ID N°: 14).

As seqüências genômica/junção do transgene, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 14, são seqüências de DNA inusitadas no evento C/y1Ac 3006-210-23, que são diagnosticas para o evento de planta de algodão Cry 1Ac 3006-210-23 e sua progênie.

Exemplo 4 Outros Testes Diagnósticos Os pares de iniciadores de eventos de DNA são usados para produzir um amplicon diagnóstico para o evento Cry1F 281-24-23 e evento CrylAc 3006-210-23. Estes pares de iniciadores de eventos incluem, porém sem limitações, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 4, SEQ ID N°: 6, SEQ ID N°: 7, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 12 e SEQ D NO: 13. Quando usados em um método de ampliação de DNA (PCR), estes iniciadores produzem um amplicon diagnóstico para o evento Cry1 F 281-24-236 e evento CrylAc 3006-210-23, e suas progênies. Além destes pares de iniciadores, outros aspectos da presente invenção incluem qualquer par de iniciadores derivado do produto amplicon de SEQ ID N°: 5, SEQ ID N°: 9, SEQ ID N°: 11 e/ou SEQ ID N°: 14, que, em uma reação de ampliação de DNA, produz um amplicon diagnóstico para o evento Oy1F 281-24-236 e evento CrylAc 3006-210-23, e suas progênies. Qualquer modificação que envolve o uso de iniciadores de DNA para produzir um amplicon diagnóstico para o evento Cry1F 281-24-236 e evento CrylAc 3006-210-23, e suas progênies, está dentro do conhecimento daqueles versados na técnica, dado o benefício do relatório descritivo em questão. A análise de uma amostra de tecido vegetal do evento C/y1F 281-24-236 e evento Cry1 Ac 3006-210-23, e suas progênies, deve incluir um controle positivo de tecido para estes eventos, um controle negativo de uma planta de algodão que qualquer um destes eventos, e um controle negativo que não contém qualquer DNA de algodão modelo. Seqüências de iniciadores adicionais podem ser derivadas a partir de SEQ ID N°: 1 e/ou SEQ ID N°: 2 para aqueles versados na técnica de métodos de ampliação de DNA. As condições otimizadas para a produção de um amplicon podem diferir dos métodos descritos nos exemplos acima. O uso destas seqüências de DNA de iniciadores com modificações nos métodos descritos nestes exemplos está dentro do âmbito da invenção. Amplicons e iniciadores derivados de SEQ ID N°: 1 e/ou SEQ ID N°: 2 que são diagnósticos para Cry1F evento 281-24-236 e/ou CryAlc evento 3006-210-23 e suas progênies estão no escopo da invenção. O ensaio para amplicons do evento C/y1F 281-24-236 e evento CrylAc 3006-210-23, e suas progênies, pode ser realizado usando um Stra-tagene Robocycler, MJ, Engine, ou Eppendorf Masíercycler Gradient Ther-moCycler, ou por métodos e aparelhos conhecidos para aqueles versados na técnica.

Tendo sido ilustrados e descritos os princípios da presente invenção, deve ficar evidente para aqueles versados na técnica que a invenção pode ser modificada no arranjo e no detalhe, sem fugir de tais princípios. Reivindica-se todas as modificações que estão dentro do espírito e do âmbito das reivindicações apensas.

Claims

1. Polinucleotídeo referente ao evento elite cry1F 281-24-236, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de SEQ ID NO: 1.

2. Polinucleotídeo referente ao evento elite crylAc 3006-210-23, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de SEQ ID NO: 2.