BRPI0512731B1 - dispositivo de amostragem de células colorretais - Google Patents

Abstract

dispositivo de amostragem de células colorretais a presente invenção refere-se a um dispositivo para a coleta de uma amostra de células esfoliadas da superfície mucosa colorretal de um indivíduo humano, que compreende um elemento de inserção colorretal (1), que tem uma extremidade de inserção distal (2), uma extremidade proximal (34) e uma cavidade interna que pode ser fechada (3) , um membrana flexível, que tem uma superfície externa de amostragem de células (5) e uma superfície interna, em que a membrana é presa, à maneira de vedação, à extremidade de inserção distal do elemento de inserção e mantida dentro da cavidade interna, de modo que, quando em uso, a pressurização da cavidade interna até pelo menos uma primeira pressão elevada faça com que a membrana seja emitida da extremidade distal do elemento de inserção de modo a fazer contato com a superfície mucosa colorretal e a pressurização da cavidade interna até uma segunda pressão reduzida faça com que a membrana seja invertida e volte à cavidade interna do elemento de inserção. são também descritos um estojo que compreende o dispositivo e métodos de amostragem de células colorretais que utilizam o dispositivo.

Description

(54) Título: DISPOSITIVO DE AMOSTRAGEM DE CÉLULAS COLORRETAIS (51) lnt.CI.: A61B 10/00 (30) Prioridade Unionista: 07/07/2004 GB 0415277.3 (73) Titular(es): COLONIX LIMITED (72) Inventor(es): ALEXANDRE LOKTIONOV; ΤΑΤΙΑΝΑ BANDALETOVA; ANDREW HUMPHREY LLEWELYN; COLIN GEORGE FERRETT; RUPERT CHARLES GIFFORD LYWOOD; HUGO GEOFFREY GIFFORD LYWOOD (85) Data do Início da Fase Nacional: 28/12/2006 •« * k-ct

DISPOSITIVO DE AMOSTRAGEM DE ÇELULAS COLORRETAIS

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se á um dispositivo para coletar uma amostra de células esfoliadas da superfície mucosa colorretal de um indivíduo humano em um estojo que compreende o dispositivo e a métodos de amostragem de célu las colorretais que usam o dispositivo.

Antecedentes da Invenção câncer colorretal esporádico (CRC) é uma das doenças de ocorrência mais frequente e mortais das doenças on cológicas que afetam as pessoas nos países ocidentais desen volvidos.

Um grande obstáculo para o diagnóstico precoce do CRC é a ausência de manifestações clíniÇas mente identificáveis na maioria dos casós gios mais avançados da doença, quando formaram, que resultam em dor, sangraní obstrução, que a doença é prontamente di tanto, os estágios avançados da doença e iniciais prontaÉ só nos estátumores maiores se snto e sintomas de agnostiçada. Entrestão também associados a tumores invasores e metatásticos. Assim, a detecção de tumores colorretais antes dos estágios avançados da doença faria aumentar consideravelmente as probabilidades de inter venção cirúrgica bem sucedida e as taxas de sobrevivência totais.

Na ausência de indicações clínLcas precoces, prontamente identificáveis, a busca por mécodos de triagem de

CRC adequados continuou durante décadas há atualmente técnica de triagem de CRC . Infelizmente, não que combine invasão reduzida, simplicidade e baixo custo cott. alta sensibilidade e especificidade. Dois métodos de triagem para o CRC são a colonoscopia/sigmoidoscopia flexível e oculto fecal (FOBT) [Rennert, G. Recent testagem de sangue

Results Câncer Res.

2003; 163: 248-253, Atkin, W. Scand. J. Gastroenterol. (Sup pl. ) 2003, 237: 13-16, Walsh, J. M. e Terdiman, J. P. JAMA

2003; 289: 1288-1296]. Entretanto, ambos estes métodos têm inconvenientes significativos.

A colonoscopia/sigmoidoscopia (flexível é considerada um procedimento diagnóstico precisó e seguro, mas sua igência de especiao procedimens produz taxas inacapacidade de invasão, seu custo e a exi listas habilitados e experientes para reelizar to tornam seu uso na triagem de rotina irhpraticável. O mesmo é verdadeiro para a colonografia tomográfica computadorizada (colonoscopia virtual) recém-introduzida.

A FOBT é barata e simples, mat ceitavelmente elevadas de resultados tar.to negativos falsos quanto positivos falsos. Apesar destas limitações, a FOBT é atualmente o método de triagem escolhido

Têm sido investigados métodos para diagnosticar o CRC com base em um indicador direto da presença de tumor. Um indicador que foi identificado é a anál esfoliados. A esfoliação dos colonócitos dimento espontâneo das células da camada ise dos colonócitos (isto é, o desprenepitelial ordenadamente organizada da mucosa colônica) é um mecanismo de renovação celular importante no intestino Humano [Eastwood, G. L. Gastroenterology 1977; 41: 122-15]. A análise citológica dos colonócitos obtidos de lavagens colônicas ou retais (is« e « rantagens da sigmoia obtenção de céluisolá-las das fezes colonócitos diagnóstico e pesto é, pela irrigação da mucosa colorretal) foi realizada aproximadamente 50 anos atrás [Bader, G. 14. e Papanicolau, G. N. Câncer 1952; 5: 307-14]. Este trabalho mostrou que células neoplãsticas esfoliadas morfologicamente distintas poderíam ser detectadas em pacientes com CRC. Entretanto, o método de obtenção destas amostras (um procedimento de lavagem colônica invasivo) sofria das mesmas des¹ doscopia/colonoscopia e exigia uma análise citológica detalhada da amostra uma vez obtida.

A abordagem predominante para las epiteliais esfoliadas tem sido a de humanas. As fezes humanas foram identifióadas como uma fonte de tais células, uma vez que as células esfoliadas do epitélio colônico podem ser excretadas em ponjunto com outras substâncias fecais.

As primeiras tentativas de ultilizar isolados das fezes humanas para fins de quisa começaram cerca de 15 anos atrás por P.P. Nair e seus colegas. Eles reivindicaram serem capaz=s de recuperar milhares de células esfoliadas viáveis de algumas gramas de material fecal disperso utilizando um procedimento de isolamento baseado na centrifugação com gradiente de densidade [Iyengar, V. et al. , FASEB J 1991; 5: 347-350] . Entretanto, estas reivindicações ambiciosas geraram dúvidas consideráveis devido à pouca probabilidade da presença de colonócitos bem preservados em um ambiente anaeróbico agressivo, como o encontrado nas fezes. Além disto, a evidência morfológica apresentada em sua referência de 1991 não era convincente. .

* · » antêm a validade de lin. Gastroenterol. produziram nenhum aseus estudos.

avanços práticos de acuação humana para uma área de pesquio a qualquer interçndido tentativas de de colonócitos de desenvolverem proceomarcadores molecuetamente isolado de do e analisado quansociadas ao câncer, pico altamente seguos marcadores molepnéticas estão sabifreqüências relatipropóem a detecção s APC, K-ras e p53 ro-satélite, têm sistroenterology 2000;

Nair Natl. Câncer t al., N. Engl. J. metilação no DNA femarcador diagnóstiet 2004; 363: 1283P. P. Nair e os membros de seu grupo m sua abordagem [Nair, P. et al. , J. C 2003; 36 (5 Suppl. ) S84-S93], mas não vanço prático com base nos resultados de Entretanto, apesar da falta de P. P. Nair e seus colegas, o uso da eV, fins de diagnóstico e pesquisa permanece sa ativa, uma vez que não está associad|' venção invasiva. Vários grupos têm empre isolar material genético (DNA) deriva· amostras de evacuação humana de modo a dimentos diagnósticos com o emprego de lares de malignidade. Embora o DNA dir fezes homogeneizadas possa ser amplifica to à presença de alterações genéticas a^ a ausência de um biomarcador molecular ú:

ro para o câncer resultou no uso de vár culares que refletem várias alterações g damente presentes em células malignas a vamente elevadas. Várias abordagens, que; simultânea de várias mutações nos gene combinada com análise de marcador de mic do descritas [Ahlquist, D. A. et al., Ga 119: 1219-1227, Dong, S. M. et al. , J

Inst. 2001; 93: 858-865, Traverso, G.

Med. 2002; 346: 311-320]. Alterações de cal têm sido também consideradas como um co potencial [Muller, Η. M. et al. , Lanó bi

V * * · ·

Η rretais por análises exeqüível, a validaontinua questionável exidade dos procedíares de CRC no DNA neizadas tem obscuinicial de colonóúe a evacuação homopação do DNA humano. nas fezes pode inção do DNA em coloérioração do DNA maeriana anaeróbica do

1285]. Embora a detecção de tumores colo moleculares com vários objetivos pareça de destes métodos para fins de triagem c devido ao alto custo e à relativa compl mentos de laboratório envolvidos.

A busca de marcadores molecul extraído de amostras de evacuação homog recido a importância da coleta/isolament<|) citos esfoliados. É evidente, contudo, q· geneizada é um material difícil para ext Em particular, a abundância de bactérias terferir com os procedimentos de recuper| nócitos, e uma rápida danificação e det mário ocorrem na presença da flora bact cólon humano.

O desenvolvimento de abordagen^ mento de colonócitos esfoliados tem sido almente a uma falta surpreendente de co foliação de células no intestino tanto e gicas normais quanto na doença. As conce; esfoliação de colonócitos são ainda afet não provada hipótese que implica a esfo de quase todos os colonócitos diferenc migração para o epitélio luminal das cri é, presume-se que deve haver milhões de tes nas matérias fecais uma vez que a baseadas no isolalento devido parciijihecimento sobre escondições fisiolópções atuais sobre a ^.das por uma velha e iação obrigatória ados quando de sua [)tas colônicas (isto colonócitos presenaxa de proliferação de células do epitélio colônico é elevada e todas as células são finalmente esfoliadas). [Entretanto, está se tornando evidente que a morte ou apoptose progra situ é pelo menos tão importante quanto

P. A. et al., J.Cell Sei. 1994; 107: 3

H. e Gibson, P. R. Pathology 1999; 31:

A. et al., Hum. Pathol. 2000; 31: 51-5 estes dois mecanismos principais de re mucosa colônica pode passar por alteraçõ^ neoplasia colorretal [Ahlquist, D. A. verdade, está agora provado que os pe 10 normais que levam as células à apopto desregulados nos tumores malignos [Bedi Res. 1995; 55: 1881-1816, Laçasse, E.

1998; 17: 3247-3259, Jass. J. R. Gastroe:

862-876, Oren, M. Cell Death Differ. 200 15 defeld, W. M. 2^nd et al,, Ann. Surg. On

851] , do que resulta um potencial ap cancerígenas consideravelmente reduzido, be-se que a aderência das células tumoroê damente â medida que o câncer progride 20 al., Câncer Res. 1996; 56: 3605-3609, Ha

G. L. Dis. Colon Rectum 2001; 44: 876-881 al., J. Pathol. 2003; 201: 528-534]. Est importante para o espalhamento metastáti colorretal a supressão combinada de apopjt 25 aderência/comunicação intercelular faz mada das células in a esfoliação [Hall, $69-3577, Barkia, D.

0-238, Ahlquist, D.

7] . A relação entre ipoção de células da s significativas na t al. (supra)] . Na rcursos reguladores

0e estão gravemente A. et al. , Câncer . et al. , Oncogene pterology 2002; 123:

; 10: 431-442, BoeCOl. 2003; 10: 839cptótico de células Ao mesmo tempo, saas diminui acentua[Yamamoto, H. et ier, J. e Nicolson,

4, Leeman, M. F. et e último fenômeno é co, mas na neoplasia ose e diminuição na aumentar consideravelmente as probabilidades de desprendimento de células malignas da superfície de tumores crescentes. Se este for o caso, as células tumorosas esfoliadas, algumas das quais po-

capacid devido dem reter um potencial de proliferação, devem diferir de suas homólogas esfoliadas normais (não tumorosas) por: i) se rem mais abundantes devido â esfoliação facilitada da superfície tumorosa; e (ii) terem uma cia muito maior, em particular mais elevada à falta de oxigênio [Graebei' ture 199S; 379: 88-91]. Quando da esfoli entram em uma camada mucocelular relat nada, que separa a mucosa colônica do co: testino e se move permanentemente em sentido distai com o fluxo de fezes [Ahlquist, D. A. et al. (supra)].

A importância da camada mucocelular, que proporciona uma interface entre a mucosa colorretal e o conteúdo fecal do intestino, não foi compreendida até recentemente. Estudos experimentais indicaram que um e:

pode ser facilmente obtido da superfície das fezes de ratos e utilizado para amplificação adicional e análise da mutação de genes [Loktionov, A. e 0'Neill, I. K.

ade de sobrevivêna uma resistência , T. G. et al. , Naação, estas células ivamente bem oxigenteúdo fecal do iniNA de boa qualidade

Int. J. Oncol.

1995; 6: 437-445]. Estas experiências iniciais sugeriam que o DNA extraído de colonócitos isolados cuações humanas (a superfície das evacua dè superfície de evaiões pode ser considerada como uma fração da camada mucocelular excretada com as fezes) poderia ser utilizado na anã desenvolvido um método de isolamento de;

de amostras de evacuação total humana lavagem das células da superfície das fe la coleta delas por um procedimento de s lise molecular. Foi células esfoliadas pela eliminação por zes resfriadas e peeparação imunomagnética ]Loktionov, A. et al., Clin. Câncer Res. 1998; 4: 337-

8 *:·'	w «t » » β * » Φ «· « <* (· ** » W ** ** V * * * * * O* υ θ w w w * ** θ
W ο W/	V q, V * V «· * W * ’
342]. Embora ο trabalho nesta direção te	nha sido inicialmen-
te planejado em termos de desenvolviment	o de uma análise di-
agnóstica molecular para o CRC, parec	eu que uma análise
quantitativa simples do DNA derivado de	colonócitos da su-
perfície de evacuações humanas poderia £	ser utilizada no di-
agnóstico e triagem de CRC, uma vez que	a proporção relativa
de DNA em pacientes com CRC era muito ma	is elevada em compa-
ração com a de indivíduos saudáveis. Oul	;ros autores relata-
ram também proporções mais elevadas ou d	e células esfoliadas
[Dutra, S. K. et al., Gastroenterology	1995; 108 (Suppl.):
A4S3] ou de DNA [Villa, E. et al. , Gaí	stroenterology 1996;
110: 1346-1353] em amostras de evacuaçãc	5 dispersas ou homo-
geneizadas obtidas de pacientes com CRC	, mas as diferenças
entre pessoas saudáveis e pacientes co	m câncer observadas
nesses estudos não foram grandes o baste	Lnte para serem con-
sideradas válidas em termos de diagnóst	ico. Por contraste,
Loktionov et al (supra) puderam mostrar	a existência de uma
diferença notável entre pacientes com C	RC e indivíduos em-
pregando um índice calculado referente	à proporção de DNA
extraído de células isoladas da superfíc	íe de evacuações com
relação ao peso das evacuações (índice	de DNA de evacuação
ou SDNAI).
0 método de diagnóstico basead	5 no SDNAI é descri-
to na patente norte-americana No. 6 187	546. Embora a técni-
ca e os resultados de suas tentativas	iniciais realçassem
aparentemente uma abordagem muito efica	z, simples e barata
para a triagem de CRC, eles tinham várií	ls falhas considerá-
veis (dificuldades aparentes de manejo	:otal das evacuações

to to to β * * * * * * * » Λ • : ”.·· <5 ú't onização dos procee introdução séria ém que números relarvadas podem ser obas com a utilização

IS 2002; 110: 239oadronização sendo o ação ao uso de colode evacuação para cando que a camada ana é particularmeneservados. Além discientes com CRC paindivíduos saudáveis lmente aumentada de i|ites. Portanto, nas que são muito mais devem dominar quanais esfoliadas. Váimplantação distai s de tumores colorDis. Colon Rectum

Dis. Colon Rectum

g. Surg. 2 0 0 0; 17:

Ctum 2003 ; 43: 835. Surg. Engl. 2004;

pà e especialmente a impossibilidade da padr dimentos), impedindo sua comercialização na prática clínica. Tornou-se claro tamb tivamente pequenos de células bem prese tidos da superfície de evacuações human desta técnica [Bandaletova, et al. , API4 245]. Estes problemas, a dificuldade de crucial, provocam sérias dúvidas com rei nócitos esfoliados isolados de amostra^ triagem de CRC em larga escala.

Há considerável evidência indi mucocelular que cobre a mucosa retal hum. te rica em colonócitos esfoliados bem pr to, o conteúdo celular desta camada em rece ser muito mais elevado do que em devido basicamente à presença considerav^ colonócitos malignos altamente resiste: células tumorosas de pacientes com CRC, bem adaptadas a uma existência autônoma, titativamente um agregado de células ret[ rios informes recentes que descrevem a (anal, por exemplo) de células esfoliadc. retais removidos [Jenner, D. C. et al.

1998; 41: 1432-1434, Wind, P. et al. ,

1998; 41: 1432-1434, Isbister, W. H.

81-83, Hyman, N. e Kida, M. Dis. Colon R.

835, Abbasakoor, F. et al. , Ann. R. ColZ 86: 38-39] corroboram fortemente esta hijbótese

Di

O acesso direto à mucosa retal é possível pelo e10 xame retal digital de rotina com o dedo enluvado do examinacom a camada anipulação simples, material e a contaontato dor. Entretanto, embora se possa obter mucocelular retal pelo emprego desta m}= são inevitáveis perdas significativas de minação com o epitélio escamoso irrelevante do canal anal durante a retirada do dedo do reto. Esfiegaços preparados a partir das luvas utilizadas no exame retal mostram colonócitos bem preservados, combinados com um a] minação por células do epitélio escamoso.

Há, portanto, grande necessida: de células epiteliais esfoliadas da superfície da mucosa retal sem os problemas de perda de material e grave contaminação com outros tecidos no estágio de remoção da superfície de coleta de células do reto. Tais células podem não só utilizadas na análise quantitativa de células e DNA, mas também investigadas quanto à presença de biom= adicionais (proteínas, por exemplo) e finalmente avaliadas em termos imuno-histoquímicos e citológiços.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro asp^ apresentado um dispositivo de amostragem tais que compreende:

um elemento de inserção colorrètal que tem uma extremidade de inserção distai, uma extremidade proximal e um cavidade interna que pode ser fechada;

lto nível de contade de coleta direta arcadores de câncer scto da invenção, é de células colorreuma membrana flexível, tem uma superfície externa de amostragem de célula e uma superfície interna, em que a â-¹ emidade de inserção dentro da cavidade pressurização da caíra pressão elevada extremidade distai jontato com a superda cavidade intercom que a membrana do elemento de injldades com a amoslível dentro do eleão quanto quando da material e a amosoutras superfícies osa diretamente, o ciadas à amostragem reza desagradável do ulas obteníveis, os ria fecal (especial^uldades de padroniroblemas, como, por ío e da consistência sivo, ele é bem menente utilizados na membrana é presa, por vedação, à extr distai do elemento de inserção e mantida interna;

de modo que, durante o uso, a vidade interna até pelo menos uma prime faça com que a membrana seja emitida dê do elemento de inserção de modo a fazer ficie mucosa colorretal e a pressurizaçã na até uma segunda pressão reduzida façc seja invertida e volte à cavidade interne, serção.

O dispositivo supera as dific tragem digital ao manter a membrana flesi mento de inserção tanto quando da inserç: retirada, de modo que não haja perda de tras não seja contaminada por células c (como, por exemplo, o epitélio escamoso)

Ao amostrar a superfície mud dispositivo supera as dificuldades asso de evacuações totais, que incluem a natu: excremento, a baixa concentração das cé níveis elevados de contaminação com maté mente bactérias) e especialmente as difi zação de métodos relacionadas a tais p exemplo, a grande variabilidade do tamarí das evacuações.

Embora o dispositivo seja inva nos invasivo que os dispositivos atual

ser operado por um O dispositivo pode ue o nível reduzido plicação levem a uma Estas vantagens deitragem seja feita e invenção, a cavidapode ser fechada, é colonoscopia/sigmoidoscopia e não exige operador habilitado e altamente treinado até ser auto-administrado. É provável q de invasão e a ausência de riscos de com] aceitação maior por parte dos pacientes, vem, por sua vez, permitir que mais amos a um custo mais baixo.

Em uma modalidade preferida da de interna do elemento de inserção, que fechada.

invenção, o dispoe também dispositirna, em que os disimal do elemento de

Em uma modalidade preferida da sitivo de amostragem de células compreend vos para a pressurização da cavidade inte positivos são presos â extremidade prox inserção. De preferência, os dispositivos da cavidade interna são presos ao dispôs de células por meio de uma válvula (urti vedação, por exemplo) presente na extr elemento de inserção.

Deve ficar entendido que os pressurização da cavidade interna podem quer dispositivos adequados para aplica quido ou gás, por exemplo) à membrana fl cia, os dispositivos para a pressurizaçã^ na compreendem uma fonte de ar comprim uma bomba (um bulbo, por exemplo).

para pressurização itivo de amostragem a válvula de autosmidade proximal do dispositivos para a compreender quaisum fluido (um líexível. De preferênda cavidade inferido, uma seringa ou

De preferência, os dispositivos para a pressurização da cavidade interna compreendem uma fonte de ar compri13 ico capaz de distriprimeira pressão epara o dispositivo e tem a vantagem de ior do elemento de a vantagem de ser dispositivos de aveis.

itivos para a presuma seringa. 0 uso i(nento simples quanto a dentro da membraaumento de dez vea flexível). Por equal uma seringa de elemento de inserzialmente fixado na efinida de uma pri, aplicada empurranaté a marca de 0 ml, exível com um volume inida de uma segunseguida puxando-se ensão máxima (até a roduziria a membrana de inserção. Em uma nga seria dotada de de encaixe de pres.tn do mido que compreende um dispositivo mecân buir uma quantidade pré-definida de uma levada e de uma segunda pressão reduzida de amostragem de células. Esta modalidac regular com precisão a pressão no inte inserção, e o dispositivo mecânico tem reutilizado com um número indefinido de mostragem de células colorretais descarta

Mais preferivelmente, os dispôs surização da cavidade interna compreendem de uma seringa permite tanto um fun o bombeamento de um volume fixo de na flexível (de preferência pelo me:

zes no volume de ar presente na membran xemplo, em uma modalidade da invenção na 100 ml é presa na extremidade proximal ção, o êmbolo da seringa pode ser ini marca de 70-90 ml. Uma quantidade pré-d|' meira pressão elevada pode ser, portanto do-se o êmbolo até sua extensão máxima ( por exemplo), que enchería a membrana fl de ar de 70-90 ml. Uma quantidade préda pressão reduzida pode ser aplicada o êmbolo da seringa de volta à sua ext marca de 100 ml, por exemplo), o que int flexível na cavidade interna do elemento modalidade preferida da invenção, a seri um ou mais recursos de retenção (locais

-def en são, por exemplo) para marcar as posições do êmbolo da seringa em cada estágio durante o uso (como, por exemplo, uma posição antes da inserção, uma durante a inserção e uma após a retirada). A vantagem de o dispositivo para a pressuriza14 ção da cavidade interna ser uma seringa é que o dispositivo invenção, a área de de células esfoliae a área de superfíerfície mucosa que é invenção, o elemencontato com um tubo de amostragem de células colorretais pode ser adaptado de modo a adequar-se ao equipamento laborajtorial e hospitalar comumente disponível e descartável.

Em uma modalidade preferida da superfície da superfície externa de amostragem de células da membrana flexível é controlável de maneira reproduzível. Isto permite que a área de superfície fixa seja posta em contato com a superfície mucosa colorretal que é amostrada, obtendo-se assim uma coleta quantificável das, que é correlacionada com a propordão presente sobre a superfície da mucosa colorretal. De preferência, a área de superfície é controlada pelos dispositivos para pressurização da cavidade interna. Isto permite qus cie fixa seja posta em contato com a supe amostrada.

Em uma modalidade preferida da to de inserção é adaptado para entrar em de acesso retal. Esta modalidade tem a vantagem de permitir que um tubo de acesso retal e um obturador, tal como um obturador em forma de oliva (um tubo de acesso retal e um obturado conjugados são comumente conhecidos como um proctoscópio), sejam inseridos primeiro para abrir a cavidade retal, seguindo-se a retirada do obturador antes da inserção ' * - t ϊ H W «- >=» lá do dispositivo de amostragem da invenção. O dispositivo de amostragem pode então permanecer mantido na posição com o tubo de acesso retal durante qualquer período de tempo que seja necessário para se obter uma amostra. O obturador seria então substituído uma vez removido o dispositivo de amostragem, e o obturador e o tubo de acesso retal seriam retirados j untos.

Em uma modalidade preferida da to de inserção é configurado para permitir a auto-inserção. Em tal modalidade, o elemento de inserção é inserido juntamente com um tubo de acesso retal e, portanto, elimina a necessidade de um obturador (o elemento de inserção tem uma invenção, o elemenarredon dada, por exemplo) . que o dispositivo de extremidade de inserção distai Esta modalidade apresenta a vantagem de amostragem da invenção pode ser auto-adiiinistrado, os paci entes podendo facilmente amostrar células esfoliadas de sua mucosa retal, por exemplo. Nesta modalidade, considera-se que o elemento de inserção e o tubo de acesso retal sejam inse ridos e removidos juntos e só separados mediante a remoção.

Em uma modalidade preferida da na flexível forma um receptáculo quando interna do elemento de inserção, de modó que o fluido possa ser adicionado. Esta modalidade da invenção permitiría que reagentes fossem adicionados ao dispôs: depois de obtida uma amostra sem a neces a amostra para um receptáculo separado alguma parte do material da amostra.

Em uma modalidade preferida da invenção, a membramantida na cavidade itivo de amostragem sidade de transferir perdendo-se assim invenção, a cavida16 paredes da cavidade obtida uma amostra, de interna do elemento de inserção é dotada de dispositivos de aderência. Esta modalidade da invenção tem o efeito de levar a membrana flexível na direção das interna do elemento de inserção uma vez e a aplicação da segunda pressão reduzjida leva a membrana flexível para dentro da cavidade interna do elemento de inserção. Este recurso tem a vantagem de proporcionar um receptáculo estável quando enchido com líqúido.

invenção, o elemencontato com um disEm uma modalidade preferida da to de inserção é adaptado para entrar em positivo de vedação para vedar o receptáculo. Isto permiti ria que o dispositivo de amostragem, que contém a amostra, fosse armazenado e transportado antes qu amostra fossem realizadas. De preferência, o dispositivo de vedação é uma tampa rosqueada. Uma tampa rosqueada tem a vantagem de vedar o receptáculo de modo a amostra e também permitir a remoção para e outras análises da prevenir a perda da análise adicional.

Na modalidade na qual o dispositivo de amostragem de células compreende dispositivos paraJ a pressurização da cavidade interna, os dispositivos são de preferência destacáveis do elemento de inserção. Isto tem a vantagem de converter o dispositivo de amostragem em um vial de análise compacto, que pode ser adequadamente transportado e armaze nado com muitos outros viais de análise compactos para reações de triagem subsequentes.

Sob um segundo aspecto da invénção, é apresentado um estojo para coletar uma amostra da superfície mucosa colorretal de um indivíduo humano, que compreende um disposi* 4 tivo de amostragem de células colorretai aqui e um tubo de acesso retal e opcional

O uso de um tubo de acesso ret uma inserção mais confortável do dispo^ quanto previne o contato entre o disposi s conforme definido mente um obturador.

al tanto proporciona itivo de amostragem tivo de amostragem e

tubo de acesso reão do tubo de acesso dá amostrada. 0 uso de um obturador além tal pode aliviar o desconforto da inserç retal.

Em uma modalidade preferida pode compreender adicionalmente um lub geléia lubrificante (geléia K-Y, por e. vantagem de proporcionar maior conforto do obturador ou dispositivo de amostragç venção.

Em uma modalidade preferida da dor é desengatado do tubo de acesso reta obturador e do tubo de acesso retal co:

retal.

Em uma modalidade preferida compreende também um dispositivo de vedá rosqueada, para entrar em contato com ção.

Em uma modalidade preferida dá compreende também um ou mais reagentes, de um tampão permite a preparação da amo se adicional.

invenção, o estojo rificante, como uma xemplo) . Isto tem a durante a inserção m de células da ininvenção, o obtura1 após a inserção do njugados na cavidade dá invenção, o estojo ção, como uma tampa elemento de inserinvenção, o estojo com um tampão. O uso stra antes da análiEm uma modalidade preferida da invenção, o tampão pode estar presente na tampa rosqueada (

:omc um pacote vesicante, por exemplo) , de modo que a fixação da tampa no ele entro do receptáculo r exemplo) de modo a superfície de amosa vantagem de apremento de inserção libere o tampão para d!= (pela perfuração do pacote vesicante, poji suspender as células presentes sobre a tragem da membrana flexível antes da análise adicional.

Em uma modalidade preferida dá invenção, o tampão é um tampão de lise de células que tem sentar uma etapa-chave antes da extraçãó do DNA. Em uma modalidade alternativamente preferida da j.nvenção, o tampão é um meio preservador de células que tem a vantagem de permitir análises citológicas, bioquímicas e aperfeiçoadas na amostra de célula resuí imuno-histoquímicas Ltante. De preferênrão também que qualcritos anteriormente esfoliado (colonócia, o meio preservador de células é suplementado com um ou mais componentes de cultura celular (nutrientes e antibióticos, por exemplo).

Os versados na técnica entende quer um dos dispositivos ou estojos des é adequado para amostrar tecido epitelia citos, por exemplo) a partir da superfipie da mucosa colorretal humana

Sob um terceiro aspecto da invenção, é apresentado um método de amostragem quantitativa de células esfoliadas a partir da superfície mucosa colorretal de um indivíduo humano sem contaminar a amostra pelo contate com outras superfície do corpo, o qual compreende as etapas de levar um dispositivo de amostragem, que compreende uma superfície

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de amostragem de células sepa	radas, até as proxi-
midades da superfície mucosa colorretal	a ser amostrada, sem
fazer contato prévio com qualquer outra	superfície do corpo;
pôr a superfície de amostragem de céluZ	as em contato com a
superfície mucosa colorretal de modo qu	s seja obtida uma a-
mostra da superfície mucosa; e
remover o dispositivo de amo	stragem e a amostra
das proximidades da superfície mucosa s	;em que a superfície
de amostragem de células separadas ou a	amostra faça contato
com qualquer outra superfície do corpo.
Este método engloba as etapas	!-chaves de amostrar
diretamente células esfoliadas de uma	superfície mucosa e
assegura que a amostra não seja contami	nada pelo contato da
membrana de amostragem de células com o	utras superfícies do
corpo. A contaminação é evitada pela sep	aração da superfície
de amostragem, em que a separação pode	ser definida como a
ação de isolar ou pôr à parte a superfíc	ie de amostragem an-
tes de pô-la em contato com a superfície	mucosa colorretal ou
após a coleta das células da superfície	mucosa colorretal.
Sob um quarto aspecto da inve	:nção, é apresentado
um método de amostragem de células esf	oliadas a partir da
superfície mucosa colorretal de um indi'	ziduo humano, o qual
compreende as etapas de:
inserir um dispositivo de am	ostragem de células
colorretais de acordo com a invenção na	cavidade retal e le-
var o dispositivo até as proximidades <	ia superfície mucosa
colorretal sem que a superfície externa	de amostragem de cé-
lulas da membrana flexível faça contato	prévio com qualquer

A outra superfície do corpo;

pressurizar a cavidade interna primeira pressão elevada de modo que a me emitida da extremidade distai do disposi pôr a superfície mucosa color: a superfície externa de amostragem de cê modo que seja obtida uma amostra de superfície mucosa colorretal;

aplicar uma segunda pressão interna de modo que a membrana flexível amostra presente sobre a superfície de a da membrana volte à cavidade interna do tragem de células; e remover o dispositivo de amost proximidades da superfície mucosa colc dispositivo da cavidade retal sem que a faça contato com qualquer outra superfíc Deve ficar entendido que o dis gem de células pode exigir adicionalmentj; retal ou sozinho ou juntamente com um ob Assim, em uma modalidade pref^ método compreende adicionalmente as etap inserir um dispositivo de am colorretais de acordo com a invenção e u tal conjugados na cavidade retal; e remover o dispositivo de amost tubo de acesso retal.

ce até pelo menos uma mbrana flexível seja tivo de amostragem;

retal em contato com lulas da membrana de lulas esfoliadas da reduzida â cavidade seja invertida e a mostragem de células dispositivo de amosragem de células das rretal e retirar o membrana ou amostra ie do corpo. positivo de amostrae um tubo de acesso turador.

rida da invenção, o as de:

estragem de células m tubo de acesso reragem e a amostra do

Em - uma modalidade preferida dá invenção, o método etal e um obturador de acesso retal antes compreende adicionalmente as etapas de inserir um tubo de acesso r conjugados na cavidade retal;

retirar o obturador do tubo de inserir um dispositivo de amostragem;

remover o dispositivo de amost substituir o obturador por me;

retal; e retirar o tubo de acesso reta jugados da cavidade retal.

Sob um quinto aspecto da inv^ um método de amostragem de células es mucosa colorretal de um indivíduo humano as etapas de:

inserir um tubo de acesso ret cavidade retal por meio do canal anal;

retirar o obturador do tubo de inserir um dispositivo de am colorretais de acordo com a invenção ns. meio do tubo de acesso retal, sem que a dispositivo de amostragem faça contato superfície do corpo;

pressurizar a cavidade intern pressão elevada de modo que a membrana f da extremidade distai do dispositivo de pôr a superfície mucosa colori’ ragem e a amostra,o do tubo de acesso e o obturador conjfol nção, é apresentado iadas da superfície , o qual compreende qLl e um obturador na acesso retal; estragem de células cavidade retal por nembrana flexível do com qualquer outra a até uma primeira lexível seja emitida ^mos t ragem;

etal em contato com a superfície externa de amostragem de células da membrana;

seja invertida e a obter uma amostra de células çsfoliadas da superfície mucosa colorretal;

aplicar uma segunda pressão jreduzida à cavidade interna de modo que a membrana flexível amostra presente sobre a superfície de amostragem de células da membrana volte â cavidade interna do dispositivo de amostragem de células;

retirar o dispositivo de amosttragem de células da cavidade retal por meio do tubo de acess membrana flexível do dispositivo de amoslt tato com qualquer superfície do corpo;

substituir o obturador por med|o do tubo de acesso retal; e retirar o tubo de acesso ret^l e o obturador do reto por meio do canal anal. .

Deve ficar entendido que, enquanto o tubo de acesso retal permanece inserido na cavidade positivo de amostragem de células da ibvenção pode ser introduzido na cavidade retal. Por exemplo, pode ser introduzido o primeiro dispositivo de amostragem de células, que compreende um tampão de lise de células tração do DNA e a análise (quantificaçí so retal, sem que a tragem entre em conretal, um outro dis· para permitir a exão, por exemplo) de quaisquer células amostradas. Em seguida, pode ser introdu zido um segundo dispositivo de amostra compreende um meio preservador de célú análise citológica, bioquímica e imuno-histoquimica de quaisquer células amostradas.

Sob um aspecto alternativo da mvençao, e apresengem de células, que las para permitir a coletar uma amostra ro da cavidade retal tado um dispositivo de amostragem para de uma superfície mucosa localizada dent de um indivíduo, que compreende:

um corpo substancialmente cil cavidade aberta na extremidade distai e de ser fechada na extremidade proximal;

uma membrana flexível mantid substancialmente cilíndrico, que forma U ra a cavidade distai aberta da cavidad ser fechada; as duas superfícies da me fície proximal e a superfície distai; e dispositivos para inflação e d· o dispositivo para inflação p são interna do fluido da cavidade proxi chada quando fechada, fazendo com que a vesso a partir da extremidade distai mente cilíndrico até que a superfície di tre em contato com a superfície mucosa a:

o dispositivo para deflação p são do fluido da cavidade proximal fech a membrana seja invertida, de modo que tida dentro do corpo substancialmente c a superfície distai da membrana tiver erl a superfície mucosa a ser amostrada.

Em uma modalidade preferida sitivo de deflação é a válvula. Esta mo seria particularmente adequada para uso mb

Indrico, que tem uma uma cavidade que poa dentro do corpo ma vedação que sepae proximal que pode rana sendo a supereflação, em que ode aumentar a presmal que pode ser femembrana vire do acorpo substancialstal da membrana enser amostrada; e óde diminuir a presida, fazendo com que membrana seja manilíndrico depois que trado em contato com do dá invenção, o dispo|ialidade da invenção com uma membrana e24 élulas esfoliadas de da cavidade retal de a cavidade proximal que seja obtida uma lástica onde a pressão interna na cavidade proximal passível de fechamento fosse maior que a existente fora da cavidade.

' Em uma modalidade preferida ds. invenção, o dispositivo de deflação compreende a seringa conectada à válvula.

Sob um segundo aspecto alternativo da invenção, é apresentado um método de amostragem de c uma superfície mucosa localizada dentro um indivíduo humano, o qual compreende aé etapas de:

levar um dispositivo de amostragem de acordo com a invenção até as proximidades da superfície mucosa sem que a membrana de amostragem faça contato préyio com qualquer outra superfície do corpo;

aumentar a pressão interna d fechada de modo que a membrana flexível vire do avesso da extremidade distai do dispositivo de amostragem;

pôr a superfície mucosa em contato com a superfície distai da membrana flexível de modo amostra de células esfoliadas da superfibie mucosa;

diminuir a pressão interna da cavidade proximal fechada de modo que a membrana flexível e a amostra sejam mantidas dentro da cavid remover o dispositivo e a amos da superfície mucosa sem que a membrana tra faça contato com qualquer outra supe

Em uma modalidade preferida d^. invenção, o método compreende as etapas de.- ₍ prender uma fonte de ar comprimido à válvula e auseja invertida e ela ade distai aberta; e tra das proximidades flexível ou a amosrfície do corpo.

mentar a pressão interna da cavidade projximal fechada abrindo-se a válvula; ou prender uma seringa ã válvula e aumentar a pressão interna da cavidade proximal techada inserindo-se o êmbolo.

Em uma modalidade preferida dá invenção, o método compreende as etapas de:

diminuir a pressão interna dá cavidade proximal fechada abrindo-se a válvula; ou diminuir a pressão interna dá cavidade proximal fechada retirando-se o êmbolo.

Em uma modalidade preferida dá invenção, o método compreende as etapas de:

adicionar um tampão de lise preservador de célula à cavidade distai vo de amostragem; e vedar a cavidade distai abert amostragem.

Sob um terceiro aspecto altern apresentado um método de amostragem de c de células ou meio aberta do dispositia do dispositivo de ativo da invenção, é élulas esfoliadas da superfície mucosa localizada dentro da çavidade retal de um indivíduo humano, o qual compreende as etapas de:

inserir um tubo de acesso retal e um obturador na cavidade retal por meio do canal anal ,retirar o obturador da tubo de inserir um dispositivo de amos a invenção na cavidade retal por meio do tubo de acesso retal, sem que a membrana flexível do dispositivo de amostra acesso retal;

tragem de acordo com â

rfície do corpo; gem a um dispositivo .a cavidade proximal vire do avesso da stragem;

com a área de superesfoliadas da supera cavidade proximal seja invertida e ela idade distai aberta,stragem da cavidade sem que a membrana éntre em contato com

:.o do tubo de acesso al e o obturador da de células ou meio aberta; e a do dispositivo de gem faça contato com qualquer outra supe ligar o dispositivo de amostra para inflação;

aumentar a pressão interna fechada de modo que a membrana flexíve extremidade distai do dispositivo de amo pôr a mucosa retal em contato fície fixa da mucosa retal;

obter uma amostra de células fície da mucosa retal;

diminuir a pressão interna fechada de modo que a membrana flexível e a amostra sejam mantidas dentro da cav retirar o dispositivo de am< retal por meio do tubo de acesso retal flexível do dispositivo de amostragem qualquer superfície do corpo,substituir o obturador por me retal;

retirar o tubo de acesso ret cavidade retal por meio do canal anal;

adicionar um tampão de lise preservador de células â cavidade distai vedar a cavidade distai abert amostragem.

Sob um quarto aspecto alterna apresentado um método de triagem e diag lorretal que compreende qualquer um dos tivo da invenção, é fiose para câncer cométodos apresentados

3Q acima e que compreende também recuperar a amostrada coletada do análise na amostra.

invenção, a análise do DNA, da extração nálise molecular opdispositivo de amostragem e realizar uma Em uma modalidade preferida da é selecionada a partira da quantificação do DNA seguida por sua quantificação e ar cional, investigação citológica/citoquímica e testes bioquímicos. Deve-se observar que a exatidão da triagem por qualquer um destes métodos será aperfeiçoaáa pela obtenção de uma amostra com baixos níveis de contaminadores e uma alta concentração de células tiradas da supe: retal que é amostrada.

Breve Descrição das Figuras

A invenção será agora descrit^/ a título de exemplo apenas, com referência aos desenhos ánexos, nos quais:

A Figura 1 mostra uma vista em corte transversal rfície mucosa coloras da invenção. tação esquemática de no qual os disposiseringa.

tação esquemática de da invenção no qual de um dispositivo de amostragem de célul A Figura 2 mostra uma represen um dispositivo de amostragem de células tivos para pressurização compreendem uma A Figura 3 mostra uma represen' um dispositivo de amostragem de células os dispositivos para pressurização compreendem uma fonte de ar comprimido.

A Figura 4 mostra os componentes necessários para amostrar células esfoliadas da superfície mucosa colorretal de um indivíduo humano.

A Figura 5 mostra um exemplo di tragem de células esfoliadas da superfíc e um método de amosie mucosa colorretal de um indivíduo humano que utiliza qualquer um dos dispositivos mostrados nas figuras 1-4.

A Figura 6 mostra um exemplo c|^as etapas que podem seguir o método mostrado na figura 5.

Descrição Detalhada da Invençã^

Descrição de modalidades de amostragem de células substancialmente ciechada na extremida0 dispositivo de amostragem de células da figura 1 é projetado para inserção em uma cavidai tivo compreende um elemento de inserção lindrico 1 com uma cavidade interna 3, f de de inserção distai 2 por uma membranã flexível e resiliente 4, que é presa, à maneira de vedação, ao elemento 1 na extremidade distai 2. Na posição mostr membrana 4 é mantida dentro da cavidade ada na figura 1, a 3 e é adaptada para ser emitida da cavidade 3 quando a cavidade 3 é pressurizada detalhadamente na figura de amostragem de células figura 1 é a superpor dispositivos 7 (mostrados mais 2). A membrana 4 tem uma superfície 5, que na posição de repouso mostrada na ficie interna, mas quando a membrana é cie externa, e uma superfície oposta 6 repouso é a superfície externa, mas que cie interna quando a membrana é emitida emitida é a superfí, que na posição de se torna a superfíA membrana é feita de nitrilo, látex ou uma substância à base de borracha. Na fechada por uma válitivo de pressurizaal o dispositivo paé uma seringa inteextremidade proximal 34, a cavidade 3 é vula de auto-vedação 18, à qual o dispôs ção 7 é adaptado para ser fixado.

A modalidade da invenção na quJ ra pressurização da cavidade interna 7 grada é mostrada na figura 2, que mostra também esquematicamente as etapas necessárias para a amostragem de célula es dê um indivíduo huntação do dispositierção em uma cavidamento de inserção 1 foliadas da superfície mucosa colorretal mano (Figuras 2A-2D).

A Figura 2A mostra uma represe vo de amostragem de células antes da ins de retal. A seringa 7 é presa a um ele substancialmente conforme descrito na figura 1. A seringa de vedação, ao lono a alterar o volume . O êmbolo 23 da setem um êmbolo 23, que desliza, à maneira go de um cilindro 32 da seringa 7 de mod dentro da câmara interna 33 da seringa 7 ringa 7 é fixado de modo que 7 0 ml de àr estejam presentes dentro da câmara 33 da seringa 7.

A Figura 2B mostra uma represeintação do dispositivo de amostragem de células uma vez inserido em uma cavidade retal. O êmbolo 23 da seringa foi completamente apertado, o que faz com que a membrana flexível 4 volume de 70 ml. A membrana flexível contato com a superfície mucosa colorrétal de humano de modo que quaisquer células seja inflada até um inflada faz então um indivíduo sejam transesf oliadas feridas para a superfície externa da membrana flexível 4.

A Figura 2C mostra uma represe vo de amostragem de células uma ve: esfoliadas e antes da remoção da cav: da seringa 7 é retraído de modo que í ;ntação do dispositi.mostradas as células retal. O êmbolo 23 le ar estejam prerr.

sentes dentro da câmara da seringa 7. Isto cria, portanto, uma pressão reduzida dentro da câmara, membrana flexível 4 seja reintroduzida que faz com que a na cavidade interna

do elemento de inserção 1 e adira firmemente âs paredes laterais do elemento de inserção 1. A quantidade de pressão reduzida pode ser pré-quantificada pela lementos de retenção de encaixe de press| quais é mostrado na figura 2C) . Os elenjentos pressão 24 são braços presentes no êmbólo 23 que são localizados em orifícios no cil:

presença de dois βίο 24 (apenas um dos de encaixe de da seringa 7 indro 32 da seringa

7. A finalidade dos elementos de encaixe de pressão 24 é a de impedir a retirada do êmbolo 23 da se A Figura 2D mostra uma represe vo de amostragem de células depois da ringa 7.

ntação do dispositiremoção da cavidade retal e antes da análise das células. A extremidade de inserção distai do elemento de inserção 1 é dotada de uma rosca que é adaptada para alojar uma tampá rosqueada 8 com 20 mm de diâmetro. A tampa 8 pode ter um pacote vesicante que contém um tampão de modo que, ao se atarraxar a tampa 8 no elemento de inserção 1, o tampão seja liberado para dentro do receptáculo formado pela membrana flexível 4 esvaziada.

Depois de atarraxada a tampa 8 no eleme nto de inserção 1, a seringa 7 pode ser destacada do elemento de inserção 1, de ão 1 seja convertido , juntamente com uma onado e enviado a um modo a permitir que o elemento de inserç: em um vial de análise compacto, o qual série de outros viais, pode ser acondici laboratório para análise das células.

A modalidade da invenção na qúal o dispositivo para pressurização da cavidade interna y é uma fonte de ar comprimido é mostrada na figura 3. Esta figura mostra esquematicamente um dispositivo mecânico 9, que é uma bomba acioV

é ca' a ativação do ga,|)az de fixação em um e conforme descrito onador de encaixe do tivo mecânico 9, que no elemento de in18 está presente no ar que a pressão seo 1 quando do deslimento de inserção 1 adas para entrar em nada por um motor elétrico (não mostrado) capaz de distribuir doses repetidas de uma primeira pressão elevada seguida por uma segunda pressão reduzida mediante tilho 14. O dispositivo mecânico elemento de inserção 1 substancialment nas figuras 1 e 2 por meio de um posici tipo de estalido 16 presente no disposi coopera com um ressalto posicionador 17 serção 1. Uma válvula de auto-vedação elemento de inserção 1 de modo a assegur ja mantida dentro do elemento de inserçã gamento do dispositivo mecânico 9. O el compreende palhetas 19, que são projet contato com um proctoscópio e são rosqueadas 20 na extremi dade de inserção distai de modo a alojarem uma tampa rosque ada 9, que tem um pacote vesicante 21 que contém um tampão. O dispositivo mecânico 9 é projetado para ser ativado por batería e pode ser recarregado por um fornecimento de energia através de uma tomada de carga 12. C> dispositivo mecânico 9 compreende um filtro de admissão de ar 25, um cabo de borracha 13 e tem também um comutador liga-desliga 15 e diodos emissores de luz 10 e 11, que indic tivo 9 está pronto e quando o ciclo da aplicações de pressão estão completas.

Quando em uso, o usuário segu cânico 9 pelo punho 13 do cabo do tipo cha e prende o dispositivo 9 ao elemeiito de inserção 1. 0 elemento de inserção é em seguida inserido na cavidade ream quando o disposis primeira e segunda ra o dispositivo mede pistola de borra32 tal, onde entra em contato com um proctoscópio por meio das incia de penetração da é aplicada pelo flaz com que o ar seja átravés do filtro de ido e faz com que a .de distai do ele> com a superfície .zida é em seguida lo 14 uma segunda vel volte â cavidade vez completada a aerção 1 é desengataico 9 é destacado do o do elemento de inde auto-vedação 18. que contém um pacopalhetas 19, o que permite uma consist aperfeiçoada. Uma primeira pressão elev usuário ao apertar o gatilho 14, o que introduzido no dispositivo mecânico 9 admissão de ar 25, que é então comprim membrana flexível seja emitida da extreir. mento de inserção 1 de modo a fazer cont mucosa colorretal. Uma segunda pressão aplicada pelo usuário ao apertar o g vez, o que faz com que a membrana flexí interna do elemento de inserção 1. Uma mostragem das células, o elemento de ins do do proctoscópio e o dispositivo mecân elemento de inserção 1 e a pressão dentr serção 1 é mantida por meio da válvula Uma tampa rosqueada 8, que tem um tampãc te vesicante 21, pode ser então atarracada em uma rosca 2 0 no elemento de inserção 1, fazendo com cjue o tampão seja liberado para dentro do receptáculo formado pela membrana flexível esvaziada. 0 dispositivo mecânico 9 pode ser então reutilizado ao ser preso a elementos qe inserção 1 subseqüentes .

Componentes necessários para a) técnica de amostragem de células por toque-impressão.

Os componentes necessários pára a amostragem de células esfoliadas a partir de uma superfície mucosa colorretal de um indivíduo humano são apresentados na figura 4.

i

O acesso à mucosa rétal pode ser obtido pela utilização de um tubo de acesso retal 29, que jbode ser uma modificação de um instrumento existente para exame retal (o retoscopio 22, por exemplo) . 0 tubo de acesso retal 29 consiste equipado com um obturador em fobma de oliva e ininscrito na figura 1 e diâmetro interno do da cavidade interna.

em um tubo rígido (com um cabo)

30, que apresenta uma superfície terrupta que facilita a introdução do tjubo de acesso retal 29 no reto através do canal anal.

ii) 0 dispositivo de amostragem de células 1 mostrado na figura 4 é substancialmente conforme de tem um diâmetro externo compatível com o tubo de acesso retal, isto é, na faixa de 15-20 mm.

iii) Uma fonte de ar comprimido 7 serve para proporcionar um meio para a pressurização

Os dispositivos para pressurização 7 pòdem compreender uma seringa (conforme descrita na figura 2) , uma bomba de ar (conforme descrita na figura 3) ou um mini-recipiente de ar comprimido (mini-cilindro). A pressão do ar no interior do dispositivo de amostragem de células da/controlada ou utilizando-se um volume de seringa simples) ou atingindo-se um ar fixo (uma válvula de precisão seria finalidade).

iv) Uma garrafa ou tubo com uni tampão 3 5 específipode ser limitade ar fixo (solução nível de pressão do necessária para esta co (tampãos diferentes devem ser utilizados para finalidades diferentes, tal como extração de DNA ou RNA ou isolamen34 to/separação de células para análise adicional).

v) Uma tampa hermética mostragem de células (necessária

o dispositivo de areações de lise de células/proteínas se uma extração imediata de DNA ou RNA for de células e, espedo material se não exemplo, transporte ilizados como um esos componentes enufeita, para procedimentos de isolamento cialmente, para armazenamento/transporte for utilizado imediatamente, como, por do consultório médico/clinica até o laboiratório) .

Os componentes necessários para o procedimento podem ser desenvolvidos de modo a serem ut:

tojo descartável, que deve incluir todos merados com a exceção da fonte de ar comprimido, que pode ser utilizada repetidamente.

Descrição da técnica de amostragem de células por toque-impressão (manipulações retais)

A Figura 5 mostra um exemplo da técnica de amostragem de células por toque-impressão pára amostrar células tal de um indivíduo spositivos mostrados nenhum treié necessário ser executado por um ermeira, etc.) em um a do paciente ou poesfoliadas da superfície mucosa colorre humano utilizando-se qualquer um dos di nas figuras 1-4. Este procedimento é siilnples e namento especial em proctologia ou endoscopia para que o operador o execute. Ele pode profissional médico qualificado (GP, enf consultório médico local ou na residênci de ser até auto-administrado pelo paciente.

A Figura 5A mostra esquematicamente um corte transversal da anatomia do reto humano 28, do canal anal 26 e da camada mucocelular colorretal 27. Deve-se observar que

com um obtuUm lubrificante qualquer contato do dispositivo de amostragem de células com o epitélio escamoso do canal retal pods resultar tanto em perda de material quanto na contaminação da amostra com o epitélio escamoso do canal anal.

O procedimento começa com a introdução de um tubo de acesso retal 29, semelhante a um retoscópio rador 30 no lugar no reto 28 (figura 5B) apropriado pode ser utilizado no procedimento de introdução para facilitá-lo e diminuir o desconforto do paciente, que pode ser causado por este estágio inicial do procedimento.

Uma vez introduzido o tubo de acesso retal 29 (figura 5C) e removido o obturador 30, o acesso direto à mucosa retal é obtido e a camada mucocelular 27 se abre.

O elemento de inserção 1 é introduzido no tubo de acesso retal 29 de modo que a borda superior do elemento de inserção seja localizada imediatamente q^ci^ma· da borda do tubo de acesso retal (figura 5D).

É aplicada uma primeira pressão elevada, que infla a membrana flexível coletora de modo a contato com a camada mucocelular retal ter a amostragem de células por toque-irhpressão (figura 5E) . O dispositivo é deixado nesta posição durante aproximadamente 10-15 segundos de modo a se obter um| melhor aderência de células esfoliadas e materiais obtidos mucocelular à membrana coletora.

A Figura 5F mostra a aplicação de uma segunda pressão reduzida, que esvazia a membrana flexível e faz com que ela volte à sua posição inicial com o material coletado se pôr a membrana em 27, de modo a se obde células da camada

i * ·» * em de células.

ovido do tubo de apulações e análises, ovo, re-lubrificado) e o tubo 29 é rerocedimento completo s que dois minutos.

tadas das etapas que podem figuras 5A-5G, que a coleta das célu,0mbrana de coleta de vo de amostragem de obre a membrana flede células. O comstragem de células é específico, que (b)). Tampãos es de células difentos de extração de m ser utilizados em élulas. O dispositipara transporte ou icamente fechado com mas deve ficar enum tampão que con) pode ser omitida, rfansportado para ou31 sobre a superfície externa de amostrarj

O elemento de inserção 1 é rem cesso retal 29 e tomado para outras mani 0 obturador 30 (pode ser utilizado um n é reinstalado no tubo de acesso retal 2 movido do reto 28 (ver a figura 5G). O p (manipulações retais) não deve levar mai

Processamento das células cole

A Figura 6 mostra um exemplo seguir o método mostrado acima para as devem ser completadas imediatamente apõe, las de modo a se evitar a secagem da m células. A etapa (a) mostra o dispositi' células 1 com as células esfoliadas 31 s xível coletora de células após a coleta partimento de topo do dispositivo de amo enchido com um volume fixo de um tampãc lisa ou suspende as células esfoliadas de lise de células ou meios preservador rentes podem ser utilizados em procedime DNA ou RNA, tampãos/meios especiais deve: aplicações que exigem o isolamento das c vo de amostragem de células é preparado armazenamento de amostras por ser hermet uma tampa rosqueada 8 segura (etapa (c)) tendido que, quando a tampa rosqueada te tém um pacote vesicante, então a etapa (

O dispositivo pode ser armazenado ou t (Etapa * * · * » 4

ca apresenta um grau omparação com outras spositivo padrão com da membrana de coHmada mucocelular reigenciável comparasfoliadas, como, por s) e quantidade paimento de amostragem ráveis para análise u das quantidades de r exemplo).

fins de triagem de

Çfl tros procedimentos a jusante par gem/diagnóstico e/ou pesquisa (etapa (d) Análise de amostras

Deve-se enfatizar que a técni muito mais elevado de padronização em c abordagens existentes. O uso de um di pressão/volume de ar padrão, área padrã^ leta inflada (a área de contato com a c tal pode variar, mas esta variação é ne da com outras maneiras obter células e exemplo, técnicas baseadas em evacuaçõé drão de tampão adicionado após o proced. de células criam condições muito favo comparativa ou dos números de células o substâncias obtidas das células (DNA, po (a) Análise de amostras para câncer colorretal

A triagem do câncer colorret avaliação, baseada na população (definj: indivíduos que não apresentam queixas p sintomáticos (precoces na maioria dos cs. tratamento oportuno pode reduzir a mort condição. Um pré-requisito necessário aplicabilidade simultânea em milhares/mi

i) Dado que há fortes indica consideravelmente mais elevadas de colori¹ do de colonócitos na camada mucocelular implica uma ampla ida pela idade) , de ra revelar casos assos) da doença, cujo alidade causada pela para o método é sua lhões de pessoas, ções de quantidades ócitos e DNA derivaretal de pacientes

Cll com câncer colorretal em comparação com indivíduos isentos r* » · ο de tumores, é muito provável que a técni ca de amostragem ditara análise de alto compatível com sisum DNA de muito menicas atualmente emde evacuação. A amreta de colonócitos esfoliados e materiais derivados de colonócitos pode proporcionar um teste de triagem simples para câncer colorretal com base na quantificáção direta da quantidade de DNA extraído das células. Paira esta abordagem, o tampão inicial utilizado imediatamente após a amostragem das células deve ser um tampão de lise de células utilizado no procedimento de extração de DNA selecionado. A adição do tampão deve proporcionar uma lise de células eficaz e a preservação do material que contém DNA durante a transportação algum de armazenamento. O método de extração de DNA deve ser selecionado com base em sua aplicabilidade rendimento operacional, isto é, deve ser temas robóticos de manejo de líquido d.e vários canais. Os valores exatos das quantidades de DNA que definem os resultados positivos, negativos e duvidosos do teste devem ser determinados em tentativas clinicas.

ii) As etapas iniciais semelhantes da extração de DNA podem ser aplicadas à análise de marcadores moleculares de câncer colorretal. As células amostradas pelo procedimento de toque-impressão devem apresentar lhor qualidade em comparação com as tédr pregadas de extração de DNA de amostras plificação PCR deste DNA pode ser feita sem quantificação precisa de sua quantidade. A análise molecular com vários objetivos é considerada como uma opção na triagem do câncer colorretal, mas ela pode ser mais demorada e dispendiosa

ÍÃ

eta. Ao mesmo tempo, pode ser certamente ise diagnostica adiitivos ou duvidocomparada com a análise quantitativa dire o DNA extraído para quantificação direta utilizado para amplificação PCR na anál cional de casos quantitativamente pos:

sos .

iii) Em caso de necessidade dê isolamento específico de colonócitos de células de outrc aplicados métodos de separação (como, poi imunomagnética ou com gradiente de dens: obter maior pureza da população de células para a análise. Para isto, podem ser app preservadores de células que contêm antibióticos (alguma presença de bactérias no material coletado é impossível de evitar) e agentes mucolíticos. Os colonócitos isolados podem ser então utilizados em diferentes tipos de análise, tais como extração e quantificação de DNA, extração de DNA seguida de amplificação PCR, análise de marcadores moleculares e bioquímicos de câncer, avaliação citológica/citoquímica e contagem direta de células (duvidosa em termos de triagem devido à baixa velocidade e alto custo).

(b) Diagnose de câncer colorrei O uso diagnóstico de testes é víduos que apresentam algumas queixas específicas e já identificados como sofrendo de uma condição. Os grupos-alvo de pacientes são muito menores que os esperados para fins de os tipos, podem ser r exemplo, separação idade) de modo a se de colonócitos licados alguns meios tal focalizado em inditriagem.

(i) A quantificação direta de

DNA pode ser aplicada em indivíduos que apresentam queixas que indicam possí40 veis condições colorretais.

(ii) A extração de DNA seguida e da análise molecular pode ser útil tanto para confirmação da diagnose inicial quanto para procedimentos diagnósticos 5 avançados (avaliação da agressividade do câncer, sensibilidade â quimioterapia para tumores meta.státicos, prognose, etc.) .

iii) O isolamento das células pode ser utilizado em outras análises tanto moleculares quanto bioquímicas, e a investigação citológica (células tumorosas com aspectos morfológicos específicos) pode ser facilmente encontrada entre colonócitos esfoliados em pacientes com CRC.

da amplificação PCR

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo de amostragem de células colorretais, compreendendo:

um elemento de inserção colorretal (1), que tem uma extremidade de inserção distal (2), uma extremidade proximal (34) e uma cavidade interna que pode ser fechada (3);

uma membrana flexível (4), que tem uma superfície externa de amostragem de células (5) e uma superfície interna, em que a membrana é presa, à maneira de vedação, à extremidade de inserção distal do elemento de inserção e quando mantida dentro da cavidade interna forma um receptáculo tendo uma superfície de amostragem de células no interior do mesmo, o receptáculo sendo aberto para a extremidade de inserção do elemento de inserção;

de modo que, quando em uso, a pressurização da cavidade interna até pelo menos uma primeira pressão elevada faz com que a membrana seja emitida da extremidade distal do elemento de inserção de modo a fazer contato com a superfície mucosa colorretal e a pressurização da cavidade interna através da válvula de auto-vedação até uma segunda pressão reduzida faz com que a membrana seja invertida e volte à cavidade interna do elemento de inserção;

CARACTERIZADO por o dispositivo compreender ainda dispositivos (8) para vedar a extremidade de inserção para formar uma cavidade fechada posicionada dentro da cavidade interna do elemento de inserção e definida pela superfície de amostragem de células da membrana flexível e os meios de vedação.

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2. Dispositivo, conforme definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a membrana flexível é elástica e é construída a partir do nitrilo, do látex ou de uma substância à base de borracha.

3. Dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO por compreender também dispositivos (7) para a pressurização da cavidade interna, em que os dispositivos são presos à válvula de autovedação presente na extremidade proximal do elemento de inserção.

4. Dispositivo, conforme definido na reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que os ditos dispositivos para pressurização da cavidade interna compreendem uma fonte de ar comprimido.

5. Dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o elemento de inserção é adaptado para entrar em contato com um tubo de acesso retal.

6. Dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o fluido pode ser introduzido na cavidade fechada formada pela membrana flexível e os dispositivos de vedação.

7. Dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que a cavidade interna do elemento de inserção é fornecida com dispositivos de aderência.

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8. Dispositivo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que os dispositivos de vedação são tampas rosqueadas.

9. Dispositivo, conforme definido em qualquer rei5 vindicação de 3 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que os dispositivos para a pressurização da cavidade interna são destacáveis do elemento de inserção.

Petição 870180040397, de 15/05/2018, pág.

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Petição 870170089507, de 21/11/2017, pág. 16/22

Petição 870170089507, de 21/11/2017, pág. 17/22

FIGURA3

Petição 870170089507, de 21/11/2017, pág. 18/22

Petição 870170089507, de 21/11/2017, pág. 19/22

FIGURA 5

Petição 870170089507, de 21/11/2017, pág. 20/22

Petição 870170089507, de 21/11/2017, pág. 21/22