BRPI0419348B1 - métodos para produzir o conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular - Google Patents

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C Widdison Wayne
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Abstract

métodos para produzir o conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular. a presente invenção refere-se a novos maitansinóides contendo dissulfeto que carregam uma substituição de mono ou dialquila no átomo de <244>-carbono que transporta o átomo de enxofre. também são apresentados métodos para a a síntese destes novos maitansinóides e métodos para a ligação destes novos maitansinóides aos agentes de ligação celular. os conjugados de maitansinóide-agente de ligação celular são úteis como agentes terapêuticos, que são liberados especificamente nas células alvos e são citotóxicos. estes conjugados apresentam eficácia terapêutica vastamente melhorada em modelos de tumor animal, comparados com os agentes anteriormente descritos.

Description

(54) Título: MÉTODOS PARA PRODUZIR O CONJUGADO DE MAITANSINÓIDE-AGENTE DE LIGAÇÃO CELULAR (51) lnt.CI.: A61K 47/48; C07D 498/16; C07D 498/00; A61P 35/00 (30) Prioridade Unionista: 20/05/2003 US 60/471,739 (73) Titular(es): IMMUNOGEN, INC.
(72) Inventor(es): WAYNE C. WIDDISON; RAVI V. J. CHARI (85) Data do Início da Fase Nacional: 15/04/2011
1/85
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS PARA PRODUZIR O CONJUGADO DE MAITANSINÓIDE-AGENTE DE LIGAÇÃO CELULAR.
Dividido do Pl 0410748-9, depositado em 20.05.2004.
Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório n° 60/471.739, depositado em 20 de maio de 2003, cuja descrição é aqui incorporada por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um método para a preparação de conjugados citotóxicos melhorados compreendendo maitansinóides e agentes de ligação celular. Estes conjugados possuem uso terapêutico quando eles são liberados a uma população específica de células em uma maneira direcionada. A presente invenção também diz respeito a um método para a preparação de maitansinóides tendo uma porção de tiol, que pode ser usada na preparação de conjugados citotóxicos. A presente invenção ainda diz respeito a novos maitansinóides, e a novos intermediários na síntese dos novos maitansinóides.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Muitos relatos têm surgido sobre as tentativas de direcionamento específico das células tumorais com conjugados de anticorpo monoclonalmedicamento (Sela et al. in Immunoconjugates 189-216 (C. Vogei, ed.
1987) ; Ghose et al, in Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener et al, in Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz et al, in Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. Rodwell, ed.
1988) ; Bumol et al, in Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988). Os medicamentos citotóxicos tais como metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C e clorambucil têm sido conjugados com uma variedade de anticorpos monoclonais de murino. Em alguns casos, as moléculas de medicamento foram ligadas às moléculas de anticorpo através de uma molécula veículo intermediária tal como albumina de soro (Garnett et al. Câncer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa et al. Câncer Immumol. Immunother. 23:81-86 (1986); Endo
2/85 et al. Câncer Res. 47:1076-1080 (1980)), dextran (Hurwitz et al. Appl. Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi et al. Biochem. Pharmacol. 34:289-291 (1985); Dillman et al. Câncer Res. 46:4886-4891 (1986); Shoval et al. Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 8276-8280 (1988)), ou ácido poliglutâmico (Tsukada et al. J. Natl. Canc. Inst. 73:721-729 (1984); Kato et al. J. Med. Chem. 27:16021607 (1984); Tsukada et al. Br. J. Câncer 52:111-116 (1985)).
Uma ampla disposição de tecnologias de articulador tem sido empregada para a preparação de tais imunoconjugados, e os articuladores tanto cliváveis quanto não cliváveis foram investigados. Na maioria dos casos, o potencial citotóxico total dos medicamentos pode somente ser observado, no entanto, se as moléculas de medicamento puderem ser liberadas dos conjugados na forma não modificada no sítio alvo.
Um dos articuladores cliváveis que foi empregado para a preparação de conjugados de anticorpo-medicamento é um articulador lábil de ácido com base no ácido cis-aconítico que leva vantagem do ambiente acídico de diferentes compartimentos intracelulares tais como os endossomas encontrados durante a endocitose mediada por receptor e os lisossomas. Shen e Ryser introduziram este método para a preparação de conjugados de daunorrubicina com veículos macromoleculares (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)). Yang e Reisfeld usaram a mesma técnica para conjugar daunorrubicina a um anticorpo antimelanoma (J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)). Recentemente, Dillman et al. também usaram um articulador lábil de ácido em uma maneira similar para preparar conjugados de daunorrubicina com um anticorpo anticélula T (Câncer Res. 48:60976102 (1988)).
Um método alternativo, explorado por Trouet et al. envolvia a ligação de daunorrubicina a um anticorpo através de uma ramificação separadora de peptídeo (Proc. Natl. Acad. Sei. 79:626-629 (1982)). Isto foi feito sob a premissa de que o medicamento livre pode ser liberado de um tal conjugado pela ação das peptidases lisossomais.
Os testes de citotoxicidade in vitro, no entanto, têm revelado que os conjugados de anticorpo-medicamento raramente alcançaram a mesma
3/85 potência de citotoxicidade como os medicamentos não conjugados livres. Isto sugeriu que os medicamentos pelos quais as moléculas de medicamento são liberadas dos anticorpos são muito ineficientes. Na área de imunotoxinas, os conjugados formados através de pontes de dissulfeto entre os anticorpos monoclonais e as toxinas de proteína cataliticamente ativas foram mostrados de serem mais citotóxicos do que os conjugados contendo outros ligantes. Ver, Lambertetal. J. Biol. Chem. 260:12035-12041 (1985); Lambert et ai. in Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie et al. Câncer Res. 48:2610-2617 (1988). Isto foi atribuído à concentração intramolecular elevada de glutationa que contribui para a divagem eficiente da ligação de dissulfeto entre uma molécula de anticorpo e uma toxina. A despeito disto, existem apenas alguns exemplos relatados do uso de pontes de dissulfeto para a preparação de conjugados entre os medicamentos e macromoléculas. Shen et al. descreveram a conversão de metotrexato em um derivado de mercaptoetilaminda seguido pela conjugação com poli-D-lisina através de uma ligação de dissulfeto (J. Biol. Chem. 260:10905-10908 (1985)). Além disso, alguns relatos descreveram a preparação de conjugados do medicamento tóxico contendo trissulfeto de caliceamicina com anticorpos (Hinman et al, 53 Câncer Res. 3336-3342 (1993), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 13, 40-46 (2002), Hamann et al., Bioconjugate Chem., 13, 47-58 (2002)).
Uma razão para a falta de conjugados de anticorpomedicamento ligados por dissulfeto é a indisponibilidade de medicamentos citotóxicos que carregam uma porção contendo átomo de enxofre que podem ser facilmente usados para ligar o medicamento a um anticorpo através de uma ponte de dissulfeto. Além disso, a modificação química dos medicamentos existentes é difícil sem administrar seu potencial citotóxico.
Os maitansinóides são medicamentos altamente citotóxicos. A maitansina foi primeiro isolada por Kupchan et al. do arbusto Africano oriental Maytenus serrata e mostrada ser de 100 a 1000 vezes mais citotóxica do que os agentes quimioterapêuticos convencionais de câncer como metotrexato, daunorrubicina e vincristina (Patente U.S. número 3.896.111). Subseqüentemente, foi descoberto que alguns micróbios também produzem mai4/85 tansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 de maitansinol (Patente U.S. número 4.151.042). Os ésteres C-3 sintéticos de maitansinol e análogos de maitansinol também foram ralatados (Kupchan et al. J. Med. Chem. 21:31-37 (1978); Higashide et al. Nature 270:721-722 (1977); Kawai et al. Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984)). Exemplos de análogos de maitansinol dos quais os ésteres C-3 foram preparados incluem maitansinol com modificações no anel aromático (por exemplo, descloração) ou no C-9, C-14 (por exemplo, grupo de metila hidroxilado), C-15, C-18 e C-4,5.
Os ésteres C-3 de ocorrência natural ou sintéticos de maitansinol podem ser classificados em dois grupos:
(a) ésteres C-3 com ácidos carboxílicos simples (Patentes U.S. números 4.248.870; 4.265.814; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.317.821; 4.322.348; e 4.331.598), e (b) ésteres C-3 com derivados de N-metil-L-alanina (Patente U.S. número 4.137.230; 4.260.608; 5.208.020; e Chem. Pharm. Bull. 12:3441 (1984)).
Os ésteres do grupo (b) foram observados serem mais citotóxicos do que os ésteres do grupo (a).
A maitansina é um inibidor mitótico. O tratamento de células L1210 in vivo com maitansina foi relatado de resultar em 67 % das células se acumularam em mitose. As células de controle não tratadas foram relatadas de demonstrar um índice mitótico variando entre 3,2 a 5,8 % (Sieber et al. 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976)). Experiências com ovos de ouriço-do-mar e ovos de mexilhão sugeriram que a maitansina inibe a mitose mediante a interferência com a formação de microtúbulos através da inibição da polimerização da proteína microtubular, tubulina (Remillard et al. Science 189:1002-1005 (1975)).
Suspensões celulares de murino leucêmico P388, L1210 e LY5178 in vitro foram observadas de serem inibidas por maitansina en doses de 10'3 a 10'1 μρ/μΙ como a linhagem P388 sendo a mais sensível. Maitansina foi também mostrada de ser um inibidor ativo do crescimento in vitro de células do carcinoma nasofaríngeco humano, e a linhagem de leucemia lin5/85 foblástica aguda humana CEM foi relatada inibida por concentrações tão baixas quanto 10'7 pg/ml (Wolpert-DeFillippes et al. Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738 (1975)).
In vivo, a maitansina também foi mostrada ser ativa. O cresci5 mento tumoral no sistema de leucemia linfocítica P388 foi mostrado de ser inibido por uma faixa de dosagem de 50 a 100 vezes, que sugeriu um índice terapêutico elevado; da mesma forma atividade inibidora significativa pode ser demonstrada com o sistema de leucemia de camundongo L1210, o sistema de carcinoma do pulmão de Lewis humano e o sistema melanocarci10 noma B-16 humano (Kupchan, Ped. Proc. 33:2288-2295 (1974)). Os maitansinóides usdos em conjugados com agentes de ligação celular são descritos nas Patentes U.S. números 5.208.020 e 5.416.064 e em Chari et al., Câncer Res., 52: 127-131 (1992) e Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 93: 8618-8623 (1996). Nestes conjugados, o agente de ligação celular é ligado através de ligações de dissulfeto ao maitansinóide DM1 [N2-deacetil-N-2(3-mercapto-1oxopropil)-maitansina, 1, CAS Number: 139504-50-0, Figura 1].
Nas patentes acima, os medicamentos de maitansinóide que carregam cadeias laterais de N-metil-L-alanina acilada são da fórmula 2a,b:
Figure BRPI0419348B1_D0001
Figure BRPI0419348B1_D0002
Na fórmula 2a, I representa um número inteiro de 1 a 10. Assim, 20 os maitansinóides da fórmula 2a possuem o átomo de enxofre conectados a um grupo de metileno não substituído (-CH2-S-). É dito que um grupo de sulfidrila em um tal composto de maitansinóide ou um grupo de dissulfeto em um conjugado de agente de ligação à célula-maitansinóide ligado a dissulfeto com um tal maitansinóide é não impedido, visto que não existe nenhum
6/85 substituinte volumoso sobre o α-carbono próximo ao grupo de sulfidrila ou dissulfeto, que causam impedimento estérico. Na fórmula 2b, m representa 0, 1, 2 ou 3. Portanto, os maitansinóides da fórmula 2b também possuem o átomo de enxofre conectado a um grupo de metileno não substituído, exceto no caso onde m = 0, e R2 = CH3 ou CH2CH3. Se m = 0, então o maitansinóide carrega um substituinte no carbono que carrega a funcionalidade tiol ou uma funcionalidade de dissulfeto após conjugação a um agente de ligação à célula através de uma ligação de dissulfeto. Entretanto, em virtude de neste caso o átomo de enxofre estar na posição β em relação a um grupo de carbonila, estes maitansinóides e conjugados de tais maitansinóides com agentes de ligação celular através de uma ligação de dissulfeto foram observados de serem instáveis devido à sua propensão de sofrer β-eliminação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se baseia na descoberta inesperada que a ligação de maitansinóides, que carregam um grupo de tiol estericamente impedido (possuindo um ou dois substituintes no α-carbono que carrega a funcionalidade de tiol), aos agentes de ligação celular dá conjugados que possuem atividade antitumoral vastamente melhorada in vivo quando comparado com conjugados preparados com os maitansinóides anteriormente descritos que não possuíam um substituinte no átomo de α-carbono que carrega a ligação de dissulfeto. Uma outra descoberta inesperada foi que a atividade biológica melhorada é obtida quando o impedimento estérico está muito favoravelmente sobre o lado de maitansinóide da ligação de dissulfeto nos conjugados. Além disso, o grupo de acila da cadeia lateral de aminoácido acilado do maitansinóide que carrega o grupo de sulfidrila tem que possuir um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre o grupo de carbonila da amida e o átomo de enxofre.
Estas descobertas mostram que os conjugados de agente de ligação celular-maitansinóide ligados a dissulfeto podem ser construídos tais que as substituições sobre os átomos de α-carbono que carregam a ligação de dissulfeto podem resultar em graus variáveis de impedimento estérico em cada lado da ligação de dissulfeto.
7/85
Conseqüentemente, a presente invenção descreve a síntese de novos maitansinóides contendo tiol e dissulfeto estéricamente impedidos, os quais carregam um ou dois substituintes de alquila no átomo de a-carbono que transporta o átomo de enxofre. Além disso, o grupo de acila da cadeia lateral de aminoácido acilado possui um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre o grupo de carbonila da amida e o átomo de enxofre.
A preparação e avaliação biológica dos conjugados de agente de ligação celular destes novos maitansinóides é também descrita.
Em uma modalidade da invenção, novos maitansinóides contendo tiol e dissulfeto que carregam uma substituição de mono- ou dialquila sobre o átomo de carbono que transporta o átomo de enxofre são descritos.
Em uma segunda modalidade, a presente invenção apresenta métodos para a síntese destes novos maitansinóides.
Em uma terceira modalidade, os métodos para a ligação destes novos maitansinóides aos agentes de ligação celular são descritos. Estes conjugados são úteis como agentes terapêuticos, que são liberados especificamente às células alvos e são citotóxicos. Estes conjugados apresentam eficácia terapêutica vastamente melhorada em modelos de tumor de animal comparados com os agentes anteriormente descritos.
Mais especificamente, a presente invenção fornece:
Um maitansinóide tendo, em C-3, hidroximetila C-14, hidróxi ΟΙ 5, ou desmetila C-20, uma cadeia lateral de aminoácido acilado com um grupo de acila que carrega um grupo de sulfidrila impedido, em que o átomo de carbono do grupo de acila que transporta a funcionalidade de tiol possui um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear ou ramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso um dos substituintes pode ser H, e em que o grupo de acila possui um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade de carbonila e o átomo de enxofre.
8/85
Um composto representado pela fórmula 4':
Figure BRPI0419348B1_D0003
em que:
Y' representa (CR7R8)i(CR9=CR1o)p(C=C)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CRi2)r(C^)sBt( CR3R4)nCRi R2SZ, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
A, B, D são cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou de heterocicloalquila;
R3, R4i R5i Re, R7, Rs, Rg, R10, R11, θ R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou de heterocicloalquila;
I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero em qualquer momento;
Ζ é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo
9/85 de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Um composto representado pela fórmula 4', em que Ri é metila, R2éHeZéH.
Um composto representado pela fórmula 4', em que Ri e R2 são metila e Z é H.
Um composto representado pela fórmula 4', em que R-ι é metila, R2 é H e Z é -SCH3.
Um composto representado pela fórmula 4', em que Rí e R2 são metila, e Z é -SCH3.
Figure BRPI0419348B1_D0004
May
D h3ç
Χ..Λ h3c N' 'Y MayZ
Figure BRPI0419348B1_D0005
A o D,L (D em que:
Y representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4· Rs, R6, Rz θ Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z é H, SR ou -COR em que R é alquila ou alquenila linear ou ramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico; e
10/85
May representa um maitansinóide que carrega a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi ou C-20 desmetila;
O composto acima descrito, em que Ri é metila, R2 é H, R5, R6, R7 , e R8 são cada um Η, I e m são each 1, n é 0, e Z é H;
O composto acima descrito, em que Ri e R2 são metila, R5, Re, R?, R8 são cada um Η, I e m são 1, n é 0, e Z é H;
O composto acima descrito, em que Ri é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, n é 0, e Z é -SCH3;
O composto acima descrito, em que Ri e R2 são metila, R5, R6, R7, R8 são cada um Η, I e m são 1, n é 0, e Z é -SCH3;
Figure BRPI0419348B1_D0006
em que:
Y representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ, em que:
R-ι e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, Rs, Re, R7 θ Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
11/85
Z é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
O composto de fórmula 4, em que Ri é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um Η; I e m são cada um 1; n é 0; e Z é H;
O composto de fórmula 4, em que Ri e R2 são metila; R5, R6, R7, Rs são cada um Η, I e m são 1; n é 0; e Z é H;
O composto de fórmula 4, em que R1 é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, n é 0, e Z é -SCH3;
O composto de fórmula 4, em que R-ι e R2 são metila, R5, R6, R7, Rs são cada um Η, I e m são 1, n é 0, e Z é -SCH3;
Um conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular que compreende pelo menos um maitansinóide ligado ao agente de ligação celular, em que o maitansinóide é qualquer um dos compostos acima descritos;
Qualquer um dos conjugados de maitansinóide-agente de ligação celular acima descritos, em que o agente de ligação compreende um sítio de ligação de um anticorpo, preferivelmente MY9 humanizado ou reemergido, anti-B4 reemergido, ou C242 humanizado ou reemergido;
Uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de qualquer um dos conjugados de maitansinóide-agente de ligação celular acima descritos, um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável destes, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável;
Um método de esterificação de um maitansinóide em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, com uma cadeia lateral de aminoácido acilado onde 0 grupo de acila carrega uma funcionalidade de sulfidrila protegida, em que 0 átomo de carbono do grupo de acila que transporta a funcionalidade de tiol protegida possui um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo CH3, C2Hs alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso um dos substituintes pode ser H, e em que
12/85 o grupo de acila possui um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade carbonila e o átomo de enxofre, dito método compreendendo a reação de um maitansinóide em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, com o aminoácido acilado onde o grupo de acila carrega um grupo de sulfidrila protegido;
Um método de esterificação de um maitansinóide para produzir um éster de maitansinóide representado pela fórmula (IV-L), (IV-D) ou (IVD,L):
Figure BRPI0419348B1_D0007
L D D, L (IV) em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 e Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila cíclica linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico; e
May é um maitansinóide; dito método compreendendo a reação de dito May em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila,
13/85 com um composto de fórmula (III-L), (lll-D), ou (Ill-D,L):
Figure BRPI0419348B1_D0008
em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 θ Re são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear ou ramificada tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
O método acima descrito, em que R-ι é metila, R2 é H, R5, R6, R7 e R8 são cada um Η; I e m são cada um 1; e n é 0.
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (III) é representado pela fórmula (lll-L).
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (lll-L) é composto 15a(S,S), 15b(S,R) ou uma mistura de 15a(S,S) e 15b(S,R).
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (lll-D) é composto 15(R, S), 15(R,R), ou uma mistura de 15(R,S) e 15(R,R).
14/85
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (lllD,L) é N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar o compostos da estrutura de 15.
O método acima descrito, em que a mistura de 15a(S,S) e 15b(S,R) é preparada por um processo que compreende:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metil-L-alanina para dar dita mistura de compostos 15a(S,S) e 15b(S,R).
O método acima descrito, em que composto 15a(S,S) é preparado por um método compreendendo:
(1) converter o (R)-1,3-butanodiol em ácido (S)-4(metiditio)pentanóico 19;
(2) converter o composto 19 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (20); e (3) reagir o composto 20 com N-metil-L-alanina para dar dito composto 15a(S,S).
O método acima descrito, em que composto 15b(S,R) é preparado por um método compreendendo:
(1) converter o (S)-1,3-butanodiol em ácido (R)-4-(metiditio)pentanóico 24;
(2) converter o composto 24 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (25); e (3) reagir o composto 25 com N-metil-L-alanina para dar dito composto 15b(S,R).
O método acima descrito, em que a mistura dos compostos 15(R,S) e 15(R,R) é preparada por um processo compreendendo:
(1) reagir o ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsul15/85 fonato de metila para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14, (3) reagir o composto 14 com N-metil-D-alanina para dar dita mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R).
O método acima descrito, em que N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura de 15 é preparado por um processo que compreende:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metilalanina racêmica para dar a N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura 15.
O método acima descrito, em que R-ι e R2 são metila; R5, R6, R7 e Rs são cada um Η; I e m são cada um 1; e n é 0.
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (lll-L) é composto 10(S) contendo N-metil-L-alanina.
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (lll-D) é composto 10(R) contendo N-metil-D-alanina.
O método acima descrito, em que o composto de fórmula (IIID,L) é composto 10(S,R) contendo N-metilalanina racêmica.
O método acima descrito, em que o composto 10 contendo Nmetii-L-alanina, N-metil-D-alanina ou N-metilalanina racêmica é preparado por um processo compreendendo:
(1) reagir sulfeto de isobutileno (5) com o ânion de acetonitrila para dar o composto 6;
16/85 (2) hidrolizar o composto 6 para dar ácido 4-mercapto-4metilpentanóico (7);
(3) converter o composto 7 em dissulfeto 8 mediante a reação com metanotiolsulfonato de metila;
(4) converter o composto 8 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 9; e (5) reagir o composto 9 com N-metil-L-alanina, N-metil-Dalanina, ou N-metilalanina racêmica para dar dito composto 10 contendo Nmetil-L-alanina, N-metil-D-alanina, ou N-metilalanina racêmica.
Um método para produzir um maitansinóide pelo método de qualquer um dos métodos acima descritos, separando os diastereômeros, se presentes, e purificando o maitansinóide por HPLC em sílica ligada por ciano.
Um método para produzir um conjugado de maitansinóideagente de ligação celular compreendendo produzir um maitansinóide purificado por qualquer um dos métodos acima descritos, e reagir o maitansinóide purificado com um agente de ligação celular que compreende um grupo de ditio reativo ou um grupo de sulfidrila.
O método acima descrito de produzir um conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular, em que o grupo de ditio reativo é um grupo de ditiopiridila ou um grupo de ditiopiridila substituído.
Um método para produzir um conjugado de maitansinóideagente de ligação celular compreendendo produzir um maitansinóide purificado por qualquer um dos métodos acima descritos, e reagir o maitansinóide purificado com um agente de ligação celular compreendendo um grupo de maleimido ou um grupo de haloacetila.
Um método de esterificação do maitansinol para dar um maitansinóide da fórmula 42':
17/85
Figure BRPI0419348B1_D0009
em que:
Y2' representa (CR7R8),(CR9=CR10)p(CX)qAr(CR5R6)mDu(CR11=CRi2)r (CsC)sBt(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
R-ι e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou aquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
A, B, e D cada um independentemente é cicloalquila ou cicloalquenila tendo 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
R3, R4, R5i R6, R7, Re, R9, R10, R11, θ R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero em qualquer momento; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aro18/85 mático heterocíclico ou heterocíclico, dito método compreendendo reagir maitansinol da estrutura 11 no C-3:
Figure BRPI0419348B1_D0010
com um composto de fórmula (ΙΙΓ-L), (ΙΙΓ-D), ou (lll'-D
HO,
ΚΛ,
Ν Y,
HO.
Figure BRPI0419348B1_D0011
Η O
U
N Y2'
D (III')
Figure BRPI0419348B1_D0012
em que:
Y2· representa (CR7R8)l(CR9-CR1o)p(C=C)qAo(CR5R6)mDu(CR11-CR12)r (C=C)sBt(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
A, B, e D cada um, independentemente é cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ariia simples ou substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9, R11, e R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou de
19/85 heterocicloalquila;
I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero em qualquer momento; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
O método de esterification de maitansinol para dar um maitansi10 nóide de o fórmula 42', em que o composto de fórmula (I) é representado pela fórmula (l-L).
O método de esterificação de maitansinol para dar um maitansinóide da fórmula 42', em que Ri é H e R2 é metila.
Um método de esterificação de maitansinol para dar um maitan15 sinóide da fórmula 42:
Figure BRPI0419348B1_D0013
em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cí20 clica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, Rs, R6, R7 e Rs são cada um independentemente H, CH3,
C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila,
20/85 fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, dito método compreendendo reagir maitansinol da estrutura 11:
Figure BRPI0419348B1_D0014
L D D, L (III) em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
Rt e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, Rs, Rôi R7 θ Re são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
21/85
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou de heterocicloalquila.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar o maitansinóide de fórmula 4a, em que o composto de fórmula (III) é representado pela fórmula (lll-L).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4a, em que dito composto de fórmula (lll-L) é o composto 15a(S,S), 15b(S,R) ou uma mistura de 15a(S,S) e 15b(S,R).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4a, em que dito composto de fórmula (lll-D) é composto 15(R,S), 15(R,R), ou uma mistura de 15(R,S) e 15(R,R).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4a, em que dito composto de fórmula (lll-D,L) é N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou de quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura de 15.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4a, em que a mistura de 15a(S,S) e 15b(S,R) é preparada por um processo que compreende:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metil-L-alanina para dar dita mistura de compostos 15a(S,S) e 15b(S,R).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol, em que dito composto 15a(S,S) é preparado por um método compreendendo:
22/85 (1) converter o (R)-1,3-butanodiol em ácido (S)-4(metiditio)pentanóico 19;
(2) converter o composto 19 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (20); e (3) reagir o composto 20 com N-metil-L-alanina para dar o composto 15a(S,S).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol, em que dito composto 15b(S,R) é preparado por um método compreendendo:
(1) converter o (S)-1,3-butanodiol em ácido (R)-4(metiditio)pentanóico 24;
(2) converter o composto 24 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (25); e (3) reagir o composto 25 com N-metil-L-alanina para dar o composto 15b(S,R).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4a, em que a mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R) pode ser preparada por um processo compreendendo:
(1) reagir o ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metil-D-alanina para dar dita mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R,).
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4a, em que N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura de 15 é preparado por um processo que compreende:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsuifonato de metila para dar composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de N23/85 hidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metilalanina racêmica para dar o N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura 15.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4b, em que Ri e R2 são metila; R5, R6, R7, R8 são cada um Η; I e m são 1; e n é 0.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4b, em que dito composto de fórmula (lll-L) é composto 10 contendo N-metil-L-alanina.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4b, em que dito composto de fórmula (lll-D) é o composto 10 contendo N-metil-D-alanina.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4b, em que dito composto de fórmula (III-D,L) é o composto 10 contendo N-metilalanina racêmica.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4b, em que o composto 10 contendo N-metilL-alanina, N-metil-D-alanina ou N-metilalanina racêmica é preparado por um processo que compreende:
(1) reagir sulfeto de isobutileno (5) com o ânion de acetonitrila para dar o composto 6;
(2) hidrolizar o composto 6 para dar ácido 4-mercapto-4metilpentanóico (7);
(3) converter o composto 7 no dissulfeto 8 mediante a reação com metanotiolsulfonato de metila;
(4) converter o composto 8 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 9; e (5) reagir o composto 9 com N-metil-L-alanina, N-metil-Dalanina, ou N-metilalanina racêmica para dar composto 10 contendo N-metil24/85
L-alanina, N-metil-D-alanina ou N-metilalanina racêmica.
O método acima descrito de esterificação de maitansinol com 10, seguido pela separação de diastereômeros, se presentes, e purificação do maitansinóide por HPLC em sílica ligada por ciano, ainda compreendendo a redução da ligação de dissulfeto, para dar maitansinóides de fórmula 4b.
Um método para produzir um conjugado de maitansinóideagente de ligação celular compreendendo produzir um maitansinóide purificado por qualquer um dos métodos acima descritos de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmula 4b, e reagir o maitansinóide com um agente de ligação celular compreendendo um grupo de sulfidrila ou um grupo de ditio reativo, preferivelmente, um grupo de ditiopiridila ou um grupo de ditiopiridila substituída.
Um método para produzir um conjugado de maitansinóideagente de ligação celular compreendendo produzir um maitansinóide purificado por qualquer um dos métodos acima descritos de esterificação de maitansinol para dar maitansinóides de fórmuia 4b, e reagir o maitansinóide com um agente de ligação celular compreendendo um maleimido ou um grupo de haloacetila.
Métodos de terapia usando os conjugados acima descritos. Compostos de fórmuia (III):
Figure BRPI0419348B1_D0015
Figure BRPI0419348B1_D0016
Figure BRPI0419348B1_D0017
Y2 em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode
25/85 ser Η;
R3, R4i R5i R6i R7 e R8 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Compostos 10 (S), 10 (R) ou racêmico 10.
Um método para produzir o composto 10 contendo N-metil-Lalanina, N-metil-D-alanina, ou N-metilalanina racêmica compreendendo:
(1) reagir sulfeto de isobutileno (5) com o ânion de acetonitrila para dar o composto 6;
(2) hidrolizar o composto 6 para dar ácido 4-mercapto-4metilpentanóico (7);
(3) converter o composto 7 em dissulfeto 8 mediante a reação com metilmetanotiolsulfonato;
(4) converter o composto 8 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 9; e (5) reagir o composto 9 com N-metil-L-alanina, N-metil-Dalanina, ou N-metilalanina racêmica para dar dito composto 10 contendo Nmetil-L-alanina, N-metil-D-alanina, ou N-metilalanina racêmica.
Uma mistura de compostos 15a(S,S) e 15b(S,R).
Um método para produzir uma mistura de compostos 15a(S,S) e 15b(S,R), compreendendo:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metilmetanotiolsulfonato para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (14); e
26/85 (3) reagir o composto 14 com N-metil-L-alanina para dar dita mistura de compostos 15a(S,S) e 15b(S,R).
Uma mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R).
Um método para produzir uma mistura de compostos 15(R,S) e
15(R,R) compreendendo:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metil-D-alanina para dar dita mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R).
N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura de 15.
Um método para produzir N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou de quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura 15, compreendendo:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metilalanina racêmica para dar o N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura 15.
Composto 15a(S,S).
Composto 15b(S,R).
Um método para produzir composto 15a(S,S) compreendendo:
27/85 (1) converter o (R)-1,3-butanodiol em ácido (S)-4(metiditio)pentanóico 19;
(2) converter o composto 19 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (20); e (3) reagir o composto 20 com N-metil-L-alanina para dar dito composto 15a(S,S).
Um método para produzir composto 15b(S,R) compreendendo:
(1) converter o (S)-1,3-butanodiol em ácido (R)-4(metiditio)pentanóico 24;
(2) converter o composto 24 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (25); e (3) reagir o composto 25 com N-metil-L-alanina para dar dito composto 15b(S,R).
Uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de qualquer um dos compostos de maitansinóide descritos acima, um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável destes, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
A composição farmacêutica acima descrita que compreende um composto de maitansinóide, ainda compreendendo um anticorpo.
Um método para induzir a morte celular em populações de célula selecionadas compreendendo o contato das células alvos ou tecido contendo células alvos com uma quantidade eficaz de qualquer um dos agentes de ligação celular com maitansinóide acima descritos, sais ou solvatos destes. BREVE DESCRIÇÃO DAS Figuras
A Figura 1 mostra as estruturas dos maitansinóides anteriormente descritos.
A Figura 2 mostra as estruturas de alguns dos maitansinóides da presente invenção.
As Figuras 3a-d mostram esquemas para a síntese dos maitansinóides representativos da presente invenção.
As Figuras 4a,b são gráficos que mostram a potência in vitro dos novos maitansinóides da presente invenção.
28/85
As Figuras 4c,d são gráficos que comparam a potência in vitro dos novos maitansinóides da presente invenção com aqueles anteriormente descritos.
As Figuras 5a-d mostram esquemas para a preparação dos conjugados de agentes de ligação celular com maitansinóides da presente invenção.
A Figura 6 é um gráfico que mostra a potência in vitro dos conjugados de agente de ligação celular-maitansinóide da presente invenção.
A Figura 7 é um gráfico que compara a eficácia antitumor in vivo de huC242-maitansinóides da presente invenção com conjugados huC42 dos maitansinóides anteriormente descritos, contra xenoenxertos de tumor do cólon humano HT-29.
A Figura 8 é um gráfico quie compara a eficácia antitumor in vivo de huC242-maitansinóides da presente invenção com conjugados huC242 de maitansinóides anteriormente descritos, contra xenoenxertos de tumor do cólon humano COLO 205.
A Figura 9 é um gráfico que compara a eficácia antitumor in vivo de MY9-6-maitansinóides da presente invenção com conjugados MY9-6 dos maitansinóides anteriormente descritos, contra xenoenxertos de leucemia mielóide promielocítica HL60.
A Figura 10 apresenta o resultado da avaliação de citotoxicidade in vitro do conjugado huMy9-6-DM4 com células HL-60 alvos e células Namalwa alvos.
A FIG 11 apresenta a avaliação de eficácia in vivo do conjugado huMy9-6-DM4 contra tumores de xenoenxerto HL-60 humanos em camundongos SCID e a compara com aquela de um conjugado huMy9-6 de um maitansinóide anteriormente descrito (huMy9-6-DM1).
A Figura 12 apresenta o resultado da avaliação de citotoxicidade in vitro do conjugado huB4-DM4 com células Ramos alvos e células Colo 205 não alvos.
Figura 13a apresenta a avaliação da eficácia in vivo do conjugado huB4-DM4 contra tumores de xenoenxerto Ramos humanos em camun29/85 dongos SCI D, e a FIG 13b mostra as mudanças nos pesos corporais dos animais durante o período de teste.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Esta invenção descreve novos maitansinóides contendo tiol e dissulfeto estericamente impedidos em que o átomo de α-carbono que carrega o átomo de enxofre transporta um ou dois substituintes de alquila. A invenção também apresenta um processo para a síntese destes novos maitansinóides. Novos compostos que são úteis como intermediário na síntese dos novos maitansinóides são ainda apresentados. Além disso, esta invenção apresenta a preparação de conjugados destes novos maitansinóides com agentes de ligação.
A técnica revela que é extremamente difícil modificar os medicamentos existentes sem diminuir seu potencial citotóxico. A invenção apresentada supera este problema mediante o ensinamento de um método de sintetização das novas moléculas de maitansinóide contendo uma porção de tiol ou dissulfeto estericamente impedida. Os novos maitansinóides apresentados preservam, e em alguns casos ainda intensificam, a potência citotóxica dos maitansinóides anteriormente descritos.
Os conjugados de maitansinóide-agente de ligação celular permitem a medição completa da ação citotóxica dos maitansinóides a serem aplicados em uma maneira direcionada somente contra as células indesejáveis, desse modo evitando os efeitos colaterais devido ao dano de células sadias não direcionadas. Assim, a invenção fornece agentes úteis, e novos métodos para a sua produção, para a eliminação de células doentes ou anormais que devem ser aniquiladas ou submetidas a lise, tais como células tumorais (particularmente células de tumor sólido), células infectadas com vírus, células infectadas com microorganismos, células infectadas com parasitas, células autoimunes (células que produzem anticorpos), células ativadas (aquelas envolvidas na rejeição de enxerto ou doenças de enxerto vs. hospedeiro), ou qualquer outro tipo de células doentes ou anormais, enquanto se apresenta um mínimo de efeitos colateriais.
Assim, esta invenção ensina um método para a produção de
30/85 conjugados citotóxicos melhorados compreendendo novos maitansinóides e agentes de ligação celular, com atividade biológica vastamente melhorada quando comparado com os maitansinóides e agentes de ligação celular anteriormente descritos. A invenção ainda ensina um método para a síntese dos derivados de maitansinóide que possuem uma porção de tiol ou dissulfeto estericamente impedida que permite a ligação química a um agente de ligação celular enquanto apresenta citotoxicidade elevada ou na forma ligada ou na forma liberada ou em ambos os estados. O conjugado citotóxico de acordo com a presente invenção compreende um ou mais maitansinóides ligados a um agente de ligação celuiar. De modo a ligar o maitansinóide a um agente de ligação celular, o maitansinóide deve primeiro ser modificado.
Os maitansinóides que podem ser usados na presente invenção para produzir os maitansinóides que são capazes de serem ligados a um agente de ligação celular são bem conhecidos na técnica e podem ser isolados de fontes naturais de acordo com os métodos conhecidos ou preparados sinteticamente de acordo com os métodos conhecidos.
Exemplos de maitansinóides adequados incluem maitansinol e análogos de maitansinol. Exemplos de análogos de maitansinol adequados incluem aqueles tendo um anel aromático modificado e aqueles tendo modificações em outras posições.
Exemplos específicos de análogos adequados de maitansinol tendo um anel aromático modificado incluem:
(1) C-19-descloração (Patente U.S. número 4.256.746) (preparado mediante a redução de LAH de ansamitocina P2);
(2) C-20-hidróxi (ou C-20-desmetila) +/-C-19-descloração (Patentes U.S. números 4.361.650 e 4.307.016) (preparados pela desmetilação usando Streptomyces ou Actinomyces ou descloração usando LAH); e (3) C-20-desmetóxi, C-20-acilóxi (-OCOR), +/-descloração (Patente U.S. número 4.294.757) (preparados mediante acilação usando cloretos de acila).
Exemplos específicos de análogos de maitansinol adequados tendo modificações de outras posições incluem:
31/85 (1) C-9-SH (Patente U.S. número 4.424.219) (preparado pela reação de maitansinol com H2S ou P2S5);
(2) C-14-alcoximetila (desmetóxi/CH2OR) (Patente U.S. número
4.331.598);
(3) C-14-hidroximetila ou aciloximetila (CH2OH ou CH2OAc) (Patente U.S. número 4.450.254) (preparado da Nocardia);
(4) C-15-hidróxi/acilóxi (Patente U.S. número 4.364.866) (preparado pela conversão de maitansinol por Streptomyces);
(5) C-15-metóxi (Patentes U.S. números 4.313.946 e 4.315.929) (isolado de Trewia nudiflora);
(6) C-18-N-desmetila (Patentes U.S. números 4.362.663 e 4.322.348) (preparada pela desmetilação de maitansinol por Streptomyces)-, e (7) 4,5-deóxi (Patente U.S. número 4.371.533) (preparado pela redução de tricloreto de titânio/LAH de maitansinol).
De modo a ligar o maitansinóide ao agente de ligação celular, o maitansinóide compreende uma porção de articulação, porção de articulação contém uma ligação química que permite a liberação de maitansinóides totalmente ativos em um sítio particular. As ligações químicas adequadas são bem conhecidas na técnica e incluem ligações de dissulfeto, ligações de ácido lábeis, ligações fotolábeis, ligações de peptidase lábeis e ligações de estearase lábeis. Preferíveis são as ligações de dissulfeto.
A descrição da Patente U.S. número 5.208.020, aqui incorporada por referência, ensina a produção de maitansinóides que carregam tais ligações.
De acordo com a presente invenção, a porção de articulação compreende uma porção de tioi ou dissulfeto estericamente impedida.
Os maitansinóides particularmente preferidos que compreendem uma porção de articulação que contém um grupo químico reativo são ésteres C-3 de maitansinol e seus análogos onde a porção de articulação contém uma ligação de tiol ou dissulfeto estericamente impedida.
Muitas posições sobre os maitansinóides podem servir como a
32/85 posição para quimicamente ligar a porção de articulação. Por exemplo, a posição C-3 tendo um grupo de hidroxila, a posição C-14 modificada com hidroximetila, a posição C-15 modificada com hidróxi e a posição C-20 tendo um grupo de hidróxi são todos esperados de serem úteis. No entanto, a posição C-3 é preferível e a posição c-3 de maitansinol é especialmente preferida.
Além disso, embora a síntese dos ésteres de maitansinol tendo uma porção de articulação seja descrita abaixo em termos de uma ligação de dissulfeto contendo porções de articulação na posição C-3, uma pessoa versada na técnica compreenderá que as porções de articulação com outras ligações químicas, como descrito acima, podem também ser usadas com a presente invenção, assim como podem outros maitansinóides e outras posições de ligação, como descrito acima.
As estruturas de vários maitansinóides da presente invenção são representadas na Figura 2. A síntese de maitansinóides tendo uma porção de tiol ou dissulfeto estericamente impedida pode ser descrita por referência à Figura 3. Muitos dos métodos exemplificados abaixo utilizam os maitansinóides contendo tiol N2-deacetil-N-2(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (denominado DM3) e N2-deacetil-N-2(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)maitansina (denominado DM4). DM3 (4a) e DM4 (4b) são representados pelas seguintes fórmulas estruturais:
Figure BRPI0419348B1_D0018
Figure BRPI0419348B1_D0019
A citotoxicidade in vitro dos novos maitansinóides contendo tiol e dissulfeto estericamente impedidos da invenção pode ser avaliada por sua capacidade de suprimir a proliferação de várias linhagens celulares indesejáveis in vitro (Figura 4). Por exemplo, as linhagens celulares tais como a
33/85 linhagem de carcinoma da mama humana SK-Br-3, ou a linhagem celular de carcinoma epidermóide humana KB, podem ser usadas para a avaliação da citotoxicidade destes novos maitansinóides. As células a serem avaliadas podem ser expostas aos compostos por 72 horas e às frações de sobrevivência das células medidas em ensaio direto por métodos conhecidos. Os valores de IC50 podem depois ser calculados a partir dos resultados dos ensaios.
Produção de Maitansinóides tendo uma Porção de Tiol ou Dissulfeto Estericamente Impedida
Os novos maitansinóides da invenção aqueles tendo, em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, uma cadeia lateral de aminoácido acilado com um grupo de acila que carrega um grupo de sulfidrila impedido, em que o átomo de carbono do grupo de acila que transporta a funcionalidade de tiol possui um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso um dos substituintes pode ser H, e em que o grupo de acila possui um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade de carbonila e o átomo de enxofre.
Preferivelmente, os compostos de maitansinóide são representados pela fórmula 4':
Figure BRPI0419348B1_D0020
em que:
Y' representa (CR7R8)i(CR9=CRio)p(C^C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CR12)r (C5C)sBt(CR3R4)nCRiR2SZ,
34/85 em que:
R-ι e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H; A, B, D são cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou de heterocicloalquila;
R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9, R-io, R11, θ R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero em qualquer momento;
Z é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Em uma modalidade preferida do composto representado pela fórmula 4', R1 é H, R2 é metila eZé H; R1 e R2 são metila e Zé H; R1 é metila, R2 é H e Z é -SCH3; ou R1 e R2 são metila, e Z é -SCH3.
Mais preferivelmente, os maitansinóides são compostos representados pela fórmula (l-L), (l-D), ou (l-D,L):
Figure BRPI0419348B1_D0021
(I) em que:
Y representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ, em que:
35/85
R-ι e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4j Rs, R6, R7 θ Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico; e
May representa um maitansinóide que carrega a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi ou C-20 desmetila.
Mais preferível é o C-3 éster, que é um composto representado pela fórmula 4:
Figure BRPI0419348B1_D0022
em que os substituintes são como definidos acima.
Especialmente preferível são qualquer um dos compostos acima descritos, em que R1 é metila, R2 é H, R5, R6, R7 e R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, n é 0, e Z é H; aqueles compostos em que R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, Re são cada um Η, I e m são 1, n é 0, e Ζ é H; aqueles compostos em que R1 é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, n é 0, e Z é -SCH3; e aqueles compostos R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, Rs são cada um Η, I e m são 1, n é 0, e Ζ é -SCH3. Além disso, o
36/85 estereoisômero L-alanila é preferível quando for o mais útil para os conjugados da invenção.
As modalidades preferidas de fórmula 4 incluem DM3 e DM4, isto é, o maitansinóide de fórmula 4 onde Z é H, R-ι é metila, R2 é H, R5, R6, R7, e R8 são cada um H, e I e m são 1, e n é 0 (DM3, composto 4a); o maitansinóide de fórmula 4 onde Zé H, e R2 são ambos metila, R5, R6, R7, e Rs são cada um Η, I e m são 1, e n é 0 (DM4, composto 4b); o maitansinóide de fórmula 4 em que Ri é metila, R2 é H, R5, R6, R7 , e R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, n é 0, e Z é -SCH3; e o maitansinóide de fórmula 4 em que Ri e R2 são metila, R5, R6, R7, Rs são cada um Η, I e m são 1, n é 0, e Z é -SCH3.
Exemplos de alquilas ou alquenilas lineares tendo de 1 a 10 átomos de carbono incluem, mas não são limitados a eles, metila, etila, propila, butila, pentila, hexila, propenila, butenila e hexenila.
Exemplos de alquilas ou alquenilas ramificadas tendo de 3 a 10 átomos de carbono incluem, mas não são limitados a eles, isopropila, isobutila, sec.-butila, terc.-butila, isopentila, 1-etil-propila, isobutenila e isopentenila.
Exemplos de alquilas e alquenilas cíclicas tendo de 3 a 10 átomos de carbono incluem, mas não são limitados a eles, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, ciclopentenila e cicloexenila.
Arilas simples incluem arilas tendo de 6 a 10 átomos de carbono, e as arilas substituídas incluem arilas tendo de 6 a 10 átomos de carbono que carregam pelo menos um substituinte de alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou substituinte de alcóxi tal como metóxi, etóxi, ou um substituinte de halogeno ou um substituinte de nitro.
Exemplos de arila simples que contêm de 6 a 10 átomos de carbono incluem fenila e naftila.
Exemplos de arila substituída incluem nitrofenila, dinitrofenila.
Os radicais aromáticos heterocíclicos incluem grupos que possuem um anel de 3 a 10 membros contendo um ou dois heteroátomos selecionados de N, O ou S.
37/85
Os radicais heterocíclicos incluem compostos cíclicos, compreendendo sistemas de anel de 3 a 10 membros, contendo um ou dois heteroátomos, selecionados de N, O ou S.
Exemplos de radicais aromáticos heterocíclicos incluem piridila, nitro-piridila, pirolila, oxazolila, tienila, tiazolila e furila.
Exemplos de radicais de heteroalquila incluem diidrofurila, tetraidrofurila, tetraidropirolila, piperidinila, piperazinila e morfolino.
Novos maitansinóides tendo uma porção de tiol ou dissulfeto estéricamente impedida podem ser preparados pelos métodos recentemente descritos que seguem.
Síntese de Maitansinóides
A Figura 3a mostra as etapas na síntese de maitansinóide DM4 (4b). Sulfeto de isobutileno (5) é reagido com o ânion de acetonitrila para dar o composto de mercapto 6. A hidrólise de 6 com base forneceu o ácido 4mercapto-4-metilpentanóico (7). A conversão de 7 em dissulfeto 8 é obtida mediante a reação com metanotiolsulfonato de metila (MeSSO2Me). A conversão de 8 no éster de N-hidroxissuccinimida 9 seguido pela reação com Nmetil-L-alanina forneceu o ácido carboxílico 10, que foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel. A reação de 10 com maitansinol (11) na presença de Ν,Ν'-dicicloexilcarbodiimida (DCC) e cloreto de zinco deu uma mistura do N-acil-N-metil-L-alanila maitansinóide L-DM4SMe (4e) e o N-acilN-metii-D-alanila maitansinóide D-DM4SMe (4f). A mistura de diastereômeros foi separada por HPLC, usando uma coluna ligada a ciano. O isômero contendo o L-aminoácido desejado 4e foi coletado e reduzido com ditiotreitol para dar o L-aminoacil maitansinóide contendo tiol DM4 (4b), que foi novamente purificado por HPLC, usando uma coluna ligada por ciano.
A Figura 3b mostra as etapas na síntese de maitansinóide DM3 (4a). O ácido 4-mercaptopentanóico (12) foi convertido no metildissulfeto mediante a reação com metanotiolsulfonato de metila para dar 13. A conversão de 13 no éster de N-hidroxissuccinimida 14 seguido pela reação com Nmetil-L-alanina forneceu o ácido carboxílico 15, que foi purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel. A reação de 15 com maitansinol (11) na
38/85 presença de Ν,Ν'-dicicloexilcarbodiimida (DCC) e cloreto de zinco deu uma mistura do N-acil-N-metil-L-alanila maitansinóide L-DM3SSMe, (4c) e o Nacil-N-metil-D-alanila maitansinóide D-DM3SSMe (4d). A mistura de diastereômeros foi separada por HPLC, usando uma coluna ligada a ciano. O isômero contendo L-aminoácido desejado foi coletado com ditiotreitol para dar o maitansinóide contendo mercapto-L-aminoácido DM3 (4a), que foi novamente purificado por HPLC, usando uma coluna ligada a ciano.
A Figura 3c e d mostram a síntese de DM3 que carrega ou a porção de (S)-4-metilditio-1-oxopentila ou a porção de (R)-4-metilditio-1-oxopentila. A conversão de (R)-1,3-butanodiol (16) em seu ditosilato 17, seguido pela reação sequencial com cianeto de sódio e xantato de potássio etila deram nitrila 18 (Figura 3c). Hidrólise da base, seguido pela troca de dissulfeto deu ácido (S)-4-metiditio-pentanóico 19. A conversão de 19 no éster de succinimidila 20, seguido pela reação com N-metil-L-alanina deu N-metil-N-[4(S)-metilditio-1-oxo-pentila]-S-alanina (15a). A reação com maitansinol, como descrito acima para o composto 15, deu os dois diastereômeros de LDM3SMe 4g e 4h. Similarmente, (S)-1,3-butanodiol (21) foi convertido em ácido (R)-4-metiditio-pentanóico 24 e depois em 15b. A reação com maitansinol, como descrito acima, deu os dois diastereômeros de DM3SMe, 4k e 4I.
Assim a presente invenção fornece um método de esterificação de um maitansinóide em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, com uma cadeia lateral de aminoácido acilada onde o grupo de acila carrega um grupo de sulfidrila protegido, em que o átomo de carbono do grupo de acila que transporta a funcionalidade de tiol protegida possui um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo CH3, C2H5 alquila ou aquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso um dos substituintes pode ser H, e em que o grupo de acila possui um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade de carbonila e o átomo de enxofre, dito método compreendendo reagir um maitansinóide em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, dito mé39/85 todo compreendendo reagir um maitansinóide em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, com o aminoácido acilado onde o grupo de acila carrega um grupo de sulfidrila protegido.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um método de esterificação de maitansinol para dar um maitansinóide da fórmula 42':
Figure BRPI0419348B1_D0023
em que:
Y2' representa (CR7R8)|(CRg=CRio)p(C^C)qAo(CR5R6)mDu(CRi l=CRi2)r (CzCWCRsFUjnCR^SZ,, em que:
Rt e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
A, B e D cada um independentemente é cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
R3, R4i R5i R6, R7i Re, R9, Rn, e R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m, n, o, p, q, r, s, t eu são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q,
40/85 r, s e t não sejam zero em qualquer momento; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aro5 mático heterocíclico ou heterocíclico, dito método compreendendo reagir maitansinol da estrutura 11 no C-3:
Figure BRPI0419348B1_D0024
com um composto de fórmula (III'-L), (ΙΙΙ'-D), ou (ΙΙΙ'-D, L):
Figure BRPI0419348B1_D0025
L D D, L (NI') em que:
Y2· representa (CR7R8)i(CR9=CR1o)p(C^C)qAo(CR5R6)mDu(CRi1=CR12)r (C^C)sBt(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ra15 mificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
A, B, e D cada um, independentemente é cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
R3, R4, R5, R6, R7i Re, R9, R10, R11, θ R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos
41/85 de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero em qualquer momento; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Preferivelmente, o composto de fórmula (I) é representado pela fórmula (l-L) e, também preferível, Ri é H eR2é metila.
Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção fornece um método de esterificação de maitansinol para dar um maitansinóide da fórmula 42:
Figure BRPI0419348B1_D0026
em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
R-ι e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila cíclica ou ramificada tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4i Rs, R6, R7 θ Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
42/85
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, dito método compreendendo reagir maitansinol da estrutura 11 no C-3:
Figure BRPI0419348B1_D0027
com um composto representado pela fórmula (lll-L), (lll-D), ou (lll-D,L):
Figure BRPI0419348B1_D0028
L D D, L (III) em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
R-ι e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6i R7 e R8 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
43/85
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Os diastereômeros podem ser separados por HPLC em sílica ligada a ciano.
Em uma modalidade mais preferida, a presente invenção fornece um método de esterificação de um maitansinóide para produzir um éster de maitansinóide representado pela fórmula (IV-L), (IV-D), ou (IV-D,L):
Figure BRPI0419348B1_D0029
em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico; e
May é um maitansinóide; dito método compreendendo reagir dito
44/85 may em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi, ou C-20 desmetila, com um composto de fórmula (lll-L), (lll-D), ou (lll-D,L):
Figure BRPI0419348B1_D0030
(III) em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR-|R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, Re, R7 θ Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Em uma modalidade ainda mais preferida a presente invenção fornece um método de esterificação de maitansinol para dar um maitansinóide da fórmula 42:
45/85
Figure BRPI0419348B1_D0031
em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ra5 mificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 e R8 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou de heterocicloalquila;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo 15 de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, dito método compreendendo reagir maitansinol no C-3 com um composto de fórmula (lll-L), (lll-D), ou (lll-D, L):
Figure BRPI0419348B1_D0032
L D D, L (III) em que:
46/85
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, Re, R7 θ Re são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0;
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Preferivelmente, o composto representado pela fórmula (I) é o estereoisômero L.
Para os métodos acima, é preferível que R1 seja H, R2 seja metila, R5, R6, R7, θ Rs sejam cada um Η, I e m sejam cada um 1, e n é 0; ou que R1 e R2 sejam metila, R5, R6, R7 e R8 sejam cada um Η, I e m sejam 1, e n seja 0.
Quando produzir DM3, o composto de fórmula (lll-L) é 15a(S,S), 15b(S,R) ou uma mistura de 15a(S,S) e 15b(S,R); o composto de fórmula (lll-D) é N-metil-D-alanina acilada com o grupo de acila racêmico ou com o grupo de acila tendo cada um quiralidade R ou S para dar compostos 15; e o composto de fórmula (lll-D,L) é N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura de 15.
A mistura de 15a(S,S) e 15b(S,R) pode ser preparada por um processo que compreende:
47/85 (1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metii-L-alanina para dar dita mistura de compostos 15a(S,S) e 15b(S,R).
Similarmente, a mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R) pode ser preparada por um processo que compreende:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metil-D-alanina para dar dita mistura de compostos 15(R,S) e 15(R,R,).
N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou de quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura 15 pode ser preparada por um processo que compreende:
(1) reagir ácido 4-mercaptopentanóico (12) com metanotiolsulfonato de metila para dar o composto 13;
(2) converter o composto 13 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 14;
(3) reagir o composto 14 com N-metilalanina racêmica para dar dita N-metilalanina racêmica acilada com um grupo carboxílico que carrega uma funcionalidade de tiol protegida, em que o centro de carbono que transporta o átomo de enxofre é ou racêmico ou da quiralidade R ou S para dar compostos da estrutura 15.
O composto 15a(S,S) pode ser preparado por um processo que compreende:
(1) converter o (R)-1,3-butanodiol em ácido (S)-4(metiditio)pentanóico 19;
48/85 (2) converter o composto 19 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (20); e (3) reagir o composto 20 com N-metil-L-alanina para dar dito composto 15a(S,S).
O composto 15b(S,R) pode ser preparado por um processo que compreende:
(1) converter o (S)-1,3-butanodiol em ácido (R)-4(metiditio)pentanóico 24;
(2) converter o composto 24 em seu éster de Nhidroxissuccinimida (25); e (3) reagir o composto 25 com N-metil-L-alanina para dar dito composto 15b(S,R).
Quando produzir DM4, o composto de fórmula (lll-L) é um composto 10 contendo N-metil-L-alanina; o composto de fórmula (lll-D) é o composto 10 contendo N-metil-D-alanina, e o composto de fórmula (lll-D,L) é o composto 10 contendo N-metilalanina racêmica.
O composto 10 contendo N-metil-L-alanina, N-metil-D-alanina, ou N-metilalanina racêmica é preparado por um processo que compreende:
(1) reagir silfeto de isobutileno (5) com o ânion de acetonitrila para dar composto 6;
(2) hidrolizar composto 6 para dar ácido 4-mercapto-4metilpentanóico (7);
(3) converter o composto 7 em dissulfeto 8 mediante a reação com metilmetanotiolsulfonato;
(4) converter o composto 8 em seu éster de Nhidroxissuccinimida 9; e (5) reagir o composto 9 com N-metil-L-alanina, N-metil-Dalanina, ou N-metilalanina racêmica para dar o composto 10 contendo Nmetil-L-alanina, N-metil-D-alanina, ou N-metilalanina racêmica.
De acordo com a presente invenção, os compostos de fórmula III são da mesma forma novos:
49/85
Figure BRPI0419348B1_D0033
em que:
Y2 representa (CR7R8)i(CR5R6)m(CR3R4)nCR1R2SZ2, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4j Rs, R6, R7 θ Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
Z2 é SR ou -COR, em que R é alquila linear, alquila ramificada ou alquila cíclica tendo de 1 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico.
Os compostos de fórmula III podem ser preparados facilmente por uma pessoa versada usual na técnica por métodos análogos a estes aqui apresentados para a produção de compostos 10 e 15.
Citotoxicidade In vitro de Maitansinóides
A citotoxicidade in vitro de maitansinóides da presente invenção é mostrada na Figura 4. Os novos maitansinóides (4c, 4e) que carregam uma ligação de dissulfeto impedido são altamente potentes com respeito às linhagens celulares testadas. Assim, 4c mata as células A-375 e as células SK-Br-3 com valores de IC50 de 1,5 x 10'11 M e 7,0 x 10'12 M respectivamente. Similarmente, o maitansinóide 4e é também altamente potente com vaio50/85 res de IC50 de 3,2 x 1011 M e 9,0 x 10'12 M com respeito às células A-375 e SK-Br-3 respectivamente. A comparação da potência in vitro do maitansinóide contendo tiol impedido 4a da presente invenção com aquele de maitansinóide anteriormente descrito 1 (Figura 4c,d), indica que os novos maitansinóides são de 20 a 50 vezes mais potentes do que aqueles descritos anteriormente.
Preparação de Agentes de Ligação Celular
A eficácia dos compostos da invenção como agentes terapêuticos depende da seleção cuidadosa de um agente apropriado de ligação celular. Os agentes de ligação celular podem ser de qualquer espécie atualmente conhecida, ou que se torna conhecida e incluem peptídeos e não peptídeos. Geralmente, estes podem ser anticorpos (especialmente anticorpos monoclonais), linfocinas, hormônios, fatores do crescimento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tais como transferrinas), ou qualquer outra molécula ou substância de ligação celular.
Exemplos mais específicos de agentes de ligação celular que podem ser usados incluem:
anticorpos policlonais; anticorpos monoclonais;
fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fab', e F(ab')2, Fv (Parham, J. Immunol. 13T.2895-2902 (1983); Spring et al. J. Immunol. 113:470478 (1974); Nisonoff et al. Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (1960));
interferons (por exemplo, .alfa., .beta., .gamma.); linfocinas tais como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
hormônios tais como insulina, TRH (hormônio de liberação a tirotropina), MSH (hormônio de estimulação de melanócito), hormônios esteróides, tais como andrógenos e estrógenos;
fatores do crescimento e fatores de estimulação da colônia tais como EGF, TGF-alfa, FGF, VEGF, G-CSF, M-CSF e GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984));
transferrina (O'Keefe et al. J. Biol. Chem. 260:932-937 (1985)); e vitaminas, tais como folato.
51/85
As técnicas de anticorpo monoclonal levam em conta a produção de agentes de ligação celular extremamente específicos na forma de anticorpos monoclonais específicos. Particularmente bem conhecidos no ofício são as técnicas para criar anticorpos monoclonais produzidos pela imunização de camundongos, ratos, hamsters ou qualquer outra animal com o antígeno de interesse tal como a célula alvo intacta, antígenos isolados da célula alvo, vírus inteiro enfraquecido, e proteínas virais tais como proteínas revestidas virais. As células humanas sensibilizadas podem também ser usadas. Um outro método de se criar anticorpos monoclonais é o uso de livrarias fago de scFv (região variável de cadeia única), especificamente scFv humano (ver por exemplo, Griffíts et al., Patentes U.S. números 5.885.793 e 5.969.108; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al., WO 99/06587). Além disso, os anticorpos reemergidos apresentados na Patente U.S. número 5.639.641 podem também ser usados, como anticorpos humanizados may.
A seleção do agente de ligação celular apropriado é uma matéria de escolha que depende da população de células particular que deve ser direcionada, mas em geral os anticorpos monoclonais humanos são preferíveis se um apropriado estiver disponível.
Por exemplo, o anticorpo monoclonal MY9 é um anticorpo IgG-j de murino que se liga especificamente ao Antígeno CD33 {J.D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} e pode ser usado se as células alvos expressam CD33 como na doença de leucemia mielogenosa aguda (AML). Similarmente, o anticorpo monoclonal anti-B4 é um IgGi de murino, que se liga ao antígeno CD19 nas células B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} e pode ser usado se as células alvo forem células B ou células doentes que expressam este antígeno tal como na linfoma não Hodgkin ou leucemia linfoblástica crônica. Similarmente, o anticorpo monoclonal, C242, que se liga ao antígeno CanAg (Patente U.S. número 5.552.293) pode ser usado para tratar tumores que expressam CanAg, tais como cânceres colorretais, pancreáticos e gástricos.
Adicionalmente, GM-CSF, que se liga às células mielóides, pode
52/85 ser usado como um agente de ligação celular nas células doentes da leucemia mielogenosa aguda. IL-2 que se liga às células T ativadas pode ser usada para a prevenção de rejeição de enxerto no transplante, para terapia e prevenção da doença enxerto versus hospedeiro, e para o tratamento de leucemia da célula T aguda. MSH, que se liga aos melanócitos, pode ser usado para o tratamento de melanoma. Ácido fólico pode ser usado para direcionar o receptor de folato expressão nòs tumores ovarianos e outros. O fator de crescimento epidérmico pode ser usado para direcionar cânceres escamosos tais como pulmão e cabeça e pescoço. A somatostatina pode ser usada para direcionar as neuroblastomas e outros tipos de tumor.
Os cânceres da mama e testes podem ser prosperamente direcionados com estrogênio (ou análogos de estrogênio) ou androgênio (ou análogos de androgênio) respectivamente como agentes de ligação celular. Produção de Conjugados Citotóxicos
A presente invenção também fornece um conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular compreendendo pelo menos um maitansinóide ligado ao agente de ligação celular, em que o agente de ligação celular é ligado ao maitansinóide usando a funcionalidade de tiol ou dissulfeto que está presente no grupo de acila de uma cadeia lateral de aminoácido acilada observado em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi ou C-20 desmetila do maitansinóide, e em que o grupo de acila da cadeia lateral de aminoácido acilada possui sua funcionalidade de tiol ou dissulfeto localizada em um átomo de carbono que possui um ou dois substituintes, ditos substituintes sendo CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso um dos substituintes pode ser H, e em que o grupo de acila possui um comprimento de cadeia linear de pelo menos três átomos de carbono entre a funcionalidade de carbonila e o átomo de enxofre.
Um conjugado de agente de ligação celular preferido compreende pelo menos um maitansinóide ligado a um agente de ligação celular, em que o maitansinóide é representado pela fórmula 4/:
53/85 em que:
Figure BRPI0419348B1_D0034
Yi' representa (CR7R8)l(CR9=CR1o)p(C^C)qAo(CR5R6)mDu(CR11=CRi2)r (CZC)sBt(CR3R4)nCRiR2S-, em que:
A, B e D, cada um independentemente é cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou substituída, ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico;
R3, R4, Rs, R6, R7, Rs, R9, R11, θ R12 são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico; e
I, m, n, o, p, q, r, s, t e u são cada um independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 5, contanto que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r, s e t não sejam zero em qualquer momento.
Preferivelmente, R1 é H e R2 é metila, ou Rt e R2 são metila.
Um conjugado de agente de ligação celular ainda mais preferível compreende pelo menos um maitansinóide ligado ao agente de ligação celular, em que o maitansinóide é representado pela fórmula (ll-L), (ll-D), ou (IID,L):
Figure BRPI0419348B1_D0035
L
Figure BRPI0419348B1_D0036
Figure BRPI0419348B1_D0037
D,L
D (H)
54/85 em que:
Y-ι representa (CR7Rs)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2S-, em que:
Ri e R2 são cada um independentemente CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída, radical aromático heterocíclico ou heterocíclico, e além disso R2 pode ser H;
R3, R4, R5, R6, R7 e Rs são cada um independentemente H, CH3, C2H5 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica tendo de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou de heterocicloalquila;
I, m e n são cada um independentemente um número inteiro de 1 a 5, e além disso n pode ser 0; e
May representa um maitansinol que carrega a cadeia lateral em C-3, C-14 hidroximetila, C-15 hidróxi ou C-20 desmetila.
Ainda mais preferível é um conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular, em que o maitansinóide é representado pela fórmula 4i, em que os substituintes são como definidos para a fórmula (II) acima.
Especialmente preferível são qualquer um dos compostos acima descritos, em que Rt é metila, R2 é H, R5, R6, R7 e Rs são cada um Η, I e m são cada um 1, e n é 0; e aqueles em que R1 e R2 são metila, R5, R6, R7, Rs são cada um Η, I e m são 1, e n é 0.
Além disso, o estereoisômero de L-aminoacila é preferível.
Os conjugados citotóxicos representacionais da invenção são anticorpo/maitansinóide, fragmento de anticorpos/maitansinóide, fator do crescimento epidérmico (EGF)/maitansinóide, hormônio de estimulação melanócito (MSH)/maitansinóide, hormônio de estimulação da tiróide (TSH)/maitansinóide, somatostatina/maitansinóide, folato/maitansinóide, estrogênio/maitansinóide, análogo de estrogênio/maitansinóide, androgênio/maitansinóide, e análogo de androgênio/maitansinóide.
O maitansinóide contendo tiol é reagido com um agente de ligação celular apropriadamente modificado para produzir conjugados citotóxi55/85 cos. Estes conjugados podem ser purificados por filtração de gel, cromatografia de troca de íon, ou por HPLC.
Os esquemas para a preparação de conjugados de maitansinóides contendo grupo de sulfidrila são apresentados na Figura 5. Mais especificamente (Figura 5a, b), uma solução de um anticorpo em tamponante aquoso pode ser incubada com um excesso molar de um agente de modificação de anticorpo tal como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP, 3a) para introduzir grupos de ditiopiridila (Fig 5a), ou com N-succinimidil-4(2-piridilditio)butanoato (SPDB, 3b) para introduzir grupos de ditiopiridila (Fig 5b). O anticorpo modificado é depois reagido com os maitansinóides contendo tiol (tal como 4a ou 4b) para produzir um conjugado de anticorpomaitansinóide ligado a dissulfeto. O conjugado de maitansinóide-anticorpo pode depois ser purificado por filtração de gel.
Alternativamente, o anticorpo pode ser incubado com um excesso molar de um agente de modificação de anticorpo tal como 2-iminotiolano para introduzir grupos de sulfidrila. O anticorpo modificado é depois reagido com os maitansinóides contendo dissulfeto apropriado para produzir um conjugado de anticorpo-maitansinóide ligado a dissulfeto. O conjugado de maitansinóide-anticorpo pode depois ser purificado por filtração de gel.
O número de moléculas de maitansinóide (indicado com w nas Figuras de 5a a 5d) ligado por molécula de anticorpo pode ser determinado mediante a medição espectrofotometricamente da relação da absorção em 252 nm e 280 nm. Uma média de 1-10 moléculas de maitansinóide/molécula de anticorpo pode ser ligada por este método. O número médio preferido de moléculas de maitansinóide ligadas por molécula de anticorpo é 2-5, e o mais preferível é 3-4,5.
Alternativamente, uma solução de um anticorpo em tamponante aquoso pode ser incubada com um excesso molar de um agente de modificação de anticorpo tal como N-succinimidil-4-(N-maleimidometila)cicloexano-1-carboxilato (SMCC, 26) para introduzir grupos de maleimido (Figura 5c), ou com N-succinimidil-4-(iodoacetila)-aminobenzoato (SIAB, 27) para introduzir grupos de iodoacetila (Figura 5d). O anticorpo modificado é
56/85 depois reagido com os maitansinóides contendo tiol (tal como 4a ou 4b) para produzir um conjugado de anticorpo/maitansinóide ligado a tioéter. O conjugado de maitansinóide-anticorpo pode depois ser purificado por filtração de gel.
O número de moléculas de maitansinóide ligadas por molécula de anticorpo pode ser determinado por análise espectrofotométrica como descrito acima.
Assim, a presente invenção fornece um método de produção de um conjugado de agente de ligação celular-maitansinóide que compreende a produção de um maitansinóide purificado por um dos métodos descritos acima, e a reação do maitansinóide purificado com um agente de ligação celular compreendendo um ditio reativo ou um grupo de sulfidrila. Preferivelmente, o grupo de ditio reativo é um grupo de ditiopiridila ou um grupo de ditiopiridila substituído. Especialmente preferível, o grupo de ditio reativo compreende um grupo de nitropiridilditio ou dinitropiridilditio.
Em um outro método, o maitansinóide purificado é reagido com um agente de ligação celular compreendendo um grupo de maleimido ou um grupo de haloacetila.
Os conjugados de agentes de ligação celular com medicamentos de maitansinóide da invenção podem ser avaliados com relação a sua capacidade de suprimir a proliferação de várias linhagens celulares indesejáveis in vitro (Figura 6). Por exemplo, as linhagens celulares tais como a linhagem de carcinoma do cólon humano COLO 205, a linhagem celular de melanoma humano A-375, a linhagem celular de leucemia mielóide humano HL60 podem ser usadas para a avaliação de citotoxicidade destes conjugados. As células a serem avaliadas podem ser expostas aos compostos por 24 horas e as frações de sobrevivência das células medidas em ensaios diretos por métodos conhecidos. Os valores IC50 podem então ser calculados a partir dos resultados dos ensaios.
A potência in vitro e especificidade alvo dos conjugados de anticorpo-maitansinóide da presente invenção são mostradas na Figura 6. 10 e
12. Desta maneira, a Figura 6 mostra que tanto huC242-DM3 quanto
57/85 huC242-DM4 são altamente potentes na aniquilação de células COLO 205 positivas ao antígeno, com valores de IC50 de 1,3 x 10'11 M e 1,1 x 10'11 M respectivamente. Ao contrário, as células A-375 negativas ao antígeno são de cerca de 500 vezes menos sensíveis o que demonstra que os conhgados de maitansinóide da presente invenção são altamente potentes e específicos. Similarmente, as Figs 10 e 12 demonstram a potência elevada e a especificidade alvo dos conjugados dos maitansinóides da presente invenção, com os anticorpos MY9-6 e anti-B4 respectivamente.
A eficácia antitumoral in vivo dos conjugados de anticorpos com os maitansinóides contendo tiol impedidos da presente invenção foi comparada com aquela dos conjugados de maitansinóide anteriormente descritos em vários modelos de tumor humano diferentes em camundongos. No primeiro modelo (Figura 7), camundongos SCID que carregam xenoenxertos HT-29 de tumor do cólon humano subcutâneo estabelecidos foram tratados com o conjugado de anticorpo (huC242-DM1) do maitansinóide anteriormente descrito DM1, ou com os dois novos conjugados de maitansinóide (huC242-DM3, huC242-DM4). O tratamento com huC242-DM1 resultou em um adiamento do crescimento do tumor de 18 dias. Ao contrário, os novos agentes foram significativamente mais eficazes, com adiamentos do crescimento de tumor de 28 dias para huC242-DM3 e 36 dias para huC242-DM4.
No segundo modelo (Figura 8), os camundongos que carregam xenoenxertos COLO 205 de tumor do cólon humano subcutâneo estabelecidos foram tratados ou com o conjugado de anticorpo (huC242-DM1) do maitansinóide anteriormente descrito DM1, ou com os dois novos conjugados de maitansinóide (huC242-DM3, huC242-DM4). O tratamento com huC242DM1 resultou em uma regressão do tumor e deu um adiamento de crescimento do tumor de 20 dias. Ao contrário, os novos agentes foram significativamente mais eficazes. A regressão do tumor completa estável 45 dias foi obtida no grupo tratado com huC242-DM3. huC242-DM4 foi ainda mais eficaz resultando em curas de todos os camundongos tratados.
No terceiro modelo (Figura 9) camundongos que carregam xenoenxertos HL-60 de mielóide humano subcutâneo estabelecidos foram tra58/85 tados ou com o conjugado de anticorpo (MY-9-6-DM1) do maitansinóide anteriormente descrito DM1, ou com os dois novos conjugados de maitansinóide (MY9-6-DM3, MY9-6-DM4). O tratamento com MY9-6-DM1 resultou em uma regressão do tumor e deu um adiamento do crescimento do tumor de 5 dias. Ao contrário, os novos agentes foram significativamente mais eficazes, resultando na regressão do tumor. Tanto MY9-6-DM3 quanto MY9-6-DM4 deram adiamentos do crescimento do tumor de mais do que 20 dias.
No quarto modelo (Figura 11), um maitansinóide da presente invenção (huMY9-6-DM4) foi diretamente comparado com aquele de um conjugado do maitansinóide anteriormente descrito (huMY9-6-DM1) em um modelo de xenoenxerto subcutâneo, estabelecido com células HL-60. Em uma dose equivalente, o tratamento com o conjugado da invenção corrente, MY9-6-DM4, resulta na regressão completa do tumor estável em 85 dias. Ao contrário, o conjugado de maitansinóide anteriormente descrito é muito menos ativo com um adiamento do crescimento de tumor de apenas cerca de 48 dias.
No quinto modelo (Figura 13a), um conjugado de um maitansinóide da presente invenção com o anticorpo huB4 mostra atividade antitumoral elevada em uma maneira dependente da dose em um modelo de tumor Ramos subcutâneo. As regressões e curas de tumor completas são obtidas em doses que são não tóxicas (Figura 13a,b).
Os resultados das cinco experiências de eficácia acima demonstram que os maitansinóides contendo tiol estericamente impedidos da presente invenção concedem conjugados de agente de ligação celular com atividade antitumor vastamente melhorada comparado com os conjugados de maitansinóide-agente de ligação celular anteriormente descritos.
Composições e métodos de uso
A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade eficaz de qualquer um dos agentes de ligação celular com maitansinóide da presente invenção, um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável destes, e um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
59/85
A presente invenção também fornece métodos de tratamento compreendendo a administração a um indivíduo com necessidade de tratamento de uma quantidade eficaz de qualquer um dos conjugados acima descritos.
Similarmente, a presente invenção fornece um método para induzir a morte celular em populações de célula compreendendo o contato das células alvo ou tecido contendo células alvos com uma quantidade eficaz de um agente citotóxico que compreende qualquer um dos agentes de ligação celular com maitansinóide da presente invenção, um sal ou solvato destes. As células alvo são células a quais o agente de ligação celular pode se ligar.
Se desejável, outros agentes ativos, tais como outros agentes antitumor, podem ser administrados juntamente com o conjugado.
Os veículos, diluentes e excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados são bem conhecidos e podem ser determinados por aqueles versados na técnica quando a situação clínica justifique.
Exemplos de veículos, diluentes e/ou excipientes incluem: (1) solução salina tamponada de fosfato da Dulbecco, pH de cerca de 7,4, contendo ou não contendo cerca de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina de soro humano, (2) 0,9 % salina (0,9 % p/v de NaCI), e (3) 5 % (p/v) dextrose; e podem também conter um antioxidante tal como triptamina e um agente estabilizante tal como Tween 20.
O método para induzir a morte celular em populações de célula selecionadas pode ser praticado in vitro, in vivo ou ex vivo.
Exemplos de usos in vitro incluem tratamentos de medula óssea análoga antes do seu transplante no mesmo paciente de modo a aniquilar células doentes ou malignas: tratamentos de medula óssea antes de seu transplante de modo a aniquilar as células T competentes e impedir a doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD); tratamentos de culturas celulares de modo a aniquilar todas as células exceto com relação as variantes desejadas que não expressam o antígeno alvo; ou aniquilar as variantes que expressam o antígeno indesejado.
As condições de uso in vitro não clínico são facilmente determi60/85 nadas por uma pessoa versada na técnica.
Exemplos de uso ex vivo clínico são para remover as células tumorais ou células linfóides da medula óssea antes do transplante autólogo no tratamento de câncer ou no tratamento de doença autoimune, ou para remover as células T e outras células linfóides da medula óssea autóloga ou alogênica ou tecido antes do transplante de modo a impedir a GVHD. O tratamento pode ser realizado como se segue. A medula óssea é colhida do paciente ou outro indivíduo e depois incubada em meio contendo soro a qual é adicionado o agente citotóxico da invenção, as concentrações variam de cerca de 10 μΜ a 1 pM, por cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas ao redor de 37 °C. As condições exatas de concentração e tempo de incubação, isto é, a dose, são facilmente determinadas por uma pessoa de habilidade usual na técnica. Após a incubação as células da medula óssea são lavadas com soro contendo meio e restituídas ao paciente intravenosamente de acordo com os métodos conhecidos. Em circunstâncias onde o paciente recebe outro tratamento tal como um curso de quimioterapia ablativa ou irradiação total do corpo entre o tempo de colheita da medula e reinfusão das células tratadas, as células da medula tratadas são armazenadas congeladas em nitrogênio líquido usando equipamento médico padrão.
Para uso in vivo clínico, o agente citotóxico da invenção será fornecido como uma solução ou um pó liofilizado que são testados com relação a esterilidade e com relação aos níveis de endotoxina. Exemplos de protocolos adequados de administração de conjugado são como se segue. Os conjugados são concedidos semanalmente durante 4 semanas como um bolo intravenoso a cada semana. As doses do bolo são dadas em 50 a 1000 ml de salina normal a qual de 5 a 10 ml de albumina de soro humano podem ser adicionados. As dosagens serão de 10 μg a 2000 mg per administração, intravenosamente (variam de 100 ng a 20 mg/kg per dia). Após quatro semanas de tratamento, o paciente pode continuar a receber tratamento em uma base semanal. Os protocolos clínicos específicos com respeito à via de administração, excipiente, diluetes, dosagens, tempos, etc. podem ser determinados por uma pessoa de habilidade usual na técnica quando a situa61/85 ção clínica justifique.
Exemplos de condições médicas que podem ser tratadas de acordo com os métodos in vivo ou ex vivo de indução da morte celular em populações de célula selecionadas incluem malignidade de qualquer tipo incluindo, por exemplo, câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário e órgãos linfáticos; doenças auto-imunes, tais como lúpus sistêmico, artrite reumatóide e esclerose múltipla; rejeições a enxerto, tais como rejeição a transplante renal, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pulmão, rejeição de transplante cardíaco, e rejeição de transplante de medula óssea; doença de enxerto versus hospedeiro; infecções virais, tais como infecção CMV, infecção por HIV, AIDS, etc.; e infecções de parasitas, tais como giardíase, amoebíase, esquistossomíase, e outras como determinado por uma pessoa versada na técnica.
EXEMPLOS
A invenção será agora ilustrada com referência aos exemplos não limitativos. A não ser que de outra maneira mencionada, todas as porcentagens, relações, partes, etc. são em peso. Os exemplos descritos abaixo são para os compostos onde Ri é H ou CH3, R2 é H, CH3, R5, R6, R7, R8 são cada um Η, I e m são cada um 1, e n é 0. Síntese similar pode ser realizada para outros compostos da invenção onde R-ι e R2 são cada um independentemente H, CH3, C2H5, ou alquila superior, alquenila, tendo de 1 a 10 átomos de carbono, ou fenila, fenila substituída ou radical aromático heterocíclico ou heterocíclico; e onde I, m e n são cada um número inteiros de 1 a 5, e além disso, n pode também ser 0.
Todos os reagentes foram adquiridos da Aldrich Chemical Co., New Jersey, ou outras fontes comerciais. Maitansinol (11) foi preparado como descrito anteriormente (Patente U.S. número 6.333.410). Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (1H RMN) foram obtidos em um instrumento Bruker 400 MHz e os espectros de massa foram obtidos em um intrumento Bruker Daltonics Esquire 3000 usando ionização por eletropulverização.
EXEMPLO 1
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Síntese de Maitansinóide 4b
Ácido 4-Mercapto-4-metilpentanóico (7): Um frasco de 500 ml foi equipado com um barra agitadora e um funil de adição de 150 ml. O sistema foi colocado sob uma atmosfera de argônio. 150 ml de tetraidrofurano anídrico (THF) e 75 ml de 2,5 M n-BuLi em hexanos (18,7 mmoles) foram adicionados através de uma cânula e a solução foi esfriada em um banho de gelo seco/acetona a -78 °C. Acetonitrila (7,3 g, 9,4 ml, 18 mmoles) foi adicionada por gotejamento através de uma seringa durante aproximadamente 5 min. A reação foi agitada por 30 min, enquanto precipitado de lítio-acetonitrila branco era formado. Sulfeto de isobutileno (15 g, 17 mmoles) foi dissolvido em 100 ml de THF anídrico e adicionado por gotejamento durante aproximadamente 30 min através do funii de adição. O banho de esfriamento foi removido e a reação foi deixada se agitar por 3 horas. O frasco foi esfriado em um banho de gelo/água quando 38 ml de 0,5 M HCI foram adicionados por gotejamento. A camada de THF foi retida e a camada aquosa foi lavada duas vezes com 75 ml de acetato de etila. As camadas de THF e acetato de etila foram combinadas, secadas com aproximadamente 20 g de sulfato de sódio anídrico e transferidas para um frasco de 250 ml. O solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo para dar 6 bruto. Etanol (30 ml) e um barra agitadora foram adicionados. Os conteúdos foram agitados como uma solução de 8,0 g NaOH em 30 ml de água desionizada lentamente adicionada. O frasco foi equipado com um condensador de refluxo e colocado sob uma atmosfera de argônio. A reação foi submetida a refluxo durante a noite depois esfriada para a temperatura ambiente. Água desionizada (60 ml) foi adicionada e a mistura foi extraída duas vezes com porções de 25 ml de uma 2:1 mistura de acetato de etila e hexano. A camada aquosa foi acidificada para pH 2 com HCI concentrado depois extraída três vezes com porções de 75 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram secadas por Na2SO4 anídrico e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo para dar 10 g de produto 7 (39 % de rendimento). O material foi usado sem mais purificação. 1H RMN (CDCI3): δ 1,38 (6H, s), 1,87 - 1,93 (2H, m), 2,08 (1H, s), 2,51 -2,57 (2H, m).
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Ácido 4-Metil-4-(metiIditio)pentanóico (8): Uma solução de ácido mercaptopentanóico 7 (6,0 ml, 40 mmoles) foi dissolvido em 50 ml de água desionizada em um frasco de 250 ml. A solução foi magneticamente agitada quando carbonato de sódio (6,4 g, 60 mmoles) foi adicionado ao ácido em um taxa que não deva causar espumação excessiva. O frasco foi equipado com um funil de adição de 100 ml, que foi carregado com uma solução de metanotiolsulfonato de metila (7,5 g, 60 mmoles) dissolvida em 30 ml de etanol destilado em vidro a 100 %l. O frasco foi esfriado em um banho de gelo/água e o sistema foi mantido sob uma atmosfera de argônio. A solução de metanotiolsulfonato de metila foi adicionada por gotejamento ao frasco tão rapidamente quanto possível mas sem causar espumação excessiva. O banho de esfriamento foi removido e a mistura de reação foi deixada se agitar por um adicional de 3 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, até que aproximadamente 20 ml sobrou. Após o que 10 ml de bicarbonato de sódio saturado e 30 ml de água desionizada foram adicionados. A mistura foi lavada três vezes com porções de 25 ml de acetato de etila em um funil separador. A camada aquosa foi ajustada para aproximadamente pH 2 com 5 M HCI e foi extraída duas vezes com porções de 120 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com 20 ml de uma solução composta de NaCl saturado e 1M HCI em uma relação de 4:1. A camada orgânica foi depois secada com 14 g de sulfato de sódio anídrico e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo para dar 5,4 g de produto 8 (70 % de rendimento). O material pode ser levado para a próxima etapa sem mais purificação. 1H RMN (CDCI3): δ 1,54 (6H, s), 2,15 - 2,21 (2H, m), 2,64 (3H, s), 2,69 - 2,72 (2H, m). MS (M + Na+) calc.: 217,0, observado: 217,1
N-Hidroxissuccinimidil 4-metil-4-(metilditio)pentanoato (9):
Ácido metilditiopentanóico 8 (3,0 g, 15 mmoles) foi dissolvido em 20 ml de cloreto de metileno e agitado magneticamente quando Nhidroxissuccinimida (2,65 g, 23 mmoles) foi adicionada seguido por cloridreto de 1-[3-(dimetilamino)propila]-3-etilcarbodiimida (EDC, 4,4 g, 23 mmol). A mistura foi agitada sob uma atmosfera de argônio por 2 horas. A mistura de
64/85 reação foi despejada em um funil separador de 125 ml, 40 ml de acetato de etila foram adicionados e a solução foi lavada duas vezes com porções de 20 ml de 50 mM tampão de fosfato de potássio, pH 6,0, e uma vez com 12 ml de cloreto de sódio saturado. A camada orgânica foi secada com 14 g de Na2SO4 anídrico e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo para dar 4,0 g de produto 9 (90 % de rendimento), que foi usado sem mais purificação. 1H RMN (CDCI3): δ 1,30 (6H, s), 2,00 - 2,05 (2H, m), 2,39 (3H, s), 2,68 - 2,72 (2H, m), 2,73 - 2,83 (4H, m). MS (M + Na+) calc.: 314,0, observado: 314,1
N-metil-N-(4-metil-4-metilditio-1 -oxopentila)-L-alanina (10): NMetil-L-alanina (2,85 g, 18,0 mmoles) foi dissolvida em 50 ml de uma 1:1 solução de dimetoxietano e água desionizada em um frasco de 125 ml equipado com uma barra agitadora magnética. Trietilamina (6,9 g, 36 mmoles) foi adicionada e a solução foi vigorosamente agitada quando 9 (5,44 g, 18 mmoles) dissolvido em 40 ml da mesma mistura de solvente foi adicionado por gotejamento durante aproximadamente 5 min. Após 2 horas a mistura de reação foi concentrada em aproximadamente 40 ml por evaporação rotativa sob vácuo, depois 10 ml de água desionizada e 1 M HCI foram adicionados para dar um pH de aproximadamente 2. A mistura foi despejada em um funil separador e extraída duas vezes com porções de 50 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e depois lavadas com 7 ml de solução saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi secada com 8,0 g de Na2SO4 anídrico e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo. O resíduo foi absorvido em um volume mínimo de acetato de etila e purificado por cromatografia em sílica (sílica: grau cintilante de 40 mícrons, leito de sílica: 24 x 3,0 cm, fase móvel: hexanos: acetato de etila: ácido acético 50:48:2). Frações contendo o produto desejado foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo. Ácido acético residual foi removido mediante a dissolução do resíduo em um volume mínimo de acetato de etila e precipitação do produto pela adição rápida mas por gotejamento de hexano com agitação. Hexano foi adicionado até que produto não fosse mais detectado no sobrenadante por análise de TLC. O precipitado foi secado em vácuo por
65/85 horas para dar 2,2 g de produto 10 (51 % de rendimento). 1H RMN (CDCl3): δ 1,32 (6H, s), 1,42 (3H, d, J = 7 Hz), 1,90 - 97 (2H, m), 2,40 (3H, s),
2.42 - 2,49 (2H, m), 2,9 (3H, s), 5,15 (1H, q, J = 7 Hz). MS (M + Na+) calc.:
302,1, observado: 302,0.
N2-deacetil-N2-(4-metil-4-metilditio-1-oxopentila)maitansina (LDM4-SMe, 4e). Uma solução de maitansinol (11, 25 mg, 0,44 mmol) e Nmetil-N-(4-metil-4-metilditio-1-oxopentila)-L-alanina (10, 42,0 mg, 0,177 mmol) em 3 ml diclorometano foi magneticamente agitada sob uma atmosfera de argônio quando uma solução de dicicloexilcarbodiimida (DCC, 57,1 mg, 0,277 mmol) em 0,67 ml de diclorometano foi adicionada. Após 1 min uma solução de 1 M ZnCI2 em éter dietílico (0,03 ml, 0,03 mmol) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas depois 5 ml de acetato de etila foram adicionados e a mistura foi filtrada em vácuo através de papel de filtro em curso. O filtrado foi lavado com 2 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio seguido por 1 ml de solução saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi secada por 2 g de sulfato de sódio anídrico. O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica usando uma mistura de diclorometano e metanol para remover maitansinol não reagido. Frações contendo o produto desejado foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo para dar uma mistura de diastereômeros 4e e 4f. O resíduo foi absorvido em um volume mínimo de acetato de etila e purificado em uma coluna de 10 mícron Diazem® CN de 50 cm por 250 cm usando como fase móvel uma mistura de hexano, 2propanol e acetato de etila em uma relação de 68:8:24. A taxa de fluxo foi 118 ml/min. Sob estas condições o produto desejado 4e eluiu com um tempo de retenção de 11 min e o diastereômero indesejado 4f tinha um tempo de retenção de 19 min. Frações contendo o produto desejado foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo para dar 12,0 mg de produto 4e (36 % de rendimento). 1H RMN (CDCI3): δ 0,80 (3H, s), 1,28 - 1,36 (13H, m),
1.42 - 1,46 (2H, m), 1,53 - 1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,75 - 1,85 (1H, m), 1,90 - 2,10 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J = 3 Hz e 14 Hz), 2,31 (3H, s), 2,40 - 2,49 (1H, m), 2,50-2,65 (1H, m), 2,85 (3H, s), 3,04 (1H, d, J = 9 Hz), 3,11 (1H, d,
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J = 11 Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J = 9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J = 10 Hz), 4,79 (1H, dd, J = 3 Hz e 12 Hz), 5,41 (1H, q, J = 7 Hz), 5,66 (1H, dd J = 9 Hz e 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = 11 Hz e 15 Hz), 6,65 ( 1H, d, J = 1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J = 11 Hz), 6,81 (1H, d, J = 1,5 Hz). Alta resolução MS (M + H+) calc.: 826,3174, observado: 826,3150.
N2 -deacetil-N2 -(4-mercapto-4-metil-1 -oxopentila)maitansina (LDM4, 4b). O dissulfeto 4e do acima (12 mg, 0,015 mmol) foi dissolvido em 1,0 ml de 1:1 acetato de etila : metanol. Uma solução de ditiotreitol (18 mg, 0,117 mmol) em 0,50 ml de 50 mM tampão de fosfato, pH 7,5, foi depois adicionado. A solução foi magneticamente agitada sob uma atmosfera de argônio por 3 horas, depois 1 ml de 200 mM tampão de fosfato, pH 6,0, foi adicionado e a mistura foi extraída três vezes com porções de 2 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com 1 ml de solução saturada de cloreto de sódio, depois secadas com 1 g de sulfato de sódio anídrico. O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi absorvido em um mínimo de acetato de etila e purificado em um coluna de 10 mícrons Diazem® CN de 50 cm x 250 cm usando como fase móvel uma mistura de hexano, 2-propanol e acetato de etila em uma relação de 70:8:22. A taxa de fluxo foi 22 ml/min. O produto desejado 4b eluiu com um tempo de retenção de 10 min. Frações contendo 4b puro foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo para dar 11 mg de 4b (97 % de rendimento). 1H RMN (CDCIs): δ 0,80 (3H, s), 1,19 - 1,23 (1H, m), 1,28 - 1,36 (12H, m), 1,42 - 1,46 (2H, m), 1,53 - 1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,75 - 1,85 (1H, m), 1,90 - 2,10 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J = 3 Hz e 14 Hz), 2,40 - 2,49 (1H, m), 2,50 - 2,65 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J = 9 Hz), 3,11 (1H, d, J = 11 Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J = 9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J = 10 Hz), 4,79 (1H, dd, J = 3 Hz e 12 Hz), 5,41 (1H, q, J = 7 Hz), 5,66 (1H, dd J = 9 Hz e 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = 11 Hz e 15 Hz), 6,65 ( 1H, d, J = 1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J = 11 Hz), 6,81 (1H, d, J = 1,5 Hz). Alta resolução MS (M + Na+) calc.: 802,3101, observado: 802,3116. EXEMPLO 2
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Síntese de Maitansinóide 4a
Ácido 4-Metilditio-pentanóico (13): Uma solução de ácido 4mercaptopentanóico (12, 16,6 g, 124 mmoles) foi dissolvido em 350 ml de água desionizada em um frasco de 500 ml. A solução foi magneticamente agitada quando carbonato de sódio (19,7 g, 186 mmoles) foi adicionado ao ácido em um taxa que não deve causar espumação excessiva. O frasco foi equipado com um funil de adição de 250 ml, que foi carregado com uma solução de metanotiolsulfonato de metila (23,4 g, 186 mmoles) dissolvido em 220 ml de etanol destilado em vidro a 100 %. O frasco foi esfriado em um banho de gelo/água e o sistema foi mantido sob uma atmosfera de argônio. A solução de metanotiolsulfonato de metila foi adicionada por gotejamento ao frasco tão rapidamente quanto possível mas em uma tal velocidade como para impedir a espumação excessiva. O banho de esfriamento foi removido e a mistura de reação foi deixada se agitar por um adicional de 2 horas. O solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo, até que aproximadamente 250 ml sobrou. Após o que 30 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio e 50 ml de água desionizada foram adicionados. A mistura foi lavada três vezes com porções de 200 ml de acetato de etila em um funil separador. A camada aquosa foi ajustada para aproximadamente pH 2 com 5 M HCI e foi extraída duas vezes com porções de 400 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, depois lavadas com 60 ml de uma 4:1 mistura de solução saturada de NaCI e 1M HCI, depois secadas com 50 g de sulfato de sódio anídrico, e finalmente o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo para dar 10,2 g de produto 13 (45 % de rendimento). O material foi usado na próxima reação sem mais purificação. H1 RMN δ 1,36 (3H, d, J = 7 Hz), 1,84 - 1,95 (H, m), 1,85 - 2,56 (1H, m), 2,42 (3H, s), 2,53 (2H, t, J = 7 Hz), 2,85 - 2,95 (1H, m), MS (M + Na+) calc.: 203,3, observado: 203,2.
4-Metilditio-pentanoato de N-hidroxissuccinimidila (14): Ácido 4metilditio-pentanóico (13, 0,75 g, 4,16 mmoles) foi dissolvido em 7,0 ml de cloreto de metileno e agitado magneticamente enquanto Nhidroxissuccinimida (0,526 g, 4,57 mmoles) foi adicionada seguido por clori68/85 dreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (0,877 g, 4,57 mmoles). A mistura foi agitada sob uma atmosfera de argônio por 2,5 horas, depois despejada em um funil separador de 60 ml contendo 20 ml de acetato de etila. A solução resultante foi lavada duas vezes com porções de 15 ml de 50 mM tampão de fosfato de potássio, pH 6,0, e uma vez com 5 ml de cloreto de sódio saturado. A camada orgânica foi secadas com 8 g de Na2SO4 anídrico e o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo para dar 1,15 g de produto 14 (87 % de rendimento), que foi usado para a próxima reação sem mais purificação. H1 RMN δ 1,48 (3H, d, J = 7), 2,06 (1H, m), 2,17 (1H, m), 2,55 (3H, s), 2,93 (2H, t, J = 7), 2,98 (4H, s), 3,15 (1H, m). MS (M + Na+) calc.: 304,1, observado: 304,0.
N-metil-N-(4-metilditio-1-oxopentil)-L-alanina (15): N-Metil-Lalanina (0,64 g, 6,2 mmol) foi dissolvida em 8 ml de uma 1:1 mistura de dimetoxietano e água desionizada em um frasco de 125 ml equipado com uma barra agitadora magnética. Trietilamina (0,841 g, 8,3 mmoles) foi adicionada e o frasco foi vigorosamente agitado como uma solução de 14 (1,0 g, 3,6 mmoles) em 8 ml da mesma mistura de solvente que foi adicionado por gotejamento durante aproximadamente 5 min. Após 2 horas, a mistura de reação foi concentrada para aproximadamente 3 ml por evaporação rotativa sob vácuo, depois 15 ml de água desionizada e 1 M HCI foram adicionados para dar um pH de aproximadamente 2. A mistura foi despejada em um funil separador de 60 ml e extraída duas vezes com porções de 15 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas, lavadas com 3 ml de solução saturada de cloreto de sódio, depois secadas com 8,0 g de Na2SO4 anídrico, e finalmente, o solvente foi removido por evaporação rotativa sob vácuo. O resíduo foi absorvido em um volume mínimo de acetato de etila e purificado por cromatografia em sílica (sílica: grau cintilante de 40 mícrons, leito de sílica 24 x 3,0 cm, fase móvel hexanos: acetato de etila: ácido acético 50:48:2). Frações contendo o produto desejado 15 foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo. Ácido acético residual foi removido mediante a dissolução do resíduo em um volume mínimo de acetato de etila e a precipitação do produto pela adição rápida mas por gotejamento de hexano
69/85 com agitação. Hexano foi adicionado até que o produto não fosse mais detectado no sobrenadante por análise de TLC. O precipitado foi secado em vácuo para dar 0,60 g de produto 15 (62 % de rendimento). H1 RMN δ 1,35 (3H, d, J = 7), 1,41 (3H, d, J = 7), 1,94 - 2,03 (2H, m), 2,43 (3H, s), 2,50 2,55 (2H, m), 2,83 - 2,93 (1H, m), 2,98 (3H, s), 5,14 (1H, q, J = 7). MS (M + Na+) calc.: 288,1, observado: 288,1.
N2-deacetil-N2-(4-metilditio-1-oxopentila)maitansina (L-DM3SMe, 4c): Uma solução de Maitansinol (25 mg, 0,44 mmol) e 15 (42,0, 0,177 mmol) em 3 ml de diclorometano foi magneticamente agitada sob uma atmosfera de argônio quando uma solução de dicicloexilcarbodiimida (DCC,
57,1 mg, 0,277 mmol) em 0,67 ml de diclorometano foi adicionada. Após 1 min, uma solução de 1 M ZnCI2 em éter dietílico (0,03 ml, 0,03 mmol) foi adicionada. A mistura foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas, depois 5 ml de acetato de etila foram adicionados e a mistura foi filtrada em vácuo através do papel de filtro em curso. O filtrado foi lavado com 2 ml de solução saturada de bicarbonato de sódio seguido por 1 ml de solução saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi secada com 2 g de sulfato de sódio anídrico, depois o solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica usando uma mistura de diclorometano e metanol para remover maitansinol não reagido. Frações contendo o produto desejado foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo para dar uma mistura dos diastereômeros 4c e 4d. O resíduo foi absorvido em um volume mínimo de acetato de etila e purificado em uma coluna de 10 mícrons Diazem® CN de 50 cm por 250 cm usando como fase móvel uma 68:8:24 mistura de hexano, 2-propanol e acetato de etila. A taxa de fluxo foi de 118 ml/min. O produto desejado 4c eluiu com um tempo de retenção de 11 min, o diastereômero indesejado 4d tinha um tempo de retenção de 19 min. Frações contendo o produto desejado foram combinadas e extraídas do solvente sob vácuo para dar 12,0 mg de produto 4c (36 % de rendimento). 1H RMN (CDCI3): δ 0,80 (3H, s), 1,19 - 1,23 (1H, m), 1,28 - 1,36 (9H, m), 1,42 - 1,46 (1H, m), 1,53 - 1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,80 - 1,89 (1H, m), 1,90 - 2,09 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J = 3 Hz e 14 Hz), 2,32 (3H, s), 2,33 - 2,42 (1H, m), 2,49 - 2,62
70/85 (2Η, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J = 9 Hz), 3,11 (1H, d, J = 11 Hz), 3,23 (3H, s), 3,35 (3H, s), 3,49 (1H, d, J = 9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J = 10 Hz), 4,79 (1H, dd, J = 3 Hze 12 Hz), 5,41 (1H, q, J = 7 Hz), 5,66 (1H, dd J = 9 Hz e 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = 11 Hz e 15 Hz), 6,65 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J = 11 Hz), 6,81 (1H, d, J = 1,5 Hz). MS (M + Na+) calc.: 834,3, observado: 834,3.
N2-deacetil-N2-(4-mercapto-1-oxopentila)maitansine (L-DM3, 4a): L-DM3-SMe (4c, 12 mg, 0,015 mmol) foi dissolvido em 1,0 ml de uma 1:1 mistura de acetato de etila e metanol. Uma solução de ditiotreitol (18 mg, 0,117 mmol) em 0,50 ml de 50 mM tampão de fosfato, pH 7,5, foi depois adicionada. A solução de reação foi magneticamente agitada sob uma atmosfera de argônio por 3 horas, depois 1 ml de 200 mM tampão de fosfato pH 6,0 foi adicionado e a mistura foi extraída três vezes com porções de 2 ml de acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com 1 ml de solução saturada de cloreto de sódio, depois secadas com 1 g de sulfato de sódio anídrico. O solvente foi removido sob vácuo e o resíduo foi absorvido em um mínimo de acetato de etila e purificado em uma coluna de 10 mícrons Diazem® CN de 50 cm x 250 cm usando como fase móvel uma 70:8:22 mistura de hexano, 2-propanol e acetato de etila. A taxa de fluxo foi de 22 ml/min. O produto desejado eluiu com um tempo de retenção de 10 min. Frações contendo o produto puro foram combinadas e o solvente foi removido sob vácuo para dar 11 mg de produto 4a (97 % de rendimento). 1H RMN (CDCb): δ 0,80 (3H, s), 1,19 - 1,23 (1H, m), 1,28 - 1,36 (9H, m), 1,42 1,46 (1H, m), 1,53 - 1,63 (2H, m), 1,64 (3H, s), 1,80 - 1,89 (1H, m), 1,90 2,09 (1H, m), 2,18 (1H, dd, J = 3 Hz e 14 Hz), 2,33 - 2,42 (1H, m), 2,49 - 2,62 (2H, m), 2,88 (3H, s), 3,04 (1H, d, J = 9 Hz), 3,11 (1H, d, J = 11 Hz), 3,23 (3H,s), 3,35 (3H,s), 3,49 (1H, d, J = 9 Hz), 3,63 (1H, d, J = 12 Hz), 3,98 (3H, s), 4,27 (1H, t, J = 10 Hz), 4,79 (1H, dd, J = 3 Hz e 12 Hz), 5,41 (1H, q, J = 7 Hz), 5,66 (1H, dd J = 9 Hz e 15 Hz), 6,21 (1H, s), 6,42 (1H, dd, J = 11 Hz e 15 Hz), 6,65 ( 1H, d, J = 1,5 Hz), 6,73 (1H, d, J = 11 Hz), 6,81 (1H, d, J = 1,5 Hz). MS: (M + Na+) calc.: 788,3, observado: 788,3.
EXEMPLO 3
71/85
Síntese de Maitansinóide 4g,h (Figura 3c).
R-1,3-Di-0-p-toluenossulfonil-butano (17): Uma solução de R-(-)1,3-butanodiol (16, 2,00 g, 22,22 mmoles) em uma mistura de piridina seca (40 ml) e tolueno seco (60 ml), foi tratado com cloreto de p-toluenossulfonila (12,70 g, 66,84 mmoles) sob argônio em 0 °C. Após agitação em 0 °C por 5 min. seguido por agitação na temperatura ambiente por 2 h, a mistura foi evaporada sob vácuo, dissolvida novamente em acetato de etila, e lavada com 0,1 M NaHCO3 aquoso, seguido por NaCI saturado. A camada orgânica foi secada por MgSO4, filtrada, e o solvente foi evaporado. Purificação por cromatografia em sílica-gel, eluindo com 1:2 (v/v) acetato de etila/hexano concedeu 6,51 g (74 %) do produto do título 17. Rf = 0,40 (1:1 EtOAc/hexano); 1H RMN (CDCI3) 7,76 (dd, 4H, J = 1,0, 8,0 Hz), 7,35 (dt, 4H, J = 0,4, 8,0 + 8,0 Hz), 4,70 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 1,92 (m, 2H), 1,26 (d, 3H, J = 6,3 Hz); 13C RMN 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21, 36,08, 21,86, 21,06; MS: 420,99 (M + Na)+, 421,93 (M + 1 + Na)+.
S-4-O-Etilxântico-pentanonitrila (18): Uma solução de R-1,3-diO-p-toluenossulfonil-butano (17, 4,80 g, 12,06 mmoles) em DMSO seco (50 ml) foi tratado com NaCN (0,65). Após agitação em RT sob argônio por 18 h, a mistura de reação foi diluída com acetato de etila, lavada sucessivamente com 1,0 M de NaH2PO4 gelado pH 7,5, água e 1,0 M de NaH2PO4 pH 4,0. A camada orgânica foi separada e secada por MgSO4, filtrada, e depois evaporada para dar 2,63 g de R-3-O-p-toluenossulfonil-pentanonitrila bruta. MS 275,80 (M + Na)+, 276,75 (M +1 +Na)+. O produto foi usado diretamente sem mais purificação.
À solução de R-3-O-p-toluenossulfonil-pentanonitrila bruta (2,63 g) em etanol (15 ml) foi adicionado O-etilxantato de potássio (4,55 g) em etanol (50 ml). Após agitação durante a noite sob argônio, a mistura foi concentrada, diluída com acetato de etila, e filtrada através de uma coluna curta de sílica. O eluente foi concentrado e purificado por cromatografia em sílicagel, eluindo com 1:4 (v/v) EtOAc/hexano, para dar 1,54 g (63 %, 2 etapas) do produto do título 18. Rf = 0,40 (1:4 EtAc/hexano). 1H RMN (CDCI3) 4,67 (dd,
72/85
2Η, J = 7,1, 14,2 Hz), 3,86 (ddd, 1H, J = 7,0, 14,0, 21,9 Hz), 2,50 (t, 2H J = 7,3 + 7,6 Hz), 2,06 (m, 2H), 1,44 (m, 6H); 13C RMN 213,04, 119,16, 70,28,
44.57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93; MS: 226,51 (M + Na)+, 242,51 (M + K)+.
Ácido S-(+)-4-Metiiditio-pentanóico (19): A uma solução de S-4O-Etilxântico-pentanonitrila (18, 1,95 g, 9,61 mmoles) em uma mistura de etanol (10 ml) e água (150 ml) foi adicionado 5,0 g de NaOH. A mistura de reação foi submetida a refluxo durante a noite sob argônio. A mistura foi esfriada para a temperatura ambiente e diluída com água (150 ml) e extraída com 1:1 EtOAc/hexano (2 x 100 ml). A camada aquosa foi acidificada com H3PO4 para pH 2,5 ~ 3,0 e extraída com EtOAc (6 x 75 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas por MgSO4, filtradas e evaporadas para secura para dar o ácido S-4-mercaptopentanóico bruto. Este produto bruto foi usado diretamente para a próxima etapa sem mais purificação.
A uma solução de ácido S-4-mercaptopentanóico bruto (1,2 g) em uma mistura de etanol (50 ml) e 0,5 M NaH2PO3, pH 7,0 (75 ml), foi adicionado por gotejamento metanotiolsulfonato de metila (1,47 g, 11,65 mmoles) em 5 THF seco (5 ml) durante 45 min a 0 °C. Após agitação sob argônio a 0 °C por 30 min, seguido por agitação em temperatura ambiente por 2 h, a mistura foi concentrada e extraída com diclorometano (2 x 50 ml). A camada aquosa foi acidificada com H3PO4 para pH 2,5 ~ 3,0 e extraída com EtOAc (4 x 100 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas por MgSO4, filtradas e evaporadas. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílicagel, eluindo com (1:100:400 HOAc/EtOAc/hexano) para dar 1,43 g (83 %) do produto do título 19. Rf = 0,32 (1:100:400 HOAc/EtAc/hexano); 1H RMN (CDCIs) 2,91 (ddd, 1H, J = 6,8, 13,7, 20,5 Hz), 2,53 (t, 2H, J = 7,7 + 7,4 Hz), 2,42 (s, 3H), 1,94 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz); 13C RMN 179,18, 45,35,
31.58, 30,73, 24,70, 21,05; MS: 202,92 (M+Na)+, 203,91 (M+1+Na)+; [a] = 41,35 (c = 2, CH3OH).
N-metil-N-[4-(S)-metilditio-1-oxopentil[-S-alanina (15a): Ácido S(+)-4-(Metilditio)-pentanóico (19) foi convertido no éster de Nhidroxissuccinimidila 20, pelo método descrito acima para o composto 14. A reação com N-metil-L-alanina pelo procedimento descrito acima para o com73/85 posto 15 deu 15a, (62 % de rendimento). H1 RMN δ 1,36 (3H, d, J = 7), 1,42 (3H, d, J = 7), 1,93 - 1,98 (2H, m), 2,40 (3H, s), 2,50 - 2,53 (2H, m), 2,90 2,95 (1H, m), 2,99 (3H, s), 5,14 (1H, q, J = 7), MS: (M + Na) calc.: 288,1, observado: 288,1
N2-deacetil-N2-(4-(S)-metilditio-1-oxopentila)maitansina (DM3SMe, 4g,h): Maitansinol (11) foi acoplado com 15a, usando DCC e cloreto de zinco em diclorometano, como descrito acima para a síntese de 4c. Uma mistura de 2 diastereômeros que carregam a porção de N-metil-S-alanila (4g, S,S) e a porção de N-metil-R-alanila (4h,R,S) foi obtida. Os diastereômeros foram separados por HPLC em uma coluna de ciano Kromasil (4,6 mm x 250 mm), usando uma eluição isocrática em uma taxa de fluxo de 1 ml/min, com hexano: acetato de etila:2-propanol (68:24:8, v/v/v). Sob estas condições, o isômero 4g (S.S) eluiu em 24,5 min. Espectro de massa: m/z 834,2 (M + Na)+. O pico para o outro isômero 4h (R,S) foi bem separado e eluiu em 34,6 min. MS: m/z 834,2 (M + Na)+.
EXEMPLO 4
Síntese de Maitansinóide 4k,I (Figura 3d)
S-1,3-Di-O-p-toluenossulfonil-butano 22: Uma solução de S-(-)1,3-butanodiol (21, 2,00 g (22,22 mmoles) em uma mistura de piridina seca (40 ml) e tolueno seco (60 ml) foi tratada com cloreto de p-toluenossulfonila (12,70 g, 66,84 mmoles) sob argônio em 0 °C. Após agitação em 0 °C por 5 min. seguido por agitação em temperatura ambiente durante 2 h, a mistura foi evaporada sob vácuo. O resíduo foi dissolvido novamente em acetato de etila, lavada com 0,1 M NaHCO3 aquoso, e NaCI saturado. A camada orgânica foi separada, secada por MgSO4, filtrada e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel, eluindo com 1:2 acetato de etila/hexano para dar 6,25 g (71 %) do produto do título 22 Rf = 0,40 (1:1 EtOAc/hexano); 1H RMN (CDCI3) 7,76 (dd, 4H, J = 1,0, 8,0 Hz), 7,35 (dt, 4H, J = 0,4, 8,0 + 8,0 Hz), 4,70 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,94 (m, 1H), 2,46 (s, 6H), 1,92 (m, 2H), 1,26 (d, 3H, J = 6,3 Hz); 13C RMN 145,17, 133,00, 130,11, 128,12, 127,91, 76,28, 66,21,36,08, 21,86, 21,06; MS: 420,99 (M + Na)+.
R-4-O-Etilxântico-pentanonitrila (23): Uma solução de S-1,3-di74/85
O-p-toluenossulfonil-butano (22, 6,25 g (15,70 mmoles) em 60 DMSO seco (50 ml) foi tratada com NaCN (0,85 g). A mistura de reação foi agitada sob argônio durante 18 h em RT. A mistura de reação foi depois diluída com acetato de etila, lavada seqüencialmente com 1,0 M de NaH2PO4 gelado pH 7,5, água e 1,0 M de NaH2PO4 pH 4,0. A camada orgânica foi secada por MgSO4, filtrada, evaporada para dar 3,62 g de S-3-O-p-toluenossulfonilpentanonitrila bruta. O produto foi usado diretamente sem mais purificação.
A uma solução de S-3-O-p-toluenossulfonil-pentanonitrila bruta (3,62 g) em etanol (50 ml), foi adicionado O-etilxantato de potássio (5,72 g) em etanol (100 ml). Após agitação sob argônio durante a noite, a mistura foi concentrada, diluída com acetato de etila e filtrada através de uma coluna curta de sílica-gel. O eluente foi concentrado, e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel, eluindo com 1:4 EtOAc/hexano para dar 2,0 g (62 %, 2 etapas) do produto do título 23. Rf = 0,40 (1:4 EtAc/hexano). 1H RMN (CDCI3) 4,67 (dd, 2H, J = 7,1, 14,2 Hz), 3,86 (ddd, 1H, J = 7,0, 14,0, 21,9 Hz), 2,50 (t, 2H J = 7,3 + 7,6 Hz), 2,06 (m, 2H), 1,44 (m, 6H); 13C RMN 213,04, 119,16, 70,28, 44,57, 32,10, 20,20, 15,21, 13,93; MS: 226,51 (M + Na)+, 242,51 (M + K)+.
Ácido R-(-)-4-Metilditio-pentanóico (24): Uma solução de R-4-OEtilxântico-pentanonitrila (23, 2,0 g, 9,85 mmoles) em uma mistura de etanol (10 ml) e 200 ml de água foi tratada com NaOH (6,0 g). A mistura de reação foi submetida a refluxo durante a noite sob argônio. A mistura foi diluída com água (150 ml) e extraída com 1:1 EtOAc/hexano (2 x 100 ml). A camada aquosa foi acidificada com H3PO4 para pH 2,5 ~ 3,0 e extraída com EtAc (6 x 75 mi). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas por MgSO4, filtradas e evaporadas para secura para dar o ácido R-4-mercaptopentanóico bruto. Este produto bruto foi usado diretamente para a próxima etapa sem mais purificação.
A uma solução de 1,60 g do ácido R-4-mercaptopentanóico bruto em uma mistura de etanol (50 ml) e 0,5 M NaH2PO4, pH 7,0 (75 ml) foi adicionado por gotejamento metanotiolsulfonato de metila (1,96 g, 15,53 mmol) em THF seco (7 ml) durante 45 min em 0 °C. A mistura de reação foi
75/85 agitada sob argônio a 0 °C por 30 min e depois em temperatura ambiente por 2 h. A mistura foi concentrada e extraída com diclorometano (2 x 50 ml). A camada aquosa foi acidificada com H3PO4 para pH 2,5 ~ 3,0 e extraída com EtOAc (4 x 100 ml). As camadas orgânicas foram combinadas, secadas por MgSO4, filtradas e evaporadas. O resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel, eluindo com 1:100:400 HOAc/EtOAc/hexano para dar 1,65 g (93 %) do produto do título 24. Rf = 0,32 (1:100:400 HOAc/EtOAc/hexano); 1H RMN (CDCI3) 2,91 (ddd, 1H, J = 6,8, 13,7, 20,4 Hz), 2,53 (t, 2H, J = 7,7 + 7,4 Hz), 2,42 (s, 3H), 1,96 (m, 2H), 1,36 (d, 3H, J = 6,8 Hz); 13C RMN 179,46, 45,67, 31,91, 31,07, 25,02, 21,36; MS: 202,9 (M + Na)+, 203,9 (M + 1 + Na)+; [a] =-39,16 (c = 2, CH3OH).
N-metil-N-[4-(R)-metilditio-1-oxopentil]-S-alanina (15b): Ácido R(+)-4-Metilditio-pentanóico (24) foi convertido no éster de Nhidroxissuccinimdila 25, pelo método descrito acima para o composto 14. A reação com N-metil-L-alanina pelo procedimento descrito acima para o composto 15 deu 15b. MS: m/z (M + Na): calc.: 288,1, observado: 288,1
N2-deacetil-N2-(4-(R)-metilditio-1-oxopentila)maitansina (DM3SMe, 4k,l): Maitansinol (11) foi acoplado com 15b, usando DCC e cloreto de zinco em diclorometano, como descrito acima para a síntese de 4c. Uma mistura de 2 diastereômeros que carregam a porção de N-metil-S-alanila (4k, S,R) e a porção de N-metil-R-alanila (4I,R,R) foi obtida. Os diastereômeros foram separados por HPLC em uma coluna de ciano Kromasil (4,6 mm x 250 mm), usando uma eluição isocrática em uma taxa de fluxo de 1 ml/min, com hexano: acetato de etila:2-propanol (68:24:8, v/v/v). Sob estas condições, o isômero 4k (S,R) eluiu em 23,9 min. Espectro de massa: m/z 834,2 (M + Na)+. O pico para o outro isômero 4I (R,R) foi bem separado e eluiu em 33,7 min. MS: m/z 834,2 (M + Na)+.
EXEMPLO 5a
Citotoxicidade In vitro de Maitansinóides e conjugados de AnticorpoMaitansinóide
A linhagem celular KB (ATCC CCI-17) é de origem epitelial humana. A linhagem celular SK-BR-3 (ATCC HTB-30) foi estabelecida a partir
76/85 de um adenocarcinoma da mama humano. As linhagens celulares de tumor do cólon humano COLO 205 (ATCC CCL-222) e HT-29 (ATCC HTB 38), a linhagem celular de meianoma humano A-375 (ATCC CRL 1619), a linhagem celular de linfoma Burkitts humano Ramos (ATCC CRL-1596) e a linhagem celular de leucemia mielóide humano HL-60 (ATCC CCL-240) foram todos obtidos da ATCC, Maryland. As linhagens celulares foram cultivadas em Dulbecco's modified Eagles Médium (DMEM, Biowhittaker, Walkersville, MD) com L-glutamina suplementada com 10 % soro bovino fetal (Hyclone, Logan, Utah) e 50 μg/ml de sulfato de gentamicina (Life Technologies, Rockville, MD). As células foram mantidas em 36 a 37,5 °C em uma atmosfera úmida que continha 6% de CO2.
O estudo da citotoxicidade executado usou um ensaio clonogênico. As linhagens celulares de teste foram incrustadas em discos de cultura de 6 cavidades em um número constante de 1000 células por cavidade. As células foram incubadas com concentrações variáveis (0 a 3 nM) dos vários maitansinóides (livres ou conjugados com anticorpos) durante 72 horas. O meio foi depois aspirado das placas e substituídos com meio novo. As culturas foram deixadas se desenvolver e formar colônias, por um total de 7 a 10 dias após a incrustação. As culturas foram depois fixadas em manchadas com 0,2 % de violeta cristal em 10 % formalina/PBS e as colônias foram contadas. A eficiência de incrustação de células não tratadas (meio apenas) foi determinada por dividir o número de colônias contadas pelo número de células incrustadas. A fração de sobrevivência das células expostas aos medicamentos foi determinada pela divisão do número de colônias nas cavidades que foram expostas ao medicamento pelo núimero de colônias nas cavidades de controle.
Os resultados das medições de citotoxicidade in vitro dos novos maitansinóides da presente invenção são mostrados na Figura 4. Os novos maitansinóides 4c,e que carregam ligações de dissulfeto impedido são altamente citotóxicos com respeito às linhagens celulares testadas, SK-BR-3 e A-375, com valores de IC5o variando de 7 x 10’12 M a 2,5 x 10'11 M. Assim, a incorporação de substituintes de alquila no carbono que carrega a porção de
77/85 dissulfeto possui potência citotóxica elevada preservada. O maitansinóide contendo tiol estericamente impedido 4a da presente invenção é de 30 a 50 vezes mais potente do que o maitansinóide não impedido correspondente anteriormente descrito 1. Desta maneira, a incorporação de substituintes de alquila no átomo de carbono que transporta a porção de tiol grandemente intensifica a potência.
Os resultados do teste in vitro de conjugados de anticorpo dos maitansinóides da presente invenção são mostrados nas Figuras 4c e 4d. A ligação dos dois novos maitansinóides, 4a ou 4b, ao anticorpo huC242 direcionado contra os tumores do cólon humano, resultou na morte específica do antígeno das células alvos. Assim, os conjugados são altamente potentes com respeito às células COLO 205 positivas ao antígeno, com valores de IC5o variando de 1,1 a 1,3 x 10'11 M. Ao contrário, os conjugados são de 100 a 200 vezes menos citotóxicas com respeito às células A-375 negativas ao antígeno, demonstrando que os novos maitansinóides da presente invenção produzem conjugados que possuem ligações de dissulfeto estericamente impedido, e apresentam citotoxicidade específica do alvo elevada.
EXEMPLO 5b
Preparação de conjugados citotóxicos de anticorpo huC242 usando Maitansinóides 4a ou 4b (MÉTODO A, Figura 5 a,b)
Uma solução de anticorpo huC242 (8 mg/ml) em tamponante aquoso (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM sal de dissódio de ácido etilenodiaminatetraacético), pH 6,5, foi incubada por 2 h com um excesso molar de 7 a 10 vezes de SPDP [3-(2-piridilditio)propionato de succinimidila, 3a), ou com N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB, 3b). A mistura de reação foi purificada pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25. A concentração do anticorpo foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos para o anticorpo s28onm = 217,560 M-1cm-1.
O anticorpo modificado foi diluído para 2,5 mg/ml em tamponante aquoso (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM sal de dissódio de ácido etilenodiaminatetraacético), pH 6,5, e depois tratado com
78/85 um excesso molar de 1,5 a 2,5 de ou DM3 ou DM4 em dimetilacetamida (concentração final de DMA foi 3 % v/v). A mistura de reação foi incubada por 18 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi purificada pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25. A concentração do conjugado foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos para o anticorpo 8280nm = 217,560 M 1cm e 8252nm = 80,062 M‘1cm1; para DM3 ou DM4, s280nm = 5,700 M1cm'1 e £252nM = 26,790 M'1cm'1). O conjugado resultante era monomérico e continha, na média, 3,2-3,5 moléculas de DM3 ou DM4 ligadas per molécula de anticorpo.
EXEMPLO 5c
Preparação de conjugados citotóxicos de anticorpo huC242 usando Maitansinóides 4a ou 4b (MÉTODO B, Figura 5c)
Uma solução de anticorpo huC242 (8 mg/ml) em tamponante aquoso (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM sal de dissódio de ácido etilenodiaminatetraacético), pH 6,5, foi incubada durante 2 h com um excesso molar de 7 a 10 vezes de SMCC [4-(N-maleimidometila)cicloexano-1-carboxilato de succinimidila, 26). A mistura de reação foi purificada pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25. A concentração do anticorpo foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos para o anticorpo 8280nm = 217,560 M'1cm1.
O anticorpo modificado foi diluído em 2,5 mg/ml em tamponante aquoso (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM sal de dissódio de ácido etilenodiaminatetraacético), pH 6,5, e depois tratado com um excesso molar de 1,5 a 2,5 de ou DM3 ou DM4 em dimetilacetamida (a concentração final de DMA era de 3 % v/v). A mistura de reação foi incubada por 18 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi purificada pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25. A concentração do conjugado foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos (para o anticorpo 8280nm = 217,560 M' 1cm' e 8252nm = 80,062 M'1cm'1; para DM3 ou DM4, 8280nm = 5,700 M'1cm'1 e
79/85 ε252ηΜ = 26,790 M1cm'1). Ο conjugado resultante era monomérico e continha, na média, de 3,2 a 3,5 moléculas de DM3 ou DM4 ligadas per molécula de anticorpo.
EXEMPLO 5d
Preparação de conjugados citotóxicos de anticorpo de huC242 usando Maitansinóides 4a ou 4b (MÉTODO C, Figura 5d)
Uma solução de anticorpo de huC242 (8 mg/ml) em tamponante aquoso (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio, 2 mM sal de dissódio de ácido etilenodiaminatetraacético), pH 6,5, foi incubada durante 2 h com um excesso molar de 7 a 10 vezes de SIAB [(4iodoacetila)aminobenzoato de N-succinimidila, 27). A mistura de reação foi purificada pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25. A concentração do anticorpo foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos para o anticorpo s28onm = 217,560 M'1 cm'1.
EXEMPLO 6
Eficácia in vivo de conjugados de huC242-Maitansinóide contra xenoenxertos de HT-29.
Camundongos SCID fêmeas com cinco semanas de idade (20 animais) foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito com células do carcinoma do cólon humano HT-29 (1,5 x 106 células/camundongo) em 0,1 ml de meio livre de soro. Os tumores foram cultivados por 11 dias até um tamanho médio de 100 mm3. Os animais foram depois aleatoriamente divididos em quatro grupos (5 animais per grupo). O primeiro grupo recebeu conjugado de huC242-DM1 (dose de DM1 de 75 μg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente. O segundo grupo recebeu conjugado de huC242-DM3 (dose de DM3 de 75 μg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente. O terceiro grupo recebeu conjugado de huC242-DM4 (dose de DM4 de 75 μg/kg, qd x 5), enquanto um quarto grupo de animais serviram como controles e receberam PBS usando o mesmo plano de tratamento como nos grupos de 1 a 3.
Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes semanal80/85 mente e os volumes de tumor foram calculados com a fórmula: volume de tumor = ^comprimento x largura x altura). O peso dos animais foi também medido duas vezes per semana. Os resultados são mostrados na Figura 7. Os tumores no grupo de controle de camundongos crescería até um tamanho de quase 1000 mm3 em 35 dias. O tratamento com huC242-DM1 resultou em um adiamento do crescimento tumoral de 18 dias, enquanto os conjugados preparados com os maitansinóides 4a e 4b da presente invenção foram significativamente mais eficazes e prolongaram o adiamento do crescimento do tumor em 28 dias e 36 dias, respectivamente.
EXEMPLO 7
Eficácia in vivo de conjugados de huC242-Maitansinóide contra xenoenxertos de COLO 205.
Camundongos SCID fêmeas com cinco semanas de idade (20 animais) foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito com células do carcinoma do cólon humano COLO 205 (1,5 x 106 células/camundongo) em 0,1 ml de meio livre de soro. Os tumores foram cultivados por 11 dias até um tamanho médio de 100 mm3. Os animais foram depois aleatoriamente divididos em quatro grupos (5 animais per grupo). O primeiro grupo recebeu conjugado de huC242-DM1 (dose de DM1 de 75 pg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente. O segundo grupo recebeu conjugado de huC242-DM3 (dose de DM3 de 75 pg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente. O terceiro grupo recebeu conjugado de huC242-DM4 (dose de DM4 de 75 pg/kg, qd x 5), enquanto um quarto grupo de animais serviram como controles e receberam PBS usando o mesmo plano de tratamento como nos grupos de 1 a 3.
Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes semanalmente e os volumes de tumor foram calculados com a fórmula: volume de tumor = ^comprimento x largura x altura). O peso dos animais foi também medido duas vezes per semana. Os resultados são mostrados na Figura 8. Os tumores no grupo de controle de camundongos crescería até um tamanho de quase 900 mm3 em 24 dias. O tratamento com huC242-DM1 resultou em um adiamento do crescimento tumoral de 20 dias, enquanto o conjugado
81/85 preparado com o maitansinóide 4b da presente invenção foi ainda mais eficaz, resultando nas curas de todos os animais tratados.
EXEMPLO 8
Eficácia in vivo de conjugados de huC242-Maitansinóide contra xenoenxertos HT-29.
Camundongos SCID fêmeas com cinco semanas de idade (20 animais) foram inoculadas subcutaneamente no flanco direito com células de leucemia mielóide humano HL-60 (1,5 x 106 células/camundongo) em 0,1 ml de meio livre de soro. Os tumores foram cultivados por 12 dias até um tamanho médio de 100 mm3. Os animais foram depois aleatoriamente divididos em quatro grupos (5 animais per grupo). O primeiro grupo recebeu conjugado de MY9-6-DM1 (dose de DM1 de 200 μg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente. O segundo grupo recebeu conjugado de MY9-6-DM3 (dose de DM3 de 200 μg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente. O terceiro grupo recebeu conjugado de MY9-6-DM4 (dose de DM4 de 200 μg/kg, qd x 5) administrado intravenosamente, enquanto um quarto grupo de animais serviram como controles e receberam PBS usando o mesmo plano de tratamento como nos grupos de 1 a 3.
Os tamanhos dos tumores foram medidos duas vezes semanalmente e os volumes de tumor foram calculados com a fórmula: volume de tumor = %(comprimento x largura x altura). O peso dos animais foi também medido duas vezes per semana. Os resultados são mostrados na Figura 9. Os tumores no grupo de controle de camundongos crescería até um tamanho de quase 1600 mm3 em 21 dias. O tratamento com MY9-6-DM1 resultou em um adiamento do crescimento tumoral de cerca de 5 dias, enquanto os conjugados preparados com os maitansinóides 4a e 4b da presente invenção foram significativamente mais eficazes prolongando o adiamento do crescimento do tumor em mais do que 20 dias.
EXEMPLO 9
Preparação de um conjugado citotóxico de anticorpo huMy9-6 usando Maitansinóide DM4 (4b).
Uma solução de anticorpo huMy9-6 em um concentração de 8
82/85 mg/ml foi incubada por 2 h com um excesso molar de 6,5 de SSNPB [4-(5'~ nitro-2'-piridilditio)butirato de sulfossuccinimidila] em 50 mM tampão de fosfato de potássio, pH 6,5, contendo 2 mM ácido etilenodiaminatetraacético (tampão A) com 5 % etanol. O anticorpo modificado foi purificado pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25 equilibrado em tampão A e a concentração do anticorpo purificado foi determinada espectrofotometricamente usando o coeficiente de extinção para o anticorpo em 280 nm. O anticorpo modificado foi diluído para 4,9 mg/ml com tampão A e incubado por 18 h em temperatura ambiente com excesso molar de 1,7 vez de DM4, que foi adicionado à mistura de reação como uma solução de carga em dimetilacetamida (a concentração final de dimetilacetamida era de 3 % v/v). O conjugado de anticorpo-medicamento foi purificado pela passagem através de um coiuna Sephadex G25 equilibrada com PBS, pH 6,5. A concentração do conjugado foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos para o anticorpo e DM4 (para o anticorpo, s28onm = 206,460 M'1cm1, s252nm = 72,261 M'1cm'1; para DM4, e280nm = 5,700 M'1cm'1, ε252ηΜ = 26,790 M'1cm'1). O conjugado anticorpomedicamento resultante continha uma média de 3,6 moléculas de DM4 per molécula de anticorpo. A análise bioquímica demonstrou que o anticorpo residual era mais do que 94 % monomérico seguinte a conjugação e tinha uma afinidade de ligação comparável ao anticorpo não modificado como determinado pela citometria de fluxo. A quantidade de medicamento associado com o anticorpo que não era ligado covalentemente (medicamento livre) foi determinada pela análise de HPLC e observada ser menor do que 1 % do medicamento ligado total.
EXEMPLO 10
Seletividade e Eficácia in vitro de conjugado de huMy9-6-DM4
A citotoxicidade de huMy9-6-DM4 em relação às células que expressam CD33 (HL-60) e células Namalwa negativas a CD33 foi testada usando um ensaio clonogênico, onde a atividade de morte celular é determinada pela quantificação do número de colônias que podem se desenvolver seguinte ao tratamento. O huMy9-6-DM4 apresenta atividade de morte celu83/85 lar potente em relação às células tumorais humanas HL-60 positivas a CD33 in vitro (Figura 10). Nenhuma toxicidade significativa em relação ás células
Namalwa humanas negativas a CD33 foi observada, indicando que a citotoxicidade dependente de CD33 era devido ao direcionamento específico pelo anticorpo anti-CD33, huMy9-6 do conjugado.
EXEMPLO 11
Eficácia in vivo de conjugados huMy9-6-DM4 contra xenoenxertos tumorais humanos HL60 em camundongos SCID
A eficácia de huMy9-6-DM4 in vivo foi determinada em camundongos SCID que carregam xenoenxertos de tumor HL-60 humanos. Células HL-60 foram injetadas subcutaneamente e os tumores foram deixados se desenvolver até um tamanho médio de 100 mm3. O conjugado HuMy9-6DM4 foi liberado i.v. uma vez ao dia durante 5 dias na dose indicada na Figure 11. A dosagem é expressa como μg de DM4 no conjugado, que corresponde a uma dose de anticorpo de aproximadamente 67 μg de anticorpo per μg de DM4. O volume do tumor foi medido como uma indicação de eficácia de tratamento e o peso corporal do camundongo foi monitorado para indicar a toxicidade devido ao tratamento. huMy9-6-DM4 induz ao adiamento prolongado do crescimento tumoral de xenoenxertos de célula HL-60 humanos em doses que causam pouca toxicidade (Figura 11). A eficácia do huMy9-6DM4 foi também comparada com aquela do huMy9-6-DM1. Inesperadamente, foi observado que huMy9-6-DM4 era mais eficaz do que huMy9-6-DM1. HuMy9-6-DM4 mantinha os animais em remissão completa (CR) por quase sessenta dias, enquanto os animais tratados com huMy9-6-DM1 tiveram recorrência após cerca de 20 dias em CR.
EXEMPLO 12
Preparação de um conjugado citotóxico de anticorpo huB4 usando Maitansinóide DM4 (4b),
Uma solução de anticorpo huB4 em uma concentração de 20 mg/ml foi incubada por 1,5 h com um excesso molar de 8 vezes de SSNPB [4-(5'-nitro-2'-piridilditio)butirato de sulfossuccinimidila] em 50 mM tampão de fosfato de potássio, pH 6,5 contendo 2 mM ácido etilenodiaminatetraacético
84/85 (tampão A) com 5 % dimetilacetamida. O anticorpo modificado foi purificado pela passagem através de uma coluna de filtração de gel Sephadex G25 equilibrada com tampão A e a concentração do anticorpo purificado foi determinada espectrofotometricamente usando o coeficiente de extinção para o anticorpo em 280 nm (199,560 M'1cm'1). O anticorpo modificado foi diluído em 8 mg/ml com tampão A e incubado por 3 h em temperatura ambiente com um excesso molar de 1,7 vez de DM4, que foi adicionado à mistura de reação como uma solução de carga em dimetilacetamida (a concentração final de dimetilacetamida era de 3 % v/v). O conjugado de anticorpomedicamento foi purificado pela passagem através de uma coluna Sephadex G25 e uma coluna Sephadex S300, ambas equilibradas com tampão de PBS, pH 6,5. A concentração do conjugado foi determinada espectrofotometricamente usando os coeficientes de extinção conhecidos para o anticorpo (£280nm: 199,560 M'1cm'1; s252nm: 67,850 M'1cm'1) e DM4 (s28onm = 5,700 M’ 1cm'1, ε252ηΜ = 26,790 M'1cm'1). O conjugado de anticorpo-medicamento resultante continha uma média de 4,0 moléculas de DM4 per molécula de anticorpo. A análise bioquímica demonstrou que o anticorpo residual era mais do que 98 % monomérica seguinte a conjugação e tinha uma afinidade de ligação comparável ao anticorpo não modificado como determinado pela citometria de fluxo. A quantidade de medicamento associado com o anticorpo que não era ligado covalentemente (medicamento livre) foi determinada pela análise de HPLC e era de aproximadamente 2 % do medicamento ligado total.
EXEMPLO 13
Seletividade e Eficácia in vitro de conjugado de huB4-DM4
A citotoxicidade de huB4-DM4 em relação às células que expressam CD19 (Ramos) comparada com uma linhagem celular negativa a CD19 (Colo 205) foi testada usando um ensaio com base em MTT, onde a atividade de morte celular é determinada pela quantificação do número de células viáveis que sobram seguinte ao tratamento com conjugado. O número viável de células é determinado pela quantificação espectrofotométrica seguinte a incubação das células com o MTT tingido vital. O huB4-DM4 a85/85 presenta atividade de morte celular potente em relação às células tumorais humanas Ramos positivas a CD19 in vitro (Figura 12). Nenhuma toxicidade significativa em relação ás células negativas a CD19 foi observada, indicando que a citotoxicidade dependente de CD19 era devido ao direcionamento específico pelo anticorpo anti-CD19, huB4.
EXEMPLO 14
Eficácia in vivo de conjugados huB4-DM4 contra xenoenxertos tumorais humanos Ramos em camundongos SCID
A eficácia de huB4-DM4 in vivo foi determinada usando camun10 dongos SCID que carregam xenoenxertos de tumor Ramos humanos. Células Ramos foram injetadas subcutaneamente e os tumores foram deixados se desenvolver até um tamanho médio de 100 mm3. O conjugado de huB4DM4 foi liberado i.v. como uma injeção única nas doses indicadas na Figura 13a. A dosagem é expressa como μg de DM4 no conjugado, que correspon15 de a uma dose de anticorpo de aproximadamente 44 μg de anticorpo per μ9 de DM4. O volume do tumor foi medido como uma indicação de eficácia de tratamento e o peso corporal do camundongo foi monitorado para indicar a toxicidade devido ao tratamento. Nas doses acima de 50 μ9^, o huB4-DM4 causa regressão completa dos tumores em todos os animais. Os animais permanecem sem doença mensurável por cerca de 35 dias no grupo de tratamento de 100 mg/kg, e por mais do que 55 dias nos dois grupos de dose mais elevada. Estes tratamentos causaram muito pouca no caso de qualquer toxicidade (Figura 13b) como avaliado pela mudanças no peso corporal dos animais tratados.
1/4

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para produzir o conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular, caracterizado pelo fato de que compreende a reação de um maitansinóide de fórmula 4':
    5 em que:
    Y' representa (CR7R8)l(CR9=CRl0)p(CEC)qAo(CR5R6)mDu(CRll=CRl2)r (CEC)sBt(CR3R4)nCRiR2SZ, em que:
    Z é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo
    10 de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica com de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou arila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclicos aromáticos ou radical heterocíclico,
    Ri e R2 são, cada um independentemente, alquila ou alquenila
    15 linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica com de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclicos aromáticos ou radical heterocíclico, e em aditamento R2 pode ser H;
    20 A, B e D, cada um independentemente, é cicloalquila ou cicloalquenila tendo de 3 a 10 átomos de carbono, arila simples ou arila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclicos aromáticos ou radical heterocíclico;
    25 R3, R4, Rs, R6, R7, Re, R9, R10, R11, θ R12 são, cada um
    Petição 870180067527, de 03/08/2018, pág. 6/13
  2. 2/4 independentemente, H, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica com de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclicos
    5 aromáticos ou radical heterocíclico; e
    I, m, n, o, p, q, r, s, t, e u são, cada um independentemente, 0 ou um número inteiro de 1 a 5, desde que pelo menos dois de I, m, n, o, p, q, r,s, t, e u não sejam zero em nenhum momento, em que o referido radical aromático heterocíclico ou o referido 10 radical heterocíclico um anel de 3 a 10 membros contendo um ou dois heteroátomos selecionados de N, O ou S, com o referido agente de ligação celular, em que o referido agente de ligação celular compreende um grupo ditio, um grupo sulfidrila, um grupo maleimido, ou um grupo haloacetila reativo.
    15 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo ditio reativo é um grupo ditiopiridila, ou um grupo ditiopiridila substituído.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que Ri é metila, R2 é H, R5, R6, R7 e Re são, cada um, Η; I e m são,
    20 cada um, 1; n é 0; e Z é H.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são metila; R5, R6, R7 e Re são, cada um, Η; I e m são, cada um, 1; n é 0; e Z é H.
  5. 5. Método para produzir o conjugado de maitansinóide-agente 25 de ligação celular, caracterizado pelo fato de que compreende a reação de um maitansinóide de fórmula 4
    Petição 870180067527, de 03/08/2018, pág. 7/13
    3/4 em que
    Y representa (CR7Re)i(CR5R6)m(CR3R4)nCRiR2SZ, em que:
    Ζ é H, SR ou -COR, em que R é alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica com
    5 de 3 a 10 átomos de carbono, ou arila simples ou arila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclicos aromáticos ou radical heterocíclico,
    Ri e R2 são, cada um independentemente, alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou
    10 cíclica com de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclico aromático ou radical heterocíclico, e em aditamento R2 pode ser H;
    R3, R4, Rs, R6, R7 e Re são, cada um independentemente, H,
    15 alquila ou alquenila linear tendo de 1 a 10 átomos de carbono, alquila ou alquenila ramificada ou cíclica com de 3 a 10 átomos de carbono, fenila, fenila substituída com pelo menos uma alquila contendo de 1 a 4 átomos de carbono, ou um alcóxi, halogênio, ou nitro, ou heterocíclico aromático ou radical heterocíclico; e
    20 I, m, e n são, cada um independentemente, um número inteiro de 1 a 5, e, além disso n pode ser 0, em que o referido radical aromático heterocíclico ou o referido radical heterocíclico é um anel de 3 a 10 membros contendo um ou dois heteroátomos selecionados de N, O ou S,
    25 com o referido agente de ligação celular, em que o referido agente de ligação celular compreende um grupo ditio, um grupo sulfidrila, um grupo maleimido, ou um grupo haloacetila reativo.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o grupo ditio reativo é um grupo ditiopiridila ou um grupo
    30 ditiopiridila substituída.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o grupo ditio reativo é um grupo ditiopiridila substituída de NPetição 870180067527, de 03/08/2018, pág. 8/13
    4/4 succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB).
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que Ri é metila, R2 é H; Rs, R6, R7 e Re são, cada um, Η, I e m são, cada um, 1; n é 0; e Z é H.
    5
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são metila; Rs, R6, R7 e Re são, cada um, Η, I e m são, cada um, 1; n é 0; e Z é H.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação celular é selecionado do grupo consistindo
    10 em um anticorpo humanizado ou anticorpo ressurgido de anticorpo murino MY9 que se liga especificamente ao antígeno CD33; um anticorpo humanizado ou ressurgido de anticorpo murino B4 que se liga especificamente ao antígeno CD19, e um anticorpo humanizado ou ressurgido de anticorpo murino C242 que se liga especificamente ao
    15 antígeno CanAg.
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação celular é um anticorpo humanizado ou ressurgido de anticorpo murino B4 que se liga especificamente ao antígeno CD19.
    20
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que R1 e R2 são metila; Rs, R6, R7 e Rs são, cada um, Η, I e m são, cada um, 1; n é 0; e Z é H.
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o grupo ditio reativo é um grupo ditiopiridila substituída de
    25 N-succinimidil-4-(2-piridilditio)butanoato (SPDB).
    Petição 870180067527, de 03/08/2018, pág. 9/13
    1/20
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