RS20060702A - Uređaj za uzorkovanje kolorektalnih ćelija - Google Patents

Abstract

Prikazani pronalazak se odnosi na uredjaj za sakupljanje uzoraka otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta koji obuhvata kolorektalni umetak (1) koji ima distalni kraj (2) za umetanje i proksimalni kraj (34) i unutrašnju šupljinu koja se zatvara (3), elastičnu membranu koja ima spoljašnju površinu (5) za uzorkovanje ćelija i unutrašnju površinu, gde pomenuta membrana je vezana i zatvara distalni kraj za umetanje pomenutog umetka i ima oslonac unutar unutrašnje šupljine, tako da prilikom upotrebe, dovodjenjem unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog pritiska dovodi do toga da se membrana izbaci sa distalnog kraja pomenutog umetka da bude u kontaktu sa površinom kolorektalne sluzokože i dovodjenje unutrašnje šupljine do drugog sniženog pritiska izaziva da se membrana uvuče i vrati u unutrašnju šupljinu pomenutog umetka. Takodje su opisani kit koji sadrži pomenuti uredjaj i postupci uzorkovanja kolorektalnih ćelija korišćenjem pomenutog uredjaja.

Description

UREĐAJZAUZORKOVANJE KOLOREKTALNIH ĆELIJA

Oblastpronalska

Prikazani pronalazak se odnosi na uređaj za sakupljanje uzorka otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanih subjekata, na kit koji sadrži pomenuti uređaj i postupke za uzorkovanje kolorektalnih ćelija pomoću pomenutog uređaja.

Stanjetehnike

Jedna od najčešćih i najsmrtonosnijih onkoloških bolesti koje napadaju ljude u razvijenim zapadnim zemljama je sporadični kolorektalni kancer (colorectal cancer - CRC). Pretežno napada ljude koji su stariji od 50 godina.

U većini slučajeva, ozbiljna prepreka za ranu dijagnozu CRC je nepostojanje ranih kliničkih pokazatelja lakih za identifikovanje. Bolest je lako dijagnozirati samo u poodmaklim stupnjevima bolesti, kada su obrazovani veći tumori koji dovode do bola, krvarenja i obstruktivnih simptoma. Međutim, kasniji stadijumi bolesti su takođe povezani sa invazivnim ili metastatičkim tumorima. Prema tome, detekcija kolorektalnih tumora, pre uznapredovalih stadijuma bolesti, bi mnogo povećala šanse uspešne hiruške intervencije i ukupne stope preživljavanja.

U nedostatku ranih kliničkih pokazatelja lakih za identifikovanje, decenijama traje potraga za pogodnim postupcima za rano otkrivanje CRC. Nažalost, za sada ne postoji tehnika za rano otkrivanje CRC koja spaja nisku invazivnost, jednostavnost i niske troškove sa visokom osetljivošću i specifičnošću. Dva postupka za rano otkrivanje CRC su fleksibilna kolonoskopija/sigmoidoskopija i testiranje krvi u fekalijama (faecal occult blood testing-FOBT) [Rennert, G. Recent Results Cancer Res. 2003; 163: 248-253, Atkin, W. Scand. J. Gastroenterol. (Suppl.) 2003; 237: 13-16, Walsh, J. M. and Terdiman, J. P. JAMA 2003; 289: 1288-1296]. Međutim, oba ova postupka imaju značajne nedostatke.

Fleksibilna kolonoskopija/sigmoidoskopija se smatra za precizan i pouzdan dijagnostički postupak, međutim, njegova invazivnost, cena i uslov da postupak izvode obučeni i iskusni specijalisti čini njegovu upotrebu nepraktičnom za rutinsko rano otkrivanje. Isto važi i za skoro uvedenu kompijuterizovanu tomografsku kolonografiju (virtualnu kolonoskopiju).

FOBT je jeftin i jednostavan, međutim, daje neprihvatljivo visoke odnose i lažnih negativnih i lažnih pozitivnih rezultata. Uprkos ovim ograničenjima, za sada najčešće korišćeni postupak za rano otkrivanje je FOBT.

Ispitivani su alternativni postupci dijagnoze CRC zasnovani na direktnom pokazatelju prisustva tumora. Jedan pokazatelj koji je bio identifikovan je analiza otpalih kolonocita. Otpadanje kolonocita (tj. spontano odvajanje ćelija od uredno organizovanog epitelnog sloja sluzokože creva) je važan mehanizam obnavljanja ćelija u čovečijim crevima [Eastwood, G. L. Gastroenterologv 1977; 41: 122-125]. Pre približno 50 godina je izvedena citološka analiza kolonocita dobijenih iz materijala dobijcnog crevnim ili rektalnim ispiranjem (tj. irigacijom kolorektalne sluzokože) [Bader, G. M. and Papanicolau, G. N. Cancer 1952; 5: 307-14]. Ovaj rad je pokazao da kod CRC pacijenata mogu biti detektovane morfološki različite otpale neoplastične ćelije. Međutim, postupak dobijanja ovih uzoraka (postupkom invazivnog ispiranja creva) ima isti nedostatak kao sigmoidoskopija/kolonoskopija i zahteva detaljne citološke analize jednom dobij enog uzorka.

Preovlađujući prilaz u dobijanju uzoraka otpalih epitelnih ćelija je njihovo izolovanje iz humanog fecesa. Kao izvor takvih ćelija identifikovan je humani feces, jer otpale ćelije epitela creva mogu biti izbačene zajedno sa drugim fekalnim materijalom.

Prve pokušaje korišćenja kolonicita izolovanih iz humanog fecesa za svrhe dijagnoze i istraživanja započeli su P.P. Nair i njegove kolege pre oko 15 godina. Oni tvrde da su u stanju da povrate hiljade "živih" otpalih ćelija iz nekoliko grama raspršenog fekalnog materijala pomoću izolacionog postupka zasnovanog na centrifugiranju u gradijentu gustine [Ivengar, V.et al,FASEB J 1991; 5: 2856-2859, Albaugh, G. P.et al.,Int. J. Cancer 1992; 52: 347-350]. Međutim, ove ambiciozne tvrdnje su dovedene u sumnju, usled niske verovatnoće prisustva dobro očuvanih kolonocita u agresivnom anaerobnoj okolini kao što je ona u fecesu. Pored toga, morfološki dokaz prikazan u njihovoj referenci iz 1991 je bio neubedljiv. P.P. Nair i članovi njegove grupe održavaju validnost njihovog pristupa [Nair, P.et al.,J. Clin. Gastroenterol. 2003; 36(5 Suppl.) S84-S93J, ali na rezultatima njihovih ispitivanja nije zasnovan bilo koji praktični napredak.

Međutim, uprkos nedostatka praktičnog napretka P.P. Nair i njegovih kolega, upotreba humane stolice za svrhe dijagnoze i istraživanja, ostavlja aktivnu oblast istraživanja kao što jeste, bez vezivanja sa bilo kojom invazivnom intervencijom. Brojne grupe su preduzele pokušaje da izoluju genetički materijal (DNK) koji potiče iz kolonocita iz uzoraka humane stolice u cilju razvijanja dijagnostičkih postupaka koji koriste molekulske biomarkere maligniteta. Iako direktno izolovana DNK iz homogenizovane stolice može biti pojačana i analizirana na prisustvo genetičkih alternacija u vezi sa kancerom, nepostojanje, jednog visoko pouzdanog molekulskog biomarkera za kancer dovodi do upotrebe višestrukih molekulskih markera koji ukazuju na brojne genetičke alternacije koje je poznato da su sa relativno visokom učestalošću prisutne kod malignih ćelija. Opisano je APC, K-ras i p53 gena kombinovanu sa analizom mikrosatelitskog markera [Ahlquist, D. A.et al,Gastroenterology 2000; 119: 1219-1227, Dong, S. M.et al,J. Natl. Cancer Inst. 2001; 93: 858-865, Rengucci, C.et al,Clin. Cancer Res. 2001; 93: 858-865, Traverso, G.et al,N. Engl. J. Med. 2002; 346: 311-320]. Takođc, metilacione promene u fekalnoj DNK se smatraju kao potencijalni dijagnostički marker [Muller, H. M.et al,Lancet 2004; 363: 1283-1285]. Iako je izvodljiva detekcija kolorektalnih tumora više-ciljnim molekulskim testovima, u pitanju je validnost ovih postupaka za svrhe ranog otkrivanja usled visokih cena i relativne kompleksnosti uključenih laboratorijskih postupaka.

Traganje za CRC molekulskim markerima u ekstrahovanoj DNK iz homogenizovanih uzoraka stolice zasenili su važnost inicijalnog sakupljanja/izolovanja otpalih kolonocita. Međutim, očigledno je da je homogenizovana stolica težak materijal za ekstrakciju humane DNK. Naročito, izobilje bakterija u fecesu može ometati postupke dobijanja DNK kolonocita, a u prisustvu anaerobne bakterijske flore humanih creva javlja se brzo oštećenje i degradacija DNK sisara.

Razvijanje prilaza koji se zasnivaju na izolovanju otpalih kolonocita je sporo, delimično usled nedostatka neočekivanih saznanja o otpadanju ćelija u crevu u normalnim fiziološkim stanjima i u bolesti. Sadašnji pogledi na otpadanje kolonocita su još uvek pod uticajem stare i nedokazane hipoteze koja u sebi sadrži 'obavezno' otpadanje gotovo svih diferenciranih kolonocita posle njihove migracije u luminalni epitelijum iz kripte creva (tj. predpostavlja se da bi bili prisutni milioni kolonicita u fekalnoj materiji usled velike brzine proliferacije ćelija epitelijuma creva, a sve ćelije eventualno otpadaju). Međutim, postaje jasno da programirana smrt ćelija ili apoptozain situje bar isto toliko važna kao i otpadanje [Hali, P. A.et al,J. Cell Sci. 1994; 107: 3569-3577, Barkla, D. H. and Gibson, P. R. Pathology 1999;31:230-238, Ahlquist, D. A.et al,Hum. Pathol. 2000;31:51-57]. Odnos između ova dva glavna mehanizma uklanjanja ćelija sa sluzokože creva može podleći značajnim promenama kod kolorektalne neoplazije. [Ahlquist, D. A.et<?/.(supra)]. Zaista, sada je dokazano da su normalni putevi regulacije koji dovode ćelije do apoptoze ozbiljno deregulisani kod malignih tumora [Bedi, A.et al,Cancer Res. 1995; 55: 1811-1816, LaCasse, E. C.et al,Oncogene 1998; 17: 3247-3259, Jass, J. R. Gastroenterology 2002; 123: 862-876, Oren, M. Cell Death Differ. 2003; 10: 431-442, Boedefeld, W. M. 2<nd>et al,Ann. Surg. Oncol. 2003; 10: 839-851] dovodeći do visokog smanjena potencijala apoptoze ćelija kancera. U isto vreme, poznato je da se adhezija ćelija tumora dramatično smanjuje kako kancer napreduje [Yamamoto, H.et al,Cancer Res. 1996; 56: 3605-3609, Haier, J. and Nicolson, G. L. Dis. Colon Rectum 2001; 44: 876-884, Leeman, M. F.et al,J. Pathol. 2003;201:528-534]. Poslednja pojava je važna za širenje metastaza, međutim kod kolorektalne neoplazije, kombinovana supresija apoptoze i pad intracelularne adhezije/komunikacije mnogo povećava šanse skidanja malignih ćelija sa površine tumora koji rastu. Ukoliko je ovo slučaj, otpale ćelije tumora, od kojih će neke verovatno zadržati proliferativni potencijal, treba da se razlikuju od njihovih normalnih (netumornih) otpalih duplikata u sledećem: i) brojnije su usled olakšanog otpadanja sa površine tumora; i ii) imaju mnogo veći kapacitet "preživljavanja", naročito usled veće otpornosti na nedostatak kiseonika [Graeber, T. G.et al,Nature 1996; 379: 88-91]. Posle otpadanja, ove ćelije ulaze u relativno dobro oksigenovani 'mukocelularni sloj' koji odvaja sluzokožu creva od fekalnog sadržaja creva i permanentno se distalno pokreće sa kretanjem fekalija [Ahlquist, D. A.et^/.(supra)].

Do skoro nije bila shvaćena važnost mukocelularnog sloja koji obezbeđuje zajedničku graničnu površinu između kolorektalne sluzokože i fekalnog sadržaja creva. Eksperimentalna istraživanja pokazuju da se sa površine izmeta pacova može lako dobiti DNK dobrog kvaliteta i koristiti za dalju amplifikaciju i analize mutacije gena [Loktionov, A. and O'Neill, I. K. Int. J. Oncol. 1995; 6: 437-445]. Ovi rani eksperimenti sugerišu da DNK ekstrahovana iz kolonocita izolovanih sa površine humane stolice (površina stolice se može smatrati kao frakcija mukocelularnog sloja izbačenog sa fekalijama) može biti korišćena za molekulsku analizu. Razvijen je postupak izolovanja otpalih ćelija iz celih uzoraka humane stolice ispiranjem ćelija sa površine ohlađenih fekalija i njihovo sakupljanje pomoću postupka imunomagnetnog odvajanja [Loktionov, A.et al,Clin. Cancer Res. 1998; 4: 337-342]. Mada je inicijalno bio planiran rad u ovom pravcu, u smislu razvijanja molekulskih dijagnostičkih testova za CRC, ustanovljeno je da za dijagnozu i rano otkrivanje CRC mogu biti korišćene jednostavne kvantitativne analize DNK koja potiče iz kolonocita sa površine humane stolice, s obzirom da relativna količina DNK kod pacijenata sa CRC je mnogo viša u poređenju sa zdravim pojedincima. Drugi autori takođe su zabeležili veće količine otpalih ćelija [Dutta, S. K.et al,Gastroenterology 1995; 108 (Suppl.): A463] ili DNK [Villa, E. et al., Gastroenterology 1996; 110: 1346-1353] ili u dispergovanim ili homogenizovanim uzorcima stolice dobijenim od pacijenata sa CRC, međutim u ovim studijama primećene razlike između zdravih ljudi i pacijenata sa kancerom nisu bile dovoljno velike da bi se smatrale dijagnostički validnim. Nasuprot tome, Loktionovet al(supra) su bili u stanju da pokažu postojanje upadljive razlike između CRC pacijenata i zdravih pojedinaca korišćenjem izračunatog indeksa koji se odnosi na količinu DNK ekstrahovanog iz ćelija izolovanih sa površine stolice prema težini stolice (indeks DNK stolice ili 'stool DNA index' - SDNAI).

U US patentu broj 6,187,546 opisan je dijagnostički postupak zasnovan na SDNAI. Iako tehnika i rezultati njegovih početnih ispitivanja očigledno ističu veoma efikasan, jednostavan i jeftin prilaz ranom otkrivanju CRC, postoje i brojni suštinski nedostaci (očigledne teškoće rukovanja ćelom stolicom i naročito nemogućnost standardizacije postupka) sprečavanje njene komercijalizacije i ozbiljnog uvođenja u kliničku praksu. Takođe postalo je jasno da korišćenjem ovih tehnika može biti dobijen relativno mali broj dobro očuvanih ćelija sa površine humane stolice [Bandaletova,etal.,APMIS 2002; 110: 239-246]. Ovi problemi teškoće standardizacije su krucijalni, i izazivaju ozbiljne sumnje u pogledu korišćenja otpalih kolonocita izolovanih iz uzoraka stolice za rano otkrivanje CRC široke skale.

Postoji valjan dokaz koji ukazuje da mukocelularni sloj koji pokriva rektalnu sluzokožu creva je naročito bogat dobro očuvanim otpalim kolonocitama. Pored toga, kod CRC pacijenata količina ćelija ovog sloja je mnogo veća nego kod zdravih pojedinaca primarno usled velikog povećanja prisustva visoko rezistentnih malignih kolonocita. Prema tome, ćelije tumora CRC pacijenata, koje su mnogo bolje adaptirane na autonomno postojanje, kvantitativno će dominirati nad ukupnim otpalim rektalnim. Nekoliko skorih izveštaja opisuju distalnu (npr. analnu) implantaciju istrajnih otpalih ćelija iz uklonjenog kolorektalnih tumora [Jenner, D. C.et al,Dis. Colon Rectum 1998; 41: 1432-1434, Wind, P.et al.,Dis. Colon Rectum 1998; 41: 1432-1434, Isbister, W. H. Dig. Surg. 2000; 17: 81-83, Hyman, N. and Kida, M. Dis. Colon Rectum 2003; 46: 835-836, Abbasakoor, F.et al,Ann. R. Coll. Surg. Engl. 2004; 86: 38-39] koji jako potvrđuju ovu hipotezu.

Direktni prilaz rekatalnoj sluzokoži je moguć rutinskim digitalnim rektalnim ispitivanjem sa ispitivačevim prstom u rukavici. Međutim, iako se korišćenjem ove jednostavne manipulacije može postići kontakt sa rektalnim mukocelularnim slojem, u toku uklanjanja prsta iz rektuma neizbežni su značajni gubici materijala i simultana kontaminacija sa sporednim skvamoznim epitelom analnog kanala. Bris pripremljen sa rukavice korišćcne za rektalno ispitivanje jc pokazao dobro očuvane kolonocite, kombinovane sa visokim nivoom kontaminacije ćelijama skvamoznog epitelijuma.

Postoji velika potreba za direktnim sakupljanjem otpalih epitelnih ćelija sa površine rektalne sluzokože bez problema materijalnog gubitka i ozbiljne kontaminacije sa elementima drugih tkiva u stupnju uklanjanja površine sa sakupljenim ćelijama iz rektuma. Takve ćelije mogu biti korišćene ne samo za kvantitativne ćelijske i DNK analize, nego su takođe ispitivane na prisutnost dodatnih biomarkera kancera (na pr. proteina) i na kraju su procenjene imunohistohemijski i citološki.

Suština pronalaska

Prema prvom aspektu ovog pronalaska, obezbeđen je uređaj za uzorkovanje kolorektalnih ćelija koji sadrži: kolorektalni umetak koji ima distalni kraj za umetanje, proksimalni kraj i unutrašnju šupljinu koja se zatvara;

elastičanu membranu koja ima spoljašnju povšinu za uzorkovanje ćelija i unutrašnju površinu, gde pomenuta membrana je vezana i zatvara distalni kraj za umetanje pomenutog umetka i nalazi se u unutrašnjoj šupljini;

tako da pri upotrebi, unutrašnja šupljina se dovodi bar do prvog povišenog pritiska koji izaziva da se membrana izbaci sa distalnog kraja pomenutog umetka, tako da uspostavi kontakt sa površinom kolorektalne sluzokože i dovođenje unutrašnje šupljine pod drugi sniženi pritisak izaziva da se membrana uvuče i vrati u unutrašnju šupljinu pomenutog umetka.

Uređaj prevazilazi teškoće uzorkovanja prstom, držanjem elastične membrane unutar umetka i pri umetanju i pri izvlačenju tako da nema gubitka materijala, a uzorak nije kontaminiran ćelijama sa drugih površina (na pr. skvamoznim epitelijumom).

Direktnim uzorkovanjem površine sluzokože, uređaj prevazilazi teškoće koje su u vezi sa uzorkovanjem cele stolice uključujući, neprijatnu prirodu posla, dobijanje niske koncentracije ćelija, visoke nivoe kontaminacije sa fekalnim materijalom (naročito bakterijama) i naročito teškoće koje su u vezi sa standardizacijom postupka koje su u vezi sa ovim problemima, na primer, velika varjabilnost veličine i konzistencije stolice.

Mada je uređaj invazivan, manje je invazivan nego uređaji koji se trenutno koriste za kolonoskopiju/sigmoidoskopiju i ne zahteva rukovanje od strane kvalifikovanog i visoko obučenog tehničara. Uređaj sc može čak i samo-primeniti. Smanjeni nivo invazivnosti i nepostojanje rizika od komplikacija će verovatno dovesti do većeg prihvatanja od strane pacjenata. Ove prednosti bi zauzvrat omogućile izvođenje više uzorkovanja i nižu cenu.

U poželjnom izvođenju pronalaska, elastična membrana je rastegljiva i konstruisana je od elastičnog materijala. Poželjnije, elastična membrana je konstruisana od supstance na bazi nitrila, lateksa ili gurne.

U poželjnom izvođenju pronalaska, unutrašnja šupljina umetka koja se zatvara je zatvorena.

U poželjnom izvođenju, uređaj za uzorkovanje ćelija dalje sadrži sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine, gde pomenuta sredstva su vezana za proksimalni kraj umetka. Poželjno, pomenuta sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine su vezana za uređaj za uzorkovanje ćelija pomoću ventila (na pr. samozaptivajućeg ventila) koji je na proksimalnom kraju umetka.

Razume se da sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine mogu sadržati bilo koje sredstvo pogodno za primenu fluida (na pr. tečnosti ili gasa) na elastičnu membranu. Poželjno, sredstva za dovođnje pod pritisak unutrašnje šupljine sadrže izvor komprimovanog vazduha, špric ili pumpu (na pr. sa lopticom).

Poželjno, sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine sadrže izvor komprimovanog vazduha koji se sastoji od mehaničkog uređaja sposobnog za postizanje prethodno određenog nivoa prvog povišenog pritiska i drugog sniženog pritiska u uređaju za uzorkovanje ćelija. Ovo izvođenje ima kao prednost tačno regulisanje pritiska unutar umetka i mehanički uređaj ima prednost da se ponovo koristi sa neodređenim brojem jednokratnih uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija.

Poželjnije, sredstvo za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine je špric. Upotreba šprica, dozvoljava i jednostavno rukovanje, i da fiksna zapremina vazduha bude pumpana na elastičnu membranu (poželjno je bar deset puta povećati zapreminu vazduha prisutnu na elastičnoj membrani). Na primer, u izvođenju pronalaska gde je špric od lOOml vezan za proksimalni kraj umetka, na početku klip pomenutog šprica može biti podešen na oznaku od 70-90ml. Prema tome, prethodno definisan nivo prvog povišenog pritiska može biti postignut guranjem klipa do njegovog maksimalnog položaja (na pr. do oznake Omi) što će napuniti elastičnu membranu sa vazduhom zapremine 70-90ml. Zatim može biti postignut prethodno određeni nivo drugog sniženog pritiska, povlačenjem klipa šprica nazad do njegovog maksimalnog položaja (na pr. do oznake lOOml) koji će povući membranu u unutrašnju šupljinu umetka. U poželjnom izvođenju pronalaska, špric bi bio snabdeven sa jednim ili više graničnika (na pr. sa zakačkom za određene položaje) da se obeleži položaj klipa šprica u svakom stupnju u toku upotrebe (na pr. jedan položaj pre umetanja, jedan u toku umetanja i drugi posle izvlačenja). Kada je sredstvo za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine špric, prednost je što uređaj za uzorkovanje kolorektalnih ćelija može biti prilagođen da odgovara sadašnjoj dostupnoj i jednokratnoj laboratorijskoj i bolničkoj opremi.

U poželjnom izvođenju prema pronalasku, zona površine spoljašnje površine za uzorkovanje ćelija pomenute elastične membrane je kontrolisane reproduktibilnosti. Ovo omogućava da fiksna zona povšine bude dovedena u kontakt sa površinom kolorektalne sluzokože koja se uzorkuje, na taj način obezbeđujući kvatitativno sakupljanje otpalih ćelija koje su u vezi sa količinom prisutnom na površini kolorektalne sluzokože. Poželjno, površina zone je kontrolisana pomoću sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine. Ovo omogućava fiksnoj zoni površine da bude dovedena u kontakt sa provršinom sluzokože koja se uzorkuje.

U poželjnom izvođenju pronalaska, umetak je adaptiran da se koristi sa rektalnom pristupnom cevi. Ovo izvođenje ima prednost jer omogućava da rektalna pristupna cev i obturator, kao što je obturator u obliku masline (zajedno spojena rektalna pristupna cev i obturator su uglavnom poznati kao proktoskop) prvo budu umetnuti da otvore rektalnu šupljinu, a zatim se obturator izvlači pre umetanja uređaja za uzorkovanje prema pronalasku. Uređaj za uzorkovanje zatim treba da ostane zadržan u položaju sa rektalnom pristupnom cevi u bilo kom vremenskom periodu koji je potreban da bi se dobio uzorak. Kada se uređaj za uzorkovanje ukloni, obturator bi bio vraćen i obturator i rektalna pristupna cev bi bili izvučeni zajedno.

U poželjnom izvođenju, umetak je napravljen da omogućava samo-umetanje. U takvom izvođenju, umetak je umetnut zajedno sa rektalnom pristupnom cevi i prema tome eliminiše potrebu za obturatorom (na pr. umetak ima zaobljeni distalni kraj za umetanje). Ovo izvođenje obezbeđuje prednost da uređaj za uzorkovanje prema pronalasku može biti samo-primenjen, na primer, pacijenti će biti u stanju da uzorkuju otpale ćelije sa njihove rektalne sluzokože. U ovom izvođenju, predočeno je da su umetak i rektalna pristupna cev zajedno umetnuti i uklonjeni i odvajaju se samo posle uklanjanja.

U poželjnom izvođenju prema pronalasku, elastična membrana obrazuje sud, u koji kada se drži unutar unutrašnje šupljine pomenutog umetka, može biti dodata tečnost. Ovo izvođenje prema pronalasku bi omogućilo da u uređaj za uzorkovanje budu dodati reagensi, posle dobijanja uzorka bez potrebe za premeštanjem uzorka u odvojeni sud, i na taj način gubeći nešto materijala uzorka.

U poželjnom izvođenju, unutrašnja šupljina umetka obezbeđena je sa adhezionim sredstvima. Ovo izvođenje ima efekat da se elastična membrana povlači ka zidovima unutrašnje šupljine umetka kada je sakupljen uzorak, i da je postizanjem drugog sniženog pritiska elastična membrana uvučena u unutrašnju šupljinu umetka. Prednost ove karakteristike je da obezbeđuje stabilni sud kada se napuni sa tečnošću.

U poželjnom izvođenju, umetak je adaptiran da se koristi sa sredstvima za zatvaranje koja zatvaraju pomenuti kontejner. Ovo će omogućiti čuvanje i transportovanje uređaja za uzorkovanje koji sadrži uzorak pre daljih analiza uzorka. Poželjno sredstvo za zatvaranje je poklopac sa navojem. Prednost poklopca sa navojem je zatvaranje suda da bi se sprečio gubitak uzorka, a takođe omogućava uklanjanje za dalje analize.

U izvođenju u kome uređaj za uzorkovanje ćelija sadrži sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine, pomenuta sredstva se poželjno mogu odvojiti od umetka. Ovo ima prednost pretvaranja uređaja za uzorkovanje u kompaktnu fijolu za testiranje, koja pogodno može biti transportovana i čuvana sa mnogo drugih kompaktnih fijola za testiranje za reakcije ranog otkrivanja koje slede.

U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je kit za sakupljanje uzorka sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, koji sadrži ovde defnisan uređaj za kolorektalno uzorkovanje ćelija i rektalnu pristupnu cev i opciono obturator.

Upotreba rektalne pristupne cevi obezbeđuje i konfornije umetanje uređaja za uzorkovanje i sprečava kontakt između uređaja za uzorkovanje i bilo koje površine koja je drugačija od površine sluzokože koja se uzorkuje. Upotreba obturatora pored rektalne pristupne cevi, može smanjiti neprijatnost umetanja rektalne pristupne cevi.

U poželjnom izvođenju, kit se može dodatno sastojati od sredstva za podmazivanje, kao što je žele za podmazivanje (na pr.. K-Y žele). Prednost ovoga je obezbeđivanje većeg konfora u toku umetanja obturatora ili uređaja za uzorkovanje ćelija prema pronalasku.

U poželjnom izvođenju pronalaska, obturator je odvojen od rektalne pristupne crevi posle umetanja zajedno spojenog obturatora i rektalne pristupne cevi u rektalnu šupljinu.

U poželjnom izvođenju pronalaska, kit dalje obuhvata sredstava za zatvaranje, kao što je poklopac sa navojem, koji se koristi sa umetkom.

U poželjnom izvođenju pronalaska, kit se dalje obuhvata jedan ili više reagenasa, kao što je pufer. Dozvoljena je upotreba pufera za pripremanje uzorka pre daljih analiza.

U poželjnom izvođenju prema pronalasku, pufer može biti prisutan u poklopcu sa navojem (na pr. kao blister paket), tako da se pričvršćavanjem poklopca na umetak oslobađa pufer u kontejner (na pr. bušenjem blister paketa) da bi se suspendovalc ćelije prisutne na površini elastične membrane za uzorkovanje pre daljih analiza.

U poželjnom izvođenju pronalaska, pufer je pufer za ćelijsku lizu koji ima prednost u obezbeđivanju ključnog stupnja pre ekstrakcije DNK. U alternativnom poželjnom izvođenju, pufer je medijum za održavanje ćelija koji ima prednost u omogućavanju povećanih citoloških, biohemijskih i imunohistohemijskih analiza na rezultujućem ćelijskom uzorku. Poželjno, medijum za održavanje ćelija je obogaćen sa jednom ili više komponenti ćelijske kulture (na pr. nutricijenata i antibiotika).

Osoba iz struke će znati da bilo koji od prethodno opisanih uređaja ili kitova je pogodan za uzorkovanje otpalog epitelnog tkiva (na pr. kolonocita) sa površine humane kolorektalne sluzokože.

U trećem aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za kvantitativno uzorkovanje otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta bez kontaminiranja uzorka dovođenjem u kontakt sa drugom površinom u telu, koji obuhvata stupnjeve: dovođenja uređaja za uzorkovanje koji sadrži odvojenu površinu za uzorkovanje u blizinu površine kolorektalne sluzokože koja se uzorkuje, bez prethodnog kontakta sa bilo kojom drugom površinom tela;

kontaktiranja površine za uzorkovanje ćelija sa površinom kolorektalne sluzokože tako da je dobijen uzorak sa površine sluzokože; i

uklanjanja uređaja za uzorkovanje i uzorka iz blizine površine sluzokože bez kontakta odvojene površine za uzorkovanje ili uzorka sa bilo kojom drugom površinom tela.

Ovaj postupak obuhvata ključne stupnjeve direktnog uzorkovanja otpalih ćelija sa površine sluzokože i obezbeđuje da uzorci nisu kontaminirani dovođenjem u kontakt membrane za uzorkovanje ćelija sa drugim površinama tela. Kontaminacija je izbegnuta odvajanjem površine za uzorkovanje, gde se odvajanje može biti definisano kao izolovanje ili odvojeno podešavanje površine za uzorkovanje pre dovođenja u kontakt sa površinom korolektarne sluzokože ili posle sakupljanja ćelija sa površine kolorektalne sluzokože.

U četvrtom aspektu pronalaska obezbeđen je postupak za uzorkovanje otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, koji obuhvata stupnjeve: umetanja uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prema pronalasku u rektalnu šupljinu i dovođenje pomenutog uređaja u blizinu površine kolorektalne sluzokože bez da je spoljašnja površina elastične membrane za uzorkovanje ćelija bila u ranijem kontaktu sa drugom površinom tela;

dovođenja unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog pritiska tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje;

kontaktiranja površine kolorektalne sluzokože sa spoljašnjom površinom pomenute membrane za uzorkovanje ćelija, tako da je dobijen uzorak otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože;

postizanja drugog sniženog pritiska u unutrašnjoj šupljini tako da se elastična membrana uvuče i uzorak prisutan na površini za uzorkovanje ćelija pomenute membrane vrati u unutrašnju šupljinu uređaja za uzorkovanje ćelija; i

uklanjanja uređaja za uzorkovanje ćelija iz okoline površine kolorektalne sluzokože i izvlačenje pomenutog uređaja iz rektalne šupljine bez da membrana ili uzorak budu u kontaktu sa bilo kojom površinom tela.

Razume se da uređaj za uzorkovanje ćelija može dodatno zahtevati rektalnu pristupnu cev samu ili zajedno sa obturatorom.

Prema tome, u poželjnom izvođenju pronalaska, postupak dodatno obuhvata stupnjeve: umetanja zajedno spojenog uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prema pronalasku sa rektalnim pristupnim crevom u rektalnu šupljinu;

i

uklanjanja pomenutog uređaja za uzorkovanje i uzorka od rektalnog pristupnog creva.

U poželjnom izvođenju pronalaska, postupak dodatno obuhvata stupnjeve: umetanja zajedno spojene rektalne pristupne cevi i obturatora u rektalnu šupljinu;

izvlačenje obturatora iz rektalne pristupne cevi pre umetanja uređaja za uzorkovanje;

uklanjanje uređaja za uzorkovanje i uzorka;

vraćanja obturatora preko rektalne pristupnem cevi; i izvlačenje spojene rektalne pristupne cevi i obturatora iz rektalne šupljine.

U petom aspektu pronalaska obezbeđen je postupak uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, koji obuhvata stupnjeve: umetanja rektalne pristupne cevi i obturatora u rektalnu šupljinu preko analnog kanala;

izvlačenja obturatora iz rektalne pristupne cevi;

umetanja uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prema pronalasku u rektalnu šupljinu preko rektalne pristupne cevi, bez daje elastična membrana uređaja u kontaktu sa bilo kojom površinom tela;

dovođenja pod pritisak unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog pritiska tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje;

kontaktiranja površine kolorektalne sluzokože sa spoljašnjom površinom pomenute membrane za uzorkovanje ćelija;

dobijanja uzorka otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože;

postizanja drugog sniženog pritiska u unutrašnjoj šupljinu tako da se elastična membrana uvuče i uzorak prisutan na površini za uzorkovanje ćelija pomenute membrane se vrati u unutrašnju šupljinu uređaja za uzorkovanje ćelija;

izvlačenja uređaja za uzorkovanje ćelija iz rektalne šupljine preko rektalne pristupne cevi, bez da elastična membrana uređaja za uzorkovanje dođe u kontakt sa površinom tela;

vraćanja obturatora preko rektalne pristupne cevi; i

izvlačenja rektalne pristupne cevi i obturatora iz rektuma preko analnog kanala.

Razume se da dok rektalna pristupna cev ostaje umetnuta u rektalnu šupljinu, u rektalnu šupljinu može biti unet drugi uređaj za uzorkovanje. Na primer, može biti uveden prvi uređaj za uzorkovanje, koji sadrži pufer za lizu ćelija, da omogući ekstrkaciju DNK i analize (na pr. kvantifikaciju) bilo kojih uzorkovanih ćelija. Posle toga, može biti uveden drugi uređaj za uzorkovanje ćelija koji sadrži medijum za održavanje ćelija koji omogućava citološke, biohemijske i imunohistohemijske analize bilo kojih uzorkovanih ćelija.

U alternativnom aspektu pronalaska, obezbeđen je uređaj za uzorkovanje koji sakuplja uzorak sa površine sluzokože smeštene u okviru rektalne šupljine subjekta, koji sadrži: suštinski cilindrično telo, koje ima otvorenu šupljinu na distalnom kraju i šupljinu koja se zatvara na proksimalnom kraju;

elastičnu membranu koja se drži između suštinski cilindričnog tela koje obrazuje zatvaranje koje odvaja otvorenu distalnu šupljinu od zatvorene proksimalne šupljine; dve površine membrane su proksimalna površina i distalna površina; i

sredstva za naduvavanje i izduvavanje, gde

sredstva za naduvavanje mogu povećati unutrašnji pritisak fluida proksimalne šupljine koja se zatvara, koja kada je zatvorena izaziva da se membrana izbaci sa distalnog kraja suštinski cilindričnog tela da distalna površina membrane dodirne površinu sluzokože koja se uzorkuje; i

sredstva za izduvavanje mogu sniziti pritisak fluida zatvorene proksimalne šupljine izazivajući da se membrana uvuče tako da je membrana držana unutar suštinski cilindričnog tela posle kontakta distalne površine membrane bila sa površinom sluzokože koja se uzorkuje.

U poželjnom izvođenju pronalaska, sredstvo za izduvavanje je ventil. Ovo izvođenje pronalaska bi bilo naročito pogodno za upotrebu sa elastičnom membranom gde je unutrašnji pritisak u proksimalnoj šupljini koja se zatvara veći nego van šupljine.

U poželjnom izvođenju pronalaska, sredstva za izduvavanje sadrže špric povezan sa ventilom.

U drugom alternativnom aspektu prema pronalasku, obezbeđen je postupak za uzorkovanje otpalih ćelija sa površine sluzokože smeštene u okviru rektalne šupljine humanog subjekta, koji obuhvata stupnjeve: dovođenja uređaja za uzorkovanje prema pronalasku u blizinu površine sluzokože bez da membrana za uzorkovanje načini raniji kontakt sa bilo kojom površinom tela;

povećavanja unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje;

dovođenja u kontakt površine sluzokože sa distalnom površinom membrane tako da je dobijen uzorak otpalih ćelija sa površine sluzokože;

snižavanja unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine tako da se elastična membrana uvuče i ona i uzorak su držani unutar otvorene distalne šupljine; i

uklanjanja uređaja i uzorka iz okoline površine sluzokože bez da su membrana ili uzorak bili u kontaktu sa bilo kojom drugom površinom tela.

U poželjnom izvođenju pronalaska, postupak obuhvata stupnjeve: priključivanja izvora komprimovanog vazduha preko ventila i povećavanje unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine otvaranjem ventila; ili

priključivanja šprica za ventil i povećavanja unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine umetanjem klipa.

U poželjnom izvođenju pronalaska, postupak obuhvata stupnjeve: snižavanja unutrašnjeg pritisaka zatvorene proksimalne šupljine otvaranjem ventila; ili

snižavanja unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine povlačenjem klipa.

U poželjnom izvođenju pronalaska, postupak obuhvata stupnjeve: dodavanja pufera za ćelijsku lizu ili medijuma za održavanje ćelija u otvorenu distalnu šupljinu uređaja za uzorkovanje; i zatvaranja otvorene distalne šupljine uređaja za uzorkovanje.

U trećem alternativnom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak uzorkovanja otpalih ćelija sa površine sluzokože koja se nalazi u okviru rektalne šupljine humanog subjekta, koji obuhvata stupnjeve: umetanja rektalne pristupne cevi i obturatora u rektalnu šupljinu preko analnog kanala;

izvlačenja obturatora iz rektalne pristupne cevi;

umetanja uređaja za uzorkovanje prema pronalasku u rektalnu šupljinu preko rektalne pristupne cevi, bez daje elastična membrana uređaja za uzorkovanje bila u kontaktu sa bilo kojom drugom površinom tela;

spajanja uređaja za uzorkovanje sa sredstvima za naduvavanje;

povećavanja unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine tako da se izbaci elastična membrana sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje;

kontaktiranja rektalne sluzokože sa zonom fiksne površine, površine za uzorkovanje;

dobijanja uzorka otpalih ćelija sa površine rektalne sluzokože;

snižavanja unutrašnjeg pritiska zatvorene proksimalne šupljine tako da se elastična membrana uvuče i ona i uzorak su držan unutar otvorene distalne šupljine;

izvlačenja uređaja za uzorkovanje iz rektalne šupljine pomoću rektalne pristupne cevi, bez da elastična membrana uređaja za uzorkovanje dođe u kontakt sa bilo kojom površinom tela;

vraćanja obturatora pomoču rektalne pristupne cevi;

izvlačenja rektalne pristupne cevi i obturatora iz rektalne šupljine preko analnog kanala;

dodavanja pufera za ćelijsku lizu ili medijuma za održavanje ćelija u otvorenu distalnu šupljinu; i

zatvaranja otvorene distalne šupljine uređaja za uzorkovanje.

U četvrtom alternativnom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak ranog otkrivanja i dijagnoze kolorektalnog kancera koji sadrži bilo koji od gore iznetih postupaka i dalje obuhvata regeneraciju sakupljenog uzorka iz uređaja za uzorkovanje i izvođenja analiza uzorka.

U poželjnom izvođenju pronalaska, analiza je odabrana od kvantifikacije DNK, ekstrakcije DNK praćene njenom kvantifikacijom i opciono njenom molekulskom analizom, citološkim/citohemijskim ispitivanjem i biohemiskim testovima. Treba primetiti da će tačnost ranog otkrivanja, bilo kojim od odvih postupaka, biti poboljšana obezbeđivanjem uzorka sa niskim nivoima kontaminirajućih materija i visoke koncentracije ćelija uzetih sa površine kolorektalne sluzokože koja je uzorkovana.

Kratak opis slika nacrta

Sada će biti opisan pronalazak, samo kroz primere, sa pozivanjem na priloženi nacrt u kome:Slika 1prikazuje poprečni presek uređaja za uzorkovanje ćelija prema pronalasku.

Slika 2je šematski prikaz uređaja za uzorkovanje ćelija prema pronalasku gde je sredstvo za dovođenje pod pritisak špric.

Slika3 je šematski prikaz uređaja za uzorkovanje ćelija prema pronalasku gde je sredstvo za dovođenje pod pritisak izvor komprimovanog vazduha.

Slika 4prikazuje komponente potrebne za uzorkovanje otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta.

Slika5 prikazuje primer postupka uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta korišćenjem uređaja prikazanog na slikama 1-4.

Slika6 prikazuje primer stupnjeva koji mogu slediti posle postupka prikazanog na slici 5.

Detaljni opis pronalaska

Opis izvođenja uzorkovanja ćelija

Uređaj za uzorkovanje ćelija sa slike 1 je napravljen za umetanje u rektalnu šupljinu. Uređaj sadrži suštinski cilindični umetak 1 sa unutrašnjom šupljinom 3, zatvorenom na distalnom kraju 2 koji se umeće, sa elastičnom membranom 4 koja je pričvršćena za umetak 1 na distalnom kraju 2 tako da ga zatvara. U položaju prikazanom na slici 1, membrana 4 se nalazi unutar šupljine 3, i podešena je da se izbaci iz šupljine 3 kada je šupljina 3 dovedena pod pritisak pomoću sredstava 7 (prikazana su u više detalja na slici 2). Membrana 4 ima površinu 5 za uzorkovanje, koja je prikazana u stanju mirovanja na slici 1 kao unutrašnja površina, ali kad se membrana izbaci to je spoljašnja površina, i suprotnu površinu 6 koja je u položaju mirovanja spoljašnja površina, ali koja postaje unutrašnja površina kada se membrana izbaci. Membrana je napravljena od supstance koja je na bazi nitrila, lateksa ili gume. Na proksimalnom kraju 34, šupljina 3 je zatvorena sa samozaptivajućim ventilom 18, koji je podešen za vezivanje sredstva 7 za dovođenje pod pritisak.

Izvođenje pronalaska u kome je sredstvo 7 za dovođenje unutrašnje šupljine pod pritisak integrisani špric je prikazano na slici 2, koja takođe šematski prikazuje stupnjeve neophodne za uzorkovanje otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta (Slika 2A-2D).

Slike 2A prikazuje uređaj za uzorkovanje ćelija pre umetanja u rektalnu šupljinu. Ustvari špric 7 je vezan za umetak 1 kao što je opisnao na slici 1. Špric ima klip 23 koji zaptivajuće klizi duž cilindra 32 šprica 7 da bi promenio zapreminu unutar unutrašnje komore 33 šprica 7. Klip 23 šprica 7 je podešen tako daje prisutno 70ml vazduha unutar komore 33 šprica 7.

Slika 2B prikazuje uređaj za uzorkovanje ćelija umetnut u rektalnu šupljinu. Klip 23 šrica je potpuno potisnut stoje izazvalo da se elastična membrana 4 naduva do zapremine od 70 ml. Naduvana elastična membrana 4 je zatim u kontaktu sa površinom kolorektalne sluzokože humanog subjekta tako da su bilo koje otpale ćelije prenete na spoljašnju površinu elastične membrane 4.

Slika 2C prikazuje uređaj za uzorkovanje ćelija onda kada su otpale ćelije uzorkovane i pre uklanjanja iz rektalne šupljine. Klip 23 šprica 7 je povučen tako da je u komori šprica 7 prisutno 80ml vazduha. Ovo prema tome stvara sniženi pritisak unutar komore koji izaziva da se elastična membrana 4 povuče nazad u unutrašnju šupljinu umetka 1 i naleže čvrsto na bočne zidove umetka 1. Nivo sniženog pritiska može biti prethodno kvantifikovan prisutvom dva graničnika sa zakačkom ('snap-fit') 24 (od kojih je samo jedan prikazan na slici 2C). Graničnici sa zakačkom 24 su ručice na klipu 23 šprica 7 koje se smeštaju u otvore na cilindru 32 šprica 7. Svrha graničnika sa zakačkom 24 je da spreči izvlačenje klipa 23 iz šprica 7.

Slika 2D prikazuje uređaj za uzorkovanje ćelija posle uklanjanja iz rektalne šupljine i pre analize ćelija. Distalni kraj za umetanje umetka 1 ima navoj koji prilagođen da primi poklopac 8 sa navojem prečnika 20mm. Poklopac 8 može da sadrži blister paket koji sadrži pufer tako da zavrtanjem poklopca 8 na umetak 1, pufer je oslobođen u kontejner obrazovan od izduvane elastične membrane 4. Pošto je poklopac 8 zavrnut na umetak 1, špric 7 može biti odvojen od umetka 1 da omogući da umetak 1 bude pretvoren u kompaktnu fiolu za testiranje koja, zajedno sa mnoštvom drugih fiola, može biti spakovana i poslata u laboratoriju za ćelijsku analizu.

Izvođenje prema pronalasku u kome su sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine 7 izvor komprimovanog vazduha prikazan na slici 3. Ova slika šematski prikazuje mehanički uređaj 9 koji je pumpa koja radi pomoću električnog motora (nije prikazan) sposobnog za dostizanje ponovljenih doza prvog povišenog pritiska, a zatim drugog sniženog pritiska posle aktivacije okidača 14. Mehanički uređaj 9 se može prikačiti za umetak 1 upravo kao što je prikazano na slikama 1 i 2 pomoću lokatora 16 sa nameštanjem na klik na mehaničkom uređaju 9 koji radi zajedno sa navratkom 17 za smešanje na umetak 1. Samozaptivajuči ventil 18 je prisutan na umetku 1 da osigura pritisak unutar umetka 1 posle odvajanja od mehaničkog uređaja 9. Umetak 1 sadrži krilca 19 koja su dizajnirana da uđu u proktoskop i navoje 20 na distalnom kraju za umetanje u cilju prihvatanja poklopca 8 sa navojima koji ima blister paket 21 koji sadrži pufer. Nameravano je da mehanički uređaj 9 bude baterija koja može biti napajanja i ponovo punjena preko punjača 12 pomoću izvora struje. Mehanički uređaj 9 sadrži usisni filter 25 za vazduh, gumiranu ručku 13 i takođe prekidač 15 za uključivanje-isključivanje i diode 10 i 11 koje emituju svetlost i pokazuju kada je uređaj 9 spreman i kada je ciklus postizanja prvog i drugog pritiska završen.

Prilikom upotrebe, korisnik drži mehanički uređaj 9 za gumiranu ručku 13 za hvatanje kao kod pištolja i uređaj 9 se vezuje za umetak 1. Umetak se zatim umetne u rektalnu šupljinu, gde se zajedno koristi sa proktoskopom sa krilcima 19 koja omogućavaju poboljšanju konzistenciju penetracije. Prvi povišeni pritisak je postignut kada korisnik pritisne obarač 14 koji izaziva da vazduh bude doveden u mehanički uređaj 9 preko ulaznog filtera 25 za vazduh koji je zatim komprimovan i izaziva da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja umetka 1 da dođe u kontakt sa površinom kolorektalne sluzokože. Zatim je postignut drugi sniženi pritisak kada korisnik drugi put pritisne obrač 14, što dovodi do toga da se elastična membrana vrati u unutrašnju šupljinu 1. Kada je uzorkovanje ćelija završeno, umetak 1 je odvojen od proktoskopa i mehanički uređaj 9 je razdvojen od umetka 1, a pritisak unutar umetka 1 je održavan pomoću samozaptivajućeg ventila 18. Zatim, poklopac 8 sa navrtnjem koji ima blister paket 21 koji sadrži pufer može biti navrnut na navoje 20 umetka 1 izazivajući oslobađanje pufera u kontejner koji je obrazovan od izduvane elastične membrane. Mehanički uređaj 9 može zatim biti ponovo korišćen povezvanjem sa sledećim umetkom 1.

Potrebne komponente za tehniku dodir-otisak ('touch-print') uzorkovanja ćelija

Komponente potrebene za uzorkovanje otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta su prikazane na slici 4.

i) Pristup rektalnoj sluzokoži može se postići upotrebom rektalne pristupne cevi 29, koja može biti modifikacija postojećih instrumenata za rekatalno ispitivanje (na pr. rektoskop 22). Rektalna pristupna cev 29 se sastoji od krute cevi (sa ručkom) snabdevene sa obturatorom 30 koji ima

kraj u obliku masline i neprekidnu površinu koja olakšava uvođenje rektalne pristupne cevi 29 preko analnog kanala u rektum.

ii) Uređaj 1 za uzorkovanje ćelija prikazan na slici 4 je ustvari kao što je prikazan na slici 1 i ima spoljni prečnik kompatibilan sa unutrašnjim prečnikom rektalne pristupne cevi, tj. u opsegu 15-20 mm.

iii) Izvor komprimovanog vazduha 7 služi da obezbedi sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine. Sredstva za dovođenje pod pritisak 7 mogu da se sastoje od šprica (kao što je opisano na slici 2), vazdušne pumpe (kao što je opisano na slici 3) ili mini-kontejnera komprimovanog vazduha (mini-cilindar). Pritisak vazduha unutar uređaja za uzorkovanje može biti ograničen/kontrolisan ili korišćenjem fiksne zapremine vazduha (jednostavan rastvor u špricu) ili dostizanjem fiksnog nivoa pritiska vazduha (za ovu svrhu bi bio potreban precizni ventil).

iv) Boca ili epruveta sa specifičnim puferom 35 (različiti puferi se koriste za različite svrhe, kao što je ekstrakcija DNK ili RNK ili izolovanje/odvajanje ćelija za dalje analize).

v) Hermetički poklopac 8 za uređaj za uzorkovanje ćelija (potreban za reakcije lize ćelija/proteina ukoliko je izvedena neposredna ekstrakcija DNK ili RNK, za postupke izolacije ćelija i naročito, za čuvanje/transport materijala ukoliko ne koristi odmah, na pr. transport od hirurga/klinike u laboratoriju).

Komponente potrebne za postupak mogu biti napravljene da se koriste kao jednokratni kit, koji bi uklučivao sve navedene komponete osim izvora komprinovanog vazduha, koji se može koristiti više puta.

Opis tehnike dodir- otisak ('touch-print') uzorkovanja ćelija (rektalno

rukovanje)

Slika 5 pokazuje primer ćelijske tehnike 'dodir-otisak' ('touch-print') uzorkovanja ćelija da bi se uzorkovale otpale ćelije sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta korišćenjem bilo kojeg od uređaja prikazanih na slikama 1-4. Ovaj postupak je jednostavan i nije potrebno specijalno obučavanje operatora u proktologiji ili endoskopiji da bi ga izveo. Može biti izveden od strane kvalifikovanog medicinskog profesionalca (OP, sestre, itd.) u lokalnoj ordinaciji ili kući pacijenta ili čak može biti samo primenjen od strane pacijenta.

Slika 5A šematski prikazuje poprečni presek anatomije humanog rektuma 28, analni kanal 26 i kolorektalni mukocelularni sloj 27. Treba primetiti da bilo koji kontakt uređaja za samo-uzorkovanje sa skvamoznim epitelijumom analnog kanala može dovesti i do materijalnog gubitka i kontaminacije uzorka sa skvamoznim epitelijumom analnog kanala.

Postupak počinje uvođenjem rektalne pristupne cevi 29 slične rektoskopu sa obturatorom 30 u rektum 28 (Slika 5B). Može biti korišćeno odgovarajuće sredstvo za podmazivanje da olakša postupak uvlačenja i smanji neprijatnost kod pacijenta, koja može biti izazvana ovim početnim stupnjem postupka.

Jednom kada je rektalna pristupna cev 29 umetnuta (slika 5C) i uklonjen je obturator 30, postignut je direktni prilaz rektalnoj sluzokoži i otvara se mukocelularni sloj 27.

Umetak 1 je unet u rektalnu pristupnu cev 29 tako da je gornji kraj umetka smešten baš iznad ivice rektalne pristupne cevi (slika 5D).

Postignut je prvi povišeni pritisak koji naduvava elastičnu membranu za sakupljanje u cilju kontakta membrane sa rektalnim mukcelularnim slojem 27 da bi se obezbedilo uzorkovanje ćelija 'dodir-otisak' (slika 5E). Uređaj je ostavljen u ovom položaju približno 10-15 sekundi da bi se postilo bolje prijanjanje otpalih ćelija i materijala koji potiče od ćelija mukocelularnog sloja na sakupljajuću membranu.

Slika 5F prikazuje postizanje drugog sniženog pritiska koji izduvava elastičnu membranu i izaziva da se vrati u njen početni položaj sa sakupljenim materijalom 31 na spoljašnjoj površini za uzorkovanje .

Umetak 1 je uklonjen iz rektalne pristupne cevi 29 i uzet za dalju obradu i analize. Obturator 30 (može biti korišćen nov, ponovo podmazan) je ponovo instaliran na rektalnu pristupnu cev 29, i cev 29 je uklonjena iz rektuma 28 (videti slike 5G). Kompletan postupak (rektalno rukovanje) ne bi trebalo da traje više od par minuta.

Obrađivanje sakupljenih ćelija

Slika 6 prikazuje primer stupnjeva koji mogu sledeti posle gore prikazanog postupka prema slikama 5A-5G) koji treba da budu završeni neposredno posle sakupljanja ćelija da bi se izbeglo sušenje membrane sa sakupljenim ćelijama. Stupanj (a) pokazuje uređaj za uzorkovanje 1 sa otpalim ćelijama 31 na elastičnoj membrani za sakupljanje ćelija posle sakupljanja ćelija. Gornji odeljak uređaja za uzorkovanje ćelija je napunjen sa fiksnom zapreminom specifičnog pufera 35 koji lizira ili suspenduje otpale ćelije (stupanj (b)). Mogu biti korišćeni razičiti puferi za ćelijsku lizu ili medijumi za održavanje ćelija za postupke ekstrakcije DNK ili RNK, a specijalni puferi/medijumi bi bili korišćeni za primene koje zahtevaju izolovanje ćelija. Uređaj za uzorkovanje ćelija je pripremljen za transport ili čuvanje uzorka tako što su bili hermetični zatvoreni sa sigurnosnim poklopcem 8 sa navojima (stupanj (c)), ali podrazumeva se da kada poklopac za navrtnjem ima blister paket sa puferom tada stupanj (b) može biti izostavljen. Uređaj može biti čuvan ili transportovan za dalje postupke ranog otkrivanja/dijagnoze i/ili svrhe istraživanja (stupanj (d)).

Analize uzoraka

Trebalo bi naglasiti da ova tehnika obezbeđuje mnogo veći stepen standardizacije u poređenju sa drugim postojećim prilazima. Upotreba standardnog uređaja sa standardnim pritiskom vazduha/zapremine, standardnom zonom naduvane membrane za sakupljanje (može varirati kontaktna zona sa rektalnim mukocelularnim slojem, ali ova varijacija je zanemarljiva u poređenju sa drugim načinima dobijanja otpalih ćelija, na pr. tehnike zasnovane na stolici) i standardnom količinom pufera dodatog posle postupka uzorkovanja ćelija stvara veoma poželjne uslove za uporednu analizu ili broja ćelija ili količine supstanci koje potiču iz ćelija (na pr.

DNK).

( a) Analize uzoraka za svrhe ranog otkrivanja kolorektalnog kancera

Rano otkrivanje kolorekatalnog kancera obuhvata široku procenu zasnovanu na populaciji (definisanih godina) pojedinaca koji nemaju simptome, da bi se otkrili asimtomatski (u mnogim slučajevima - rani) slučajevi bolest, a lečenje na vreme može sniziti smrtnost izazvanu ovim stanjem. Jedan neophodan uslov postupaka je njegova simultana primenjivost na hiljade/milione ljudi.

i) Budući da postoje jake indikacije da kod pacijenata sa kolorektalnim kancerom postoje značajno veće količine kolonocita i DNK koji potiče iz kolonocita u rektalnom mukoznom sloju u poređenju sa pojedincima koji su bez tumora, veoma je verovatno da tehnika direktnog uzorkovanja otpalih kolonocita i materijala koji potiče iz kolonocita može obezbediti jednostavan test ranog otkrivanja kolorektalnog kancera zasnovanog na direktnoj kvantifikaciji količne DNK ekstrahovane iz ovih ćelija. U ovom slučaju, početni pufer korišćen neposredno posle uzorkovanja ćelija bi bio pufer za ćelijsku lizu korišćen za selekcioni ekstrakcioni postupak DNK. Dodavanje pufera bi obezbedilo efikasnu ćelijsku lizu i održavanje materijala koji sadrži DNK u toku transporta u određenu laboratoriju u

(verovatno) izvesanom periodu čuvanja. Postupak ekstrakcije DNK treba da je izabran na osnovu njegove primenjivosti u visokoproduktivnim testovima tj. treba da su kompatiblne sa višekanalnim robotskim sistemom za rukovanje sa tečnostima. Tačne vrednosti količine DNK koje definišu "pozitivne", "negativne" i "sumljive" rezultate testa treba da budu određenje u kliničkim ispitivanjima.

ii) Slični početni stupnjevi ekstrakcije DNK mogu biti primenjeni za analize molekulskih markera kolorektalnog kancera. Ćelije uzorkovane postupkom dodir-otisak ('touch-print') bi obezbeđivale mnogo bolji kvalitet DNK u poređenju sa sadašnjim korišćenim tehnikama ekstrakcije DNK iz uzoraka stolice. PCR amplifikacija ove DNA može biti učinjena bez precizne kvantifikacije njene količine. Više-ciljna molekulska analiza se smatara kao opcija u ranom otkrivanju kolorektalnog kancera, međutim može biti vremenski zahtevnija i skuplja u poređenju sa direktnim kvantitativnim analizama. U isto vreme DNK ekstrahovana za direktnu kvantifikaciju može sigurno biti korišćena za PCR amplifikaciju u daljim dijagnostičkim analizama za kvantitatine 'pozitivne' ili 'sumljive' slučajeve.

iii) U slučaju potrebe specifične izolacije kolonocita iz ćelija drugih tipova, postupci odvajanja (na pr. imunomagnetsko odvajanje ili u gradijentu gustine) može biti primenjeno da se postigne viša čistoća populacije ćelija kolonocita za analizu. Za ovu svrhu mogu biti primenjeni neki mediji koje sadrže antibiotike za održavanje ćelija (prisustvo nekih bakterija u kolorektalnom materijalu je nemoguće izbeći) i mukolitičko sredstvo. Izolovane kolonocite tada mogu biti korišćene za različite tipove analiza kao što su ekstrakcija DNK i kvantifikacija praćena sa PCR amplifikacijom, testovi kancer molekularnih i biohemijskih markera, citološka/citohemijska procena i direktno ćelijsko brojanje (nesigurno za svrhe ranog otkrivanja usled niske brzine i visoke cene).

( b) Dijagnoza kolorektalnog kancera

Dijagnostička upotreba testova je fokusirana na pojedince koji imaju simptome ili kod kojih je već identifikovana bolest. Ciljne grupe pacijenata su mnogo manje nego one koje se očekuju za svrhe ranog otkrivanja.

i) Direktna DNK kvantifikacija može biti primenjena kod pojedinaca koji imaju simptome koji ukazuju na moguće kolorektalne bolesti.

ii) Ekstrakcija DNK praćena sa PCR amplifikacijom i molekulskom analizom može biti korisna i za potvrdu prvobitne dijagnoze i za uznapredovale dijagnostičke postupke (procene agresivnosti kancera, osetljivosti na hemoterapiju za metastatičke tumore, prognoze itd.).

iii) Ćelijska izolacija može biti korišćena i za dalje molekularne/biohemijske testove i citološka ispitivanja (ćelije tumora sa specifičnim morfološkim karakteristikama) mogu biti lako nađena među otpalim ćelijama kolonocita kod CRC pacijenata.

1. Uređaj za uzorkovanje kolorekatalnih ćelija, naznačen time, što sadrži: kolorektalni umetak koji ima distalni kraj za umetanje, proksimalni kraj i unutrašnju šupljinu koja se zatvara; elastičnu membranu koja ima spoljašnju povšinu za uzorkovanje ćelija i unutrašnju površinu, gde pomenuta membrana je vezana i zatvara distalni kraj za umetanje pomenutog umetka i nalazi se u unutrašnjoj šupljini; tako da pri upotrebi, unutrašnja šupljina se dovodi do bar prvog povišenog pritiska koji izaziva da se membrana izbaci sa distalnog kraja pomenutog umetka, da uspostavi kontakt sa površinom kolorektalne sluzokože i dovođenjem unutrašnje šupljine pod drugi sniženi pritisak koji izaziva da se membrana uvuče i vrati u unutrašnju šupljinu pomenutog umetka. 2. Uređaj prema zahtevu 1, naznačen time, što je elastična membrana elastična i napravljena od supstance zasnovane na nitrilu, lateksu ili gumi. 3. Uređaj prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time, što je unutrašnja šupljina umetka koja se može zatvoriti zatvorena. 4. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahtcva, naznačen time, što se dalje sastoji od sredstava za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine, gde su pomenuta sredstva vezana za proksimalni kraj umetka. 5. Uređaj prema zahtevu 4, naznačen time, što pomenuta sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine su vezana za ventil, kao što je samozaptivajući ventil, koji se nalazi na proksimalnom kraju umetka. 6. Uređaj prema zahtevu 4 ilizahevu 5, naznačen time, što pomenuta sredstva za dovođenje pod priisak unutrašnje šupljine sadrže izvor komprimovanog vazduha ili špric. 7. Uređaj prema bilo kom odfrethodnih zahteva, naznačen time, što je površina zone spoljašnje površineza uzorkovanje ćelija pomenute elastične membrane kontrolisane reproduktcflnosti. 8. Uređaj prema zahtevu 7, njanačen time, što pomenuta površina zone je kontrolisana pomoću sredstava za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine . 9. Uređaj prema bilo kom odfrethodnih zahteva, naznačen time, što je umetak prilagođen za korišćenje sirektalnom pristupnom cevi. 10. Uređaj prema bilo kom odfrethodnih zahteva, naznačen time, što je umetak napravljen da omogućava nmo-umetanje. 11. Uređaj prema zahtevu 10, mznačen time, što je umetak zaobljen na distalnom kraju za umetanje. 12. Uređaj prema bilo kom oi zahteva, naznačen time, što elastična membrana obrazuje kontejner kala se nalazi unutar unutrašnje šupljine pomenutog umetka, tako da može liti dodata tečnost. 13. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što unutrašnja šupljina umetka je obeieđena sa adhezionim sredstvima. 14. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što je umetak prilagođen da se koristi sa sredstvima za zatvaranje, kao što je poklopac sa navojima, da se zatvori pomenuti kontejner. 15. Uređaj prema bilo kom od zahteva 4 do 14, naznačen time, što se pomenuta sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine mogu odvojiti od umetka. 16. Kit za sakupljanje uzorka sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, naznačen time, što sadrži uređaj za uzorkovanje kolorektalnih ćeliji prema zahtevu 1 do 15, i rektalnu pristupnu cev i opciono obturator. 17. Kit prema zahtevu 16, naznačen time, što dodatno sadrži sredstvo za podmazivanje, kao što je žele za podmazivanje. 18. Kit prema zahtevu 16 ili zahtevu 17, naznačen time, što dodatno sadrži sredstva za zatvaranje, kao što je poklopac sa navojem koji se koristi sa umetkom. 19. Kit prema bilo kom od zahteva 16 do 18, naznačen time, što se dodatno sastoji od jednog ili više reagenasa, kao što su pufer za lizu ćelija ili medijum za održavanje ćelija. 20. Kit prema zahtevu 19, naznačen time, što su u poklopcu sa navojem prisutni jedan ili više reagenasa kao blister paket. 21. Postupak kvantitativnog uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta bez kontaminacije uzorka dovođenjem u kontakt sa drugom površinom tela, naznačen time, što obuhvata stupnjeve: dovođenja uređaja za uzorkovanje koji sadrži odvojenufovršinu za uzorkovanje u blizinu površine kolorektalne sluzokaie koja se uzorkuje, bez prethodnog kontakta sa bilo kojom drugo«površinom tela; kontaktiranja površine za uzorkovanje ćelija sa površinom kolorektalne sluzokože tako da je dobijen uzorak a površine sluzokože; i uklanjanja uređaja za uzorkovanje i uzorka iz bliz«: površine sluzokože bez kontakta odvojene površine za uzorkova^t ili uzorka sa bilo kojom drugom površinom tela. 22. Postupak uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, naznačen time, što obuhvata stup^cve umetanja uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prem bilo kom od zahteva 1 do 15 u rektalnu šupljinu i dovođenje pomemtog uređaja u blizinu površine kolorektalne sluzokože bez daje spoljaiajapovršina elastične membrane za uzorkovanje ćelija bila u ranijem lontaktu sa drugom površinom tela;

dovođenja unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog priidca tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog krajalređaja za uzorkovanje;

kontaktiranja površine kolorektalne sluzokože sa spoljašnjom površinom pomenute membrane za uzorkovanje ćelija, lako da je dobijen uzorak otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože;

postizanja drugog sniženog pritiska u unutrašnjoj šupljini tako da se elastična membrana uvuče i uzorak prisutan na površini za uzorkovanje ćelija pomenute membrane vrati u unutraš^u šupljinu uređaja za uzorkovanje ćelija; i

uklanjanja uređaja za uzorkovanje ćelija iz okoline površine kolorektalne sluzokože i izvlačenje pomenutog uređaja iz rektalne

šupljine bez da membrana ili uzorak budu u kontaktu sa bilo kojom površinom tela. 23. Postupak prema zahtevu 22, naznačen time, što se dodatno sastoji od stupnjeva: umetanja zajedno spojenog uređaja za uzorkovanje kolorekalnih ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 15 i rektalne pristupne cevi u rektalnu šupljinu; i uklanjanja pomenutog uređaja za uzorkovanje i uzorka od rektalne pristupne cevi. 24. Postupak prema zahtevu 22, naznačen time, što dodatno sadrži stupnjeve: umetanja zajedno spojene rektalne pristupne cevi i obturatora u rektalnu šupljinu; izvlačenje obturatora iz rektalne pristupne cevi pre umetanja uređaja za uzorkovanje; umetanja uređaja za uzorkovanje prema bilo kom od zahteva 1 do 15; uklanjanje uređaja za uzorkovanje i uzorka; vraćanja obturatora preko rektalne pristupnem cevi; i izvlačenje zajedno spojene rektalne pristupne cevi i obturatora iz rektalne šupljine. 25. Postupak uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, naznačen time, što se sastoji od stupnjeva: umetanja rektalne pristupne cevi i obturatora u rektalnu šupljinu preko analnog kanala; izvlačenja obturatora iz rektalne pristupne cevi; umetanja uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prema zahtevima 1 do 15 u rektalnu šupljinu preko rektalne pristupne cevi, bez da je elastična membrana uređaja u kontaktu sa bilo kojom površinom tela; dovođenja pod pritisak unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog pritiska tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje; kontaktiranja površine kolorektalne sluzokože sa spoljašnjom površinom pomenute membrane za uzorkovanje ćelija; dobijanja uzorka otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože; postizanja drugog sniženog pritiska u unutrašnjoj šupljinu tako da se elastična membrana uvuče i uzorak prisutan na površini za uzorkovanje ćelija pomenute membrane se vrati u unutrašnju šupljinu uređaja za uzorkovanje ćelija; izvlačenja uređaja za uzorkovanje ćelija iz rektalne šupljine preko rektalne pristupne cevi, bez da elastična membrana uređaja za uzorkovanje dođe u kontakt sa površinom tela; vraćanja obturatora preko rektalne pristupne cevi; i izvlačenja rektalne pristupne cevi i obturatora iz rektuma preko analnog kanala. 26. Postupak ranog otkrivanja i dijagnoze kolorektalnog kancera, naznačen time, što obuhvata bilo koji postupak prema zahtevima 21 do 25 i dalje sadrži regeneraciju kolorektalnog uzorka iz uređaja za uzorkovanje i izvođenje dijagnostičkog testa na uzorku . 27. Postupak prema zahtevu 26, naznačen time, što pomenuti test je izabran od DNK kvanti zacije, DNK ekstrakcije praćene sa njenom kvantifikacijom i opciono molekulskom analizom, citološko/citohemijsko ispitivanje i biohemijskih testova.

Claims (23)

1. Uređaj za uzorkovanje kolorekatalnih ćelija, naznačen time, što sadrži: kolorektalni umetak koji ima distalni kraj za umetanje, proksimalni kraj i unutrašnju šupljinu koja se zatvara; elastičanu membranu koja ima spoljašnju povšinu za uzorkovanje ćelija i unutrašnju površinu, gde pomenuta membrana je vezana i zatvara distalni kraj za umetanje pomenutog umetka i nalazi se u unutrašnjoj šupljini; tako da pri upotrebi, unutrašnja šupljina se dovodi do bar prvog povišenog pritiska koji izaziva da se membrana izbaci sa distalnog kraja pomenutog umetka, da uspostavi kontakt sa površinom kolorektalne sluzokože i dovođenjem unutrašnje šupljine pod drugi sniženi pritisak koji izaziva da se membrana uvuče i vrati u unutrašnju šupljinu pomenutog umetka.

2. Uređaj prema zahtevu 1, naznačen time, što je elastična membrana elastična i napravljena od supstance zasnovane na nitrilu, lateksu ili gumi.

3. Uređaj prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time, što je unutrašnja šupljina umetka koja se može zatvoriti zatvorena.

4. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što se dalje sastoji od sredstava za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine, gde su pomenuta sredstva vezana za proksimalni kraj umetka.

5. Uređaj prema zahtevu 4, naznačen time, što pomenuta sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine su vezana za ventil, kao što je samozaptivajući ventil, koji se nalazi na proksimalnom kraju umetka.

6. Uređaj prema zahtevu 4 ili zahevu 5, naznačen time, što pomenuta sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine sadrže izvor komprimovanog vazduha ili špric.

7. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što je umetak prilagođen za korišćenje sa rektalnom pristupnom cevi.

8. Uređaj prema bilo kom od zahteva, naznačen time, što elastična membrana obrazuje kontejner kada se nalazi unutar unutrašnje šupljine pomenutog umetka, tako da može biti dodata tečnost.

9. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što je unutrašnja šupljina umetka obezbeđena sa adhezionim sredstvima.

10. Uređaj prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što je umetak prilagođen da se koristi sa sredstvima za zatvaranje, kao što je poklopac sa navojima, da se zatvori pomenuti kontejner.

11. Uređaj prema bilo kom od zahteva 4 do 10, naznačen time, što se pomenuta sredstva za dovođenje pod pritisak unutrašnje šupljine mogu odvojiti od umetka.

12. Kit za sakupljanje uzorka sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, naznačen time, što sadrži uređaj za uzorkovanje kolorektalnih ćeliji prema zahtevu 1 do 11, i rektalnu pristupnu cev i opciono obturator.

13. Kit prema zahtevu 12, naznačen time, što dodatno sadrži sredstvo za podmazivanje, kao što je žele za podmazivanje.

14. Kit prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, naznačen time, što dodatno sadrži sredstva za zatvaranje, kao što je poklopac sa navojem koji se koristi sa umetkom.

15. Kit prema bilo kom od zahteva 12 do 14, naznačen time, što se dodatno sastoji od jednog ili više reagenasa, kao što su pufer za lizu ćelija ili medijum za održavanje ćelija.

16. Kit prema zahtevu 15, naznačen time, što su u poklopcu sa navojem prisutni jedan ili više reagenasa kao blister paket.

17. Postupak kvantitativnog uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta bez kontaminacije uzorka dovođenjem u kontakt sa drugom površinom tela, naznačen time, što obuhvata stupnjeve: dovođenja uređaja za uzorkovanje koji sadrži odvojenu površinu za uzorkovanje u blizinu površine kolorektalne sluzokože koja se uzorkuje, bez prethodnog kontakta sa bilo kojom drugom površinom tela; kontaktiranja površine za uzorkovanje ćelija sa površinom kolorektalne sluzokože tako da je dobijen uzorak sa površine sluzokože; i uklanjanja uređaja za uzorkovanje i uzorka iz blizine površine sluzokože bez kontakta odvojene površine za uzorkovanje ili uzorka sa bilo kojom drugom površinom tela.

18. Postupak uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, naznačen time, što obuhvata stupnjeve umetanja uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 11 u rektalnu šupljinu i dovođenje pomenutog uređaja u blizinu površine kolorektalne sluzokože bez daje spoljašnja površina elastične membrane za uzorkovanje ćelija bila u ranijem kontaktu sa drugom površinom tela; dovođenja unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog pritiska tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje; kontaktiranja površine kolorektalne sluzokože sa spoljašnjom površinom pomenute membrane za uzorkovanje ćelija, tako da je dobijen uzorak otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože; postizanja drugog sniženog pritiska u unutrašnjoj šupljini tako da se elastična membrana uvuče i uzorak prisutan na površini za uzorkovanje ćelija pomenute membrane vrati u unutrašnju šupljinu uređaja za uzorkovanje ćelija; i uklanjanja uređaja za uzorkovanje ćelija iz okoline površine kolorektalne sluzokože i izvlačenje pomenutog uređaja iz rektalne šupljine bez da membrana ili uzorak budu u kontaktu sa bilo kojom površinom tela.

19. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time, što se dodatno sastoji od stupnjeva: umetanja zajedno spojenog uređaja za uzorkovanje kolorekalnih ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i rektalne pristupne cevi u rektalnu šupljinu; i uklanjanja pomenutog uređaja za uzorkovanje i uzorka od rektalne pristupne cevi.

20. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time, što se dodatno sastoji od stupnjeva: umetanja zajedno spojenog uređaja za uzorkovanje kolorekalnih ćelija prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i rektalne pristupne cevi u rektalnu šupljinu; i uklanjanja pomenutog uređaja za uzorkovanje i uzorka od rektalne pristupne cevi.

21. Postupak uzorkovanja otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože humanog subjekta, naznačen time, što se sastoji od stupnjeva: umetanja rektalne pristupne cevi i obturatora u rektalnu šupljinu preko analnog kanala; izvlačenja obturatora iz rektalne pristupne cevi; umetanja uređaja za uzorkovanje kolorektalnih ćelija prema zahtevima 1 do 11 u rektalnu šupljinu preko rektalne pristupne cevi, bez da je elastična membrana uređaja u kontaktu sa bilo kojom površinom tela; dovođenja pod pritisak unutrašnje šupljine do bar prvog povišenog pritiska tako da se elastična membrana izbaci sa distalnog kraja uređaja za uzorkovanje; kontaktiranja površine kolorektalne sluzokože sa spoljašnjom površinom pomenute membrane za uzorkovanje ćelija; dobijanja uzorka otpalih ćelija sa površine kolorektalne sluzokože; postizanja drugog sniženog pritiska u unutrašnjoj šupljinu tako da se elastična membrana uvuče i uzorak prisutan na površini za uzorkovanje ćelija pomenute membrane se vrati u unutrašnju šupljinu uređaja za uzorkovanje ćelija; izvlačenja uređaja za uzorkovanje ćelija iz rektalne šupljine preko rektalne pristupne cevi, bez da elastična membrana uređaja za uzorkovanje dođe u kontakt sa površinom tela; vraćanja obturatora preko rektalne pristupne cevi; i izvlačenja rektalne pristupne cevi i obturatora iz rektuma preko analnog kanala.

22. Postupak ranog otkrivanja i dijagnoze kolorektalnog kancera, naznačen time, što obuhvata bilo koji postupaka prema zahtevima 17 do 21 i dalje sadrži regeneraciju kolorektalnog uzorka iz uređaja za uzorkovanje i izvođenje dijagnostičkog testa na uzorku.

23. Postupak prema zahtevu 22, naznačen time, što pomenuti test je izabran od DNK kvantizacije, DNK ekstrakcije praćene sa njenom kvantifikacijom i opciono molekulskom analizom, citološko/citohemijsko ispitivanje i biohemijskih testova.