BRPI0512042B1

BRPI0512042B1 - composição imunogênica, vacina, uso de uma composição ou vacina, método para produzir uma composição imunogênica, e, uso de vlps ou capsômeros de hpv 16 e 18 com vlps ou capsômeros de pelo menos um outro hpv do tipo causador de câncer

Info

Publication number: BRPI0512042B1
Application number: BRPI0512042A
Authority: BR
Inventors: Stephenne Jean; Martin Marie-Therese; Anne Cecile Wettendorff Martine; John Stephen Robert; Debrus Serge
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals Sa
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2005-06-14
Publication date: 2019-01-22
Also published as: LU92899I2; JP2008502633A; LU92900I2; AU2005253723B2; FR15C0084I1; NO20070195L; SG153837A1; CA2566620A1; EP1758609B1; KR20070029254A; MA28692B1; EP1758609A1; PL1758609T3; AR049354A1; MXPA06014515A; LU92898I2; CA2566620C; PE20060434A1; FR15C0082I2; FR15C0082I1

Abstract

composição imunogênica, vacina, métodos de evitar infecção e/ou doença por hpv, de produzir uma composição imunogênica e de prevenir ou tratar infecção e/ou doença por hpv uma composição imunogênica e métodos para produzir dita composição, a composição compreendendo vlps de hpv 16 e 18 e pelo menos um outro tipo de câncer hpv, o outro tipo de câncer sendo selecionado da lista consistindo de i-ipv tipos 31, 45 e 52, em que a dose do vlp do pelo menos um outro tipo de câncer é reduzida àquela do hpv 16 ou 18.

Description

“COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, USO DE UMA COMPOSIÇÃO OU VACINA, MÉTODO DE PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, USO DE VLPS OU CAPSÔMEROS DE HPV 16 E 18 COM VLPS OU CAPSÔMEROS DE PELO MENOS UM OUTRO HPV DO TIPO CAUSADOR DE CÂNCER”

A presente invenção refere-se a vacinas contra papilomavírus humanos.

Fundamentos Da Invenção

Os papilomavírus são pequenos vírus tumorais de DNA, que são altamente específicos de espécie. Até agora, acima de 100 genótipos de papilomavírus humanos individuais foram descritos. Os HPVs são geralmente específicos para a pele (por exemplo, HPV-1 e 2 ou superfícies mucosas (por exemplo, HPV-6 e 11) e usualmente causam tumores benignos (verrugas) que persistem por diversos meses ou anos. Tais tumores benignos podem ser penosos para os indivíduos envolvidos, porém tendem a não ser ameaçadores da vida, com algumas exceções.

Alguns HPVs são também associados com cânceres, conhecidos como tipos de HPV oncogênicos. A associação positiva mais forte entre um câncer HPV e humano é aquela que existe entre o HPV-16 e HPV18 e o carcinoma cervical. O câncer cervical é a malignidade mais comum nos países em desenvolvimento, com cerca de 500.000 novos casos ocorrente no mundo a cada ano.

Outros HPVs de particular interesse com respeito a câncer são os tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82, 26, 53 e 66.

As partículas semelhantes a vírus HPV (VLPs) foram sugeridas como vacinas potenciais para tratamento do HPV. Uma vacina bivalente, utilizando VLPs, foi mostrada ser eficaz na prevenção da infecção com HPV tipos 16 e 18 em mulheres jovens (Lacet, vol. 364, edição 9447, novembro de 2004, páginas 1757 - 1765).

Há ainda uma necessidade de uma vacina que proteja contra

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 13/62 múltiplos (por exemplo, > 2) tipos de HPV.

A presente invenção trata desta necessidade.

Resumo Da Invenção

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo VLPs de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP do pelo menos um outro tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela do HPV 16 ou 18.

Em um aspecto relacionado, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo VLPs de HPV 16 e pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31 e 32, em que a dose das VLP do pelo menos um outro tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela do HPV 16.

Em um aspecto relacionado, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo VLPs de HPV 18 E HPV 45, em que a dose das VLP de HPV 45 é reduzida em relação àquela do HPV 18.

A invenção refere-se ainda a uma composição imunogênica como definida acima, em combinação com um adjuvante e/ou veículo.

A invenção refere-se ainda a uma vacina compreendendo uma composição imunogênica como definida acima, com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

A invenção refere-se ainda a um método de prevenir infecção e/ou doença por HPV, compreendendo administrar a um indivíduo em necessidade dela uma composição ou vacina como acima definido.

A invenção refere-se ainda a um método para produzir uma composição imunogênica como definida acima, compreendendo misturar VLPs de HPV 16 e 18 com pelo menos um outro HPV do tipo causador de

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 14/62 câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP do pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela do HPV 16 ou

18.

Os aspectos acima da invenção podem empregar capsômeros de HPV, em vez de VLPs.

Descrição Detalhada

Determinamos surpreendentemente que as VLPs de HPV 16 e 18 fornecem proteção cruzada contra infecção e/ou doença por certos HPVs do tipo causador de câncer, que é HPV 31, HPV 45 e HPV 52. São fornecidos dados nos exemplos aqui.

A proteção cruzada pode ser considerada como a proteção propiciada por uma vacina contendo um tipo de HPV contra infecção (incidente ou persistente) e/ou doença causadas por um diferente tipo de HPV. Infecção incidente e persistente é definida como no jornal Lancet por Harper et al. Vol. 364, edição 9447, novembro de 2004, págs. 1757 - 1765. A proteção cruzada pode ser avaliada considerando-se a eficácia da vacina (V.E.), em que a V.E. é a melhoria % de proteção contra infecção pela vacina, em comparação com um grupo placebo para um dado tipo.

Por conseguinte, as vacinas HPV, compreendendo VLPs de HPV 16 e 18, podem ser formuladas usando-se uma dose mais baixa de outras (não-HPV 16/18) VLPs de tipo causador câncer (31, 45 ou 52) que de outro modo seria necessária na ausência de VLPs de HPV 16 e 18, enquanto ainda obtendo-se a mesma resposta protetora contra infecção por HPV incidente e/ou persistente para aquele outro tipo. A redução da dose de outras VLPs de tipo causador de câncer, em um cenário de vacina multivalente, sem significativo impacto da proteção causada por aqueles outros tipos, pode ser vantajosa onde a quantidade total de antígeno pode ser limitada; por exemplo, por restrições físicas, químicas ou regulatórias. Ela também permite que

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 15/62 sejam produzidas mais doses de uma vacina para uma determinada quantidade de antígeno e pode potencialmente reduzir o custo total da vacina.

A dose das VLP aqui é adequadamente a quantidade de VLP, medida em peso.

Em outras palavras, para obter-se a mesma resposta protetora contra infecção e/ou doença incidente e/ou persistente, a dose das VLPs de “outros tipos causadores de câncer” (não-HPV 16/HPV 18), que necessita ser reduzida, comparada com aquele nível que é necessário na ausência de tais VLPs tipo 16 e/ou 18.

A invenção assim refere-se a uma composição imunogênica compreendendo VLPs de HPV 16 e 18 e pelo menos de um outro HPV do tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP do pelo menos um outro tipo de HPV causador de câncer é reduzida em relação àquela do HPV 16 ou 18.

Em um aspecto alternativo, a invenção refere-se a uma composição imunogênica compreendendo VLPs de HPV 16 e 18 e de pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose das VLP do pelo menos um outro HPV de tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela que de outro modo seria requerida, na ausência de VLPs de HPV 16 e 18, para gerar a mesma proteção contra infecção por HPV incidente e/ou persistente por aquele outro tipo de câncer.

Em um aspecto, a dose do (não-HPV 16, 18) das outras VLP de outro HPV de tipo causador de câncer é suficiente para fornecer proteção contra infecção incidente e/ou persistente por aquele tipo e, em um aspecto da invenção, proteção contra pelo menos uma infecção incidente.

Em um aspecto da invenção, a composição da invenção é adequada para proteção de infecção e/ou doença em indivíduos humanos.

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Uma dose adequada pode ser determinada, por exemplo, por experimentos em humanos, tais como aqueles descritos nos exemplos aqui.

Proteção vs. infecção incidente e/ou persistente por um dado tipo de HPV, tal como HPV 16, 18, 31, 45 ou 52, por exemplo, é adequadamente proteção em 50% de uma população vacinada contra infecção por aquele tipo e, em um aspecto da invenção, é proteção de 60%, em um outro aspecto, proteção de 70%, em um outro aspecto, proteção de 80%, em mais um aspecto, 90% de proteção, em um outro aspecto, 95% de proteção, em mais um aspecto, 96% de proteção, em mais um aspecto, 97% de proteção, em um outro aspecto, 98% de proteção, em mais um aspecto, 99% de proteção e em ainda um outro aspecto, proteção de 100%.

Adequadamente, esta proteção é estimada durante um período de pelo menos 6 meses, tal como durante um período de pelo menos 9 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 18 meses, adequadamente durante um período de 2 anos ou mais do que 2 anos.

Em um aspecto da invenção, a proteção é vista contra infecção ou doença causada por HPV 16 e/ou HPV 18 e, em um aspecto, infecção e/ou doença tanto por HPV 16 e HPV 18.

A prevenção da infecção pode ser estimada por análise de espécies de HPV presentes em indivíduos vacinados, por exemplo, por análise PCR e/ou técnicas de hibridização, tais como aquelas descritas no WO 03014402 e WO 9914377, incorporado aqui por referência.

Onde a composição imunogênica da invenção compreender VLPs de ambos HPV 16 e 18, então as VLPs de HPV de tipo causador de câncer não-HPV 16/18 é do tipo 31, tipo 45 ou tipo 52, ou uma combinação deles. Em um aspecto, a composição imunogênica da invenção compreende VLPs de HPV 16, 18, 31 e 45. Em um aspecto, a composição imunogênica da invenção compreende VLPs de HPV 16, 18, 31 e 52. Em um aspecto, a composição imunogênica da invenção compreende VLPs de HPV 16, 18, 45 e

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52. Em um aspecto, a composição imunogênica da invenção compreende VLPs de HPV 16, 18, 31, 52 e 45. Onde houver 2 ou mais de outras VLPs de tipo de câncer (por exemplo, 31 e 45, 31 e 52, 45 e 52), então pelo menos um destes outros tipos causadores de câncer está presente em uma dose que é reduzida àquela do HPV 16 ou HPV 18.

Em um aspecto, a dose de HPV 31 é reduzida em relação àquela do HPV 16.

Em um aspecto, a dose de HPV 52 é reduzida em relação àquela do HPV 16.

Em um aspecto, a dose de HPV 45 é reduzida em relação àquela do HPV 18.

Adequadamente, as composições imunogênicas, como definidas acima, fornecem proteção contra infecção incidente e/ou infecção persistente e/ou doença causada por HPV 16, HPV 18 e um ou mais dos outros (31, 45 ou 52) tipos de HPV presentes nos grupos listados acima, tais como infecção incidente.

Onde uma composição imunogênica da invenção compreender VLPs de HPV 16, mas não VLPs de HPV 18, então, adequadamente, o VLP de HPV do tipo causador de câncer não-HPV 16/18 é tipo 31 e/ou tipo 52.

Onde uma composição imunogênica da invenção compreender VLPs de HPV 18, mas não VLPs de HPV 16, então, adequadamente o VLP de HPV do tipo causador de câncer não-HPV 16/18 é tipo 45.

Em um aspecto da invenção, a composição compreende VLPs de HPV 16 e 18, em combinação com VLPs de um ou outro ou de ambos de HPV 31 e HPV 45.

Em um aspecto da invenção, a composição compreende pelo menos VLPs de HPV 16, em combinação com VLPs de HPV 31.

A composição da invenção pode compreender, além das VLPs em dose reduzida, outras VLPs de HPV em qualquer dose adequada. Por

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 18/62 exemplo, a composição da invenção pode compreender tipos causadores de câncer de “alto risco” adicionais, tais como um ou mais de HPV, 33, 35, 39, 51, 56,58, 59,66 ou 68.

Em um aspecto, a composição pode compreender tipos adicionais chamados de “verrugas genitais”, tais como HPV 6 e/ou 11, ou chamados tipos de “pele”, tais como HPV 5 e/ou 8. Em um aspecto, as VLPs adicionais estão presentes na mesma dose ou mais elevadas do que de HPV 16 e/ou HPV 18.

Em um aspecto da invenção, a composição compreende VLPs de HPV 39 e/ou HPV 51 e a dose de pelo menos uma destas é reduzida em relação ao HPV 16 e/ou HPV 18.

Em um aspecto, a quantidade de VLP adicional é selecionada a fim de fornecer algum grau de proteção contra infecção ou doença em relação ao(s) tipo(s) adicional(ais).

Certas composições da invenção, individualizadas abaixo, compreendem a seguinte dose de VLPs.

Número Composição	VLP de HPV 16 (P-g)	VLP de HPV 18 (Ug)	VLP de HPV 31 (P-g)	VLP de HPV 45 (P-g)
1	20	20	10	10
2	20	30	10	10
3	20	30	20	20
4	30	20	10	10
5	30	20	20	20

Adequadamente, não há interferência significativa ou biologicamente importante entre as VLPs de HPV da composição da invenção, de modo que a vacina VLP combinada da invenção é capaz de oferecer proteção eficaz contra infecção por cada tipo de VLP de HPV representado na vacina. Adequadamente, a resposta imune contra um dado tipo de VLP da combinação é de pelo menos 50% da resposta imune daquele mesmo tipo de VLP, quando medida individualmente, preferivelmente 100% ou substancialmente 100%. Para resposta aos componentes de VLP de HPV 16 e HPV 18, a vacina combinada da invenção preferivelmente estimula uma

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 19/62 resposta imune, que é de pelo menos 50% daquela fornecida por uma vacina de VLP de HPV 16 / HPV 18 combinados. Adequadamente, a resposta imune, gerada pela vacina da invenção, é em um nível em que o efeito protetor de cada tipo de VLP é ainda visto. A resposta imune pode adequadamente ser medida, por exemplo, por resposta anticorpo, empregando-se técnicas padrão, tais como ELISA, e por experimentos clínicos, como aqui descritos.

Em um aspecto, a composição da invenção não compreende uma proteína de choque térmico ou seu fragmento.

Em um aspecto, a composição da invenção não compreende uma proteína ou peptídeo L2 de HPV. Em outro aspecto, a composição da invenção compreende uma proteína ou peptídeo L2 de HPV.

As VLPs de HPV e métodos para a produção de VLPs são bem conhecidos na técnica. As VLPs tipicamente são construídas das proteínas estruturais LI e, opcionalmente, L2 do vírus, vide, por exemplo, WO 9420137, WO9629413 e WO 9405792. Quaisquer VLP de HPV adequadas podem ser usadas na presente invenção, tais como VLP de LI ou LI + L2.

A formação de VLP pode ser estimada por técnicas padrão, tais como, por exemplo, microscopia eletrônica e dispersão de luz laser dinâmica.

Em um aspecto da invenção, as VLPs são VLPs somente de Ll.

As VLPs podem compreender proteína Ll de comprimento total.

Em um aspecto da invenção, a proteína Ll, usada para formar as VLP, é uma proteína Ll truncada. As proteínas Ll HPV truncadas são descritas, por exemplo, em US6361778, incorporada aqui por referência. Em um aspecto, a truncagem remove um sinal de localização nuclear. Em um outro aspecto, a truncagem é uma truncagem de terminal C. Em um outro

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 20/62 aspecto, a truncagem de terminal C remove menos do que 50 aminoácidos, adequadamente preferivelmente menos do que 40 amino ácidos. Adequadamente, a seqüência de LI de HPV 16 começa no segundo códon da metionina, por exemplo, como mostrado na seqüência abaixo, ou posições análogas dos outros tipos de HPV. Onde as VLP forem VLP de HPV 16, então, em um aspecto, a truncagem de terminal C remove 34 aminoácidos da seqüência LI de HPV 16. Onde as VLP forem VLP de HPV 18, então, em um aspecto, a truncagem de terminal C remove 35 aminoácidos da seqüência LI de HPV 18.

Em um aspecto, a seqüência HPV 16 é a seguinte:

MSLWLPSEATVYLPPVPVSKWSTOEYVARTNIYYHAGTSRLLAVGHPYFPIKKPNNNKI 60 LVPKVSGLQYRVFRIHLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGH 120 PLLNKLDDTENASAYAANAGVDNRECISMDYKQTQLCLIGCKPPIGEHWGKGSPCTNVAV 180 NPGEX2PPLELINTVIQDGDMVDTGFGAMDFTTLQANKSEVPLDICTSICKYPDYIKMVSE 240 PYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGAVGENVPDDLYIKGSGSTANLASSNYFPIPSGSMV 300 TSDAQIFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMSLCAAISTSETTYKNTNF 360 KEYLRHGEEYDLQFIFQLCKITLTADVMIYIHSMNSTILEDWNFGLQPPPGGTLEEnYRF 420 VTSQAIACQKHTPPAPKEDPLKKYTFWEVNLKEKFS ADLDQFPLGRKFLIjQ 471

A seqüência HPV 16 pode também ser aquela descrita no WO 9405792 ou US6649167, por exemplo, adequadamente truncada. Truncados adequados são truncados em uma posição equivalente àquela mostrada acima, como estimado pela comparação de seqüência.

Em um aspecto, a seqüência HPV 18 é a seguinte seqüência: MALWRPSDNTVYLPPPSVARWNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQ 60 DIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDNSIYNPETQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGH 120 PFYNKLDDIESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPL 180 SQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD 240 PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPPSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIV 300 TSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATK 360

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FKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYR 420 FVQSVAITCQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQ 472

Uma seqüência HPV 18 alternativa é descrita no WO 9629413, que pode ser adequadamente truncada. Truncados adequados são truncados em uma posição equivalente àquela mostrada acima, como estimado pela comparação de seqüência.

Outras seqüências HPV 16 e HPV 18 são bem conhecidas na técnica e podem ser adequadas para uso na presente invenção.

Truncagens adequadas de HPV 31, HPV 45 e HPV 52 podem também ser feitas, adequadamente removendo-se as partes de terminal C equivalentes da proteína LI daquelas descritas acima, como estimado pelo alinhamento de seqüência.

As proteínas LI truncadas são descritas por exemplo, em WO 9611272 e US6066324, aqui incorporados por referência.

Em um aspecto, as proteínas LI truncadas são derivados de proteína LI adequadamente funcionais, capazes de provocar uma resposta imune (se necessário, quando adequadamente auxiliada), dita resposta imune sendo capaz de reconhecer VLP consistindo da proteína LI de comprimento total e/ou do tipo HPV de que a proteína LI é derivada.

As VLPs da invenção podem também compreender outros tipos de derivados de proteína funcionais, incluindo mutantes das proteínas LI de HPV de comprimento total ou truncadas, tais como mutantes de deleção, substituição ou inserção. A proteína LI ou derivado pode também ser uma proteína de fusão, tal como a fusão da proteína LI com L2 ou uma proteína precoce. A proteína ou derivado de proteína funcional LI é capaz de formar uma VLP e a formação de VLP pode ser estimada por técnicas padrão, tais como, por exemplo, microscopia eletrônica e dispersão de luz laser dinâmica.

As VLPs podem ser produzidas em qualquer substrato de

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 22/62 célula adequado, tal como células de levedura ou células de inseto, por exemplo, células de baculovírus, e técnicas para preparação das VLPs são bem conhecidas na técnica, tais como WO9913056 e US6245568 e referências ah, cujo inteiro conteúdo é por este meio incorporado por referência.

Em um aspecto, as VLPs são produzidas por técnicas de desmontagem e remontagem, que podem prover VLPs de papilomavírus mais estáveis e/ou homogêneas. Por exemplo, McCarthy et al., 1998, “Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Viruslike Particles in Vitro”, J. Virology 72(1):33-41, descreve a desmontagem e remontagem de VLPs de HPV 11 de LI recombinantes, purificadas de células de insetos, a fim de obter-se uma preparação homogênea de VLP’s. Os WO9913056 e US6245568 também descrevem processos de desmontagem/remontagem para produzir VLPs de HPV.

Em um aspecto, as VLPs de HPV da invenção são produzidas como descrito em WO 9913056 ou US6245568.

As VLPs da invenção podem ser combinadas com um adjuvante ou imunoestimulante, tal como mais não limitado a lipídeo A desintoxicado de qualquer fonte e derivados não-tóxicos de lipídeo A, saponinas e outros reagentes capazes de estimular uma resposta tipo TH1.

E há muito tempo sabido que o lipopolissacarídeo (LPS) enterobacteriano é um potente estimulador do sistema imune, embora seu uso em adjuvantes tenha sido encurtado por seus efeitos tóxicos. Um derivado não-tóxico de LPS, monofosforil lipídeo A (MPL), produzido por remoção do grupo carboidrato de núcleo e do fosfato da glicosamina de término reduzido, foi descrito por Ribi et al. (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, págs. 407 - 419) e tem a seguinte estrutura:

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Uma outra versão desintoxicada de MPL resulta da remoção da cadeia acila da posição-3 da cadeia principal dissacarídea e é chamada monofosforil lipídeo A 3-O-desacilado (3D-MPL). Ele pode ser purificado e preparado pelos métodos ensinados na GB 2122204B, cuja referência também 5 descreve a preparação de difosforil lipídeo A e suas variantes 3-0desaciladas.

Em um aspecto, o 3D-MPL é na forma de uma emulsão tendo um pequeno tamanho de partícula menor do que 0,2 pm de diâmetro e seu método de manufatura é descrito no WO 94/21292. Formulações aquosas 10 compreendendo monofosforil lipídeo A e um tensoativo foram descritas no WO 9843670A2.

Os adjuvantes derivados de lipopolissacarídeo bacteriano, a serem formulados nas composições da presente invenção, podem ser purificados e processados de fontes bacterianas ou, altemativamente, eles 15 podem ser sintéticos. Por exemplo, o monofosforil lipídeo A purificado é descrito em Ribi et al. 1986 (supra) e o monofosforil 3-O-desacilado ou derivado de difosforil lipídeo A derivado de Salmonella sp. é descrito em GB 2220211 e US 4912094. Outros lipopolissacarídeos sintéticos foram descritos (Hilgers et al., 1986, Int. Arch. Allergy Immunol., 79(4): 392-6; Hilgers et al.,

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1987, Immunology, 60(1): 141-6; e EP 0 549 074 Bl). Em um aspecto, o adjuvante de lipopolissacarídeo bacteriano é 3D-MPL.

Por conseguinte, os derivados de LPS, que podem ser usados na presente invenção, são aqueles imunoestimulantes que são de estrutura similar àquele de LPS ou MPL ou 3D-MPL. Em um aspecto da presente invenção, os derivados de LPS podem ser um monossacarídeo acilado, que é uma sub-parte da estrutura de MPL acima.

As saponinas são mostradas em: Lacaille-Dubois, M e Wagner

H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 págs. 363 - 386). As saponinas são glicosídeos esteróides ou triterpenos, largamente distribuídos nos reinos animais vegetal e marinho. As saponinas são observadas formarem soluções coloidais em água que espuma com agitação e para precipitar colesterol. Quando as saponinas estão próximas das membranas celulares, elas criam estruturas semelhantes a poros na membrana, que fazem com que a membrana estoure. A hemólise de eritrócitos é um exemplo deste fenômeno, que é uma propriedade de certas, porém não todas as saponinas.

As saponinas são conhecidas como adjuvantes em vacinas para administração sistêmica. A atividade adjuvante e hemolítica das saponinas individuais tem sido extensamente estudada na técnica (Lacaille-Dubois and Wagner, supra). Por exemplo, Quil A (derivado da casca da árvore sul americana Quillaja Saponaria Molina) e suas frações são descritos na US 5.057.540 e “Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1 - 55; e EP 0 362 279 Bl. Estruturas particulares, denominadas Immune Stimulating Complexos (ISCOMS), compreendendo frações de Quil A, são hemolíticos e têm sido usados na manufatura de vacinas (Morein, B., EP 0 109 942 Bl; WO 96/11711; WO 96/33739). As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (frações de Quil A purificadas por HPLC) foram descritas como potentes adjuvantes sistêmicos e

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 25/62 o método de sua produção é descrito na Patente US No. 5.057.540 e EP 0 362 279 Bl. Outras saponinas que foram usadas em estudos de vacinação sistêmica incluem aquelas derivadas de outras espécies de planta, tais como Gypsophila and Saponaria (Bomford et al., Vaccine, 10(9): 572 - 577,1992).

Um sistema aumentado envolve a combinação de um derivado de lipídeo A não-tóxico e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica, em que QS21 é extinto com colesterol, como descrito no WO 96/33739.

Em um aspecto, o adjuvante é uma formulação adjuvante particularmente potente, envolvendo QS21 e 3D-MPL em uma emulsão de óleo em água, e é descrito no WO 95/17210.

Por conseguinte, em uma forma de realização da presente invenção é provida uma composição auxiliada com lipídeo A desintoxicado ou um derivado não-tóxico de lipídeo A, mais preferivelmente auxiliado com um monofosforil lipídeo A ou seu derivado.

Em um aspecto, a composição adicionalmente compreende uma saponina, mais preferivelmente QS21.

Em um aspecto, a formulação auxiliada adicionalmente compreende uma emulsão de óleo em água. A presente invenção também fornece um método para produzir uma formulação de vacina, compreendendo misturar uma VLP da presente invenção junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL.

Componentes adicionais que são preferivelmente presentes em uma composição auxiliada de acordo com a presente invenção incluem detergentes não-iônicos, tais como os octoxinóis e polioxietileno ésteres como aqui descrito, particularmente t-octilfenóxi polietoxietanol (Triton X-100) e monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80); e sais biliares ou derivados do ácido cólico, como aqui descrito, em particular deoxicolato ou

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 26/62 taurodeoxicolato de sódio. Em um aspecto, a formulação adjuvante compreende 3D-MPL, Triton X-100, Tween 80 e dioxicolato de sódio, que podem ser combinados com uma VLP de HPV, para fornecer uma vacina adequada.

Em uma forma de realização da presente invenção, a composição compreende uma formulação adjuvante vesicular compreendendo colesterol, uma saponina e um derivado de LPS. A este respeito, a formulação adjuvante pode compreender uma vesícula unilaminar compreendendo colesterol, tendo uma bicamada lipídica adequadamente compreendendo dioleoil fosfatidil colina, em que a saponina e o derivado de LPS são associados com ou embutidos dentro da camada lipídica. Mais preferivelmente, estas formulações adjuvantes compreendem QS21 como a saponina e 3D-MPL como o derivado de LPS, em que a relação de QS21:colesterol é de 1:1 a 1:100 peso/peso e, muitíssimo preferivelmente, 1:5 peso/peso. Tais formulações adjuvantes são descritas em EP 0 822 831 B, cuja descrição é incorporada aqui por referência.

Em um aspecto, as composições da invenção são usadas em combinação com alumínio e são adequadamente adsorvidas ou parcialmente adsorvidas em adjuvantes de alumínio. Adequadamente, o adjuvante é um sal de alumínio, que em um aspecto é em combinação com 3D MPL, tal como fosfato de alumínio e 3D MPL. Em outro aspecto, o adjuvante é hidróxido de alumínio, opcionalmente em combinação com 3D MPL.

Em outro aspecto, a composição é a combinação de VLPs com um sal de alumínio ou com um sal de alumínio + 3D MPL. Em um aspecto da invenção, o sal de alumínio é hidróxido de alumínio.

A composição da invenção pode também compreender alumínio ou um composto de alumínio como um estabilizador.

A presente invenção geralmente refere-se a combinações de VLPs. Entretanto, é apreciado que o componente essencial da VLP seja uma

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 27/62 proteína Ll. As proteínas LI associam-se para formar pentâmeros (capsômeros) que então formam padrões mosaicos (reunem-se) para formar VLPs. Como tal, a presente invenção refere-se também a composições imunogênicas como descrito acima, compreendendo as proteínas Ll, ou capsômeros compreendendo proteínas Ll, em lugar das VLPs, como descrito aqui. Adequadamente, as proteínas Ll são capazes de estimular uma resposta imune protetora. Adequadamente, as proteínas Ll são conformacionalmente corretas.

Para evitar dúvida, a invenção assim também se refere ao uso de derivados Ll funcionais, como descrito acima, tais como truncados Ll, deleção, substituição ou mutantes de inserção e proteínas de fusão, adequadamente aquelas que são capazes de provocar uma resposta imune capaz de reconhecer um vírus HPV. Os capsômeros compreendendo tais proteínas são também incluídos na presente invenção. Os capsômeros como agentes imunogênicos são descritos, por exemplo, no WO 0204007. O WO 9901557 também descreve composições contendo capsômero de HPV. As proteínas, derivados e capsômeros de Ll podem ser usados da mesma maneira como descrito para os VLPs acima.

Assim, a invenção pode ser vista relacionar-se com uma composição imunogênica compreendendo uma proteína Ll, ou seu derivado funcional, de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose da proteína Ll, ou seu derivado, do pelo menos um outro tipo causador de câncer, é reduzida em relação àquela do HPV 16 ou 18.

Assim, a invenção pode ser vista relacionar-se com uma composição imunogênica compreendendo um capsômero de HPV de HPV 16 e 18 e pelo menos um outro tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 28/62 que a dose do capsômero do pelo menos um outro tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela do HPV 16 ou 18.

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma composição imunogênica, como examinado acima, em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Excipientes adequados são bem conhecidos na técnica e incluem tampões e água, por exemplo.

As composições e vacinas da invenção podem ser providas e supridas por qualquer uma de uma variedade de vias, tais como oral, tópica, subcutânea, mucosa (tipicamente intravaginal), intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, intradérmica e via supositório.

Em um aspecto da invenção, a composição ou vacina pode ser formulada ou co-administrada com um antígeno precoce de HPV, por exemplo, um antígeno selecionado da lista consistindo de HPV El, E2, E3, E4, E5, E6, E7 e E8. Em um aspecto alternativo, a vacina pode não ter um antígeno precoce de HPV, por exemplo, um antígeno selecionado a lista consistindo de HPV El, E2, E3, E4, E5, E6, E7 e E8.

Opcionalmente, a composição ou vacina pode também ser formulada ou co-administrada com antígenos não-HPV. Adequadamente, estes antígenos não-HPV podem prover proteção contra outras doenças, muitíssimo preferivelmente doenças sexualmente transmitidas, tais como vírus do herpes simplex, EBV, clamídia e HIV. Particularmente preferidos que a composição ou vacina compreenda gD ou um seu truncado de HSV, adequadamente um truncado de terminal C de HSV-2 conhecido como gD2t. Desta maneira, a composição ou vacina provê proteção contra tanto HPV como HSV.

A dosagem da composição ou componentes da vacina variará com a condição, sexo, idade e peso do indivíduo, a via de administração e o HPV da vacina. A quantidade pode também ser variada com o número de tipos de VLP. Adequadamente, o suprimento é de uma quantidade de vacina

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 29/62 adequada para gerar uma resposta imunologicamente protetora. Adequadamente, cada dose de vacina compreende de 1 - 100 pg de cada VLP, em um aspecto, 5-80 pg, em um outro aspecto 5 - 30 pg de cada VLP, em um outro aspecto, 5 - 20 pg de cada VLP, com ainda outros aspectos sendo especificamente 5 pg, 6 pg, 15 pg ou 20 pg.

Doses adequadas para uso em humanos tipicamente incluem 20 - 40 pg de VLPs de HPV 16 e HPV 18, com reduzidas doses dos outros tipos de câncer por HPV (31, 45, 52), como aqui descrito, adequadamente em um nível menor do que 20 pg por VLP, adequadamente em um nível que é capaz de provocar uma resposta imune protetora em pelo menos alguns indivíduos vacinados.

Outras doses adequadas para uso em humanos pode compreender quantidades menores de HPV 16 e/ou 18, desde que tais doses sejam protetoras de humanos, como pode ser estimado utilizando-se experimentos aqui resumidos. Tais doses podem ser apropriadas onde as VLPs da invenção sejam combinadas com adjuvantes fortes, por exemplo.

Em aspecto, a composição da invenção compreende 20 pg de HPV 16, 20 pg de HPV 18 e entre 5 - 18 pg de cada VLP do outro tipo causador de câncer (31, 45 ou 52), por exemplo, 5 - 15 pg e, em um outro aspecto, especificamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14 ou 15 pg de VLP de cada tipo causador de câncer de não-HPV 16/18.

Em um aspecto, a composição da invenção compreende 10 15 pg de HPV 16, 10 - 15 pg de HPV 18 e entre 5 - 9 pg de cada VLP do outro tipo causador de câncer (31, 45 ou 52) e em um aspecto especificamente 5, 6, 7, 8 ou 9 pg de VLP de cada tipo causador de câncer não-HPV 16/18.

Em um aspecto, a relação em peso de VLP de HPV 16 para VLP de tipo causador de câncer (31, 45, ou 52) é na faixa de 1:0,9 - 1: 0,1 (HPV 16: outro tipo), adequadamente na faixa de 1: 0,9 - 1: 0,3, adequadamente 1: 0,8 - 1: 0,4.

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 30/62

Em um aspecto, a relação em peso de VLP de HPV 18 para VLP de outro tipo causador de câncer (31, 45 ou 52) é de 1: 0,9 - 1: 0,1 (HPV 18: outro tipo), adequadamente na faixa de 1: 0,9 - 1: 0,3, adequadamente 1: 0,8-1:0,4.

Em outras palavras, uma dose reduzida é adequadamente de 10 - 90% da dose de VLPs de HPV 16 ou HPV 18 e, em um aspecto, é de 20 80 % da dose de VLPs de HPV 16 ou HPV 18, em um outro aspecto, de 30 70%, em ainda outro aspecto, de 30 - 60% e, especificamente, de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,70%, 80% ou 90% da dose de HPV 16 ou HPV 18.

Em um aspecto, a composição é adequadamente usada para evitar uma ou mais de: infecção por HPV-16 e/ou HPV-18, infecção persistente por HPV-16 e/ou HPV-18 e neoplasia cervical associada com HPV-16 e/ou HPV-18.

Adequadamente, o uso da composição imunogênica da invenção é feito para evitar neoplasia cervical e/ou infecção incidente e/ou infecção persistente associadas com infecção por outros tipos oncogênicos (não-HPV 16, 18).

Adequadamente, a composição imunogênica da invenção é usada na imunização ativa de adultos e adolescentes femininas da idade de 10 anos em diante. Para todas as composições e vacinas da invenção, a composição ou vacina é adequadamente usada para a vacinação de meninas adolescentes com a idade de 10 - 15, preferivelmente de 10 - 13 anos. A composição ou vacina pode também ser administrada a mulheres adultas mais velhas, em seguida a um esfregaço de Pap anormal ou após cirurgia em seguida à remoção de uma lesão causada por HPV ou que seja soronegativa e DNA negativa para tipos causadores de câncer por HPV. Mulheres de 10 - 55 anos são outro grupo alvo adequado. Em outro aspecto, a vacina pode ser usada em meninas e mulheres de todas as idades, de bebês para cima, e em um outro aspecto pode ser dada em meninos ou homens. Em um outro

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 31/62 aspecto, a vacina pode ser usada terapeuticamente em mulheres que são soropositivas para o vírus HPV.

Em um aspecto, a composição da invenção é usada para evitar ou tratar câncer cervical, ou estados doentios CIN 1, CIN II ou CIN III causados por infecção por HPV.

Em um aspecto, a vacina é suprida em um regime de 2 ou 3 doses, por exemplo, em um regime de 0, 1 mês, um regime de 0, 2 meses, um regime de 0, 2, 6 meses ou um regime de 0,1 e 6 meses, respectivamente. Adequadamente, o regime de vacinação incorpora uma injeção de reforço após 3 a 10 anos ou 5 - 10 anos, tal como preferivelmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 anos.

Em um aspecto, a composição ou vacina da invenção é uma formulação de vacina líquida, embora a vacina possa ser liofilizada e reconstituída antes da administração. As formulações tópicas, tais como cremes intravaginais, podem também ser usadas, por exemplo.

O ensinamento de todas as referências do presente pedido, incluindo pedidos de patente e patentes concedidas, é aqui totalmente incorporado por referência.

As composições e vacinas da invenção compreendem certos componentes de HPV como exposto acima. Em um outro aspecto da invenção, a vacina consiste essencialmente de ou consiste de ditos componentes.

A presente invenção é por este meio ilustrada por referência aos seguintes exemplos não-limitativos, relativos à proteção cruzada por VLPs de HPV 16 e HPV 18 e mostrando produção de VLPs de HPV: Exemplo 1

Mulheres saudáveis entre as idades de 15 e 25 anos foram imunizadas com uma mistura de VLPs de LI de HPV 16 e HPV 18. As mulheres do alistamento eram: 1) soronegativas para HPV-16 e HPV-18; 2)

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 32/62 negativas para infecção por HPV de alto risco da cerviz (detectada por PCR de HPV); 3) tiveram 6 ou menos parceiros sexuais durante a vida e 4) tinham esfregaços PAP normais.

A mistura consistiu, por dose de 0,5 ml, de 20 pg de VLP de LI de HPV-16, 20 pg de VLP de LI de HPV-18 e foi auxiliada com 500 pg de hidróxido de alumínio e 50 pg de 3D MPL. O grupo placebo foi injetado com 500 pg de hidróxido de alumínio apenas.

A eficácia da vacina (V.E.) contra tipos de HPV de câncer de alto risco foi estimada, em que a V.E. é a melhoria % de proteção contra infecção pela vacina, em comparação com um grupo placebo.

A proteção cruzada foi estimada detectando-se a presença de ácido nucléico específico para vários tipos oncogênicos das vacinas e grupo de controle. A detecção foi realizada usando-se técnicas como descritas no WO 03014402 e referências ah, particularmente para amplificação nãoespecífica de DNA de HPV e subseqüente detecção de tipos de DNA empregando-se um sistema LiPA, como descrito no WO 99/14377 e em Kleter et al., [Journal of Clinicai Microbiology (1999), 37 (8): 2508 - 2517], cujo inteiro conteúdo é incorporado aqui por referência.

Qualquer método adequado pode, entretanto, ser usado para a detecção do DNA HPV em uma amostra, tal como PCR específico de tipo, empregando-se iniciadores específicos para cada tipo de HPV de interesse. Iniciadores adequados são conhecidos daqueles hábeis na técnica ou podem ser facilmente construídos, visto que as seqüências dos tipos de HPV oncogênicos são conhecidas.

A eficácia da vacina foi estimada contra infecções para todos os 12 tipos de câncer de alto risco, tipos relacionados com a filogenética de HPV-16 (os grupos de: 31, 35 e 58; 31, 33, 35, 52 e 58) e tipos relacionados com a filogenética de HPV-18 (45 e 59).

Uma análise inicial foi realizada em um “ITT” (coorte de

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 33/62 intenção de tratar, representando todos os indivíduos que receberam pelo menos uma dose da vacina). Estes dados são mostrados na Tabela 1.

Os resultados apresentados na Tabela 2 e 3 relacionam-se com o grupo “ATP” (de acordo com o protocolo) para aqueles pacientes que satisfizeram todos os critérios dos experimentos. A Tabela 2 é uma análise do ponto médio com dados retirados de todos os pacientes no ponto de tempo em que pelo menos 50% do corte eram 18 meses após sua primeira vacinação. A Tabela 3 dá os resultados finais, todos os dados sendo de indivíduos a 18 meses pós primeira vacinação (mês 0). No grupo ATP, todos os pacientes receberam 3 doses de vacina a 0, 1 e 6 meses e eram soronegativos a 6 meses.

Como demonstrado pelos dados apresentados na Tabela 1, a imunização com uma mistura de VLPs de HPV 16 e HPV 18 forneceu proteção cruzada evidente contra outros tipos de HPV. Neste ponto, os tamanhos das amostras são demasiados pequenos para fornecer uma análise estatística rigorosa, os dados, entretanto, demonstram uma tendência positiva e sugerem que a imunização com VLPs de HPV 16 e HPV 18 será eficaz contra infecção com outros tipos de HPV.

Isto foi confirmado à medida que o estudo prosseguia.

Detalhes do protocolo são descritos ainda no Exemplo 3.

A Tabela 2 demonstra que o HPV 16 e HPV 18 fornecem proteção cruzada estatisticamente significativa contra o grupo de câncer de alto risco 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

A Tabela 3 demonstra que, exceto para os tipos relacionados com HPV-18 (que mostram uma tendência muito forte), existe proteção cruzada estatisticamente significativa contra os grupos de: HPV 31, 35, 58; HPV 31, 33, 35, 52, 58; e os 12 tipos de alto risco (não HPV-16/18) avaliados.

Análise posterior dos dados experimentais indicou que a vacina de HPV 16 e 18 combinados, usada nos Exemplos 1, fornece proteção

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 34/62 cruzada estatisticamente significativa contra infecção incidente estatística por HPV 31 (eficácia da vacina 75,1%, p = 0,007). Embora o tamanho da amostra não permita ainda que conclusões estatisticamente significativas sejam extraídas sobre outros tipos, os dados sobre os outros tipos, tais como 39, 45, 5 51 e 52, demonstram uma tendência positiva e sugerem que a imunização com VLPs de HPV 16 e HPV 18 será eficaz contra infecção com outros tipos de HPV.

Os dados apresentados no Exemplo 3 fornecem mais dados obtidos no mesmo estudo e concentram-se na proteção cruzada provida contra 10 certos tipos específicos.

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 35/62 xf04

(X	0,127	0,252	0,309	0,086
95% limites de confiança limite superior	00	62,6	87,6	59,9
95% limites de confiança -limite inferior	σ? <N 1	-29,7	-97,7	-6,5
% eficácia vacina 1 - (A/B) x 100, ajustado para tamanho relativo de vacina e grupo placebo	w?	30,3	50,6	34,6
% mulheres infectadas (grupo placebo) = B	οΓ	in	cn	σ?
Número de mulheres infectadas (grupo placebo)	ι-H	24		40
% mulheres infectadas (grupo de vacina) = A		3,8	o'	6,3
Número de mulheres infectadas (grupo vacina)			cn	27
Tipos HPV analisados	HPV 31, 35, 58	00 of νγ uri cn cri cn cn 1	HPV 45, 59	00 'n.cri ^00' cn m 'n.sd κι r or ir>

cú

CZ5

O

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 36/62

CN

C3	valor-p	0,060	0,052	0,223	0,012	0,019	0,001
c • Q
>			\o		O\
U	^t	O\ <n	^t	68.	O\ <n	55.

'cá Q Ití w	95%	0,2	\q	-27,9	00 cn	O σ?	γ

		49,4	37,0	42,9	cs 00 Ν’	39,3	39,6	N = número de indivíduos em coorte específico
Taxa de Ataque	Placebo	AR	5,5	O\ o”	3,6	σ?	CN cn	22,8
	24	46	\o		56	00 00
	438	423	449	438	423	386
Vacina	AR	2,8	O\ \d	2,0	4,9	8,0	00^ cn
	CS	29	O\	cs	34	53
	433	423	442	433	423	385
Tipo de Infecção	HPV-16 relacionado	HPV-16 relacionado*	HPV -18 relacionado	HPV-16/18 relacionado	HPV-16/18 relacionado*	Alto Risco**

o CN

CO

ο

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 38/62 <N

Η

Λ ω

	0,012 \|	0,015	0,319 \|	0,002
95% de limites de confiança limite superior	78,9 \|	63,5	69,8 \|	53,6
95% de limites de confiança limite inferior	15,9 \|	o‘n	cn \d T	16,2
% eficácia vacina, 1 - (A/B) x 100, ajustado para tamanho relativo de grupo de vacina e placebo	57,9 \|	43,0	33,5 \|	rrcn
% de mulheres infectadas (grupo placebo) = B	6,3 \|	12,2	3,6 \|	25,3
Número de mulheres infectadas (grupo placebo)	26 \|	00	IT)	90
% mulheres infectadas (grupo vacina) = A	rí	6,9	(N	15,8
Número de mulheres infectadas (grupo vacina)		00 (N	o	00
Número total de número de indivíduos com informação disponível por grupo	(N	403	421 \|	368
Tipos HPV analisados	\| HPV 31,35,58 \|	HPV 31, 33, 35, 52, 58	\| HPV 45, 59 \|	HPV31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 39/62

Exemplo 2

As VLPs de HPV 16 e HPV 18 podem ser produzidas da seguinte maneira:

Exemplo 1

A combinação das VLPS de LI de HPV 16 e de HPV 18 é detalhada aqui. As proteínas de LI de outros genótipos HPV pode ser prontamente produzida por métodos similares, já conhecidos na técnica. A Preparação de VLPs de LI de HPV16/18

A produção de VLPs de HPV 16 e HPV 18 foi realizada utilizando-se protocolos padrão - por exemplo, vide WO 9913056. As proteínas HPV 16/18 foram expressas em células de Trichoplusia ni (High Eive™) (em uma densidade de -350.000 células/ml) infectadas com Baculovírus recombinante (MOI de 0,3) codificando o gene de interesse LI HPV 16 ou 18. As células foram colhidas aproximadamente 72 horas pós infecção.

4.1 B Coleta de Célula / extração de antígeno

O antígeno (Ll-16/18) foi extraído de células Hi5 em um processo de três etapas de concentração, extração, clarificação. A etapa de concentração remove até 90% do meio de cultura e foi realizada por filtragem de fluxo tangencial. A etapa de extração foi realizada com um tampão hipotônico (Tris 20mM, pH 8,5). Um volume igual ao volume da cultura foi usado para realizar a extração. Um tempo de contato de no mínimo meia-hora sob agitação suave foi usado. A clarificação foi realizada por filtragem de fluxo tangencial.

C Purificação

O processo de purificação foi realizado em temperatura ambiente, β-mercaptoetanol (4% p/p) foi adicionado ao extrato, a fim de desmontar as VLPs em capsômeros, para ambos antígenos, Ll-16/18. Glicerol foi adicionado até uma concentração de p/p 10% precisamente antes da adição

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 40/62 de β-mercaptoetanol.

Todos os tampões usados foram filtrados em filtros de 0,22 pm antes da armazenagem a 2°C - 8°C. Antes de cada realização de purificação, as matrizes de gel são sanitizadas e equilibradas com apropriado tampão antes de carga da amostra.

Os regimes de purificação são fornecidos para a purificação separada de LI de tanto HPV 16 como 18. Estes esquemas são amplamente similares e envolvem as etapas de:

Cromatografia de troca aniônica (Di metil amino etil DMAE),

Cromatografia de troca aniônica (tri metil amino etil TMAE),

Cromatografia de hidroxiapatita,

Filtragem nanométrica (Planova),

Ultrafiltragem,

Cromatografia de interação hidrofóbica (empregando-se Octil Sefarose) pra HPV 18 ou Cromatrografia de troca aniônica (DEAE) para HPV 16; e

Filtragem estéril.

4.1.1 Especificamente:

4.1.2 Cl Purificação de antigeno Ll-18

4.1.2.1 Cromatografia de troca aniônica DMAE

O extrato clarificado (proteína em uma concentração de ~ 1 g/ml, com a proteína LI a -150 mg/ml) é aplicado a uma coluna de troca aniônica (Di Metil Amino Etil). Eluição é realizada com tampão (Tris 20 mM I NaCl 200 mM I 4% β-mercaptoetanol BME), pH 7,9 ± 0,2. O antigeno é eluído em aproximadamente 5 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorado a 280 nm.

4.2.2.2 Cromatografia de troca aniônica TMAE

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 41/62

O eluído da primeira etapa é diluído com 1 volume de H2O/BME 4%. O eluído diluído é então aplicado a uma segunda coluna de troca aniônica (Tri Metil Amino Etil). A eluição é realizada com tampão (20 mM Tris I NaCl 200 mM I 4% BME), pH 7,9 ± 0,2. O antígeno é eluído em aproximadamente 4 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorado a 280 nm.

4.1.2.3 Cromatografia de hidroxiapatita

O eluído da etapa TMAE é aplicado a uma coluna de hidroxiapatita (HA). Após aplicação da amostra, o gel é eluído com aproximadamente 2,5 volumes de coluna de tampão (NaH2PO₄ 100 mM I NaCl 30 mM I 4% BME), pH 6,0 ± 0,2.

4.1.2.4 Filtragem nanométrica (Planova)

O eluído de HA é diluído a fim de alcançar as seguintes condições: tampão (NaH2PO₄ 25 Mm I nAcL 10 mM I 4% BME), pH 7,5 ± 0,2.

Em seguida é filtrado sucessivamente em um pré-filtro de 0,2 pm e em um filtro Planova 15N de 0,12 m². A filtragem é realizada em constante pressão de 200 mbar ± 20 mbar.

4.1.2.5 Ultrafiltragem

A ultrafiltragem é realizada com um sistema de ultrafiltragem de fluxo tangencial, equipado com membranas de polietersulfona (cassete Centramate 0,1 m², 100 kD).

O eluído da Planova é tratado para alcançar as seguintes condições: (NaH₂PO₄ 100 mM I NaCl 30 mM I 4% BME), Ph 6,0 ± 0,2; em seguida é carregado no sistema, concentrado 5 vezes e dia-filtrado com contínua injeção de ~10 volumes de partida de tampão (NaH2PO₄ 20 mM I NaCl 500 mM), pH 6,0 ± 0,2.

4.1.2.6 Cromatografia de interação hidrofóbica (Octil Sefarose)

O permeado de ultrafiltragem é aplicado em uma coluna de

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 42/62

Octil Sefarose.

Esta etapa de cromatografia é realizada no modo negativo com aproximadamente 5 volumes de coluna de tampão (Na₃PO4 20 mM I NaCl 500 mm), pH 6,0 ± 0,2.

4.1.2.7 Filtragem Estéril

A solução de antígeno Ll-18 purificada é esterilizada por filtragem em uma membrana de 0,22 pm.

4.1.3

4.1.4 C2 Purificação de antígeno Ll-16

4.1.4.1 Cromatografia de troca aniônica DMAE

O extrato clarificado é aplicado a uma coluna de troca aniônica (Di Metil Amino Etil). A eluição é realizada com tampão (Tris 20 mM I NaCl 180 mM I 4% BME), pH 7,9 ± 0,2. O antígeno é eluído em aproximadamente 4 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorado a 280 nm.

4.1.4.2 Cromatografia de troca aniônica TMAE

O eluído da primeira etapa é diluído com 1 volume de H2O/BME 4%. O eluído é então aplicado a uma segunda coluna de troca aniônica (Tri Metil Amino Etil). A eluição é realizada com tampão (20 mM Tris I NaCl 180 mM I 4% BME), ph 7,9 ± 0,2. O antígeno é eluído em aproximadamente 5 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorado a 280 nm.

4.1.4.3 Cromatografia de hidroxiapatita (HA)

O eluído da etapa TMAE é aplicado a uma coluna HA. Após a aplicação da amostra, o gel é eluído com aproximadamente 3 volumes de coluna de tampão (NaH2PO4 100 mm I NaCl 30 mM I 4% BME), ph 6,0 ± 0,2.

4.1.4.4 Filtragem nanométrica (Planova)

O eluído HA é diluído a fim de alcançar as seguintes condições: tampão (NaH2PO4 25 mM I NaCl 10 mM I 4% BME), pH 7,5 ± 0,2. Em seguida é filtrado sucessivamente em um pré-filtro de 0,2 pm e em

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 43/62 um filtro 15N Planova de 0,12 m². A filtragem é realizada em constante pressão de 200 mbar ± 20 mbar.

4.1.4.5 Ultrafiltragem

A ultrafiltragem é realizada com um sistema de ultrafiltragem de fluxo tangencial (cassete Centramate 0,1 m², 100 kD). O eluído Planova é tratado para alcançar as seguintes condições: (NaH^PCL 100 mM I NaCl 30 mM I 4% BME), ph 6,0 ± 0,2; em seguida é isolado no sistema, concentrado 5 vezes e dia-filtrado com injeção contínua de ~10 volumes de partida de tampão (NaH₂PO₄ 20 mM I NaCl 500 mM), pH 6,0 ± 0,2.

4.1.4.6 Cromatografia de troca aniônica DEAE

O eluído de ultrafiltragem é ajustado à condutividade do tampão de equilíbrio, (NagPCL 20 Mm I NaCl 250 mM), pH 6,0 ± 0,2 e aplicado em uma coluna de troca aniônica (Di Etil Amino Etil).

A eluição é realizada com tampão (NaH₂PO4 20 mM I NaCl 500 mM), pH 6,0 ± 0,2. O antígeno é eluído em aproximadamente 3 volumes de coluna e o perfil de eluição é monitorado a 280 nm.

4.1.4.7 Filtragem estéril

A solução de antígeno Ll-16 purificada é esterilizada em uma membrana de 0,22 pm.

C3

Cada tipo de VLP é adsorvida independentemente para produzir um monovalente adsorvido concentrado.

Preparação de monovalente adsorvido concentrado VLP16:

pg de VLPs purificadas de HPV16 são adsorvidos em 150 pg Al³⁺ de A1(OH)3, em um pH de 6,0 ± 0,2, por uma hora em temperatura ambiente com suave agitação. Este monovalente adsorvido concentrado é armazenado a + 4°C. A adsorção é verificada centrifugando-se a preparação e quantificando-se as VLPs do sobrenadante.

Preparação de monovalente adsorvido concentrado VLP 18:

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 44/62 pg de VLPs purificadas de HPV 18 são adsorvidos em 150 pg Al³⁺ de Α1(ΟΗ)₃, em um pH de 6,0 ± 0,2, por uma hora em temperatura ambiente com suave agitação. Este mono valente adsorvido concentrado é armazenado a +4°C. A adsorção é verificada centrifugando-se a preparação e quantificando-se as VLPs do sobrenadante.

D Preparação de Vacina Final:

Os monovalentes adsorvidos concentrados, preparados pelo método acima, podem ser combinados para formar uma suspensão contendo 20 pg de cada VLP por dose. A vacina final é armazenada a + 4°C.

A adição das VLPs de outros tipos causadores de câncer pode ser feita como apropriado, em concentração adequada, de acordo com a presente invenção. As seqüências de tais tipos são bem conhecidas na técnica e as VLPs compreendendo tais proteínas podem ser prontamente expressas pela pessoa hábil.

Os volumes adsorvidos combinados, ou volumes adsorvidos individuais, podem ser ainda misturados com adjuvantes, tais como 3D-MPL. Exemplo 3

Detalhes precisos do experimento realizado são providos em Harper et al., the Lancet. 13 de novembro de 2004; 364 (9447):1757-65.

Em resumo, mulheres saudáveis entre as idades de 15 e 25 anos foram imunizadas com uma mistura de VLPs de LI de HPV 16 e HPV 18. As mulheres no alistamento foram: 1) soronegativas para HPV-16 e HPV18; 2) negativas para infecção por HPV de alto risco da cerviz (detectada por PCR HPV); 3) tiveram 6 ou menos parceiros sexuais durante a vida e 4) tiveram esfregaços PAP normais.

A mistura consistiu, por 0,5 ml de dose, 20 pg de VLP de LI HPV-16, 20 pg de VLP de LI de HPV-18 e foi auxiliada com 50 pg de hidróxido de alumínio e 50 pg de MPL 3D. O grupo placebo foi injetado com 500 pg de hidróxido de alumínio apenas.

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 45/62

As VLPs de HPV 16 consistem de um 471 amino ácidos, proteína LI de HPV terminalmente truncada C, com uma deleção de 34 amino ácidos. As VLPs de HPV 18 consistem de uma proteína de LI de HPV de 472 amino ácidos terminalmente truncados C, com uma deleção de 35 amino ácidos.

A eficácia da vacina (V.E.) contra certos tipos de HPV causadores de câncer foi estimada, em que a V.E. é a % de melhoria na proteção contra infecção pela vacina, em comparação com um grupo placebo.

A proteção cruzada foi avaliada detectando-se a presença de ácido nucléico específico para vários tipos oncogênicos das vacinas e grupo de controle. A detecção foi realizada empregando-se técnicas como descritas em WO 03014402 e referências ali, particularmente para amplificação nãoespecífica de DNA de HPV e subseqüente detecção de tipos de DNA, empregando-se um sistema LiPA, como descrito no WO 99/14377 e em Kleter et al. [Joumal of Clinicai Microbiology (1999), 37 (8): 2508-2517], cujo inteiro teor é aqui especificamente incorporado por referência.

Qualquer método adequado pode, entretanto, ser usado para a detecção do DNA de HPV em uma amostra, tal como um PCR específico de tipo, utilizando-se iniciadores específicos para cada tipo de HPV de interesse. Iniciadores adequados são conhecidos da pessoa hábil ou podem ser facilmente construídos, dado que as seqüências dos tipos de HPV oncogênicos são conhecidas.

Em detalhe, a seção de métodos do documento de Lancet é reproduzida aqui abaixo, para completação:

Harper et al., the Lancet. 13 Novembro de 2004; 364 (9447): 1757-65 detalhes experimentais.

O objetivo primário deste estudo foi avaliar a eficácia da vacina na prevenção de infecção com HPV-16, HPV-18, ou ambos (HPV16/18), entre os meses 6 e 18 nos principiantes que mostraram inicialmente

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 46/62 serem soronegativos para HPV-16/18 por ELISA e negativos pra DNA HPV16/18 por PCR. Os objetivos secundários incluíram: avaliação da eficácia da vacina na prevenção de infecção persistente com HPV-16/18 e a avaliação da eficácia da vacina na prevenção de lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), citologicamente confirmadas, lesões intraepiteliais escamosos de alto grau (HSIL) e LSIL (CIN 1) histologicamente confirmadas, câncer de célula escamosa HSIL (CIN 2 ou 3) ou adenocarcinoma associado com infecção por HPV-16/18 entre os meses 6 e 18 e meses 6 e 27. A prevenção de citologia de células escamosas atípicas de significância indeterminada (ASCUS), associada com infecção por HPV-16/18, foi adicionada post-hoc para análises resultantes.

Fizemos também uma análise exploratória dos pontos finais histopatológicos CIN 1 e 2, associados com DNA HPV-16/18 detectado por CPC em tecido lesional. Outros objetivos incluíram a estimativa da imunogenicidade, segurança e tolerabilidade da vacina.

Investigadores da América do Norte (Canadá e os USA) e Brasil recrutaram mulheres para este estudo de eficácia, através de anúncios ou participação prévia em um estudo de epidemiologia de secção-transversal de HPV, que ocorreu entre julho e dezembro de 2000.

Para cada um dos 32 locais de estudo, uma junta de recapitulação institucional aprovou o protocolo, formas de consentimento e aperfeiçoamentos. As mulheres assinaram consentimentos escritos separados para participação no estudo e colposcopia. Para aquelas abaixo de 18 anos, consentimento dos pais e assentimento da participante foram obrigatórios.

Houve duas fases de estudo: uma fase inicial para vacinação e acompanhamento, que foram concluídas no mês 18; e uma fase de extensão de acompanhamento cega, que foi concluída no mês 27.

As mulheres elegíveis para a fase inicial (meses 0-18) incluíram mulheres saudáveis com a idade de 15 - 25 anos, que tinha tido não

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 47/62 mais do que seis parceiros sexuais, nenhuma história de um teste Pap anormal ou tratamento ablativo ou excisional da cerviz e nenhum tratamento em andamento para condilomas externos; e que eram citologicamente negativas, soronegativas para anticorpos de HPV-16 e HPV-18 por ELISA e negativasDNA-HPV por PCR para 14 tipos de HPV de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68), não mais do que 90 dias antes da entrada do estudo.

As mulheres que completaram a fase inicial do estudo mais cedo e que não tiveram terapia ablativa ou excisional da cerviz, ou hiterectomia após alistamento, foram elegíveis para participar da fase de extensão do estudo (meses 18 - 27).

Procedimentos

Cada dose da vacina de partículas semelhantes a vírus de HPV-16/18 bivalente (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Bélgica) continha 20 pg de partículas semelhantes a vírus de LI HPV-16 e 20 pg de partícula semelhante a vírus LI HPV-18. Cada tipo de partícula semelhante a vírus foi produzida em substrato de célula de Spodoptera frugiperda Sf-9 e Trichoplusia ni HI-5, com adjuvante AS04 contendo 500 pg de hidróxido de alumínio e 50 pg de monofosforil lipídeo A 3-desacilado (MPL, Corixa, Montana USA), fornecido em um frasco de monodose. O placebo continha 500 pg de hidróxido de alumínio por dose e era de aparência idêntica à vacina HPV-16/18. Cada participante do estudo recebeu uma dose de 0,5 ml de vacina ou placebo a 0 mês, 1 mês e 6 meses.

Os provedores de cuidados da saúde obtiveram espécimes cervicais com uma escova e espátula cervicais (lavados em PreservCyt, Cytyc Corporation, Boxborough, MA, USA) para teste de citologia e DNA HPV na seleção e meses 6, 12 e 18. Nos meses 0 e 6 e, subseqüentemente a cada 3 meses, as mulheres auto-obtiveram amostras cervicovaginais com dois esfregões seqüenciais (colocados em PreservCyt) para teste de DNA HPV

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 48/62 [DM Harper, WW Noll, DR Belloni and BF. Cole, Randomized clinicai trial of PCR-determined human papillomavirus detection methods: self-sampling versus clinician-directed-biologic concordance and women's preferences. Am J Obstet Gynecol 186 (2002), pp. 365-373]. Um laboratório central (Quest Diagnostics, Teterboro, NJ, USA) informou os resultados das citologias (ThinPrep, Cytyc Corporation) pelo uso do sistema de classificação Bethesda 1991.

As diretrizes de protocolo recomendaram colposcopia após dois relatórios de ASCUS ou um relatório de células glandulares atípicas de significância indeterminada, LSIL ou HSIL, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma in situ ou adenocarcinoma. Estas diretrizes também recomendarem biópsia para quaisquer lesões suspeitas.

O laboratório de histologia central preparou um diagnóstico inicial dos espécimes de tecido fixados com formalina para controle clínico. Um painel de três patologistas fez um subseqüente diagnóstico consensual para lesões associadas com HPV-16 e HPV-18 com o sistema CIN. Este diagnóstico de consenso também incluiu recapitulação das seções retiradas na ocasião da microdissecação para detecção PCR de DNA HPV lesional.

O DNA HPV isolado do espécime de citologia (MagNaPure Total Nucleic Acid System, Roche Diagnostics, Almere, Netheriands) e do espécime de biópsia cervical (extração de proteinase K) foi amplificado de uma alíquota de DNA total purificado com os iniciadores de largo espectro SPF10, que amplificam uma região de 65 pb do gene LI [ B Kleter, LJ van Doom, J ter Schegget et al., Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 153 (1998), pp. 1731-1739: LJ van Doom, W Quint, B Kleter et al., Genotyping of human papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY fine blot assay and the SPF(10) fine probe assay. J Clin Microbiol 40 (2002), pp. 979-983 e WG Quint, G Scholte, LJ van Doom,

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 49/62

B Kleter, PH Smits and J. Lindeman, Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF(IO) PCR and HPV genotyping. J Pathol 194 (2001), pp. 51-58]. Os produtos de amplificação foram detectados por um imunoensaio de enzima de

DNA. O ensaio de sonda de linhagem (ensaio de genotipagem LiPA Kit HPV INNO LiPA HPV, versão de sistema 1 SPF-10, Innogenetics, Gent, Bélgica, manufaturado por Labo Bio-medical Products, Rijswijk, Países Baixos) detectou 25 genótipos de HPV (6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, e 74) [B Kleter, LJ van Doom, L 10 Schrauwen et al., Development and clinicai evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37 (1999), pp. 25082517]. Qualquer espécime que era positivo por imunoensaio de enzima de DNA foi testado por PCR de HPV-16 e HPV-18 específico de tipo. Os 15 iniciadores de PCR específicos de tipo de HPV-16 amplificaram um segmento de 92 pb do gene E6/E7 e iniciadores PCR específicos de tipo HPV-18 amplificaram um segmento de 126 pb do gene Ll. [MF Baay, WG Quint, J Koudstaal et al., Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin20 embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 34 (1996), pp. 745-747].

Definimos infecção cervical incidente com HPV-16/18 como pelo menos um resultado PCR positivo para HPV-16 ou HPV-18 durante o experimento e persistente infecção com HPV-16/18 como pelo menos dois ensaios PCR DNA-HPV positivos para o mesmo genótipo viral separado por 25 pelo menos 6 meses [H Richardson, G Kelsall, P Tellier et al., The natural history of type-specific human papillomavirus infections in female university students. Câncer Epidemiol Biomarkers Prev 12 (2003), pp. 485-490 e AB Moscicki, JH Ellenberg, S Farhat e J. Xu, Persistence of human papillomavirus infection in HlV-infected and - uninfected adolescent girls:

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 50/62 risk factors and differences, by phylogenetic type. J Infect Dis 190 (2004), pp. 37-45]. Os resultados de teste de DNA-HPV foram cancelados pelos investigadores durante o estudo e os diagnósticos citológicos e histológicos foram somente revelados para fins de controle clínico. As análises incluíram resultados de DNA HPV-16/18 para espécimes cervicais e espécimes cervicais e cervicovaginais combinados auto obtidos.

Coletamos soro dos participantes do estudo nos meses 0, 1, 6, 7, 12 e 18 para avaliação da imunogenicidade. O teste sorológico para os anticorpos para partículas semelhantes a vírus de HPV-16 e HPV-18 foi por ELISA. As partículas semelhantes a vírus de HPV-16 E HPV-18 recombinantes foram usadas como antígenos de revestimento para detecção de anticorpo (vide apendiceweb http://image.

thelancet.com/extras/04art 10103webappendix.pdf). A soropositividade foi definida como um título maior do que ou igual ao título de corte do ensaio estabelecido em 8 unidades ELISA/ml para HPV-16 e 7 unidades ELISA/ml para HPV-18. Títulos naturais típicos foram determinados pelo uso de amostras de sangue obtidas de mulheres do estudo de epidemiologia precedente, que foram constatadas serem soropositivas para HPV-16 ou HPV18 por ELISA.

As mulheres registraram os sintomas experimentados durante os primeiros 7 dias após vacinação em cartões diários com uma escala de três graus de intensidade do sintoma. Adicionalmente, elas informaram ao pessoal de estudo em entrevista todos os eventos adversos dentro dos primeiros 30 dias após vacinação. Informações sobre eventos adversos sérios e gravidez foram coletados por todo o estudo.

Métodos Estatísticos

Presumindo-se uma taxa de incidência cumulativa de 6% de ambas as infecções tipo HPV-16 e HPV-18 durante 12 meses, estimamos que 500 mulheres por grupo de tratamento forneceríam 80% capacidade de 80%

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 51/62 para estimar um limite inferior de Cl de 95% de eficácia da vacina acima de zero. Presumimos uma taxa de retenção de 80% durante 18 meses. Análises interinas quanto à eficácia, segurança e imunogenicidade foram realizadas para fins de planejamento de estudo fruto somente; o método de CTBrien and Fleming foi usado para ajustar o valor para a análise final após análises interinas ocorridas (total = 0,05; teste de dois lados) [ PC O'Brien e TR. Fleming, A multiple testing procedure for clinicai trials. Biometrics 35 (1979), pp. 549-556].

Aleatorização de bloco, estratificada, de acordo com algoritmos validados, foi centralizada com um sistema de aleatorização da internet. A estratificação foi de acordo com a idade (15-17, 18-21, e 22-25 anos) e região (América do Norte e Brasil). A cada dose de vacina foi atribuído um número escolhido aleatoriamente, baseado em informação de participante específica, introduzida no sistema de aleatorização computadorizada pelo pessoal do estudo. A alocação de tratamento permanece escondida dos investigadores e das mulheres participantes de um estudo de acompanhamento de longo-termo.

Os coortes de intenção-de-tratar e de-acordo-com-o-protocolo são mostrados na figura, em que as razões para a exclusão das análises são listadas em ordem de classificação; as mulheres que atenderam a mais do que um critério de exclusão foram somente contadas uma vez, de acordo com os mais elevados critérios de classificação. Referimos aos conjuntos de participantes introduzidos nas análises de intenção-de-tratar e de-acordo-como-protocolo como coortes, embora a informação usada para restringir a inclusão do indivíduo no de-acordo-com-o-protocolo foi somente conhecida após o acompanhamento.

Fizemos análises tanto de-acordo-com-o-protocolo como comintenção-de-tratar para eficácia. O cálculo da eficácia da vacina na análise deacordo-com-o-protocolo de 18-meses foi baseado na proporção de

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 52/62 participantes com infecção por HPV-16/18 nos grupos vacinados versus placebo. A eficácia da vacina foi definida como 1 menos a relação entre estas duas proporções; 95% das CIs mediram a precisão das estimativas de eficácia. Os valores p foram calculados com o teste exato de Fisher de dois lados.

Taxas correspondentes foram expressas como os números de casos com o resultado dividido pelos números de participantes sob risco. O coorte de 18meses de-acordo-com-o-protocolo incluiu mulheres alistadas que receberam três doses programadas de vacina e satisfizeram o protocolo como descrito na figura.

O cálculo da eficácia da vacina nas análises de intenção-detratar e de-acordo-com-o-protocolo de 27-meses foi baseado no modelo de risco proporcional de Cox, empregando-se o tempo-para-ocorrência dos casos com infecção por HPV-16/18 dos grupos vacinado versus placebo. Isto permitiu o controle para os dados de tempo de pessoa acumulados de cada 15 grupo. A eficácia da vacina foi calculada utilizando-se 1 menos a relação de risco e os valores p calculados usando-se o teste de classificação log. As taxas correspondentes foram expressas como o número de casos dividido pelo tempo-pessoa total. Todas as mulheres alistadas, que receberam pelo menos uma dose de vacina ou placebo, que eram negativas para DNA-HPV de alto 20 risco no mês 0 e tinham quaisquer dados disponíveis para medição do resultado, foram incluídas no coorte de intenção-de-tratar. O coorte deacordo-com-o-protocolo de 27 meses incluiu resultados do coorte de-acordocom-o-protocolo de 18 meses e resultados que ocorreram durante a fase de extensão (de 18 meses a 27 meses).

O cálculo dos valores p para a análise de segurança foi realizado utilizando-se comparações de teste exatos de Fisher. O coorte para análise de segurança incluiu todas as mulheres alistadas, que receberam pelo menos uma dose de vacina ou placebo e satisfizeram as exigências mínimas de protocolo especificadas (vide figura abaixo).

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A imunogenicidade foi avaliada em um subconjunto do coorte de segurança de-acordo-com-o-protocolo, que incluiu mulheres com resultados de sorologia nos meses 0, 7 e 18, que receberam todas três doses de vacina de estudo ou placebo de acordo com o programa, satisfizeram o programa de amostragem de sangue e não se tomaram positivas para DNAHPV-16/18 durante o experimento. As taxas de soropositividade entre os grupos de vacina e placebo foram comparados com o teste exato de Fisher (p < 0,001 julgado significativo). Títulos médios geométricos foram comparados com ANOVA e teste Kruskal-Wallis.

A aleatorização de bloco e análises estatísticas foram realizadas com SAS versão 8.2 (SAS Institute, Cary, North Carolina).

Resultados

Os resultados da análise inicial sobre a proteção cruzada são apresentados no pedido de patente WO2004/056389, cujo inteiro conteúdo é aqui incorporado por referência.

Análise adicional

Uma análise foi realizada em um grupo “ATP” (de-acordocom-o-protocolo) para aqueles pacientes que atenderam a todos os critérios do experimento. No grupo ATP todos os pacientes receberam 3 doses de vacina a 0, 1 e 6 meses e eram soronegativo a 6 meses.

Como demonstrado pelos dados apresentados na Tabela 4, imunização com uma mistura de VLPs de HPV 16 e HPV 18 forneceu proteção cruzada estatisticamente significativa contra infecção incidente por HPV tipos 31, 52 e 45, em comparação com o controle.

Proteção cruzada estatisticamente significativa contra infecção incidente foi também observada contra o grupo de todos os tipos relacionados com HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 e 58) e o grupo de todos os tipos de alto risco, excluindo 16 e 18 (HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68).

Proteção cruzada estatisticamente significativa contra infecção

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 55/62 persistente foi também observada contra os tipos 31 e 52 (vide tabela 5) e foi também observada contra o grupo de todos tipos relacionados com HPV 16 (vide Tabela 5).

Proteção cruzada estatisticamente significativa foi também 5 observada contra anormalidades citológicas associadas com HPV 52, vide tabela 6. Proteção estatisticamente significativa foi também observada contra anormalidades citológicas associadas com o grupo de todos os tipos relacionados com HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 e 58) e o grupo de todos os tipos de alto risco, excluindo 16 e 18 (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 10 e 68).

Tabela 4

Eficácia contra Infecções Incidentes com Tipos Relacionados 16/18 f

relacionados k

relacionados

Tipo HPV	Vacina	Controle	Eficácia Vacina
	N	AR	N	AR	%	Valor P
HPV-31	1	0,2	10	2,4	90,0	0,006
HPV-33	6	1,4	6	1,4	-0,2	1,000
HPV-3 5	1	0,2	3	0,7	66,5	0,624
HPV-52	6	1,4	16	3,9	63,0	0,031
HPV-5 8	5	1,2	5	1,2	0,0	1,000
HPV-45	0	0,0	5	1,2	100,0	0,031
HPV-59	4	0,9	2	0,5	-100,5	0,448

Todos 16 relacionados	16	4,0	32	Ã.l	51,1	0,017
Todos 18 relacionados	4	1,0	7	1,7	43,0	0,384
Todos HE (exceto 16/18)	32	9,0	53	15,6	42,3	0,011

* Amostras cervicais: coorte ATP.

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 56/62

Tabela 5 f

relacionados relacionados *

Tipo HPV	Vacina	Controle	Eficácia Vacina
	N	AR	N	AR	%	Valor P
HPV-31	2	0,48	9	2,15	78,5	0,030
HPV-33	3	0,71	5	1,18	40,2	0,476
HPV-35	1	0,24	1	0,24	0,4	0,998
HPV-52	5	1,20	2)	5,10	77,1	0,001
HPV-58	4	0,95	6	1,42	34,1	0,515
HPV-45	1	0,24	4	0,94	75,4	0,174
HPV-59	3	0,71	0	0,00	-	0,083

Todos 16 relacionados	11	2,7	30	7,6	65,1	0,002
Todos 18 relacionados	4	1,0	4	1,0	1,0	0,989
Todos HR (exceto 16/18)	36	10,1	46	13,5	27,1	0,155

* Todas as amostras; coorte ATP

Tabela 6 relacionados

X.

r relacionados

Tipo HPV	Vacina	Controle	Eficácia Vacina
	N	AR	N	AR	%	Valor P
HPV-31	l	0,24	5	1,20	80,1	0,123
HPV-33	2	0,47	4	0,94	49,9	0,686
HPV-35	0	0,00	2	0,47	100	0,499
HPV-52	1	0,24	11	2,67	91	0,003
HPV-58	2	0,47	2	0,47	0,2	1,000
HP\M5	0	0,00	2	0,47	100	0,249
HPV-59	4	0,94	2	0,47	-101	0,451

Todos 16 relacionados	5	1,2	18	4,6	72,8	0,005
Todos 18 relacionados	4	1,0	4	1,0	0,2	1,000
Todos HR (exceto 16/18)	10	2,8	30	8,8	68,2	<0,001

* Coorte ATP

Nas tabelas 4, 5 e 6,

N = número de indivíduos em coorte específico

AR = taxa de ataque = n(número de indivíduos com infecção

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 57/62 incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica HPV, como apropriado para a tabela) / N % Eficácia da Vacina é 1 - (A/B) x 100, ajustado para tamanho relativo de grupo vacina e placebo, em que

A = % mulheres do grupo de vacina com infecção incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica, como apropriado para a tabela

B = % mulheres do grupo placebo com infecção incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica, como apropriado para a 10 tabela.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender VLPs ou capsômeros de HPV 16 e 18 e pelo menos de um outro HPV do tipo causador de câncer, o outro HPV do tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose de VLP ou capsômero do pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela de HPV 16 ou 18.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o outro HPV do tipo causador de câncer ser HPV 31.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o outro HPV do tipo causador de câncer ser HPV 45.

4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o outro HPV do tipo causador de câncer ser HPV 52.

5 21. Uso de VLPs ou capsômeros de HPV 16 e 18 com VLPs ou capsômeros de pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer , o outrotipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose da VLP ou capsômero do pelo menos um outro HPV do tipo causador de câncer é reduzida àquela do HPV 16 ou 18,

5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de os outros HPVs do tipo causador de câncer serem HPV 31 e HPV 45.

6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de os outros HVPs do tipo causador de câncer serem HPV 31 e HPV 52.

7. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de os outros HPVs do tipo causador de câncer serem HPV 52 e HPV 45.

8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de os outros HPVs do tipo causador de câncer serem HPV 31, HPV 45 e HPV 52.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de compreender 10 pg ou mais de VLPs ou capsômero de HPV 16 e/ou HPV 18 e de 2 - 9 pg de VLP ou capsômero do outro tipo causador de câncer.

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 59/62

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizada pelo fato de compreender 20 pg ou mais de VLPs ou capsômeros de HPV 16 e/ou HPV 18 e de 5 - 15 pg de VLP ou capsômero do outro tipo causador de câncer.

11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de compreender 10 pg de VLP ou capsômero do outro tipo causador de câncer.

12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizada pelo fato de ser em combinação com um adjuvante.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato do adjuvante ser um sal de alumínio.

14. Composição de acordo com a reivindicação13, caracterizada pelo fato do adjuvante ser hidróxido de alumínio.

15. Composição de acordo com a reivindicação12, caracterizada pelo fato do adjuvante ser um derivado de lipídeo A.

16. Composição de acordo com a reivindicação15, caracterizada pelo fato do adjuvante ser 3D MPL.

17. Composição de acordo com a reivindicação16, caracterizada pelo fato do adjuvante ser 3D MPL e hidróxido de alumínio.

18. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações precedentes com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

19. Uso de uma composição ou vacina como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para evitar infecção e/ou doença por HPV.

20. Método de produzir uma composição imunogênica como definido acima, caracterizado pelo fato de compreender misturar VLPs ou capsômeros de HPV 16 e 18 com VLPs ou capsômeros de pelo menos um

Petição 870180132911, de 21/09/2018, pág. 60/62 outro HPV do tipo causador de câncer, o outro tipo causador de câncer sendo selecionado da lista consistindo de HPV tipos 31, 45 e 52, em que a dose da VLP ou capsômero do pelo menos um outro tipo causador de câncer é reduzida em relação àquela do HPV 16 ou 18.

10 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para prevenir ou tratar infecção e/ou doença por HPV.